KR101854490B1 - 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법, 당해 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물 및 그의 이식방법 - Google Patents

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Abstract

[과제] 모낭 원기의 이식에 의해 털을 재생시키는 기술에 있어서 재생되는 모색을 제어하는 것을 목적으로 한다.
[해결수단] 이식 후에 발생하는 발모의 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법으로서, 간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체를 조제하는 공정, 상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 조제하는 공정, 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 조제하는 공정, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽에 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시키는 공정, 및 계속해서 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체로서 적어도 한쪽이 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합한 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 제조방법을 제공한다.

Description

모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법, 당해 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물 및 그의 이식방법{Method of preparing regenerated hair follicle germ for transplantation in which hair color is controlled, composition including regenerated hair follicle germ for transplantation, and method of transplanting regenerated hair follicle germ}
본원의 발명은 모색(hair color)이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법, 당해 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물 및 그의 이식방법에 관한 것이다.
이식의료를 보완하는 차세대 의료기술로서 각종 질병이나 외상에 의해 기능 부전이 된 장기나 기관을 재생한 장기나 기관과 치환하는 재생의료가 기대되고 있다(비특허문헌 1). 지금까지의 재생의료 연구에서는 상해를 받은 조직이나 부분적으로 기능장애가 있는 기관에 줄기세포나 전구세포를 이입하여 기능 회복시키는 줄기세포 이입요법이 진행되고 있다.
단일 세포종으로 이루어지는 이차원적인 조직의 재생, 피부나 각막 상피세포, 심근세포 등에 있어서는 세포 시트 테크놀로지에 의해 세포를 시트상으로 배양하여 조직화하는 조직 재생기술도 실용화에 가까운 단계에 있다. 그 중에서도 피부조직은 간엽계 세포인 섬유아세포와 피부 표피세포를 중층화하고 조직학적으로 적절한 층구조를 인위적으로 재현시킴으로써 기능적인 피부를 재생하는 것이 가능하여 심각한 열상의 치료에 있어서 임상 응용되고 있다.
한편 기관은 복수 종의 기능적인 세포가 삼차원적인 배치를 취하여 고유의 기능을 발현하는 것이 알려져 있다. 거의 모든 기관은 태아기의 상피계 세포와 간엽계 세포의 상호작용에 의해 발생하여 고유의 형태나 기관 기능을 발휘하게 된다. 현재의 재생의료 기술로는 복수 종의 세포를 삼차원적으로 배치하는 것은 곤란하며 생체외에 있어서 즉시 기능 가능한 재생 기관 구축은 아직 개발되어 있지 않다.
최근 들어서 외배엽성 기관인 치아나 타액선, 피부 부속기관인 모낭에 있어서 기관 원기를 재생하고 발생 과정을 재현함으로써 기관 재생을 목표로 한 연구가 진행되고 있다. 이들 기관은 생명의 유지에 직결되는 것은 아니지만 기관 상실이나 기능 부전에 빠지는 것이 알려져 있다. 이러한 예로서는 우식이나 상해, 치배형성 부전에 의한 치아의 상실이나, 고령화에 수반되는 타액 분비장애, 남성형 탈모증이나 모낭 형성 부전에 의한 모발의 상실 등을 들 수 있다. 이러한 기관 상실이나 기능 부전은 QOL(Quality of Life)에 커다란 영향을 미치기 때문에 기관 재생에 의한 기능 회복이 크게 기대되고 있다.
일반적으로 포유류나 조류에 있어서 털, 깃털 및 발톱 등의 외배엽성 피부 부속기관은 피부에 편재하여 생존이나 생식 등 생물종 특이한 기능을 갖는다. 포유류에 있어서 털은 체온의 유지나 외상 및 자외선에 대한 방어 기능을 갖는다. 또한 영장류 등의 고등 포유류에서는 모발에 의해 체표면에 특징적인 색이나 모양이 생겨 생식 집단 내에 있어서의 순위나 생식 능력의 어필에 도움이 되는 것으로 생각되고 있다. 또한 모발은 체표면의 부위나 기능에 따라 굵기, 경도, 색과 같은 모질에 차를 발생시키고 특정 부위에 다수 존재함으로써 그의 심미적 및 기능적 가치를 발휘한다. 특히 사람에서는 두발의 색이나 질은 사회적인 의미를 가져 가령이나 질병에 의한 변화는 개인의 QOL에 대해서 커다란 영향을 미치는 것으로 생각되고 있다.
임상 응용에 충분한 모낭 재생의료의 확립에는 재생 모낭이 정상 조직 구조를 가져 이식 부위에 적합한 모간을 갖는 털이 형성, 신장되는 것이 필요하다. 이러한 털 등의 피부 부속기관을 포함하는 외배엽성 부속기관은 통상 태아기에 있어서 상피·간엽계 세포의 상호작용에 의해 발생한다. 외배엽성 부속기관 중 하나인 모낭은 개체의 생애에 걸쳐 성장과 퇴행(모주기)을 반복하고, 성장기에 있어서의 모구부의 재생은 모낭기관 발생기와 동일한 분자 메커니즘에 의해 유도되는 것이 알려져 있다. 또한 이러한 모주기에 있어서의 모구부의 재생은 간엽계 세포인 모유두 세포에 의해 유도되는 것으로 생각되고 있다. 즉 성장기에 있어서 모낭 상피 줄기세포가 간엽계 세포인 모유두 세포에 의해 분화 유도되어 모구부가 재생된다. 또한 벌지영역 및 그의 아래쪽 영역에는 신경능선 유래 줄기세포의 니치가 존재하는 것으로부터, 모낭은 복수의 줄기세포 니치를 보유하여 줄기세포 풀로서 기능하고 있는 것으로 생각되고 있다.
지금까지 모낭 재생을 위해 간엽계 세포(모유두 세포 및 진피 모근초 세포)를 치환하는 것에 의한 모낭 가변영역의 재생이나 모낭 유도능을 갖는 간엽계 세포에 의한 모낭 신생, 상피·간엽계 세포에 의한 모낭의 재구축 등이 시도되어 왔다. 또한 최근 본 발명자들은 기관 원기법(예를 들면 특허문헌 1 참조)에 의해 성체 마우스 수염 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 수염 유래의 배양 모유두 세포로 재구축한 재생 모낭 원기는 정상 발생을 모방하여 모낭과 털을 재생할 수 있는 것을 나타내었다. 그러나 성체 마우스 수염 유래의 재생 모낭 원기를 사용하여 모낭을 재생시켰을 때에는 재생된 털의 대부분이 백색모가 되어 버리는 문제를 가지고 있었다.
국제공개 제2006/129672호 팸플릿
Sharpe PT, Young CS. Test-tube teeth. Sc. Am. 293, 34-41, 2005
전술한 바와 같이 임상 응용에 충분한 모낭 재생기술, 특히 모색에 대해서 제어된 모낭 재생기술에 대해서는 현재까지 보고되어 있지 않다. 특히 모발의 재생기술을 인간에 적용할 때에는 성체 유래의 조직으로부터 모색이 제어된 재생모를 얻을 필요가 있어 성체 조직 유래의 재생모의 모색을 제어하는 방법이 강하게 요망되고 있었다.
상기 과제를 해결하기 위해서 본 발명자들은 먼저 모색(hair color)을 관장하는 세포인 멜라노블라스트의 분포와 그 분포영역에 착안하여 각각의 분포역에 존재하는 세포의 기능을 해석하였다. 그리고 본 발명자들은 이 멜라노블라스트 분포역에 포함되는 세포의 기능을 응용함으로써 모색을 제어한 이식용 재생 모낭 원기(regenerative hair follicle germ)의 제작방법을 발견하였다.
즉 본 발명은 이식 후에 발생하는 발모의 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법으로서, 간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체를 조제하는 공정, 상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 조제하는 공정, 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 조제하는 공정, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽에 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시키는 공정, 및 계속해서 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체로서 적어도 한쪽이 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합한 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법에 관한 것이다.
여기서 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 제1 세포 집합체가 간엽계 세포로 실질적으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 제2 세포 집합체가 상피계 세포로 실질적으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체가 단일화 처리된 것인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 색소 줄기세포가 서브벌지영역 유래의 멜라노블라스트 또는 모기질 기저부 유래의 멜라노사이트 전구세포인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 세포 집합체끼리를 결합시키는 공정에 있어서, 상기 제1 세포 집합체의 세포수 또는 상기 제2 세포 집합체의 세포수와 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수의 비가 0.1：1~100：1의 범위 내인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 간엽계 세포가 모유두 세포(hair papilla cells) 또는 진피 모근초 세포(dermal root sheath cells)인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 상피계 세포가 벌지영역 상피세포(bulge region epithelial cells) 또는 모기질 기저부 상피세포(hair matrix basal epithelial cells)인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 간엽계 세포 또는 상피계 세포가 성체의 모낭 유래인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 재생 모낭 원기에 가이드를 삽입하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 재생 모낭 원기를 이식했을 때에 재생되는 재생 모낭이 멜라노블라스트의 줄기세포 니치(niche)를 구비하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법의 일실시태양에 있어서는 상기 재생 모낭 원기를 이식했을 때에 재생되는 재생 모낭이 영속적으로 유색모를 형성 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 태양은 상기 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법에 의해 제작되는 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 다른 태양은 상기 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법에 의해 제작된 이식용 재생 모낭 원기를 대상으로 하는 부위로 이식하는 공정을 포함하는 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 이식방법에 관한 것이다.
