JP2006304668A - タンパク質の生産に用いることが可能なｆ９胚性腫瘍細胞、およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 各種細胞外マトリックス分子を組み込んだ細胞外基質や分泌タンパク質を、効率よく大量調製する用途に好適に用いることのできるＦ９胚性腫瘍細胞と、その代表的な利用技術を提供する。
【解決手段】 少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞であって、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座には、ラミニンα１遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列が設けられているＦ９胚性腫瘍細胞によれば、各種細胞外マトリックス分子を組み込んだ細胞外基質や分泌タンパク質を、効率よく大量調製する用途に好適に用いることができる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞とその利用とに関するものであり、特に、ラミニンα１遺伝子を改変することにより、ラミニンをはじめとするさまざまなタンパク質や組み換えタンパク質を組み込んだ細胞外マトリックスや分泌タンパク質等を大量かつ安価に生産する用途に好適に用いることができるＦ９胚性腫瘍細胞とその代表的な利用技術とに関するものである。

基底膜は、ラミニン、IV型コラーゲン、ナイドジェンおよびパールカンを主成分として含む厚さ１００ｎｍ程度の構造物である。近年、上皮細胞や実質細胞の極性の維持、増殖、生存および分化が、基底膜と細胞表面のレセプター分子との相互作用によって制御されていることを示す証拠が多く得られている。

基底膜の主要構成タンパク質の一つであるラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の３本のサブユニットからなるヘテロ３量体タンパク質であって、それぞれのサブユニットには、５種類、３種類（または４種類）および３種類のアイソフォームの存在が知られている。それらの組み合わせによって、種々の機能を示すラミニンアイソフォームが構成される。

ラミニン−１は、α１β１γ１、ラミニン−２は、α２β１γ１、ラミニン−３は、α１β２γ１、ラミニン−４は、α２β２γ１、ラミニン−５は、α３β３γ２、ラミニン−６は、α３β１γ１、ラミニン−７は、α３β２γ１、ラミニン−８は、α４β１γ１、ラミニン−９は、α４β２γ１、ラミニン−１０は、α５β１γ１、ラミニン−１１は、α５β２γ１、ラミニン−１２は、α２β１γ３、ラミニン−１３は、α３β２γ３、ラミニン−１４は、α４β２γ３、ラミニン−１５は、α５β２γ３の各組み合わせである。

以上のように、ラミニンは、多くのラミニンアイソフォームからなり、他の基底膜主要構成タンパク質と比較して多様性に富む。したがって、各ラミニンアイソフォームが基底膜の多様性を規定する重要な分子であることが示唆されている。実際、これらラミニンアイソフォームは、様々の組織において発生段階に応じた特異的な発現パターンを示す。またラミニンの各サブユニットのノックアウトマウスは特異的な表現型を示す。以上のことは、各ラミニンアイソフォームが細胞の増殖、生存および分化の制御において、特異的な働きを有することを示している。

ラミニンアイソフォームの中には、研究および産業分野において多く用いられているものもある。そのため、生理活性を有するラミニンアイソフォームを含む基底膜様基質を大量に安定的かつ安価に調整する技術が求められている。

従来から、上記ラミニンアイソフォームを調製する技術として、生体組織や細胞培養液から直接精製する技術が知られている（非特許文献１および非特許文献２参照）。

また、ラミニン−１を調製する技術として、マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍を用いる技術が知られている。上記ＥＨＳ腫瘍を用いると、基底膜成分を高濃度で含む粗抽出物（例えば、ラミニン−１を３−１０ｍｇ／ｍｌ程度で含む粗抽出物）が容易に得られる。この粗抽出物は、ラミニン−１の精製原料としてのみならず、基底膜様基質として様々な細胞の培養やアッセイに広く使用され、組織工学、発生工学および再生医学の分野において非常に重要な材料となっている（非特許文献３参照）。

さらに、所望のラミニンアイソフォームを生産するために、培養細胞中で各種ラミニンサブユニットを組換え蛋白質として強制発現する技術も用いられている。この技術では、培養細胞として、ヒト腎由来２９３細胞などを用い、発現ベクターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーターを有する発現ベクター等が用いられる（非特許文献４乃至７参照）。
Wewer UM et al, Methods Enzymol 1994;245:85-104 Kikkawa Y et al, J. Biol. Chem 1998,273,15854-9 Kleinman HK et al, Biochemistry, 1986, 25:312-8 Kortesmaa J, J. Biol Chem, 2000,275:14853-9 Doi M et al, J Biol Chem, 2002,277:12741-8 Hayashi Y et al , Biochem Biophys Res Commun 2002,299:498-504 Ido H et al, J. Biol. Chem, 2004, 279:10946-54

しかしながら、上記従来の技術は、生理活性を有する所望のラミニンアイソフォームを含む基底膜様基質を大量に安定的かつ安価に調製することが困難であるという課題を有する。

まず、非特許文献１に開示されているような、生体から直接精製する技術では、一般にラミニンをはじめとする基底膜の構成成分の精製は困難である。これは、生体での基底膜の厚さは、殆どの組織において１００ｎｍ程度というサブマイクロメートルのレベルに保たれているため、基底膜様基質の量を十分に確保することが困難であることによる。

また、非特許文献３に開示されているような、ＥＨＳ腫瘍を用いる技術では、ＥＨＳ腫瘍は、ラミニン１を精製するために精製原料として用いられるが、他のラミニンアイソフォームは、ほとんど発現していないため、上記他のラミニンアイソフォームの精製原料としては適しているとはいえない。

さらに、非特許文献４乃至７に開示されているような、組み換えタンパク質としてラミニンを発現させて精製する技術では、組み換えタンパク質の発現および精製の効率が悪いことが知られている。これは、ラミニンは複雑な糖鎖修飾をうける３本のサブユニットからなる３量体であることによる。しかも、この精製ラミニンは生理的に不活性なラミニンをも含んでいるので、上記精製ラミニン中に活性なラミニンが、どの程度含有されているかという点も実用上大きな問題となる。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、各種細胞外マトリックス分子を組み込んだ細胞外基質や分泌タンパク質を、効率よく大量調製する用途に好適に用いることのできるＦ９胚性腫瘍細胞と、その代表的な利用技術を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ラミニンα１遺伝子座に、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入することで、細胞外マトリックス分子を組み込んだ細胞外基質や分泌タンパク質を、効率的に生産することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞は、上記の課題を解決するために、少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞であって、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座には、ラミニンα１遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列が設けられていることを特徴としている。

上記Ｆ９胚性腫瘍細胞においては、他方の遺伝子座では、ラミニンα１遺伝子が破壊されていることが好ましい。また、前記外来遺伝子挿入配列には、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挿入することがより好ましい。ここで、前記基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子としては、ラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子等を挙げることができる。

また、前記外来遺伝子挿入配列には、マーカー遺伝子が含まれることが好ましく、当該マーカー遺伝子としては、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子または分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子を用いることが好ましい。また、蛍光蛋白質をコードする遺伝子としては、ＥＧＦＰ遺伝子、ＡｃＧＦＰ遺伝子、ＡｍＣｙａｎ遺伝子、ＡｓＲｅｄ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、ＥＢＦＰ遺伝子、ＥＣＦＰ遺伝子、ＥＹＦＰ遺伝子、ＨｃＲｅｄ遺伝子、ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子、ＺｓＹｅｌｌｏｗ遺伝子（クロンテック社）を挙げることができる。

本発明には、上記Ｆ９胚性腫瘍細胞を用いる細胞外マトリックスの生産方法や、上記Ｆ９胚性腫瘍細胞を用いて、細胞分化誘導因子、分化阻害因子または抗癌剤をスクリーニングする方法も含まれる。

さらに、本発明には、上記Ｆ９胚性腫瘍細胞の作製方法（生産方法）も含まれる。具体的には、少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法であって、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座に、ラミニン遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を組み込む工程を含む方法を挙げることができる。

