CN113755423B - 胚胎癌性细胞在制备3d细胞培养基质中的应用、制备方法及3d细胞培养基质 - Google Patents

胚胎癌性细胞在制备3d细胞培养基质中的应用、制备方法及3d细胞培养基质 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用、制备方法及3D细胞培养基质，涉及生物技术领域，本发明的发明人通过实验发现，胚胎癌性细胞在分化过程中会分泌高含量的可溶性基底膜混合物，该基底膜混合物在室温下，可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，从而用于制备可满足不同需求的3D细胞培养基质。并且，可以根据后续培养需求选择同源的胚胎癌性细胞制备3D细胞培养基质，有效避免因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制，制作繁琐等问题。

Description

胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用、制备方法及 3D细胞培养基质
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用、制备方法及3D细胞培养基质。
背景技术
与2D细胞培养相比，3D培养的细胞表现出更高程度的细胞间相互作用，具有更多生理相关的形态，能更好地再现高阶组织过程。近几年干细胞和3D细胞培养系统正逐渐成为再生医学、药物开发、毒理学和癌症研究的关键模型，在基础研究和转化医学应用中具有重要意义，在再生医学、疾病模型、个性化药物筛选、精准医学等领域具有广阔的应用前景。
目前市场主打产品如BD公司的Matrigel基底膜提取物是将肿瘤肉瘤经过分离纯化方法获得。虽然BD基底膜可支持细胞层，还能在组织形成中影响细胞的粘附、迁移、增值和分化，但这种基底膜为异源产物，容易造成因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制等其他不利影响，并存在产品批次之间的差异。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种3D细胞培养基质的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述的制备方法制备得到的3D细胞培养基质。
本发明提供了胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用。
进一步地，所述胚胎癌性细胞为小鼠畸胎瘤细胞。
本发明还提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括使用硫酸铵沉淀胚胎癌性细胞的细胞培养液，将得到的沉淀经尿素复溶后，取上清进行透析复性，得到所述3D细胞培养基质。
进一步地，所述胚胎癌性细胞为单细胞或细胞株，优选为小鼠畸胎瘤细胞株。
进一步地，使用无血清的细胞培养液培养胚胎癌性细胞，优选使用无血清的DMEM培养液；
优选地，所述培养的时间为18～24小时。
进一步地，所述硫酸铵沉淀包括在10～30％wt/vol硫酸铵溶液中混合8～14小时，优选在20％wt/vol硫酸铵溶液中混合12小时；
优选地，所述混合的温度为4℃；
优选地，去除胚胎癌性细胞的细胞培养液中的细胞碎片后，再进行硫酸铵沉淀。
进一步地，所述尿素复溶包括将得到的沉淀溶解在含有2～4M尿素和20～150mMNaCl的Tris-HCl缓冲液中混合8～14小时，优选将得到的沉淀溶解在含有2M尿素和50mMNaCl的Tris-HCl缓冲液中混合12小时；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～100mM，pH为7.4，优选浓度为50mM；
优选地，将得到的沉淀浓缩后再进行尿素复溶。
进一步地，所述透析复性包括依次进行的一次透析、二次透析和三次透析；
优选地，使用透析袋进行透析。
进一步地，所述一次透析包括在4℃透析8～14小时；
可选地，所述二次透析包括在含有20～150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液中透析8～14小时，优选含有50mM NaCl；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～100mM，pH为7.4，优选浓度为50mM；
可选地，所述三次透析包括在DMEM溶液中透析，所述透析的温度为4℃。
另外，本发明还提供了上述的制备方法制备得到的3D细胞培养基质。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明的发明人通过实验发现，胚胎癌性细胞在分化过程中会分泌高含量的可溶性基底膜混合物，其主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含转化生长因子-b、成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子等。该基底膜混合物在室温下，可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，从而用于制备可满足不同需求的3D细胞培养基质。并且，可以根据后续培养需求选择同源的胚胎癌性细胞制备3D细胞培养基质，有效避免因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制，制作繁琐等问题。
本发明提供的3D细胞培养基质的制备方法，通过对胚胎癌性细胞的细胞培养液进行硫酸铵沉淀、尿素复溶和透析复性即可得到目标产物，该方法操作简单、观察方便且成本低廉。
