JP7158676B2 - 再生毛の色制御方法、毛の再生方法及び毛包原基の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、再生毛の色制御方法、毛の再生方法及び毛包原基の製造方法に関する。
特許文献１には、成体マウスの毛包の毛乳頭から培養毛乳頭細胞を得たこと、当該毛包のバルジ領域からバルジ領域上皮細胞を得たこと、当該毛包のサブバルジ領域からサブバルジ領域細胞を得たこと、及び当該毛包の毛母基底部から毛母基底部細胞を得たことが記載されている。また、特許文献１には、バルジ領域上皮細胞と、サブバルジ領域細胞又は毛母基底部細胞とを混合して遠心分離することにより、当該バルジ領域上皮細胞と、当該サブバルジ領域細胞又は当該毛母基底部細胞とを含む細胞凝集塊を作製するとともに、培養毛乳頭細胞を遠心分離することにより、当該培養毛乳頭細胞の細胞凝集塊を作製したこと、次いで、コラーゲンゲルドロップ内で、当該バルジ領域上皮細胞と、当該サブバルジ領域細胞又は当該毛母基底部細胞とを含む細胞凝集塊の上に、当該培養毛乳頭細胞の細胞凝集塊を密着させたこと、さらに、当該バルジ領域上皮細胞の細胞凝集塊にガイドとしてのナイロン糸を挿入したこと、その後、当該ゲルドロップを固化させて、再生毛包原基を作製したことが記載されている。さらに、特許文献１には、再生毛包原基を、ナイロン糸製ガイドが体表面に露出するようにヌードマウスの皮内に移植した結果、黒色毛の再生毛が得られたことが記載されている。
特許文献２には、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、マウス胎児から採取された上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を加えて、酸素を供給しながら混合培養することにより、再生毛包原基を作製したことが記載されている。また、特許文献２には、再生毛包原基をヌードマウスの皮下に注入した結果、発毛が観察されたことが記載されている。
しかしながら、従来、成体の毛包を細胞源として使用して、再生毛包原基から生える毛の色を制御することは容易ではなかった。
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、毛の色を簡便且つ効果的に制御できる、再生毛の色制御方法、毛の再生方法及び毛包原基の製造方法を提供することをその目的の一つとする。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る再生毛の色制御方法は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び前記毛包原基を動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、を含み、前記成体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合を変えることにより、前記毛包原基から生える毛の色を変える。本発明によれば、毛の色を簡便且つ効果的に制御できる再生毛の色制御方法が提供される。
前記方法において、前記動物は、非ヒト動物であることとしてもよい。また、前記方法においては、前記成体毛包組織に含まれる前記非恒常部の重量割合を増加させることにより、前記毛包原基から生える毛の色を濃くすることとしてもよい。また、前記方法において、前記非恒常部は、毛乳頭及び毛母以外の部分を含むこととしてもよい。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る毛の再生方法は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び前記毛包原基を動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、を含み、非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記毛包原基から、前記非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす。本発明によれば、毛の色を簡便且つ効果的に制御できる毛の再生方法が提供される。
前記方法において、前記動物は、非ヒト動物であることとしてもよい。また、前記方法は、前記非恒常部を第一の重量割合で含む第一の成体毛包組織を使用して製造された第一の毛包原基を前記動物に移植して、前記第一の毛包原基から第一の色の毛を生やすこと、及び前記非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む第二の成体毛包組織を使用して製造された第二の毛包原基を前記動物に移植して、前記第二の毛包原基から前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やすこと、を含むこととしてもよい。また、前記方法において、前記非恒常部は、毛乳頭及び毛母以外の部分を含むこととしてもよい。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る毛包原基の製造方法は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、及び分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植されることで毛を生やす毛包原基を製造すること、を含み、非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす前記毛包原基を製造する。本発明によれば、毛の色を簡便且つ効果的に制御できる毛包原基の製造方法が提供される。
前記方法は、前記非恒常部を第一の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで第一の色の毛を生やす第一の毛包原基を製造すること、及び前記非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やす第二の毛包原基を製造すること、を含むこととしてもよい。また、前記方法において、前記非恒常部は、毛乳頭及び毛母以外の部分を含むこととしてもよい。
本発明によれば、毛の色を簡便且つ効果的に制御できる、再生毛の色制御方法、毛の再生方法及び毛包原基の製造方法が提供される。
以下に、本発明の一実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。
本方法の一側面は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、分散された毛乳頭細胞と、分散された当該原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び当該毛包原基を動物に移植して当該毛包原基から毛を生やすこと、を含み、当該成体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合を変えることにより、当該毛包原基から生える毛の色を変える、再生毛の色制御方法を含む。
また、本方法の他の側面は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、分散された毛乳頭細胞と、分散された当該原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び当該毛包原基を動物に移植して当該毛包原基から毛を生やすこと、を含み、非恒常部をさらに含む当該成体毛包組織を使用することにより、当該毛包原基から、当該非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす、毛の再生方法を含む。
また、本方法のさらに他の側面は、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞を含む原料細胞を使用すること、及び分散された毛乳頭細胞と、分散された当該原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植されることで毛を生やす毛包原基を製造すること、を含み、非恒常部をさらに含む当該成体毛包組織を使用することにより、当該非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす当該毛包原基を製造する、毛包原基の製造方法を含む。
