KR20090109564A

KR20090109564A - 간엽계 세포의 제조방법, 이빨의 제조방법 및 이빨 형성용 간엽계 세포

Info

Publication number: KR20090109564A
Application number: KR1020097017305A
Authority: KR
Inventors: 다카시 츠지; 리츠코 모리타
Original assignee: 가부시키가이샤 오간 테크놀로지즈
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2009-10-20
Also published as: WO2008090826A1; RU2465325C2; US8574904B2; JP2008200033A; EP2119768A1; US20100119997A1; AU2008208433A1; TW200844234A; CN101842477A; RU2009130630A; AU2008208433B2; EP2119768A4; CN101842477B; CA2676174A1; JP5069572B2

Abstract

본 발명은 이빨을 형성하기 위해 사용되는 간엽계 세포를 제조하는 간엽계 세포의 제조방법으로서, 전능성 줄기세포를 분화 유도제의 존재하에서 배양하여 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 분화 유도 처리후의 세포 집단을 생성하는 것, 상기 분화 유도 처리후의 세포 집단에서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를, 이빨 형성용 간엽계 세포로서 선별하는 것을 포함한 간엽계 세포의 제조방법을 제공한다. 또 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 하나로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 어느 다른 하나로만 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를, 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 지지 담체의 내부에 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하여 배양하는 것을 포함하고, 상기 간엽계 세포를, 상기 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 것으로 하는 이빨의 제조방법을 제공한다.

Description

간엽계 세포의 제조방법, 이빨의 제조방법 및 이빨 형성용 간엽계 세포{Method for production of mesenchymal cell, method for production of tooth, and mesenchymal cell for formation of tooth}

본 발명은, 이빨을 형성하기 위해 사용되는 간엽계 세포의 제조방법, 이빨의 제조방법 및 이빨 형성용 간엽계 세포에 관한 것이다.

이빨은 최외층에 에나멜질, 그 내층에 상아질이라는 경(硬)조직을 가지고, 또 상아질 안쪽에 상아질을 생산하는 상아 아(芽)세포, 더 중심부에 치수(齒髓)를 가진 기관으로서, 충치나 치주병 등에 의해 소실될 수 있는 기관이다. 일반적으로 이빨의 손실에 대해서는 생명에 대한 위협이 적다고 생각되고 있기 때문에 현재는 주로 의치나 임플란트로 보충하는 경우가 많다. 그러나 이빨의 유무는 외관이나 음식물의 미각에 크게 영향을 주고 또 건강 유지나 질 높은 생활을 유지한다는 관점에서 이빨의 재생 기술의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

이빨은, 태아기의 발생 과정의 유도에 의해 형성되며, 여러 개의 세포종에 의해 구축된 기능 단위로서, 기관이나 장기와 같다고 생각되고 있다. 따라서 이빨은 성체 내의 조혈 줄기세포나 간엽계(間葉系) 줄기세포와 같은 줄기세포에서 세포종이 발생되는 줄기세포 시스템에 의해 발생하지는 않는다. 따라서 현재 재생 의료 에 의해 진행되고 있는 줄기세포의 이입(줄기세포 이입 요법)만으로는 이빨을 재생할 수 없다.

그래서 최근 단리된 치배(齒胚) 세포를 사용한 치배를 재구성시켜 이 재구성 치배를 이식함에 따른 이빨의 재생을 중심으로 한 검토가 이루어지고 있다.

예를 들면, J.Dent.Res.,2002,Vo1.81(10),pp.695-700에는, 치배에서 단리된 상피계 세포나 간엽계의 치낭 세포 등의 세포를 생체 흡수성 담체와 함께 랫트의 복강 내에 이식함으로써 이빨 형태의 조직이 재생되는 것이 개시되어 있다.

치배의 재생 방법으로서는, 예를 들면 일본특개2004-331557호 공보에는, 생체에서 단리된 치배 세포를, 선유아 세포 증식 인자 등 생리 활성 물질의 존재하에서 배양하는 것이 기재되어 있다. 또한, 일본특개2004-357567호 공보에는, 생체에서 단리된 치배 세포 및 이들 세포로 분화 가능한 세포 중 적어도 1종류를, 피브린을 포함한 담체와 함께 배양하는 것이 제안되어 있고, 여기에서 피브린을 포함한 담체는 치배의 목적 형상인 것을 사용하여 특유의 형태를 가진 「이빨」을 형성한다고 기재되어 있다.

미국 특허출원공개 제2002/0119180호 공보 및 미국 특허출원공개 제2004/0219489호 공보에는, 6개월생 돼지의 하악골에서, 상아질을 형성하는 치수 유래의 간엽계 세포와 에나멜 형성에 기여하는 상피계 세포를 포함한 치배와의 세포 혼합물을, 폴리글리콜산―폴리초산 공중합체로 이루어진 생분해성 중합체를 고형화시킨 담체(Scaffold)에 파종하고 동물의 체내에 이식하여 이빨을 형성하는 방법이 개시되어 있다. 여기에서 담체는 치배의 목적 형상인 것을 사용하여 특유의 형태를 가진 「이빨」을 형성한다고 기재되어 있다.

한편, 국제공개 제2005/014070호 팜플렛에는 뼈의 결손 또는 손상이 있는 환자를 치료하기 위한 이빨의 재생 방법을 개시하고 있다. 이 방법에 의하면, 폴리글리콜산 메쉬 담체에, 예를 들면 치배 유래의 간엽계 세포를 파종한 후에, 상피계 세포를 콜라겐과 함께 중층(重層)하거나 또는 상피 세포 씨트로 감쌈으로써 뼈가 형성된다. 아울러 국제공개 제2005/014070호 팜플렛에서는 뼈의 형상을 구축하기 위해 담체를 사용하고 있다.

또한, 국제공개 제2006/129672호 팜플렛에는 치배 유래의 상피계 세포와 간엽계 세포를 각각 세포 집합체로 한 후에 콜라겐 겔의 내부에 세포 집합체끼리 밀착시키고, 그 상태를 유지하면서 배양함으로써 이빨 특유의 세포 배치를 구비한 이빨을 제조하는 기술이 개시되어 있다.

그러나 상기 기술에서는 이빨 또는 치배를 재생하기 위해 치배 세포 또는 그 세포로 분화 가능한 세포를 생체에서 입수하고 있다. 이와 같이 생체에서 채취한 세포를 사용하는 기술에서는, 입수 가능한 세포수가 충분하지 않은 경우가 있다. 또 세포의 입수처에 대해서 제한이 이루어지는 경우가 있다.

또한, 조직으로서 기능하려면 조직을 구성하는 여러 종류의 세포가 적절한 상대 위치에 배치(세포 배치)되어 조직으로서의 방향성을 갖는 것이 필수이다.

발명의 개시

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은, 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로서, 이빨 형성용 간엽계 세포의 제조방법, 이빨의 제조방법 및 이빨 형성용 간엽계 세포를 제공한다.

본 발명의 제1측면은, 이빨을 형성하기 위해 사용되는 간엽계 세포의 제조방법으로서, 전능성 줄기세포를 분화 유도제의 존재하에서 배양하여 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 분화 유도 처리후의 세포 집단을 생성하는 것, 상기 분화 유도 처리후의 세포 집단에서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 이빨 형성용 간엽계 세포로서 선별하는 것을 포함한 간엽계 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제2측면은, 지지 담체의 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 어느 하나로만 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 어느 다른 하나로만 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것을 포함하는, 상기 간엽계 세포가 상기 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 이빨의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제3측면은, 전능성 줄기세포에서 유도되는 CD44 양성 및 CD29 양성 또는 CD44 양성 및 CD106 양성의 이빨 형성용 간엽계 세포를 제공한다.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 목적으로 하는 이빨을 효율적으로 대량으로 제작할 수 있는 간엽계 세포의 제조방법, 및 에나멜질 및 상아질에 의한 특유의 세포 배치를 유지한 이빨을 효율적으로 대량으로 제조할 수 있는 이빨의 제조방법을 제공할 수 있다.

[간엽계 세포의 제조방법]

본 발명의 간엽계 세포의 제조방법은, 이빨을 형성하기 위해 사용되는 간엽계 세포를 제조하는 간엽계 세포의 제조방법으로서, 전능성 줄기세포를 분화 유도제의 존재하에서 배양하고, CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 분화 유도 처리후의 세포 집단을 생성하는 것, 상기 분화 유도 처리후의 세포 집단에서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 이빨 형성용 간엽계 세포로서 선별하는 것을 포함하는 것이다.

본 발명은, 전능성 줄기세포를 분화 유도하여 얻어진 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포가 이빨 형성용 간엽계 세포로서 사용할 수 있다는 것을 발견한 것이다. 이로써 이빨을 제작하기 위해 필요한 간엽계 세포를 생체 유래의 이빨 또는 치배 이외로부터도 얻을 수 있어 이빨을 형성하기 위한 간엽계 세포를 얻기 위해 생체 유래의 이빨 등을 사용해야 할 필요성을 배제할 수 있다. 그 결과, 치배에서 직접 채취한 세포수가 충분하지 않은 사정이나 입수처에서의 제한 유무라는 사정을 고려하지 않고 필요한 양의 간엽계 세포를 용이하게, 그리고 경우에 따라서는 대량으로 얻을 수 있다.

본 발명에서 「이빨」이란, 안쪽에 상아질 및 바깥쪽에 에나멜질의 층을 연속하여 구비한 조직을 말하며, 특히 치관이나 치근을 가진 방향성을 구비한 조직을 말한다. 이빨의 방향성은, 치관이나 치근의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은 형상이나 조직 염색 등에 기초하여 육안으로 확인할 수 있다. 치관이란, 에나멜질과 상아질의 층구조를 가진 부분을 말하며, 치근에는 에나멜질의 층은 존재하지 않는다.

상아질 및 에나멜질은, 당업자라면 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다. 또한, 에나멜질은 에나멜 아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 에나멜 아세포의 존재는 아멜로제닌(amelogenin)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 한편, 상아질은 상아 아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 상아 아세포의 존재는 덴틴시아로프로틴의 유무에 의해 확인할 수 있다. 아멜로제닌 및 덴틴시아로프로틴의 확인은 이 분야에서 주지의 방법에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들면 in situ 하이브리다제이션, 항체 염색 등을 들 수 있다.

또 본 발명에서의 간엽계 세포는, 이빨을 형성하기 위해 우선 치배를 형성하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명에서 「치배」 및 「치아」는 후술하는 발생 단계에 기초하여 구별된 것을 특별히 언급할 경우에 사용되는 표현이다. 이 경우의 「치배」란, 장차 이빨이 될 것으로 결정된 이빨의 초기배로서, 이빨의 발생 시기에서 일반적으로 사용되는 봉상기(Bud stage)에서 종상기(Bell stage)까지의 단계로서, 특히 이빨의 경조직으로서의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 인정되지 않는 조직이다. 한편, 「치아」란 본 발명에서 사용되는 「치배」의 단계로 이동하는, 이빨의 경조직의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 시작된 단계부터 이빨이 치육에서 싹이 터서 일반적으로 이빨로서의 기능을 발현하기 전 단계의 조직을 말한다.

치배에서 이가 발생하는 것은, 도 1에 도시된 바와 같이 개체 발생 과정에서 봉상기, 모상기(帽狀期), 종상(鍾狀) 전기 및 후기의 각 시기를 거쳐 이루어진다. 여기에서 봉상기에서는 상피계 세포가 간엽계 세포를 감싸도록 함입되어 종상 전기 및 종상 후기에 이르면 상피계 세포 부분이 바깥쪽의 에나멜질이 되고, 간엽계 세포 부분이 내부에 상아질을 형성하게 된다. 따라서 상피계 세포와 간엽계 세포와의 세포간 상호 작용에 의해 치배에서 이빨이 형성된다.

