JP6093946B2 - Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法 - Google Patents

Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6093946B2
JP6093946B2 JP2014513383A JP2014513383A JP6093946B2 JP 6093946 B2 JP6093946 B2 JP 6093946B2 JP 2014513383 A JP2014513383 A JP 2014513383A JP 2014513383 A JP2014513383 A JP 2014513383A JP 6093946 B2 JP6093946 B2 JP 6093946B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide sequence
polynucleotide
seq
protein
sequence represented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014513383A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2015128894A1 (ja
Inventor
青木　淳賢
淳賢 青木
飛鳥 井上
飛鳥 井上
繁樹 東山
繁樹 東山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Ehime University NUC
Original Assignee
Tohoku University NUC
Ehime University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku University NUC, Ehime University NUC filed Critical Tohoku University NUC
Application granted granted Critical
Publication of JP6093946B2 publication Critical patent/JP6093946B2/ja
Publication of JPWO2015128894A1 publication Critical patent/JPWO2015128894A1/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

本発明は、被検物質（リガンド）とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導される、Ｇタンパク質のシグナル伝達活性化を検出する方法や、リガンドとＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇタンパク質のシグナル伝達活性化を検出するためのキットに関する。
Ｇタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通型の特徴的な構造を有する膜結合型受容体であり、ヒトにおいて約８００種類ものタンパク質が知られている。ＧＰＣＲは、神経伝達物質やホルモン等の多種多様なリガンドを受容し、細胞内の様々なシグナル伝達に関与する。また、現在臨床応用されている薬剤の約５０％がＧＰＣＲに作用すると考えられていることから、ＧＰＣＲは創薬開発の標的タンパク質として重要視されている。最近では、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）１受容体を標的とした多発性硬化症治療薬や、メラトニン（ＭＴ１及び２）受容体を標的とした睡眠導入剤や、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）２Ｃ受容体を標的とした抗肥満薬等のＧＰＣＲを標的とする薬剤が開発・市販されている。
ＧＰＣＲによるシグナル伝達経路において、三量体（αβγ）Ｇタンパク質を構成するＧαサブユニット（以下、単に「Ｇα」ということがある）が特に重要な働きを担う。まず、ＧＰＣＲがリガンドと結合すると、非活性型ＧＰＣＲから活性型ＧＰＣＲへタンパク質の立体構造が変化する。続いて、活性型ＧＰＣＲは、三量体Ｇタンパク質のＧαに結合することにより、非活性型（ＧＤＰ結合型）Ｇαから活性型（ＧＴＰ結合型）Ｇαへタンパク質の立体構造が変化し、かかる構造変化により三量体Ｇタンパク質から活性型Ｇαが解離する。解離した活性型Ｇαは、エフェクタータンパク質を活性化し、エフェクタータンパク質を介したシグナルが伝達される。
Ｇαサブユニットは、４種類のファミリー（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２）から構成されており、活性型Ｇαによるシグナル伝達経路は、これらファミリーの種類によりある程度大別される。例えば、Ｇｓファミリーは、アデニル酸シクラーゼの活性化を介したｃＡＭＰの増加を調節し、Ｇｉファミリーは、アデニル酸シクラーゼの抑制を介したｃＡＭＰの減少を調節し、Ｇｑファミリーは、ホスホリパーゼＣを介した細胞へのＣａ２＋の流入を調節し、Ｇ１２ファミリーは、低分子量Ｇタンパク質であるＲｈｏの活性化タンパク質（ＲｈｏＧＥＦ）を介したアクチンストレスファイバー形成を調節することが知られている。これら調節機構を検出することにより、リガンドとそのＧＰＣＲにより誘導されるＧαのシグナル伝達活性化を評価することはできるが、ＧＰＣＲが共役するＧαは通常１種類か２種類であり、特定の調節機構を検出するだけでは、他のＧαのシグナル伝達活性化を評価することはできない。
本発明者らは、生理活性脂質であるリゾホスファチジン酸が毛髪形成に必要であることを明らかにする過程において、リゾホスファチジン酸の受容体の一つであるＬＰＡ６（「Ｐ２Ｙ５」ともいう）がＧ１２ファミリーを介し、ＴＧＦα（Transforming growth factor alpha）の膜結合型前駆体の切断を引き起こすことや、かかる切断にはＴＡＣＥ（tumor necrosis factor α-converting enzyme）の活性化が関与していることを見いだしている（非特許文献１）。また、本発明者らは、アルカリホスファターゼと膜結合型ＴＧＦαとの融合タンパク質を用いて、Ｇ１２ファミリーを介した膜結合型ＴＧＦαの切断の有無を、アルカリホスファターゼを指標として検出する方法を開発した（非特許文献２、特許文献１、図１）。ＴＧＦα切断アッセイ（TGFα shedding assay）と命名されたこの手法を用いると、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性に加え、Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性を検出できることや、Ｇｓ及びＧｉファミリーと、ＧｑファミリーとのキメラＧαタンパク質をさらに用いることにより、Ｇｓ及びＧｉファミリーのシグナル伝達活性も検出できるとされている。しかし、このＴＧＦα切断アッセイは、内在性Ｇ１２及びＧｑファミリーが存在した条件下で行っているため、内在性Ｇ１２及びＧｑファミリーによるＧＰＣＲのシグナル伝達活性化の影響を除外することができない。また、リガンドとそのＧＰＣＲにより、あるＧα（例えばＧ１２ファミリー）のシグナル伝達は活性化されても、別のＧα（例えばＧｑファミリー）のシグナル伝達は不活性化され、見かけ上活性化がないと評価されることもあり、内在性Ｇ１２及びＧｑファミリーが存在した条件下でのＴＧＦα切断アッセイが、ＧＰＣＲのシグナル伝達活性化を十分検出できるものであるかどうかは不明であった。
一方、哺乳動物細胞中で遺伝子を簡便かつ効果的にノックアウトする手法として、近年、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法が開発された（非特許文献３）。
国際公開第２０１２／１５７７４６号パンフレット
Inoue, A. et al. EMBO J., 30, 4248-4260 (2011) Inoue, A. et al. Nature Methods, 9, 1021-1029 (2012) Cong, L. et al. Science, 339, 819-823 (2013)
本発明の課題は、［１］哺乳動物細胞において、被検物質（リガンド）とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導される、内在性Ｇｑ又はＧ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を高感度かつ特異的に検出できる方法を提供することや、［２］哺乳動物細胞において、リガンドとＧＰＣＲとの結合により誘導される、多数のＧαのシグナル伝達活性化を高感度かつ特異的に検出できる方法を提供することにある。
 発明を解決するための手段
本発明者らは、Ｇｑファミリーのシグナル伝達と、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達がＴＧＦαの切断に関与することを見いだしている。上記課題［１］を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、Ｇｑファミリーに含まれる２種類の遺伝子（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）に着目し、かかる遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１）株を、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法により作製し、ΔＧＮＡＱ／１１株を用いてＴＧＦα切断アッセイを行ったところ、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出できることを見いだした。また、Ｇ１２ファミリーを構成する２種類の遺伝子（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノックアウト細胞（ΔＧＮＡ１２／１３）株を、上記遺伝子ターゲッティング法により作製し、ΔＧＮＡ１２／１３株を用いてＴＧＦα切断アッセイを行ったところ、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出できることを見いだした。
また、本発明者らは、上記課題［２］を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、Ｇｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）と、Ｇ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株を、上記遺伝子ターゲッティング法により作製し、ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株へＧｑファミリーを骨格としたＧαキメラタンパク質を発現させ、ＴＧＦα切断アッセイにより検討したところ、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇαのファミリー４種類（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２）のシグナル伝達活性化を特異的に検出したり、かかるＧαのファミリー４種類間でシグナル伝達活性化レベルを、相対的に評価できることを見いだした。さらに、Ｇｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）と、Ｇ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノッダウン細胞（ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株を用いてＴＧＦα切断アッセイを行った場合と比べ、検出感度や特異性が優れていることを確認した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、（１）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出する方法に関する。
（ａ）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、又はＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞に、
ＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質と、
膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質
とを導入する工程；
（ｂ）工程（ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養し、培養上清を採取する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程；
また本発明は、（２）以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出する方法に関する。
（Ａ）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞に、
ＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質と、
膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質と、
以下の（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質
とを導入する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養し、培養上清を採取する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程；
（ｐ−１）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］及び［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチド；
（ｐ−２）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ−３）以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｑファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＱ−１）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＱ−２）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＱ−３）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−１）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−２）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−３）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−１）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−２）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−３）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−１）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−２）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−３）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡ１２−１）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１２−２）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１２−３）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−１）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−２）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−３）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｓファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＳ−１）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＳ−２）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役（結合）できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＳ−３）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−１）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−２）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−３）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｉファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＩ１−１）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ１−２）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ１−３）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−１）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−２）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−３）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−１）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−２）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−３）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−１）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−２）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−３）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−１）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−２）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−３）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−１）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−２）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−３）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−１）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−２）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−３）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−１）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−２）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−３）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
また本発明は、（３）キメラタンパク質のアミノ末端ドメインが、（ＧＮＡＱ−１）〜（ＧＮＡＱ−３）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインであることを特徴とする上記（２）に記載の方法や、（４）キメラタンパク質が、以下の（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかのタンパク質から選択されることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の方法に関する。
（ｑ−１）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質；
（ｑ−２）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
（ｑ−３）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
また本発明は、（５）標識物質がアルカリホスファターゼであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法や、（６）哺乳動物細胞がヒト細胞であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法や、（７）膜結合型ＴＧＦα遺伝子が、以下の（ｒ−１）〜（ｒ−３）のいずれかのポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法に関する。
（ｒ−１）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｒ−２）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ−３）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
また本発明は、（８）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、又はＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、
膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質
とを備えること特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出するためのキットに関する。
また本発明は、（９）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、
膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質と、
以下の（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質