基于上述有益效果，本发明提供的3D细胞培养基质可以有效帮助上皮细胞等各类细胞的附着和分化，同时还会影响细胞的蛋白表达水平，支持周围神经再生和上皮细胞分化等，具有质量稳定、不易降解等优点，填补了国内外干细胞和3D细胞基底培养物技术方面的科技和产品空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1提供的人乳腺细胞MCF-10A在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有发明的3D细胞培养基质(B)中生长比较的结果图；
图2为本发明实验例2提供的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成实验在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有发明的3D细胞培养基质(B)中的比较的结果图；
图3为本发明实验例3提供的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有本发明的3D细胞培养基质(B)中球体spheroid生长比较的结果图；
图4为本发明实验例4提供的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析本发明3D细胞培养基质以及其他同类产品的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的发明人针对现有技术中使用肿瘤肉瘤细胞制备3D细胞培养基质所带来的问题，通过广泛而深入的研究，发现使用胚胎癌性细胞制备3D细胞培养基质具有更优质的性能，在此基础上完成了本发明。
根据本发明的第一个方面，提供了胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用。
胚胎癌性细胞是在胚胎发育早期形成的一种恶性肿瘤细胞，具有类似干细胞的多种分化潜能，本发明的发明人利用胚胎癌性细胞的这一特性，发现其在分化过程中会分泌高含量的可溶性基底膜混合物，且主要成分包括利于细胞附着和分化的层黏连蛋白、胶原IV等，同时含转化生长因子-b、成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子等。该基底膜混合物在室温下，可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，从而用于制备可满足不同需求的3D细胞培养基质。
并且，在实际使用过程中，可以根据后续培养需求选择同源的胚胎癌性细胞制备3D细胞培养基质，例如当需3D培养的细胞为鼠源细胞，则在选择胚胎癌性细胞时，可相应选择同为鼠源的胚胎癌性细胞，例如可以为，但不限于小鼠畸胎瘤细胞。基于此，即可有效避免因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制、批间批次差别较大、制作繁琐、生产成本高及制备周期长等其他不利影响。
根据本发明的第二个方面，提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括使用硫酸铵沉淀胚胎癌性细胞的细胞培养液，将得到的沉淀经尿素复溶后，取上清进行透析复性，得到所述3D细胞培养基质。
此制备方法操作简便可行，取代传统的肿瘤肉瘤分离纯化技术方法，操作简单，观察方便，基于此，能有效避免因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制，批间批次差别较大，制作繁琐，生产成本高，制备周期长等其他不利影响，同时对技术人员的专业性要求较低，适于推广应用。
在一些优选地实施方式中，所述胚胎癌性细胞为单细胞或细胞株。
选择单细胞或由单细胞增殖形成的细胞株作为胚胎癌性细胞，能够将应用该胚胎癌细胞制备得到的3D细胞培养基质之间的批次差异降到最小，从而有效克服现有技术中产品批次间差异的问题。
在一些优选地实施方式中，使用无血清的细胞培养液培养胚胎癌性细胞，优选使用无血清的DMEM培养液。
使用无血清培养基进行胚胎癌性细胞的培养，与传统的培养基相比，既能满足细胞在体外长时间培养的要求，又能避免动物血清所带来的不利因素，比如可重复性差、疾病传播和免疫反应的风险高等问题。
其中，使用无血清的细胞培养液培养胚胎癌性细胞的时间为18～24小时，例如可以为，但不限于18小时、20小时、22小时或24小时。
在一些优选的实施方式中，所述硫酸铵沉淀包括在10～30％wt/vol硫酸铵溶液中混合8～14小时，浓度例如可以为，但不限于10％wt/vol、15％wt/vol、20％wt/vol、25％wt/vol或30％wt/vol，时间例如可以为，但不限于8小时、10小时、12小时或14小时。其中，可以采用搅拌的方式进行混合。
优选地，所述混合的温度为4℃，在4℃条件下进行沉淀操作，能够在保证有效成分活性的基础上，保证沉淀效率。
优选地，去除胚胎癌性细胞的细胞培养液中的细胞碎片后，再进行硫酸铵沉淀。通过去除细胞碎片等杂质，能够进一步提升产物的纯度，更利于后续3D细胞培养。
在一些优选的实施方式中，所述尿素复溶包括将得到的沉淀溶解在含有2～4M尿素和20～150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液中混合8～14小时，其中尿素的含量例如可以为，但不限于2M、3M或4M，NaCl的含量例如可以为，但不限于20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、120mM或150mM，混合时间例如可以为，但不限于8小时、10小时、12小时或14小时，优选混合12小时。
通过选择特定的复溶液对沉淀进行复溶，对基底物的溶解度高，复性效果好。
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～100mM，例如可以为，但不限于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，优选浓度为50mM，pH为7.4；
