JP2001512664A - Ｇタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびその密接に関連するペプチドのＰＴＨｒＰは、同じレセプターのＰＴＨＲを共有する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、ＰＴＨＲを正常に発現しないブタ腎臓上皮細胞である。本発明は、ヒトＰＴＨＲを発現する安定にトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞を提供する。目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するための方法も、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （合衆国支援の研究開発のもとで行われた発明の権利についての陳述） 本発明の開発中に行われた研究の一部は、米国政府資金を利用した。米国政府
は、本発明に一定の権利を有する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、Ｇタンパク質結合レセプターに関する。より詳細には、Ｇｓおよび
Ｇｑタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスク
リーニングアッセイが提供される。安定にトランスフェクトされた細胞株も提供
される。

【０００３】 （関連技術） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨代謝回転の主要な全身性レギュレーターで
あり、そして成人および胎児組織で広く発現される密接に関連するペプチド、Ｐ
ＴＨｒＰは、特に発育中の軟骨および骨において重要なパラクリン作用を及ぼす
と考えられる（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ
１４：６９０−７０９（１９９３）；Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７３：６６３−６６６（１９９６）；Ｌｅｅ，Ｋ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３７：５１０９−５１１８（１９９６）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，
Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４））。
外因性の投与されたＰＴＨは、インビボで骨量における著しい効果を及ぼし、そ
の性質は、ＰＴＨの用量および循環ペプチドの濃度の得られる一時的プロファイ
ルに非常に依存する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒ
ｅｖ １４：６９０−７０９（１９９３））。したがって、高いＰＴＨ濃度への
連続的曝露は、正味の骨吸収および骨減少症を導くが、低用量の間欠的投与は、
正味の骨形成の増加を導く−これは、骨量を増加させるためおよび骨粗鬆症を含
む代謝的骨疾患を予防または処置するためのアナボリック薬剤としての、ＰＴＨ
またはＰＴＨアナログの潜在的使用において大いに興味をたきつける所見である
（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ １４：６９０
−７０９（１９９３）、Ｗｈｉｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ
．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １６：３８２−３８６（１９
９５））。

【０００４】 ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方とも、単一のレセプター、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ
レセプター（ＰＴＨＲ）を活性化し得、これは、ラット、フクロネズミ、マウス
、ブタ、およびヒトを含むいくつかの種からクローニングされており、そして骨
の細胞で発現されることが示されている（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：２７３２−２７３６（
１９９２）；Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１
０２６（１９９１）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ ２４６：１４９−１５５（１９９３）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．
ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（１９９３）；
Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１７１３−１７１
６（１９９４））。骨芽細胞におけるＰＴＨＲの活性化は、アデニリルシクラー
ゼ（ＡＣ）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、および細胞質ゾルの遊離カルシウム
トランジエントの活性化を含む、複数の平行シグナル伝達事象を引き起こす（Ａ
ｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｕｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８９：２７３２−２７３６（１９９２）、Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１０２６（１９９１）、Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓ
ｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（
１９９３）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら
，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｙ
ａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：７７１１−
７７１８（１９８７））。これらの個々のシグナル伝達事象のそれぞれと、全体
の骨量の変化のようなＰＴＨに対する最終的に統合した組織応答との間の連結は
、非常に不確定のままである。ＡＣを選択的に活性化するようであるＰＴＨアナ
ログが、インビボでの間欠的投与後に骨に対する完全なアナボリック効果（ａｎ
ａｂｏｌｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を生じ得ることが報告されている（Ｒｉｘｏｎ，
Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１
９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｗｈ
ｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ５８：８
１−８７（１９９６））。このような観察は、個々のＰＴＨ第２メッセンジャー
が、特定の組織応答に実際に連結され得、したがってＰＴＨＲシグナル伝達事象
のパターン、ならびにその強度が、骨における応答の定性および定量局面の両方
を示し得ることを示唆している。この結果は、骨において、成熟破骨細胞がＰＴ
ＨＲを発現しないと考えられ、したがって、これらのレセプターを発現する骨芽
細胞または骨髄間質細胞のような隣接細胞によって生成される応答によって、間
接的にのみＰＴＨのこれらの影響を経験しなければならないという事実によって
悪化する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ １４
：６９０−７０９（１９９３）、ＭｃＳｈｅｅｈｙ，Ｐ．およびＣｈａｍｂｅｒ
ｓ，Ｔ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１８：８２４−８２８（１９８６）
）。このような骨芽または間質ＰＴＨ標的細胞が、破骨細胞系統の近隣細胞に、
一時的に微細な差を反映する複雑な情報およびＰＴＨ曝露の濃度プロファイルを
伝達し得る方法は、不明瞭なままである。

【０００５】 ＰＴＨＲの著しい脱感作およびダウンレギュレーションは、高濃度のリガンド
への曝露後に記載されており（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，
Ａ−Ｂら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：２５４７−２５５４（１９９
１）；Ｍｉｔｏｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １２６：２６５０−２６６０（１９９０）；Ｆｕｋｕｙａｍａ
，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：１７５７−１７６９（１９９
２））、そして最近、ラットＰＴＨＲによって生成されるシグナル伝達事象のパ
ターンが、細胞表面におけるその発現のレベルによって強く影響されることが報
告された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−
３８９１（１９９５））。詳細には、ＰＬＣ応答の程度が、最大ＡＣ応答に影響
を及ぼさない発現の範囲（細胞当たり４０，０００〜３００，０００レセプター
）にわたる安定にトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞の表面上の利用可能
なＰＴＨＲの密度に直接的に関連することが見いだされている（Ｇｕｏ，Ｊ．ら
，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。

【０００６】 ヒトＰＴＨＲは、培養した細胞でこれまでに発現されているが（Ｐｉｎｅｓ，
Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１７１３−１７１６（１９９４
）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３５１：２８１−２８
５（１９９４）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９（１９
９６））、そのシグナル伝達特性は、まだ十分に解明されていない。特に、シグ
ナル伝達応答の特徴に対するヒトＰＴＨＲ発現の変化の効果は、組織的に分析さ
れていない。ＰＴＨ（３−３４）、ＰＴＨ（７−３４）、およびＰＴＨ（１−３
１）のような特定のアミノまたはカルボキシル末端短縮型ＰＴＨアナログは、通
常のＰＴＨＲ第２メッセンジャーのサブセットのみの選択的活性化を示すことが
これまでに見いだされている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ
ｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ
．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ
１６：３８２−３８６（１９９５）、Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：３０８２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａ
ｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：２５８８−２５９
４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：
１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら
，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｅｆｉｅｓｔ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７１：１１０
５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ
，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）
）。ｈＰＴＨ（１−３１）アナログは、ＰＫＣではなくＡＣを活性化し、さらに
卵巣摘出したラットにおいて著しいアナボリック効果を保持することが報告され
た（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７
９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍ
ｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：９４３−９４９（１９９４））。ヒトＰＴＨＲによるこ
のような選択的シグナル伝達の確認は、臨床使用のためのこれらのシグナル特異
的ＰＴＨペプチドの開発のための重要な追加の理論を提供する。したがって、Ｐ
ＴＨＲによって媒介される応答の特徴づけについて、当該技術分野で必要性があ
る。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明者らは、安定にトランスフェクトしたヒトＰＴＨＲの広い範囲を集合的
に発現する十分に特徴づけられた腎臓上皮ＬＬＣ−ＰＫ１細胞株の多くのサブク
ローンを単離しそして特徴づけた。ラットＰＴＨＲについて、ヒトレセプターが
、ＰＬＣ活性化について必要とされるよりもかなり低いレセプター発現のレベル
でＡＣを最大に活性化することを見いだした。さらに、これらの細胞におけるＰ
ＬＣ活性化の一時的パターンおよび程度は、最大ＡＣ活性化を誘起することを越
える発現の範囲にわたる細胞表面ヒトＰＴＨＲの密度に強く依存的である。驚く
べきことに、ｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）が、ヒトＰＴＨ
ＲによってＰＬＣおよび細胞質ゾルの遊離カルシウムトランジエントを等価に活
性化し、そしてさらにｈＰＴＨ（１−３１）が、ｃＡＭＰ非依存的シグナル伝達
経路に依存するこれらの細胞におけるＰＴＨに対する他のより遅延した生物学的
応答を完全に誘導することも見いだした。これらの所見は、骨または腎臓のよう
な組織における統合された細胞応答を形作ることにおけるＰＴＨＲ調節および示
差シグナル伝達の潜在的な生理学的役割を指摘し、そしてこれらは、ヒトＰＴＨ
Ｒのリガンド選択性が、ＰＴＨＲの他の種のリガンド選択性とは異なり得ること
を示す。

【０００８】 本発明者らはまた、これらの細胞においてヒトＰＴＨＲによってＡＣまたはＰ
ＬＣのいずれかの活性化に対して応答する便利および感度のある分光光度的バイ
オアッセイを開発し、そしてラット細胞においてシグナル感受性アゴニストであ
ることが既に見いだされているＰＴＨ（３−３４）およびＰＴＨ（１−３１）の
ようなアナログが、ヒトＰＴＨＲによる生物学的活性の異なるスペクトルを示し
得ることを示すために、他の測定とともに、これを用いている。

【０００９】 したがって、本発明は、ＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を含む安定に
トランスフェクトされた細胞株を提供する。

【００１０】 本発明はまた、目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターの
アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するための方法を提供し
、上記方法は （ａ）ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現
する細胞株を提供する工程； （ｂ）ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配
列を含む発現ベクターを提供する工程であって、このレセプターが、工程（ａ）
のこの細胞株で正常に発現されない、工程； （ｃ）この細胞株にこの発現ベクターを導入し、それによって安定にトランス
フェクトした細胞を提供する工程； （ｄ）この安定にトランスフェクトした細胞をこの目的の化合物と接触させる
工程；および （ｅ）工程（ｄ）のこの細胞の細胞培養上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、
を包含する。