とを備えること特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出するためのキットに関する。
（ｐ−１）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］及び［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチド；
（ｐ−２）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ−３）以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｑファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＱ−１）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＱ−２）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＱ−３）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−１）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−２）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１１−３）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−１）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−２）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１４−３）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−１）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−２）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１５−３）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡ１２−１）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１２−２）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１２−３）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−１）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−２）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡ１３−３）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｓファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＳ−１）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＳ−２）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＳ−３）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−１）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−２）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＬ−３）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［Ｇｉファミリー遺伝子群］
（ＧＮＡＩ１−１）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ１−２）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ１−３）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−１）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−２）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ２−３）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−１）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−２）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＩ３−３）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−１）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−２）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＯ１−３）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−１）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−２）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＺ−３）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−１）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−２）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ１−３）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−１）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−２）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ２−３）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−１）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−２）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＧＮＡＴ３−３）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
また本発明は、（１０）キメラタンパク質のアミノ末端ドメインが、（ＧＮＡＱ−１）〜（ＧＮＡＱ−３）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインであることを特徴とする上記（９）に記載のキットや、（１１）キメラタンパク質が、以下の（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかのタンパク質から選択されることを特徴とする上記（９）又は（１０）に記載のキットに関する。
（ｑ−１）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質；
（ｑ−２）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
（ｑ−３）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
さらに本発明は、（１２）標識物質がアルカリホスファターゼであることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のキットや、（１３）哺乳動物細胞がヒト細胞であることを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のキットや、（１４）膜結合型ＴＧＦα遺伝子が、以下の（ｒ−１）〜（ｒ−３）のいずれかのポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のキットに関する。
（ｒ−１）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｒ−２）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ−３）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
本件検出方法１によると、哺乳動物細胞において、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合により誘導される、内在性Ｇｑ又はＧ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を高感度かつ特異的かつ定量的に検出でき、また、外因性ＧｑやＧ１２ファミリータンパク質を用いる必要がないため、簡便性にも優れている。
本件検出方法２によると、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇαのシグナル伝達活性化を高感度かつ特異的かつ定量的に検出でき、また、多数のＧαのファミリーのシグナル伝達活性化を単一のアッセイ系で評価できるため、簡便性に優れている上に、異なるＧα間におけるシグナル伝達活性化レベルを、相対的に評価することができる。
図１Ａは、膜結合型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合ＴＧＦα（ＡＰ−ＴＧＦα）のモデル図を示す。図１Ｂは、被検物質（リガンド）とその受容体（ＧＰＣＲ）との結合に誘導されるＧタンパク質シグナル伝達のモデル図を示す。 図２Ａは、Ｇｑファミリーの遺伝子ノックアウト細胞株において、被検物質（リガンド）とその受容体（ＧＰＣＲ）との結合に誘導される、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達のモデル図を示す。図２Ｂは、Ｇ１２ファミリーの遺伝子ノックアウト細胞株において、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合に誘導される、Ｇｑファミリーのシグナル伝達のモデル図を示す。図２Ｃは、Ｇαキメラタンパク質を発現させたＧｑ及びＧ１２ファミリーの遺伝子ノックアウト細胞株において、リガンドとそのＧＰＣＲとの結合に誘導される、Ｇαキメラタンパク質のシグナル伝達のモデル図を示す。 図３Ａは、Ｇαの１６種遺伝子（Ｇｓファミリー遺伝子２種［ＧＮＡＳ及びＧＮＡＬ遺伝子］、Ｇｉファミリー遺伝子８種［ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＯ１、ＧＮＡＺ、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２、及びＧＮＡＴ３遺伝子］、Ｇｑファミリー遺伝子４種［ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５遺伝子］、及びＧ１２ファミリー遺伝子２種［ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子］）の進化系統樹を示す図である。図３Ｂは、上記Ｇαの１６種遺伝子がコードするタンパク質のカルボキシル（Ｃ）末端のアミノ酸配列を示す図である。「−」は、各ファミリーの遺伝子がコードするタンパク質のうち、最上段のものと共通のアミノ酸であることを示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＧｑファミリー遺伝子４種（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４及びＧＮＡ１５遺伝子）と、Ｇ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸は、βアクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子のｍＲＮＡの発現量（細胞当たりのコピー数［１０００］）に対する相対値として示す。 ＨＥＫ２９３野生株や、Ｇｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）及び／又はＧ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノックアウトＨＥＫ２９３細胞（ΔＧＮＡＱ／１１、ΔＧＮＡ１２／１３、及びΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株を用いたＴＧＦα切断アッセイにより解析した結果を示す図である。 Ｇｑファミリータンパク質４種（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、及びＧα１６）並びにＧ１２ファミリータンパク質２種（Ｇα１２及びＧα１３）を骨格としたＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇα１１／ｓ、Ｇα１４／ｓ、及びＧα１６／ｓ、並びにＧα１２／ｓ及びＧα１３／ｓ）を発現させたＨＥＫ２９３野生株を用いたＴＧＦα切断アッセイにより解析した結果を示す図である。 Ｇｑファミリータンパク質１種（Ｇαｑ）を骨格としたＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）を発現させたＧｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株を用いたＴＧＦα切断アッセイで解析した結果を示す図である。 Ｇｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）及びＧ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞における４種遺伝子（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。縦軸は、ＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした場合の相対値として示す。 Ｇｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）及び／又はＧ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノックダウンＨＥＫ２９３細胞（ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ、ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ、及びＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株を用いたＴＧＦα切断アッセイにより解析した結果を示す図である。 Ｇｑファミリータンパク質１種（Ｇαｑ）を骨格としたＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）を発現させたＧｑファミリー遺伝子２種（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子）及びＧ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のノックダウン細胞（ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株を用いたＴＧＦα切断アッセイにより解析した結果を示す図である。
本発明の検出方法としては、ＧＮＡＱ遺伝子及びＧＮＡ１１遺伝子（以下、これらを総称して「本件Ｇｑファミリー遺伝子」という）、又はＧＮＡ１２遺伝子及びＧＮＡ１３遺伝子（以下、これらを総称して「本件Ｇ１２ファミリー遺伝子」という）をノックアウトした哺乳動物細胞に、ＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質（ＧＰＣＲタンパク質）と、膜結合型ＴＧＦα（Transforming growth factor alpha）のアミノ（Ｎ）末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質（標識物質結合膜結合型ＴＧＦαタンパク質）とを導入する工程（ａ）；工程（ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質（リガンド）の存在下で培養し、培養上清を採取する工程（ｂ）；工程（ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程（ｃ）；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えた方法（以下、「本件検出方法１」という）であれば特に制限されず、また、本件Ｇｑファミリー遺伝子及び本件Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞に、ＧＰＣＲ遺伝子又はタンパク質と、上記標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又はタンパク質と、上記（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子（以下、「本件Ｇα遺伝子」という）又は本件Ｇα遺伝子をコードするタンパク質（本件Ｇαタンパク質）とを導入する工程（Ａ）；工程（Ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養し、培養上清を採取する工程（Ｂ）；工程（Ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程（Ｃ）；の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次備えた方法（以下、「本件検出方法２」という）であれば特に制限されず、本件検出方法１の工程（ａ）において、本件Ｇｑファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞を用いた場合、本件検出方法１により、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導される、内在性（内因性）Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出することができ（図２Ａ）、また、本件検出方法１の工程（ａ）において、本件Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞を用いた場合、本件検出方法１により、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導される、内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出することができる（図２Ｂ）。また、本件検出方法２により、被検物質とＧＰＣＲの結合により誘導される、本件Ｇαタンパク質のシグナル伝達活性化を特異的に検出することができる（図２Ｃ）。なお、本件検出方法１及び２は、インビトロで実施されるものである。
本発明のキットとしては、本件Ｇｑファミリー遺伝子又は本件Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、上記標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又はタンパク質とを備える、被検物質（リガンド）とＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇタンパク質のシグナル伝達活性化を検出するためのキット（以下、「本件検出キット１」という）や、本件Ｇｑファミリー遺伝子及び本件Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、上記標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又はタンパク質と、上記（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる本件Ｇα遺伝子又はタンパク質とを備える、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導される、Ｇタンパク質のシグナル伝達活性化を検出するためのキット（以下、「本件検出キット２」という）であれば特に制限されず、ここで、本件検出キット１や本件検出キット２は、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるＧタンパク質のシグナル伝達活性化の検出用としての用途に限定されるものである。本件検出キット１や件検出キット２としては、さらに１又は複数（２以上）の本発明のＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子をコードするタンパク質を備えることが好ましく、ここで「複数（２以上）」とは、好ましくは５以上、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは５０以上、さらにより好ましくは１００以上を意味する。本発明のＧＰＣＲ遺伝子が複数ある場合、本発明のＧＰＣＲ遺伝子の形態としては、本発明のＧＰＣＲ遺伝子がプラスミド、コスミド、ＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）等のベクターに挿入された遺伝子ライブラリーが好ましい。また本件検出キット１や本件検出キット２には、一般にこの種の検出キットに用いられる成分、例えば、本発明の標識物質を検出するための試薬や、培養液の他、取扱説明書等の添付文書が通常含まれる。
本発明の哺乳動物細胞には、細胞周期のチェックポイント機構が正常な哺乳動物正常細胞や、細胞周期のチェックポイント機構が異常な哺乳動物癌細胞や、上記正常細胞にＳＶ４０由来のＴ抗原を発現させ、無限の増殖能を獲得した哺乳動物形質転換細胞等の他、多能性幹細胞（胚性幹細胞［ＥＳ細胞］、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞等）、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞などの哺乳動物幹細胞が含まれる。上記哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することが、中でも、ヒトを好適に例示することができる。