すなわち、本発明の発明者らは、成体毛包組織から得られた細胞を使用して生体外で再構築した毛包原基から生える毛の色を制御する技術的手段について鋭意検討を重ねた結果、意外にも、細胞源として非恒常部を含む成体毛包組織を使用することにより、当該毛包原基から生える毛の色を簡便且つ効果的に制御できることを独自に見出し、本発明を完成するに至った。
ここで、成体毛包組織の構造について説明する。図１Ａには、成体毛包の構造を模式的に示す。また、図１Ｂには、成体マウスから採取された毛包の構造を示す。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、毛幹を包む成体毛包組織は、恒常部と、非恒常部とを含む。
恒常部は、定常部又は不変部とも呼ばれる。恒常部は、成体毛包組織の上側（すなわち、毛幹の先端側）の略半分を占める。恒常部には皮脂腺がある。恒常部は、その皮脂腺より下側（すなわち、毛幹の先端と反対側）に、立毛筋が接着しているバルジ領域を含む。なお、図１Ｂに示すように、マウスにおいては、立毛筋に相当する位置に、リングブルスト(Ｒｉｎｇｗｕｒｓｔ）が存在する。バルジ領域には上皮幹細胞が含まれる。
このため、恒常部のバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた原料細胞は、当該バルジ領域から得られた上皮幹細胞を含む。上皮幹細胞は、例えば、成体毛包組織（特に、バルジ領域）から得られた、ＣＤ３４を発現する細胞として特定される。恒常部はさらに、バルジ領域の下側にサブバルジ領域を含む。サブバルジ領域は、恒常部の最下部を構成する。
非恒常部は、非定常部又は可変部とも呼ばれる。非恒常部は、成体毛包組織の下側の略半分を占める。すなわち、非恒常部は、例えば、成体毛包組織のうち、恒常部のサブバルジ領域より下側の部分である。非恒常部は、毛球部を含む。毛球部は、毛乳頭と毛母とを含む。毛乳頭には毛乳頭細胞が含まれる。毛母には毛母細胞及び色素細胞が含まれる。非恒常部は、毛球部以外の部分（すなわち、恒常部と、毛球部との間の部分）も含む。なお、原料細胞の細胞源としては、毛周期の成長期にある成体毛包組織を使用することが好ましい。
本方法において特徴的なことの一つは、上皮幹細胞を含む原料細胞の細胞源として、非恒常部を含む成体毛包組織を利用する点である。成体毛包組織に含まれる非恒常部は、当該成体毛包組織の非恒常部の一部又は全部であれば特に限られないが、毛乳頭以外の部分を含むこととしてもよく、毛母以外の部分を含むこととしてもよく、毛乳頭及び毛母以外の部分を含むこととしてもよく、毛球部以外の部分を含むこととしてもよい。
成体毛包組織に含まれる非恒常部に対する、毛乳頭以外の部分、毛母以外の部分、毛乳頭及び毛母以外の部分、又は毛球部以外の部分の重量割合は、例えば、５０重量％以上であってもよく、７０重量％以上であってもよく、９０重量％以上であってもよい。
成体毛包組織に含まれる非恒常部は、毛乳頭を含まないこととしてもよく、毛母を含まないこととしてもよく、毛乳頭及び毛母を含まないこととしてもよく、毛球部を含まないこととしてもよい。
成体毛包組織に含まれる非恒常部は、恒常部のサブバルジ領域と、当該非恒常部の毛球部との間の部分の一部又は全部を含むこととしてもよい。
成体毛包組織に含まれる非恒常部に対する、恒常部のサブバルジ領域と、当該非恒常部の毛球部との間の部分の重量割合は、例えば、５０重量％以上であってもよく、７０重量％以上であってもよく、９０重量％以上であってもよい。
上述のように非恒常部を含む成体毛包組織は、上皮幹細胞を含む原料細胞の細胞源として使用するため、恒常部のバルジ領域を含む。原料細胞の細胞源としての成体毛包組織は、サブバルジ領域をさらに含むこととしてもよい。
原料細胞の細胞源として使用する成体毛包組織は、成体動物から採取された毛包組織である。成体動物は、皮膚付属器としての毛包を有する成体であれば特に限られず、ヒトであってもよいし、非ヒト動物（ヒト以外の動物）であってもよい。非ヒト動物は、特に限られないが、非ヒト脊椎動物（ヒト以外の脊椎動物）であることが好ましい。非ヒト脊椎動物は、特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。
本方法で使用する原料細胞は、後述の毛包原基の製造において、毛乳頭細胞と混合して培養する細胞である。原料細胞は、バルジ領域及び非恒常部を含む成体毛包組織に酵素処理を施すことにより得られる。
酵素処理に使用される酵素は、成体毛包組織から原料細胞を遊離させるために有効な酵素（例えば、当該成体毛包組織において当該原料細胞の周囲のマトリクスを分解し、及び／又は当該原料細胞間の結合を切断する分解酵素）であれば特に限られないが、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びトリプシンからなる群より選択される１以上であってもよい。
なお、原料細胞は、毛乳頭細胞から独立して、別途調製される。すなわち、原料細胞の細胞源として使用される成体毛包組織は、毛乳頭細胞の細胞源（例えば、生体毛包組織から分離された毛乳頭）とは別に準備される。そして、毛乳頭細胞の調製とは別に、バルジ領域及び非恒常部を含む成体毛包組織から原料細胞を調製する。
原料細胞は、生体毛包組織のバルジ領域から得られた上皮幹細胞に加え、当該成体毛包組織の非恒常部から得られた細胞を含む。すなわち、原料細胞は、毛乳頭以外の非恒常部から得られた細胞を含むこととしてもよく、毛母以外の非恒常部から得られた細胞を含むこととしてもよく、毛乳頭及び毛母以外の非恒常部から得られた細胞を含むこととしてもよく、毛球部以外の非恒常部から得られた細胞を含むこととしてもよい。
また、原料細胞は、非恒常部から分離された毛乳頭から得られた細胞を含まないこととしてもよく、非恒常部から分離された毛母から得られた細胞を含まないこととしてもよく、非恒常部から分離された毛乳頭及び毛母から得られた細胞を含まないこととしてもよく、非恒常部から分離された毛球部から得られた細胞を含まないこととしてもよい。
また、原料細胞は、毛乳頭から得られた細胞を含まないこととしてもよく、毛母から得られた細胞を含まないこととしてもよく、毛乳頭及び毛母から得られた細胞を含まないこととしてもよく、毛球部から得られた細胞を含まないこととしてもよい。
毛乳頭細胞は、毛包原基の一部を形成できるものであれば特に限られないが、例えば、成体毛包組織の毛乳頭に由来する細胞であってもよく、皮膚組織（胎児、幼体、成体のいずれの皮膚組織であってもよい。）に由来する細胞であってもよく、予め培養された細胞であってもよく、生体外で幹細胞（例えば、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、又は胚性生殖（ＥＧ）細胞）から誘導された細胞であってもよい。毛乳頭細胞は、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現する細胞として特定される。
本方法においては、分散された毛乳頭細胞と、分散された原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造する。すなわち、分散された毛乳頭細胞と、分散された原料細胞とを含む混合細胞懸濁液を培養容器に播種することにより、当該毛乳頭細胞及び原料細胞の混合培養を行う。混合細胞懸濁液は、分散された毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞懸濁液と、分散された原料細胞を含む原料細胞懸濁液とを混合することにより調製される。
なお、分散された細胞とは、他の細胞と結合しておらず、又は数個の細胞と結合しているのみであり、溶液中に分散されて浮遊している細胞である。例えば、細胞懸濁液に含まれる細胞と溶媒とを分離するために、分散された細胞を含む当該細胞懸濁液を遠心する場合、遠心後に形成される当該細胞の沈殿物は、当該細胞の凝集塊であり、当該沈殿物を構成する細胞は、分散された細胞ではない。
毛乳頭細胞懸濁液は、毛乳頭細胞の培養に適した培養液に、当該毛乳頭細胞を分散させることにより調製される。毛乳頭細胞の培養に適した培養液は、特に限られないが、例えば、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を含む培養液を使用することが好ましい。