【００１１】 本発明は、さらに、上記の方法においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を使用して、目的
の化合物がＧｓまたはＧｑカップリングレセプターのアゴニストまたはアンタゴ
ニストであるかどうかを決定する方法を包含する。本発明は、さらに、上記の方
法を使用して、目的の化合物がヒトＰＴＨＲのアゴニストまたはアンタゴニスト
であるかどうかを決定する方法を提供する。

【００１２】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明者らは、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞株を開発した。安
定にトランスフェクトしたヒトＰＴＨＲの発現の広い範囲に集合的に及ぶクロー
ンＬＬＣ−ＰＫ１細胞株の本研究は、ホルモンに対する細胞応答の特徴ならびに
程度を調節することにおけるヒトレセプター発現の調節について重要な役割を示
す、ｈＰＴＨシグナル伝達と生物学的活性とのレセプター密度依存的な差を証明
した。

【００１３】 本発明の１つの実施態様では、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を
含む安定にトランスフェクトした細胞株が提供される。細胞株は、培養物中で不
確定に生存し得る同じ型の細胞の集団である。「安定にトランスフェクトした細
胞株」とは、細胞株が、正常に発現しないポリペプチドを発現するためのいくつ
かの方法で変化されていることを意味する。「発現する」とは、構造遺伝子が、
ｍＲＮＡに転写され、そしてこのようなｍＲＮＡがポリペプチドを産生するよう
に翻訳されることを意味する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、カルシトニンおよびバゾ
プレシンレセプターを発現するが、正常にはＰＴＨＲを発現しない、ブタ腎臓上
皮細胞であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＣＬ−１０１から入手可能である。ヒトＰＴＨＲは、ヒトＰＴＨおよびヒト
ＰＴＨｒＰの両方に結合するレセプターである。ヒトＰＴＨＲは、既にクローニ
ングされている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
２４６：１４９−１５５（１９９３）；Ａｄａｍｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：
１０５５３−１０５５９（１９９５））。したがって、ヒトＰＴＨＲを発現する
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、「安定にトランスフェクトされた」といわれる。

【００１４】 ｕ−ＰＡが、カルシトニンによるＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方の活性化に対
する応答においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞によって分泌されることが、既に示されて
いる（Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．およびＨｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ．，ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ ２０５：１２７−１３１（１９８６））。本発明者らは、ＬＬＣ−ＰＫ１
細胞において、ＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方とも、ｕ−ＰＡ産生に連結するこ
とを再確認した。本発明者らは、これらの細胞におけるｕ−ＰＡ産生、およびこ
のようなＰＫＡまたはＰＫＣ活性化を測定する分光光学的バイオアッセイを開発
した。ＧｓおよびＧｑタンパク質は、ＰＫＣ経路を活性化し、それによってＬＬ
Ｃ−ＰＫ１細胞におけるｕ−ＰＡ産生を増加させる。ＧｓまたはＧｑタンパク質
結合レセプターのアゴニストは、ｕ−ＰＡを発現する細胞におけるｕ−ＰＡ産生
を増加させる。ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアンタゴニストは、
ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターアゴニストの活性を阻害し、それによ
って単独で投与されたアゴニストに対してｕ−ＰＡを発現する細胞においてｕ−
ＰＡ産生を減少させる。

【００１５】 ＬＬＣ−ＰＫ１以外の細胞株は、ｕ−ＰＡを発現する。これらの細胞株は、化
合物が、本発明の方法を使用してＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのア
ゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために使用され得る。
ｕ−ＰＡを発現する細胞株の例には、ＨＥ−ＬＵ（Ｒｉｆｋｉｎ）（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＣＲＬ−７７１７）；ＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−７）；
ＮＭＵ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７４３）；ＬＬＣ−ＲＫ１（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＣＣＬ−１０６）；およびＭＩＡ ＰａＣａ−２（ＣＲＬ−１４２０）が挙
げられるが、これらに限定されない。

【００１６】 したがって、本発明のさらなる実施態様は、目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑ
タンパク質カップリングレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるか
どうかを決定する方法を包含し、（ａ）ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアク
チベーター（ｕ−ＰＡ）を発現する細胞株を提供する工程；（ｂ）ＧｓまたはＧ
ｑタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター
を提供する工程であって、このレセプターが、工程（ａ）のこの細胞株で正常に
発現されない、工程；（ｃ）この細胞株に該発現ベクターを導入し、それによっ
て安定にトランスフェクトした細胞を提供する工程；（ｄ）この安定にトランス
フェクトした細胞をこの目的の化合物と接触させる工程；および（ｅ）工程（ｄ
）のこの細胞の細胞培養上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、を包含する。本発
明の好ましい実施態様は、上記の方法を使用して、目的の化合物が、Ｇｓタンパ
ク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定す
る方法である。本発明の他の好ましい実施態様は、上記の方法を使用して、目的
の化合物が、Ｇｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト
であるかどうかを決定する方法である。本発明の特に好ましい実施態様は、上記
の方法においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を使用して、目的の化合物が、ＧｓまたはＧ
ｑタンパク質結合レセプターアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを
決定する方法である。本発明の他の特に好ましい実施態様は、上記の方法を使用
して、目的の化合物が、ヒトＰＴＨＲのアゴニストまたはアンタゴニストである
かどうかを決定する方法である。

【００１７】 「目的の化合物」は、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント
、有機天然分子、または合成分子であり得る。ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レ
セプターのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の例は、ホルモン
、ホルモンアナログ、および抗体である。

【００１８】 「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニスト」は、ＧｓまたはＧ
ｑタンパク質結合レセプターと相互作用しそしてＧｓまたはＧｑタンパク質結合
レセプターを活性化する化合物である。「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプ
ターのアンタゴニスト」は、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニ
スト誘導した活性化を阻害する化合物である。

【００１９】 「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプター」は、適切なリガンドに結合した
場合、ＧｓまたはＧｑタンパク質を活性化するレセプターである。いくつかのレ
セプターは、ＧｓおよびＧｑタンパク質の両方を活性化し得るが、いくつかは、
ＧｓまたはＧｑタンパク質のいずれかのみを活性化する。好ましくは、本発明で
使用されるＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターは、本発明の方法で使用さ
れる細胞のＧｓまたはＧｑタンパク質を活性化し得るべきである。Ｇｓタンパク
質結合レセプターの例には、β−アドレナリン作用性、グルカゴン、ＡＤＨ、Ｆ
ＳＨ、ＬＨ、およびＶＩＰレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｇｑタンパク質結合レセプターの例には、ＴＲＨ、トロンビン、およびＰＧＦ₂ αレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。ＧｓおよびＧｑタンパク
質の両方を活性化するレセプターの１つの例は、カルシトニンレセプターである
。

【００２０】 本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現ベクターが適切な宿主
細胞に安定にトランスフェクトされる場合、構造遺伝子が発現され得るように、
発現制御配列に作動可能に連結された構造遺伝子を含むベクターである。２つの
ＤＮＡ配列は、２つの核酸分子間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の
導入を生じないか、（２）プロモーター領域配列が所望の配列の転写を指示する
能力を妨害しないか、または（３）所望の配列がプロモーター領域配列によって
転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に連結される」という。したが
って、プロモーター領域は、プロモーターが、核酸配列の転写をもたらし得た場
合、所望の核酸配列に作動可能に連結される。好ましいプロモーターには、マウ
スメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ
．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））、ＨＳＶチミジンキナ
ーゼプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５（
１９８２））、またはＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））が挙げられる。

【００２１】 細胞におけるＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターの発現は、発現ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することによって増加し得る。エンハンサーは、プ
ロモーターの転写活性を増加させるように作用する、一般に約１０〜３００ｂｐ
のサイズの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーの代表的例には
、ｂｐ１００〜２７０に複製起点の後期部位に位置するＳＶ４０エンハンサー；
サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー；複製起点の後期部位にお
けるポリオーマエンハンサー；およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる
が、これらに限定されない。

【００２２】 発現ベクターは、核酸配列の誘導性発現を提供し得る。このようなベクターの
中で好ましいものは、温度および栄養添加物のような、操作することが容易にな
る環境因子によって誘導可能である発現について提供するベクターである。

【００２３】 発現ベクターはまた、安定にトランスフェクトした細胞における増殖について
の選択マーカーを含み得る。選択マーカーの代表的例には、ジヒドロ葉酸レダク
ターゼ、ハイグロマイシンまたはネオマイシン耐性が挙げられる。

【００２４】 発現ベクターは、市販で提供され得るか、または当該技術分野で周知のクロー
ニングの任意の方法によって構築され得る。好ましい発現ベクターには、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐ
ＸＴ１、およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｓＶＫ３、ｐＢＰ
Ｖ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な
ｐｃＤＮＡＩｎｅｏが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なベクタ
ーは、当業者に容易に明らかである。

【００２５】 発現ベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクショ
ン（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換を
含む、任意の適切な方法によって、宿主細胞に導入され得る。このような方法は
、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような、多くの標準的実験室マニュアルに記載され
る。

【００２６】 「細胞株で正常に発現しない」とは、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプタ
ーが、本発明の方法で使用される細胞株において検出可能レベルで発現されない
ことを意味する。

【００２７】 「安定にトランスフェクトした細胞を目的の化合物と接触させる」とは、目的
の化合物が、任意の適切な方法によって安定にトランスフェクトした細胞に投与
されることを意味する。これは、化合物をインビトロまたはインビボで外因的に
投与する工程、またはさらに化合物を発現させるために細胞をトランスフェクト
する工程を包含し得る。化合物を外因的に投与する場合、キャリアが使用され得
る。キャリアは、細胞生存性と適合性であるべきである。キャリアの例には、Ｄ
ＭＳＯ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＨ、水、Ｔｒｉｓ、およびＨＥＰＥＳが挙げられるが
、これらに限定されない。

【００２８】 目的の化合物は、高度に精製されるか、部分精製されるか、または未精製であ
り得る。目的の化合物は、単独または組み合わせて安定にトランスフェクトした
細胞に投与され得る。組み合わせて化合物を投与することによって、Ｇｓまたは
Ｇｑタンパク質結合レセプターにおける相乗効果が決定され得る。