上記作製方法においては、さらに、上記外来遺伝子挿入配列に、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含むことが好ましく、さらに、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、他方の遺伝子座のラミニンα１遺伝子を破壊する工程を含むことが好ましい。

以上のように、本発明では、Ｆ９胚性腫瘍細胞において、ラミニンα１遺伝子座に、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するか、挿入可能としている。これによって、所望の遺伝子の発現をラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御下にて行うことが可能となる。それゆえ、分化誘導剤などにより上記Ｆ９胚性腫瘍細胞を分化誘導すれば、所望の遺伝子の発現を誘導することが可能となる。その結果、各種細胞外マトリックス分子を組み込んだ細胞外基質や分泌タンパク質を、効率よく大量調製することが可能になるという効果を奏する。

本発明の一実施形態につい具体的に説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。

（Ｉ）本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞
本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞（以下、単に「Ｆ９細胞」と称する場合もある）は、少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なものであり、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座には、ラミニンα１遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列が設けられているものである。

〔ラミニン遺伝子座〕
上記ラミニンα１遺伝子座は、第１７番染色体上に位置する。ラミニンα１遺伝子のプロモーターは、さまざまな刺激によって活性化することができる、例えば、Ｆ９胚性腫瘍細胞を分化誘導することによってラミニンα１遺伝子のプロモーターを活性化することができる。また、後述する実施例では、レチノイン酸及びｃＡＭＰを用いてＦ９胚性腫瘍細胞を分化誘導して、ラミニンα１遺伝子のプロモーターを活性化させている。

本発明では、上記ラミニンα１遺伝子座において、少なくとも一方の遺伝子座には、上記外来遺伝子挿入配列が組み込まれているが、他方の遺伝子座では、ラミニンα１遺伝子が破壊されていることが好ましい。これによって、α１サブユニットの発現が完全に無くなっている。したがって、Ｆ９−／−細胞は、ラミニンα１ノックアウト細胞としてラミニンα１遺伝子の機能解析に利用することが可能となる。また、例えば、ラミニンα１サブユニットの生成を抑制でき、所望の構成（例えば、ラミニンα１サブユニット以外のα鎖を有する）のラミニンアイソフォームを効率的に生産することができる。より具体的には、例えば、Ｆ９胚性腫瘍細胞は、内在性にラミニン−１（α１β１γ１）を発現している。このＦ９胚性腫瘍細胞に、ラミニンα５サブユニットを発現さることによってラミニン−１０（α５β１γ１）を生産しようとした場合、内在性のβ１サブユニットおよびγ１サブユニットは、外来性に発現するα５サブユニットよりも内在性に発現するα１サブユニットとヘテロ３量体タンパク質を形成する。その結果、ラミニン−１０をはじめとする所望のラミニンアイソフォームの生産効率を上げることができなかった。しかし、上述のように、ラミニンα１サブユニットの遺伝子を破壊することにより、所望のラミニンα１サブユニット以外のα鎖を有するラミニンアイソフォームを効率的に生産することができる。

ここで、上記「ラミニンα１遺伝子の破壊」とは、ラミニンα１サブユニットの生成が阻害される状態になっていること指すものとする。上記ラミニンα１遺伝子を破壊するための具体的な手法としては特に限定されるものではなく、従来公知の分子生物学的方法を用いることができる。具体的には、後述する実施例に示すように、相同組換えにより外来配列を挿入し、α１サブユニットのエクソンの一部を欠損することによって発現を抑制する技術を採用している。

〔外来遺伝子挿入配列〕
上記外来遺伝子挿入配列としては、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座には、ラミニンα１遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための遺伝子配列であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、lox配列、Flp recombination target配列（インビトロジェン社）、att関連配列（インビトロジェン社）などを挙げることができる。このとき組換え酵素としては、それぞれＣＲＥリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ｇａｔｅｗａｙクロナーゼを用いることが可能であるが、組換えを生じさせることが可能な酵素であればよく、特に限定するものではない。

上記外来遺伝子挿入配列に挿入される遺伝子としては、特に限定されるものではなく、多種多様な外来遺伝子を挿入することができる。例えば、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。より具体的には、例えば、ラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子を挙げることができる。

また、上記外来遺伝子挿入配列には、さらに、マーカー遺伝子が含まれることが好ましい。このようなマーカー遺伝子としては、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの転写状態（転写が活性化しているか抑制しているか）を判定するための指標として使用可能なものであればよく、従来公知のマーカー遺伝子を用いることができる。具体的には、例えば、ＥＧＦＰ遺伝子、ＡｃＧＦＰ遺伝子、ＡｍＣｙａｎ遺伝子、ＡｓＲｅｄ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、ＥＢＦＰ遺伝子、ＥＣＦＰ遺伝子、ＥＹＦＰ遺伝子、ＨｃＲｅｄ遺伝子、ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子、ＺｓＹｅｌｌｏｗ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子または分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子などを挙げることができる。

上述のようにマーカー遺伝子を有することにより、後述するスクリーニング方法に利用することができる。

〔その他の構成〕
本発明に用いるＦ９胚性腫瘍細胞は、少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なものであればよい。具体的には、例えば、後述の実施例に示すように、常法（例えば、市販されている細胞を購入すること）により取得できるＦ９細胞を好適に使用できる。

上記の構成によれば、ラミニンα１遺伝子のプロモーター制御を受けて発現するように外来性の遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有するため、所望の遺伝子をラミニンα１遺伝子のプロモーター制御下で発現させることが可能となる。また、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入した本発明に係るＦ９胚性腫瘍細胞は、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導することによって所望の遺伝子の発現タイミングを制御することが可能となる。さらに、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導する前の上記Ｆ９胚性腫瘍細胞は、速やかに増殖する。このため、所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得るためには、分化誘導する前に、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞を大量培養し、その後分化誘導することによって所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得ることが可能となる。つまり、本発明のＦ９胚性腫瘍細胞を用いれば、所望の遺伝子を大量に発現させるためのシステムを容易にスケールアップすることが可能である。

（ＩＩ）本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法
本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法（生産方法または製造方法）は特に限定されるものではなく、上記（Ｉ）の項で述べたＦ９胚性腫瘍細胞を作製（生産または製造）できる方法であればよい。例えば、具体的には、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座に、ラミニン遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を組み込む工程（外来遺伝子挿入配列組込み工程）を含んでいればよい。

上記外来遺伝子挿入配列組込み工程では、前述した外来遺伝子挿入配列をラミニン遺伝子座に組み込めばよいが、その具体的な方法は特に限定されるものではなく、本発明において公知の遺伝子組換え技術を用いればよい。後述する実施例では、相同組換え法を利用している。さらに、上記外来遺伝子挿入配列に、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含むことが好ましい。

本発明にかかる作製方法においては、さらに、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、他方の遺伝子座のラミニンα１遺伝子を破壊する工程（ラミニンα１遺伝子破壊工程）を含むことが好ましい。上記ラミニンα１遺伝子破壊工程では、従来公知の遺伝子破壊の常法を好適に使用でき、その具体的な方法は特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例では、相同組換え法により、外来配列をラミニンα１遺伝子に挿入し、エクソンの一部を欠損することによって発現を抑制する方法を用いている。

上記の方法によれば、簡便かつ効率的に本発明に係るＦ９胚性腫瘍細胞を作製することができる。

（ＩＩＩ）本発明の利用
本発明の利用分野は特に限定されるものではないが、具体的には、上記Ｆ９胚性腫瘍細胞を用いる細胞外マトリックスの生産方法、上記Ｆ９胚性腫瘍細胞を用いて、細胞分化誘導因子、分化阻害因子または抗癌剤をスクリーニングする方法等を挙げることができる。

具体的には、本発明に係る細胞外マトリックスの生産方法は、上述のＦ９胚性腫瘍細胞を用いておればよく、その他の具体的な構成や材料等については特に限定されるものではない。上記方法によれば、上述のＦ９胚性腫瘍細胞を用いて所望の細胞外マトリックスを効率的に生産することができる。