아울러 본 발명에서 「간엽계 세포」란, 간엽 조직 유래의 세포를 의미하고, 「상피계 세포」란, 상피 조직 유래의 세포를 의미한다.

또한, 본 발명에서 「치주 조직」이란, 이빨의 주로 외층에 형성된 치조골 및 치근막을 말한다. 치조골 및 치근막은, 당업자라면 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 관한 이빨 형성용 간엽계 세포에 대해서 설명한다.

본 발명에 관한 이빨 형성용 간엽계 세포를 얻기 위해 사용되는 전능성 줄기세포는, 적어도 2개 이상의 세포로 분화 가능한 다분화 능력을 가진 세포를 말하며, 바람직하게는 배아 암종 세포, 배아 줄기세포, 배아 생식 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 이 중에서, 입수 용이성의 관점에서 배아 암종 세포(이하, 「EC세포」라고 함)가 보다 바람직하다. 본 발명에 적용 가능한 EC세포에는 신경, 고환, 난소 등 어느 한 조직에 유래된 것이어도 좋다. 이와 같은 EC세포로서는, 예를 들면 인간 유래로서는 NCR-G3세포, 및 NTERA-2세포를 들 수 있고, 마우스 유래로서는 c-1300세포나 F9세포, LT-2세포, OTT6050세포, PCC4세포, P19세포, METT-1세포, STT-3세포 등의 세포주를 들 수 있다. 이들 세포는 포유동물의 영장류(예를 들면 인간, 원숭이 등), 유제류(예를 들면 돼지, 소, 말 등), 소형 포유류의 설치류(예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등)의 각종 동물에 유래된 것으로부터 적절히 사용 목적에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면 마우스 유래의 배아 암종 세포주로서는, 상기에 기재한 세포주나 이러한 파생 클론을 들 수 있다.

전능성 줄기세포의 배양에는, 통상 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 배양에 사용되는 배지로서는, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM) 등을 사용할 수 있다. 이 배지에는 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나, 혹은 혈청을 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등 기지(旣知)의 혈청 성분을 첨가해도 좋다. 아울러 혈청을 첨가할 경우의 농도는, 그 때의 배양 상태에 따라 적절히 변경할 수 있지만, 통상 10%로 할 수 있다. 세포의 배양에는 통상의 배양 조건, 예를 들면 37℃의 온도에서 5% CO₂농도의 배양기 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 좋다.

본 발명에서는 전능성 줄기세포에 대해 분화 유도제의 존재하에서 배양함에 따른 분화 유도 처리가 이루어진다. 이 분화 유도 처리에 의해 전능성 줄기세포로부터 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 세포 집단이 생성된다. 유도 처리에 의해 얻어지는 세포 집단에는, 상기 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포가 포함되어 있으면 되고 이들 두 세포가 포함되어 있어도 좋다.

상기 분화 유도제로서는, 적어도 전능성 줄기세포에서 CD44 발현 세포로의 분화 유도가 가능한 CD44 양성 세포 유도 인자라면 사용할 수 있다. 이와 같은 CD44 양성 세포 유도 인자로서는, 신경제세포계 유도 인자, 신경제세포(neural crest cell) 발생 관여 인자, 신경제세포 증식 촉진 인자를 들 수 있다. 신경제세포계 유도 인자는, 전능성 줄기세포를 신경제세포 또는 그 파생 세포(평활근 세포, 심근 세포 등)로 유도할 수 있는 인자로서, 예를 들면 디메틸술폭시드(DMSO), Dex, cAMP, 헥사메틸렌비스아세트아미드, 5'―아자시티딘, TGFβ, Noggin 등을 들 수 있다. 신경제세포 발생 관여 인자로서는, 레티노인산(RA), BMP-4, BMP-7, Shh, Wnt, FGF2, 엔도셀린-1, 엔도셀린-3, 액티빈βA, PDGF, VEGF 등을 들 수 있다. 신경제세포 증식 촉진 인자로서는, FGF2, FGF8, FGF10, BMP-2, SCF, 활성형 비타민 D3 등을 들 수 있다. 신경제세포계 유도 인자, 신경제세포 발생 관여 인자 및 신경제세포 증식 촉진 인자는 각각 명확하게 구별되지 않으며, 또 이들을 단독으로 또는 하나 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이 중에서 후술하는 본 발명의 목적 세포 집단을 효율적으로 생성할 수 있는 DMSO 및 RA가 바람직하며, 이들은 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이들 분화 유도제는, 전능성 줄기세포의 배지에 분화 유도 가능한 농도로 첨가하면 된다. 여기에서 분화 유도 가능한 농도란, 사용되는 분화 유도제의 종류나 전능성 줄기세포의 종류 등에 따라 다르다.

예를 들면 DMSO의 경우, 일반적으로 배지의 용량에 대해 0.5용량%∼10용량%, 처리에 대한 세포의 생존율 및 배양에 의해 얻어지는 목적 세포의 취득 효율의 관점에서, 바람직하게는 2.5용량%∼5용량%, 더욱 바람직하게는 4용량%∼5용량%의 농도로 할 수 있다. 2.5용량% 이상의 농도라면, 전능성 줄기세포의 분화를 충분하게 유도할 수 있고, 한편 5용량% 이하의 농도라면 목적 세포 취득 효율을 현저하게 손상시키지 않는다.

또한, RA의 경우, 일반적으로 배지 중에서 0.1μM∼10μM, 처리에 대한 세포의 생존율 및 배양에 의해 얻어지는 목적 세포의 취득 효율의 관점에서, 바람직하게는 0.5μM∼5μM, 더욱 바람직하게는 0.5μM∼2μM의 농도로 할 수 있다. 0.1μM 이상의 농도라면, 전능성 줄기세포의 분화를 충분히 유도할 수 있고, 10μM 이하의 농도라면 목적 세포 취득 효율을 현저하게 손상시키지 않는다.

전능성 줄기세포에 대한 분화 유도 처리는, 상기 분화 유도제의 존재하에서 전능성 줄기세포를 배양함으로써 이루어진다. 분화 유도 처리(배양)의 기간은, 분화 유도제의 농도와 세포의 생육 활성에 따라 다르지만, 일반적으로 2시간∼3일, 세포의 생존율 및 목적 세포의 입수 효율의 관점에서 바람직하게는 6시간∼24시간으로 할 수 있다. 6시간 이상으로 함으로써 충분히 분화 유도된 세포를 효율적으로 얻을 수 있고, 24시간 이하로 함으로써 효율을 현저히 손상시키지 않는다.

아울러, 분화 유도 처리 기간과 분화 유도제의 농도 사이에는 전능성 줄기세포에 대한 분화 유도를 효과적으로 일으키기 위해 일정 관계가 성립한다. 즉, 일반적으로 분화 유도제 존재 하에서의 배양 기간(처리 시간)은, 분화 유도제의 농도와 분화 유도제의 종류에 따라 다르지만, 특정 분화 유도제의 경우에는, 배양 일수를 고정시킨 경우, 일반적으로 그 농도에는 바람직한 적합 농도 영역이 존재한다. 또 배양 일수를 짧게 한 경우에는 적합 농도 영역은 높은 농도쪽으로 이동하고, 반대로 배양 일수를 길게 할 경우에는 적합 농도 영역은 낮은 농도쪽으로 이동한다. 이러한 요소를 고려하면, 배양 일수를 조절함으로써 폭넓은 농도 영역에서의 분화 유도 효과가 얻어짐과 동시에 당업자에게는 유도 효과가 얻어지는 적합 농도 영역을 용이하게 설정할 수 있다.

상기 분화 유도 처리에 의해 얻어진 분화 유도 처리후의 세포 집단에는, CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 세포 집단이 생성된다. 이들 양쪽의 세포가 포함되어 있어도 좋다. 이 분화 유도 처리후의 세포 집단은, 계속해서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 이빨 형성용 간엽계 세포로서 선별하는 선별 처리에 제공된다.

세포의 선별은, 상술한 바와 같은 본 발명에 관한 간엽계 세포를 선별할 수 있는 수단이라면 어느 것을 사용해도 좋다. 이와 같은 선별 수단으로서는, 유전자 발현 패턴, 세포 표면 항원, 형태 등을 기준으로 하는 선별을 들 수 있고, 이들 1가지 또는 2가지 이상을 사용하여 전능성 줄기세포를 선별할 수 있다. 선별 수단은, 세포 선별 효율의 관점에서 세포 표면의 발현을 토대로 한 셀 분류기를 사용하는 것이 바람직하고, 확실히 간엽계 세포를 선별하기 위해서는 여러 가지 조합, 특히 유전자 발현 패턴과 세포 표현 항원의 발현을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 선별된 이빨 형성용 간엽계 세포는 CD44 양성일 뿐만 아니라 CD29 양성 또는 CD106 양성 세포 성상을 나타내는 것이다. CD44는, 히알루론산 수용체로서 세포 표면에 발현하는 막단백질로 알려져 있다. 한편, CD29는 인테그린β1분자로서 세포 표면에 발현하는 막단백질로 알려져 있고, EC세포에서는 약양성, 간엽계 세포에서는 mRNA레벨로 발현하는 것이 각각 보고되어 있다. 또 CD106은 접착 분자로서 기지의 VCAM-1분자인 것으로 알려져 있고, 주로 상피계 세포의 마커로서 이용되는 경우가 많다. 이와 같은 성상을 나타내는 세포라면, 후술하는 것처럼 이빨의 형성시에 간엽계 세포로서 사용할 수 있다.

본 발명에서의 이빨 형성용 간엽계 세포는, CD44 양성에 추가하여 CD29 및 CD106 중 적어도 어느 한쪽의 항원이 양성이 되는 집단이면 되는데, CD44, CD29, CD106의 3종류의 항원이 함께 양성이 되는 삼중 양성 세포가 포함되어 있어도 된다.

본 발명에서의 이빨 형성용 간엽계 세포는, 상기 CD44, CD29 및 CD106의 세포 표현 항원에 추가하여 다른 세포 성상에 기초하여 선별해도 좋다.

다른 세포 성상으로서는 다른 세포 표면 항원 패턴이나 유전자 발현 패턴을 들 수 있다. 세포 표현 항원 패턴으로서, 예를 들면 CD14 음성, CD34 음성, CD45 음성 등을 들 수 있고, 이들을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또 유전자 발현 패턴으로서는, 예를 들면 Slug 발현, Wnt5a 발현, Lhx8 발현, BMP4 발현, Pax3 발현, Pax9 발현, Msx1 발현, Oct3/4 비발현, nanog 비발현, Sox9 비발현, Sox5 비발현 등을 들 수 있고, 이들을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 이빨 형성용 간엽계 세포는, 바람직하게는 상기 CD44, CD29, CD106에 추가하여 이빨 형성 능력의 정도로 보아 Slug 유전자, Pax3 유전자, Msx1 유전자 및 Pax9 유전자의 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자를 발현하는 것이 바람직하고, Slug 유전자 및 Pax3 유전자를 함께 발현하는 것이 더욱 바람직하고, 이들 4개 유전자를 전부 발현하는 것이 특히 바람직하다.

이들 세포 표면 항원이나 유전자 발현 패턴의 확인 및 여기에 기초한 선별에는, 표면 항원을 인식하는 각종 항체나 유전자 발현 확인이 가능한 핵산 서열번호 등을 사용한다. 이들 항체 및 핵산 서열번호는 모두 공지의 것으로서 용이하게 입수 가능하다. 또한, 이들 표면 항원이나 유전자 발현에 기초한 확인 및 선별은 이러한 용도로 일반적으로 사용되는 수단, 예를 들면, 각종 항체에 의한 면역 염색, 유세포 분석기(flow cytometry), 셀 분류기, RT-PCR 등을 사용하면 된다.