【００２９】 「ｕ−ＰＡ活性を測定すること」とは、直接的（すなわち、絶対ｕ−ＰＡ活性
を決定または評価することによって）または相対的（すなわち、目的の化合物と
接触していないコントロールの安定にトランスフェクトした細胞株に対して、目
的の化合物と接触している安定にトランスフェクトした細胞株のｕ−ＰＡ活性を
比較することによって）のいずれかで、ｕ−ＰＡ活性のレベルを定性的または定
量的に測定または評価することを意図する。好ましくは、目的の化合物と接触し
ている安定にトランスフェクトした細胞株におけるｕ−ＰＡ活性は、目的の化合
物と接触されていない安定にトランスフェクトした細胞株または目的の同じ化合
物と接触されているトランスフェクトしていない細胞株のいずれか、あるいは両
方のｕ−ＰＡ活性に対して比較される。

【００３０】 ｕ−ＰＡ活性を測定する１つの好ましい方法を、以下の実施例３に記載する。
簡単にいえば、安定にトランスフェクトした細胞からの上清のアリコートを、ク
リーンなマイクロプレートに移す。「上清」は、細胞から取り出された液体培地
である。ｕ−ＰＡ活性をアッセイするための緩衝液を添加する。マイクロプレー
トを適切な量の時間インキュベートし、そして反応を、終結緩衝液で停止する。
比色産物の吸光度を測定する。

【００３１】 好ましくは、目的の化合物がアゴニストであるかどうかを決定する場合、化合
物を、安定にトランスフェクトした細胞に投与し、そしてｕ−ＰＡ活性のレベル
を測定または評価し、そして目的の化合物と接触していない安定にトランスフェ
クトした細胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルと比較する。

【００３２】 目的の化合物がアンタゴニストであるかどうかを決定する場合、目的の化合物
と公知のアゴニストの両方が、安定にトランスフェクトした細胞に投与されるべ
きである。アゴニストおよび潜在的アンタゴニストは、任意の順で（すなわち、
最初にアゴニスト、次いで潜在的アンタゴニストを、または最初に潜在的アンタ
ゴニスト、次いでアゴニストを）、ならびに同時に投与され得る。細胞をアゴニ
ストおよび目的の化合物の両方と接触させた後、安定にトランスフェクトした細
胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルを測定または評価し、そしてアゴニスト単独と
接触している安定にトランスフェクトした細胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルに
対して比較する。

【００３３】 本発明の一般的に記載したので、本発明が以下の実施例を参照してより容易に
理解される。実施例は、例示のみによって提供され、そして本発明の限定を意図
するものではない。

【００３４】

【実施例】

（実施例１）プラスミドトランスフェクションおよびクローンの単離 クローン化されたブタ腎臓由来細胞株、ＬＬＣ−ＰＫ１（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓ
ｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（
１９９３））およびヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターｃＤＮＡでの安定なトラ
ンスフェクション後に単離されたサブクローンを、空気中５％ＣＯ₂下で、１０ ００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むまたは含まない７％ＦＢＳおよび１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（すべてＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒ
ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから）中で維持した。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセ
プターを安定に発現する細胞株を調製するために、細胞のコンフルエント単層を
、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）中に構築した全長ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮ
Ａでトランスフェクトした（Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
８：９８−１００（１９９５））。いくつかの場合には、細胞を、レセプターｃ
ＤＮＡおよび優勢ネガティブＰＫＡ調節サブユニット変異体「ＲＥＶ ＡＢ」を
コードするプラスミドで同時トランスフェクトした（Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ．ら，
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７））。ト
ランスフェクションを、既述のようにリン酸カルシウム沈降技法を使用して行っ
た（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２
：２０９０−２０９８（１９９３））。

【００３５】 １１のクローン細胞株を、広範囲のレセプター発現を提供するために１００以
上の独立したサブクローンの合計の中から選択した（表１）。

【００３６】 表１。クローンＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタ
ー発現およびシグナル伝達 ｈＰＴＨＲ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞のサ
ブクローンを、競合放射性リガンド（スキャッチャード）結合分析によって、お
よびｈＰＴＨ（１−３４）（１０００ｎＭ）に対する最大シグナル伝達応答（基
準の倍数またはパーセントの平均±ＳＤ）について分析した。すべての値を、３
つ組で行った少なくとも２または３実験から得た。コントロールにおけるサイク
リックＡＭＰ蓄積およびＩＰ₃形成は、それぞれ３〜１０ｐｍｏｌ／ウェルおよ び１，０００〜１，５００ｃｐｍ／ウェルの範囲であった。

【００３７】

【表１】

【００３８】 （実施例２）放射性リガンド ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターに対する特異的結合を、いくつかの改変ととも
に既述（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １
３２：２０９０−２０９８（１９９３））のように測定した。簡単にいえば、細
胞を、２．５×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、そし て研究前にさらに２日間培養した。細胞層を、氷冷緩衝液Ａ［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．７）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ ＦＢＳ、および５％熱非働化ウマ血清］でリンスし、
次いで０．５ｍｌの緩衝液Ａ中、非標識ペプチドを含むまたは含まない、¹²⁵Ｉ 標識した［Ｎｌｅ^8,18，Ｔｙｒ³⁴］ウシ（ｂ）ＰＴＨ（１−３４）（１×１０⁵ ｃｐｍ／ウェル）と、冷室温（２〜８℃）で６時間インキュベートした。結合反
応を、インキュベーション混合物を吸引することによって終結し、その後、細胞
を０．５ｍｌの氷冷緩衝液Ａで２回洗浄した。０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．５
Ｎ ＮａＯＨ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で細胞を可溶化した後、
放射活性およびタンパク質の測定を、既述のように、スキャッチャード分析によ
って細胞当たりのレセプター数を算出して行った（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．
Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（１９９３
））。他に記載がなければ、すべての試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）から得、そしてすべての同位体をＤｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。［Ｎｌｅ^8,18，Ｔｙｒ ³⁴ ］ｂＰＴＨ（１−３４）を、クロラミンＴ方法によって放射性ヨウ素化（ｒａ
ｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅ）し、そして既述のように精製した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒ
ｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８
（１９９３））。

【００３９】 それぞれ細胞当たり９５０，０００および２８０，０００ｈＰＴＨＲを発現す
る２つの代表的細胞株ＨＫＲＫ Ｂ７およびＨＫＲＫ Ｂ２８についての放射性
リガンド競合アッセイおよびスキャッチャード分析を、図１に示す。選択された
細胞株のすべてのスキャッチャード分析は、１〜７ｎＭの見かけのＫ_dを有する 、細胞当たり９０，０００〜１，０００，０００部位からのＰＴＨＲ発現の範囲
を示した（表１）。それぞれの場合、スキャッチャード分析は、高親和性結合部
位の単一のクラスに一致して直線であった。以下の記載のその後の実施例を、２
つの細胞株で行い、これを、それぞれ高（ＨＫＲＫ Ｂ７）および低（ＨＫＲＫ
Ｂ２８）密度のｈＰＴＨＲを発現するものの代表として選択した。

【００４０】 （実施例３）ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲシグナル伝達 （方法） （ペプチドおよび他の試薬） 他に指示がなければ、すべての試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）から得、そしてすべての同位体をＤｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。［Ｎｌｅ^8,18，Ｔｙｒ³⁴］
ｂＰＴＨ（１−３４）、［Ｔｙｒ³⁴］ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３
１）、ｈＰＴＨ（３−３４）、ｈＰＴＨ（７−３４）、およびｈＰＴＨｒｐ（１
−３６）を、カルボキシ末端アミド基で合成した。［Ｎｌｅ^8,18，Ｔｙｒ³⁴］ｂ
ＰＴＨ（１−３４）を、クロラミンＴ方法によって放射性ヨウ素化し、そして既
述のように精製した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。

【００４１】 （細胞性ｃＡＭＰ蓄積） 細胞を、２．５×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、 そして研究の前にさらに２日間培養した。細胞を、１ｍＭイソブチルメチルキサ
ンチン（ＩＢＭＸ）を補充した０．５ｍｌの氷冷緩衝液Ｂ［１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ ７．４）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．２ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、５ｍＭグルコース、
および０．１％熱非働化ＢＳＡ］で１回リンスし、氷上においた。処理を、ＩＢ
ＭＸを補充した緩衝液Ｂの０．２５ｍｌ中で各ウェルに添加し、その後プレート
を３７℃にて１５分間インキュベートした。次いで、緩衝液を迅速に吸引し、プ
レートを液体窒素上に迅速に移し、そしてその後凍結した単層を０．５ｍｌの５
０ｍＭ ＨＣｌ中に直接的に融解した。次いで、抽出したｃＡＭＰを、市販のＲ
ＩＡキット（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓ
ｔｏｎ，ＭＡ）を使用して測定した。結果を、基準の倍数として表し、ここでベ
ースのレベルは、３８〜１２８ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質／１５分の範囲であっ
た。天然のままのＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄積のベースのレベルは
、野生型ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターを発現するサブクローンにおいて一貫し
て変化しなかった。

【００４２】 （イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ₃）産生） 細胞を、２．５×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、 そして研究前にさらに２日間培養した。細胞を、アッセイ培地（０．１％ＢＳＡ
を補充した無血清およびイノシトールを含まないＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で３ｕＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ｍｙｏ−イ ノシトールでアッセイ前に１６時間３７℃にて標識した。３０ｍＭ ＬｉＣｌを
含む予め温めたアッセイ培地で細胞を洗浄した後、３０ｍＭ ＬｉＣｌおよび刺
激剤（またはビヒクル）を含む０．２５ｍｌのアッセイ培地とともに３７℃にて
種々の間隔（１〜３０分）でインキュベートした。ＩＰ₃形成を、吸引および０ ．５ｍｌの氷冷５％ＴＣＡの直接添加によって停止した。次いで、酸抽出物を、
２容量の水飽和したエーテルで２回抽出し、そして既述のように（Ｇｕｏ，Ｊ．
ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５））
、ＡＧ １Ｘ８陰イオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ
）でのクロマトグラフィーの前に濃縮ＮａＯＨおよびＴｒｉｓ塩（最終濃度＝１
０ｍＭ）でｐＨ ７．４に調整した。他の画分（遊離の［³Ｈ］ｍｙｏ−イノシ トール、グリセロホスフェートイノシトール、ＩＰ₁、およびＩＰ₂）を溶出した
後に、ＩＰ₃画分を収集し、そして放射活性のその含量を、液体シンチレーショ ン分光測定法（Ｂｅｃｋｍａｎ，モデルＬＳ ６０００ＩＣ）によって決定した
。