毛乳頭の培養に使用される培養液に含まれるＦＧＦ２の濃度は、特に限られないが、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ以上であることとしてもよく、３０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、７５ｎｇ／ｍＬ以上であることがより一層好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。
原料細胞懸濁液は、原料細胞の培養に適した培養液に、当該原料細胞を分散させることにより調製される。原料細胞の培養に適した培養液は、上皮幹細胞の培養に適した培養液であることが好ましい。上皮幹細胞の培養に適した培養液は、特に限られず、上皮幹細胞の培養に使用されている公知の培養液を使用してもよい。
混合細胞懸濁液に含まれる毛乳頭細胞と原料細胞との数比は、最終的に毛包原基が製造される範囲内であれば特に限られないが、当該毛乳頭細胞の数に対する当該原料細胞の数の比は、例えば、０．１０以上、１０．００以下であることとしてもよく、０．２０以上、５．００以下であることが好ましく、０．５０以上、２．００以下であることがより好ましく、０．７５以上、１．５０以下であることが特に好ましい。
分散された毛乳頭細胞と分散された原料細胞とを混合培養する培養液は、特に限られないが、例えば、ＦＧＦ２を含む培養液を使用することが好ましい。混合培養に使用される培養液に含まれるＦＧＦ２の濃度は、特に限られないが、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ以上であることとしてもよく、３０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、７５ｎｇ／ｍＬ以上であることがより一層好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養における細胞密度（混合細胞懸濁液の単位体積あたりに含まれる、毛乳頭細胞と原料細胞との合計数）は、毛包原基が形成される範囲内であれば特に限られないが、例えば、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることとしてもよく、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養に使用する培養容器は、特に限られないが、例えば、細胞非接着性の培養容器が好ましく使用される。細胞非接着性の培養容器は、細胞非接着性の表面を有する培養容器である。すなわち、例えば、培養容器が、基材の表面に形成された凹部（有底穴）である場合、当該凹部は、細胞非接着性の底面を有し、細胞非接着性の側面をさらに有することが好ましい。
細胞非接着性の表面は、培養される細胞が接着して伸展しない表面である。すなわち、細胞非接着性の表面を有する培養容器で培養された細胞は、当該表面に弱く接着することはあるが、当該表面に伸展はしない。このため、細胞非接着性表面に接着した細胞は、例えば、酵素処理やキレート処理を行うことなく、培養液を流動させることにより、当該表面から脱離して浮遊する。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養に使用する培養容器は、例えば、酸素透過性が比較的大きい基材の表面に形成された凹部であることが好ましい。すなわち、培養容器としては、例えば、酸素透過率が１００ｃｍ３／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上の基材に形成された凹部であることとが好ましく、酸素透過率が５００ｃｍ３／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上の基材に形成された凹部であることとがより好ましく、酸素透過率が１０００ｃｍ３／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上の基材に形成された凹部であることとが特に好ましい。
酸素透過性が大きい基材を構成する材料としては、例えば、シリコン系材料（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ））が好ましく使用される。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養に使用する培養容器として、基材の表面に形成された凹部を使用する場合、当該凹部の容積や、当該凹部の底面の形状及び面積は特に限られない。凹部の容積は、例えば、１ｎＬ以上、１ｍＬ以下であることとしてもよく、１０ｎＬ以上、１００μＬ以下であることが好ましく、１００ｎＬ以上、１０μＬ以下であることが特に好ましい。凹部の底面の形状は、例えば、円形、楕円形、又は多角形であることとしてもよい。凹部の底面の面積は、例えば、１μｍ２以上、１００ｍｍ２以下であることとしてもよく、１０μｍ２以上、１０ｍｍ２以下であることが好ましく、１００μｍ２以上、１ｍｍ２以下であることが特に好ましい。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養に使用する培養容器としては、基材の表面に規則的に形成された複数の凹部（例えば、一定の間隔で直線的又は網目状に配置された複数の凹部）を使用することとしてもよい。
毛乳頭細胞と原料細胞との混合培養時間は、毛包原基を形成できる範囲内であれば特に限られないが、例えば、１２時間以上、１０日以下であってもよく、１日以上、７日以下であることが好ましい。培養温度は、毛包原基を形成できる範囲内であれば特に限られないが、例えば、２５℃以上、４０℃以下であることとしてもよく、３５℃以上、３９℃以下であることが好ましい。
混合細胞懸濁液中で、混合された毛乳頭細胞及び原料細胞を培養することにより、当該毛乳頭細胞の凝集部と、当該原料細胞の凝集部とを含む複合細胞凝集体である、毛包原基が形成される。
すなわち、この毛包原基は、毛乳頭細胞が互いに結合し凝集することにより形成された毛乳頭細胞凝集部と、原料細胞が互いに結合し凝集することにより形成された原料細胞凝集部とを含む。原料細胞凝集部は、上皮幹細胞が互いに結合し凝集して形成された上皮幹細胞凝集部を含んでもよい。
毛包原基において、毛乳頭細胞凝集部の一部と原料細胞凝集部の一部とは結合している。すなわち、毛乳頭細胞凝集部に含まれる一部の毛乳頭細胞と、原料細胞凝集部に含まれる一部の原料細胞とが結合している。この場合、毛乳頭細胞凝集部に含まれる一部の毛乳頭細胞と、原料細胞凝集部に含まれる一部の上皮幹細胞とが結合していてもよい。
本方法における毛包原基の形成は、毛乳頭細胞及び原料細胞が分散され、且つ混合された状態で培養を開始した後、当該毛乳頭細胞同士が結合して自発的に凝集し、且つ当該原料細胞同士（例えば、上皮幹細胞同士）が結合して自発的に凝集するとともに、一部の毛乳頭細胞と一部の原料細胞（例えば、一部の上皮幹細胞）とが結合することにより、達成される。
本方法において形成される毛包原基の形状は、特に限られないが、例えば、球状、又は長球状であることとしてもよい。本方法において形成される毛包原基の体積は、特に限られないが、例えば、１×１０－５ｍｍ３以上、１０ｍｍ３以下であることとしてもよく、１×１０－４ｍｍ３以上、１ｍｍ３以下であることが好ましく、１×１０－３ｍｍ３以上、０．１ｍｍ３以下であることが特に好ましい。
毛包原基に含まれる細胞の密度（毛包原基の単位体積あたりに含まれる細胞の合計数）は、特に限られないが、例えば、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上、７．０×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であることとしてもよく、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上、６．５×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であることが好ましく、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上、５．０×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であることが特に好ましい。