또한, 본 발명의 제조방법에서는, 상기 선별 수단에 조합하여 단일의 간엽계 세포로 하기 위한 클로닝을 사용할 수 있다. 클로닝의 방법으로서는, 통상 이 목적으로 사용되고 있는 방법, 예를 들면, 한계 희석법, 셀 분류기, 클로닝 링 등을 사용할 수 있다. 클로닝은, 상기 선별 수단에 의한 선별 전후 중 어느 한 타이밍으로 수행해도 되지만, 목적으로 하는 간엽계 세포를 효율적으로 얻기 위해서는 선별 후에 수행하는 것이 바람직하다.

선별 공정에서 목적으로 하는 세포수를 효율적으로 얻기 위해서 선별 공정 전에 증식 공정을 마련해도 좋다. 이와 같은 증식 공정에서는 분화 유도제를 포함하지 않는 통상 배양용 배지를 사용하여 분화 유도 후의 세포 집단을 배양한다. 이로써 분화 유도된 목적 세포를 소정의 세포수까지 증식시킬 수 있다. 그 결과, 충분한 세포수에 의해 선별을 용이하게 실시하도록 할 수 있다.

이와 같은 증식 공정의 기간은, 분화 유도 처리후의 세포수 및 세포의 상태에 기초하여 적절히 설정할 수 있는데, 목적 세포의 농축 효율의 관점에서 일반적으로 3∼30일, 바람직하게는 5∼10일로 할 수 있다. 그 결과, 선별 공정의 대상이 되는 세포 집단 중 목적으로 하는 이빨 형성용 간엽계 세포가 포함되고, 이와 같은 세포 집단을 선별 공정에 제공함으로써, 본 발명에 관한 이빨 형성용 간엽계 세포를 효율적으로 또한 대량으로 얻을 수 있다.

본 발명의 방법으로 얻어진 간엽계 세포는, 이빨을 형성하기 위해 사용된다. 이빨의 형성은, 본 발명에 관한 간엽계 세포를 사용하는 것이라면 어떠한 방법이어도 좋지만, 이하의 본 발명의 이빨의 제조방법에 사용되는 것이 가장 바람직하다.

이하, 본 발명의 이빨의 제조방법에 대해서 설명한다.

[이빨의 제조방법]

본 발명의 이빨 형성용 간엽계 세포를 이용한 바람직한 이빨의 제조방법은, 지지 담체의 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 어느 하나로만 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 어느 다른 하나로만 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 것(배치 공정), 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것(배양 공정)을 포함하고, 상기 간엽계 세포가 상기 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 것이다.

본 제조방법에서는, 간엽계 세포를 상피계 세포와 함께 세포 집합체로 하여 지지 담체의 내부에서 혼합하지 않고 밀착시킨 상태에서 생육시키기 때문에, 긴밀한 접촉 상태에 의해 세포간 상호 작용을 효과적으로 재현할 수 있어 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이빨 특유의 세포 배치를 가진 이빨을 얻을 수 있다. 이 때 간엽계 세포로 실질적으로 이루어진 세포 집합체가 본 발명에 관한 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함하기 때문에, 특유의 세포 배치를 가진 이빨을 효율적으로 대량으로 제조할 수 있다.

배치 공정에서는 지지 담체의 내부에 제1 세포 집합체를 제2 세포 집합체와 함께 접촉시켜 배치한다.

여기에서 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체는, 각각 간엽계 세포만으로, 또는 상피계 세포만으로 실질적으로 구성되어 있는 것이다. 여기에서 간엽계 세포만으로 실질적으로 구성되어 있는 세포 집합체는, 상술한 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 것이다. 이 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 세포 집합체는, 상술한 제조방법에 따른 제조 공정으로 제조할 수 있고, 한편 상피계 세포만으로 실질적으로 구성되어 있는 세포 집합체는, 간엽계 세포로 실질적으로 이루어진 세포 집합체와는 독립적으로 제조할 수 있다(제1 세포 제조 공정 및 제2 세포 제조 공정).

또한「세포 집합체」란, 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직의 상태여도 좋고, 단일 세포의 상태로부터 제조된 세포 집합체(세포 응집체)여도 좋다. 또한, 「실질적으로 이루어진」이란, 대상이 되는 세포 이외의 것을 가능한 한 포함하지 않는 것을 의미한다. 따라서 상피계 세포로 이루어진 세포 집합체는 조직 일부 또는 단일 세포의 집합체로 할 수 있다. 또 상피계 세포 및 간엽계 세포는 함께 단일 세포로 구성된 세포 집합체여도 좋다.

제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는 어느 하나가 상피계 세포 및 간엽계 세포여도 좋고 이 세포 집합체를 구성하는 세포의 수는 동물의 종류나 지지 담체의 종류, 경도(硬度) 및 크기에 따라 다르지만, 세포 집합체 1개당 일반적으로 1O¹∼1O⁸개, 바람직하게는 1O³∼1O⁸개로 할 수 있다.

간엽계 세포로 실질적으로 이루어진 세포 집단은, 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함하고 있다면 다른 간엽계 세포를 포함해도 좋다.

상기 간엽계 세포 이외의 다른 간엽계 세포로서는, 치배 및 치배 이외에서 유래된 간엽계 세포를 들 수 있다. 치배 이외에서 유래된 간엽계 세포로서는, 생체내의 다른 간엽계 조직에 유래된 세포로서, 바람직하게는 혈액 세포를 포함하지 않는 골수 세포나 간엽계 줄기세포, 더욱 바람직하게는 구강내 간엽계 세포나 악골 내부의 골수 세포, 두부 신경제세포에 유래된 간엽계 세포, 상기 간엽계 세포를 만들어낼 수 있는 간엽계 전구세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

본 제조방법에서 사용되는 상피계 세포는, 생체 내에서의 세포 배치를 재현하여 특유의 구조 및 방향성을 가진 이빨을 효과적으로 형성하기 위해 치배에서 유래된 것인 바람직하고, 세포의 분화 단계의 유약성과 균질성의 관점에서 봉상기에서 모상기까지의 것이 바람직하다.

또한, 치배 이외에서 유래된 상피계 세포여도 되고, 이것에는 생체내의 다른 상피계 조직에서 유래된 세포를 들 수 있다. 바람직하게는, 피부나 구강 내의 점막이나 치육의 상피계 세포, 더욱 바람직하게는 피부나 점막 등의 분화된, 예를 들면 각화(角化)된, 혹은 엇각화된 상피계 세포를 만들어낼 수 있는 미숙한 상피계 전구세포, 예를 들면 비각화 상피계 세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

세포 집합체를 제조하기 위해 각 세포를 조직에서 단리할 경우, 치배 및 다른 조직은 포유동물의 영장류, 예를 들면 인간, 원숭이 등, 유제류(有蹄類), 예를 들면 돼지, 소, 말 등, 소형 포유류의 설치류, 예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등 다양한 동물의 악골 등에서 채취할 수 있다. 치배 및 조직 채취는, 통상 조직 채취에 사용되는 조건을 그대로 적용하면 되고, 무균 상태에서 취출하여 적당한 보존액으로 보존하면 된다. 아울러 인간의 치배로서는, 제3대 어금니, 이른바 사랑니의 치배 외에 태아 치배를 들 수 있는데, 자가 조직 이용이라는 관점에서 사랑니 치배를 사용하는 것이 바람직하다.

조직, 예를 들면 치배로부터 상기 세포를 제조할 경우에는, 우선 주위의 조직에서 단리된 치배를, 형상에 따라 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직으로 나눈다. 이 때, 치배 조직은 현미경하에서 구조적으로 분별할 수 있기 때문에 해부용 가위나 핀셋 등으로 절단하거나 벗겨냄으로써 용이하게 분리할 수 있다. 또한, 치배 조직에서의 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직 분리는, 그 형상에 따라서 주사바늘, 텅스텐 바늘, 핀셋 등으로 절단하거나 벗겨냄으로써 용이하게 수행할 수 있다.

바람직하게는, 주위 조직에서 치배 세포를 용이하게 분리하기 위해 및/또는 치배 조직에서 상피 조직 및 간엽 조직을 분리하기 위해 효소를 사용해도 좋다. 이와 같은 용도에 사용되는 효소로서는 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다.

세포 집합체를 구성하는 세포는, 채취한 조직으로부터 단일 세포의 상태로 제조해도 좋다. 제조 공정에서 단일의 세포에 용이하게 분산 가능하도록 하기 위해 효소를 사용해도 좋다. 이와 같은 효소로서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다. 이 때, 상피 조직으로부터의 상피계 세포의 분리에는 콜라게나아제 처리 후에 트립신 처리와 DNase처리를 하는 것이 바람직하다. 한편, 간엽 조직으로부터의 간엽계 세포의 분리시에는 콜라게나아제와 트립신으로 동시에 처리하고 최종적으로 DNase처리를 하는 것이 바람직하다. 이 때 DNase처리를 하는 것은, 효소 처리에 의해 일부 세포가 데미지를 받아 세포막이 용해되었을 때 용액중에 방출되는 DNA에 의해 세포가 응집되어 세포의 회수량이 저하되는 것을 막기 위함이다.

아울러 세포 집합체를 구성하는 세포는, 각각 충분한 세포수를 얻기 위해 배치 공정에 앞서 예비적인 배양을 거친 것이어도 좋다. 세포의 배양은, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 온도 등의 조건을 그대로 사용할 수 있다.

배양에 사용되는 배지로서는, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 등을 사용할 수 있고, 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나 혹은 혈청을 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등 기지의 혈청 성분을 첨가해도 좋다. 아울러 혈청을 첨가할 경우의 농도는, 그 때의 배양 상태에 따라 적절히 변경할 수 있지만, 통상 10용량%로 할 수 있다. 세포의 배양에는, 통상의 배양 조건, 예를 들면 37℃의 온도에서 5% CO₂농도의 배양기 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 좋다.

이러한 예비적인 배양을 간엽계 세포에 적용할 경우, 상술한 이빨 형성용 간엽계 세포의 증식을 위한 배양을 겸한 것이어도 좋고, 선별 공정 후에 하는 것, 또는 상기 두가지 모두여도 좋다.

또 세포의 성질을 바꾸지 않는다는 관점에서, 간엽계 세포의 예비 배양이나 상술한 이빨 형성용 간엽계 세포의 단순한 증식을 위한 배양에서는, 전술한 분화 유도제를 함유하지 않는 배지에서 수행하는 것이 바람직하다.

배치 공정에서의 세포 집합체의 배치는, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를, 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 지지 담체의 내부에 배치한다. 이 때, 각 세포 집합체는 서로 혼합되지 않는다. 이와 같이 각 세포 집합체를 혼합하지 않고 배치하기 때문에 세포 집합체 사이에 경계선이 형성된다. 이와 같은 배치 형태를, 본 명세서에서는 적절히 「구획화」라고 표현한다.

여기에서 사용되는 지지 담체로서는, 세포를 내부에서 배양 가능한 것이면 좋고, 바람직하게는 상기 배지와의 혼합물이다. 이와 같은 지지 담체로서는, 콜라겐, 아가로스겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스(상품명), 메비올겔(상품명), 매트리겔(상품명), 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리젖산(PLA), 젖산/글리콜산 공중합체(PLGA) 등을 들 수 있다. 이들 지지 담체는, 세포를 내부에 배치했을 때 배치된 위치를 거의 유지할 수 있는 정도의 경도를 가진 것이면 되며 겔형, 섬유형, 고체형의 것을 들 수 있다. 그 중에서도 세포외 매트릭스 혼합물 등의 겔이 적절한 경도나 유지력을 제공하기 쉽다는 관점에서 콜라겐, 아가로스겔, 카복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스, 메비올겔, 매트리겔, 세포배 매트릭스 혼합물, 엘라스틴, 피브린, 라미닌이 보다 바람직하다. 여기에서 세포의 위치를 유지할 수 있는 경도란, 통상 3차원 배양으로서 적용되는 경도, 즉, 세포의 배치를 유지함과 동시에 증식에 의한 비대화를 저해하지 않는 경도면 되며 용이하게 결정할 수 있다.