【００４３】 （細胞質ゾルの遊離カルシウムの測定） 細胞質ゾルの遊離カルシウムを、Ｃａ²⁺感受性細胞内プローブｆｕｒａ−２を
加えた細胞における二重蛍光によって測定した。細胞を、４０，０００〜６００
，０００／ｃｍ²の密度でガラスカバースリップ上に播種し、そして上記のよう に２日間インキュベートした。カバースリップを、室温（２２℃）にて３０分間
４ｕＭのｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎ
ｅ，ＯＲ）を含むリン酸を含まない緩衝液Ｂ中に加える前にＰＢＳで２回洗浄し
た。ｆｕｒａ−２を含まない緩衝液Ｂで２回洗浄した後、カバースリップを、３
７℃にて２ｍｌのリン酸を含まない緩衝液Ｂを含むキュベットに載せ、そして３
４０および３８０ｎｍでの交互の励起に対する５１０ｎｍでの発光を、２ｎｍの
励起および発光バンド幅で比測定（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）ＰＴＩ Ｄｅｌｔ
ａｓｃａｎ蛍光スペクトロメーターを使用してモニターした。安定なベースライ
ンを得た後、アゴニストを、２ｍｌの新しい緩衝液への交換によって導入し、そ
れに１０〜２０ｕｌの濃縮したアゴニストストック（またはビヒクル単独）を添
加した。ペプチドストックを、０．１％トリフルオロ酢酸中で調製し、イオノマ
イシンおよびホルボールエステルを、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして他
の添加物を、水中で調製した。最大および最小蛍光シグナルを、それぞれカルシ
ウムの名目上の不在下で１ｕＭイオノマイシン＋２０ｍＭカルシウムまたは２ｍ
Ｍ ＥＧＴＡを含む改変した緩衝液への曝露によって得、そして自己蛍光をイオ
ノマイシン＋２．５ｍＭ ＭｎＣｌ₂の存在下で得たシグナルから見積もった。 次いで、細胞質ゾルの遊離カルシウムを、既述のように決定した（Ｂｒｉｎｇｈ
ｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０
９８（１９９３））。

【００４４】 （ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）） 細胞を、６×１０⁴細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、そし て翌日使用した。細胞を、０．２ｍｌで１回洗浄し、次いで０．０５％ＢＳＡを
含む０．１ｍｌの予め温めたＤＭＥＭを再供給した。各刺激剤を添加した後、プ
レートを、３７℃にて１６時間インキュベーター中に戻した。次いで、馴化培地
（５ｕｌ）を、各ウェルからクリーンなマイクロプレートへ移した。反応を、５
０ｕｌのｕ−ＰＡアッセイ緩衝液［９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８
）、０．４５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１４ｕｇ／ｍｌ ヒトプラスミノ
ーゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および０．４ｍ
ｇ／ｍｌ Ｓ−２２５１プラスミン基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ−Ｎｐ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］の添加によって開始した
。プレートを、最初は３７℃にて１５分間、次いで室温（２２℃）にて３０分間
インキュベートした。反応を、１０ｕｌの氷冷２５％酢酸の添加によって停止し
た。比色産物の吸光度を、１時間以内に４０５ｎｍで測定した。活性を、標準と
して精製したヒトウロキナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、Ｐｌｏｕ
ｇ単位／ウェルで表した。

【００４５】 （細胞リン酸取り込み） 細胞を、２．５×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、 そして研究前にさらに２日間培養した。アッセイの２４時間前、細胞に、０．１
％ＢＳＡを含む０．５ｍｌのＤＭＥＭに再供給した。翌日、細胞に、薬物または
ペプチドを含む無血清培地（ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ）を再供給し、そしてイ
ンキュベーションを、空気中５％ＣＯ₂下で３７℃にてさらに６時間続けた。次 いで、細胞を、ＢＳＡおよびＮａ₂ＨＰＯ₄を含まない予め温めた緩衝液Ｂで洗浄
し、次いで［³²Ｐ］オルトリン酸（４μＣｉ／ｍｌ）および０．１ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄を含む０．２５ｍｌの同じ緩衝液で３７℃にて５分間インキュベートし た。リン酸取り込みを、１ｍｌの氷冷ナトリウムを含まない「停止緩衝液」［１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１４０ｍＭ 塩化コリン、および５ｍＭ
ヒ酸ナトリウム］を添加することによって停止し、次いで同じ緩衝液でさらに２
回洗浄した。次いで、排出した細胞層を、０．５ｍｌの溶解緩衝液で可溶化し、
そして細胞関連放射活性を、既述のように、Ｃｅｒｅｎｋｏｖカウンティングに
よって決定した（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８
８４−３８９１（１９９５））。

【００４６】 （結果） ＬＬＣ−ＰＫ１細胞で安定に発現したヒトＰＴＨＲの特性の研究は、２つの重
要な観察をもたらした。第１は、ヒトＰＴＨＲの細胞表面密度が、リガンド濃度
に関係なく、ＰＴＨに対する個々のシグナル伝達応答の程度の重要な決定基であ
り、そしてこれらの変化が、全く異なる、本質的に重複しない、レセプター密度
の範囲にわたって生じるという所見である。これらの研究の過程において、ＰＬ
Ｃ応答の一時的プロファイルにおけるｈＰＴＨＲ密度依存的な差もまた観察し、
そしてこれらの細胞においてＰＴＨによって誘起された最初の細胞質ゾルカルシ
ウムシグナルを持続することにおけるＰＫＡの役割の証拠を検出した。第２の主
要な所見は、ＰＬＣ活性化能力が、ラットＰＴＨＲを発現する細胞において幾分
減少したとしても、推定シグナル選択的ＰＴＨアナログｈＰＴＨ（１−３１）が
、ヒトＰＴＨＲを有する細胞において必ずしもシグナル選択的ではないことであ
る。これらの結果は、ＰＴＨＲのヒトと他の種との間のリガンド−レセプター相
互作用における微細な差を指摘し、そしてラットモデルに由来する結果が、ヒト
ＰＴＨＲを発現する系へ注意して外挿すべきであることを示唆する。

【００４７】 （発現したｈＰＴＨＲのシグナル伝達特性における細胞表面密度の影響） 最大ＰＴＨ依存的ｃＡＭＰ蓄積を、ｈＰＴＨ（１−３４）の高濃度（１０００
ｎＭ）との１５分間のインキュベーション後、ヒトＰＴＨＲトランスフェクトし
たＬＬＣ−ＰＫ１サブクローンでアッセイした（表１）。ラットＰＴＨＲを安定
に発現したＬＬＣ−ＰＫ１細胞について既に報告されたように（Ｇｕｏ，Ｊ．ら
，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５））、
最大アデニリルシクラーゼ応答は、（ＰＬＣ活性化について必要とされる閾値に
対して−以下を参照のこと）比較的低い閾値以上のヒトＰＴＨＲの表面密度とは
比較的独立していた。しかし、ヒトＰＴＨＲの場合、最大ＡＣ活性化の飽和につ
いてのこの閾値は、１２０，０００と２８０，０００との間にあるようであり（
表１）、これは、ラットＰＴＨＲについてこれまでに観察されたものよりも少な
くとも６〜１０倍高い（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６
：３８８４−３８９１（１９９５））。予測のとおり、ｈＰＴＨＲを発現するＬ
ＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）によるＡＣの活性化は、濃度依
存的であり、そして図２Ａに示すように、ＥＣ５０（約１ｎＭ）および最大応答
は、細胞株ＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲＫ Ｂ７において同一であった。

【００４８】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラットＰＴＨＲの発現を含むこれまでの研究にお
いて、３０分で放出された総ＩＰ₃として測定される、ＰＴＨによる最大ＰＬＣ 活性化を、最大ＡＣ活性化の飽和に必要とされるレセプター密度の閾値を明らか
に超える広範囲の発現（すなわち、２０，０００〜４００，０００レセプター／
細胞）にわたるラットＰＴＨＲの密度に密接に関連することが見いだされた（Ｇ
ｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１
９９５））。同様に、図３および表１に示すように、最大ＰＬＣ活性化は、ヒト
ＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１サブクローン中のＰＴＨＲ密度に強く既存的
であった。ＡＣ活性化の場合のように、ヒトＰＴＨＲがこれらの細胞においてＰ
ＬＣ結合相対効率は、ラットレセプターよりも約３〜５倍低かった。−すなわち
、ラットレセプターよりもほぼ３〜５倍以上のヒトレセプターを、ＰＬＣの等価
活性化に必要とした。