또한 본 발명의 이식용 재생 모낭 원기의 이식방법의 일실시태양에 있어서는 상기 가이드를 이식 부위로부터 돌출된 상태로 유지함으로써, 이식한 재생 모낭 원기의 상피계 세포측 부분과 상기 대상의 상피계 세포가 가이드를 따라 신장되어 연결하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면 재생 모낭 원기의 제작시에 상피계 세포 또는 간엽계 세포와는 별도로 조제한 색소 줄기세포를 사용함으로써 이식 후 최초로 발모하는 털이 유색모인 이식용 재생 모낭 원기를 제작할 수 있다. 또한 본 발명에 의해 제작되는 이식용 재생 모낭 원기는 모색뿐 아니라 정상 모간(hair shaft)을 갖는 털을 재생시킬 수 있다.
또한 본 발명의 일실시태양에 있어서는 본 발명에 의해 제작되는 이식용 재생 모낭 원기의 이식 후에 재생되는 재생 모낭에 있어서 멜라노블라스트의 줄기세포 니치를 형성시킬 수 있다. 이것에 의해 모낭 중의 멜라노블라스트의 줄기세포 니치가 멜라노블라스트를 유지하는 동시에 멜라노사이트를 적절히 공급할 수 있기 때문에 장기간에 걸쳐 유색모를 형성시킬 수 있다.
도 1은 모낭에 있어서의 멜라노블라스트와 멜라노사이트 전구세포의 분포를 나타내는 모식도이다. 모낭의 서브벌지영역에는 멜라노블라스트가 분포되어 있는 멜라노블라스트 니치가 존재하고 있고 모기질 기저부에는 멜라노사이트 전구세포가 분포되어 있다. 도 1 중 DP는 모유두를 나타내고 SG는 피지선을 나타낸다.
도 2는 하기 3개의 조건에 의해 제작한 재생 모낭 원기를 이식 후 모낭 재생되어 발모된 이식 부위의 실체현미경에 의한 사진을 나타낸다(도 2 a~c). 도 2a는 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기를 이식한 발모 부위를 나타낸다(대조). 또한 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포에 대해서 성체 마우스 구레나룻 유래의 서브벌지영역 세포를 추가로 첨가하여 재생 모낭 원기를 제작하고 이식했을 때의 발모 부위를 도 2b에 나타내고(서브벌지 첨가구), 성체 마우스 구레나룻 유래의 모기질 기저부로부터 채취한 세포를 추가로 첨가하여 재생 모낭 원기를 제작하고 이식했을 때의 발모 부위를 도 2c(모기질 기저부 첨가구)에 나타낸다. 대조에서는 백색모가 얻어진 것에 대해서(도 2a) 서브벌지 첨가구 및 모기질 기저부 첨가구에서는 흑색모를 얻을 수 있었다(도 2b의 검은 화살표 및 도 2c). 또한 도 2b의 흰 화살표는 백색의 재생모를 나타낸다.
도 3은 천연의 모낭 또는 재생 모낭 원기의 이식에 의해 재생한 모낭의 멜라노블라스트 줄기세포 니치가 존재하는 부위인 서브벌지영역의 외모근초에 있어서 멜라노블라스트의 분화 계보 마커인 도파크롬 타우토머라아제(dopachrome tautomerase：Dct)의 in situ 하이브리다이제이션을 행했을 때의 결과를 나타낸다. 도 3의 화상은 in situ 하이브리다이제이션 후의 형광현미경 하에서 촬영한 화상을 나타낸다. 도 3A~C는 각각 흑색모를 갖는 천연의 모낭(A), 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기 유래의 백색모를 갖는 모낭(B), 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포에 대해서 성체 마우스 구레나룻 유래의 서브벌지영역 세포(서브벌지 첨가구)를 첨가하여 제작한 재생 모낭 원기 유래의 흑색모를 갖는 모낭(C)의 화상을 나타낸다. 도 3 중의 화살표는 도파크롬 타우토머라아제의 검출 부위를 나타낸다.
도 4는 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기(대조), 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포에 대해서 성체 마우스 구레나룻 유래의 서브벌지영역 세포(서브벌지 첨가구), 또는 성체 마우스 구레나룻 유래의 모기질 기저부로부터 채취한 세포(모기질 기저부 첨가구)를 추가로 첨가하여 제작한 재생 모낭 원기를 각각 이식한 후, 최초로 발모된 털의 유색모율을 나타낸다.
도 5는 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포 및 성체 마우스 구레나룻 유래의 모기질 기저부로부터 채취한 세포를 사용하여 제작한 재생 모낭 원기를 수령자(recipient) 마우스의 피내에 이식하고 재생된 모낭으로부터 발모된 털의 모간을 전자현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 하기 2개의 조건으로 제작한 재생 모낭 원기의 이식 후 36일째 및 이식 후 306일째에 있어서 그 발모된 이식 부위를 실체현미경으로 촬영한 사진을 나타낸다. 도 6 중 왼쪽 도면 및 가운데 도면은 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포에 대해서 성체 마우스 구레나룻 유래의 모기질 기저부로부터 채취한 세포를 추가로 첨가하여 재생 모낭 원기를 제작하고, 이식 후 36일째 및 306일째의 발모 부위를 나타낸다(모기질 기저부 첨가구). 또한 도 6 중 오른쪽 도면은 성체 마우스 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기를 이식 후 306일째의 발모 부위를 나타낸다(대조).
본 발명에 따른 제조방법의 제1 태양은 이식 후에 발생하는 발모의 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법으로서, 간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체를 조제하는 공정, 상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 조제하는 공정, 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 조제하는 공정, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽에 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시키는 공정, 및 계속해서 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체로서 적어도 한쪽이 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합한 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 있어서 「간엽계 세포」란 간엽 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미하고, 「상피계 세포」란 상피 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미한다.
색소세포란 피부의 표피층과 진피층 내 및 모낭의 상피층 내에 분포하여 멜라닌을 만들어 내는 세포로 색소세포가 만드는 멜라닌은 모발의 색에 깊이 관여하고 있다. 또한 색소세포는 색소 줄기세포나 색소세포의 전구세포로부터 분화되는 것이 알려져 있다.
또한 본 명세서에 있어서 「색소 줄기세포」란 색소세포(멜라노사이트)로 분화되는 멜라노사이트 전구세포, 멜라노블라스트(색소 줄기세포)를 의미한다. 또한 색소 줄기세포를 포함한다고 하는 경우에는 상기 세포 중 어느 1종을 사용하는 것도 가능하고, 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 멜라노블라스트란 멜라노사이트 및 멜라노사이트 전구세포로 분화 가능하며 미분화 상태의 색소를 갖지 않는 줄기세포를 말한다. 멜라노블라스트는 모낭 중의 특정 줄기세포 니치에서 장기간 미분화 상태가 유지된다. 또한 멜라노사이트 전구세포란 멜라노사이트로 분화 가능한 전구세포로서 미분화 상태의 색소를 갖지 않는 전구세포를 말한다. 그리고 색소세포(멜라노사이트)란 최종 분화된 색소를 갖는 세포를 말한다.
또한 본 명세서에 있어서 「색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체」란 상기와 같은 색소 줄기세포를 포함하는 조직이나 영역, 이들 조직이나 영역을 효소처리나 단일화 처리 등에 의해 세포 단위로 분리시킨 상태의 세포 또는 분리된 세포를 원심분리 등에 의해 세포 응집괴(cell aggregate)로 한 상태를 포함한다. 또한 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체는 실질적으로 색소 줄기세포로 구성되는 세포 집합체로 하는 것도 가능하다.
또한 본 발명에 있어서 「벌지영역」이란 모낭의 피지선 부착 부위보다 아래쪽이고 또한 입모근(hair erector muscle) 부착 부위보다 위쪽의 모낭 정상영역(constant region)을 말한다. 또한 입모근이 존재하지 않는 마우스 구레나룻 등의 경우에는 입모근 부착 부위에 상당하는 부위에 링브루스트(Ringwurst)가 존재한다. 링브루스트란 구레나룻 모낭 불변부의 최하단부에 부착되어 있는 신경능선(neural crest) 유래 간엽세포로 이루어지는 링형상의 구조로 설치류의 구레나룻에 특유의 구조이다. 따라서 본 명세서에 있어서 입모근이 존재하지 않는 구레나룻 등의 모낭에 있어서의 「벌지영역」이란 모낭의 피지선 부착 부위보다 아래쪽이고 또한 링브루스트보다 위쪽의 영역으로 한다. 또한 정상영역(불변부영역)이란 모낭의 모주기에 관련된 성장 또는 퇴행과 같은 모낭의 조직구조 상의 변화를 갖지 않는 영역을 말한다. 「서브벌지영역」이란 벌지영역의 아래쪽에 인접한 정상영역의 최하단부를 말한다.
