JP7158676B2 - 再生毛の色制御方法、毛の再生方法及び毛包原基の製造方法 - Google Patents
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Description
成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取した。すなわち、まず7週齢の成体C57BL/6マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭を切り分けた。この毛乳頭を100U/mLのコラゲナーゼと4.8U/mLのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、CO2インキュベータ内、37℃で40分間、酵素処理を行った。酵素処理によって毛乳頭から単離された細胞を培養ディッシュに播種して、10ng/mL又は100ng/mLのFGF2を含む培地中で培養した。培養後の細胞をトリプシン-EDTA溶液を用いて回収し、実験に使用した。
バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。すなわち、まず7週齢の成体C57BL/6マウスより髭を採取し、当該髭の周囲の脂肪組織を取り除いた。次いで、髭毛包より毛乳頭及び毛母を除去した。毛乳頭及び毛母が除去された毛包組織を、100U/mLのコラゲナーゼと4.8U/mLのディスパーゼとを含む酵素溶液に浸漬して、CO2インキュベータ内、37℃で10分間、酵素処理を行った。その後、毛包組織を、DMEM培地にHEPESを混合して調製されたDMEM/HEPES培地中に移し、当該毛包組織からコラーゲン鞘を取り除いた。さらに、毛包組織にトリプシン溶液に浸漬して、CO2インキュベータ内、37℃で60分間、酵素処理を行った。その後、酵素処理によって毛包組織から単離された細胞をピペッティングで分散させ、さらに70μmセルストレーナーによる単一化処理を施し、得られた細胞を実験に使用した。
図2A及び図2Bには、それぞれ10ng/mL及び100ng/mLのFGF2を含む培地中で2日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。また、図2C及び図2Dには、それぞれ10ng/mL及び100ng/mLのFGF2を含む培地中で9日間培養した毛乳頭細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図2A~図2Dのいずれにおいても、毛乳頭から同心円状に広がるように細胞が増殖する様子が観察された。
図3Aには、上述のようにして成体毛包組織の毛乳頭から採取され培養された細胞に、毛乳頭細胞のマーカータンパク質であるVersicanの免疫組織化学染色を施して、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。図3Aに示すように、Versican/DAPIの蛍光二重染色によって、Versicanを発現する細胞の存在が確認された(図中の矢印は、Versicanを発現する細胞の一つを指している。)。すなわち、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞が得られたことが確認された。
毛乳頭細胞と原料細胞とを共培養するためのマルチウェル培養容器を、上述した特許文献2と同様にして作製した。すなわち、まずCADソフト(V Carve Pro 6.5)を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂(クリスタルリジン、日新レジン株式会社製)を流し込み、1日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を24ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を流し込んで固化し、その後、離型することで、PDMS基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル(各ウェルの直径は1mm、深さは1mm)を有するマルチウェル培養容器(以下、「PDMSスフェロイドチップ」という。)を作製した。
上述の実施例1と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
上述の実施例1と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞(本実施例において「原料細胞(Full)」という。)を採取した。
毛包原基の培養に使用する培地として、間葉細胞培養培地(DMEM+10%FBS+1%P/S(Penicillin-Streptomycin))とHuMediaKG2培地とを体積比1:1で混合し、FGF2を10ng/mL添加することにより、混合培地を調製した。
3日間の培養により形成された毛包原基を回収し、注射器を用いて、5週齢のSCID-nuマウスの皮下に直接注入することにより、当該毛包原基を移植した。
移植後3週間目に、マウスの皮下に移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。
上述の実施例1と同様に、成体毛包組織の毛乳頭から毛乳頭細胞を採取し培養した。
上述の実施例1と同様に、バルジ領域を含む恒常部と、毛乳頭及び毛母が除去された非恒常部とを含む成体毛包組織から、上皮幹細胞を含む原料細胞を採取した。
毛包原基の培養に使用する培地として、上述の実施例2で使用した混合培地にFGF2を10ng/mL、50ng/mL、又は100ng/mL添加したFGF2含有混合培地を使用したこと以外は上述の実施例2と同様にして、マルチウェル培養容器を使用して、毛包原基を製造した。
図5A、図5B及び図5Cには、それぞれ10ng/mL、50ng/mL、及び100ng/mLのFGF2を含む混合培地中の培養で形成された毛包原基を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図5A~図5Cにおけるスケールバーは500μmを示す。
3日間の培養で形成された毛包原基における発毛マーカー遺伝子(Versican及びWnt-10b)の発現について、RT-PCR解析を行った。すなわち、まず毛包原基からRNAを抽出した。具体的に、毛包原基を15mLチューブに回収し、当該毛包原基が沈殿したら、溶液の体積が1mLとなるように上清を除去した。次いで、毛包原基を含む溶液1mLを1.5mLマイクロチューブに移し替えて、4℃、5000rpmで、3分間遠心した。
3日間の培養により形成された毛包原基を回収し、パッチ法で、5週齢のSCID-nuマウスの皮膚に移植した。すなわち、マウスの皮膚の真皮又は筋膜の付近に複数の毛包原基を注入した。
移植後6週間目に、マウスに移植された毛包原基をデジタルマイクロスコープにより観察した。図7A及び図7Bには、それぞれ10ng/mL及び100ng/mLのFGF2を含む培地中で形成された毛包原基を観察した結果を示す。各図において、矢印は、移植された毛包原基を指している。
Claims (6)
- 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び
前記毛包原基を非ヒト動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、
を含み、
前記成体毛包組織に含まれる前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部の重量割合を変えることにより、前記毛包原基から生える毛の色を変える、再生毛の色制御方法。 - 前記成体毛包組織に含まれる前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部の重量割合を増加させることにより、前記毛包原基から生える毛の色を濃くする、請求項1に記載の再生毛の色制御方法。
- 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、毛包原基を製造すること、及び
前記毛包原基を非ヒト動物に移植して前記毛包原基から毛を生やすこと、
を含み、
前記 毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記毛包原基から、前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす、毛の再生方法。 - 前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を第一の重量割合で含む第一の成体毛包組織を使用して製造された第一の毛包原基を前記動物に移植して、前記第一の毛包原基から第一の色の毛を生やすこと、及び
前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む第二の成体毛包組織を使用して製造された第二の毛包原基を前記動物に移植して、前記第二の毛包原基から前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やすこと、
を含む、請求項3に記載の毛の再生方法。 - 恒常部のバルジ領域と毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部とを含む成体毛包組織から得られた、上皮幹細胞と前記非恒常部由来の細胞とを含む原料細胞を使用すること、及び
分散された毛乳頭細胞と、分散された前記原料細胞とを混合して培養することにより、動物に移植されることで毛を生やす毛包原基を製造すること、
を含み、
前記 毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部をさらに含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を含まない成体毛包組織を使用する場合に比べて色が濃い毛を生やす前記毛包原基を製造する、毛包原基の製造方法。 - 前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を第一の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで第一の色の毛を生やす第一の毛包原基を製造すること、及び
前記毛乳頭及び毛母以外の部分を含む非恒常部を前記第一の重量割合より大きい第二の重量割合で含む前記成体毛包組織を使用することにより、前記動物に移植されることで前記第一の色より濃い第二の色の毛を生やす第二の毛包原基を製造すること、
を含む、請求項5に記載の毛包原基の製造方法。
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