【００４９】 ＰＴＨＲのより低い数を発現するいくつかのＰＴＨ応答性細胞株−すなわち、
ＵＭＲ １０６細胞（約７０，０００レセプター／細胞）において、非常に迅速
であるが一時的なＰＬＣ活性化のパターンが記載されている（Ｙａｍａｇｕｃｈ
ｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：７７１１−７７１８（１９
８７））。このような一時的パターンが４００，０００より少ないヒトＰＴＨＲ
を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞において持続したＰＬＣ活性化の不在の基準とな
り得るかどうかを決定しようとして、予備研究を行い、ＨＫＲＫ Ｃ５３、ＨＫ
ＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲＫ Ｃ１０１細胞（それぞれ、１２０，０００、２８
０，０００、および３３０，０００ＰＴＨＲ／細胞）においてより早い時間（４
分）に増加したＩＰ₃を示したが、ＨＫＲＫ Ｂ６４細胞（９０，０００部位／ 細胞）では示さなかった（データを示さず）。次いで、ＰＬＣ活性化の時間経過
を、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞においてより詳細に研究し、そしてＨＫＲＫ Ｂ７細
胞と比較した。図４Ａに示すように、一時的にＰＴＨ刺激したＩＰ₃形成を、Ｐ ＴＨ曝露の最初の数分以内にＨＫＲＫ Ｂ２８細胞で観察した。この応答は４分
でピークとなり、次いで１０分までに基準レベルまでの迅速な低下が起こった。
逆に、３００，０００ラットＰＴＨＲ／細胞を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞につ
いて既に報告されたように（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １
３６：３８８４−３８９１（１９９５））、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるＩＰ₃ 形成は、１０分と３０分との間増加し続けたが、より迅速な開始期もまた、これ
らの細胞で明らかであった。

【００５０】 ＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲＫ Ｂ７細胞で観察されたＰＴＨ誘導したＰＬ
Ｃ活性化の種々の一時的パターンは、より広範な脱感作を含むいくつかの可能性
を示唆し、これは、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるより弱いＰＬＣ応答、または
、より高いレセプター発現による、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるＩＰ₃形成のよ り弱くカップリングするが異なるメカニズムの可能性のある補充を、より迅速に
失わせ得る。これらを区別するための努力において、他の系において報告された
ように（Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ．ら，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：７２７
−７３３（１９９１））、濃度依存性が、それぞれＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫ
ＲＫ Ｂ７細胞における迅速（すなわち、４分）対持続性（すなわち、３０分）
ＰＬＣ応答について異なり得るかどうかを評価した。しかし、図４Ｂに示すよう
に、ＨＫＲＫ Ｂ２８において４分でおよびＨＫＲＫ Ｂ７において３０分での
最大応答の程度は非常に異なるが、２つの応答のＥＣ₅₀は、これらの細胞におい
てラットＰＴＨＲについて既に報告されたものと同一（約２０〜３０ｎＭ）およ
び類似であった（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８
８４−３８９１（１９９５））。さらに、表２に示すように、２つの応答のリガ
ンド特異性も類似であり、その点で、ｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨｒＰ
（１−３６）によるＰＬＣ活性化は、各細胞株内で等価であり、そしてｈＰＴＨ
（３−３４）もｈＰＴＨ（７−３４）もそれぞれの場合においてなんら一貫した
検出可能な活性を示さなかった。全体で、これらの結果は、ＨＫＲＫ Ｂ２８に
おける一時的ＰＬＣ応答とＨＫＲＫ Ｂ７における持続した応答との間のリガン
ド−レセプターカップリングまたは選択性の重要な差を示唆しなかった。

【００５１】 表２。ＨＫＲＫ Ｂ７およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるＰＴＨまたはＰＴ
ＨｒＰペプチドによるホスホリパーゼＣの活性化。

【００５２】 ［³Ｈ］ｍｙｏ−イノシトールで既に負荷をかけた、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞およ びＨＫＲＫ Ｂ２８細胞を、それぞれ３０分または４分間各ペプチド（１０００
ｎＭ）とともにインキュベートした。ＩＰ₃の形成を、ビヒクル処理コントロー ルにおいて測定した量のパーセントとして表す。示した値は、３つ組の決定の平
均±ＳＥＭである。

【００５３】

【表２】

【００５４】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲを介するＰＬＣ活性化の予測された
結果は、とりわけ細胞内貯蔵からの隔離されたカルシウムの放出である（Ｂｒｉ
ｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０
−２００９８（１９９３）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａ
ｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）、Ｙａｍａｇ
ｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：７７１１−７７１８
（１９８７）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９（１９９
６））。したがって、細胞質ゾルの遊離カルシウムを、ｈＰＴＨ（１−３４）へ
の曝露後のＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲＫ Ｂ７細胞において測定した。図５
に示すように、Ｆｕｒａ ２ＡＭ負荷をかけた細胞の単層へのｈＰＴＨ（１−３
４）（１００ｎＭ）の添加は、２０秒以内に４００〜６００ｎＭでピークになり
そしてその後ゆっくり減少する細胞質ゾルの遊離カルシウムの迅速な上昇を引き
起こした。この応答において、程度または時間経過の有意な差は、ＨＫＲＫ Ｂ
７細胞におけるより大きなＩＰ₃応答（図４Ａ）にもかかわらず、ＨＫＲＫ Ｂ ７とＨＫＲＫ Ｂ２８との間で観察されなかった（図５Ａおよび５Ｃを参照のこ
と）。

【００５５】 ｃＡＭＰ経路の活性化が、これらの細胞においてＰＴＨに対する細胞質ゾルの
遊離カルシウム応答の原因であり得る可能性を試験するために、ＡＢ４５細胞を
研究し、この細胞においてヒトＰＴＨＲ（３７０，０００／細胞）を、基準およ
びホルモン刺激したプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の両方の優勢なネガティブ
インヒビターであるＲＥＶ ＡＢとともに同時発現させた（Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ
．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７）
、Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：１８５１
−１８５８（１９９４））。図５Ｄに示すように、ｈＰＴＨ（１−３４）に対す
る強い細胞質ゾルカルシウム応答をまだ、これらのｃＡＭＰ耐性細胞において観
察し、そしてｈＰＴＨＲの類似の数を発現するｃＡＭＰ応答性ＨＫＲＫ Ｂ２８
細胞において観察されるものに匹敵する程度であった。したがって、これらの細
胞におけるｈＰＴＨの活性化によって引き起こされる細胞質ゾルの遊離カルシウ
ムにおける迅速な増加は、明らかに、ｃＡＭＰによって媒介されない。しかし、
興味深いことに、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるよりもｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細
胞においてより迅速に減少したカルシウム移動が、ほんの２〜３分以内に基準レ
ベルに近づくことを観察した（図５Ｄ）。これは、ＡＢ４５細胞におけるＩＰ₃ 形成の程度および一時的パターンが、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるものとほぼ
同一であるという事実にもかかわらず生じた（データを示さず）。８ＢｒｃＡＭ
Ｐ（１ｍＭ）も活性なホルボールエステルＴＰＡ（１００ｎＭ）も、迅速なカル
シウム応答を引き起こさなかった（示さず）。これらの結果は、最初の細胞質ゾ
ルの遊離カルシウム応答の程度がＰＬＣ活性化に最も密接に関連するが、応答の
期間が、おそらく細胞外カルシウム侵入の増強によるＰＫＡ経路の活性化によっ
て優勢に影響を及ぼし得ることを意味した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））。

【００５６】 （ＰＴＨによる生物学的応答の調節） ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲ発現の種々のレベルで観察されたシ
グナル伝達効率および選択性の変化が、ＰＴＨに対する完全な遠位の生物学的応
答の変化を生じ得るかどうかを決定するために、これらの細胞における２つの十
分に特徴づけられたホルモン応答（ｕ−ＰＡの分泌および無機リン酸のナトリウ
ム依存的能動輸送）を研究した。

【００５７】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞によるウロキナーゼ型のプラスミノゲン活性化因子（ｕ−
ＰＡ）の分泌は、カルシトニンによってＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方の活性化
に応じるものがすでに報告されている（Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．およびＨｅｍｍｉｕ
ｇｓ，Ｂ．Ａ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２０５：１２７−１３１（１９８６））
。このアッセイを、これらの細胞においてヒトＰＴＨＲによるＡＣまたはＰＬＣ
の活性化を報告する従来の分光光度バイオアッセイを提供するように適合した。
図６に示すように、ｈＰＴＨ（１−３４）との１６時間のインキュベーションは
、ＨＫＲＫ Ｂ７およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞の両方からのｕ−ＰＡ分泌におけ
る用量依存的増加を誘起した。８ＢｒｃＡＭＰおよびＴＰＡの両方の細胞株にお
いて、ＰＫＡおよびＰＫＣの薬理学的アクチベーターはまた、それぞれこの活性
を著しく誘導し、ＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方ともｕ−ＰＡ産生に連結するこ
とを確認した。ｈＰＴＨ（１−３４）に応じたＨＫＲＫ Ｂ７によるｕ−ＰＡの
最大産生は、絶対量で、およびカルシトニンまたは８ＢｒｃＡＭＰのような他の
アゴニストとの相対量での両方で、ＨＫＲＫ Ｂ２８におけるものよりも大きか
った（図６）。

【００５８】 これらの２つの細胞株におけるＰＴＨへのｃＡＭＰ応答の感度および程度が同
一であったので、ＨＫＲＫ Ｂ７対ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞で観察されるＰＴＨへ
のより大きい最大ｕ−ＰＡ応答が、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞においてのみ見られるＰ
ＬＣの持続活性化を反映し得る可能性があるようであった。さらに、ｈＰＴＨ（
１−３４）によるｕ−ＰＡ産生の刺激についてのＥＣ₅₀（１０〜２０ｎＭ）は、
特にＨＫＲＫ Ｂ７細胞において、ｃＡＭＰ蓄積（１ｎＭ）についてよりもＩＰ ₃ 形成の活性化（２０〜３０ｎＭ）についてより類似していた。また、ＰＴＨに 対する最大ｕ−ＰＡ応答は、これらの細胞におけるより豊富なｈＰＴＨＲによる
、さらなるＰＫＡ非依存的メカニズムの活性化に一致して、ＨＫＲＫ Ｂ７にお
ける（しかし、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞においてではない）８ＢｒｃＡＭＰの応答
よりも高かった。これらの細胞においてＰＴＨ誘導したｕ−ＰＡ分泌のｃＡＭＰ
非依存的（おそらくＰＫＣ依存的）メカニズムの関連についてのさらなる証拠を
、ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞を使用して得た（図７）。予測したとおり、８Ｂｒ
ｃＡＭＰに対するｕ−ＰＡ応答は、これらの細胞においてほぼなくなったが、ホ
ルボールエステルに対する応答は十分に維持した。カルシトニンと同様にＰＴＨ
応答は、劇的に減弱したが、８ＢｒｃＡＭＰの最大濃度で達成したよりも顕著に
大きく保持した。この結果は、これらの細胞においてＰＴＨ刺激したｕ−ＰＡ分
泌を媒介することにおけるＰＫＡとは独立したメカニズムの役割をさらに支持す
る。