또한 본 발명에 있어서 「모기질 기저부」란 모구부(hair bulb)의 모기질 중에서 Auber씨 선(Auber's line)보다도 아래쪽에 위치하고 멜라닌을 생산하는 멜라노사이트가 분포하지 않는 영역을 말한다.
본 명세서에 있어서 「재생 모낭 원기」는 간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체와 상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제작되는 모낭 원기를 의미한다.
「간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체와 상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정」은 예를 들면 특허문헌 1, 일본국 특허공개 제2008-29756호 공보, 일본국 특허공개 제2008-206500호 공보, 일본국 특허공개 제2008-200033호 공보 및 일본국 특허공개 제2008-29757호 공보에 기재되어 있고, 그들 각 문헌의 개시는 전체로 본 명세서에 참조로써 포함된다.
상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽은 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합시킨다. 그 후 다른 쪽의 세포 집합체와 함께 지지체 내부에서 배양하여 재생 모낭 원기를 제작한다. 이때 상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는 어느 한쪽에 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시켜 두는 것도 가능하고, 또한 양쪽에 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시켜 두는 것도 가능하다.
또한 멜라노블라스트는 모낭의 상피층에 존재하기 때문에 색소 줄기세포로서 멜라노블라스트를 사용할 때는 상피계 세포를 포함하는 세포 집합체에 결합시키는 편이 줄기세포의 기능을 유지할 수 있는 점에서 바람직하다.
또한 본 명세서에 있어서 「제1 또는 제2 세포 집합체와 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시킨다」는 것은 어떤 세포 집합체를 전체적 또는 부분적으로 다른 세포 집합체와 혼합시키는 것을 포함하고 또한 세포 집합체의 표면끼리를 접촉 또는 접착시키는 것도 포함한다. 따라서 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합시킨 제1 또는 제2 세포 집합체는 그 세포 집합체 중에 색소 줄기세포가 혼합된 상태 또는 포함된 상태가 된다.
제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽에 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시키는 공정에 있어서, 제1 세포 집합체의 세포수 또는 제2 세포 집합체의 세포수와 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수의 비는 사용하는 세포 등의 조건에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면 0.1：1~100：1의 범위 내가 되도록 조정하는 것이 바람직하고, 0.1：1~10：1의 범위 내가 되도록 조정하는 것이 보다 바람직하며, 0.5：1~2：1의 범위 내가 되도록 조정하는 것이 더욱 바람직하다.
그러나 제1 세포 집합체의 세포수 또는 제2 세포 집합체의 세포수와 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수의 비는 제작되는 재생 모낭 원기의 모색을 제어할 수 있는 한 상기의 범위에 한정되지 않는다.
제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체의 양쪽에 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시킬 때에도 각각의 세포 집합체에 대해서 상기의 범위 내가 되도록 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시킬 수 있다.
또한 이때 제1 세포 집합체 또는 제2 세포 집합체에 결합시키는 색소 줄기세포의 세포수의 비율을 조정함으로써 모색의 농담에 대해서도 제어할 수 있다.
또한 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시킨 후 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정에 있어서, 간엽계 세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수와 상피계 세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수의 비는 사용하는 세포 등의 조건에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면 0.1：1~3：1의 범위 내가 되도록 조정하는 것이 바람직하고, 0.3：1~1：1의 범위 내가 되도록 조정하는 것이 보다 바람직하다. 또한 배양시에 상피계 세포의 세포수의 비율을 올리면 재생모의 발생률의 향상과 모질의 향상을 기대할 수 있어 이 점에 있어서 바람직하다.
또한 상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는 어느 한쪽의 세포 집합체에 색소 줄기세포를 포함하는 경우, 다른 쪽의 세포 집합체를 실질적으로 간엽계 세포만 또는 실질적으로 상피계 세포만으로 구성할 수 있다. 「실질적으로 간엽계 세포만으로 구성되어 있다」는 것은 본 발명에 있어서 어떤 세포 집합체가 간엽계 세포만으로 구성되어 있는 경우와 동일한 기능을 하는 것을 의미한다. 바람직하게는 간엽계 세포가 되는 세포 이외의 것을 될 수 있는 한 포함하지 않는 상태를 말한다. 또한 간엽계 세포라면 상이한 종류의 세포를 포함하고 있어도 된다. 「실질적으로 상피계 세포로 구성된다」고 하는 경우도 동일하다.
여기서 세포 집합체란 세포가 밀착된 상태여도 되고 세포가 밀착되지 않은 상태여도 되며, 조직 또는 조직으로부터 채취 후에 단일화 처리된 세포군이어도 되고 제각각의 세포로부터 조제된 세포 응집괴여도 된다. 조직을 사용하면 세포 배치나 형상이 바른 기관이 얻어지기 쉽다는 이점이 있지만 입수 가능한 양에 제약이 있는 경우도 있다. 세포 응집괴는 배양세포도 사용할 수 있기 때문에 비교적 입수하기 쉬워 적어도 그 점에 있어서는 바람직하다. 또한 재생 모낭 원기를 제작하기 위해서 세포 집합체를 지지체 내부에 주입하고 밀착시켜서 배양할 때에는 세포 집합체는 세포가 밀착된 상태인 조직이나 세포 응집괴인 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 색소 줄기세포로서 모낭에 유래하는 색소 줄기세포를 사용하면 모낭 재생에 대한 방향 결정이 용이하기 때문에 이 점에 있어서 바람직하다. 예를 들면 색소 줄기세포로서 멜라노블라스트를 사용할 때는 모낭의 서브벌지영역에 존재하는 멜라노블라스트를 사용할 수 있고 또한 색소 줄기세포로서 멜라노사이트 전구세포를 사용할 때에는 모낭의 모기질 기저부에 존재하는 멜라노사이트 전구세포를 사용할 수 있다.
또한 모낭 이외에 유래하는 색소 줄기세포로서는 피부 내의 표피층 내에 분포되어 있는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 간엽계 세포와 상피계 세포 중 적어도 한쪽은 모낭(모낭을 구성하는 기관, 조직, 세포를 포함한다)에 유래하는 것이 바람직하다. 이것에 의해 모낭으로 방향 결정이 이미 행해져 있는 세포를 사용하여 용이하게 기관을 형성할 수 있다. 또한 보다 확실하게 모낭을 제조하기 위해서는 간엽계 세포와 상피계 세포가 모두 모낭에 유래하는 것이 가장 바람직하다.
즉 재생 모낭 원기를 제작하는 경우에는 모낭 유래의 간엽계 세포 또는 상피계 세포를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 간엽계 세포로서 모유두 세포나 진피 모근초 세포 및 발생기의 피부 간엽계 세포 등을 사용할 수 있고, 상피계 세포로서는 벌지영역의 외모근초 최외층 세포 및 모기질 기저부의 상피계 세포 등을 사용할 수 있다. 또한 간엽계 세포로서 iPS 세포나 ES 세포로부터 유도된 모낭 간엽계 세포도 사용할 수 있고, 상피계 세포로서 iPS 세포나 ES 세포로부터 유도된 모낭 상피계 세포도 사용할 수 있다.
또한 간엽계 세포, 상피계 세포, 및 색소 줄기세포를 채취하기 위한 모낭은 성장기의 것인 것이 바람직하다. 성장기의 모낭 유래의 세포를 사용함으로써 높은 빈도로 품질이 좋은 재생모를 유도하는 것이 가능하다. 또한 모낭은 태아 유래여도 되고 성체 유래여도 된다. 태아 유래의 모낭으로부터 세포를 채취하는 경우에는 모낭 기관 발생기의 모낭세포를 효율적으로 채취할 수 있고 또한 미분화 세포를 취득할 수 있기 때문에 이 점에 있어서 바람직하다. 한편 성체 유래의 모낭으로부터 세포를 채취하는 경우에는 기관 내에 있어서의 세포 분포의 영역성을 이용하여 유용한 세포를 분리 취득할 수 있기 때문에 이 점에 있어서 바람직하고, 특히 본 발명을 인간의 임상에 응용할 때에는 대상자의 세포를 이용할 수 있기 때문에 면역에 의한 거부반응의 회피나 ES 세포의 이용 등 윤리적인 문제의 회피면에 있어서 바람직하다. 또한 이식 후의 모낭은 면역관용된다는 보고도 있고(Reynolds et.al., Trans-gender induction of hair follicles. Nature. 1999 Nov 4；402(6757)：33-4.), 또는 그 외의 방법에 의해 면역 억제가 가능하다면 미용 성형수술 등에서 발생한 타가(another family)의 성체 유래의 수술재료 등을 이용할 수 있어 산업 이용상의 가치가 매우 높아 바람직하다.