また、本発明に係るスクリーニング方法は、上述のＦ９胚性腫瘍細胞を用いていればよく、その他の具体的な構成については特に限定されるものではない。なお、上述のＦ９胚性腫瘍細胞のなかでも、特に、上記外来遺伝子挿入配列にマーカー遺伝子が含まれるものが好ましい。

具体的には、上述のＦ９胚性腫瘍細胞において、マーカー遺伝子の発現は、ラミニンα１遺伝子と同じ発現制御を受ける。ラミニンα１遺伝子の発現は、細胞の分化マーカーとして用いられるので、ラミニンα１遺伝子と同じ発現制御を受けるマーカー遺伝子の発現は、細胞の分化マーカーとして用いることが可能となる。

例えば、後述する実施例に示すＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導した場合、ラミニンα１遺伝子の発現は誘導されるとともに、ＥＧＦＰ遺伝子の発現も誘導される。このとき、分化阻害因子が存在した場合、ラミニンα１遺伝子の発現は誘導されず、かつＥＧＦＰ遺伝子の発現も誘導されない。したがって、ＥＧＦＰ遺伝子が発現されないことを蛍光顕微鏡などによって確認することによって、分化阻害因子が存在することを確認することが可能となる。以上のように本発明の上記外来遺伝子挿入配列にＥＧＦＰ等のマーカー遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞は、分化阻害因子のスクリーニングに用いられることが可能となる。

一方、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導をしない場合、ラミニンα１遺伝子の発現は誘導されず、かつＥＧＦＰ遺伝子の発現も誘導されない。ここに、例えば分化誘導因子が存在した場合、ラミニンα１遺伝子の発現は誘導され、かつＥＧＦＰ遺伝子の発現も誘導される。したがって、ＥＧＦＰ遺伝子が発現されることを蛍光顕微鏡などによって確認することによって、分化誘導因子が存在することを確認することが可能となる。公知の抗癌剤の中には、分化誘導作用を持つものが知られているので、このスクリーニング系は、分化誘導作用を指標とした抗癌剤のスクリーニングに用いることが可能である。

また、上記分化阻害因子、分化誘導因子および抗癌剤は発現ｃＤＮＡライブラリーであってもよい。例えば、発現ｃＤＮＡライブラリーを本発明に係るＦ９胚性腫瘍細胞に導入し、蛍光強度が強くなった細胞をフローサイトメリーによって分離した後、発現ｃＤＮＡライブラリーベクターを回収することによって分化誘導因子を同定することができる。また、同様に、発現ｃＤＮＡライブラリーを上記Ｆ９胚性腫瘍細胞に導入した後、分化を誘導し、そのとき蛍光強度が強くならない細胞をフローサイトメトリーによって分離した後、発現ｃＤＮＡライブラリーベクターを回収することによって分化阻害因子を同定することができる。

ＥＧＦＰ遺伝子の発現の確認は、蛍光顕微鏡などによって簡便かつ安価に行うことが可能となる。したがって、上記外来遺伝子挿入配列にＥＧＦＰ遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞（例えば、Ｆ９−／−ＥＧＦＰ細胞またはＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞）は、小規模から大規模にいたるまで、細胞分化誘導因子、分化阻害因子または抗癌剤のスクリーニングに好適に用いることが可能である。

なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明について、実施例および比較例、並びに図１〜図１２に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。

なお、本明細書中、「Ｆ９−／−細胞」とは、一対のラミニンα１遺伝子のうち、一方が破壊されており、他方に外来遺伝子挿入配列が存在しており、ラミニンα１遺伝子の両方が欠損している細胞を示す。また「Ｆ９＋／−細胞」とは、一対のラミニンα１遺伝子のうち、一方に外来遺伝子挿入配列が存在しているが、他方はそのまま残っており、ラミニンα１遺伝子の片方のみが欠損している細胞を示す。

〔相同組み換えＦ９胚性腫瘍細胞を得るための遺伝子ターゲティングベクターの構造〕
図１に、本発明の相同組み換えＦ９胚性腫瘍細胞を得るためのloxPターゲティングベクターおよびlox2272-loxPターゲティングベクターの構造を示す。

図１（ａ）に示すように、lox2272-loxPターゲティングベクターは、ジフテリアトキシン発現カセット（MC1-Diphteria toxin-PGK polyA）、lox2272配列（外来遺伝子挿入配列）、G418耐性カセット(G418r-PGK polyA)、loxp配列（外来遺伝子挿入配列）を有する。

本発明のlox2272-loxPターゲティングベクターでは、マウスラミニンα１遺伝子の第１エクソンの転写開始起点の下流に、マウスラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けるように、G418耐性遺伝子にフォスフォグルセロキナーゼ由来ポリアデニレーション配列を付加したG418耐性カセット（G418r-PGK polyA）を組み込み、マウスラミニンα１遺伝子の第１エクソンの下流配列および第１イントロンの配列の一部を取り除いた。上記G418耐性カセットの上流端にはlox2272配列を、下流端にはloxP配列を挿入した（Araki K et al,Nucleic Acid Res(2002)30:e103）。またプロモーター上流側にジフテリアトキシン発現カセットを備えている。

上記lox2272-loxPターゲティングベクターでは、G418耐性遺伝子は、ラミニンα１遺伝子プロモーターの制御を受けて発現する。したがってG418耐性遺伝子は、lox2272-loxPターゲティングベクターが組み込まれた細胞を選択するためのマーカーとして機能する。また、ジフテリアトキシン発現カセットは、lox2272-loxPターゲティングベクターのゲノムへの非特異的な組み込みを抑制する。lox2272-loxPターゲティングベクターが、非特異的にゲノムに組み込まれた場合、細胞内においてジフテリアトキシンＡフラグメントが発現し、その細胞を死滅させることが可能となる。また、本実施例において、G418耐性カセットの上流端にはlox2272配列を、下流端にはloxP配列を挿入した。このlox2272配列およびloxP配列によって挟まれた領域は、ＣＲＥリコンビナーゼによって、他のＤＮＡ断片中のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれた領域と組み換えを起こすことが可能となる。つまり本発明のlox2272-loxPターゲティングベクターによってラミニンα１遺伝子座を組み換えたＦ９胚性腫瘍細胞は、後述する遺伝子転換ベクターとＣＲＥリコンビナーゼの発現ベクターとを同時に導入することによって、lox2272配列およびloxP配列によって挟まれた領域間で組み換えを生じることが可能となる。したがって、遺伝子転換ベクターのlox2272配列およびloxP配列によって挟まれた領域に挿入される所望の遺伝子は、組み換えによって、ラミニンα１遺伝子プロモーターの下流に挿入されることとなる。その結果、所望の遺伝子をラミニンα１遺伝子プロモーターの制御下で発現させることが可能となる。本実施例においては、外来遺伝子挿入配列としてlox2272配列およびloxP配列を用い、組み換えを生じさせる酵素としてＣＲＥリコンビナーゼを用いたが、ＣＲＥリコンビナーゼによって組み換えを起こす配列であればよく、上記配列に限定するものではない。また、組み換えを生じさせる酵素としてＣＲＥリコンビナーゼを用いたが、組み換えを生じさせ得るものであればよく、上記酵素に限定するものではない。このとき、上記外来遺伝子挿入配列は、組み換えを生じさせ得る酵素に合わせて選択することが可能である。

また、図１（ｂ）に示すように、loxPターゲティングベクターは、ジフテリアトキシン発現カセット（MC1-Diphteria toxin-PGK polyA）、フォスフォグルセロキナーゼプロモーター、G418耐性カセット(G418r-PGK polyA)およびloxP配列を有する。

マウスラミニンα１遺伝子の第１エクソンの転写開始起点の下流に、フォスフォグルセロキナーゼプロモーターの制御を受けるように、G418耐性遺伝子にフォスフォグルセロキナーゼ由来ポリアデニレーション配列を付加したG418耐性カセット（G418r-PGK polyA）を組み込み、マウスラミニンα１遺伝子の第１エクソンの下流配列および第１イントロンの配列の一部を取り除いた。上記G418耐性カセットの上流端および下流端には、loxP配列を挿入した。またプロモーター上流側にジフテリアトキシン発現カセットを備えている。