【００５９】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラットＰＴＨＲの活性化後のナトリウム依存的リ
ン酸取り込みの刺激が、主としてＰＬＣ／ＰＫＣ経路によって媒介されることは
既に報告された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８
８４−３８９１（１９９５））。類似の検察は、ＣＨＯ細胞において他者によっ
て報告されている（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ １０４：２１−２７（１９９４））。したがって、ヒトＰＴＨＲを発
現するＨＫＲＫ Ｂ７およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるＰＴＨによるこの応
答の調節を試験した。図８に示すように、リン酸取り込みを、これらの細胞にお
いてｈＰＴＨ（１−３４）によって顕著に刺激した。ＰＴＨ（１−３４）のこの
ＰＫＣ依存的作用を、ＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲＫ Ｂ７細胞の両方におい
て観察し、これは、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞で観察した一時的ＰＬＣ応答が、この
より持続した生物学的応答を誘導するために十分であることを示唆した。この結
果は、リン酸取り込みも、ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞においてＰＴＨ（１−３４
）によって２倍以上刺激し（データを示さず）、ここで、上記のように、唯一の
測定可能なＰＴＨＲシグナルが、ＰＬＣの一時的刺激でありそして細胞質ゾルの
遊離カルシウムにおける増加が伴ったという観察によって、さらに支持された。

【００６０】 ＡＣおよびＰＬＣエフェクターのリガンド依存的活性化におけるＰＴＨＲ密度
の変化の効果は、インビトロで非相同モデル系を使用して得たが、重要な生理学
的関連を有し得たことを観察した。特に骨芽または骨髄間質細胞において、ＰＴ
ＨＲ活性化によって生成した細胞内第２メッセンジャーシグナルの特定のパター
ンおよび相対強度の差は、最終的に骨における大いに異なる効果を有し得る循環
するＰＴＨの種々の一時的パターンおよび濃度プロフィールについての破骨細胞
系情報の直近の標的細胞および近隣細胞の両方に伝達することに重要であり得る
（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ １４：６９０
−７０９（１９９３））。したがって、このような示差シグナル伝達の潜在的メ
カニズムへの洞察は、インビボで骨におけるＰＴＨのアナボリックおよびカタボ
リック効果にあるに違いない別個のメカニズムを理解するために重要であり得る
。ＰＴＨＲの「シグナル伝達表現型」におけるレセプター発現の影響はまた、発
育中の骨においてＰＴＨｒＰの高い局所濃度に対する軟骨細胞の応答を調節する
ことに重要であり得た（Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：６６
３−６６６（１９９６）、Ｌｅｅ，Ｋ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
７：５１０９−５１１８（１９９６））。

【００６１】 細胞外リガンド濃度の変化に単に基づく、このような示差シグナル伝達につい
ての１つのメカニズムは、ＰＴＨに対するＡＣおよびＰＬＣ応答のリガンド感度
（ＥＣ₅₀）の実質的な差が、ＰＴＨに対する未刺激（ｎａｉｖｅ）の細胞の最初
の曝露で観察されているこれまでの研究から明らかである（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
，Ｈ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２４６：１４９−１５５（１９９３
）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１７１３−１
７１６（１９９４）、Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：
３８８４−３８９１（１９９５）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８
１−３８９（１９９６）、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ １０４：２１−２７（１９９４））。本発明者らは、ｈＰＴＨ
Ｒを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＰＴＨに対するＡＣおよびＰＬＣ応答
の感度の同様に顕著な差を報告し−すなわち、ＡＣの活性について観察されたＥ
Ｃ₅₀は、ＰＬＣ刺激についてのものより１０〜１００倍低かった。

【００６２】 示差シグナル伝達のもう１つのメカニズムは、次のリガンドへの曝露前の異な
るＧタンパク質へのＰＴＨＲカップリングの不均一化脱感作に関連し得る。ＰＴ
ＨＲシグナル伝達の脱感作は、広く記載されており（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．お
よびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２６：２６５０
−２６６０（１９９０）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ １３５：２５８８−２５９４（１９９４）、Ｆｕｋａｙａｍａ，
Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：１８５１−１８５８（１９９４
）、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１２０
８−１２１７（１９８８）、Ｆｒｅｙａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｍ
Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６２：Ｅ８７−Ｅ９５（１９９２））、そしてこれら
の脱感作事象の一時的パターンおよび程度に関しての種々の伝達経路の中に認め
られる差も、各経路に沿ったその後のシグナル伝達の相対強度を調節し得た。

【００６３】 示差シグナル伝達を生じるための第３のメカニズムは、最大ＡＣおよびＰＬＣ
シグナルの相対程度が、細胞表面上で発現したラットＰＴＨＲの数に依存して、
顕著に異なるというこれまでの所見によって示唆された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５）））。した
がって、任意の所定の細胞外リガンド濃度について、細胞表面ｒＰＴＨＲの数の
変動は、所定の細胞内シグナルの程度のみならず、他のシグナルに対するその強
度にも影響を及ぼし、それによってリガンド濃度の変化とは独立して細胞内シグ
ナル伝達のパターンを変更した。本研究は、ＡＣ対ＰＬＣシグナル伝達効率にお
けるレセプター発現のこの示差影響が、ヒトＰＴＨＲにさらに適用し得、そして
個々の応答のＥＣ₅₀においてなんら変化なく生じ得ることを示す。類似の結果は
、ヒトＰＴＨＲの異なる数を発現するＨＥＫ−２９３ヒト腎臓細胞におけるＡＣ
および細胞質ゾルの遊離カルシウムシグナル伝達の比較について、最近報告され
た（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９（１９９６））。Ｇ
タンパク質および／またはエフェクターカップリングの効率の変化からのリガン
ド感度の変化のこの解離は、アゴニスト認識および活性化に関連するＰＴＨＲの
構造決定基が、Ｇタンパク質／エフェクター相互作用に関連するものとは比較的
独立して操作し得ることを示唆する。これらの観察の生理学的関連は、骨の細胞
であるいはインビトロまたはインビボでの繰り返したＰＴＨ曝露中に生じること
が公知のＰＴＨＲの発現の実質的変化によって支持される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，
Ｊ．およびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２６：２
６５０−２６６０（１９９０）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：２５８８−２５９４（１９９４）、Ｆｕｋａｙａ
ｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：１８５１−１８５８（１
９９４）、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：
１２０８−１２１７（１９８８）；Ｆｒｅｙａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｍ．ら
，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６２：Ｅ８７−Ｅ９５（１９９２）；Ｆｏｒｔ
ｅ，Ｌ．ら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２４２：Ｅ１５４−Ｅ１６３（１９８
２）；Ｂｅｌｌｏｒｉｎ，Ｆ．Ｅ．ら，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４７：３８−４
４（１９９５））。さらに、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞で研究された範囲内の内因性Ｐ
ＴＨＲ発現の変動は、内因性ＰＴＨＲ遺伝子が発現される他の細胞系で記載され
ている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１
２０８−１２１７（１９８８）、Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ，Ｃ．ら，Ｊ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ １３３：４５７−４６８（１９９６））。

【００６４】 ここで観察されたｈＰＴＨＲのシグナル伝達特性のいくつかの追加の局面は、
コメントする価値がある。第１に、ヒトＰＴＨＲがＬＬＣ−ＰＫ１細胞において
ＡＣおよびＰＬＣ応答にカップリングする効率が、ラットＰＴＨＲを発現する細
胞における対応する応答について比較した場合、実質的および同等に減少したこ
とは、興味深い。これは、図３で非常に明らかであり、例えば、ラットよりもほ
ぼ３〜５倍多いヒトＰＴＨＲは、ＰＬＣの匹敵する最大活性化を達成するために
必要とされた。ＡＣカップリングの効率の類似の差は、これらの細胞においてラ
ットＰＴＨＲについて既に報告された結果と、表１におけるｈＰＴＨＲについて
のデータとを比較することによって示唆される（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。全体のシグナル
伝達効率とレセプター密度との間の関連のこの「右側シフト」は、ヒトＰＴＨＲ
の本質的特性、あるいは、ヒトレセプターとここで使用されるブタ細胞によって
発現される細胞内シグナルトランスデューサーとの間の相対的種不適合性を反映
し得る。ＰＬＣまたは細胞質ゾルカルシウムシグナル伝達に対するトランスフェ
クトしたヒトＰＴＨＲのより効率的なカップリングは、霊長類またはヒト起源の
細胞で観察されている（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９
（１９９６）、Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：９８−１
００（１９９５））。より広範な種に由来する細胞におけるトランスフェクトし
たラットおよびヒトＰＴＨＲの機能の直接比較は、この問題を明らかにするため
に必要とされる。