모낭 이외에 유래하는 간엽계 세포로서 생체 내의 다른 간엽계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는 혈액세포를 포함하지 않는 골수세포나 간엽계 세포, 더욱 바람직하게는 구강 내 간엽계 세포나 악골 내부의 골수세포, 두부 신경능선 세포에 유래하는 간엽계 세포, 이들 간엽계 세포로 분화 가능한 간엽계 전구세포나 그의 줄기세포 등이다. 간엽계 세포로서 양막 유래 세포를 사용하는 예가 일본국 특허공개 제2008-206500호 공보에, 전능성 줄기세포를 분화 유도한 세포를 사용하는 예가 일본국 특허공개 제2008-200033호 공보에 기재되어 있고, 그 개시는 전체로 본 명세서에 참조로써 포함된다.
모낭 이외에 유래하는 상피계 세포로서 생체 내의 다른 상피계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는 피부나 구강 내의 점막이나 치육의 상피계 세포, 더욱 바람직하게는 피부나 점막 등의 분화된, 예를 들면 각화된(keratinized), 또는 착각화된(parakeratinized) 상피계 세포로 분화 가능한 미숙한 상피계 전구세포, 예를 들면 비각화(non-keratinized) 상피계 세포나 그의 줄기세포 등이다. 구강 내 상피세포나 그의 초대배양 세포를 상피계 세포로서 사용하는 예가 일본국 특허공개 제2008-29756호 공보에 기재되어 있고, 그 개시는 전체로 본 명세서에 참조로써 포함된다. 또한 자가 조직을 이용하는 관점에서는 이식 대상의 간엽계 세포 및 상피계 세포 또는 이들 세포를 포함하는 조직을 사용하는 것이 바람직하다.
재생 모낭 원기를 제작하기 위한 간엽계 세포, 상피계 세포, 색소 줄기세포, 또는 이들 세포를 포함하는 조직은 포유동물인 영장류(예를 들면 인간, 원숭이 등), 유제류(예를 들면 돼지, 소, 말 등), 소형 포유류인 설치류(예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등) 외에 개, 고양이 등 각종 동물로부터 채취할 수 있다. 간엽계 세포, 상피계 세포, 색소 줄기세포, 또는 이들 세포를 포함하는 조직의 채취는 통상 조직의 채취에서 사용되는 조건을 그대로 적용하면 되고, 무균상태에서 취출하여 적당한 보존액에 보존하면 된다.
모낭으로부터의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 조제는, 예를 들면 먼저 주위의 조직으로부터 단리된 모낭을 형상에 따라 간엽 조직 및 상피 조직으로 분리함으로써 행해진다.
또한 모낭으로부터의 색소 줄기세포의 조제는, 예를 들면 멜라노블라스트를 포함하는 서브벌지영역을 분리할 때에는 현미경 검경하에서 피지선과 입모근을 마커로 하여 벌지영역에 인접한 정상부 최하단부로서 분리할 수 있다. 또한 멜라노사이트 전구세포를 포함하는 모기질 기저부를 분리할 때에는 현미경 검경하, 모유두의 모구부를 마커로 하여 Auber씨 선보다도 아래쪽의 가변부 최하단부로부터 분리할 수 있다. 또한 멜라노블라스트의 마커인 Dct의 프로모터 아래에 GFP를 삽입한 유전자를 도입한 동물 유래의 세포나 배양세포를 재료로 하는 경우는 효소처리에 의해 단일화된 세포로부터 추가로 멜라노블라스트를 세포 분류장치(cell sorter)로 분리·취득할 수 있다. 또한 조직으로부터 간엽계 세포, 상피계 세포, 서브벌지영역 및 모기질 기저부 등을 분리할 때에는 분리를 용이하게 행하기 위해 효소를 사용해도 된다. 효소로서는 디스파제, 콜라게나제, 트립신 등 공지의 것을 들 수 있고 당업자는 적절히 바람직한 효소를 사용할 수 있다.
또한 모낭으로부터 분리된 간엽계 세포, 상피계 세포, 또는 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체는 재생 모낭 원기의 제작에 사용되기 전에 세포 분리용 필터를 통과시켜 단일화 처리되는 것이 바람직하다. 단일화 처리란 세포간의 접착을 해리시켜 유동성을 부여하는 것으로, 이 처리를 함으로써 첨가 세포를 고루 혼합 가능해지고 또한 재생 모낭 원기를 제작할 때에 마이크로 피펫으로 취급할 수 있기 때문에 바람직하다. 세포 분리용 필터로서는 간엽계 세포, 상피계 세포, 또는 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 다른 조직 및 다른 세포로부터 분리할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 세포 분리용 필터의 직경은 채취하는 세포별로 당업자에 의해 적당히 선택할 수 있고, 예를 들면 40 ㎛~100 ㎛의 직경을 갖는 필터를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 세포 응집괴는 간엽 조직 또는 상피 조직에 유래하는 세포가 응집된 것, 색소 줄기세포를 포함하는 세포군이 응집된 것, 또는 간엽 조직 또는 상피 조직에 유래하는 세포와 색소 줄기세포를 포함하는 세포군이 응집된 것 등을 의미한다. 이러한 세포 응집괴는 예를 들면 간엽 조직, 상피 조직, 또는 색소 줄기세포를 포함하는 영역을 제각기 분산시켜서 얻은 세포, 또는 당해 세포의 초대 또는 계대 배양에 의해 얻은 세포를 응집시켜서도 조제할 수 있다.
세포를 분산시키기 위해서는 디스파제, 콜라게나제, 트립신 등의 효소를 사용해도 된다. 충분한 세포수를 얻기 위해서 세포 응집괴를 조제하기 전에 분산한 세포의 초대 또는 계대 배양을 행하는 경우, 배양에 사용되는 배지로서는 일반적으로 동물세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘베코 개변 이글배지(DMEM) 등을 사용할 수 있다. 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나 또는 혈청으로 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등의 기지 혈청 성분을 첨가해도 된다. 또한 혈청을 첨가하는 경우의 농도는 그때의 배양 상태에 따라 적절히 변경할 수 있는데 통상 10% 전후로 할 수 있다. 세포의 배양에는 통상의 배양 조건, 예를 들면 약 37℃의 온도에서 5% CO2 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 또한 적절히 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 된다.
세포를 응집시키기 위해서는 예를 들면 세포 현탁액을 원심처리하면 된다. 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 응집괴는 양자를 밀착시켰을 때에 확실하게 세포끼리 상호작용하도록 각각을 고밀도의 상태로 해두는 것이 바람직하다. 고밀도의 상태란 조직을 구성할 때의 밀도와 동등 정도인 것을 말하고, 예를 들면 5×107개/㎖~1×109개/㎖, 바람직하게는 1×108개/㎖~1×109개/㎖, 가장 바람직하게는 2×108개/㎖~8×108개/㎖이다. 세포 응집괴를 고밀도로 하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 세포를 원심처리에 의해 응집시켜 침전화하는 방법에 의해 행할 수 있다. 원심처리는 세포의 활성을 손상시키지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 원심처리는 300×g~1200×g, 바람직하게는 500×g~1000×g의 원심력을 부여하는 회전수로 3분간~10분간 행하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심처리의 경우는 세포밀도를 충분히 높게 할 수 없게 되는 경향이 있는 한편, 1200×g보다도 높은 원심처리의 경우는 세포가 손상을 받는 경우가 있다.
원심분리에 의해 고밀도의 세포 응집괴를 조제하는 경우에는 통상 세포를 원심분리하기 위해 사용되는 튜브 등의 용기에 세포의 현탁액을 조제한 후 원심분리를 행하고, 침전물로서의 세포를 남기고 상청을 될 수 있는 한 제거하면 된다. 이때 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들면 배양액, 완충액 등)은 세포의 용량과 등량 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이러한 고밀도의 세포 집합체를 후술하는 방법에 의해 지지 담체 내에서 밀착시키면 세포가 긴밀히 접촉하여 세포간 상호작용이 효과적으로 발휘된다.
또한 간엽계 세포 또는 상피계 세포와 색소 줄기세포를 포함하는 세포 응집괴의 제작은 예를 들면 상기와 같은 원심분리의 처리에 의해서도 조제할 수 있고, 구체적으로는 원심분리할 때의 세포 현탁액 중에 각각 바람직한 비율로 간엽계 세포 또는 상피계 세포와 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 조정하여 포함시키고 원심분리처리를 함으로써 색소 줄기세포가 혼입된 세포 응집괴를 제작할 수 있다.