上記loxPターゲティングベクターでは、G418耐性遺伝子は、フォスフォグルセロキナーゼプロモーターの制御を受けて発現する。したがってG418耐性遺伝子は、loxPターゲティングベクターが組み込まれた細胞を選択するためのマーカーとして機能する。また、ジフテリアトキシン発現カセットは、loxPターゲティングベクターのゲノムへの非特異的な組み込みを抑制する。loxPターゲティングベクターが、非特異的にゲノムに組み込まれた場合、細胞内においてジフテリアトキシンＡフラグメントが発現し、その細胞を死滅させることが可能となる。

〔破壊された一方のラミニンα１遺伝子座と、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有する他方のラミニンα１遺伝子座とを有するＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９−／−細胞）の樹立〕
図２に、Ｆ９−／−細胞を樹立する方法を示す。

Ｆ９胚性腫瘍細胞は、核型３９ＷＯで、第８染色体のトリソミー、第１４染色体のモノソミーを持つマウス由来胚性癌細胞である。上記Ｆ９胚性腫瘍細胞において、ラミニンα１遺伝子の遺伝子座であるＬＡＭＡ１は、１７番染色体上に存在する。

まず、Ｆ９胚性腫瘍細胞に、制限酵素処理によって直線化したloxPターゲティングベクターを電気穿孔法により導入した後、loxPターゲティングベクターが組み込まれた細胞を選択した。細胞の選択は、G418耐性遺伝子の発現を指標として行った。つまり、geneticinに耐性であるクローンを選択した。更に、選択されたクローンをサザンブロット法によって解析することによって、相同組み換えによって一方のＬＡＭＡ１遺伝子座の第１エクソンが改変された細胞（＃５４）を得た。

図３（ａ）に、相同組み換えによってＬＡＭＡ１遺伝子座の第１エクソンが改変されたＦ９胚性腫瘍細胞（＃５４）と相同組み換えを起こしていないＦ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）のサザンブロット法による解析結果を示す。また、図３（ｂ）に、loxPターゲティングベクターが組み込まれたラミニンα１遺伝子近傍の制限酵素の配置を示す。

Ｆ９胚性腫瘍細胞（＃５４）およびＦ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）から精製されたゲノムＤＮＡを、それぞれSphＩ、NdeＩ、EcoRＩ＋EcoRＶ、MluＩ＋EcoRＩまたはBamHＩによって酵素消化した。酵素消化産物を、電気泳動後、サザンブロット法によって解析した。このとき、SphＩ、NdeＩ、EcoRＩ＋EcoRＶおよびMluＩ＋EcoRＩによる酵素消化産物のサザンブロット法による解析には、配列番号１で示されるＬＡＭＡ１プローブを用い、BamHＩによる酵素消化産物のサザンブロット法による解析には、配列番号２で示されるＮｅｏプローブを用いた。

SphＩによる酵素消化産物の解析では、Ｆ９胚性腫瘍細胞（＃５４）は、3382bpおよび8075bpのバンドを示し、Ｆ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）は、8075bpのバンドを示した。NdeＩによる酵素消化産物の解析では、Ｆ９胚性腫瘍細胞（＃５４）は、7194bpおよび6772bpのバンドを示し、Ｆ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）は、6772bpのバンドを示した。EcoRＩ＋EcoRＶによる酵素消化産物の解析では、Ｆ９胚性腫瘍細胞（＃５４）は、2927bpおよび9550bpのバンドを示し、Ｆ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）は、9550bpのバンドを示した。MluＩ＋EcoRＩによる酵素消化産物の解析では、Ｆ９胚性腫瘍細胞（＃５４）は、5.2kbpおよび3.6kbpのバンドを示し、Ｆ９胚性腫瘍細胞（ｗｔ）は、3.6kbpのバンドを示した。BamHＩによる酵素消化産物の解析では、＃５４は、7.8kbpのバンドを示した。以上のようにして、相同組み換えによって一方のＬＡＭＡ１遺伝子座の第１エクソンが改変されたＦ９胚性腫瘍細胞（＃５４）を選択した。

次にＬＡＭＡ１遺伝子座の第１エクソンが改変されたＦ９胚性腫瘍細胞（＃５４）にＣＲＥリコンビナーゼを一過性に導入したのち、限界希釈法によって単細胞クローンを得た。このときＣＲＥリコンビナーゼを発現することによってloxP配列間で組み換えが生じ、G418耐性カセットを欠損したＦ９胚性腫瘍細胞が得られる。したがって、G418耐性カセットを欠損したＦ９胚性腫瘍細胞を選択するために、上記単細胞クローンの中でG418感受性を示すものを選別した。このクローンでは、図２右上に示すように、２コピーのラミニンα１遺伝子座のうち、１コピーのラミニンα１遺伝子座が破壊されている。

さらに、そのクローンに直線化したlox2272―loxPターゲティングベクターを電気穿孔法により導入した後、再びgeneticinによってクローンを選択した。このクローンでは、lox2272―loxPターゲティングベクターは、破壊されていない１コピーのラミニンα１遺伝子座と相同組み換えを起こす。その結果、ラミニンα１遺伝子座が２コピーとも破壊されたクローンが得られることになる。選択されたクローンはサザンブロット法によって解析され、内在性ラミニンα１遺伝子座の一方を破壊し、かつ他方のラミニンα１遺伝子座に、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有するＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９−／−細胞）を得た。

本発明のＦ９−／−細胞は、ラミニンα１遺伝子のプロモーター制御を受けて発現するように外来性の遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有するため、所望の遺伝子をラミニンα１遺伝子のプロモーター制御下で発現させることが可能となる。ラミニンα１遺伝子のプロモーターは、Ｆ９胚性腫瘍細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などすることによって分化誘導した場合、正に制御される。したがって、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入した本発明のＦ９−／−細胞は、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導する前、所望の遺伝子の発現は低く抑えられているが、分化誘導した後、所望の遺伝子の発現が高く誘導される。つまり所望の遺伝子の発現タイミングを制御することが可能となる。

また、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導する前の上記Ｆ９−／−細胞は、速やかに増殖する。また、例えば、上記外来遺伝子挿入配列に挿入する遺伝子が細胞増殖抑制効果を有する遺伝子である場合、分化誘導しなければ、上記所望の遺伝子の発現は低く抑えられている。したがって、分化誘導する前の上記Ｆ９−／−細胞は、速やかに増殖する。したがって、所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得るためには、分化誘導する前に、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入したＦ９−／−細胞を大量培養し、その後分化誘導することによって所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得ることが可能となる。つまり、本発明のＦ９−／−細胞を用いれば、所望の遺伝子を大量に発現させるためのシステムを容易にスケールアップすることが可能である。

また、上記Ｆ９−／−細胞は、両方のラミニンα１遺伝子座が破壊されている。したがって、上記Ｆ９−／−細胞は、内在性のラミニンα１遺伝子を発現しないので、内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１は、内在性のラミニンα１とヘテロ３量体蛋白質を形成することがない。一方、外来性にαサブユニットを発現させた場合は、Ｆ９−／−細胞が内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１と共にヘテロ３量体蛋白質を形成する。その結果、外来性に発現するαサブユニットに由来する所望のラミニンアイソフォームを優先的に発現することが可能となる。このとき外来性に発現するαサブユニットは、Ｆ９−／−細胞の上記外来遺伝子挿入配列に挿入することによって発現されてもよく、別の発現ベクターによって発現されてもよく、特に限定されるものではない。

また、上記Ｆ９−／−細胞は、両方のラミニンα１遺伝子座が破壊されているため、α１サブユニットの発現が完全に無くなっている。したがって、Ｆ９−／−細胞は、ラミニンα１ノックアウト細胞としてラミニンα１遺伝子の機能解析に利用することが可能となる。

〔ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有するラミニンα１遺伝子座を有するＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９＋／−細胞）の樹立〕
図４に、Ｆ９＋／−細胞を樹立する方法を示す。