本件Ｇｑファミリー遺伝子及び／又は本件Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞としては、哺乳動物細胞の染色体上に存在する本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子にヌクレオチドを挿入したり、前記本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子のヌクレオチドを欠失することにより、哺乳動物細胞の染色体上に存在する本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子を破壊した哺乳動物細胞であればよく、哺乳動物細胞の染色体上に存在する本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子を破壊するために、相同組換えを利用してヌクレオチドを欠失させたり挿入したりすることにより遺伝子を破壊する方法を用いてもよいが、費用対効果や時間対効果の観点から、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（文献「Urnov, F.D. et al (2010) Nature Review Genetics. 11, 636-646」）や、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを改良したタンパク質（特開２０１３−９４１４８号公報）や、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（文献「Cong et al (2013) Science 339, 819-823」）等を用いて、本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子領域の２本鎖ＤＮＡを切断し、相同組換え修復時にヌクレオチドの欠失や挿入が起こることを利用して遺伝子を破壊する方法（遺伝子ターゲッティング法）を用いることが好ましく、特にｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法を用いることがより好ましい。
なお、哺乳動物細胞の染色体上に存在する本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件ファミリーＧ１２遺伝子を破壊する際、標的とするヌクレオチド配列を選択するために、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクし、以下のGene IDを基に、ヒト由来の本件Ｇｑファミリー遺伝子や本件Ｇ１２ファミリー遺伝子の塩基配列情報を参照したり、これら遺伝子のオーソログ遺伝子（チンパンジー、マウス、ラット、ウシ等）を参照することができる。
ＧＮＡＱ遺伝子（Gene ID 2776）
ＧＮＡ１１遺伝子（Gene ID 2767）
ＧＮＡ１２遺伝子（Gene ID 2768）
ＧＮＡ１３遺伝子（Gene ID 10672）
本発明のＧＰＣＲ遺伝子としては、１本のポリペプチドが細胞膜を７回貫通する特徴を有するＧＰＣＲをコードする遺伝子であれば特に制限されず、ここでＧＰＣＲとしては、具体的に、アドレナリン受容体（α１Ａ、α１Ｂ、α２Ａ、α２Ｂ、β１、β２等）、システイニルロイコトリエン受容体１（ＣｙｓＬＴＲ１）、ＧＰＣＲ９１、ＧＰＣＲ３４、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様配列２（ＥＭＲ２）、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）、ＧＰＣＲ１０５、７回膜貫通スーパーファミリー・メンバー１（ＴＭ７ＳＦ１）、ＧＰＣＲ３７、ＣＤ９７抗原（ＣＤ９７）、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１）、ＦＩＲＥ、フォルミルペプチド受容体１（ｆＭＬＰ１）、ＧＰＣＲ６５、プリン受容体Ｐ２Ｙ８（Ｐ２Ｙ８）、ドーパミン受容体Ｄ２（Ｄ２）、内皮分化リゾホスファチジン酸Ｇ蛋白質共役型受容体２（ＥＤＧ２）、アデノシンＡ３受容体（Ａ３）、補体第５成分受容体１（Ｃ５Ｒ１）、オプシン３（ＯＰＮ３）、ＧＰＣＲ２７、ＧＰＣＲ４４（ＣＲＴＨ２）、内皮分化スフィンゴ脂質Ｇ蛋白質共役型受容体１（ＥＤＧ１）、フォルミルペプチド受容体様２（ＦＰＲＬ２）、トロンボキサン受容体（ＴＰ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体様２（ＣＣＲＬ２）、メタボトロピックグルタミン酸受容体６（ｍｇｌｕ６）、カンナビノイド受容体（ＣＢ１、ＣＢ２等）、ＧＰＣＲ３９、プリン受容体Ｐ２Ｙ５（Ｐ２Ｙ５）、アデノシンＡ１受容体（Ａ１）、ピリミジン受容体Ｐ２Ｙ４（Ｐ２Ｙ４）、プロスタグランジンＥ受容体（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４等）、プロスタグランジンＦ受容体（ＦＰ）、ヒスタミン受容体（Ｈ１Ｒ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｒ、Ｈ４Ｒ等）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａ）、アンジオテンシンII受容体（ＡＴ１、ＡＴ２）、エンドセリン受容体（ＥＴＡ、ＥＴＢ等）、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧＮＲＨＲ）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回貫通Ｇ型受容体２（ＣＥＬＳＲ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（ＣＣＲ７）、ヒスタミン受容体Ｈ４（Ｈ４）、ＧＰＣＲ１２、ヒスタミン受容体Ｈ１（Ｈ１）、ＧＰＣＲ３２、腫瘍内皮細胞マーカー５（ＴＥＭ５）、ＧＰＣＲ５８、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回貫通Ｇ型受容体１（ＣＥＬＳＲ１）、ＧＰＣＲ８５、モチリン受容体（Ｍｏｔｉｌｉｎ Ｒ）、ＧＰＣＲ６４（ＨＥ６）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回貫通Ｇ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）、カルシトニン受容体様（ＣＡＬＣＲＬ）、網膜色素上皮由来ロドプシンホモログ（ＲＲＨ）、ＧＰＣＲ１８、ＧＰＣＲ３５、プリン受容体Ｐ２Ｙ１０（Ｐ２Ｙ１０）、ＦＬＪ４０２７９（Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０２７２９６）、ＧＰＣＲ１４１、精巣下降関連Ｇ蛋白質共役型受容体（ｈＲＵＰ１６）、内膜肥厚関連受容体（ＩＴＲ）、ＭＲＧＸ２、トレースアミン受容体１（ＳＮＯＲＦ３３）、７回膜貫通受容体ＣＢＲＣ７ＴＭ＿３７５（Ｃ−ＴＨＹＭＵ２０１１５４８）、アドレノメデュリン受容体（Ｇ１０ｄ）、ＧＰＣＲ１０７、ＧＰＣＲ１２６、ＧＰＣＲ４１、ＧＰＣＲ４３、ＧＰＣＲ６８、ガストリン放出ペプチド受容体（ＧＲＰＲ）、ＧＰＣＲ１０１９（ＨＥＯＡＤ５４）、ｈＧＰＣＲ１０（ｈＲＵＰ９）、膜型プロゲスチン受容体α（ｍＰＲａ）、膜型プロゲスチン受容体γ（ｍＰＲｇ）、推定Ｇ蛋白質共役型受容体ＧＰＣＲ１（ＳＲＬ）、血小板活性化受容体ホモログＨ９６３（Ｈ９６３）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＣＲ１）、ドーパミン受容体Ｄ５（Ｄ５）、ロイコトリエンＢ４受容体（ＬＴＢ４Ｒ）およびケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＸＣＲ５）などを挙げることができる。また、上記ＧＰＣＲはリガンドやその機能が不明ないわゆるオーファン受容体も含まれる。
本発明の膜結合型ＴＧＦα遺伝子としては、ＴＧＦαのカルボキシル（Ｃ）末端に、ＴＡＣＥ（tumor necrosis factor α-converting enzyme）による切断ドメインを有し、さらにかかる切断ドメインのＣ末端に、膜結合ドメインを有する膜結合型ＴＧＦαタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されず、ここで膜結合型ＴＧＦαタンパク質は、ＴＧＦαとＴＡＣＥによる切断ドメインとの間や、ＴＡＣＥによる切断ドメインと膜結合ドメインとの間にリンカー（例えば１〜１０アミノ酸残基の範囲内）が挿入されたものであってもよい。本発明の膜結合型ＴＧＦα遺伝子としては、上記（ｒ−１）〜（ｒ−３）のいずれかのポリヌクレオチドから選択されるものが好ましい。
本発明の標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子としては、本発明の膜結合型ＴＧＦαのアミノ（Ｎ）末端に標識物質が結合したものであれば特に制限されず、ここで本発明の膜結合型ＴＧＦαＮ末端と標識物質との結合としては、標識物質がタンパク質である場合、タンパク質融合が好ましく、また、標識物質が非タンパク質（蛍光色素等の化合物）である場合、共有結合や、イオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等の非共有結合を挙げることができる。
本発明の標識物質がタンパク質である場合、本発明の標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］）、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質を挙げることができ、これらの中でもアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を好適に例示することができる。
また、本発明の標識物質が非タンパク質（蛍光色素等の化合物）である場合、本発明の標識物質としては、例えば、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン等を挙げることができる。
上記本件Ｇαファミリー遺伝子におけるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記［Ｇｑファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質（以下、「Ｇｑファミリータンパク質」ということがある）のＮ末端ドメインと、上記［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質（以下、「Ｇｑファミリー以外のＧαタンパク質」ということがある）のＣ末端ドメインとのキメラタンパク質であり、かつＴＡＣＥと、Ｇｑファミリー以外のＧαタンパク質共役受容体の両方を共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は上記［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質（以下、「Ｇ１２ファミリータンパク質」ということがある）のＮ末端ドメインと、上記［Ｇｑファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質（以下、「Ｇ１２ファミリー以外のＧαタンパク質」ということがある）のＣ末端ドメインとのキメラタンパク質であり、かつＴＡＣＥと、Ｇ１２ファミリー以外のＧαタンパク質共役受容体の両方と共役（結合）できるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば特に制限されない。上記キメラタンパク質には、Ｇｑファミリータンパク質のＮ末端ドメインと、Ｇｑファミリー以外のＧαタンパク質のＣ末端ドメインとの融合タンパク質や、Ｇ１２ファミリータンパク質のＮ末端ドメインと、Ｇ１２ファミリー以外のＧαタンパク質のＣ末端ドメインとの融合タンパク質の他、便宜上、Ｇｑファミリータンパク質のＣ末端ドメインにおけるアミノ酸残基を、かかるアミノ酸残基に対応する、Ｇｑファミリー以外のＧαタンパク質におけるアミノ酸残基へ置換したタンパク質や、Ｇ１２ファミリータンパク質のＣ末端ドメインにおけるアミノ酸残基を、かかるアミノ酸残基に対応する、Ｇ１２ファミリー以外のＧαタンパク質におけるアミノ酸残基へ置換したタンパク質も含まれ、ここで置換するアミノ酸残基としては、Ｃ末端から１〜５番目のアミノ酸残基が好ましく、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基と４番目のアミノ酸残基がＧαの機能に重要であるため（文献「Liu, J., et al. Identification of a receptor/G-protein contact site critical for signaling specificity and G-protein activation. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 11642-11646 (1995)」、文献「Conklin, B.R. et al. Carboxyl-terminal mutations of Gq alpha and Gs alpha that alter the fidelity of receptor activation. Mol Pharmacol 50, 885-890 (1996).」）、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基や４番目のアミノ酸残基を好適に例示することができる。
本発明のキメラタンパク質のＮ末端ドメインとしては、上記［Ｇｑファミリー遺伝子群］の（ＧＮＡＱ−１）〜（ＧＮＡＱ−３）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインが好ましい。
本発明のキメラタンパク質における「タンパク質のＮ末端ドメイン」としては、タンパク質のＣ末端から５〜１アミノ酸残基を少なくとも欠失するポリペプチドドメインが好ましく、タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基を少なくとも欠失するポリペプチドドメインがより好ましい。タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基を少なくとも欠失するポリペプチドドメインとしては、例えば、タンパク質のＣ末端から５０〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から２５〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から２０〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から１５〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から１０〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から７〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメイン等を挙げることができ、これらの中でもタンパク質のＣ末端から７〜１アミノ酸残基を欠失するポリペプチドドメインを好適に例示することができる。
また、本発明のキメラタンパク質における「タンパク質のＣ末端ドメイン」としては、タンパク質のＣ末端から５〜１アミノ酸残基を含むポリペプチドドメインが好ましく、タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基を含むポリペプチドドメインがより好ましい。タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基を含むポリペプチドドメインとしては、例えば、タンパク質のＣ末端から５０〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から２５〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から２０〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から１５〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から１０〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から７〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン、タンパク質のＣ末端から６〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメイン等を挙げることができ、これらの中でもタンパク質のＣ末端から７〜１アミノ酸残基からなるポリペプチドドメインを好適に例示することができる。
したがって、本発明のキメラタンパク質としては、上記（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかのタンパク質から選択されるものを好適に例示することができる。
なお、本発明のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を選択するために、配列番号５０で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＱ遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号５１で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡ１１遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号５２で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡ１４遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号５３で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡ１５遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号５４で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡ１２遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号５５で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡ１３遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＬ遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＩ１遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＩ２遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＩ３遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＯ１遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＺ遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＴ２遺伝子のｃＤＮＡ配列）や、配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列（ヒトＧＮＡＴ３遺伝子のｃＤＮＡ配列）の情報を参照したり、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクし、以下のGene IDを基に、これら遺伝子のオーソログ遺伝子（チンパンジー、マウス、ラット、ウシ等）のｃＤＮＡ配列を参照することができる。
ＧＮＡＱ遺伝子（Gene ID2776）
ＧＮＡ１１遺伝子（Gene ID2767）
ＧＮＡ１４遺伝子（Gene ID9630）
ＧＮＡ１５遺伝子（Gene ID2769）
ＧＮＡ１２遺伝子（Gene ID2768）
ＧＮＡ１３遺伝子（Gene ID10672）
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）
ＧＮＡＩ１遺伝子（Gene ID 2770）
ＧＮＡＩ２遺伝子（Gene ID 2771）
ＧＮＡＩ３遺伝子（Gene ID 2773）
ＧＮＡＯ１遺伝子（Gene ID 2775）
ＧＮＡＺ遺伝子（Gene ID 2781）
ＧＮＡＴ１遺伝子（Gene ID 2779）
ＧＮＡＴ２遺伝子（Gene ID 2780）
ＧＮＡＴ３遺伝子（Gene ID 346562）
本発明において、「タンパク質」は、タンパク質発現の有無の確認や、単離・精製のために、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグがさらに付加されたものであってもよい。
本発明において、「タンパク質」は、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを発現させ、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳が可能な当業者に既知の任意のタンパク質合成系を用いて作製し、必要に応じて単離・精製することができる。
本件検出方法１の工程（ａ）や本件検出方法２の工程（Ａ）において、哺乳動物細胞へ遺伝子導入する方法としては、哺乳動物発現用ベクターのプロモーター配列の下流に、作動可能に連結されるように目的の遺伝子を挿入し、哺乳動物発現用ベクターの種類に応じて適切な方法で細胞へ導入すればよく、例えば、哺乳動物発現用ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターである場合、目的の遺伝子が挿入された哺乳動物発現用ベクターを細胞へ導入する方法としては、目的の遺伝子を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞細胞など）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを採取し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを線維芽細胞に感染させる方法を挙げることができる。例えば、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合、具体的な手法については、文献「Science, 318, 1917-1920 (2007)」に記載の方法を参照することができ、レトロウイルスベクターを用いる場合、文献「WO2007/69666」、「Cell, 126, 663-676 (2006)」、「Cell, 131, 861-872 (2007)」等に記載の方法を参照することができ、アデノウイルスベクターを用いる場合、文献「Science, 322, 945-949 (2008)」に記載の方法を参照することができる。
また、哺乳動物発現用ベクターが、非ウイルスベクターであるプラスミドベクター（ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ/ＣＭＶ、ｐＲｃ/ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ/Ｎｅｏ等）である場合、目的の遺伝子が挿入された哺乳動物発現用ベクターを細胞へ導入する方法としては、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等の方法を挙げることができる。
上記哺乳動物発現用ベクターのプロモーター配列としては、例えばＥＦ−１αプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター等を挙げることができる。上記哺乳動物発現用ベクターは、エンハンサー、ターミネータ配列（βグロビンターミネーター配列、ＳＶ４０ターミネータ配列、ＢＧＨターミネータ配列等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子等）、ＳＶ４０複製起点などを含有していてもよい。