【００６５】 第２に、ＩＰ₃応答（リガンドの最大濃度で）の程度だけでなく一時的プロフ ァイルが、レセプター密度に関連することを見いだした。詳細には、ＰＴＨＲ発
現のより低いレベルでのＰＬＣ応答は、一時的であり、１０分未満持続するが、
より高い密度のＰＴＨＲで引き起こされる応答は、かなり永く持続した。この差
についての説明は、直ちには明らかではない。多くのレセプター応答の代表であ
る、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞で観察された、測定したＩＰ₃のピークからの迅速な 低下のメカニズム（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．およびＩｒｖｉｎｅ，Ｒ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４１：１９７−２０５（１９８９））は、おそらく複雑であり、そし
て（ａ）最初の刺激の終結（レセプター脱感作またはインターナリゼーションを
介する）、（ｂ）ＰＴＨＲに接近可能な膜ホスファチジルイノシトール４，５−
ビスホスフェート基質の限定されたプールの枯渇（特に、リチウムの存在下で（
Ｎａｈｏｒｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ
１２：２９７−３０３（１９９１）））、または（ｃ）ＰＫＣの活性化によって
一部媒介され得る、イノシトールポリリン酸−顕著にはイノシトール１，４，５
−三リン酸−５−ホスファターゼを代謝する酵素の迅速な誘導（Ｎａｈｏｒｓｋ
ｉ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １２：２９７−
３０３（１９９１）、Ｓｈｅａｒｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６０：
３１３−３２４（１９８９））を含み得る。基質枯渇は、４分での基質加水分解
およびＩＰ₃形成のピーク速度が、より長期の応答を有するＨＫＲＫ Ｂ７細胞 で実際により大きいので、この系においてありそうにない説明のようである。し
かし、発現したＰＴＨＲの分布が、研究されたｈＰＴＨＲ発現のすべてのレベル
でこれらの極性化した上皮細胞の膜全体を通して均一であるかどうかは、まだ公
知ではない。例えば、ＰＴＨＲ分布が、レセプター合成のより低い速度でより制
限され得、これが、このような細胞においてレセプターに利用可能な基質プール
のサイズを限定し、そして「局所」基質枯渇させ得ることが可能である。ＨＫＲ
Ｋ Ｂ７細胞におけるより長期のＰＬＣ応答が、ＩＰ₃を代謝することに関連し たホスファターゼをほぼ飽和するために十分である、これらの細胞において活性
な立体配置で保持される占有されたレセプターの非常に大きな数により持続され
る、酵素のより激しくかつ延長した活性化のみによるものであり得ると考えられ
た（Ｓｈｅａｒｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６０：３１３−３２４（
１９８９））。差が４分対３０分で測定した応答のＥＣ₅₀で検出され得ず、また
２つの異なるメカニズムに指摘され得たリガンド選択性で検出される明らかな差
がなかったので、結果は、この可能性に最も一致するようである。ＰＬＣ応答に
おけるこれらの差とは逆に、ＰＴＨによるＡＣの活性化は、両方の細胞株におい
て最初の１５分にわたって同一に行われたようである。さらに、示していない実
験では、１０００ｎＭ ｈＰＴＨ（１−３４）の添加後２４時間までの間隔で酵
素活性の直接測定によって、これが、さらにこれらの細胞においてより持続した
ＰＫＡ応答に当てはまることも確認した。

【００６６】 これらの細胞におけるｈＰＴＨＲシグナル伝達の第３の興味深い特徴は、観察
された細胞質ゾルカルシウム応答に関与する。ＨＫＲＫ Ｂ２８とＨＫＲＫ Ｂ
７細胞との間のＰＬＣ活性化プロファイルにおける上記の差があれば、ＩＰ₃が 、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化中の細胞内貯蔵からのカルシウム放出の
主要な決定基であるという広く受け入れられた見解（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ
．，Ｎａｔｕｒｅ ３６１：３１５−３２５（１９９３））、およびヒトＰＴＨ
Ｒを発現する浸透可能なＨＥＫ−２９３細胞において、ＰＴＨおよびＩＰ₃が、 カルシウムの同じ細胞内プールからの放出に競合するようであるという最近の証
明（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９（１９９６））、こ
れらの２つの細胞株においてＰＴＨによって引き起こされる細胞質ゾルの遊離カ
ルシウム移動が、時間および程度の両方において実質的に同一であることは、お
そらく驚くべきことである。ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞での結果は、細胞質ゾル
の遊離カルシウム上昇の持続した期が、おそらく細胞外カルシウムの侵入を促進
することによって、ＰＫＡの活性化に関連し得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ
．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））が
、カルシウム応答の最初の期が、ＰＫＡに非依存的なようであることを示唆した
。さらに、フォルスコリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびホルボールエステルも
またカルシウム応答を誘起できない他の実験は、この応答を誘起することにおけ
るＰＫＡまたはＰＫＣの直接的関連についての証拠を提供しなかった。ＰＴＨへ
の迅速な細胞質ゾルカルシウム応答が、これらの細胞におけるＩＰ₃の最初の増 加に最も密接に関連し、そしてさらに、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞で急に生成したＩ
Ｐ₃の量（ただし、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞で産生したより少ないＩＰ₃の量で）が、
ＩＰ₃感受性細胞内プールからのカルシウムの最大放出を達成するために十分あ るに違いないと、結論づけた。

【００６７】 （ｈＰＴＨアナログのシグナル伝達および生物学的活性） いくつかのＰＴＨアナログは、非ヒト起源のＰＴＨ応答性細胞におけるシグナ
ル選択性を示すことが報告された。これらには、ＰＫＣおよび／または細胞質ゾ
ルカルシウム移動を選択的に活性化することがいくつかの系で示されているＰＴ
Ｈ（３−３４）およびＰＴＨ（７−３４）（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−
Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：２５８８−２
５９４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７
１：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ
．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７１：１１
０５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉ
ｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３
））、ならびにラット骨肉腫細胞および初代ラット脾臓細胞においてＡＣを活性
化するがＰＫＣを活性化しないことが報告されているＰＴＨ（１−３１）（Ｒｉ
ｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１
８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，
Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １６：３８２−３８６（１９９５
）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：５
３−６０（１９９２））が挙げられる。このようなフラグメントが、臨床使用の
ための候補と考えられているので（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｅ Ｒｅｖ １４：６９０−７０９（１９９３）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，
Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃ
ｉ １６：３８２−３８６（１９９５））、これらのアナログが、ヒトＰＴＨＲ
による予測されたシグナル選択性を提示するかどうかを決定した。

【００６８】 図２Ｂに示すように、ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるＡＣの活性化は、１０ｎ
Ｍ以上の濃度でのｈＰＴＨ（３−３４）によって顕著に刺激されたが、このペプ
チドの１０００ｎＭに対する応答は、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する最大応答の
１６％のみであった。ヒトＰＴＨ（７−３４）は、テストしたすべての濃度でＡ
Ｃを活性できなかったが、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）およびｈＰＴＨ（１−３１
）に対する応答は、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する応答とは区別不可能であった
。同様の結果を、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞での実験で得た（データを示さず）。

【００６９】 １０００ｎＭの濃度でテストした場合、ｈＰＴＨ（３−３４）もｈＰＴＨ（７
−３４）も、細胞当たりほぼ百万レセプターを発現したＨＫＲＫ Ｂ７細胞にお
いてでさえ、ＰＬＣを顕著に活性化しなかった（表２）。逆に、ｈＰＴＨｒＰ（
１−３６）および予期せぬことにｈＰＴＨ（１−３１）の両方とも、ＨＫＲＫ
Ｂ２８（４分で）およびＨＫＲＫ Ｂ７（３０分で）の両方においてｈＰＴＨ（
１−３４）と等価にＰＬＣを刺激した。ヒトＰＴＨ（１−３１）（１００ｎＭ）
はまたＨＫＲＫ Ｂ７細胞において細胞質ゾルの遊離カルシウムトランジエント
を十分に活性化したが（図５Ｂ）、ｈＰＴＨ（３−３４）もｈＰＴＨ（７−３４
）（１００ｎＭ）のいずれも、この応答を誘導しなかった（示さず）。

【００７０】 ＰＫＡ活性化に主として依存的であるがまたＰＫＡ非依存的シグナル伝達を反
映するｕ−ＰＡバイオアッセイにおいて（上記のように）、ｈＰＴＨ（３−３４
）、ｈＰＴＨ（７−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の活性は、それらのシグ
ナル伝達特性と調和した。したがって、ｈＰＴＨ（３−３４）は、部分的に活性
であったが（ｈＰＴＨ（１−３４）に対する最大応答の５０〜６０％）、ｈＰＴ
Ｈ（７−３４）は不活性であり、そしてｈＰＴＨ（１−３１）は十分に活性であ
った（表３、図９）。顕著なことに、ｈＰＴＨ（１−３１）によるｕ−ＰＡ分泌
の最大活性化は、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞においてでさえ、ｈＰＴＨ（１−３４）の
活性化と同一であり（図９、表３）、ここで、最大ＰＴＨ活性は、８ＢｒｃＡＭ
Ｐで、およびＡＢ４５細胞で、ＰＫＡの最大薬理学的活性化で達成された活性を
超え（図７）、ここで、ＰＫＡ（および８ＢｒｃＡＭＰの作用）は、ほとんど完
全にブロックされ、そしてＰＴＨの残りの活性は、おそらく、ＰＫＡ非依存的シ
グナルによってほぼ完全に媒介される。同様に、ＨＫＲＫ Ｂ２８およびＨＫＲ
Ｋ Ｂ７細胞の両方において、ｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４
）（ならびにｈＰＴＨｒＰ（１−３６））は、リン酸取り込みのかなりの最大活
性化を示し、これは、これらの細胞においてＰＫＣ依存的であるが（Ｇｕｏ，Ｊ
．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５）
）、ｈＰＴＨ（３−３４）およびｈＰＴＨ（７−３４）は、予測されたように不
活性であった（図８）。

【００７１】 表３。ＨＫＲＫ Ｂ７細胞およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるｈＰＴＨ／Ｐ
ＴＨｒｐペプチドによるｕ−ＰＡ分泌の刺激 細胞を、培地中に存在する分泌されたｕ−ＰＡの測定前に１６時間所定のペプ
チド（１０００ｎＭ）とインキュベートし、これをビヒクル処理コントロールで
測定した活性のパーセントとして表した。示される値は、３つ組の実験の平均±
ＳＥＭである。