아울러, 여기에서 지지 담체는 제1 및 제2 세포 집합체가 담체 내부에 생육될 수 있는 정도의 두께를 가지면 되고, 목적으로 하는 조직의 크기 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.

또한, 지지 담체는 세포가 분산되지 않고 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 유지력을 갖추고 있으면 된다. 여기에서 말하는 「접촉 상태」란, 각 세포 집합체에서, 또 세포 집합체간에 있어서 확실하게 세포 상호 작용시키기 위해 긴밀(고밀도)한 상태인 것이 바람직하고, 이와 같은 고밀도의 상태란, 세포 응집체의 경우에는, 예를 들면 단순히 맞닿는 것보다도 강하게 밀착된 상태를 유지할 수 있는 유지력으로 세포를 배양 가능한 것으로 할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐의 경우, 최종 농도 2∼3㎎/㎖의 농도, 즉 JIS-K6503-1996에 근거한 방법(12.7㎜직경의 플런저로 4㎜ 눌러내릴 때 필요한 하중으로서 측정)에 의해 120g∼250g의 젤리 강도가 되는 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다. 또 이 젤리 강도는 한정되지 않으며 다른 종류의 지지 담체에서도 동일한 평가 방법에 의해 동일한 강도가 있으면 본 발명의 지지 담체로서 바람직하게 사용된다. 또 1종류 또는 여러 종류의 지지 담체를 혼합함으로써 목적으로 하는 젤리 강도에 상당하는 경도의 지지 담체를 얻어도 좋다.

고밀도의 상태란, 조직을 구성할 때의 밀도와 동등 정도인 것을 말하며, 예를 들면, 세포 집합체의 경우, 세포 배치시에 5×1O⁷∼1×1O⁹개/㎖, 세포의 활성을 손상시키지 않고 확실히 세포 상호 작용시키기 위해 바람직하게는 1×1O⁸∼1×1O⁹개/㎖, 가장 바람직하게는 2×1O⁸∼8×1O⁸개/㎖의 밀도를 말한다. 이와 같은 세포 밀도로 세포 집합체를 제조하려면 세포를 원심에 의해 응집시켜 침전화하는 것이 세포의 활성을 손상시키지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 원심은, 세포의 생존을 손상시키지 않는 300∼1200×g, 바람직하게는 500∼1000×g의 원심력에 해당하는 회전수로 3∼10분간 수행하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심에서는 세포의 침전이 불충분해져 세포 밀도가 낮아지는 경우가 있고, 반면 1200×g보다도 높은 원심에서는 세포가 손상을 입는 경우가 있기 때문에 각각 바람직하지 않다.

원심분리에 의해 고밀도의 세포를 제조할 경우에는, 통상 세포 원심분리하기 위해 사용되는 튜브 등의 용기에 단일 세포의 현탁액을 제조한 후에 원심분리하고, 침전물로서의 세포를 남겨 상청액을 가능한 한 제거하면 된다. 이 때 사용되는 튜브 등의 용기는 상청액을 완전히 제거하는 관점에서 실리콘 코팅된 것이 바람직하다.

원심분리에 의한 침전물로 한 경우에는, 침전물을 그대로 지지 담체의 내부에 배치하면 된다. 이 때, 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들면, 배양액, 완충액, 지지 담체 등)은, 세포의 용량과 같은 양 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이와 같은 고밀도의 세포 집합체에서는 세포가 긴밀하게 접촉되어 있어 세포간 상호 작용이 효과적으로 발휘된다. 특히 목적으로 하는 세포 이외의 성분이 극단적으로 적은 세포 집합체를 지지 담체의 내부에 배치하면, 지지 담체의 고형화 등에 의해 더욱 응집되어 한층 더 긴밀한 상태가 된다.

조직 상태에서 사용할 경우에는, 효소 처리 등을 하여 대상이 되는 세포 이외의 결합 조직 등을 제거하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 세포 이외의 성분이 많은 경우, 예를 들면 세포의 용량과 같은 양 이상이 되면, 세포간 상호 작용이 충분히 발휘되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉은, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉은 밀접할수록 바람직하고, 제1 세포 집합체에 대해 제2 세포 집합체를 눌러붙여 배치하는 것이 특히 바람직하다. 또 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체의 주위를 배양액, 산소 투과를 저해하지 않는 고형물로 감싸는 것도 세포 집합체끼리의 접촉을 밀접하게 하기에 효과적이다. 점도가 다른 용액에 밀도가 높은 세포 현탁액을 집어넣어 배치시키고, 용액을 그대로 고형화시키는 것도 세포의 접촉 유지를 용이하게 달성할 수 있기 때문에 바람직하다. 이 때, 제1 세포 집합체를 치배 간엽계 세포의 단일 세포 집합물로 하고, 제2 세포 집합체를 치배 상피 조직으로 한 경우에는, 치배 상피 조직의 에나멜 결절이 제1 세포 집합체에 접촉하도록 배치하는 것이 바람직하지만, 여기에 한정되지는 않는다.

지지 담체가 겔 형태 혹은 용액 형태인 경우에는 배치 공정 후에 지지 담체를 고형화시키는 고형화 공정을 마련해도 좋다. 고형화 공정에 의해 지지 담체 내부에 배치된 세포가 지지 담체 내부에 고정화된다. 지지 담체의 고형화에는, 일반적으로 사용한 지지 담체의 고형화 조건을 그대로 적용하면 된다. 예를 들면 지지 담체에 콜라겐 등의 고형화 가능한 화합물을 사용한 경우에는, 통상 적용되는 조건으로, 예를 들면 배양 온도하에서 수분∼수십분 정치시킴으로써 고형화시킬 수 있다. 이로써 지지 담체 내부에서의 세포간 결합을 고정화시킴과 동시에 견고하게 할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서의 배양 공정에서는, 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내부에 배양한다. 이 배양 공정에서는 서로 긴밀하게 접촉된 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체에 의해 세포간 상호 작용이 효과적으로 이루어져 조직, 즉 이빨이 재구성된다.

배양 공정은, 지지 담체에 의해 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉 상태가 유지되어 이루어지면 되고, 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체 단독에 의한 배양이어도 좋고 다른 동물 세포의 존재하에서의 배양이어도 좋다.

배양 기간은, 지지 담체 내부에 배치된 세포수 및 세포 집합체 상태, 나아가 배양 공정의 실시 조건에 따라 다르지만, 일반적으로 1∼300일, 에나멜질을 바깥쪽에 가지고 상아질을 안쪽에 가진 이빨을 형성하기 위해서는, 바람직하게는 1∼120일, 신속하게 제공할 수 있도록 하는 관점에서는, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다. 나아가 치주 조직을 구비한 이빨로 하기 위해서는 일반적으로 1∼300일, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다.

지지 담체만의 배양으로 한 경우에는, 동물 세포의 배양에 사용되는 통상의 조건하에서의 배양으로 할 수 있다. 여기에서의 배양은, 일반적으로 동물 세포에서의 배양 조건을 그대로 적용하면 되므로 전술한 조건을 그대로 적용할 수 있다. 또한, 배양에는, 포유동물 유래의 혈청을 첨가해도 좋고, 이들 세포의 증식이나 분화에 유효한 것으로 이미 알려져 있는 각종 세포 인자를 첨가해도 좋다. 이와 같은 세포 인자로는 FGF, BMP 등을 들 수 있다.

또한, 조직이나 세포 집합체의 가스 교환이나 영양 공급의 관점에서 기관 배양을 사용하는 것이 바람직하다. 기관 배양에서는, 일반적으로 동물 세포의 증식에 적합한 배지상에 다공성 막을 플로팅시키고, 그 막 위에 지지 담체로 감싸져 있는 세포 집합체를 놓고 배양한다. 여기에서 사용되는 다공성 막에는 0.3∼5㎛ 정도의 포어를 다수 가진 막인 것이 바람직하고, 구체적으로는 셀 컬쳐 인서트(상품명), 아이포어 필터(상품명)를 들 수 있다.

다른 동물 세포의 존재하에서의 배양인 경우에는, 동물 세포로부터 각종 사이토카인 등의 작용을 받아 조기에 특유의 세포 배치를 가진 이빨을 형성할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 다른 동물 세포의 존재하에서의 배양은, 단리 세포나 배양 세포를 사용하여 생체 외에서의 배양에 의해 수행해도 좋다.

또한, 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체를 생체에 이식하여 생체 내에서 배양해도 좋다. 이와 같은 생체 내에서의 배양은, 이빨, 나아가 치주 조직의 형성을 조기에 실시할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 이 경우, 지지 담체와 함께 제1 및 제2 세포 집합체가 생체 내에 이식된다.

이러한 용도로 이용 가능한 동물은, 포유동물, 예를 들면 인간, 돼지, 마우스 등을 바람직하게 들 수 있고, 치배 조직과 동일한 종에서 유래된 것이 더욱 바람직하다. 인간 치배 조직을 이식할 경우에는, 인간, 또는 면역 불완전하게 변형된 인간 이외의 다른 포유동물을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 생체내 생육에 적합한 생체 부위로서는, 동물 세포의 기관이나 조직을 가능한 한 정상적으로 발생시키기 위해서는 신장 피막하, 장간막, 피하 이식, 구강 내 등이 바람직하다.

이식에 의한 생육 기간으로서는, 이식시의 크기와 발생시키는 이빨의 크기에 따라 다르지만, 일반적으로 3∼400일로 할 수 있다. 예를 들면, 신장 피막하로의 이식 기간은 이식하는 배양물의 크기와 재생시키는 이빨의 크기에 따라서도 다르지만, 이빨의 재생과 이식처에서 발생시키는 이빨의 크기 관점에서 7∼60일간인 것이 바람직하다.

생체로 이식하기 전에 생체 외에서의 배양(전(前)배양)을 해도 좋다. 이 전배양에 의해 세포간의 결합과 제1 및 제2 세포 집합체끼리의 결합을 견고하게 하여 세포간 상호 작용을 보다 견고하게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 그 결과, 전체 생육 기간을 단축할 수 있다.

전배양 기간은 단기여도 좋고 장기여도 좋다. 장기간, 예를 들면 3일 이상, 바람직하게는 7일 이상으로 한 경우에는 치배에서 치아로 발생시킬 수 있어 이식 후에 이빨이 생길 때까지의 기간을 단축할 수도 있기 때문에 바람직하다. 전배양 기간으로서는, 예를 들면 신장 피막하에 이식할 경우의 기관 배양으로서, 바람직하게는 1∼7일로 하는 것이 효율적으로 이빨을 재생하기 위해 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이빨은 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이빨 특유의 세포 배치(구조)를 갖는 것으로서, 또한 바람직하게는, 이빨의 선단(치관)과 치근이라는 방향성도 갖춘 것이다. 적어도 이와 같은 특유의 세포 배치, 바람직하게는 세포 배치에 추가하여 방향성을 가짐으로써 이빨로서의 기능도 발휘할 수 있는 것이다. 따라서 이빨의 대체물로서 널리 이용할 수 있다. 특히, 자가의 치배에 유래된 간엽계 세포 및 상피계 세포를 사용한 경우에는 거부 반응에 의한 문제를 회피하면서 사용할 수 있다. 또 일반적으로 이식 항원이 적합한 타인의 치배에 유래된 세포를 사용하는 경우에도 거부반응에 의한 문제를 회피할 수 있다.

또 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이빨은, 이빨 특유의 세포 배치를 가진 이빨의 집합체여도 좋다.

이와 같은 이빨의 집합체는, 이빨 특유의 세포 배치를 가진 여러 개의 이빨로 구성되어 있기 때문에 각각의 이빨을 집합체에서 분리하여 이하에 설명하는 바와 같이 이빨 1개의 이식편으로서 사용할 수 있다. 그 결과, 이식편으로서의 이빨을 효율적으로 제작할 수 있다.