まず、Ｆ９胚性腫瘍細胞に、制限酵素処理によって直線化したlox2272-loxPターゲティングベクターを電気穿孔法により導入した後、lox2272-loxPターゲティングベクターが組み込まれた細胞を選択した。細胞の選択は、G418耐性遺伝子の発現を指標として行った。つまり、geneticinに耐性であるクローンを選択した。更に、選択されたクローンをサザンブロット法によって解析することによって、相同組み換えによって一方のＬＡＭＡ１遺伝子座の第１エクソンが改変されたＦ９＋／−細胞を得た。

本発明のＦ９＋／−細胞は、一方のラミニンα１遺伝子のプロモーター制御を受けて発現するように外来性の遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を有するため、所望の遺伝子をラミニンα１遺伝子のプロモーター制御下で発現させることが可能となる。ラミニンα１遺伝子のプロモーターは、Ｆ９胚性腫瘍細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などすることによって分化誘導した場合、正に制御される。したがって、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入した本発明のＦ９＋／−細胞は、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導する前、所望の遺伝子の発現は低く抑えられているが、分化誘導した後、所望の遺伝子の発現が高く誘導される。つまり所望の遺伝子の発現タイミングを制御することが可能となる。

また、レチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導する前の上記Ｆ９＋／−細胞は、速やかに増殖する。また、例えば、上記外来遺伝子挿入配列に挿入する遺伝子が細胞増殖抑制効果を有する遺伝子である場合、分化誘導しなければ、上記所望の遺伝子の発現は低く抑えられている。したがって、分化誘導する前の上記Ｆ９＋／−細胞は、速やかに増殖する。したがって、所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得るためには、分化誘導する前に、上記外来遺伝子挿入配列に所望の遺伝子を挿入したＦ９＋／−細胞を大量培養し、その後分化誘導することによって所望の遺伝子を発現する細胞を大量に得ることが可能となる。つまり、本発明のＦ９＋／−細胞を用いれば、所望の遺伝子を大量に発現させるためのシステムを容易にスケールアップすることが可能である。

このとき、上記Ｆ９＋／−細胞は、一方のラミニンα１遺伝子座から内在性のラミニンα１遺伝子を発現し、他方のラミニンα１遺伝子座から所望の遺伝子を発現する。したがって、上記Ｆ９＋／−細胞の内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１は、内在性に発現するラミニンα１とヘテロ３量体蛋白質を形成するとともに、外来性に発現するαサブユニットともヘテロ３量体蛋白質を形成する。その結果、本発明のＦ９＋／−細胞は、ラミニン−１と外来性に発現するαサブユニットに由来する所望のラミニンアイソフォームとを同時に発現することが可能となる。

〔遺伝子転換プラスミドの構造〕
図２および図４に示したように、Ｆ９−／−細胞およびＦ９＋／−細胞は、一方のラミニンα１遺伝子座に、lox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットを有する。Ｆ９−／−細胞およびＦ９＋／−細胞中に、上流にlox2272配列を有し、かつ下流にloxP配列を有する任意のDNA断片（遺伝子転換プラスミド）とＣＲＥリコンビナーゼ発現プラスミドとを同時に発現させることによって、細胞内のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットをlox2272配列およびloxP配列によって挟まれた任意のＤＮＡ断片に転換することが可能となる。

図５に、遺伝子転換プラスミドの構造を示す。

遺伝子転換プラスミドは、lox2272配列、pCINeoプラスミド（プロメガ社）由来イントロン配列、マルチクローニングサイト、牛成長ホルモンpolyA、ピューロマイシン耐性カセット（PGK promoter-Puromycin-resistance-PGK polyA）、loxP配列を有する。

遺伝子転換プラスミド中のマルチクローニングサイトは、任意の遺伝子を挿入することが可能であるように１種類以上の制限酵素配列を含む配列であるが、任意の遺伝子を挿入することが可能であればよく、特に限定されるものではない。上記マルチクローニングサイトに任意の外来遺伝子のｃＤＮＡを挿入し、この遺伝子転換プラスミドとＣＲＥリコンビナーゼ発現プラスミドとを同時にＦ９−／−細胞またはＦ９＋／−細胞中で発現させることによって、細胞内のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットを遺伝子転換プラスミド中のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたＤＮＡ断片に転換することが可能となる。その結果、Ｆ９−／−細胞またはＦ９＋／−細胞中の一方のラミニンα１遺伝子座に外来遺伝子のｃＤＮＡが挿入される。上記外来遺伝子は、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの下流に挿入されるので、外来遺伝子はラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現する。したがって、外来遺伝子としてラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子などを挿入した場合、外来性のαサブユニットに由来するラミニンは、他の内在性の基底膜構成蛋白遺伝子と協調的に発現される。その結果、内在性の基底膜構成蛋白質と共に協調的に基底膜様の細胞外基質を形成することが可能となる。

本実施例においては、外来遺伝子挿入配列としてlox2272配列およびloxP配列を用い、組み換えを生じさせる酵素としてＣＲＥリコンビナーゼを用いたが、ＣＲＥリコンビナーゼによって組み換えを起こす配列であればよく、上記配列に限定するものではない。また、組み換えを生じさせる酵素としてＣＲＥリコンビナーゼを用いたが、組み換えを生じさせ得る酵素であればよく、上記酵素に限定するものではない。このとき、上記外来遺伝子挿入配列は、組み換えを生じさせ得る酵素に合わせて選択することが可能である。

また、本発明の遺伝子転換プラスミドのピューロマイシン耐性カセットは、フォスフォグルセロキナーゼ由来ポリアデニレーション配列を付加したピューロマイシン耐性遺伝子の上流に、フォスフォグルセロキナーゼ由来プロモーター配列を付加した構造である。上記遺伝子転換ベクターによって遺伝子転換を受けたＦ９−／−細胞またはＦ９＋／−細胞ではG418耐性カセットが取り除かれ、ピューロマイシン耐性カセットが挿入される。したがって、遺伝子転換された細胞はピューロマイシン耐性であると同時にG418感受性となるため、これら薬剤耐性を指標に高い効率で遺伝子転換された細胞を選択することができる。

〔相同組み換えＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞）の樹立方法および同細胞の用途〕
図６にＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞の樹立方法を示す。

ここで、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞とは、上記Ｆ９＋／−細胞の外来遺伝子挿入配列に、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞のことをいう。

上記遺伝子転換ベクターのマルチクローニングサイトにオワンクラゲ由来緑色蛍光蛋白質(ＥＧＦＰ：クロンテック社)ｃＤＮＡを組み込んだ。この遺伝子転換ベクターをＣＲＥリコンビナーゼ発現プラスミドとともにＦ９＋／−細胞に導入した。Ｆ９＋／−細胞内のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットは、遺伝子転換プラスミド中のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたEGFP遺伝子およびピューロマイシン耐性カセットを含むＤＮＡ断片に転換される。したがって、部位特異的組み換えが起こったＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を選択するために、まずピューロマイシン耐性クローンを選択した後、得られたクローンからG418感受性を示すクローンを選択した。その後、選択した細胞をサザンブロット法によって解析し、部位特異的組み換えが起こっているＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を得た。

Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞では、ＥＧＦＰの発現はラミニンα１遺伝子のプロモーターによる発現制御を受けるので、ＥＧＦＰは、ＬＡＭＡ１遺伝子と同じ様式で発現する事が期待される。ラミニンα１遺伝子は、未分化Ｆ９胚性腫瘍細胞においては非常に低いレベルでしか発現しないが、レチノイン酸およびｃＡＭＰによりＦ９胚性腫瘍細胞を壁側内胚葉類似細胞へと分化すると高いレベルで発現される。そこで、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰによって分化を誘導したあと、ＥＧＦＰ蛋白質の発現レベルを蛍光顕微鏡によって、またＥＧＦＰｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲ法によって確認した。