优选地，将得到的沉淀浓缩后再进行尿素复溶，浓缩后再复溶能够进有效提升复溶效率，同时减少杂质干扰。
在一些优选的实施方式中，所述透析复性包括依次进行的一次透析、二次透析和三次透析。
三次透析能够更好地提高基底物蛋白复性效率，防止蛋白变性。
其中，一次透析包括在4℃透析8～14小时，例如可以为，但不限于8小时、10小时、12小时或14小时；
二次透析包括在含有20～150mMNaCl的Tris-HCl缓冲液中透析8～14小时，NaCl含量例如可以为，但不限于20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、120mM或150mM，优选含有50mMNaCl，时间例如可以为，但不限于8小时、10小时、12小时或14小时；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～100mM，例如可以为，但不限于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，优选浓度为50mM，pH为7.4；
三次透析包括在DMEM溶液中透析，所述透析的温度为4℃。
根据本发明的第三个方面，提供了应用上述制备方法制备得到的3D细胞培养基质。
基于本发明应用及制备方法的有益效果，本发明提供的3D细胞培养基质可以有效帮助上皮细胞等各类细胞的附着和分化，同时还会影响细胞的蛋白表达水平，支持周围神经再生和上皮细胞分化等，具有质量稳定、不易降解等优点，填补了国内外干细胞和3D细胞基底培养物技术方面的科技和产品空白。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括：
将F9细胞株放入大约40个150cm2塑料组织培养板里，于无血清的DMEM培养液中培养18～24小时，条件为37℃，5％CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，20％(wt/vol)硫酸铵溶液中搅拌过夜。沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在2M尿素和50mMNaCl，50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中搅拌12小时，然后离心取上清液，4℃透析过夜，再转到50mM Tris-HCl，50mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，最后转到DMEM溶液中4℃下透析。结束后，将产品分装并冻存在-80℃。
实施例2
本实施例提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括：
将F9细胞株放入大约40个150cm2塑料组织培养板里，于无血清的DMEM培养液中培养18～24小时，条件为37℃，5％CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，10％(wt/vol)硫酸铵溶液中搅拌过夜。沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在2M尿素和150mMNaCl，10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中搅拌12小时，然后离心取上清液，4℃透析过夜，再转到100mM Tris-HCl，20mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，最后转到DMEM溶液中4℃下透析。结束后，将产品分装并冻存在-80℃。
实施例3
本实施例提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括：
将F9细胞株放入大约40个150cm2塑料组织培养板里，于无血清的DMEM培养液中培养18～24小时，条件为37℃，5％CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，30％(wt/vol)硫酸铵溶液中搅拌过夜。沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在4M尿素和20mMNaCl，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中搅拌12小时，然后离心取上清液，4℃透析过夜，再转到10mM Tris-HCl，150mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，最后转到DMEM溶液中4℃下透析。结束后，将产品分装并冻存在-80℃。
对比例1
本对比例提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括：
将F9细胞株放入大约40个150cm2塑料组织培养板里，于无血清的DMEM培养液中培养18～24小时，条件为37℃，5％CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，8％(wt/vol)硫酸铵溶液中搅拌过夜。沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在5M尿素和15mMNaCl，120mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中搅拌12小时，然后离心取上清液，4℃透析过夜，再转到120mM Tris-HCl，15mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，最后转到DMEM溶液中4℃下透析。结束后，将产品分装并冻存在-80℃。
对比例2
本对比例提供了一种3D细胞培养基质的制备方法，包括：