복수 개의 이빨로 구성된 이빨의 집합체를 얻기 위해서는, 제1 및 제2 세포 집합체 모두 여러개의 이빨을 발생하기 위한 치배의 재유도를 용이하게 하기 위해 함께 단일 세포로 구성되어 있는 것이 바람직하다.

아울러, 배양 공정은 상기와 같이 기관 배양이어도 좋고 신장 피막하에서의 배양이어도 좋지만, 얻어진 이빨을 이식편으로서 사용할 경우에는, 다른 동물 세포와의 접촉이 없고 또 전과정을 in vitro로 제조할 수 있는 기관 배양으로 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 제조방법에서는, 배양 기간을 치주 조직이 형성될 때까지 계속해도 좋다. 이로써 이빨 그 자체에 추가하여 이빨을 악골 위에서 지지하고 고정화시키는 치조골이나 치근막 등의 치주 조직도 형성시킬 수 있다. 그 결과, 이식 후에 실용 가능한 이빨을 제공할 수 있다.

아울러, 치주 조직을 제조하기 위해서는 상기 배양 공정 후에 상기 배양에 의해 얻어진 치주 조직을 단리하는 공정을 마련하여 치주 조직만을 얻어도 좋다. 치주 조직의 단리는, 배양 공정의 과정에서 형성된 치주 조직과 이빨을 분리할 수 있는 방법이라면 어떤 방법으로든 수행해도 좋고, 핀셋 등에 의한 분리나 효소에 의한 부분 소화 등을 들 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 이빨 및 치주 조직은, 이식편으로서 사용되는 것 외에 이빨의 발생 과정을 해명하기 위한 연구에도 바람직하게 이용할 수 있고, 앞으로 이빨에 관련된 조직 발생을 위해 유효한 리서치 툴(tool)로서 이용할 수 있다.

아울러, 얻어진 이빨 또는 치주 조직을 이식편으로서 사용할 경우에는, 제조방법에서의 배양 공정을 다른 동물 세포와의 접촉이 없고 또한 전과정을 in vitro로 제조할 수 있는 기관 배양으로 한 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에는 이빨의 이식 방법이 포함된다. 이 이식 방법에는, 상기 이빨의 집합체를 얻는 공정과, 이빨의 복합체로부터 개개의 이빨을 분리하는 공정과, 분리된 이빨을 이식 부위에서의 다른 이빨과 동일한 방향성이 되도록 일치시켜 이식하는 공정을 포함한다.

이로써 이빨의 이식을, 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 여러 개의 이빨을 동시에 얻어 효율적으로 실시할 수 있다.

본 발명에 의한 이빨은 이빨의 결손 및 손상을 동반한 각종 증상, 예를 들면 충치, 변연성(邊緣性) 치주염(치조농루), 치주병에 의한 이빨의 결손, 사고 등에 의한 절손이나 탈락 등의 치료 또는 조치에 적용할 수도 있다.

즉, 본 발명의 치료 방법은, 본 발명에 의한 제조방법에 의해 얻어진 이빨 및/또는 치주 조직을 결손 및/또는 손상 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이로써 결손 및/또는 손상 부위의 상기 증상을 치료 및/또는 완화할 수 있다.

본 발명의 다른 치료 방법은, 본 발명에서의 배양 공정만, 또는 배치 공정 및 배양 공정을 결손 및/또는 손상 부위에서 실시시키는 것을 포함한다. 이 경우, 지지 담체로서는, 상술한 것에 추가하여 결손 및/또는 손상 부위의 주위 조직 그 자체를 지지 담체로서 적용해도 좋다. 이로써 생체 내의 주변 조직에서의 사이토카인 등에 의해 보다 신속하게 결손 및/또는 손상 부위의 치료 등을 수행할 수 있다.

도 1은 치배의 형성을 모식적으로 도시한 개념도이다.

도 2a는 본 발명의 실시예 1에 관한 EC세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 2b는 본 발명의 실시예 1에 관한 DMSO처리후 6일째의 세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 2c는 본 발명의 실시예 1에 관한, 선별된 CD44 양성 및 CD29 양성 세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 3a는 본 발명의 실시예에 관한, 치배 유래의 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축의 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 세포 배치 전의 겔팩(gel pack)의 상태를 도시한 도면이다.

도 3b는 본 발명의 실시예에 관한, 치배 유래의 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제1 세포 집합체를 겔팩 내에 배치한 상태를 도시한 도면이다.

도 3c는 본 발명의 실시예에 관한, 치배 유래의 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제2 세포 집합체를 겔팩 내에 배치한 상태를 도시한 도면이다.

도 3d는 본 발명의 실시예에 관한, 치배 유래의 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체가 배치된 겔팩을 고형화시킨 상태를 도시한 도면이다.

도 4a는 본 발명의 실시예 4에 관한 치배 상피 조직과 치배 간엽 세포로 제작한 치배의 HE염색상이다(배율: 100배).

도 4b는 본 발명의 실시예 4에 관한 치배 상피 조직과 DMSO-EC세포로 제작한 치배의 HE염색상이다(배율: 100배).

도 4c는 본 발명의 실시예 4에 관한 치배 상피 조직과 DMSO-EC클론화 세포로 제작한 치배의 HE염색상이다(배율: 100배).

도 5a는 본 발명의 실시예 5에 관한 EC세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 5b는 본 발명의 실시예 5에 관한 RA 처리후 7일째의 세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 5c는 본 발명의 실시예 5에 관한, 선별된 CD44 양성 및 CD29 양성 세포의 CD44 및 CD29의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 6은 본 발명의 실시예 5에서 RA처리에 의해 얻어진 CD44 양성 및 CD106 양성 세포와 치배 상피 조직으로 제작한 치배의 HE염색상이다(배율:200배, 바(bar)는 50㎛).

도 7a는 본 발명의 실시예 6에 관한 EC세포의 CD44 및 CD106의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 7b는 본 발명의 실시예 6에 관한 RA 처리후 7일째의 세포의 CD44 및 CD106의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

도 7c는 본 발명의 실시예 6에 관한 선별된 CD44 양성 및 CD106 양성 세포의 CD44 및 CD106의 이중 염색 상태를 도시한 도면이다.

이하에 본 발명의 실시예에 대해서 설명하였으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중의 %는 별도로 기재하지 않는 한 중량(질량) 기준이다.

[실시예 1]

1.EC세포의 배양 방법

EC세포는 AT805세포(129계 EC세포인 OTT6050의 파생 클론, 이화학 연구소 바이오 리소스 센터 세포 재료 개발실에서 입수)를 사용하였다. AT805세포의 배양은, 10용량% 소 태아 혈청(FCS: JRH 또는 JBS, Hyclone社製) 및 55μM2―머캅토에탄올(GIBCO社製)을 첨가한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: SIGMA사 또는 코진바이오社製)를 사용하여 실시하였다. EC세포는 통상 10O㎜ 접시당 5∼8×1O⁵개의 농도로 파종하고 하루 간격으로 전량 배지 교환과 계대 배양을 반복하였다. 계대 배양에서는, 세포를 HCMF버퍼(pH 7.4, 10mM Hepes, 136.9mM NaC1, 0.34mM Na₂HPO₃, 13.9mM글루코스, 5.37mM KCl)에서 1회 세정 후, 최종 농도 0.025%의 트립신-EDTA·2Na(GIBCO社製)를 용해한 효소 용액을 5㎖ 첨가하고 37℃에서 1분간 효소 처리를 하였다. 그 후, 같은 양의 10% FCS첨가 DMEM을 추가하여 세포를 분산시킨 후, 원심분리에 의해 침전 회수한 세포를 다시 한번 현탁시켜 새로운 배양 접시에 파종하고 계대 배양하였다.

2.EC세포의 분화 유도 및 세포의 회수

트립신 처리에 의해 회수한 EC세포를, 최종농도 0.5∼5용량%의 디메틸술폭시드(DMSO: SIGMA社製)를 첨가한 10용량% FCS첨가 DMEM에서 현탁시켜 1.0×10⁶개/100 ㎜접시의 농도로 파종하였다. 5% CO₂농도 조건하에서 37℃에서 배양하고 14시간후 HCMF버퍼에서 세포를 1회 세정하여 배양액을 10용량% FCS첨가 DMEM에 배지 교환하였다.

DMSO로 처리한 EC세포는, 3일마다 배양액의 반절을 10용량% FCS첨가 DMEM에 교환하면서 배양을 6일간(5용량% DMSO만 19일간) 계속하여 적절히 관찰하였다. 미분화 세포를 포함한 세포 집단이 증식한 시점에서 HCMF 버퍼에서 1회 세정 후 3mM EDTA 및 0.5% BSA를 포함한 Ca²⁺, Mg²⁺ 불포함 PBS(-)(EDTA/BSA-PBS)를 첨가하여 세포를 분산하고 원심조작에 의해 세포를 침전하여 회수하였다. 세포를 다시 EDTA/BSA-PBS에 현탁시키고 FITC표식된 항CD44항체(CD44-FITC: BD Pharmingen社製) 및 PE표식된 항CD29항체(CD29-PE: BD Pharmingen社製)에 의해 이중 염색을 하고 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 분획을 세포 분류기, Epics ALTRA(Beckman Coulter社製)를 사용하여 분리 취득함으로써 미분화 EC세포가 제거된 DMSO처리에 의해 분화 유도한 EC세포 분획을 얻었다(도 2 참조). 이 세포를 DMSO-EC세포라고 명명했다.

또한, 각 DMSO농도로 처리한 경우의 DMSO-EC세포의 비율에 대해서, 표 1에 도시하였다. 표 1에 도시한 바와 같이 DMSO처리 농도에 의존하여 CD44 양성 및 CD29 양성 세포는 증가된다고 판명되었다. 아울러 5용량% DMSO로 처리한 EC세포는 대부분의 세포가 처리 직후에 사멸되기 때문에 처리후의 배양 일수가 다른 처리 농도보다 길게 필요한 반면, 배양 후에 얻어진 CD44 양성 및 CD29 양성 세포는 높은 비율이라는 것이 명백해졌다.

이후의 실험에는, 5용량%의 DMSO를 사용하여 얻어진 세포를 사용하였다.

[표 1]

DMSO농도(v/v%)	배양 일수(일)	세포수(x1O⁷개)	CD44 양성 및 CD29 양성 세포(%)
0
0.5	6	1.15	0.3
1.0	6	1.19	0.5
2.5	6	1.64	13.7
5.0	19	2.83	93.0

<DMSO-EC세포의 클론화>

DMSO-EC세포의 클론화는 클로닝 링에 의한 콜로니의 분리, 혹은 한계 희석법에 의해 수행하였다.

클로닝 링에 의한 세포의 취득에서는, DMSO-EC세포를 배양 접시에 저농도(약 100개)로 파종하고, 증식에 의해 생긴 콜로니의 세포수가 10개 이상이 된 시점에서 멸균된 실리콘 그리스를 클로닝 링의 일단에 바르고 배지를 제거한 접시 바닥면에 세포의 콜로니를 둘러싸도록 부착하였다. 그 후, 클로닝 링내에서 트립신 처리를 하고 세포를 회수하여 증식된 세포부터 차례대로 배양의 스케일을 높여 클론을 취득하였다.

한계 희석법에 의한 클론의 취득은, 상기 방법에 의해 취득한 DMSO-EC세포를 HCMF버퍼에서 1회 세정 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수하였다. 회수된 세포수를 계측하여 1세포/200㎕/웰(설명)이 되도록 96웰 배양 플레이트에 파종하였다. 3∼5일 후에 단일의 콜로니임을 확인하였다. 그 후 5일마다 절반의 배지를 교환하면서 배양을 계속하여 증식된 세포로부터 차례대로 배양의 스케일을 높여 클론을 취 득하였다.