本件検出方法１の工程（ａ）や本件検出方法２の工程（Ａ）において、哺乳動物細胞へタンパク質導入する方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）−又は細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）−融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等を挙げることができる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes社製）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE社製）及びProVectin（IMGENEX社製）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems社製）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene社製）及びChariot Kit（Active Motif社製）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業社製）等が市販されている。
本件検出方法１の工程（ｂ）において、工程（ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養する方法としては、被検物質がＧＰＣＲに結合し、内在性Ｇ１２ファミリーや内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されるのに十分な時間、哺乳動物細胞の培養に適した条件下で培養すればよく、また、本件検出方法２の工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養する方法としては、被検物質がＧＰＣＲに結合し、本件Ｇαタンパク質のシグナル伝達経路の活性化が誘導されるのに十分な時間、哺乳動物細胞の培養に適した条件下で培養すればよく、時間、温度、培養液の種類等の培養条件は、哺乳動物細胞や被検物質やＧＰＣＲの特性を考慮して適宜選択することができる。培養時間は、通常５分〜２４時間の範囲内、好ましくは１０分〜１２時間の範囲内、より好ましくは２０分〜６時間の範囲内、さらに好ましくは３０分〜３時間の範囲内、特に好ましくは４０分〜２時間の範囲内である。また、培養温度は、通常２０〜３８℃の範囲内であり、好ましくは３５〜３７℃の範囲内である。培養液としては、通常０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲内で血清（ＦＢＳ、ＣＳ等）を含有する動物細胞培養用基礎培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等）を用いる。
本件検出方法１の工程（ｂ）において、工程（ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養することにより、被検物質がＧＰＣＲに結合し、内在性Ｇ１２ファミリーや内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されると、或いは、本件検出方法２の工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養することにより、被検物質がＧＰＣＲに結合し、本件Ｇαタンパク質のシグナル伝達経路の活性化が誘導されると、内在性ＴＡＣＥが標識物質結合膜結合型ＴＧＦαを切断することにより、標識物質とＴＧＦαとの結合体が生成され、培養上清に遊離する。このため、本件検出方法１の工程（ｂ）や本件検出方法２の工程（Ｂ）において、かかる遊離した標識物質とＴＧＦαとの結合体を含む培養上清を採取する。
本件検出方法１の工程（ｃ）や本件検出方法２の工程（Ｃ）において、標識物質を検出する方法としては、検出物質の種類に応じて任意の方法で検出すればよく、例えば、検出物質がＡＰである場合、ＡＰの基質であるｐ?ニトロフェニルリン酸（Ｐ−ＮＰＰ）を添加し、反応させた後、波長４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定することにより検出する方法を挙げることができ、また、検出物質がルシフェラーゼである場合、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを添加し、反応させた後、波長４２０ｎｍの吸光度（ＯＤ４２０）を測定することにより検出する方法を挙げることができ、また、検出物質がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside）や、ＣＰＲＧ（chlorophenol redβ-D-galactopyranoside)や、Ｘ−Ｇａｌ（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）を添加し、反応させた後、波長４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）（ＯＮＰＧ）や、波長５７５ｎｍの吸光度（ＯＤ５７５）（ＣＰＲＧ）や、青色色素（Ｘ−Ｇａｌ）を測定することにより検出する方法を挙げることができる。
本件検出方法１の工程（ａ）において、本件Ｇｑファミリー遺伝子のノックアウト哺乳動物細胞を用いた場合、本件検出方法１の工程（ｃ）において、標識物質が検出されたとき、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、内在性Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化が検出された、或いは内在性Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されたと判定することができ、また、本件検出方法１の工程（ｃ）において、標識物質が検出されなかったとき、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、内在性Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化が検出されなかった、或いは内在性Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されなかったと判定することができる。
本件検出方法１の工程（ａ）において、本件Ｇ１２ファミリー遺伝子のノックアウト哺乳動物細胞を用いた場合、本件検出方法１の工程（ｃ）において、標識物質が検出されたとき、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化が検出された、或いは内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されたと判定することができ、また、本件検出方法１の工程（ｃ）において、標識物質が検出されなかったとき、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化が検出されなかった、或いは内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路の活性化が誘導されなかったと判定することができる。
本件検出方法２の工程（Ｃ）において、標識物質が検出された場合、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、本件Ｇαファミリータンパク質のシグナル伝達活性化が検出された、或いは本件Ｇαファミリータンパク質のシグナル伝達経路の活性化が誘導されたと判定することができ、また、本件検出方法２の工程（Ｃ）において、標識物質が検出されなかった場合、被検物質とＧＰＣＲとの結合により、本件Ｇαファミリータンパク質のシグナル伝達活性化が検出されなかった、或いは本件Ｇαファミリータンパク質のシグナル伝達経路の活性化が誘導されなかったと判定することができる。
本発明において、「Ｇｓ共役型受容体」とは、プロスタグランジンＥ受容体（ＥＰ２）、アドレナリンβ１又はβ２、ヒスタミンＨ２受容体（Ｈ２Ｒ）等のＧｓファミリー（ＧＮＡＳ又はＧＮＡＬ遺伝子がコードするタンパク質）と共役（結合）する受容体のことを意味する。また、本発明において、「Ｇｉ共役型受容体」とは、ヒスタミンＨ３受容体（Ｈ３Ｒ）、アドレナリンα２Ａ又はα２Ｂ受容体、セロトニン（５−ＨＴ）受容体等のＧｉファミリー（ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＯ１、ＧＮＡＺ、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２、又はＧＮＡＴ３遺伝子がコードするタンパク質）と共役（結合）する受容体のことを意味する。
本発明において、「シグナル伝達活性化を検出する」とは、シグナル伝達活性化の有無を検出することや、シグナル伝達活性化の程度を検出することを意味する。
本発明において、「少なくとも８０％以上の同一性」とは、同一性が８０％以上であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を意味する。
本発明において、「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により作製することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［Ｇα遺伝子のｍＲＮＡ発現解析］
ＨＥＫ２９３細胞（２９３A Cell、Life Technologies社製）を１×１０６細胞回収し、Mammalian Total RNA Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。三量体（αβγ）Ｇタンパク質を構成するαサブユニットをコードするＧα遺伝子は、４種類のファミリー（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２）遺伝子から構成されており、このうち、Ｇｓファミリー遺伝子は、２種の遺伝子（ＧＮＡＳ及びＧＮＡＬ遺伝子）で構成されており、また、Ｇｉファミリー遺伝子は、８種の遺伝子（ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＯ１、ＧＮＡＺ、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２、及びＧＮＡT３遺伝子）で構成されており、また、Ｇｑファミリー遺伝子は、４種類の遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５遺伝子）で構成されており、また、Ｇ１２ファミリー遺伝子は、２種の遺伝子（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）で構成されている（図３）。この中から、６種類のＧα遺伝子（Ｇｑファミリー遺伝子４種［ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５遺伝子］及びＧ１２ファミリー遺伝子２種［ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子］）のｍＲＮＡ発現量の他、内部コントロール用のＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量するために、得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（Fasmac社で受託合成）とSYBR Premix Ex Taq Kit（タカラバイオ社製）を用いて、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社製）でＰＣＲを行い、上記６種類のＧα遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子のｃＤＮＡ断片の増幅と定量を行った。なお、定量は、上記６種類のＧα遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子が組み込まれた濃度既知のプラスミドベクターＤＮＡを用いて作成した検量線を基に定量した。ＰＣＲ反応条件は、初期変性９５℃（３０秒間）の後、９５℃（５秒）と６０℃（３１秒間）からなるサイクルを４０回繰り返し、解離ステージ（Dissociation Stage）で反応産物の融解曲線を解析した。なお、融解曲線の解析により、ＨＥＫ２９３細胞由来の上記６種類のＧα遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物の融解曲線のピーク温度と、プラスミドＤＮＡ由来の上記６種類のＧα遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子のＤＮＡ増幅産物の融解曲線のピーク温度とが一致することが確認された。
上記６種類のＧα遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子のｃＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットを、以下の表１に示す。
［Ｇα遺伝子をノックアウトするためのプラスミドコンストラクトの作製］
ゲノム中に存在するＧα遺伝子をノックアウトするために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の両方を発現させるｐＸ３３０ベクターを用い、文献（Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910-918 (2013).）に記載の方法に従ってプラスミドコンストラクトを作製した。すなわち、ゲノム中に存在するＧα遺伝子（標的遺伝子）の２０塩基長の相補配列（ｓｇＲＮＡ結合配列）を有するｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを培養細胞中で発現させ、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼの複合体が標的遺伝子中に存在するｓｇＲＮＡ結合配列に結合し、かかる部位で標的遺伝子の二本鎖切断が生じ、二本鎖切断末端同士が結合する過程で塩基の欠失や挿入が起こり、標的遺伝子機能の欠損を誘導するシステムを利用した。米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）に登録されているヒト遺伝子の塩基配列データベースから、４種類のＧα遺伝子（Ｇｑファミリー遺伝子２種［ＧＮＡＱ〔Accession No. NM_002072〕及びＧＮＡ１１〔Accession No. NM_002067〕遺伝子］、Ｇ１２ファミリー遺伝子２種［ＧＮＡ１２〔Accession No. NM_007353〕及びＧＮＡ１３〔Accession No. NM_006572〕］遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの結合配列として、それぞれ配列番号１５〜１８で示される塩基配列からなるＤＮＡを選択した。１本鎖オリゴヌクレオチドのセット４種類（配列番号１９及び２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセット、配列番号２１及び２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号２３及び２４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号２５及び２６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）（Fasmac社で受託合成）をそれぞれ混合し、９５℃（５分間）／９５℃から３０℃への勾配（１５分間）／２５℃（１分間）／２０℃（１分間）／１５℃（１分間）／１０℃（１分間）の条件でアニールすることにより、上記４種類のＧα遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの結合配列を含むＤＮＡ断片を得た。かかるＤＮＡ断片１０ｐｍｏｌと、制限酵素ＢｂｓＩで消化したｐＸ３３０ベクター２０ｎｇとを混合し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いてリガーゼ処理を行い、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社製）に導入し形質転換させた。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択し、選択された大腸菌コロニーを単離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培養液で増殖させた後、大腸菌に含まれるベクターＤＮＡをPureYield Plasmid Miniprep System（Promega社製）を用いて単離・精製した。精製したベクターＤＮＡ中に、上記４種類のＧα遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡが含まれることは、シーケンス用プライマー（配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマー）を用いたダイターミネーター法により確認した（Fasmac社に委託）。なお、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと上記４種類のＧα遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの両方が発現するｐＸ３３０ベクターを、以下「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター」という。
［Ｇα遺伝子のノックアウト細胞株の作製］
ＨＥＫ２９３細胞（２９３A Cell、Life Technologies社製）を２×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、GIBCO社製）含有のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Nissui社製）（以下、「本件培養液」という）で懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレート（Grenier Bio-One社製）の各ウェルに１ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２存在下で２４時間細胞培養した後、各ウェルに、上記［Ｇα遺伝子をノックアウトするためのプラスミドコンストラクトの作製］の項目に記載の方法に従って作製したＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター５００ｎｇと、pGreenLantern-1（GIBCO BRL社製）１００ｎｇとを、LipofectAMINE 2000（Life Technologies社製）１．２５μＬを用いて、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後の細胞を、０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて細胞を剥がし、セルソーターSH800Z（Sony社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を分取することによりＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターが導入された細胞を選択した。かかる細胞を、２０細胞／ｍＬ又は８０細胞／ｍＬとなるように培養液中に再懸濁し、細胞培養用９６ウェルプレート（Grenier Bio-One社製）の各ウェルに１００μＬずつ播種した。５％ＣＯ２存在下で約２週間培養後、細胞コロニーが出現したウェルの細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥がし、半量の細胞を細胞培養用６ウェルプレート（Grenier Bio-One社製）に播種し、残り半量の細胞を遺伝型解析に用いた。以下の［Ｇα遺伝子の遺伝型解析］の項目に記載の方法に従って遺伝子型解析を行い、ゲノム中に存在する４種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）に変異が導入されたことを確認した後、細胞クローンを６ウェルプレートのセミコンフルエントに達するまで培養し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養容器から剥がし、半量を細胞培養用１００ｍｍディッシュ（Grenier Bio-One社製）に播種した。残り半量を１２ウェルプレートに播種し、ＴＧＦα切断アッセイにより、変異導入された上記４種類のＧα遺伝子がコードするタンパク質（Ｇαｑ［ＧＮＡＱ遺伝子がコードするタンパク質］、Ｇα１１［ＧＮＡ１１遺伝子がコードするタンパク質］、Ｇα１２［ＧＮＡ１２遺伝子がコードするタンパク質］、及びＧα１３［ＧＮＡ１３遺伝子がコードするタンパク質］）の機能評価を行い、かかるＧαタンパク質の機能欠損（Ｇα遺伝子ノックアウト）を確認した後、細胞クローンを１００ｍｍディッシュのセミコンフルエントに達するまで培養し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養容器から剥がし、CELLBANKER 1 plus（日本全薬工業社製）中に凍結保存した。また、ＧＮＡＱ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターと、ＧＮＡ１１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターとを混合し、親細胞（ＨＥＫ２９３細胞）へトランスフェクションすることにより、ＧαｑとＧα１１の２重欠損（ΔＧＮＡＱ／１１）細胞株を単離した。同様に、ＧＮＡ１２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターと、ＧＮＡ１３遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターとを混合し、親細胞へトランスフェクションすることにより、α１２とＧα１３の２重欠損（ΔＧＮＡ１２／１３）細胞株を単離した。さらに、ＧＮＡ１２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターと、ＧＮＡ１３遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが発現するＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターとを混合し、ΔＧＮＡＱ／１１株へトランスフェクションすることにより、ＧαｑとＧα１１とＧα１２とＧα１３の４重欠損（ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）細胞株を単離した。
［Ｇα遺伝子の遺伝型解析］
Ｇαタンパク質欠損細胞株を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液で３０分処理し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加え中和した。ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）とプライマーセット（Fasmac社で受託合成）を用いてＰＣＲを行い、変異導入された４種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ反応産物を、制限酵素ＸｂａＩ（ＧＮＡＱ遺伝子）、ＴａｑＩ（ＧＮＡ１１及びＧＮＡ１３遺伝子）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＧＮＡ１２遺伝子）（制限酵素はタカラバイオ社から購入）で消化した後、３％アガロールゲル（ニッポンジーン社製）で分離し、上記制限酵素の認識部位が上記４種類のＧα遺伝子中に存在することを確認した。
上記４種類のＧα遺伝子のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットを、以下の表２に示す。