本方法においては、分散された毛乳頭細胞と、分散された原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植されることで毛を生やす毛包原基を製造する。すなわち、本方法における混合培養で形成された毛包原基は、後述するように、動物に移植することができ、且つ当該動物に移植された後に、当該毛包原基から毛が生える。
本方法において、製造された毛包原基を動物に移植して当該毛包原基から毛を生やす場合、当該動物は特に限られず、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物は特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。
毛包原基の動物への移植は、当該動物の皮膚への移植であることが好ましい。皮膚への移植は、例えば、皮下移植であってもよいし、皮内移植であってもよい。
本方法における毛包原基の製造及びその動物への移植は、医学的用途であってもよいし、研究用途であってもよい。すなわち、本方法においては、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防のために、当該疾患を患っている又は患う可能性のあるヒト患者に移植する目的で毛包原基を製造し、又は当該毛包原基を当該ヒト患者に移植することとしてもよい。
脱毛を伴う疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
また、本方法においては、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防に使用され得る物質の探索、及び／又は当該疾患の機構に関与する物質の探索のために、毛包原基を製造し、又は当該毛包原基を非ヒト動物に移植することとしてもよい。
そして、本実施形態に係る再生毛の色制御方法においては、成体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合（すなわち、原料細胞の細胞源として使用される成体毛包組織の重量に対する、当該成体毛包組織に含まれる非恒常部の重量の割合）を変えることにより、毛包原基から生える毛の色を変える。
具体的に、例えば、成体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合を増加させることにより、移植された毛包原基から生える毛の色を濃くする。ここで、毛の色の濃さは、目視でも評価できるが、例えば、当該毛の単位重量当たりに含まれるメラニン色素の量として、定量的に評価してもよい。毛に含まれるメラニン色素の定量は、例えば、測定対象となる当該毛を水酸化ナトリウム溶液中で６０℃３０分間インキュベートしてメラニンを抽出し、次いで、吸光度計を用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定することで、抽出された当該メラニンを定量することができる。
また、本実施形態に係る毛の再生方法においては、非恒常部を含む成体毛包組織を使用することにより、移植された毛包原基から、当該非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす。
すなわち、例えば、毛乳頭以外の部分を含む非恒常部、毛母以外の部分を含む非恒常部、毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部、又は毛球部以外の部分を含む非恒常部を含む成体毛包組織から得られた原料細胞を使用して製造された第一の毛包原基を動物に移植することにより、当該非恒常部を含まない成体毛包組織から得られた原料細胞を使用して製造された第二の毛包原基を動物に移植する場合に比べて、色が濃い毛を当該移植された第一の毛包原基から生やす。
また、非恒常部を第一の重量割合で含む第一の成体毛包組織を使用して製造された第一の毛包原基を動物に移植して、当該第一の毛包原基から第一の色の毛を生やすとともに、当該非恒常部を当該第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む第二の成体毛包組織を使用して製造された第二の毛包原基を動物に移植して、当該第二の毛包原基から当該第一の色より濃い第二の色の毛を生やすこととしてもよい。
この場合、原料細胞の細胞源として使用する生体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合として、複数の重量割合を採用することにより、移植された複数の毛包原基から、色の濃さが異なる複数の毛を生やすことができる。
また、本実施形態に係る毛包原基の製造方法においては、非恒常部を含む成体毛包組織を使用することにより、当該非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす毛包原基を製造する。
すなわち、例えば、毛乳頭以外の部分を含む非恒常部、毛母以外の部分を含む非恒常部、毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部、又は毛球部以外の部分を含む非恒常部を含む成体毛包組織から得られた原料細胞を使用することにより、当該恒常部を含まない成体毛包組織から得られた原料細胞を使用する場合に比べて、動物に移植されることで色が濃い毛を生やす毛包原基を製造する。
また、非恒常部を第一の重量割合で含む第一の成体毛包組織を使用することにより、動物に移植されることで第一の色の毛を生やす第一の毛包原基を製造するとともに、当該非恒常部を当該第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む第二の成体毛包組織を使用することにより、当該動物に移植されることで当該第一の色より濃い第二の色の毛を生やす第二の毛包原基を製造する。
この場合、原料細胞の細胞源として使用する生体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合として、複数の重量割合を採用することにより、移植された場合に色の濃さが異なる毛を生やす複数の毛包原基を製造することができる。
生体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合は、０％以上、１００％以下の範囲内であれば特に限られない。すなわち、第一の重量割合が０％である場合（すなわち、非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合）、第二の重量割合は、例えば、５％以上であることとしてもよく、１０％以上であることとしてもよく、２０％以上であることとしてもよく、３０％以上であることとしてもよい。通常、生体毛包組織から非恒常部を除去しない場合（すなわち、生体毛包組織が恒常部及び非恒常部の全部を含む場合）、当該成体毛包組織の重量に対する、当該非恒常部の重量の割合は、４０％程度となる。
なお、本方法において、生体毛包組織に含まれる非恒常部の重量割合が０％である場合、すなわち、原料細胞の細胞源として非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合、上述のようにして、分散された毛乳頭細胞と、分散された当該原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植された場合に白色の毛が生える毛包原基を製造することができる。
すなわち、本方法によれば、バルジ領域に加え、サブバルジ領域を含む成体毛包組織から得られた原料細胞を使用することにより、実質的に着色されていない毛が生える毛包原基が製造される。
したがって、例えば、このように白色の毛が生える条件と、着色された毛が生える条件とを採用する場合、本方法は、毛の色の制御に関する知見を得るための研究ツールとして利用することができる。また、本方法は、白色の毛を人工的に製造するために利用することもできる。
また、第一の重量割合が０％超である場合、当該第一の重量割合に対する第二の重量割合の比は、１超であれば特に限られないが、例えば、１．５以上であることとしてもよく、２．０以上であることとしてもよく、５．０以上であることとしてもよく、１０．０以上であることとしてもよい。
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
［毛乳頭細胞の採取］