이로써 DMSO-EC세포 유래의 클론 1(DMSO-EC클론 1: Clone#1) 및 클론 2(DMSO-EC 클론 2: Clone#2)를 얻었다.

[실시예 2]

DMSO-EC세포의 성상

(1)위상차 현미경상

상기에서 얻어진 클론 1 및 2의 형태와 EC세포, DMSO-EC세포 및 EC세포 유래 연골계 전구세포인 ATDC5세포(이화학 연구소 바이오 리소스 센터 세포 재료 개발실에서 입수)의 형태를 각각 위상차 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, EC세포는 콜로니 안의 세포가 작고 고밀도로 증식되는 것 외에 콜로니 주변이 부풀어 있어 전형적인 전능성 줄기세포 형태인 것이 관찰되었다. 이에 반해 DMSO-EC나 DMSO-EC클론 1 및 2, ATDC5세포는 모두 콜로니를 구성하는 하나씩의 세포 면적이 크고 부착성 세포로서의 특징인 단일층을 형성하고 있어 특징적인 EC세포의 형태와 명백히 다른 형태를 나타내었다. 이와 같은 부착성 세포 형태는, EC세포보다는 간엽계 세포와 유사하다.

(2)각종 유전자 발현

EC세포, DMSO-EC, DMSO-EC클론 1 및 2, ATDC5세포에서의 각종 유전자 발현을 실시간 PCR(RT-PCR)로 해석하여 각종 마커 유전자의 발현을 검토하였다.

EC세포 및 DMSO-EC, DMSO-EC클론 1 및 2, ATDC5세포로부터의 총RNA의 추출은 TRIzol Reagent(Invitrogen社製)를 사용하여 실시하였다. 해석하는 세포의 배양액 을 제거하고 10O㎜의 배양 접시에 직접 2㎖의 TRIzol Reagent를 떨어뜨려 Cell Scraper(Falcon社製)로 충분히 혼합한 후, 에펜 튜브에 회수하여 폴리트론호모게나이저(폴리트론社製)로 균질화하였다. 그 후의 RNA추출까지의 조작은 첨부된 사용 설명서에 따랐다. 세포·조직에서 추출된 총RNA는 DEPC처리수로 용해하고 분광 광도계로 농도를 산정한 후 -30℃로 저장했다.

세포에서 추출한 총RNA를 주형으로 하여 실시간 PCR(RT-PCR) 해석을 위해 주형이 되는 cDNA를 합성하였다. cDNA합성은, ReverTra Ace(TOYOBO)을 사용하여 실시하고 조작은 첨부된 사용 설명서에 따라 실시하였다.

PCR 및 해석은 ABI PRISM 7000(Applied Biosystems社製)를 사용하여 실시하였다. 폴리메라아제는 SYBR Premix Ex Taq(TAKARA社製)를 사용하고, 내재성 콘트롤은 β-액틴을 사용하였다. RT-PCR전용 96웰플레이트에 1샘플당 SYBR Premix Ex Taq(TAKARA社製)를 13㎕, 20배로 희석한 cDNA반응 용액을 2㎕, 1μM 농도의 프라이머를 각각 5㎕, 멸균수를 5㎕ 첨가하여 최종 용량 25㎕의 반응계를 제조하고 PCR반응을 통상의 방법에 따라 실시하였다. 또 각각의 유전자에 대해서 콘트롤 반응을 하여 검량선을 작성하고 각각 정량화하였다. 해석에 사용한 프라이머의 서열을 표 2 및 표 3에 도시하였다.

유전자 발현은, 각각의 세포에서의 β-액틴의 발현량에 의해 표준화하고 β-액틴 발현량을 일정하게 한 경우의 상대적인 발현량으로 비교하였다. 결과를 표 4에 도시하였다.

[표 2]

Oct3/4-F Oct3/4-R Nanog-F Nanog-R Slug-F Slug-R Pax3-F Pax3-R Wnt1-F Wnt1-R Sox9-F Sox9-R Sox5-F Sox5-R Msx1-F Msx1-R Pax9-F Pax9-R

ATTGAGAACCGTGTGAGGTGGA GCGCCGGTTACAGAACCATAC CAAGGGTCTGCTACTGAGATGCT ATCAGGGCTGCCTTGAAGAG GACCCTGGCTGCTTCAAGGA TATTGCAGTGAGGGCAAGAG CAAGCTGGAGCCAATCAACTG GCGGTGGGAGGGAATCC CCTACGCTTCCTCATGAACCTT TGGCGCATCTCAGAGAACAC GAGGCCACGGAACAGACTC CAGCGCCTTGAAGATAGCATT GCGTTGGACGGGAAGGT TCCTTTTCTGTCCGGCAGTT CAGCCCTATAGAAAGCAAGGA CCCCTCAGAGCAATGCTTTG GGCCAGGCACCGAATG GCCATGCTGGATGCTGAGA

(서열번호:1) (서열번호:2) (서열번호:3) (서열번호:4) (서열번호:5) (서열번호:6) (서열번호:7) (서열번호:8) (서열번호:9) (서열번호:10) (서열번호:11) (서열번호:12) (서열번호:13) (서열번호:14) (서열번호:15) (서열번호:16) (서열번호:17) (서열번호:18)

[표 3]

Wnt5a-F Wnt5a-R Lhx8-F Lhx8-R BMP4-F BMP4-R Runx2-F Runx2-R Dlx1-F Dlx1-R FGF10-F FGF10-R BMP7-F BMP7-R βActin-F βActin-R

CGCCATGAAGAAGCCCATT TCCAGCGGTCCCCAAAG AAGTGGAGAACGGTAATGGGATTAG GCTTTGGATGATTGACGTCTTG TCAAGACACCATGATTCCTGGTAA GCTCGCGCCTCCTAGCA ACGGCCCTCCCTGAACTC GGGATCTGTAATCTGACTCTGTCCTT AGCCGAGCCCGAGCTT CAGCCGGTCCTTCCTAGAAGTT TCCCTCTGGGTACGGATCTG TGGTCGGCTCTCTTGCATAA CGCTCCAAGACGCCAAAG GCTGCTGTTTTCTGCCACACT TGACAGGATGCAGAAGGAGA GCTGGAAGGTGGACAGTGAG

(서열번호:19) (서열번호:20) (서열번호:21) (서열번호:22) (서열번호:23) (서열번호:24) (서열번호:25) (서열번호:26) (서열번호:27) (서열번호:28) (서열번호:29) (서열번호:30) (서열번호:31) (서열번호:32) (서열번호:33) (서열번호:34)

[표 4]

유전자	EC	DMSO-EC	DMSO-EC		ATDC5	마커 종류
유전자	EC	DMSO-EC	#1	#2	ATDC5	마커 종류
0ct3/4	100	0	0	0	0	미분화 세포
Nanog	377	0	0	0	0	미분화 세포
Slug	2	92	100	83	94	신경제세포
Pax3	0	57	92	100	3
Wnt1	0	35	67	32	0
Msx1	48	91	100	91	1	치간엽계 세포
Pax9	1	50	67	100	12
Wnt5a	5	100	86	75	5
Lhx8	4	93	100	54	0
BMP4	0	100	68	97	39
Runx2	0	44	53	53	100
DIx1	7	47	43	46	100
Fgf10	4	15	12	18	5
BMP7	26	3	1	2	0
Sox9	1	10	10	10	100	연골 세포
Sox5	7	4	4	1	58	연골 세포

표 4에 도시된 바와 같이 미분화 줄기세포 마커 유전자인 Oct3/4와 Nanog의 발현은 EC세포에서만 검출되고 DMSO로 처리하여 얻어진 EC세포나 그 클론 세포, ATDC5세포에서는 인정되지 않았다. 신경제세포의 마커 유전자인 Slug, Pax3, Wnt1의 발현은 EC세포에서는 인정되지 않고 Slug는 EC세포 이외의 세포군 모두에서 인정되고, Pax3과 Wnt1은 발현량의 차이는 있지만 EC세포와 ATDC5세포 이외의 DMSO-EC세포군에서 인정되었다.

이로부터 DMSO-EC세포와 그 클론화 세포는 DMSO의 첨가에 의해 미분화 줄기세포로부터 신경제세포로 분화 유도된 세포라는 것이 시사되고, 유전자 발현의 특성으로부터 Oct3/4 음성, Nanog 음성, Slug 양성, Pax3 양성, Wnt1 양성의 세포라는 것이 판명되었다.

한편, 이빨의 간엽 세포의 마커 일군에서는 EC세포에서는 Msx1과 BMP-7이 발현되어 있는 것 외에는 어떠한 유전자도 발현되지 않는 데 반해, DMSO-EC세포 및 그 클론화 세포에서는 Msx1, Pax9, Wnt5a, Lhx8이 특이적으로 고발현되었다. BMP4, Runx2, Dlx1은 DMSO-EC세포 및 그 클론화 세포와 ATDC5세포에서 발현량에 다소의 차이는 있지만 발현이 인정되었다.

또 연골 세포에서의 특이적인 마커 유전자인 Sox9, Sox5의 발현은 ATDC5세포에서만 고발현되었으며, DMSO-EC세포와 그 클론화 세포는 연골계로 분화되지 않은 세포라고 판단되었다.

따라서, DMSO에 의해 EC세포가 신경제세포형 내지는 간엽계 세포형의 세포로 분화 유도된 것은 분명했다.

[실시예 3]

<EC세포에서 분화 유도된 세포의 이빨 형성 능력의 평가>

다음으로 본 발명에 의해 얻어진 DMSO-EC세포, 그 클론화 세포의 상아 아세포로의 분화 능력, 및 이빨의 상아질 형성 능력을 하기한 바와 같이 수행하여 확인하였다.

(1)치배 상피 조직의 제조

C57BL/6마우스(SLC에서 구입)의 태령 14.5일, 배자(胚子)로부터 하악 절치(切齒) 치배 조직을 현미경하에서 통상의 방법으로 적출하였다. 적출한 하악 절치 치배 조직을 PBS(-)로 세정하고 PBS(-)에 최종 농도 1.2U/㎖의 디스파아제II(Roche, Mannheim, Germany)를 첨가한 효소액으로 실온에서 12.5분간 처리한 후, 10% FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 첨가한 DMEM(Sigma, St.Louis, MO)으로 3회 세정하였다. 또 DNaseI용액(Takara, Siga, Japan)을 최종 농도 70U/㎖가 되도록 첨가하여 치배 조직을 분산시키고 25G 주사바늘(Terumo, Tokyo, Japan)을 사용하여 외과적으로 치배 상피 조직을 분리하였다.

(2)재구성 치배의 제작

재구성 치배의 제작에는 상기에서 제조된 치배 상피 조직과, 간엽계 세포로서 EC세포, DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2 중 어느 한 평가 대상 세포를 사용하였다.

치배 재구축에 사용하는 평가 대상 세포군을, 각각 트립신 처리에 의해 접시에서 회수하였다. 실리콘 그리스를 도포한 1.5㎖ 마이크로 튜브(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 10% FCS(JRH) 첨가 DMEM(Sigma)으로 현탁한 평가 대상 세포를 넣고 원심분리(580×g)에 의해 세포를 침전시켜 회수하였다. 원심 후의 배양액의 상청액을 가능한 한 제거하고 다시 한번 원심조작을 하여 실체 현미경으로 관찰하면서 세포의 침전 주위에 잔존하는 배양액을 GELoader Tip 0.5-20μL(에펜돌프社製)를 사용하여 완전히 제거하고 재구성 치배 제작에 사용하는 각각의 평가 대상 세포를 준비하였다.