将F9细胞株放入大约40个150cm2塑料组织培养板里，于无血清的DMEM培养液中培养18～24小时，条件为37℃，5％CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，20％(wt/vol)硫酸铵溶液中搅拌过夜。沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在2M尿素和50mMNaCl，50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中搅拌12小时，然后离心取上清液，转到50mM Tris-HCl，50mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中透析12小时。结束后，将产品分装并冻存在-80℃。
为便于区分本发明各实施例及对比例提供的方案，将各实例的不同之处列于下表中：
实验例1
人乳腺细胞MCF-10A腺泡在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有本发明实施例1提供的3D细胞培养基质(B)中生长10天的比较。
用本发明实施例1提供的3D细胞培养基质混悬液预先固定在8孔腔室玻片培养皿中，再将MCF-10A细胞培养在8孔腔室玻片培养皿中，让MCF-10A细胞培养物生长10天，然后将细胞洗涤固定并用溴化乙锭染色，在奥林帕斯荧光显微镜下观察(罗丹明荧光滤光片)，研究这些细胞的腺泡形态发生。同时使用没有发明的3D细胞培养基质做对比。
结果表明，相比于未使用本发明实施例1提供的3D细胞培养基质培养的人乳腺细胞MCF-10A腺泡，使用了本发明实施例1提供的3D细胞培养基质培养的人乳腺细胞MCF-10A腺泡能生长成更完整的形态。
实验例2
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成管状网络实验在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有本发明实施例1提供的3D细胞培养基质(B)中的比较。
将本发明实施例1提供的3D细胞培养基质50μl放入96孔板的相应孔中，在37℃培养30分钟后凝胶化，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板上，并在内皮细胞生长培养基(ECGM)中培养(细胞应用)，初始密度为5×104个细胞/孔，37℃，5％CO2持续孵育4-6小时，然后用奥林帕斯倒置显微镜观察毛细血管样结构。结果跟没有发明的3D细胞培养基质预涂在96孔中做对比。
结果表明，相比于未使用本发明实施例1提供的3D细胞培养基质，使用了本发明实施例1提供的3D细胞培养基质培养的人脐静脉内皮细胞更能促进血管的生成，形成的管状网络更清晰完整。
实验例3
人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)在没有此发明的3D细胞培养基质(A)和有本发明实施例1提供的3D细胞培养基质(B)中球体spheroid生长比较。
将MDA-MB-231乳腺癌细胞和本发明实施例1提供的3D细胞培养基质悬浮混合(10％)在96孔中以3000个细胞/孔培养接种，37℃，5％二氧化碳孵育72小时、诱导制备，静态培养球体形成。隔24小时更换培养基，用新鲜培养基代替。球体形成后用奥林帕斯倒置显微镜拍摄，并且图像分析采用ImageJ软件。
结果表明，相比于未使用本发明实施例1提供的3D细胞培养基质，使用了本发明实施例1提供的3D细胞培养基质培养的人乳腺癌细胞增殖形成完整的球形spheroid结构。
实验例4
聚丙烯酰胺凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色分析本发明实施例1提供的3D细胞培养基质(1-3列)以及其他同类产品(4-6列)：可以看到本发明实施例1提供的3D细胞培养基质170KD处有副层粘连蛋白Entactin(如图4所示)。
结果表明，本发明实施例1提供的3D细胞培养基质中含有更多巢原蛋白(Entactin)，能连接层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白，并与层粘连蛋白和蛋白多糖的核心形成三级复合物，更有利于各类细胞的生长附着和分化。
实验例5
将本发明实施例1-3及对比例1-2提供的3D细胞培养基质进行的人乳腺细胞MCF-10A腺泡培养实验，使用奥林巴斯显微镜和ImageJ软件测量每个腺泡结构的面积值，并将其粘贴到excel电子表格中计算腺泡平均粒径值，结果如下表所示：
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.胚胎癌性细胞在制备3D细胞培养基质中的应用；
所述胚胎癌性细胞为小鼠畸胎瘤细胞F9；
所述3D细胞培养基质的制备方法为：将小鼠畸胎瘤细胞F9细胞株于无血清的DMEM培养液中培养18~24小时，条件为37℃，5% CO2，随后离心收集培养基，澄清细胞碎片，并在4℃，10~30% wt/vol硫酸铵溶液中搅拌过夜；沉淀的蛋白质通过离心浓缩，溶解在2~4 M尿素和20~150mM NaCl，10~100 mM Tris-HCl缓冲液中搅拌8~14小时，然后离心取上清液，在2~4 M尿素和20~150mM NaCl，10~100 mM Tris-HCl缓冲液中4℃透析过夜，再转到20~150 mMTris-HCl，10~100mM NaCl缓冲液中透析8~14小时，最后转到DMEM溶液中4℃下透析，得到所述3D细胞培养基质；
所述3D细胞培养基质用于3D培养人乳腺细胞形成腺泡，和/或，
所述3D细胞培养基质用于3D培养人脐静脉内皮细胞形成血管，和/或，
所述3D细胞培养基质用于3D培养人乳腺癌细胞形成球形结构。
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