図７（ａ）は、蛍光顕微鏡によって観察した、レチノイン酸およびｃＡＭＰで分化誘導して４８時間後および分化誘導前の、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞の形態とＥＧＦＰ蛋白質の発現レベルとを示した図である。

Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の細胞密度となるように、フィブロネクチンによってコートされたガラススライド上に蒔き、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で９６時間の培養をおこなった。このとき、上記ＤＭＥＭ培地には、レチノイン酸およびｃＡＭＰを、最終濃度が、それぞれ１μMおよび１mＭとなるように加えた。９６時間の培養の後、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞をＰａｓｃａｌ ＬＳＭ５共焦点レーザー顕微鏡によって観察した。

図７（ａ）に示すように、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞は、分化誘導する前、細胞は分化形態を示さないとともにＥＧＦＰ蛋白質の発現レベルが非常に低い。一方、分化誘導処理して９６時間後、細胞は分化形態を示すとともにＥＧＦＰ蛋白質の発現レベルが上昇する。したがって、ＥＧＦＰ遺伝子の発現は、ラミニンα１遺伝子のプロモーターによる制御を受けており、ＥＧＦＰ遺伝子の発現様式を知ることによって、ラミニンα１遺伝子の発現様式を知ることが可能となることが確認された。

図７（ｂ）は、リアルタイムＰＣＲによって定量した、レチノイン酸およびｃＡＭＰで分化誘導処理して９６時間後のＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞の内在性のラミニンα１ｍＲＮＡ（ＭＬＡ）、内在性のラミニンγ１ｍＲＮＡ（ＭＬＣ）およびＥＧＦＰｍＲＮＡ（ｅｇｆｐ）の発現量を示した図である。

Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の細胞密度となるように、ゼラチンによってコートされた培養皿上に蒔き、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で９６時間の培養をおこなった。このとき、上記ＤＭＥＭ培地には、レチノイン酸およびｃＡＭＰを、最終濃度が、それぞれ１μMおよび１mＭとなるように加えた。９６時間の培養の後、ＲＮＡｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、細胞からＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（インビトロジェン社）およびランダムプライマーを用い、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの５０分の１量を用い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｃｙｂｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（キアゲン社）およびＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）によってリアルタイムＰＣＲを行った。このときＰＣＲの反応条件は、９５℃で９００秒間の前変性処理の後、９５℃で１０秒間の変性反応、６０℃で３０秒間のアニーリング反応および７２℃で６０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４５サイクル行うものであった。検出した各遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨ（Glyseraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）遺伝子の発現量に基づき、補正を行った。

また、リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは、以下に示すものを用いた。

ラミニンα１を検出するために、ＭＬＡフォワードプライマー：5’-CTACCACAGCCTGAACTGTG-3’（配列番号３）およびＭＬＡリバースプライマー：5’-TGTATTCTGTCTTGACTGTGTG-3’（配列番号４）を用いた。ラミニンγ１を検出するために、ＭＬＣフォワードプライマー：5’-TGTACCATGCCTGGTCACGT-3’（配列番号５）およびＭＬＣリバースプライマー：5’-TGGCAATCTCCGAGATGGAG-3’（配列番号６）を用いた。ＥＧＦＰを検出するために、ｅｇｆｐフォワードプライマー：5’-GGCGATGCCACCTACGGCAAG-3’（配列番号７）およびｅｇｆｐリバースプライマー：5’-GTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG-3’（配列番号８）を用いた。ＧＡＰＤＨを検出するために、ｇａｐｄｈフォワードプライマー：5’-GCAAAGTGGAGATTGTTGCCAT-3’（配列番号９）およびｇａｐｄｈリバースプライマー：5’-GATGCAGGGATGATGTTCTGG-3’（配列番号１０）を用いた。

図７（ｂ）に示すように、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を分化誘導する前、内在性に発現するラミニンα１およびラミニンγ１のｍＲＮＡの量は、低く抑えられている。同様に、外来性に発現させるＥＧＦＰのｍＲＮＡの量も、低く抑えられている。一方、Ｆ９＋／−ＥＧＦＰ細胞を分化誘導すると、ラミニンα１、ラミニンγ１およびＥＧＦＰのｍＲＮＡの量は平行して増加することが確認された。したがって、ＥＧＦＰ遺伝子の発現は、ラミニンα１遺伝子のプロモーターによる制御を受けており、ＥＧＦＰ遺伝子の発現様式を知ることによって、ラミニンα１遺伝子の発現様式を知ることが可能となることが確認された。

本発明のＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞は、マーカー遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子が用いられる。その結果、上記ＥＧＦＰ遺伝子の発現は、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けることになる。したがって、上記ＥＧＦＰ遺伝子は、ラミニンα１遺伝子と同じ様式で発現されることとなり、ＥＧＦＰ遺伝子の発現様式を知ることによって、ラミニンα１遺伝子の発現様式を知ることが可能となる。

このとき、ＥＧＦＰ遺伝子の発現の確認は、蛍光顕微鏡などによって簡便かつ安価に行うことが可能となる。発現の確認を簡便かつ安価に行うことを可能とするがゆえに、大量の細胞サンプルにおいて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターが活性化したか否かを知ることを可能とする。

〔相同組み換えＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞）の樹立法〕
図８に、Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞の樹立方法を示す。

ここで、Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞とは、上記Ｆ９＋／−細胞の外来遺伝子挿入配列に、ラミニンα5遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞のことをいう。

上記遺伝子転換ベクターのマルチクローニングサイトにラミニンα5ｃＤＮＡを組み込んだ。この遺伝子転換ベクターをＣＲＥリコンビナーゼ発現プラスミドとともにＦ９＋／−細胞に導入した。Ｆ９＋／−細胞内のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットは、遺伝子転換プラスミド中のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたラミニンα5遺伝子およびピューロマイシン耐性カセットを含むDNA断片に転換される。したがって、部位特異的組み換えが起こったＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞を選択するために、まずピューロマイシン耐性クローンを選択した後、得られたクローンからG418感受性を示すクローンを選択した。その後、選択した細胞をサザンブロット法によって解析し、部位特異的組み換えが起こっているＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞を得た。

この細胞は分化誘導により、内在性に発現するα１サブユニットを含むラミニン−１(α１β１γ１)および外来性に発現するα5サブユニットを含むラミニン−１０（α５β１γ１）を分泌する。
本発明のＦ９＋／−細胞は、上記外来遺伝子挿入配列にラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子が挿入されてもよい。その結果、上記Ｆ９＋／−細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導することによって、ラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子の発現を誘導することが可能となる。このとき、上記Ｆ９＋／−細胞は、一方のラミニンα１遺伝子座から内在性のラミニンα１遺伝子を発現し、他方のラミニンα１遺伝子座から上記外来遺伝子挿入配列に挿入したラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子を発現する。

上記Ｆ９＋／−細胞の内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１は、内在性に発現するラミニンα１とヘテロ３量体蛋白質を形成するとともに、外来性に発現するラミニンα１、α２、α３、α４またはα５ともヘテロ３量体蛋白質を形成する。その結果、所望のラミニンアイソフォームとラミニン−１とを同時に発現することが可能となる。つまり、ラミニンα１により遺伝子転換されたＦ９＋／−細胞ではラミニン−１、ラミニンα２により遺伝子転換されたＦ９＋／−細胞ではラミニン−２およびラミニン−１、ラミニンα３により遺伝子転換されたＦ９＋／−細胞ではラミニン−６およびラミニン−１、ラミニンα４により遺伝子転換されたＦ９＋／−細胞ではラミニン−８およびラミニン−１、ラミニンα５により遺伝子転換されたＦ９＋／−細胞ではラミニン−１０およびラミニン−１を発現することが可能となる。その結果、所望のラミニンアイソフォームおよびラミニン−１を含む基底膜様構造物を得ることが可能となる。

また、本発明のＦ９＋／−細胞が外来性に発現したラミニンアイソフォームは、分泌されて基底膜様構造物を形成するので、上記外来性に発現したラミニンアイソフォームは、容易に精製することが可能である。

〔相同組み換えＦ９胚性腫瘍細胞（Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞）の樹立法〕
図９に、Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞の樹立方法を示す。