ＰＣＲにより増幅した上記４種類のＧα遺伝子のＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング法によりT-Vector pMD20ベクター（タカラバイオ社製）に組み込み、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社製）へ導入し形質転換させた。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択を行い、選択された大腸菌コロニーを鋳型として、T-Vector pMD20ベクターに挿入された上記４種類のＧα遺伝子のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセット（配列番号３６及び３７で示される塩基配列からなるプライマーセット）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物が得られたことはアガロールゲル電気泳動で確認し、ＰＣＲ産物を鋳型として、シーケンス用プライマー（配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマー）を用いたダイターミネーター法により（Fasmac社に委託）、上記４種類のＧα遺伝子の遺伝子型（塩基配列）を決定した。
［Ｇαタンパク質発現ベクターの作製１］
６種類のＧα遺伝子（Ｇｑファミリー遺伝子４種［ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５遺伝子］、及びＧ１２ファミリー遺伝子２種［ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子］）をクローニングするために、FirstChoice Human Total RNA Survey Panel（Applied Biosystems社製）を鋳型として、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行い、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（Fasmac社で受託合成）とポリメラーゼPrimeSTAR HS（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。
上記６種類のＧα遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを、以下の表３に示す。
ＰＣＲにより得られた上記６種類のＧα遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物を、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ処理（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、ＧＮＡ１５、及びＧＮＡ１２遺伝子）又は制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶ（ＧＮＡ１３）処理（制限酵素はタカラバイオ社から購入）した。哺乳類細胞発現用ｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳベクター（文献「Sakagami, H. et al. Biochemical and molecular characterization of a novel choline-specific glycerophosphodiester phosphodiesterase belonging to the nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family. J Biol Chem 280, 23084-23093 (2005).」参照）を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ処理又は制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶ処理し、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて制限酵素処理したｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳを精製した。制限酵素処理したｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳ５０ｎｇと、制限酵素処理した上記６種類のＧα遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物１００ｎｇとを混合し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いてリガーゼ処理を行い、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社）へ導入し形質転換させた。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択し、選択された大腸菌コロニーを単離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培養液で増殖させた後、ベクターＤＮＡをNucleoBond Xtra Midi Plus Kit（Macherey-Nagle社製）を用いて精製した。精製したベクターＤＮＡ中に、上記６種類のＧα遺伝子のｃＤＮＡの全長が含まれることは、ダイターミネーター法により確認した（Fasmac社に委託）。なお、上記６種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のｃＤＮＡは、それぞれ配列番号５０〜５３、並びに５４及び５５で示される塩基配列からなるＤＮＡである。
［Ｇαタンパク質発現ベクターの作製２］
Ｇαキメラタンパク質を発現するベクターの作製は、以下の手順に従って行った。
まず、ｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）で処理し、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製した。１１種類のＧα遺伝子（Ｇｓファミリー遺伝子２種［ＧＮＡＳ及びＧＮＡＬ遺伝子］、Ｇｉファミリー遺伝子４種［ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＯ１、及びＧＮＡＺ遺伝子］、Ｇｑファミリー遺伝子３種［ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５遺伝子］、並びにＧ１２ファミリー遺伝子２種［ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子］）がコードするタンパク質（それぞれＧαｓ及びＧαｏｌｆ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、及びＧαｚ、Ｇαｑ、Ｇα１４、及びＧα１６、並びにＧα１２及びＧα１３）の、カルボキシル（Ｃ）末端から７〜１アミノ酸残基からなるペプチド断片（以下、「１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片」という）をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、かかるＤＮＡ断片１０ｐｍｏｌと、上記制限酵素処理したｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳベクター２０ｎｇとを混合し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いてリガーゼ処理を行い、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社製）に導入し形質転換させた。
なお、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ含むＤＮＡ断片は、配列番号５６〜７７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをFasmac社で受託合成し、２種類ずつ（ＧＮＡＳ遺伝子の場合、配列番号５６及び５７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＬ遺伝子の場合、配列番号５８及び５９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＩ１遺伝子の場合、配列番号６０及び６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＩ３遺伝子の場合、配列番号６２及び６３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＯ１遺伝子の場合、配列番号６４及び６５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＺ遺伝子の場合、配列番号６６及び６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＱ遺伝子の場合、配列番号６８及び６９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡ１４遺伝子の場合、配列番号７０及び７１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡ１５遺伝子の場合、配列番号７２及び７３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡ１２遺伝子の場合、配列番号７４及び７５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；ＧＮＡＩ３遺伝子の場合、配列番号７６及び７７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を混合し、９５℃（５分間）／９５℃から３０℃への勾配（１５分間）／２５℃（１分間）／２０℃（１分間）／１５℃（１分間）／１０℃（１分間）の条件でアニールすることにより調製した。
形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択し、選択された大腸菌コロニーを単離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培養液で増殖させた後、大腸菌に含まれるベクターＤＮＡをGenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて単離・精製した。精製したベクターＤＮＡ中に、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片が含まれることは、ダイターミネーター法により確認した（Fasmac社に委託）。すなわち、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ含むＤＮＡ断片は、制限酵素ＰｖｕＩＩ認識配列と、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ（終止コドンを含む）とを含むＤＮＡであり、また、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号７８〜８８で示される塩基配列からなるＤＮＡであることが確認された。
次に、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を含むｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳベクターを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｖｕＩＩ（タカラバイオ社製）で処理し、１％アガロールゲルで泳動後、制限酵素で切断された断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製した。また、上記［Ｇαタンパク質発現ベクターの作製１］の項目に記載の方法によって作製した６種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４、及びＧＮＡ１５、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３）のｃＤＮＡを含むｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳを鋳型として、かかる６種類のＧα遺伝子がコードするタンパク質のＣ末端ペプチド断片が欠損したペプチド断片（以下、「６種類のＧαタンパク質のＮ末端ペプチド断片」という）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとポリメラーゼPrimeSTAR HS（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。
上記６種類のＧαタンパク質のＮ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを、以下の表４に示す。
ＰＣＲにより得られた上記６種類のＧαタンパク質のＮ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ増幅産物を、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）処理した。かかる制限酵素処理したＤＮＡ増幅産物１００ｎｇと、上記制限酵素処理した１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を含むｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳベクター５０ｎｇとを混合し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いてリガーゼ処理を行い、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社製）に導入し形質転換させた。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択し、選択された大腸菌コロニーを単離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培養液で増殖させた後、ベクターＤＮＡをNucleoBond Xtra Midi Plus Kit（Macherey-Nagle社製）を用いて精製した。精製したベクターＤＮＡ中に、上記６種類のＧαタンパク質のＮ末端ペプチド断片と、上記１１種類のＧαタンパク質のＣ末端ペプチド断片とのキメラタンパク質（Ｇαキメラタンパク質）をコードするＤＮＡが含まれることは、ダイターミネーター法により確認した（Fasmac社に委託）。
なお、上記Ｇαキメラタンパク質は、具体的には、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、ＧαｓのＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｓ）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、ＧαｏｌｆのＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｏｌｆ）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇαi1のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｉ１）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ３のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｉ３）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、ＧαｏのＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｏ）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、ＧαｚのＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／ｚ）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇα１４のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／１４）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇα１６のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／１６）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇα１２のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／１２）、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇα１３のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇαｑ／１３）、Ｇα１１のＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇα１１／ｉ１）、Ｇα１４のＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇα１４／ｉ１）、Ｇα１６のＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇα１６／ｉ１）、Ｇα１２のＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇα１２／ｉ１）、及びＧα１３のＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片との融合タンパク質（Ｇα１３／ｉ１）の計１５種類であり、これら１５種類のキメラＧαタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｏｌｆ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／ｉ３、Ｇαｑ／ｏ、Ｇαｑ／ｚ、Ｇαｑ／１４、Ｇαｑ／１５、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／１３、Ｇα１１／ｉ１、Ｇα１４／ｉ１、Ｇα１６／ｉ１、Ｇα１２／ｉ１、及びＧα１３／ｉ１）は、それぞれ配列番号９５〜１０９で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる。
［Ｇαタンパク質発現ベクターの作製３］
野生型ＧＮＡＱ遺伝子のｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡに対して、耐性のサイレント変異を導入したＧαｑ（ｓｉＲＮＡ耐性Ｇαｑ）発現用ベクターと、ｓｉＲＮＡ耐性GαｑをベースとしたＧαキメラタンパク質発現用ベクターの作製は、以下の手順に従って行った。
まず、上記［Ｇαタンパク質発現ベクターの作製１］の項目に記載の方法によって作製したＧＮＡＱのｃＤＮＡを含むｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳを鋳型として、２種類のプライマーセット（配列番号３８及び１１１で示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号３９及び１１０で示される塩基配列からなるプライマーセット）とポリメラーゼPrimeSTAR HS（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。２種類のプライマーセットを用いて得られた２種類のＰＣＲ産物を、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製し、混合した後、かかる２種類のＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーセット（配列番号３８及び３９で示される塩基配列からなるプライマーセット）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を、１％アガロールゲルで泳動後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）で処理した。かかる制限酵素処理したＰＣＲ産物１００ｎｇと、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）で処理したｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳ５０ｎｇとを混合し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いてリガーゼ処理を行い、コンピテント大腸菌ＳＣＳＩ（Agilent Technologies社）へ導入し形質転換させた。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地プレートで薬剤選択し、選択された大腸菌コロニーを単離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培養液で増殖させた後、ベクターＤＮＡをNucleoBond Xtra Midi Plus Kit（Macherey-Nagle社製）を用いて精製した。精製したベクターＤＮＡ中に、ｓｉＲＮＡ耐性GαｑをコードするＤＮＡが含まれることは、ダイターミネーター法により確認した（Fasmac社に委託）。ｓｉＲＮＡ耐性ＧαｑをコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号１１２で示される塩基配列からなるＤＮＡである。
［ＴＧＦα切断アッセイ］
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合ＴＧＦα（ＡＰ−ＴＧＦα）及び１０種類のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（３種類のプロスタグランジンＥ受容体［ＥＰ１、ＥＰ２、及びＥＰ３］、ヒスタミンＨ３受容体［Ｈ３Ｒ］、アドレナリンα１Ａ受容体［α１Ａ］、トロンボキサン受容体［ＴＰ］、Ａ型エンドセリン受容体［ＥＴＡ］、I型アンジオテンシンII受容体［ＡＴ１］、プロスタグランジンＦ受容体［ＦＰ］、及びカンナビノイド受容体１［ＣＢ１］）発現細胞を作製するために、文献（Inoue, A. et al. Nature Methods, 9, 1021-1029 (2012)）に記載の方法に従ってＡＰ−ＴＧＦα発現ベクターと１０種類のＧＰＣＲ発現ベクターを入手又は作製した。細胞を２×１０５細胞／ｍＬとなるように本件培養液で懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）の各ウェルに１ｍＬずつ播種し、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後、各ウェルに、ＡＰ−ＴＧＦα発現ベクター２５０ｎｇと、上記１０種類のＧＰＣＲ発現ベクター１００ｎｇとを、又はＡＰ−ＴＧＦα発現ベクター２５０ｎｇと、上記１０種類のＧＰＣＲ発現ベクター１００ｎｇと、Ｇαタンパク質発現ベクター５０ｎｇとを、LipofectAMINE 2000（Life Technologies社製）１．２５μＬを用いて細胞へトランスフェクションした。なお、ＡＰ−ＴＧＦαは、膜結合型pro-TGFα（ＴＧＦＡ遺伝子がコードするタンパク質）のＮ末端側に胎盤ＡＰ（ＡＬＰＰ遺伝子がコードするタンパク質）が融合したタンパク質である。