제1 및 제2 세포 집합체를 배양할 목적으로 사용되는 지지 담체로서는 내부에서 세포의 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으나 예를 들면 겔상, 섬유상, 고체상의 것이 바람직하고, 이러한 지지 담체를 사용함으로써 추가로 생체 내에서 재생 모낭 원기에 과잉의 압력이 가해지는 것을 방지할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 지지 담체로서는 예를 들면 콜라겐, 아가로스겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀 매트릭스(상품명), 메비올 겔(상품명), 매트리겔(상품명), 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산/글리콜산 공중합체(PLGA) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 적절한 경도나 유지력을 갖는 콜라겐, 아가로스겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀 매트릭스, 메비올 겔, 매트리겔, 세포외 매트릭스 혼합물, 엘라스틴, 피브린, 라미닌이 바람직하다.
예를 들면 지지 담체는 액상인 것을 사용하고 제1과 제2 세포 집합체로 이루어지는 재생 모낭 원기를 배치한 후에 경화시켜도 된다. 예를 들면 배양용 디쉬 상에 콜라겐 겔 드롭을 제작하여 콜라겐 드롭 내에 재생 모낭 원기를 배치한 후, 37℃의 CO2 인큐베이터 내에서 배양함으로써 콜라겐을 겔화시킬 수 있다.
제1 및 제2 세포 집합체를 배양할 목적으로 사용되는 지지 담체는 세포가 분산되지 않고 세포 집합체의 밀착상태를 유지 가능한 유지력을 구비하고 있는 것이 바람직하다. 밀착된 상태란 전술한 고밀도의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 집합체가 간엽계 세포와 상피계 세포의 접촉면 부근에 있어서도 같은 정도 높이의 밀도를 유지하고 있는 상태를 의미한다. 밀착상태를 유지 가능한 지지 담체는, 예를 들면 콜라겐의 경우 최종농도 2 ㎎/㎖~3 ㎎/㎖의 농도, 즉 JIS-K6503-1996에 준거한 방법(12.7 ㎜ 직경의 플런저로 4 ㎜ 눌러내리는 데 필요한 하중으로서 측정)에 의해 120 g~250 g의 젤리 강도가 되는 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다. 다른 종류의 지지 담체에 있어서도 동일한 평가방법에 의해 동일한 강도가 있으면 본 발명의 지지 담체로서 바람직하게 사용된다. 또한 1종 또는 복수 종의 지지 담체를 혼합함으로써 목적으로 하는 젤리 강도에 상당하는 경도의 지지 담체를 얻어도 된다.
제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 세포 집합체가 세포 응집괴인 경우는 예를 들면 전술한 원심분리로 얻어지는 침전물을 마이크로 시린지 등으로 지지 담체 내에 삽입하여 배치할 수 있다. 세포 집합체가 조직인 경우에는 시린지 바늘의 선단 등을 사용하여 지지 담체 내의 임의의 위치에 배치할 수 있다.
본 발명에 있어서 제1과 제2 세포 집합체를 지지 담체에 밀착시켜서 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 한쪽의 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치한 후 다른 쪽 세포 집합체를 그것에 꽉 누르듯이 배치함으로써 양자를 밀착시킬 수 있다. 보다 구체적으로는 지지 담체 내에 있어서 상기 시린지 바늘의 선단 위치를 적절히 변경함으로써 한쪽의 세포 집합체를 다른 쪽의 세포 집합체에 꽉 누르는 것이 가능하다. 또한 세포 집합체로서 상피계 조직 또는 간엽계 조직을 사용하는 경우에는, 당해 조직이 원래의 기관(당해 기관에 속하는 조직을 포함)에 있어서 각각 간엽계 조직 또는 상피계 조직과 접촉해 있던 면을 다른 쪽의 세포 집합체에 접촉하듯이 배치하는 것이 바람직하다.
또한 배치한 후에 지지 담체를 고화하는 공정을 마련하는 것도 바람직하다. 이것에 의해 세포가 더욱 응집되어 보다 고밀도의 상태로 할 수 있다. 예를 들면 콜라겐 겔의 경우 배양 온도하에서 수 분~수십 분간 정치함으로써 고화할 수 있다. 이때 세포 집합체 내에 세포 이외의 성분이 적으면 적을수록 보다 고밀도의 상태가 실현된다.
배양 기간은 지지 담체 내부에 배치된 세포수, 세포 집합체의 상태, 배양 조건, 동물종 등에 따라 상이하여 당업자가 적당히 선택할 수 있다.
배양 기간은 길게 함으로써 재생 모낭 원기의 형성을 보다 진행시킬 수 있다. 목적하는 상태를 얻기 위해 예를 들면 1일 이상, 2일 이상, 6일 이상, 30일 이상, 50일 이상, 100일 이상, 또는 300일 이상 배양해도 되고 배양 도중에 배지나 배양 조건을 변경하는 것도 가능하다.
예를 들면 재생 모낭 원기를 이식했을 때에 기능적인 모발을 얻기 위해서는 재생 모낭 원기를 1일 이상 배양하는 것이 바람직하고, 2일 이상이 보다 바람직하다.
지지 담체 내부에 있어서의 배양공정은 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 단독으로 배양해도 되고 다른 동물세포 등의 존재하에서 배양해도 된다.
지지 담체를 단독으로 배양하는 경우 배양 조건은 일반적인 동물세포의 배양에 사용되는 조건으로 할 수 있다. 또한 배양에는 포유동물 유래의 혈청을 첨가해도 되고 또한 이들 세포의 증식이나 분화에 유효한 것이 알려져 있는 각종 세포인자를 첨가해도 된다. 이러한 세포인자로서는 FGF, BMP 등을 들 수 있다.
세포 집합체의 가스 교환이나 영양 공급의 관점 및 다른 동물세포와의 접촉·혼입이 없고 또한 전공정을 in vitro에서 행할 수 있다는 관점에서 지지 담체 내부에 있어서의 배양을 기관 배양으로 하는 것이 바람직하다. 기관 배양의 경우는 일반적으로 동물세포의 증식에 적합한 배지 상에 다공성 막을 플로팅시키고, 그 막 상에 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 올려놓고 배양을 행한다. 여기서 사용되는 다공성 막은 0.3~5 ㎛ 정도의 구멍을 다수 갖는 것인 것이 바람직하고, 예를 들면 셀 컬쳐 인서트(상품명)나 아이소포어 필터(상품명)를 들 수 있다.
또한 본 발명의 다른 태양에 의하면 제1과 제2 세포 집합체를 지지 담체에 밀착시켜서 배치하거나 또는 배양한 후 제1과 제2 세포 집합체로 이루어지는 재생 모낭 원기에 가이드를 삽입하는 것도 가능하다.
본 발명에 사용할 수 있는 「가이드」란 기관 배양에 의해 구축한 배양 중의 재생 모낭 원기로 삽입하여 재생 모낭 원기의 이식 후에 재생 모낭 원기의 상피계 세포측 부분과 수령자측의 상피계 세포의 연결을 촉진시키기 위한 것이다. 사용되는 가이드로서는 상기의 효과를 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않고 예를 들면 나일론 등의 폴리머나 합성 또는 천연의 생체 흡수 가능한 폴리머로부터 만들어진 섬유, 스테인리스 스틸 등의 금속섬유, 탄소섬유 및 유리섬유 등의 화학섬유, 및 천연의 동물섬유나 식물섬유 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 나일론사나 스테인리스 스틸 와이어 등을 들 수 있다. 특히 재생 모낭 원기에 대해서는 생체 유래의 모발을 가이드로서 사용하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 사용되는 가이드는 중공사의 형상으로 하는 것도 가능하다. 가이드의 직경은 당업자에 의해 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면 5~100 ㎛로 하는 것이 바람직하고, 20~50 ㎛로 하는 것이 보다 바람직하다. 또한 재생 모낭 원기에 대해서 사용하는 가이드의 길이도 당업자에 의해 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면 1~10 ㎜로 하는 것이 바람직하고, 4~6 ㎜로 하는 것이 보다 바람직하다.
가이드의 삽입은 재생 모낭 원기의 구조, 특히 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉면을 손상시키지 않고 제1 집합체와 제2 세포 집합체를 수직으로 관통하도록 재생 모낭 원기가 되는 세포 집합체의 상피계 세포측으로부터 삽입한다.
또한 재생 모낭 원기가 되는 세포 집합체로의 가이드의 삽입은 기관 배양개시 직후, 즉 상피계 세포 및 간엽계 세포를 배지 내로 배치한 후 바로 삽입할 수 있다. 잠시 배양한 후에 가이드를 삽입할 때에는 재생 모낭 원기의 상피계 세포는 기관 배양에 의해 세포접착에 의해 강도를 증가시키는 것으로부터, 가이드의 소재 강도(예를 들면 스테인리스 스틸 와이어 등을 사용하거나)와 가이드의 선단을 예리하게 하거나 함으로써 관통력을 증강시킴으로써, 배양개시 후 1~2일째에 삽입하는 것도 가능하다. 가이드 삽입의 타이밍을 기관 원기 제작 직후로 하는 것은 나일론사 등의 생체에 대한 이물질 응답이 낮아 플렉시블한 소재를 사용할 수 있는 점에서 바람직하다. 또한 잠시 배양한 후에 가이드를 삽입하면 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉면이 보다 강고하게 접착되어 있어 가이드의 삽입에 의해 접촉면을 손상시키지 않아 이 점에 있어서 바람직하다.