成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取した。すなわち、まず７週齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭を切り分けた。この毛乳頭を１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼと４．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で４０分間、酵素処理を行った。酵素処理によって毛乳頭から単離された細胞を培養ディッシュに播種して、１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で培養した。培養後の細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、実験に使用した。
成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取した。すなわち、まず７週齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭を切り分けた。この毛乳頭を１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼと４．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で４０分間、酵素処理を行った。酵素処理によって毛乳頭から単離された細胞を培養ディッシュに播種して、１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で培養した。培養後の細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、実験に使用した。
［原料細胞の採取］
バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。すなわち、まず７週齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭及び毛母を除去した。毛乳頭及び毛母が除去された毛包組織を、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼと４．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で１０分間、酵素処理を行った。その後、毛包組織を、ＤＭＥＭ培地にＨＥＰＥＳを混合して調製されたＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ培地中に移し、当該毛包組織からコラーゲン鞘を取り除いた。さらに、毛包組織にトリプシン溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で６０分間、酵素処理を行った。その後、酵素処理によって毛包組織から単離された細胞をピペッティングで分散させ、さらに７０μｍセルストレーナーによる単一化処理を施し、得られた細胞を実験に使用した。
バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。すなわち、まず７週齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭及び毛母を除去した。毛乳頭及び毛母が除去された毛包組織を、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼと４．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で１０分間、酵素処理を行った。その後、毛包組織を、ＤＭＥＭ培地にＨＥＰＥＳを混合して調製されたＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ培地中に移し、当該毛包組織からコラーゲン鞘を取り除いた。さらに、毛包組織にトリプシン溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で６０分間、酵素処理を行った。その後、酵素処理によって毛包組織から単離された細胞をピペッティングで分散させ、さらに７０μｍセルストレーナーによる単一化処理を施し、得られた細胞を実験に使用した。
［培養毛乳頭細胞の顕微鏡観察］
図２Ａ及び図２Ｂには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で２日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。また、図２Ｃ及び図２Ｄには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で９日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図２Ａ～図２Ｄのいずれにおいても、毛乳頭から同心円状に広がるように細胞が増殖する様子が観察された。
図２Ａ及び図２Ｂには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で２日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。また、図２Ｃ及び図２Ｄには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で９日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図２Ａ～図２Ｄのいずれにおいても、毛乳頭から同心円状に広がるように細胞が増殖する様子が観察された。
［毛乳頭細胞及び上皮幹細胞の特定］
図３Ａには、上述のようにして成体毛包組織の毛乳頭から採取され培養された細胞に、毛乳頭細胞のマーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎの免疫組織化学染色を施して、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。図３Ａに示すように、Ｖｅｒｓｉｃａｎ／ＤＡＰＩの蛍光二重染色によって、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現する細胞の存在が確認された（図中の矢印は、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現する細胞の一つを指している。）。すなわち、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞が得られたことが確認された。
図３Ａには、上述のようにして成体毛包組織の毛乳頭から採取され培養された細胞に、毛乳頭細胞のマーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎの免疫組織化学染色を施して、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。図３Ａに示すように、Ｖｅｒｓｉｃａｎ／ＤＡＰＩの蛍光二重染色によって、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現する細胞の存在が確認された（図中の矢印は、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現する細胞の一つを指している。）。すなわち、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞が得られたことが確認された。
図３Ｂには、上述のようにして毛乳頭及び毛母が除去された成体毛包組織から採取された細胞に、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質であるＣＤ３４の免疫組織化学染色を施して、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。図３Ｂに示すように、ＣＤ３４／ＤＡＰＩの蛍光二重染色によって、ＣＤ３４を発現する細胞の存在が確認された（図中の矢印は、ＣＤ３４を発現する細胞の一つを指している。）。すなわち、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた原料細胞には、上皮幹細胞が含まれていることが確認された。