ここで、Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞とは、上記Ｆ９−／−細胞の外来遺伝子挿入配列に、ラミニンα5遺伝子を挿入したＦ９胚性腫瘍細胞のことをいう。

上記遺伝子転換ベクターのマルチクローニングサイトにラミニンα5ｃＤＮＡを組み込んだ。この遺伝子転換ベクターをＣＲＥリコンビナーゼ発現プラスミドとともにＦ９−／−細胞に導入した。Ｆ９−／−細胞内のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたG418耐性カセットは、遺伝子転換プラスミド中のlox2272配列およびloxP配列によって挟まれたラミニンα5遺伝子およびピューロマイシン耐性カセットを含むDNA断片に転換される。したがって、部位特異的組み換えが起こったＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞を選択するために、まずピューロマイシン耐性クローンを選択した後、得られたクローンからG418感受性を示すクローンを選択した。その後、選択した細胞をサザンブロット法によって解析し、部位特異的組み換えが起こっているＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞を得た。

この細胞では内在性に発現するα１サブユニットが全く発現していないため、内在性に発現するβ１サブユニットおよびγ１サブユニットは、外来性に発現するα５サブユニットとヘテロ３量体蛋白質を形成する。その結果、分泌されるラミニンの殆どが外来性のα５サブユニットを含むラミニン−１０となる。こうして得られた細胞を分化誘導した後、培養液を抗ラミニンα５抗体を用いたウエスタンブロッティングによって解析し、分泌されるラミニン−１０の量を推定した。

分泌されるラミニン−１０のウエスタンブロッティング法による解析結果を図１０に示す。

Ｆ９細胞、Ｆ９−／−細胞およびＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞のそれぞれを１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の細胞密度となるように、ゼラチンによってコートされた培養皿上に蒔き、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で９６時間の培養をおこなった。このとき、上記ＤＭＥＭ培地には、レチノイン酸およびｃＡＭＰを、最終濃度が、それぞれ１μMおよび１mＭとなるように加えた。９６時間の培養の後、培養皿から培地を回収した。回収した培地１０μｌを非還元条件下で電気泳動した後、抗ラミニンα５抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。このとき、Ｆ９細胞、Ｆ９−／−細胞およびＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞は、それぞれ１種類、１種類および４種類の細胞系統に関して、抗ラミニンα５特異的モノクローナル抗体（非特許文献２参照）を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。なお、培地中に分泌されたラミニンα５を定量するために、５００ｎｇの組み換えラミニン−１０も電気泳動し、抗ラミニンα５抗体を用いて、ウエスタンブロッティング解析を行った
図１０において、分子量の大きなバンドは、ラミニン−１０、すなわちラミニンβ１およびラミニンγ１と３量体を形成したラミニンα５を示し、分子量の小さなバンドは、ラミニンα５の単量体を示す。図１０に示すように、Ｆ９細胞およびＦ９−／−細胞では、分化誘導の前後ともに、ラミニン−１０の発現が確認できない。一方、４系統のＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞は、分化誘導後、培地中にラミニン−１０を分泌することが示された。このとき、ウエスタンブロッティング解析における、Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞のラミニン−１０のバンド強度と５００ｎｇの組み換えラミニン−１０のバンド強度とを比較することによって、培地中のラミニン−１０の濃度は、少なくとも１０ｎｇ／μｌであると推定された。
本発明のＦ９−／−細胞は、上記外来遺伝子挿入配列にラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子が挿入されてもよい。その結果、上記Ｆ９−／−細胞をレチノイン酸およびｃＡＭＰ処理などによって分化誘導することによって、ラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子の発現を誘導することが可能となる。このとき、上記Ｆ９−／−細胞は、両方のラミニンα１遺伝子座が破壊されている。したがって、上記Ｆ９−／−細胞は、内在性のラミニンα１遺伝子を発現しないので、上記Ｆ９−／−細胞の内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１は、内在性のラミニンα１とヘテロ３量体蛋白質を形成することがない。一方、外来性にラミニンα１、α２、α３、α４またはα５を発現させた場合、外来性に発現されたラミニンα鎖は、内在性に発現するラミニンβ１およびラミニンγ１と共にヘテロ３量体蛋白質を形成する。その結果、所望のラミニンアイソフォームを優先的に発現することが可能となる。つまり、ラミニンα１により遺伝子転換されたＦ９−／−細胞ではラミニン−１、ラミニンα２により遺伝子転換されたＦ９−／−細胞ではラミニン−２、ラミニンα３により遺伝子転換されたＦ９−／−細胞ではラミニン−６、ラミニンα４により遺伝子転換されたＦ９−／−細胞ではラミニン−８、ラミニンα５により遺伝子転換されたＦ９−／−細胞ではラミニン−１０を優先的に発現することが可能となる。その結果、所望のラミニンアイソフォームを含む基底膜様構造物を得ることが可能となる。

また、本発明のＦ９−／−細胞が外来性に発現したラミニンアイソフォームは、分泌されて基底膜様構造物を形成するので、上記外来性に発現したラミニンアイソフォームは、容易に精製することが可能である。

〔Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞を用いたラミニン−１及びラミニン−１０を含む基底膜様構造物あるいはラミニン−１０を含みラミニン−１を含まない基底膜様構造物の作製法〕
Ｆ９細胞、Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞、Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９−／−細胞のそれぞれを１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の細胞密度となるように、フィブロネクチンによってコートされた２枚のスライドガラス上に蒔き、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で９６時間の培養をおこなった。このとき、上記ＤＭＥＭ培地には、レチノイン酸およびｃＡＭＰを、最終濃度が、それぞれ１μMおよび１mＭとなるように加えた。９６時間培養をして、壁側内胚葉類似細胞へ分化誘導した上記細胞を４％パラフォルムアルデヒドによって固定した。一枚のスライドガラス上に固定された細胞は、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＨを含む溶液によって細胞を溶解し、除去した。その後、蛍光免疫組織化学法によって、細胞膜上または基底膜様構造物中に存在するラミニンα１蛋白質、ラミニンα５蛋白質およＩＶ型コラーゲン蛋白質を可視化した。１次抗体として、ラット抗ラミニンα１モノクローナル抗体（Sanzen N et al. unpublished）、マウス抗ラミニンα５モノクローナル抗体（非特許文献２参照）またはウサギ抗ＩＶ型コラーゲンポリクローナル抗体（エル・エス・エル社）を反応させた後、それぞれに、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体（American Qualex社）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（American Qualex社）またはＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（BIOSOURCE社）を二次抗体として反応させた。封入処理のあと、Ｐａｓｃａｌ ＬＳＭ５共焦点レーザー顕微鏡によって観察した。

図１１に、Ｆ９細胞、Ｆ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞、Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９−／−細胞よる基底膜構成成分の沈着を蛍光免疫組織化学法により解析した結果を示す。図１１において、ラミニンα１およびラミニンα５は緑色に可視化されておりＩＶ型コラーゲンは赤色に可視化されている。

図１１（ａ）に示すように、内在性のラミニンα１を発現するＦ９細胞およびＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞は、ラミニン−１（α１β１γ１）を含む基底膜様構造物を沈着する。一方、ラミニンα１を発現しないＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９−／−細胞は、ラミニン−１（α１β１γ１）を含む基底膜様構造物を沈着しない。また、図１１（ｂ）に示すように、ラミニンα５遺伝子が導入されていないＦ９細胞およびＦ９−／−細胞は、ラミニン−１０（α５β１γ１）を含む構造物を沈着しない。一方、ラミニンα５遺伝子が導入されているＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞は、ラミニン−１０（α５β１γ１）を含む構造物を沈着する。