또한 재생 모낭 원기로 가이드를 삽입한 후에는 재생 모낭 원기를 가이드가 삽입된 상태에서 배양할 수 있다. 가이드 삽입 후의 배양 기간은 예를 들면 1~4일간 배양하는 것이 바람직하고, 1.5~2일간 배양하는 것이 보다 바람직하다. 가이드 삽입 후 2일간 배양함으로써 가이드와 재생 모낭 원기의 접착이 강해져 이식시에 용이하게 빠지는 경우가 없어진다. 또한 가이드 삽입 후의 배양에 의해 재생 모낭 원기의 상피계 세포측 부분을 가이드를 따라 신장시킬 수 있어 바람직하다. 이러한 신장은 재생 모낭 원기 이식 후에 재생 모낭 원기의 상피계 세포측 부분과 수령자의 상피계 세포의 자율적인 접착의 효율 및 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일실시태양에 있어서 본 발명의 제조방법에 의해 제작되는 이식용 재생 모낭 원기는 이식 후에 재생되는 모낭 내에 기능적인 멜라노블라스트의 줄기세포 니치를 형성 가능한 재생 모낭 원기이다. 이 멜라노블라스트의 줄기세포 니치는 천연의 모낭과 동일하게 서브벌지영역의 외모근초에 형성된다. 여기서 기능적인 멜라노블라스트의 줄기세포 니치란 당해 니치를 구성하는 부분에 있어서 멜라노블라스트를 유지하는 기능을 갖는 동시에 멜라노사이트를 분화·공급하는 기능을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 일실시태양에 있어서의 이식용 재생 모낭 원기는 기능적인 멜라노블라스트의 줄기세포 니치를 구비한 모낭을 재생 가능하기 때문에 당해 모낭은 영속적으로 유색모의 형성을 가능하게 한다.
또한 본 발명의 다른 태양에 의하면 본 발명의 제조방법에 의해 제작된 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기를 대상으로 하는 부위에 이식하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제작된 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기를 이식함으로써 모색이 제어된 발모를 이식 부위에서 얻을 수 있다. 특히 성체 유래의 모낭으로부터 재생 모낭 원기를 재구축했을 때라도 그 재생 모낭 원기의 이식에 의해 이식 부위에 있어서 유색모를 얻을 수 있다.
모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기는 당업자에게 공지의 방법으로 대상으로 하는 부위에 이식할 수 있고, 예를 들면 샤피로식 식모술(Shapiro hair transplant technique)이나 최식 식모기(Choi hair transplant device)를 사용한 식모, 공기압을 이용한 임플란터 등을 사용하여 이식할 수 있다. 샤피로식 식모술이란 대상으로 하는 이식 부위에 마이크로 메스 등으로 이식 상처(graft wound)를 만든 후에 핀셋을 사용하여 이식물을 이식하는 방법이다. 이러한 식모술을 적용할 때에는 이식용 재생 모낭 원기가 가이드를 가짐으로써 재생 모낭 원기를 직접 만지지 않고 조작 가능하여 간편하게 조작할 수 있다.
재생 모낭 원기의 이식 심도로서는 예를 들면 0.05~5 ㎜로 하는 것이 바람직하고, 0.1~1 ㎜로 하는 것이 보다 바람직하며, 0.3~0.5 ㎜로 하는 것이 가장 바람직하다. 특히 재생 모낭 원기를 수령자에 이식할 때에는 진피층 내에 이식하는 것이 바람직한 경우가 있고, 모낭 형성 및 그 후의 발모효율이 우수한 진피·피하 조직의 경계면보다 위쪽으로 하는 것이 보다 바람직한 경우가 있다. 이식시의 재생 모낭 원기는 수령자의 체표면측에 재생 모낭 원기의 상피계 세포측을, 수령자의 체내측에 재생 모낭 원기의 간엽계 세포측이 오도록 이식하는 것이 발모방향을 체표면측으로 제어할 수 있는 점에서 바람직하다. 또한 이식 상처 상단부에 재생 모낭 원기의 상피계 세포 성분의 상단부가 노출되도록 이식 심도를 조절하면 추가로 수령자의 상피계 세포와의 연속성을 높일 수 있는 점에 있어서 바람직하다.
또한 가이드를 갖는 재생 모낭 원기를 이식한 후에는 가이드가 빠지지 않도록 피부 접합용 테이프나 밴드 등으로 가이드와 대상 부위를 고정하는 것도 가능하다.
가이드는 재생 모낭 원기를 이식 후 잠시 후에 수령자측의 상피계 세포와 재생 모낭 원기의 상피계 세포 유래측의 연속성이 확보된 후 이식 부위로부터 뺄 수 있다. 가이드를 빼는 타이밍은 적당히 설정할 수 있는데 예를 들면 이식 후 3일~7일에 이식 부위로부터 빼는 것이 바람직하다. 또는 가이드가 자연히 이식 부위로부터 빠질 때까지 방치하는 것도 가능하다. 생체 흡수성 재료의 가이드는 자연히 이식 부위로부터 빠지거나 분해·흡수될 때까지 방치할 수 있다.
이와 같이 이식용 재생 모낭 원기에 가이드를 보유시킴으로써, 수령자측의 상피계 세포가 이물질을 배제하도록 가이드를 따라 이식 부위의 내측으로 신장하고, 한편 재생 모낭 원기의 상피계 세포 유래의 세포가 가이드를 따라 신장한다. 이것에 의해 이식 후의 수령자측의 상피계 세포와 재생 모낭 원기의 상피계 세포측의 연속성을 향상시킬 수 있다. 또한 가이드의 삽입에 의해 배양 중의 재생 모낭 원기에 있어서 상피계 세포 및 간엽계 세포와의 극성 유지도 향상시킬 수 있어 바람직하다. 이것에 의해 모낭 형성효율을 높이는 동시에 이식시의 방향 결정을 용이하게 할 수 있다. 특히 재생 모낭 원기에 가이드를 사용한 경우에는 재생 모낭 원기와 수령자측의 상피계 세포의 연속성을 확보할 수 있을 뿐 아니라 의도한 방향으로 모낭 형성을 촉진시킬 수 있다. 그 결과, 재생 모낭 원기로부터의 발모율을 향상시킬 수 있는 동시에 발모방향의 제어도 가능해진다.
또한 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는 특정 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로 발명을 한정하는 의도는 아니다.
또한 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는 문맥상 명백하게 상이한 이해를 해야 하는 경우를 제외하고 기술된 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그것 이외의 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
상이한 정의가 없는 한 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는 상이한 정의가 명시되어 있지 않은 한 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 하며, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우 설명을 명확하게 하기 위해 과장되게 표현되어 있는 경우가 있다.
제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되는데 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면 제1 요소를 제2 요소로 기재하고 마찬가지로 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위에서 가능하다.
또한 본 명세서에 있어서 모낭에 있어서의 위쪽 또는 아래쪽의 표현은 편의상 모낭의 구성에 있어서 모유두가 존재하는 부분을 아래쪽으로 하고 모낭에 있어서 모유두와는 반대측, 즉 털이 발모·신장하는 방향을 위쪽으로 한다.
이하에 있어서 본 발명을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로서 해석되어서는 안된다.
실시예
1. 재료와 방법
(1) 실험동물
7-8주령의 C57BL/6 마우스(일본 클레아) 및 C57BL/6 6-TgN(act-EGFP) 마우스로부터 모낭을 채취하였다. 또한 하기 실험수법에 의해 제작된 재생 모낭 원기는 6-8주령의 Balb/c nu/nu 마우스(SLC)에 이식하였다. 동물의 사육 및 실험은 관련법규, 성령(省令) 및 지침을 준수하여 동경 이과대학 동물실험 윤리위원회의 승인하에 실시하였다.