실리콘 그리스를 도포한 페트리 디쉬에 2.4㎎/㎖의 Cellmatrix type I-A(新田젤라틴社製)를 30㎕ 떨어뜨려 콜라겐 겔드롭을 제작하였다. 이 용액에 상기 평가 대상 세포를 0.1-10㎕의 피펫 팁(에펜돌프社製)을 사용하여 0.2㎕∼10.3㎕ 적용하여 고밀도의 세포 집합체로서 세포 응집체를 제작하였다(세포 밀도: 2×1O⁸개/㎖). 계속해서 1O㎕의 피펫 팁을 사용하여 치배 상피 조직 또는 치배 간엽 조직을 같은 겔드롭 안에 적용하고 텅스텐침을 사용하여 분리한 치배 유래 상피 조직이 본래 간엽 조직과 접촉되어 있던 면을 평가 대상 세포의 세포 응집체에 밀착시켰다. 그 후, 겔 드롭을 고형화시킴으로써 치배 조직과 평가 대상 세포간의 결합을 보다 견고하게 함으로써 고밀도 재구성 치배를 제작하였다.

이것을, 도 3을 참조하여 설명하기로 한다.

피펫 팁(16)에서 먼저 겔 드롭(10)(도 3a 참조) 안에 배치된 세포 응집체(12)는 겔 드롭(10) 안에서 구체를 구성한다(도 3b 참조). 그 후에 다른 쪽 세포 응집체(14)를 밀어넣음으로써 구체의 세포 응집체(12)가 으깨어져 다른 쪽 세포 응집체(14)를 감싸게 되는 경우가 많다(도 3c 참조). 그 후에 겔 드롭(10)을 고형화시킴으로써 세포간의 결합이 견고해진다(도 3d 참조).

(3)재구성한 치배의 기관 배양

겔 속에서 제작한 고밀도 재구성 치배는 CO₂ 배양기에 10분간 정치시켜 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)를 고형화하였다. 10용량% FCS(JRH社製), 0.1㎎/㎖의 L―아스코르빈산(Sigma社製), 2mM의 L―글루타민(GIBCO社製) 첨가 DMEM(Sigma社製)에 셀 컬쳐 인서트(포어 사이즈가 0.4미크론인 PET멤브레인; BD社製)가 접하도록 배양 용기를 준비하였다. 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막위에 재구성 치배를 지지 담체인 주위의 겔과 함께 옮겨 기관 배양하였다.

기관 배양에 의해 이빨의 발생을 해석할 경우에는, 통상 14일간 배양하였다. 기관 배양한 경우에는 이식 후 10∼30일째에 재구성 치배를 적출하고 4% 파라포름 알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정시킨 후, 4.5% EDTA용액(pH 7.4)를 사용하여 24시간 중성 탈회(脫灰)를 수행하였다. 그 후, 통상의 방법에 의해 파라핀으로 감싸서 10㎛의 절편을 제작하였다. 조직학적 해석을 위해서는 통상의 방법에 따라 헤마톡시린-에오신 염색(HE염색)을 하였다.

<기관 배양에 의한 평가>

14.5일령, 하악 절치 치배 상피 조직과 EC세포의 고밀도 재구성 치배에서는 EC세포의 이상 증식에 의해 재구성 치배는 비대화되고 HE염색에서도 이빨의 간엽 세포에서 유래된 상아 아세포나 상아질은 관찰되지 않았다.

이에 반해, DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2에서는 상피 조직과의 상호 작용이 유도되고 위상차 현미경상에서도 치배의 기관 배양과 마찬가지로 조직 유도가 관찰되었다. 또한 DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2에서는 모두 바깥쪽에 에나멜질, 안쪽에 상아질을 가진 재구성 치배를 형성할 수 있다는 것을 HE염색상으로 확인할 수 있어 이빨 특유의 조직 구조를 형성할 수 있다는 것이 나타났다.

이들로부터 DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2는, 치배 상피 세포와의 상호 작용에 의해 이빨의 간엽 조직인 상아 아세포로 분화되어 이빨 특유의 상아질을 생산할 수 있다는 것은 분명했다. 또한, 고밀도 재구성 치배법에 의해 기관 배양에서도 바깥쪽에 에나멜질, 안쪽에 상아질, 내부에 치수 세포, 이빨의 선단과 치근을 가진 이빨 특유의 조직 구조를 가진 이빨을 형성할 수 있다는 것이 분명했다.

[실시예 4]

<신피막하 이식 방법>

다음으로 DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2의 세포와 14.5일령 태아 하악 절치 치배 상피 세포로부터 고밀도 재구성 치배를 제작하고, 얻어진 재구성 치배를 C57BL6 마우스(일본 크레아사에서 입수) 신피막하에 이식하여 이빨 형성 능력을 평가하였다.

실시예 3과 동일하게 하여 제작한 재구성 치배를 48시간 내지 96시간 기관 배양을 한 후, 주위의 겔마다 8주령의 NOD-SCID 마우스(찰스리버사에서 입수)의 신피막하에 이식하여 이소적(異所的)인 이빨의 발생을 진행시켜 해석하였다.

신피막하에 이식한 경우에는 이식 후 10∼30일째에 주위의 신조직(腎組織)마다 재구성 치배를 적출하였다. 적출 조직을 4% 파라포름알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정시킨 후, 4.5% EDTA용액(pH 7.4)을 사용하여 24시간의 중성 탈회를 수행하였다. 그 후, 통상의 방법에 의해 파라핀을 내장시켜 1O㎛의 절편을 제작하였다. 조직학적 해석을 위해서는 통상의 방법에 따라 HE염색을 하였다.

(1)신피막하 이식에 의한 평가

신피막하 이식에서는 14.5일령 태아 절치 치배를 이식한 경우에는 안쪽에 상아질 및 바깥쪽에 에나멜질을 가진 특징적인 구조의 이빨을 16일의 기간에 신피막하 이식에 의해 발생시킬 수 있었다(도 4 참조). 14.5일령 태아 절치 치배에 유래된 치배 상피 조직과 치배 간엽 세포(도 4a 참조), 치배 상피 조직과 DMSO-EC세포(도 4b 참조), 치배 상피 조직과 DMSO-EC클론(클론 #1, 도 4c 참조)에 의한 재구성 치배에서는, 신피막하 이식에 의해 이식 후 14일째에는 정상 치배를 그대로 신피막하에 이식한 경우와 마찬가지로 바깥쪽의 에나멜 아세포, 에나멜질, 그 안쪽에 상 아질, 상아 아세포가 용이하게 인정되었다. 생긴 이빨은 선단과 치근을 가지고 있어 정상 발생한 이빨과 동일한 구조를 가지고 있었다.

이빨 형성의 빈도는 EC세포 및 ATDC세포가 0%인 데 반해, DMSO-EC세포에서는 51.3±8.8%, DMSO-EC클론 1에서는 23.3%±16.7%, 클론 2에서는 33.3%±47.1%였다.

이로부터 DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2는, 이빨의 간엽 유래 조직인 상아 아세포로 분화되어 이빨의 경조직인 상아질을 생산할 수 있다는 것이 명백해졌다. 나아가 고밀도 재구성 치배법에 의해 신피막하 이식에서도 DMSO-EC세포, DMSO-EC클론 1 및 2에 의해 특유의 조직 구조를 가진 이빨을 형성할 수 있다는 것이 명백해졌다.

(2)In situ 하이브리다이제이션

14.5일령 태아 절치 치배에서 유래된 치배 상피 조직과 DMSO-EC세포를 신피막하에 이식하고, 14일후에 적출한 조직에 대해서 In situ 하이브리다이제이션에 의해 에나멜질의 구성 분자인 아멜로제닌과, 상아질의 구성 요소인 덴틴시아로포스포프로틴(DSPP)의 mRNA의 발현 및 치근막 특이적인 유전자인 페티로스타틴 mRNA의 발현을 해석하였다.

신피막하 이식 후 14일째의 재구성 치배를 적출하여 4% 파라포름알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정시킨 후, 4.5% EDTA용액(pH 7.4)을 사용하여 24시간 중성 탈회를 수행하였다. 그 후, 12.5% 수크로오스 용액, 25% 수크로오스 용액에 차례대로 담근 후 OCT compound(SAKURA Finetechnica社製)에 내장하였다. 내장 후에는 클리오스탯(Leica社製)으로 10㎛의 절편을 제작하였다.

상기 절편을 최종 농도 2μg/㎖의 프로테아제K(Nacalai tesque, kyoto, Japan)를 포함한 PBS(-)로 10분간 처리하고 최종 농도 4% 파라포름알데히드(Nacalai tesque)를 포함한 PBS(-)에서 10분간 고정시켰다. 각각 최종 농도로 1.325% 트리에탄올아민, 0.0175N의 HCl(Wako), 0.25% 무수초산을 포함한 디에틸피로카보네이트 처리(DEPC)수로 10 분간 처리한 후, PBS(-)로 5분간 3회 세정하였다. DEPC 수중의 1.5%(v/v) 트리에탄올아민(Nacalai tesque), 0.33N의 HCl(Wako), 0.25%(v/v)의 무수초산(Nacalai tesque)으로 10분간 처리한 후, 2×SSC에서 10분간 2회 세정하였다. 치근막 특이적 유전자인 펠리오스틴(Genbank accession no.NM_015784) 프로브는 센스 프라이머(-7; ggctgaagatggttcctctc:서열번호 35)와 안티센스 프라이머(573; gtacattgaaggaataacca:서열번호 36)를 사용하여 PCR에 의해 취득한 cDNA단편을 DIG표식하여 사용하였다.

정해진 방법에 따라서 in situ 하이브리다이제이션을 수행하여 항DIG―알칼리포스파타아제(AP)Fab프래그먼트(Roche)와 NBT/BCIPStock Solution(Roche)에서 발색시키고 Axio Imager A.1(Zeiss)와 AxioCam MRc5(Zeiss)에서 해석하였다.

그 결과로부터 HE염색상에서의 에나멜 아세포에서는 아멜로제닌 mRNA의 발현이, 상아 아세포에서는 DSPP mRNA의 발현이 각각 인정되었다. 또 펠리오스타틴 mRNA의 발현이 인정되었다. 이로부터 경조직 형성에 관여하는 분자의 mRNA는, 각각이 적절하게 그 생산 세포에서 명백히 발현되고 있었다. 또 치근막에서 발현되는 펠리오스틴이 검출된 것으로 보아 치주 조직이 형성되어 있다는 것이 시사되었다.

[실시예 5]

<레티노인산에 의한 유도>

(1)CD44 양성 및 CD29 양성 세포의 취득을 위한 EC세포의 분화 유도 방법

실시예 1과 동일하게 하여 트립신 처리에서 회수된 AT805세포를 1.0×10⁶개/100㎜접시의 농도로 파종하고, 다음날 최종농도 0∼10.0μM의 레티노인산(RA)(SIGMA社製)을 첨가한 10용량% FCS DMEM으로 치환하여 자극을 가하였다. 배양 72시간후, HCMF버퍼로 2회 세정을 하여 전량 10용량% FCS DMEM으로 배지 교환을 하였다.

(2)RA 처리후의 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 취득

3일마다 10용량% FCS DMEM을 사용하여 절반의 배지 교환을 하면서 배양을 7일간 계속하여 적절히 관찰하였다. RA처리후 증식되어 온 미분화 세포를 포함한 세포 집단을 HCMF로 1회 세정 후, 3mM의 EDTA-0.5% BSA-PBS(-)을 첨가하고 37℃에서 배양하여 회수하였다. 회수 후의 세포는 CD44 FITC(BD Pharmingen) 및 CD29(BD Pharmingen) PE에 의해 이중 염색을 하고 CD44 양성 및 CD29 양성 세포를 Epics ALTRA(Beckman Coulter)를 사용하여 분리 취득함으로써 미분화 세포를 제외한 분화된 세포 집단만을 얻었다. 이 세포를 RA-EC세포로 명명하였다. 결과를 도 5에 도시하였다.

또한, 각 RA농도로 처리한 경우의 RA-EC세포의 비율에 대해서 표 5에 도시한다. 표 5에 도시된 것처럼 RA농도에 의존하여 CD44 양성 및 CD29 양성 세포가 변화되는 것이 판명되었다.