上記のように、本発明のＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞は、ラミニン−１およびラミニン−１０を発現し、発現されたラミニン−１およびラミニン−１０は、分泌されて基底膜様構造物として沈着する。また、本発明のＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞は、ラミニン−１０を発現し、発現されたラミニン−１０は分泌されて基底膜様構造物として沈着する。したがって、本発明のＦ９胚性腫瘍細胞を、ゼラチン、フィブロネクチンまたはコラーゲンなどによってコートされた構造物上で培養し、分化誘導をおこなうことによって、上記構造物上に所望の蛋白質を含む基底膜様構造物を沈着することが可能となる。例えば、コラーゲンで作製したスポンジ上で本発明のＦ９胚性腫瘍細胞を培養し、分化誘導をおこなえば、基底膜様基質によって覆われた三次元構造物を作製することが可能となる。

また、細胞成分を０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＨを含むリン酸緩衝生理食塩水により溶解除去する事によって、無細胞基底膜様構造物を容易に得ることも可能である。

〔Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞培養上清からのラミニン−１０の精製および精製ラミニン−１０の用途〕
Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞をゼラチンコートした１００ｍｍ培養皿 ２０枚上で培養した。各培養皿には、１×１０^６個の細胞を蒔き、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で培養をおこなった。このとき、各培養皿にＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ加え、さらにレチノイン酸およびｃＡＭＰを、最終濃度が、それぞれ１μMおよび１mＭとなるように加えた。培養開始７２時間後に各培養皿の培地を新しい上記ＤＭＥＭ培地と交換した。培養開始１２０時間後に各培養皿中の培地を回収するとともに、各培養皿に新しい上記ＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ加え、さらに培養した。培養開始１６８時間後に、再び各培養皿中の培地を回収するとともに、各培養皿に新しい上記ＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ加え、さらに培養した。そして、培養開始２４０時間後に培地をすべて回収した。以上のようにして、６００ｍｌの培地を回収した。

この集められた６００ｍｌの培養液を、抗ラミニンα５モノクローナル抗体を固相化したカラムを用いて精製した。１回のカラム通過によりおよそ６００μｇのラミニン−１０が精製された。

Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞およびＦ９＋／−ＬＡＭＡ５が生産するラミニン−１０は、αサブユニットがヒト由来であって、βおよびγサブユニットがマウス由来である。また、ラミニンは、複雑な糖修飾をうける３本のサブユニットからなる３量体蛋白質である。したがって、精製されたラミニンが生理活性を有するか否かということは重要な問題である。そこで、細胞伸展活性を指標として上記Ｆ９−／−ＬＡＭＡ５細胞培養上清から精製したラミニン−１０の生理活性を測定した。

９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社）に０ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ，１０ｎＭ、２０ｎＭまたは４０ｎＭ（３２μｇ／ｍｌ）のＥＨＳ腫瘍由来ラミニン（シグマ社）あるいは精製ラミニン−１０を含むＰＢＳを、１穴あたり５０μｌずつ加え、４℃で１２時間のコーティング処理をおこなった。コーティング処理の後、９６穴プレートを２％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水でブロッキング処理した。０．５％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培地に、３×１０^５細胞／ｍｌの濃度となるようにＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を懸濁し、この懸濁液１００μｌを上記９６穴プレートに加え、ＣＯ_２インキュベーター内で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベート中に９６穴プレート上に接着した細胞を、３．７％のホルマリンを含むリン酸緩衝水溶液によって固定した。その後、Ｄｉｆｆ ｑｕｉｋ試薬によって染色し、細胞を観察した（Hayashi Y et al , Biochem Biophys Res Commun 2002,299:498-504参照）。

その結果、ラミニン−１０では、２．５ｎＭ以上の濃度で培養皿をコーティングした場合、ＨＴ１０８０細胞は、細胞接着活性を示し、５ｎＭ以上の濃度で培養皿をコーティングした場合、ＨＴ１０８０細胞は、強い細胞伸展活性を示した。一方、ＥＨＳ腫瘍由来のラミニンでは、１０ｎＭ以上の濃度で培養皿をコーティングした場合、ＨＴ１０８０細胞は、細胞接着活性を示したが、４０ｎＭの濃度で培養皿をコーティングした場合においても、１０ｎＭの濃度のラミニン−１０で培養皿をコーティングした場合と比べて、細胞伸展活性は弱かった。

したがって、本発明のＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞の培養上清から精製したラミニン−１０は、生理活性を有すると共に、その活性は、ＥＨＳ腫瘍から精製したラミニンの活性よりも高いことが明らかとなった。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以上のように、本発明にかかるＦ９胚性腫瘍細胞は、大量かつ安価にラミニンアイソフォームをはじめとする所望のタンパク質を生産することを可能とするため、培養皿に代表される各種培養装置や皮膚、肝臓および脾臓などに代表される各種人工組織または人工臓器、およびそれらの部品を製造する分野に利用できるのみならず、組織工学、発生工学および再生医学の分野において広く利用することが可能である。

本発明にかかるラミニンα１遺伝子改変Ｆ９胚性腫瘍細胞株を得るためのloxPターゲティングベクターおよびlox2272-loxPターゲティングベクターの構造を示す模式図である。 本発明にかかるＦ９−／−細胞の樹立方法を示すフローチャートである。 本発明にかかるラミニンα１遺伝子改変Ｆ９胚性腫瘍細胞株のサザンブロット法による解析結果を示す図である。 本発明にかかるＦ９＋／−細胞の樹立方法を示すフローチャートである。 本発明にかかる遺伝子転換プラスミドの構造を示す模式図である。 本発明にかかるＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞の樹立方法を示すフローチャートである。 本発明にかかるＦ９＋／−ＥＧＦＰ細胞の分化誘導に伴うＥＧＦＰタンパク質およびＥＧＦＰｍＲＮＡの発現量の変化を示す図である。 本発明にかかるＦ９＋／−ＬＡＭＡ５細胞の樹立方法を示すフローチャートである。 本発明にかかるＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞の樹立方法を示すフローチャートである。 本発明にかかるＦ９−／−ＬＡＭＡ５細胞が分泌するラミニン−１０のウエスタンブロッティング法による解析結果を示す図である。 本発明にかかるラミニンα１遺伝子改変Ｆ９胚性腫瘍細胞株が分泌する基底膜様構造物の蛍光免疫組織化学法による解析結果を示す図である。 本発明にかかるラミニンα１遺伝子改変Ｆ９胚性腫瘍細胞株から精製したラミニン−１０を用いた細胞接着アッセイの結果を示す図である。

Claims (11)

1. 少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞であって、
   一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座には、ラミニンα１遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列が設けられていることを特徴とするＦ９胚性腫瘍細胞。
2. 他方の遺伝子座では、ラミニンα１遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求項１に記載のＦ９胚性腫瘍細胞。
3. 前記外来遺伝子挿入配列には、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挿入することを特徴とする請求項１または２に記載のＦ９胚性腫瘍細胞。
4. 前記基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子が、ラミニンα１、α２、α３、α４またはα５遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のＦ９胚性腫瘍細胞。
5. 前記外来遺伝子挿入配列には、マーカー遺伝子が含まれることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載のＦ９胚性腫瘍細胞。
6. 前記マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子または分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子であることを特徴とする請求項５に記載のＦ９胚性腫瘍細胞。
7. 請求項１ないし６の何れか１項に記載のＦ９胚性腫瘍細胞を用いる細胞外マトリックスの生産方法。
8. 請求項１ないし６の何れか１項に記載のＦ９胚性腫瘍細胞を用いて、細胞分化誘導因子、分化阻害因子または抗癌剤をスクリーニングする方法。
9. 少なくともタンパク質の生産に用いることが可能なＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法であって、
   一対のラミニンα１遺伝子座のうち、一方の遺伝子座に、ラミニン遺伝子に代えて、ラミニンα１遺伝子のプロモーターの制御を受けて発現するように外来性遺伝子を挿入するための外来遺伝子挿入配列を組み込む工程を含むことを特徴とするＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法。
10. さらに、上記外来遺伝子挿入配列に、基底膜を構成するタンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法。
11. さらに、一対のラミニンα１遺伝子座のうち、他方の遺伝子座のラミニンα１遺伝子を破壊する工程を含むことを特徴とする請求項９または１０に記載のＦ９胚性腫瘍細胞の作製方法。