(2) 모유두 세포의 배양
7-8주령의 C57BL/6 마우스를 경추 탈구에 의해 안락사시킨 후에 모구부(hair bulb)를 흠집내지 않도록 뺨부 피부 전층 및 피하 조직을 채취하였다. 구레나룻 주위의 피하 조직을 제거한 후에 모낭을 분리하였다. 분리한 모낭으로부터 성장기 I-IV기의 구레나룻 모낭을 선택하고 선택한 구레나룻 모낭으로부터 25G 주사바늘을 사용하여 콜라겐 초(collagen sheath)를 제거하여 모낭을 노출시켰다. 추가로 노출시킨 모낭으로부터 모구부를 분리하고 모유두를 적출하였다. 또한 분리한 모낭 및 적출한 모유두를 작업 중에 보존하기 위한 보존액으로서 10 mM의 HEPES, 10% 소태아 혈청 및 1% 페니실린·스트렙토마이신 용액을 포함하는 DMEM 배지(DMEM10)를 사용하였다. 분리한 모유두는 3.5 ㎝ 배양 플라스틱 디쉬(일본 벡톤 딕킨슨)에 파종하고 10 ng/㎖의 FGF2(와코 순약)를 포함하는 DMEM10에서 5% CO2, 37℃, 습도 95% 환경하에서 초대배양을 행하였다. 초대배양 모유두 세포는 4일째 및 8일째에 배지 교환하고 9일간 배양한 후에 재생 모낭 원기의 제작을 위해 사용하였다. 9일간 배양 후의 초대배양 모유두 세포는 PBS(-)로 3회 세정한 후에 0.05% 트립신을 포함하는 10 mM EDTA 용액(GIBCO)으로 박리하고, DMEM10에서 트립신 중화하여 충분히 세정한 후에 빙온하에서 사용시까지 보존하였다.
(3) 모낭 벌지 상피세포의 취득
상기 (2)에 있어서 분리한 구레나룻 조직의 모낭으로부터 25G 주사바늘을 사용하여 콜라겐 초를 제거하여 벌지영역을 분리하였다. 벌지영역 조직은 최종농도 4.8 U/㎖의 Dispase II(Becton Dickinson) 및 100 U/㎖의 Collagenase(Worthington, Lakewood, NJ) 용액으로 37℃에서 4분간 반응시킨 후 25G 주사바늘을 사용하여 외과적으로 벌지영역 상피 조직과 벌지 주위의 간엽 조직으로 분리하였다. 분리한 벌지영역 상피 조직은 0.05% Trypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)으로 인큐베이터에서 1시간 효소처리를 행하여 35 ㎛ pore 세포 여과체(cell strainer)를 통과시켜 단일화 세포로 하였다.
또한 재생 모낭 원기의 제작 직전에 배양 모유두 세포는 0.05% Trypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)으로 회수하여 35 ㎛ pore 세포 여과체를 통과시켜 단일화 세포로 하였다.
(4) 재생 모낭 원기의 제작
재생 모낭 원기는 기관 원기법에 따라 제작하였다. 이하에 순서의 상세를 기재한다. 상기와 같이 취득한 단일화된 벌지영역 세포와 단일화된 배양 모유두 세포는 각각 실리콘그리스를 도포한 1.5 ㎖ 마이크로 튜브(에펜도르프)에 옮기고 원심분리기에 걸었다. 원심분리에 의해 침전된 단일화된 벌지영역 세포 또는 단일화된 배양 모유두 세포를 회수하기 위해 원심 후의 배양액의 상청을 GELoader Tip 0.5-20 ㎖(에펜도르프)를 사용해서 완전히 제거하였다. 다음으로 실리콘그리스(다우코닝 도오레)를 도포한 페트리접시 상에 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan)를 30 ㎖ 적하하여 콜라겐 겔 드롭을 제작하고, 상기에서 조제한 단일화된 배양 모유두 세포를 0.1-10 ㎖의 피펫 팁(Quality Scientific plastics)을 사용하여 0.2 ㎖ 정도 주입해서 세포 응집괴를 제작하였다. 계속해서 동 겔 드롭 내로 상기에서 조제한 벌지영역 세포를 0.1-10 ㎖의 피펫 팁(Quality Scientific plastics)을 사용하여 배양 모유두 세포의 응집괴 상에 밀착시키듯이 0.2 ㎖ 정도 주입해서 세포 응집괴를 제작하였다. 또한 세포 응집괴의 벌지영역 세포로부터 전장 5 ㎜의 나일론사(마츠다 의과 공업)를 삽입하고, 그 후 37℃에서 5분간 정치하여 겔 드롭을 고화시킴으로써, 벌지영역 세포와 배양 모유두 세포의 결합을 보다 강고하게 함으로써 재생 모낭 원기를 제작하였다.
하기 (5) 및 (6)에 기재한 바와 같이 서브벌지영역 세포 및 모기질 기저 세포를 조제하여 재생 모낭 원기의 제작에 사용하였다.
(5) 서브벌지영역 세포의 조제
(3)에 기재된 벌지영역의 취득과 동일한 순서로 7-8주령의 C57BL/6 마우스의 구레나룻의 모낭으로부터 링브루스트 부착 부위보다 위쪽의 정상영역을 분리하고, 벌지영역에 인접한 정상부 최하단부를 서브벌지영역으로서 분리하여, 효소처리 및 세포 분리용 필터를 사용해서 단일화된 서브벌지영역 세포로 하였다.
(6) 모기질 기저부 세포의 조제
상기 (2)에 있어서 분리한 7-8주령의 C57BL/6 마우스 구레나룻 조직의 모낭의 모구부로부터 콜라겐 초와 진피 모근초를 제거하고 25G 주사바늘을 사용하여 모유두의 기저부에 인접하고 있는 모기질 기저부 조직을 분리하였다. 분리된 모기질 기저부 조직을 0.25% 트립신으로 37℃에서 10분간 처리하고 DMEM10로 세정한 후에 35 ㎛ pore 세포 여과체를 통과시켜 단일화된 모기질 기저부 세포로 하였다.
(4)에 기재된 재생 모낭 원기의 제작법에 있어서 단일화된 벌지영역 세포를 원심분리에 의해 농축시킬 때에, 상기 (6) 또는 (7)에서 얻어진 단일화된 약 400개의 서브벌지영역 세포 또는 단일화된 약 400개의 모기질 기저부 세포를 약 10,000개의 벌지영역 상피세포와 혼합하고 원심분리함으로써 단일화된 서브벌지영역 세포 또는 단일화된 모기질 기저부 세포와 단일화된 벌지영역 세포를 포함하는 세포 응집괴를 제작하였다. 이와 같이 해서 얻어진 세포 응집괴를 벌지영역 세포 대신에 겔 드롭 내의 배양 모유두 세포의 응집괴 위에 밀착시키듯이 주입함으로써 서브벌지영역 세포 첨가군 또는 모기질 기저부 세포 첨가군으로서 재생 모낭 원기를 제작하였다.
상기의 방법에 의해 겔 중에서 제작한 각 재생 모낭 원기는 DMEM10을 1 ㎖ 첨가한 6 well Plate(벡톤 딕킨슨)에 세팅한 0.4 ㎖ pore size의 Cell Culture Insert(벡톤 딕킨슨) 상에 콜라겐 겔째로 옮겨 37℃, 5% CO2, 습도 95% 조건하에서 2일간 배양을 행하였다.
(8) 재생 모낭 원기의 누드 마우스 피내 이식
누드 마우스를 정법에 따라 펜토바르비탈 마취를 행하여 배부(背部)를 이소딘 소독한 후에 자연 횡와위(natural recumbent position)를 취하게 하였다. V 랜스 마이크로메스(일본 알콘)를 사용하여 천자(穿刺)하여 피부 표피층으로부터 진피층 하층부에 이르는 이식 상처를 형성하였다. 이식 상처는 체표면으로부터 수직방향으로 400 ㎛의 심도까지로 하고 수평방향은 1 ㎜ 정도로 하였다. 나일론사제 가이드를 삽입한 재생 모낭 원기로부터 콜라겐 겔을 제거하고, 이식 상처의 체표측에 상피세포 성분이 향하도록 삽입하였다. 이식 상처 상단부에 재생 모낭 원기의 상피세포 성분의 상단부가 노출되도록 이식 심도를 조절하여 나일론사제 가이드가 체표면에 노출되도록 위치시켰다. 나일론사제 가이드를 이식 상처에 근접한 피부 표면에 스테리스트립(쓰리엠)으로 고정한 후 너스 밴드 및 서지컬 테이프(쓰리엠)로 이식 상처를 보호하였다. 이식 후 5-7일에 보호 테이프를 제거하고, 이식물의 생착을 육안 또는 형광 실체현미경으로 판정한 후에 경과관찰을 행하였다.
(9) 발모 경과관찰 및 조직학적 분석
재생 모낭 원기의 이식 부위를 육안 및 형광 실체현미경으로 관찰하여 발모를 평가하였다.
2. 결과
(1) 재생 모낭 원기의 피내 이식에 의한 체모와 수염의 재생에 있어서의 모색
유색 마우스의 성체 구레나룻 유래의 벌지영역과 성체 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기의 이식에 의해 재생된 수염은 95.5%의 빈도로 백색이었다(도 2a). 도 1에 나타내는 바와 같이 모간에 멜라닌 침착하여 모색을 제어하는 색소 줄기세포는 벌지영역 아래쪽의 서브벌지영역에 분포되어 있는 것이 알려져 있다. 또한 멜라노사이트의 전구세포는 모구부의 모기질 기저부에도 분포하고 모기질 중에서 멜라노사이트로 분화되어 모간을 착색시킨다. 성체 구레나룻 유래의 재생 모낭 원기는 멜라노블라스트가 포함되지 않는 벌지영역에 국한하여 재생 모낭 원기를 구축했기 때문에 재생 모낭 원기는 멜라노블라스트를 갖지 않아 재생된 모낭의 모기질로 분화된 멜라노사이트가 포함되지 않기 때문에 백색으로 될 가능성이 시사되었다.