トランスフェクション２４時間後の細胞を、０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて細胞を剥がし、本件培養液でトリプシン反応を停止し、遠心処理した。上清を除去後、細胞沈殿物（ペレット）をＰＢＳで懸濁し、室温で１０分間静置した。遠心処理後、上清を除去し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、５ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］含有）３．５ｍＬに懸濁した。かかる細胞懸濁液を、細胞培養用９６ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）の各ウェルに９０μＬずつ播種し、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間静置した。各濃度の被検化合物（プロスタグランジンＥ２［Prostaglandin E2］、ヒスタミン、ノルアドレナリン［Noradrenaline］、Ｕ−４６６１９、エンドセリン−１（Endothelin-1）、ＣＰ−５５９４０、アンジオテンシンII（Angiotensin II）、又はアンジオテンシンIIのアナログ［Sar(1)-Ile(4)-Ile(8)AngII；ＳII］）を１０μＬずつ添加し、５％ＣＯ２存在下でさらに１時間静置した。９６ウェルプレートを遠心処理（１９０×ｇ、２分、室温）し、１２連マルチチャネル電動ピペッターeLine（Sartorius社製）を用いて培養上清１００μＬのうち８０μＬを別の９６ウェルプレートに移し（培養上清プレート）、細胞が付着した９６ウェルプレート（細胞プレート）と分けた。培養上清プレートと細胞プレートのそれぞれに、ＡＰの基質であるｐ?ニトロフェニルリン酸（Ｐ−ＮＰＰ）１０ｍＭ含有反応液（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．５］、４０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２）８０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、波長４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）をマイクロプレートリーダーVersaMax（Molecular Devices社製）を用いて測定し（反応前のＯＤ４０５［バックグラウンド］）、さらに３７℃インキュベーター（ＣＯ２添加なし）で１時間インキュベーションした後、ＯＤ４０５を再度測定した（反応後のＯＤ４０５）。細胞プレートにおける反応後のＯＤ４０５を、細胞プレートにおける反応前のＯＤ４０５（バックグラウンド）で減して「細胞のＯＤ４０５」を算出し、また、培養上清プレートにおける反応後のＯＤ４０５を、培養上清プレートにおける反応前のＯＤ４０５（バックグラウンド）で減して「上清のＯＤ４０５」を算出し、かかる「細胞のＯＤ４０５」と「上清のＯＤ４０５」の値を、以下の式に入力することによりＡＰ活性（％）を算出した。このとき得られた値を「刺激ＡＰ活性値」とする。なお、コントロールとして、被検化合物を添加しない場合の実験も同様に行ない、ＡＰ活性（％）を算出した。このとき得られた値を「無刺激ＡＰ活性値」とする。被検化合物（リガンド）の各濃度において、刺激ＡＰ活性値を無刺激ＡＰ活性値で減した値を算出し、容量反応曲線を作成し、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を、文献「Ehlert, F.J. On the analysis of ligand-directed signaling at G protein-coupled receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 377, 549-577 (2008).」に記載の方法に従って算出した。
［ｓｉＲＮＡによるＧαタンパク質の発現抑制］
ＨＥＫ２９３細胞を１×１０５細胞／ｍＬとなるように本件培養液で懸濁し、１２ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後、各ウェルに、４種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３）を標的とするｓｉＲＮＡ（Stealth siRNA［Life Technologies社製］）１２ｐｍｏｌ（終濃度１０ｎＭ）を、LipofectAMINER RNAiMAX（Life Technologies社製）１μＬを用いて細胞へトランスフェクションした。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとして、Stealth RNA siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (Life Technologies社製)を用いた。また、上記４種類のＧα遺伝子（ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３）を標的とするｓｉＲＮＡが標的とするＤＮＡは、それぞれ配列番号１１３及び１１４、並びに１１５及び１１６で示される塩基配列からなるＤＮＡである。
５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後、培養液を除去し、新しい本件培養液を各ウェルに１ｍＬずつ添加した。
［結果１：ＨＥＫ２９３細胞におけるＧｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のｍＲＮＡの発現］
本発明者らの以前の報告（Inoue et al (2012) Nature Meth 9, 1021-1029）では、Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路と、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達経路とがＴＧＦαの切断に関与することを示している。Ｇｑファミリー遺伝子として、４種類の遺伝子（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４及びＧＮＡ１５遺伝子）が知られており、また、Ｇ１２ファミリー遺伝子として、２種類の遺伝子（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）が知られている。そこで、ＴＧＦαの切断に関与する遺伝子を詳細に解析するために、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧｑファミリー遺伝子とＧ１２ファミリー遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを、上記［Ｇα遺伝子のｍＲＮＡ発現解析］の項目に記載の方法に従って解析した。その結果を図４に示す。
Ｇｑファミリー遺伝子４種（ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１４及びＧＮＡ１５遺伝子）のうち、主にＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子が発現していることが示された（図４）。また、Ｇ１２ファミリー遺伝子２種（ＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析したところ、両者の発現レベルはほぼ同じであることが示された（図４）。この結果は、ＨＥＫ２９３細胞中でＴＧＦα切断応答を担う主要なＧαタンパク質は、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、及びＧα１３の計４種類であることが示された。
［結果２：Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株を用いたＴＧＦα切断アッセイ］
ＨＥＫ２９３野生株（Parent）中で行うＴＧＦα切断アッセイが、Ｇｑファミリーのシグナル伝達経路と、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達経路の両方を特異的に検出できるアッセイ系であることを確認するために、６種類の外因性ＧＰＣＲ（ＥＰ２、ＥＰ３、α１Ａ、ＥＰ３、ＴＰ、及びＥＴＡ）が発現するＨＥＫ２９３野生株（Parent）と、５種類の被検化合物（プロスタグランジンＥ２、ヒスタミン、ノルアドレナリン、Ｕ−４６６１９、及びエンドセリン−１）のリガンドとを用いて、上記［ＴＧＦα切断アッセイ］の項目に記載の方法に従ってＴＧＦα切断アッセイを行った。その結果を図５に示す。
ＥＰ２（Ｇｓ共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＥＰ２受容体のリガンドであるプロスタグランジンＥ２で刺激した場合、ＡＰの活性化は検出されなかった（図５Ａの「○ Parent」）。他方、ＥＰ３（Ｇ１２共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＥＰ３受容体のリガンドでもあるプロスタグランジンＥ２で刺激した場合、ＡＰの活性化が検出された（図５Ｄの「○ Parent」）これらの結果は、ＨＥＫ２９３野生株中でＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を検出でき、Ｇｓファミリーのシグナル伝達活性化は検出できないことを示している。
また、Ｈ３Ｒ（Ｇｉ共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、Ｈ３Ｒ受容体のリガンドであるヒスタミンで刺激した場合、ＡＰの活性化は検出されなかったのに対して（図５Ｂの「○ Parent」）、α１Ａ（Ｇｑ共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、α１Ａ受容体のリガンドであるノルアドレナリンで刺激した場合、ＡＰの活性化が検出された（図５Ｃの「○ Parent」）。これらの結果は、ＨＥＫ２９３野生株中でＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化を検出でき、Ｇｉファミリーのシグナル伝達経路の活性化は検出できないことを示している。
以上の結果をまとめると、ＨＥＫ２９３野生株中でＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化と、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化の両方を特異的に検出できることが確認された。この点は、ＧｑファミリーとＧ１２ファミリーの両方の共役型受容体であるＴＰやＥＴＡ受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞を、それら受容体のリガンド（Ｕ−４６６１９及びエンドセリン−１）で刺激した場合にも、同様にＡＰの活性化が検出されたことにより確かめられた（図５Ｅ及びＦの「○ Parent」）。
次に、ＧｑやＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１、ΔＧＮＡ１２／１３、及びΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株を用いて、上記［ＴＧＦα切断アッセイ］の項目に記載の方法に従ってＴＧＦα切断アッセイを行った場合に、Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化と、Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化とを区別して検出できるかどうかを検討した。その結果を図５に示す。
α１Ａ（Ｇｑ共役型）受容体発現Ｇ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡ１２／１３）株をノルアドレナリン（α１Ａ受容体のリガンド）で刺激した場合（図５Ｃの「◇ ΔＧＮＡ１２／１３」）、ＨＥＫ２９３野生株を用いた場合と同様にＡＰの活性化が検出されたのに対して、α１Ａ受容体発現Ｇｑファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１）株をノルアドレナリンで刺激した場合（図５Ｃの「● ΔＧＮＡＱ／１１」）、ＡＰの活性化は検出されなかった。この結果は、Ｇ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株中でＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、内在性Ｇｑファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出できることを示している。
また、ＥＰ３（Ｇ１２共役型）受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１株をプロスタグランジンＥ２（ＥＰ３受容体のリガンド）で刺激した場合（図５Ｄの「● ΔＧＮＡＱ／１１」）、ＨＥＫ２９３野生株を用いた場合と同様にＡＰの活性化が検出されたのに対して、ＥＰ３受容体発現ΔＧＮＡ１２／１３株をプロスタグランジンＥ２で刺激した場合（図５Ｄの「◇ ΔＧＮＡ１２／１３」）、ＡＰの活性化は検出されなかった。この結果は、Ｇｑファミリー遺伝子のノックアウト細胞株中でＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、内在性Ｇ１２ファミリーのシグナル伝達活性化を特異的に検出できることを示している。
さらに、ＴＰ及びＥＴＡ（ＧｑとＧ１２の両方の共役型）受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１株を、それぞれＵ−４６６１９及びエンドセリン−１（それぞれＴＰ及びＥＴＡ受容体のリガンド）で刺激した場合（図５Ｅ及びＦの「● ΔＧＮＡＱ／１１」）や、ＴＰ及びＥＴＡ受容体発現ΔＧＮＡ１２／１３株を、それぞれＵ−４６６１９及びエンドセリン−１で刺激した場合（図５Ｅ及びＦの「◇ ΔＧＮＡ１２／１３」）、ＨＥＫ２９３野生株を用いた場合と同様にＡＰの活性化が検出されたのに対して、ＴＰ及びＥＴＡ受容体発現Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株を、それぞれＵ−４６６１９及びエンドセリン−１で刺激した場合（図５Ｅ及びＦの「◆ ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３」）、ＡＰの活性化レベルは検出されなかった。この結果は、上記図５Ｃ及びＤにおける結果を支持するとともに、Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株中にＧｑやＧ１２ファミリータンパク質を発現させてＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により誘導される、外因性ＧｑやＧ１２ファミリータンパク質依存的なシグナル伝達活性化を特異的に検出できることを示唆している。
［結果３：Ｇｑ及びＧ１２ファミリータンパク質を骨格としたＧαキメラタンパク質を発現させた野生株を用いたＴＧＦα切断アッセイ］
本発明者らの以前の報告（Inoue et al (2012) Nature Meth 9, 1021-1029）では、外因性アセチルコリンＭ２（Ｇｉ共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞に、ＧαｑのＮ末端ペプチド断片と、Ｇαｉ１のＣ末端ペプチド断片とが融合したＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｉ１）をさらに発現させ、アセチルコリンで刺激してＴＧＦα切断アッセイを行うと、ＡＰを活性化できることを示している。この結果は、ＧｑやＧ１２ファミリータンパク質を骨格とし、Ｇｓ又はＧｉが融合したＧαキメラタンパク質を用いてＴＧＦα切断アッセイを行うと、ＧｓやＧｉファミリータンパク質のシグナル伝達活性化も検出できることを示唆している。この点をさらに詳細に検証するために、Ｇｑファミリータンパク質４種（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、及びＧα１６）のＮ末端ペプチド断片と、Ｇｓファミリータンパク質１種（Ｇαｓ）のＣ末端ペプチド断片とがそれぞれ融合したＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇα１１／ｓ、Ｇα１４／ｓ、及びＧα１６／ｓ）や、Ｇ１２ファミリータンパク質２種（Ｇα１２及びＧα１３）のＮ末端ペプチド断片と、ＧαｓのＣ末端ペプチド断片とがそれぞれ融合したＧαキメラタンパク質（Ｇα１２／ｓ及びＧα１３／ｓ）を発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、上記［ＴＧＦα切断アッセイ］の項目に記載の方法に従ってＴＧＦα切断アッセイを行った。その結果を図６に示す。
コントロールとして、ＥＰ２（Ｇｓ共役型）受容体発現ＨＥＫ２９３細胞に、６種類のＧαタンパク質（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、及びＧα１６、並びにＧα１２及びＧα１３）をさらに発現させ、プロスタグランジンＥ２（ＥＰ２受容体のリガンド）で刺激した場合（図６の下段の「● ＥＰ２」）、ＡＰの活性化は検出されない、又は感度以下であったのに対して、ＥＰ２受容体発現ＨＥＫ２９３細胞に、６種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇα１１／ｓ、Ｇα１４／ｓ、及びＧα１６／ｓ、並びにＧα１２／ｓ及びＧα１３／ｓ）をさらに発現させ、プロスタグランジンＥ２で刺激した場合（図６の中段の「● ＥＰ２」）、いずれの場合においてもＡＰの活性化が検出されたが、特にＧαｑ／ｓを用いた場合、もっとも検出レベルが高かった。なお、ＥＰ２受容体を発現させなかった場合（図６の「○ Mock」）や、Ｇαキメラタンパク質やＧαタンパク質を発現させなかった場合（図６の上段）には、ＡＰの活性化は検出されなかったことを確認した。これらの結果は、Ｇαｑを骨格とし、Ｇｓ又はＧｉが融合したＧαキメラタンパク質を用いてＴＧＦα切断アッセイを行うと、Ｇαｑ以外の他のＧｑファミリータンパク質（Ｇα１１、Ｇα１４、及びＧα１６）や、Ｇ１２ファミリータンパク質（Ｇα１２及びＧα１３）を骨格とし、Ｇｓ又はＧｉが融合したＧαキメラタンパク質を用いてＴＧＦα切断アッセイを行った場合と比べ、ＧｓやＧｉのシグナル伝達経路の活性化を感度よく検出できることを示している。
［結果４：Ｇｑ及びＧ１２ファミリータンパク質を骨格としたＧαキメラタンパク質を発現させたＧｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株を用いたＴＧＦα切断アッセイ］
図５の結果から、Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞（ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３）株中にＧｑ及びＧ１２ファミリータンパク質を発現させてＴＧＦα切断アッセイを行うと、Ｇｑ及びＧ１２ファミリータンパク質の発現に依存したシグナル伝達経路の活性化を特異的に検出できることが示唆された。そこで、Ｇｑファミリータンパク質を骨格とし、Ｇｓ、Ｇｉ、又はＧ１２ファミリータンパク質が融合したＧαキメラタンパク質を発現させたΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を用いて、上記［ＴＧＦα切断アッセイ］の項目に記載の方法に従ってＴＧＦα切断アッセイを行った場合に、対象となるリガンドが、４種類のＧαファミリータンパク質（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２）のいずれを活性化できるものであるかを明らかにしたり、対象となるリガンドによる上記４種類のＧαタンパク質の活性化レベルを、相対的に評価できるかどうか検討した。なお、Ｇαキメラタンパク質の骨格に用いるＧｑタンパク質として、図６の結果で最も感度よく検出できるＧαｑを用いた。その結果を図７に示す。
ＴＰ（ＧｑとＧ１２の両方の共役型）受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、Ｕ−４６６１９（ＴＰ受容体のリガンド）で刺激した場合（図７Ａの「○ No Ｇα」）、ＡＰの活性化は検出されなかったのに対して、ＴＰ受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、Ｇαｑをさらに発現させ、Ｕ−４６６１９で刺激した場合（図７Ａの「Ｇαｑ」）、ＡＰの活性化が検出された。また、ＴＰ受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、３種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、及びＧαｑ／１２）をさらに発現させ、Ｕ−４６６１９で刺激した場合（図７Ａの「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、及び「Ｇαｑ／１２」）、ＡＰの活性化が検出された。検出されたＡＰの活性化レベルを、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を用いて定量すると、最も低いＵ−４６６１９濃度でリガンド刺激（ＡＰ活性化）を誘導することができたのは、Ｇαｑを発現させた場合であり、以下、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／ｓの順でリガンド刺激を誘導できるＵ−４６６１９濃度は低かった。この結果は、Ｕ−４６６１９がＴＰ受容体に結合すると、Ｇαｑのシグナル伝達が最も高いレベルで活性化され、以下Ｇαｉ１、Ｇα１２、Ｇαｓの順で高いことが示された。
また、ＣＢ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、ＣＰ−５５９４０（ＣＢ１受容体のリガンド）で刺激した場合（図７Ｂの「○ No Ｇα」）、ＡＰの活性化は検出感度以下であったのに対して、ＣＢ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、Ｇαｑや３種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、及びＧαｑ／１２）をさらに発現させ、ＣＰ−５５９４０で刺激した場合（図７Ｂの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、及び「Ｇαｑ／１２」）、ＡＰの活性化が検出された。検出されたＡＰの活性化レベルを、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を用いて定量すると、最も低いＣＰ−５５９４０濃度でリガンド刺激（ＡＰ活性化）を誘導することができたのは、Ｇαｑ／ｉ１を発現させた場合であり、以下、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑの順でリガンド刺激を誘導できるＣＰ−５５９４０濃度が低かった。この結果は、ＣＰ−５５９４０がＣＢ１受容体に結合すると、Ｇαｉ１のシグナル伝達が最も高いレベルで活性化され、以下Ｇα１２、Ｇαｓ、Ｇαｑの順で高いことが示された。