또한, RA처리후의 CD44 양성 및 CD29 양성 세포에 대해서 실시예 2(2)와 마찬가지로 유전자의 발현에 대해서 확인한 바, DMSO-EC세포와 같이 Oct3/4 음성, Nanog 음성, Slug 양성, Pax3 양성, Wnt1 양성의 세포라는 것이 판명되었다.

[표 5]

RA농도(μM)	배양 일수(일)	세포수(×1O⁶개)	CD44 양성 및 CD29 양성 세포(%)
0
0.5	7	1.5	10.8
1.0	7	1.1	10.0
2.0	7	1.3	11.3
5.0	7	0.5	11.5
10.0	7	0.7	10.4

(3)RA처리후의 CD44 양성 및 CD29 양성 세포에 의한 이빨 형성 능력의 평가

상기와 같이 하여 얻어진 CD44 양성 및 CD29 양성 세포(RA농도 2μM)를 사용하여 실시예 3과 동일하게 하여 치배 재구축 및 기관 배양을 하고 평가하였다. 기관 배양 14일 후에는 치배 상피 세포와의 상호 작용에 의해 이빨의 간엽 조직인 상아 아세포로 분화되었다. 또 고밀도 재구성 치배법에 의해 바깥쪽에 에나멜질, 안쪽에 상아질, 내부에 치수 세포를 가진 이빨 특유의 조직 구조를 가진 이빨이 형성되었다(도 6 참조).

또한, RA 처리후의 CD44 양성 및 CD29 양성 세포에 대해서 실시예 4(2)와 동일하게 하여 아멜로제닌 및 DSPP, 펠루오스타틴의 발현을 확인한 바, DMSO-EC와 마찬가지로 각 mRNA의 발현이 인정되었다. 이로부터 경조직, 치근막을 포함한 치주 조직이 형성되어 있다는 것이 시사되었다.

[실시예 6]

(1)CD44 양성 및 CD106 양성 세포 취득을 위한 EC세포의 분화 유도 방법

실시예 1과 동일하게 하여 트립신 처리에 의해 회수된 AT805세포를 1.0×10⁶개/100㎜ 접시의 농도로 파종하고, 다음날 종농도 2μM의 RA(SIGMA社製)를 첨가한 10용량% FCS DMEM으로 치환하여 자극을 가하였다. 배양 72시간후, HCMF버퍼에서 2회 세정을 하고 전량 10용량% FCS DMEM에서 배지를 교환하였다. 다음날, HCMF버퍼로 2회 세정을 하여 죽은 세포를 제거한 후, 10용량% FCS DMEM에서 배양을 더 계속하였다. 이후 하루마다 배지를 교환하면서 7 일간 배양하였다.

(2)CD44 양성 및 CD106 양성 세포 취득

상기 처리에 의해 취득된 미분화 세포를 포함한 세포 집단은 HCMF로 1회 세정 후, 3mM EDTA-0.5% BSA-PBS(-)을 첨가하고 37℃에서 배양하여 회수하였다. 회수 후의 세포는 CD44 FITC(BD Pharmingen) 및 항CD106항체(CD106(BD Pharmingen)PE)에 의해 이중 염색을 하고, CD44 양성 및 CD106 양성 분획을 Epics ALTRA(Beckman Coulter)를 사용하여 분리 취득함으로써 미분화 세포를 제외한 분화된 세포 집단만을 얻었다. 결과를 도 7에 도시하였다.

(3)RA처리후의 CD44 양성 및 CD106 양성 세포에 의한 이빨 형성 능력의 평가

상기와 같이 하여 얻어진 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 사용하여 실시예 3과 동일하게 하여 치배 재구축 및 기관 배양을 하고 평가하였다. 기관 배양 14일 후에는 치배 상피 세포와의 상호 작용에 의해 이빨의 간엽 조직인 상아 아세포로 분화되었다. 또 고밀도 재구성 치배법에 의해 바깥쪽에 에나멜질, 안쪽에 상아질, 내부에 치수 세포를 가진 이빨 특유의 조직 구조를 가진 이빨이 형성되었다.

또한, 이들 CD44 양성 및 CD106 양성 DMSO-EC세포에 대해서 실시예 2(2)와 같이 유전자의 발현에 대해서 확인하였다. 그 결과, CD44 양성 및 CD29 양성 DMSO-EC세포와 마찬가지로 Oct3/4 음성, Nanog 음성, Slug 양성, Pax3 양성, Wnt1 양성의 세포인 것으로 나타났다.

또한, 실시예 4(2)와 동일하게 하여 아멜로제닌 및 DSPP, 펠루오스타틴의 발현을 확인한 바, DMSO-EC와 마찬가지로 각 mRNA의 발현이 인정되었다. 이로써 경조직, 치근막을 포함한 치주 조직이 형성되어 있다는 것이 시사되었다.

[실시예 7]

실시예 6(2) 및 (3)과 동일하게 하여 DMSO-EC세포에 대해서 CD44FITC 및 CD106PE를 사용하여 이중 염색한 바, CD44 양성 및 CD106 양성 세포의 존재가 나타났다. 이들 CD44 양성 및 CD106 양성 DMSO-EC세포에 대해서 실시예 2와 동일하게 유전자의 발현에 대해서 확인한 바, CD44 양성 및 CD29 양성 DMSO-EC세포와 마찬가지로 Oct3/4 음성, Nanog 음성, Slug 양성, Pax3 양성, Wnt1 양성의 세포인 것으로 판명되었다.

여기에서 얻어진 CD44 양성 및 CD106 양성 세포의 세포 집단을 사용하여 실시예 3 및 실시예 4(2)와 마찬가지로 치배 재구축, 기관 배양 및 mRNA의 발현을 하여 평가하였다. 그 결과, 치배 상피 세포와의 상호 작용에 의한 특유의 조직 구조를 가진 이빨이 형성되었다. 또한, 실시예 4(2)와 마찬가지로 아멜로제닌 및 DSPP, 펠루오스타틴의 발현이 인정되었다. 이로써 경조직, 치근막을 포함한 치주 조직의 형성이 가능하다는 것이 시사되었다.

이와 같이 전능성 줄기세포에서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 분화 유도할 수 있으며 이들 세포를 상피계 세포와 함께 구획화하여 배양함으로써 치배를 재구성하여 에나멜질 및 상아질을 가진 특유의 구조를 나타내는 이빨을 제공할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의하면 전능성 줄기세포에서 이빨 형성용 간엽계 세포를 얻을 수 있어 효율적으로 대량으로 이빨을 제작할 수 있다.

일본 출원번호 제2007-011805의 개시는 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원 및 기술 규격은 각각의 문헌, 특허출원 및 기술 규격이 참조로서 반영되는 것이 구체적이며 또한 각각에 기재된 경우와 같은 정도로 본 명세서 중에 참조로서 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Tokyo University of Science Educational Foundation Administrative Organization OTSUKA CHEMICAL CO., LTD. <120> Method of Preparing Mescenchymal Cells for Producing Tooth, Method of Producing Tooth, and Mescenchymal Cells for Producing Tooth <130> CO-F03289-00 <150> JP2007-011805 <151> 2007-01-22 <160> 36 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Oct3/4-F <400> 1 attgagaacc gtgtgaggtg ga 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Oct3/4-R <400> 2 gcgccggtta cagaaccata c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer nanog-F <400> 3 caagggtctg ctactgagat gct 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer nanog-R <400> 4 atcagggctg ccttgaagag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Slug-F <400> 5 gaccctggct gcttcaagga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Slug-R <400> 6 tattgcagtg agggcaagag 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Pax3-F <400> 7 caagctggag ccaatcaact g 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Pax3-R <400> 8 gcggtgggag ggaatcc 17 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Wnt1-F <400> 9 cctacgcttc ctcatgaacc tt 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Wnt1-R <400> 10 tggcgcatct cagagaacac 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Sox9-F <400> 11 gaggccacgg aacagactc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Sox9-R <400> 12 cagcgccttg aagatagcat t 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Sox5-F <400> 13 gcgttggacg ggaaggt 17 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Sox5-R <400> 14 tccttttctg tccggcagtt 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Msx1-F <400> 15 cagccctata gaaagcaagg a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Msx1-R <400> 16 cccctcagag caatgctttg 20 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Pax9-F <400> 17 ggccaggcac cgaatg 16 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Pax9-R <400> 18 gccatgctgg atgctgaga 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Wnt5a-F <400> 19 cgccatgaag aagcccatt 19 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Wnt5a-R <400> 20 tccagcggtc cccaaag 17 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Lhx8-F <400> 21 aagtggagaa cggtaatggg attag 25 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Lhx8-R <400> 22 gctttggatg attgacgtct tg 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer BMP4-F <400> 23 tcaagacacc atgattcctg gtaa 24 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer BMP4-R <400> 24 gctcgcgcct cctagca 17 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Runx2-F <400> 25 acggccctcc ctgaactc 18 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Runx2-R <400> 26 gggatctgta atctgactct gtcctt 26 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Dlx1-F <400> 27 agccgagccc gagctt 16 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Dlx1-R <400> 28 cagccggtcc ttcctagaag tt 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer FGF10-F <400> 29 tccctctggg tacggatctg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer FGF10-R <400> 30 tggtcggctc tcttgcataa 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer BMP7-F <400> 31 cgctccaaga cgccaaag 18 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer BMP7-R <400> 32 gctgctgttt tctgccacac t 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer beta Actin-F <400> 33 tgacaggatg cagaaggaga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer beta Actin-R <400> 34 gctggaaggt ggacagtgag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> periostin primer -7 <400> 35 ggctgaagat ggttcctctc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Periostin primer 573 <400> 36 gtacattgaa ggaataacca 20

Claims

이빨을 형성하기 위해 사용되는 간엽계 세포의 제조방법으로서,

전능성 줄기세포를 분화 유도제의 존재하 에서 배양하여 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 포함한 분화 유도 처리후의 세포 집단을 생성하는 것,

상기 분화 유도 처리후의 세포 집단에서 CD44 양성 및 CD29 양성 세포 또는 CD44 양성 및 CD106 양성 세포를 이빨 형성용 간엽계 세포로서 선별하는 것

을 포함한 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 이빨 형성용 간엽계 세포가 또한 Slug 유전자, Pax3 유전자, Msx1 유전자 및 Pax9 유전자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 발현하고 있는 것인 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 이빨 형성용 간엽계 세포가 또한 Slug 유전자 및 Pax3 유전자를 함께 발현하고 있는 것인 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포가 배아 줄기세포, 배아 암종 세포, 배아 생식 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포가 배아 암종 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 유도제가 디메틸술폭시드 및 레티노인산에서 선택된 적어도 하나인 제조방법.
지지 담체의 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 어느 하나로만 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 어느 다른 하나로만 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 것,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것,

을 포함하고, 상기 간엽계 세포가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 상기 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 것인 이빨의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 배양이 치주 조직이 형성될 때까지 계속되는 것인 이빨의 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 상피계 세포가 치배 유래의 것인 이빨의 제조방법.
전능성 줄기세포에서 유도되는 CD44 양성 및 CD29 양성 또는 CD44 양성 및 CD106 양성의 이빨 형성용 간엽계 세포.
제10항에 있어서, 상기 이빨 형성용 간엽계 세포가 또한 Slug 유전자, Pax3 유전자, Msx1 유전자 및 Pax9 유전자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 발현하고 있는 것인 이빨 형성용 간엽계 세포.
제10항에 있어서, 상기 이빨 형성용 간엽계 세포가 또한 Slug 유전자 및 Pax3 유전자를 함께 발현하고 있는 것인 이빨 형성용 간엽계 세포.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포가 배아 줄기세포, 배아 암종 세포, 배아 생식 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 이빨 형성용 간엽계 세포.