(2) 색소 줄기세포 첨가에 의한 모색 제어
마우스 성체 구레나룻 모낭에 있어서 유색모 멜라노블라스트가 존재하는 서브벌지영역 및 멜라노사이트 전구세포가 분포하는 모기질 기저부영역으로부터 각각 단일화된 세포를 취득하여 재생 모낭 원기를 구성하는 세포 집합체에 첨가했을 때에 재생모의 모색에 영향을 미치는지 여부를 검증하였다. 재생 모낭 원기를 피내 이식 후 3주 후에 발모된 모간의 색과 성상을 해석한 결과, 서브벌지영역 또는 모기질 기저부 세포를 첨가한 양쪽의 구에 있어서 흑색모의 재생모를 얻는 것에 성공하였다(도 2b의 검은 화살표 및 도 2c).
여기서 재생 모낭 원기로부터 재생된 모낭으로서 흑색모를 형성시킨 모낭에 있어서, 천연의 모낭과 동일하게 멜라노블라스트의 줄기세포 니치가 형성되어 있는지를 확인하기 위해 멜라노블라스트의 분화 계보 마커인 도파크롬 타우토머라아제(dopachrome tautomerase：Dct)의 in situ 하이브리다이제이션을 행하였다. 그 결과, 유색 마우스 성체 구레나룻 유래의 벌지영역 및 모유두 세포의 세포 집합체에 대해서 서브벌지영역의 단일화 세포를 첨가하여 제작한 재생 모낭 원기 유래의 모낭으로서 흑색모를 형성시킨 모낭에 있어서는, 천연 모낭과 동일하게 멜라노블라스트의 줄기세포 니치가 존재해야 하는 장소인 서브벌지영역의 외모근초에 멜라노블라스트를 검출할 수 있었다. 이는 서브벌지영역의 단일화 세포를 첨가하여 제작한 재생 모낭 원기에 의해 재생된 모낭이 멜라노블라스트의 줄기세포 니치를 형성하여 멜라노블라스트가 적절하게 격납되어 있는 것을 나타낸다. 한편으로 유색 마우스 성체 구레나룻 유래의 벌지영역과 모유두 세포에 의해 제작한 재생 모낭 원기로부터 재생된 모낭으로서 백색모를 형성시킨 모낭에 있어서는, 멜라노블라스트의 줄기세포 니치가 존재해야 하는 장소에 멜라노블라스트를 검출할 수 없었다(도 3).
또한 서브벌지영역 세포 또는 모기질 기저 세포의 첨가 유무에 따른 모색 변화의 빈도를 계측하였다. 그 결과, 서브벌지영역 세포 첨가군에서는 65.4%가 유색이 되어 상피계 세포로서 벌지영역 세포를 단독으로 사용한 대조와 비교하여 흑색모의 비율은 14.5배나 높아졌다(도 4). 동일하게 모기질 기저영역 세포 첨가군에서는 31.6%가 흑색모가 되어 벌지영역 세포를 단독으로 사용한 대조와 비교하여 흑색모율은 7.0배 높아졌다(도 4). 또한 모기질 기저 세포를 첨가하여 제작한 재생 모낭 원기로부터 발모된 털을 채취하여 주사형 전자현미경으로 모간의 표면 형태를 해석한 바, 천연모와 동일하게 큐티클 구조가 발달되어 있는 것이 관찰되었다(도 5).
여기서 흑색모를 만들어 내는 재생된 모낭에 있어서 멜라노블라스트의 줄기세포 니치가 줄기세포 유지 기능을 재현하여 흑색모를 영속적으로 형성 가능한지 여부를 확인하기 위해, 이식으로부터 장기간 경과 후의 재생된 모낭에 있어서의 흑색모 형성능에 대해서 관찰을 행하였다. 관찰에 사용하는 재생 모낭 원기로서 유색 마우스 성체 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포에 대해서 모기질 기저부영역 유래의 단일화 세포를 첨가함으로써 제작한 재생 모낭 원기(모기질 기저부 첨가구)를 사용하였다. 또한 대조구로서 유색 마우스 성체 구레나룻 유래의 벌지영역 상피세포와 성체 마우스 구레나룻 유래의 모유두 세포로 제작한 재생 모낭 원기의 이식에 의해 재생된 모낭을 관찰하였다.
그 결과, 모기질 기저부 첨가구에 있어서는 재생 모낭 원기 이식 후 36일째 및 306일째에 있어서도 흑색모가 형성되어 있는 것이 확인되었다(도 6). 본 시험에 있어서 재생 모낭 원기에 의해 형성되는 모낭은 평균 약 15일에 모주기가 일주하기 때문에 평균 약 20회 흑색모의 형성이 반복되고 있는 것이 확인되었다. 한편 대조구에 있어서는 이식 후 306일째에 있어서도 백색모의 형성만 확인되었다.
이들 결과로부터 재생 모낭 원기에 멜라노블라스트 또는 멜라노사이트 전구세포를 포함하는 영역의 세포를 첨가함으로써 모색을 제어 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 색소 줄기세포의 첨가에 의해 제작한 재생 모낭 원기로부터 발생하는 유색모는 정상 형태의 모간을 갖는 것이 나타내어졌다.
또한 색소 줄기세포의 첨가에 의해 제작한 재생 모낭 원기로부터 재생된 모낭은 그 모낭 내에 멜라노블라스트의 줄기세포 니치를 재생 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 색소 줄기세포의 첨가에 의해 제작한 재생 모낭 원기로부터 재생된 모낭은 유색모의 형성을 영속적으로 유지 가능한 것이 나타내어졌다. 이것은 재생된 모낭 내의 멜라노블라스트의 줄기세포 니치에 있어서 장기간에 걸쳐 멜라노블라스트를 유지할 수 있고, 또한 추가로 모낭의 생리적인 기능을 재현하여 모기질에 멜라노사이트를 공급할 수 있는 것을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 이식 후에 발생하는 발모의 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기(regenerative hair follicle germ)의 제조방법으로서,
    간엽계 세포를 포함하는 제1 세포 집합체를 조제하는 공정,
    상피계 세포를 포함하는 제2 세포 집합체를 조제하는 공정,
    색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 조제하는 공정,
    상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체 중 적어도 한쪽에 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체를 결합시키는 공정, 및
    계속해서 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체로서 적어도 한쪽이 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체와 결합한 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체를 서로 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정
    을 포함하는 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 세포 집합체가 간엽계 세포로 구성되는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2 세포 집합체가 상피계 세포로 구성되는 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체가 단일화 처리된 것인 제조방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 색소 줄기세포가 서브벌지영역 유래의 멜라노블라스트 또는 모기질 기저부 유래의 멜라노사이트 전구세포인 제조방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 색소 줄기세포가 모기질 기저부 유래의 멜라노사이트 전구세포인 제조방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 집합체끼리를 결합시키는 공정에 있어서, 상기 제1 세포 집합체의 세포수 또는 상기 제2 세포 집합체의 세포수와 상기 색소 줄기세포를 포함하는 세포 집합체의 세포수의 비가 0.1：1~100：1의 범위 내인 제조방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체를 서로 밀착시켜서 지지체 내부에서 배양하는 공정에 있어서, 상기 제1 세포 집합체의 세포수와 상기 제2 세포 집합체의 세포수의 비가 0.3：1~1：1의 범위 내인 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 간엽계 세포가 모유두 세포 또는 진피 모근초 세포인 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 상피계 세포가 벌지영역 상피세포 또는 모기질 기저부 상피세포인 제조방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 간엽계 세포 또는 상피계 세포가 성체의 모낭 유래인 제조방법.
  12. 제1항, 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 재생 모낭 원기에 가이드를 삽입하는 공정을 추가로 포함하는 제조방법.
  13. 제1항, 제9항 또는 제10항에 기재된 방법에 의해 제작되는 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물.
  14. 제1항, 제9항 또는 제10항에 기재된 제조방법에 의해 제작된 이식용 재생 모낭 원기를, 인간을 제외한 동물에 있어서의 대상으로 하는 부위로 이식하는 공정을 포함하는 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 이식방법.
  15. 제12항에 기재된 제조방법에 의해 제작된 이식용 재생 모낭 원기를, 인간을 제외한 동물에 있어서의 대상으로 하는 부위로 이식하는 공정을 포함하는 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 이식방법으로서,
    상기 가이드를 이식 부위로부터 돌출된 상태로 유지함으로써 이식한 재생 모낭 원기의 상피계 세포측 부분과 상기 대상의 상피계 세포가 가이드를 따라 신장되어 연결하는 것을 특징으로 하는, 이식용 재생 모낭 원기의 이식방법.
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