［マルチウェル培養容器の作製］
毛乳頭細胞と原料細胞とを共培養するためのマルチウェル培養容器を、上述した特許文献２と同様にして作製した。すなわち、まずＣＡＤソフト（Ｖ Ｃａｒｖｅ Ｐｒｏ ６．５）を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン、日新レジン株式会社製）を流し込み、１日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を２４ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込んで固化し、その後、離型することで、ＰＤＭＳ基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル（各ウェルの直径は１ｍｍ、深さは１ｍｍ）を有するマルチウェル培養容器（以下、「ＰＤＭＳスフェロイドチップ」という。）を作製した。
毛乳頭細胞と原料細胞とを共培養するためのマルチウェル培養容器を、上述した特許文献２と同様にして作製した。すなわち、まずＣＡＤソフト（Ｖ Ｃａｒｖｅ Ｐｒｏ ６．５）を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン、日新レジン株式会社製）を流し込み、１日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を２４ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込んで固化し、その後、離型することで、ＰＤＭＳ基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル（各ウェルの直径は１ｍｍ、深さは１ｍｍ）を有するマルチウェル培養容器（以下、「ＰＤＭＳスフェロイドチップ」という。）を作製した。
このＰＤＭＳスフェロイドチップは、酸素透過性に優れたＰＤＭＳ製の基板にウェルが形成されているため、当該ウェル内で培養される細胞、及び細胞凝集塊には、培養期間を通じて、適切な量の酸素が供給された。
［毛乳頭細胞の採取］
上述の実施例１と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
上述の実施例１と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
［原料細胞の採取］
上述の実施例１と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞（本実施例において「原料細胞（Ｆｕｌｌ）」という。）を採取した。
上述の実施例１と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞（本実施例において「原料細胞（Ｆｕｌｌ）」という。）を採取した。
また、非恒常部が除去された成体毛包組織（すなわち、バルジ領域及びサブバルジ領域を含み、非恒常部を含まない成体毛包組織）から、上皮幹細胞を含む原料細胞（本実施例において「原料細胞（１／２）」という。）を採取した。すなわち、まず７週齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包の恒常部より下側の部分（すなわち、サブバルジ領域より下の部分）を切断することにより、当該髭毛包から毛乳頭及び毛母を含む非恒常部を除去した。
次いで、非恒常部が除去された毛包組織を、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼと４．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で１０分間、酵素処理を行った。その後、毛包組織を、ＤＭＥＭ培地にＨＥＰＥＳを混合して調製されたＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ培地中に移し、当該毛包組織からコラーゲン鞘を取り除いた。さらに、毛包組織にトリプシン溶液に浸漬して、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で６０分間、酵素処理を行った。その後、酵素処理によって毛包組織から単離された細胞をピペッティングで分散させ、さらに７０μｍセルストレーナーによる単一化処理を施し、得られた細胞を「原料細胞（１／２）」として実験に使用した。
［毛包原基の製造］
毛包原基の培養に使用する培地として、間葉細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ））とＨｕＭｅｄｉａＫＧ２培地とを体積比１：１で混合し、ＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍＬ添加することにより、混合培地を調製した。
毛包原基の培養に使用する培地として、間葉細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ））とＨｕＭｅｄｉａＫＧ２培地とを体積比１：１で混合し、ＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍＬ添加することにより、混合培地を調製した。
上述のようにして得られた毛乳頭細胞を混合培地に分散して、毛乳頭細胞懸濁液を調製した。また、上述のようにして得られた原料細胞を混合培地に分散して、原料細胞懸濁液を調製した。そして、毛乳頭細胞懸濁液と原料細胞懸濁液とを混合して、分散された毛乳頭細胞及び原料細胞を含む混合細胞懸濁液を調製した。
上述のようにして作製したマルチウェル培養容器の各ウェルに、毛乳頭細胞及び毛包上皮幹細胞それぞれの細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（全細胞数２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）となるように、混合細胞懸濁液を播種し、ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で３日間、培養を行った。
培養３日目にウェル内を位相差顕微鏡で観察したところ、当該ウェル内に播種された細胞が凝集して球状の細胞凝集塊（いわゆるスフェロイドと呼ばれる。）が形成されていることが確認された。なお、予備的な検討において、この細胞凝集塊は、主に毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞凝集部と、当該毛乳頭細胞凝集部と結合し、主に上皮幹細胞を含む上皮系細胞凝集部とを含むことが確認された。
このような細胞凝集塊の形成は、上述のように、分散された毛乳頭細胞と、分散された原料細胞とを混合して、非接着性の培養容器内で培養することにより、例えば、同種の細胞同士が自発的に集合して各細胞凝集部を形成することにより達成されるものと推測される。
［毛包原基の移植］
３日間の培養により形成された毛包原基を回収し、注射器を用いて、５週齢のＳＣＩＤ－ｎｕマウスの皮下に直接注入することにより、当該毛包原基を移植した。
３日間の培養により形成された毛包原基を回収し、注射器を用いて、５週齢のＳＣＩＤ－ｎｕマウスの皮下に直接注入することにより、当該毛包原基を移植した。
［再生毛の観察］
移植後３週間目に、マウスの皮下に移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。
移植後３週間目に、マウスの皮下に移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。
図４Ａ及び図４Ｂには、それぞれ原料細胞（１／２）を使用して製造された毛包原基、及び原料細胞（Ｆｕｌｌ）を使用して製造された毛包原基を観察した結果を示す。各図において、矢印は、移植された毛包原基から生えた毛を指している。
図４Ａに示すように、非恒常部を含まない成体毛包組織から得られた原料細胞（１／２）を使用して製造された毛包原基からは、白色の毛が生えていることが確認された。一方、図４Ｂに示すように、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部を含む成体毛包組織から得られた原料細胞（Ｆｕｌｌ）を使用して製造された毛包原基からは、着色された黒っぽい毛が生えていることが確認された。