また、ＦＰ受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、プロスタグランジンＦ２α（ＦＰ受容体のリガンド）で刺激した場合（図７Ｃの「○ No Ｇα」）、ＡＰの活性化は検出されなかったのに対して、ＦＰ受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、Ｇαｑや４種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）をさらに発現させ、プロスタグランジンＦ２αで刺激した場合（図７Ｃの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、「Ｇαｑ／１２」、及び「Ｇαｑ／１３」）、ＡＰの活性化が検出された。検出されたＡＰの活性化レベルを、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を用いて定量すると、最も低いプロスタグランジンＦ２α濃度でリガンド刺激（ＡＰ活性化）を誘導することができたのは、Ｇαｑ／ｓを発現させた場合であり、以下、Ｇαｑ、Ｇαｑ／１３、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／ｉ１の順でリガンド刺激を誘導できるプロスタグランジンＦα濃度が低かった。この結果は、プロスタグランジンＦ２αがＦＰ受容体に結合すると、Ｇαｓのシグナル伝達が最も高いレベルで活性化され、以下Ｇαｑ、Ｇα１３、Ｇα１２、Ｇαｉ１の順で高いことが示された。
また、ＡＴ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、アンジオテンシンII（ＡＴ１受容体のリガンド）で刺激した場合（図７Ｄの「○ No Ｇα」）、ＡＰの活性化は検出されなかったのに対して、ＡＴ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、Ｇαｑや４種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）をさらに発現させ、アンジオテンシンIIで刺激した場合（図７Ｄの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、「Ｇαｑ／１２」、及び「Ｇαｑ／１３」）、ＡＰの活性化が検出された。検出されたＡＰの活性化レベルを、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を用いて定量すると、最も低いアンジオテンシンII濃度でリガンド刺激（ＡＰ活性化）を誘導することができたのは、Ｇαｑを発現させた場合であり、以下、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／１３の順でリガンド刺激を誘導できるアンジオテンシンII濃度が低かった。この結果は、アンジオテンシンIIがＡＴ１受容体に結合すると、Ｇαｑのシグナル伝達が最も高いレベルで活性化され、以下Ｇαi1、Ｇα１２、Ｇαｓ、Ｇα１３の順で高いことが示された（図７Ｆ）。
また、ＡＴ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、アンジオテンシンIIのアナログ（ＳII）で刺激した場合（図７Ｅの「○ No Ｇα」）、ＡＰの活性化は検出感度以下であったのに対して、ＡＴ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株に、Ｇαｑや４種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）をさらに発現させ、ＳIIで刺激した場合（図７Ｅの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、「Ｇαｑ／１２」、及び「Ｇαｑ／１３」）、ＡＰの活性化が検出された。検出されたＡＰの活性化レベルを、容量反応曲線から得られるＥｍａｘ/ＥＣ５０値を用いて定量すると、最も低いＳII濃度でリガンド刺激（ＡＰ活性化）を誘導することができたのは、Ｇαｑ／１２を発現させた場合であり、以下、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ、Ｇαｑ／１２、Ｇαｑ／ｓの順でリガンド刺激を誘導できるＳII濃度が低かった。この結果は、ＳIIがＡＴ１受容体に結合すると、Ｇα１２のシグナル伝達が最も高いレベルで活性化され、以下Ｇαｉ１、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇαｓの順で高いことが示された（図７Ｆ）。なお、文献「Sauliere, A. et al. Deciphering biased-agonism complexity reveals a new active AT1 receptor entity. Nat Chem Biol 8, 622-630 (2012).」には、ＳIIがアンジオテンシンIIと比べ、ＧαｑよりもＧαｑを活性化することが報告されており、この報告の内容は、本発明のＴＧＦα切断アッセイで得られた結果を支持するものである。
以上の結果から、Ｇｑファミリータンパク質やＧ１２ファミリータンパク質を骨格とし、Ｇｓ、Ｇｉ、又はＧ１２タンパク質が融合したＧαキメラタンパク質を発現させたＧｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株を用いてＴＧＦα切断アッセイを行うと、リガンドとその受容体との結合により活性化される４種類のＧαファミリー（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２）タンパク質のシグナル伝達のうち、最も高いレベルで活性化されるものを明らかにすることや、上記４種類のＧαファミリータンパク質間でシグナル伝達の活性化レベルを、相対的に評価できることが示された。
［比較例］
［結果５：Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックダウン細胞株を用いたＴＧＦα切断アッセイ］
Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子をノックダウンした細胞株を用いてＴＧＦα切断アッセイを行った場合にも同様に、リガンドとその受容体との結合により誘導されるＧαのシグナル伝達の活性化を検出できるかどうかを検討した。
上記［ｓｉＲＮＡによるＧαタンパク質の発現抑制］の項目に記載の方法に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した場合（図８の「ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３」の「■ siRNA」）、コントロールのｓｉＲＮＡで処理した場合（図８の「ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３」の「□ Control」）と比べ、ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、すべて１／６以下まで低下しており、ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡが、ＨＥＫ２９３細胞中に存在する標的遺伝子（Ｇｑファミリー遺伝子やＧ１２ファミリー遺伝子）をノックダウンできるものであることが確認された。
次に、上記［ｓｉＲＮＡによるＧαタンパク質の発現抑制］の項目に記載の方法に従って、
Ｇｑファミリー遺伝子をノックダウンした細胞（ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ）株や、Ｇ１２ファミリー遺伝子をノックダウンした細胞（ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株や、Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子をノックダウンした細胞（ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株を作製し、これら細胞株を用い、上記［ＴＧＦα切断アッセイ］の項目に記載の方法に従ってＴＧＦα切断アッセイ行った。その結果を図９に示す。
ＴＰ（ＧｑとＧ１２の両方の共役型受容体）受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、Ｕ−４６６１９（ＴＰ受容体のリガンド）で刺激した場合、ＡＰの活性化レベルは検出されなかった（図９Ｂ［図５Ｅの結果と同一］）のに対して、ＴＰ受容体発現Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックダウン細胞（ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株を、Ｕ−４６６１９で刺激した場合（図９Ａの「◆ ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ」）、ＡＰの活性化レベルは、ＴＰ受容体発現Ｇｑファミリー遺伝子のノックダウン細胞（ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ）株（図９Ａの「● ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ」）や、ＴＰ受容体発現Ｇ１２ファミリー遺伝子のノックダウン細胞（ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ）株（図９Ａの「◇ ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ」）を用いた場合と比べ、減少するものの、検出されていた。
また、ＥＰ１（ＧｑとＧ１２の両方の共役型受容体）受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を、プロスタグランジンＥ２（ＥＰ１受容体のリガンド）で刺激した場合、ＡＰの活性化は検出されなかった（図９Ｄ）のに対して、ＥＰ１受容体発現ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ株を、プロスタグランジンＥ２で刺激した場合（図９Ｃの「◆ ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ」）、ＡＰの活性化は、ＥＰ１受容体発現ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ株（図９Ｃの「◇ ＧＮＡ１２／１３ ｓｉＲＮＡ」）を用いた場合と比べそのレベルは減少するものの、検出された上に、ＥＰ１受容体発現ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ株（図９Ｃの「● ＧＮＡＱ／１１ ｓｉＲＮＡ」）を用いた場合と差が検出できなかった。
また、ＴＰ受容体発現ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ株に、Ｇαｑや３種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、及びＧαｑ／１２）をさらに発現させ、Ｕ−４６６１９で刺激した場合（図１０Ａの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、及び「Ｇαｑ／１２」）、ＡＰの活性化レベルが増加したものの、コントロール（図１０Ａの「○ No Ｇα」）との差は、ＥＰ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株を用いた場合と比べ小さかった（図１０Ｃ［図７Ａの結果と同一］）。
また、ＦＰ受容体発現ＧＮＡＱ／１１／１２／１３ ｓｉＲＮＡ株に、Ｇαｑや４種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、Ｇαｑ／ｉ１、Ｇαｑ／１２、及びＧαｑ／１３）をさらに発現させ、プロスタグランジンＦ２α（ＦＰ受容体のリガンド）で刺激した場合（図１０Ｂの「Ｇαｑ」や、「Ｇαｑ／ｓ」、「Ｇαｑ／ｉ」、「Ｇαｑ／１２」、及び「Ｇαｑ／１３」）、Ｇαｑや２種類のＧαキメラタンパク質（Ｇαｑ／ｓ、及びＧαｑ／１３）をさらに発現させたときは、ＡＰの活性化レベルが増加したものの、コントロール（図１０Ｂの「○ No Ｇα」）との差は、ＥＰ１受容体発現ΔＧＮＡＱ／１１／１２／１３株（図１０Ｄ［図７Ｃの結果と同一］）を用いた場合と比べ、小さかった上に、２種類のＧαキメラタンパク質（αｑ／ｉ１、及びＧαｑ／１２）をさらに発現させたときは、コントロールとの差を十分に検出することができなかった。
以上の結果は、Ｇｑ及びＧ１２ファミリー遺伝子のノックダウン細胞株を用いたＴＧＦα切断アッセイは、リガンドとその受容体との結合により誘導されるＧαのシグナル伝達の活性化を感度よく検出できるものではないことを示すとともに、ＧｑやＧ１２ファミリー遺伝子のノックアウト細胞株を用いた本発明のＴＧＦα切断アッセイは、感度及び特異性に優れた方法であることを示している。
本発明は、リガンドとそのＧＰＣＲにより誘導される、多数のＧαのシグナル伝達活性化を簡便かつ高感度かつ特異的かつ定量的に検出できるため、個々のＧαのシグナル伝達活性化を特異的に活性化できるＧＰＣＲの標的薬（バイアストアゴニスト［biased agonist］）のスクリーニングに有用である。個々のＧαのシグナル伝達活性化を特異的に活性化できるＧＰＣＲの標的薬（バイアストアゴニスト）は、内因性リガンドとそのＧＰＣＲにより誘導される複数の生理活性のうち、単一のものを特異的に阻害する可能性があるため、本発明によると、副作用の少ないＧＰＣＲの標的薬（バイアストアゴニスト）をより簡便にスクリーニングできることが期待される。同様に、個々のＧαのシグナル伝達活性化を特異的に阻害できるＧＰＣＲの標的薬（アンタゴニスト）のスクリーニングにも有用である。個々のＧαのシグナル伝達活性化を特異的に阻害できるＧＰＣＲの標的薬（アンタゴニスト）は、リガンドとそのＧＰＣＲにより誘導される複数の生理活性のうち、単一のものを特異的に阻害する可能性があるため、本発明によると、副作用の少ないＧＰＣＲの標的薬（アンタゴニスト）をより簡便にスクリーニングできることが期待される。また、本発明のうち、ΔＧＮＡＱ／１１細胞株を用いることで、Ｇ１２やＧ１３のシグナル伝達活性化を高感度かつ特異的に検出できるため、Ｇ１２やＧ１３と共役するＧＰＣＲに対する標的薬を正確に評価することが可能となり、創薬の標的となるＧＰＣＲの対象が広がることに加え、ＧＰＣＲの標的薬Ｇ１２やＧ１３のシグナル伝達経路を介した薬効や副作用を精度よく予測できることが期待される。

Claims (14)

  1. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出する方法。
    （ａ）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、又はＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞に、
    ＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質と、
    膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質
    とを導入する工程；
    （ｂ）工程（ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養し、培養上清を採取する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程；
  2. 以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出する方法。
    （Ａ）ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞に、
    ＧＰＣＲ遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質と、
    膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質と、
    以下の（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質
    とを導入する工程；
    （Ｂ）工程（Ａ）で導入処理した哺乳動物細胞を被検物質の存在下で培養し、培養上清を採取する工程；
    （Ｃ）工程（Ｂ）で採取した培養上清中における標識物質の有無を検出する工程；
    （ｐ−１）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］及び［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチド；
    （ｐ−２）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｐ−３）以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｑファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＱ−１）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＱ−２）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＱ−３）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−１）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−２）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−３）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−１）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−２）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−３）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−１）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−２）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−３）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡ１２−１）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１２−２）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１２−３）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−１）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−２）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−３）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｓファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＳ−１）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＳ−２）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＳ−３）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−１）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−２）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−３）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｉファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＩ１−１）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ１−２）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ１−３）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−１）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−２）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−３）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−１）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−２）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−３）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−１）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−２）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−３）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−１）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−２）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−３）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−１）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−２）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−３）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−１）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−２）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−３）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−１）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−２）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−３）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
  3. キメラタンパク質のアミノ末端ドメインが、（ＧＮＡＱ−１）〜（ＧＮＡＱ−３）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. キメラタンパク質が、以下の（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかのタンパク質から選択されることを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
    （ｑ−１）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質；
    （ｑ−２）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