すなわち、毛乳頭及び毛母以外の非恒常部を含む成体毛包組織から得られた原料細胞（Ｆｕｌｌ）を使用することにより、非恒常部を含まない成体毛包組織から得られた原料細胞（１／２）を使用する場合よりも色が濃い毛が生える毛包原基を製造できることが確認された。
このように、原料細胞の細胞源である成体毛包組織における非恒常部（特に、毛乳頭及び毛母以外の非恒常部）の含有量が、当該原料細胞を使用して形成される毛包原基から生える毛の色を変化させるメカニズムは明らかではないが、例えば、当該非恒常部の含有量によって、当該毛包原基に含まれる、色素細胞等の毛色を制御する細胞の含有量及び／又は分布が変化することによるものと推測される。
［毛乳頭細胞の採取］
上述の実施例１と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
上述の実施例１と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
［原料細胞の採取］
上述の実施例１と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。
上述の実施例１と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。
［毛包原基の製造］
毛包原基の培養に使用する培地として、上述の実施例２で使用した混合培地にＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬ添加したＦＧＦ２含有混合培地を使用したこと以外は上述の実施例２と同様にして、マルチウェル培養容器を使用して、毛包原基を製造した。
毛包原基の培養に使用する培地として、上述の実施例２で使用した混合培地にＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬ添加したＦＧＦ２含有混合培地を使用したこと以外は上述の実施例２と同様にして、マルチウェル培養容器を使用して、毛包原基を製造した。
［毛包原基の顕微鏡観察］
図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む混合培地中の培養で形成された毛包原基を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図５Ａ～図５Ｃにおけるスケールバーは５００μｍを示す。
図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む混合培地中の培養で形成された毛包原基を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図５Ａ～図５Ｃにおけるスケールバーは５００μｍを示す。
図５Ｄ、図５Ｅ及び図５Ｆには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む混合培地中の培養で形成された毛包原基を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図５Ｄ～図５Ｆにおけるスケールバーは１ｍｍを示す。
図５Ａ～図５Ｆに示すように、３日間の培養で形成された毛包原基の形態は、混合培地のＦＧＦ２含有量によって違いは見られなかった。
［発毛に関する遺伝子発現の解析］
３日間の培養で形成された毛包原基における発毛マーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ－１０ｂ）の発現について、ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。すなわち、まず毛包原基からＲＮＡを抽出した。具体的に、毛包原基を１５ｍＬチューブに回収し、当該毛包原基が沈殿したら、溶液の体積が１ｍＬとなるように上清を除去した。次いで、毛包原基を含む溶液１ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し替えて、４℃、５０００ｒｐｍで、３分間遠心した。
３日間の培養で形成された毛包原基における発毛マーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ－１０ｂ）の発現について、ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。すなわち、まず毛包原基からＲＮＡを抽出した。具体的に、毛包原基を１５ｍＬチューブに回収し、当該毛包原基が沈殿したら、溶液の体積が１ｍＬとなるように上清を除去した。次いで、毛包原基を含む溶液１ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し替えて、４℃、５０００ｒｐｍで、３分間遠心した。
遠心後の溶液の上清を捨てた後、３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴを加え、よくピペッティングした。さらに、ピペッティング後の溶液をＱＩＡ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに回収し、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。ＱＩＡ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムの上部を捨て、コレクションチューブ内の溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加えた。溶液をＲＮｅａｓｙスピンカラムに移し、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。
コレクションチューブ内の濾液を捨て、７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１を加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。コレクションチューブ内の濾液を捨て、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。コレクションチューブ内の濾液を捨て、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを加え、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。遠心後のカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブに移し、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。これは、残存するＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを除去するために行った。
遠心後のカラムを１ｍＬマイクロチューブに移し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。遠心後のカラムが設置された１ｍＬマイクロチューブに、再度ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心し、ＲＮＡ溶解液を得た。
次いで、分光光度計によりＲＮＡ濃度を測定した。すなわち、分光光度計（Ｎａｎｏ Ｖｕｅ）の電源を付け、希釈率を６０．０に設定した。ここで、希釈率とは、ＲＮＡ抽出における最終容量である。測定板を７０％エタノールで拭いた後、２μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを当該測定板の中心にアプライし、［ＯＡ／１００％Ｔ］のボタンを押した。この操作でベースラインを得た。
上述のようにして毛包原基から得られたＲＮＡ溶解液２μＬを測定板の中心にアプライし、測定ボタンを押した。Ａ２６０／Ａ２８０はサンプルの純度を表し、２．０に近い方が好ましい。
その後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。すなわち、上述のようにしてＲＮＡ濃度を測定したＲＮＡ溶解液を、そのＲＮＡ濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。希釈後のＲＮＡ溶解液を、６５℃で、５分間インキュベートし、氷上で冷却した。