    （ｑ−３）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
  5. 標識物質がアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 哺乳動物細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 膜結合型ＴＧＦα遺伝子が、以下の（ｒ−１）〜（ｒ−３）のいずれかのポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
    （ｒ−１）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｒ−２）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｒ−３）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
  8. ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、又はＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、
    膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質
    とを備えること特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出するためのキット。
  9. ＧＮＡＱ及びＧＮＡ１１遺伝子、並びにＧＮＡ１２及びＧＮＡ１３遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞と、
    膜結合型ＴＧＦαのアミノ末端に標識物質が結合した標識物質結合膜結合型ＴＧＦα遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質と、以下の（ｐ−１）〜（ｐ−３）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質
    とを備えること特徴とする、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化を検出するためのキット。
    （ｐ−１）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］及び［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチド；
    （ｐ−２）以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｐ−３）以下の［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインと、以下の［Ｇｑファミリー遺伝子群］、［Ｇｓファミリー遺伝子群］、及び［Ｇｉファミリー遺伝子群］から選択されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質のカルボキシル末端ドメインとのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｑファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＱ−１）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＱ−２）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＱ−３）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−１）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−２）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１１−３）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−１）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−２）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１４−３）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−１）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−２）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１５−３）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇ１２ファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡ１２−１）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１２−２）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１２−３）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−１）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−２）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡ１３−３）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｓファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＳ−１）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＳ−２）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＳ−３）配列番号１１８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−１）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−２）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＬ−３）配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｓ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    ［Ｇｉファミリー遺伝子群］
    （ＧＮＡＩ１−１）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ１−２）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ１−３）配列番号１２０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−１）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−２）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ２−３）配列番号１２１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−１）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−２）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＩ３−３）配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−１）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−２）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＯ１−３）配列番号１２３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−１）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−２）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＺ−３）配列番号１２４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−１）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−２）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ１−３）配列番号１２５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−１）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−２）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ２−３）配列番号１２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−１）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−２）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ＧＮＡＴ３−３）配列番号１２７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＧｉ共役型受容体と共役できるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
  10. キメラタンパク質のアミノ末端ドメインが、（ＧＮＡＱ−１）〜（ＧＮＡＱ−３）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ末端ドメインであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
  11. キメラタンパク質が、以下の（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかのタンパク質から選択されることを特徴とする請求項９又は１０に記載のキット。
    （ｑ−１）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質；
    （ｑ−２）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
    （ｑ−３）配列番号９５、９７、１０３、又は１０４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするタンパク質からなり、かつＧＰＣＲとＴＡＣＥとのシグナル伝達活性を有するタンパク質；
  12. 標識物質がアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のキット。
  13. 哺乳動物細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載のキット。
  14. 膜結合型ＴＧＦα遺伝子が、以下の（ｒ−１）〜（ｒ−３）のいずれかのポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載のキット。
    （ｒ−１）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｒ−２）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｒ−３）配列番号１１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＴＡＣＥによる切断部位と膜結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
JP2014513383A 2014-02-25 2014-02-25 Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法 Active JP6093946B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/000992 WO2015128894A1 (ja) 2014-02-25 2014-02-25 Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP6093946B2 true JP6093946B2 (ja) 2017-03-15
JPWO2015128894A1 JPWO2015128894A1 (ja) 2017-03-30

Family

ID=54008269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014513383A Active JP6093946B2 (ja) 2014-02-25 2014-02-25 Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6093946B2 (ja)
WO (1) WO2015128894A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210310039A1 (en) * 2018-07-31 2021-10-07 The University Of Tokyo Membrane protein activity measurement method
EP3828543B1 (en) * 2018-09-05 2024-04-03 Yamasa Corporation Method and kit for rapid measurement of autoantibody activity with respect to tsh receptor
WO2022065354A1 (ja) 2020-09-23 2022-03-31 国立大学法人京都大学 アルファ２アドレナリン受容体アンタゴニスト

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001512664A (ja) * 1997-07-31 2001-08-28 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション Ｇタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ
JP2007537707A (ja) * 2003-05-20 2007-12-27 ザ ユニバーシティー コート オブ ザ ユニバーシティー オブ グラスゴウ Ｇタンパク質結合受容体オリゴマーに関する物質及び方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001512664A (ja) * 1997-07-31 2001-08-28 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション Ｇタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ
JP2007537707A (ja) * 2003-05-20 2007-12-27 ザ ユニバーシティー コート オブ ザ ユニバーシティー オブ グラスゴウ Ｇタンパク質結合受容体オリゴマーに関する物質及び方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014014625; 井上飛鳥、青木淳賢: 'Ｃｌｏｓｅ Ｕｐ実験法 ＴＧＦalpha切断を用いたＧＰＣＲの高感度・高精度な活性化検出法' 実験医学 Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．８, 20130501, Ｐ．１３０５-１３１２ *
JPN6014014626; 井上飛鳥、青木淳賢: '新規ＧＰＣＲ活性化検出法を利用したオーファン受容体のリガンドの同定' 生化学 Ｖｏｌ．８５，Ｎｏ．１１, 20131125, Ｐ．１０２９-１０３３ *
JPN6014014627; 井上飛鳥: 'ＴＧＦalpha切断を用いたＧＰＣＲ活性化の新しい検出法' 遺伝子医学ＭＯＯＫ Ｎｏ．２４, 20130531, Ｐ．９３-９８ *
JPN6014014628; Ａｓｕｋａ ＩＮＯＵＥ ｅｔ ａｌ．: 'ＴＧＦalpha ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙ： ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＧＰＣＲ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ' ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１０, 201210, Ｐ．１０２１-１０２９ *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015128894A1 (ja) 2017-03-30
WO2015128894A1 (ja) 2015-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102301464B1 (ko) 종양 세포에 의한 면역 억제를 감소시키기 위한 방법 및 조성물
JP4734498B2 (ja) タンパク質−タンパク質相互作用を解析する方法
Matti et al. ACKR4 recruits GRK3 prior to β-arrestins but can scavenge chemokines in the absence of β-arrestins
EP1504030B1 (en) Constitutively translocating cell line
EP1378749A1 (en) Screening method
AU2019203098B2 (en) NME variant species expression and suppression
Gijsbers et al. Functional characterization of the non-catalytic ectodomains of the nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase NPP1
Zhong et al. The essential role of Giα2 in prostate cancer cell migration
JP6093946B2 (ja) Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法
Jiang et al. A novel EST-derived RNAi screen reveals a critical role for farnesyl diphosphate synthase in β2-adrenergic receptor internalization and down-regulation
JP2009529893A (ja) タンパク質−タンパク質相互作用のアッセイ方法
Kaczmarek et al. Identifying G protein-coupled receptors involved in adipose tissue function using the innovative RNA-seq database FATTLAS
US20110104705A1 (en) Musclin receptor and use thereof
WO2004038026A2 (en) Calcineurin-like human phosphoesterase
JP4374454B2 (ja) タンパク質の生産に用いることが可能なｆ９胚性腫瘍細胞、およびその利用
US7700361B2 (en) Secretory or membrane protein expressed in skeletal muscles
JP2017163984A (ja) 苦味評価のための融合タンパク質および苦味評価方法
Hajaj et al. Alternative splicing of SLAMF6 in human T cells creates a co-stimulatory isoform that counteracts the inhibitory effect of the full-length receptor
Devireddy et al. Surf4 Promotes Endoplasmic Reticulum Exit of the Lysosomal Prosaposin-Progranulin Complex
Srivastava et al. Adgrg6/Gpr126 is required for myocardial Notch activity and N-cadherin localization to attain trabecular identity
Potluri et al. High throughput gene complementation screening permits identification of a mammalian mitochondrial protein synthesis (ρ−) mutant
Herndon et al. Neuregulin‐1 induces acetylcholine receptor transcription in the absence of GABPα phosphorylation
Holsey Density-Dependent Mu Opioid Receptor Function Revealed by Single-Molecule Microscopy
KR101099650B1 (ko) 인테그린알파５를 이용한 항암제 또는 ｓｉｐ１／ｚｅｂ２ 저해제의 스크리닝 방법
Gao Characterization of p120-catenin, a novel RSK substrate in the Ras/MAPK signalling pathway

Legal Events

Date Code Title Description
TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20161205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20161221

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20161222

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20161227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20161221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20161222

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6093946

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250