その後、２μＬのＲＮＡ溶解液と、１２μＬのＮｕｃｌｅａｒ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒと、４μＬの５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒと、１μＬのＰｒｉｍｉｅｒ ｍｉｘと、１μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘとをマイクロチューブに入れて、透明フィルムで覆った。
マイクロチューブをサーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。その後、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の逆転写反応を行い、毛包原基由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを得た。
その後、１μＬのｃＤＮＡ（毛包原基由来のＲＮＡの逆転写産物）と、１０μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと、０．４μＬのＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒと、０．４μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒと、０．４μＬのＤｙｅと、７．８μＬのＮｕｃｌｅａｒ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒとをマイクロチューブに入れて、透明フィルムで覆った。
なお、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列は、Ｖｅｒｓｉｃａｎについて、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＧＡＣＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＧ－３’」、Ｗｎｔ－１０ｂについて、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧ－３’」、コントロールとして用いたＧＡＰＤＨについて、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’」であった。
マイクロチューブをサーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。その後、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間、のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ－１０ｂの相対的な発現量を算出した。
図６Ａ及び図６Ｂには、それぞれ毛包原基におけるＶｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ－１０ｂの相対的な遺伝子発現量を示す。図６Ａ及び図６Ｂより、毛包原基におけるＶｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ－１０ｂの遺伝子発現量が、培地のＦＧＦ２濃度に依存して増加する傾向が確認された。
［毛包原基の移植］
３日間の培養により形成された毛包原基を回収し、パッチ法で、５週齢のＳＣＩＤ－ｎｕマウスの皮膚に移植した。すなわち、マウスの皮膚の真皮又は筋膜の付近に複数の毛包原基を注入した。
３日間の培養により形成された毛包原基を回収し、パッチ法で、５週齢のＳＣＩＤ－ｎｕマウスの皮膚に移植した。すなわち、マウスの皮膚の真皮又は筋膜の付近に複数の毛包原基を注入した。
［再生毛の観察］
移植後６週間目に、マウスに移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。図７Ａ及び図７Ｂには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で形成された毛包原基を観察した結果を示す。各図において、矢印は、移植された毛包原基を指している。
移植後６週間目に、マウスに移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。図７Ａ及び図７Ｂには、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で形成された毛包原基を観察した結果を示す。各図において、矢印は、移植された毛包原基を指している。
図７Ａ及び図７Ｂより、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む培地中で形成された毛包原基に比べて、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む培地中で形成された毛包原基の方が、より高い毛髪再生能を示すことが確認された。
Claims (6)
- 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び
前記毛包原基を非ヒト動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、
を含み、
前記成体毛包組織に含まれる前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部の重量割合を変えることにより、前記毛包原基から生える毛の色を変える、再生毛の色制御方法。 - 前記成体毛包組織に含まれる前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部の重量割合を増加させることにより、前記毛包原基から生える毛の色を濃くする、請求項１に記載の再生毛の色制御方法。
- 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び
前記毛包原基を非ヒト動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、
を含み、
前記 毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記毛包原基から、前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす、毛の再生方法。 - 前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を第一の重量割合で含む第一の成体毛包組織を使用して製造された第一の毛包原基を前記動物に移植して、前記第一の毛包原基から第一の色の毛を生やすこと、及び
前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む第二の成体毛包組織を使用して製造された第二の毛包原基を前記動物に移植して、前記第二の毛包原基から前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やすこと、
を含む、請求項３に記載の毛の再生方法。 - 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、及び
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植されることで毛を生やす毛包原基を製造すること、
を含み、
前記 毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす前記毛包原基を製造する、毛包原基の製造方法。 - 前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を第一の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで第一の色の毛を生やす第一の毛包原基を製造すること、及び
前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やす第二の毛包原基を製造すること、
を含む、請求項５に記載の毛包原基の製造方法。
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