【００７２】

【表３】

【００７３】 これらのＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてトランスフェクトされたヒトＰＴＨＲに
よって観察されたｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）のシグナル
伝達および生物学的特性の完全な等価物は、このアナログが、ラット系において
ＡＣの刺激に関しての完全な効力にもかかわらず、ＰＫＣ活性化の細胞バイオア
ッセイにおいて活性が欠如していることが報告されているので（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ
．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９
９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０
：５３−６０（１９９２）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３４：８８３５−８８４２（１９９５））、全く予測できなかった。
本発明者らの所見とこれまでの報告との間の見かけの不一致が、レセプター種に
おける差に関連し得るかどうかを決定した。したがって、ラットＰＴＨＲを発現
するＬＬＣ−ＰＫ１細胞（ＥＷ５）におけるｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴ
Ｈ（１−３１）の効果を比較した。両方のペプチドとも、ＥＷ５細胞においてＡ
Ｃを等価に活性化した（図１０）。表４に示すように、ＥＷ５細胞において（お
よび３つの他のｒＰＴＨＲ発現細胞株において）ラットＰＴＨＲを介するｈＰＴ
Ｈ（１−３１）による最大ＩＰ₃生成は、ｈＰＴＨ（１−３４）による生成の約 ７０％の大きさであるが、１６時間でのｕ−ＰＡの生成は、１００ｎＭのいずれ
かのペプチドに対する応答において同一であった。２つのペプチドによるリン酸
取り込みの刺激も同一であった。したがって、ｈＰＴＨ（１−３１）がＰＬＣを
活性化する能力およびＰＴＨＲを介する他のｃＡＭＰ非依存的応答は、ヒトレセ
プターに対して制限されなかったが、組換えラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−
ＰＫ１細胞でも見られた。ｈＰＴＨ（１−３１）に対するＰＬＣ応答は、ラット
ＰＴＨＲを介してｈＰＴＨ（１−３４）に対して中程度に損なわれたが、ヒトレ
セプターは、これらの２つのリガンド間を識別できないようである。

【００７４】 表４。ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−
３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の比較。

【００７５】 ｈＰＴＨ（１−３４）またはｈＰＴＨ（１−３１）に対する応答を、１細胞当
たり３２０，０００のラットＰＴＨＲを発現するＥＷ５細胞で測定した。各値は
、３つ組で行った代表的実験の平均±ＳＥＭである。同様の結果を、少なくとも
３つの個々の実験で得た。ｈＰＴＨ（１−３４）に対するｈＰＴＨＲ（１−３１
）で観察されたＩＰ₃形成における中程度の減少を、ラットＰＴＨＲを発現する ３つの他のＬＬＣ−ＰＫ１細胞株（すなわち、ＥＷ２９、ＡＲ−Ｃ３８、および
ＡＲ−Ｂ４４、これらは、それぞれ１９０，０００、６３０，０００、および８
００、０００のＰＴＨＲ／細胞を発現する）で確認し、ここで、ｈＰＴＨ（１−
３１）後の最大ＩＰ₃形成は（ｈＰＴＨ（１−３４）効果の％として）、それぞ れ７５％、７７％、および６４％であった。

【００７６】

【表４】

【００７７】 特定のＰＴＨＲ生成した第２のメッセンジャーシグナルと、骨または腎臓のよ
うなホルモンのある生物学的作用との間の広く仮定された連結を考慮して（Ｄｅ
ｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ １４：６９０−７０
９（１９９３）、Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ
９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．および
Ｍｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １６：３８
２−３８６（１９９５）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａｍ
Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）、Ｊａｎｕｌ
ｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９
３））、ヒトＰＴＨＲを発現する細胞においていくつかの短縮型ｈＰＴＨ（１−
３４）アナログの特性を検査することは、非常に興味深かった。

【００７８】 ｈＰＴＨ（３−３４）によるＡＣ（およびｕ−ＰＡ分泌）の弱いが顕著な活性
化を観察したが、ＰＬＣまたは細胞質ゾルカルシウム刺激活性はなかった。これ
らの結果は、主として齧歯類モデルに基づく他の報告とは反対であり、ここで、
ＰＴＨ（３−３４）ペプチドは、一般に、ＰＬＣ／ＰＫＣまたはカルシウム刺激
活性の相対的保存でのＡＣ活性化の損失を示した（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂ
ｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：２５８
８−２５９４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
２７１：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，
Ｂ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７１
：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ
．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎ
ｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１
９９３）、Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２３１
６６−２３１７２（１９９５））。１細胞当たり４００，０００のヒトＰＴＨＲ
を発現するトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞において、Ｐｉｎｅｓらは
、１０ｎＭ［Ｎｌｅ^8,18，Ｔｙｒ³⁴］ｂＰＴＨ（３−３４）アミドに応じてＡＣ
および細胞質ゾルの遊離カルシウムの両方においてわずかであるが顕著な増加を
観察したが（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８：３８１−３８９（１９９６
））、１００ｎＭでのｈＰＴＨ（３−３４）アミドに対するＰＬＣまたはカルシ
ウム応答は観察されなかった。一方、他者はまた、ラットおよび他の非ヒト細胞
系においてＰＴＨ（３−３４）ペプチドの活性化を検出できなかった（Ｒｅｉｄ
，Ｉ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２５２：Ｅ４５−Ｅ５１（１９８７）；
Ｃｉｖｉｔｅｌｌｉ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：１２０４
−１２１０（１９８９）；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１３５２−１３５８（１９８９））。し
たがって、これらの不均一が、実験系の差、あるいは関連のＰＴＨＲまたは用い
られる特定のＰＴＨ（３−３４）ペプチドの種および構造の差によるものであり
得るようである。

【００７９】 ｈＰＴＨ（１−３１）が、ＡＣ、ＰＬＣ、細胞質ゾルカルシウム移動の活性化
、ｈＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｕ−ＰＡ分泌およびリン酸
取り込みに関して、ｈＰＴＨ（１−３４）と完全に等価であるという所見は、よ
り驚くことであった。これまで、ｈＰＴＨ（１−３１）は、ＡＣ活性を保持する
が、ＰＫＣ刺激活性が欠如することが報告されている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら
，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４）、
Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：９４
３−９４９（１９９４）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３４：８８３５−８８４２（１９９５））。これらの観察は、領域ｈＰ
ＴＨ（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９
：９４３−９４９（１９９４）；Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６８：９８−１００（１９９５）；Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７）；Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ
．ら，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：７２７−７３３（１９９１）；Ｆｕ
ｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：１８５１−１８
５８（１９９４））が、ＰＴＨＲを介するＰＫＣの活性化のためのコアドメイン
を含むという提案の基準を形成した（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏ
ｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １６：３８２−
３８６（１９９５）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅ
ｒ Ｒｅｓ ９：９４３−９４９（１９９４））。したがって、 ｈＰＴＨ（１ −３１）の毎日の注射を受けた卵巣摘出したラットが、ｈＰＴＨ（１−３４）で
見られるものに匹敵する骨量の増加を示す実験は、骨におけるＰＴＨのアナボリ
ック効果におけるｃＡＭＰ／ＰＫＡカスケードについての一時的役割の証拠とし
て広く解釈されている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ
Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．
ら，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ５８：８１−８７（１９９６））。
ＰＫＣは、ｃＡＭＰアナログによって模倣され得ないｈＰＴＨ（１−３１）に対
する細胞質ゾルカルシウム応答、およびさらにリン酸取り込みの激しい刺激の両
方を直接的に測定しないが、これらの細胞におけるＰＫＣの活性化に主として連
結されることがこれまでに示された生物学的応答が観察された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら
，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。
したがって、ｈＰＴＨＲを介するｈＰＴＨ（１−３１）によるＰＬＣ活性化の直
接的証明は顕著であり、そしてヒトＰＴＨＲのリガンド選択性が、ラットＰＴＨ
Ｒの選択性とは実質的に異なり得る重要な可能性を上昇する（すべてのこれまで
の研究がラット系で行われているならば）。このような結果は、ラットにおける
バイオアッセイの基準において臨床的に有用なシグナル選択的ＰＴＨアナログを
開発することをねらった努力についての重要な関連を有する（Ｗｈｉｔｆｉｅｌ
ｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
Ｓｃｉ １６：３８２−３８６（１９９５））。

【００８０】 この問題をさらに検討するために、ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１
細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の活性を比較し
た。驚くべきことに、２つのペプチドの活性が、この系でさらにほぼ認識不可能
であるが、ｈＰＴＨ（１−３１）による最大ＰＬＣ活性化が、ｈＰＴＨ（１−３
４）に対する最大応答の６０％まで、顕著に減少することを見いだした。これら
の所見は、ラット細胞におけるｃＡＭＰ選択的アナログとしてのｈＰＴＨ（１−
３１）のこれまでの特徴づけと一致せず、そしてＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてｈ
ＰＴＨＲを介して観察されたｈＰＴＨ（１−３１）のｃＡＭＰ非依存的活性の全
範囲が、ヒトＰＴＨＲに全体的には独特ではないことを示す。したがって、ＰＴ
ＨＲ種それ自体の差は、ＨＫＲＫ細胞における本所見とラット細胞を使用する他
者によってこれまでに報告された所見（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ
Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏ
ｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：９４３−９４９（１
９９４）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：
８８３５−８８４２（１９９５））との不均一を説明しないようである。

【００８１】 本所見とｈＰＴＨ（１−３１）ペプチドのこれまでの研究からの所見との間の
見かけの差についていくつかの可能性のある説明がある。第１に、異なる応答が
測定されている。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＰＬＣ／ＰＫＣ活性化に連結する
ことが公知のＰＬＣ、細胞質ゾルの遊離カルシウム、およびある遠位生物学的効
果が測定されるが、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅらは、抽出されていない膜においてＰ
ＫＣを測定したが、ＰＬＣまたは細胞質ゾルの遊離カルシウムでは測定しなかっ
た（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７
９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍ
ｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：９４３−９４９（１９９４））。ＰＫＣが、ＰＬＣ以外
の上流のエフェクターによって調節され得ることが公知である（Ｅｘｔｏｎ，Ｊ
．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１−４（１９９０））。第２に、これま
での研究は、ＲＯＳ １７／２骨肉腫細胞、またはトランスフェクトされたより
もむしろ内因性のラットＰＴＨレセプター遺伝子を発現するラット脾臓リンパ球
の初代培養を使用して行った（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ
ｅｒ Ｒｅｓ ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，
Ｈ．ら，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ９：９４３−９４９（１９９４）
）。ＲＯＳ １７／２細胞は、ｒＰＴＨＲ ｃＤＮＡがもともとクローニングさ
れ、次いで実験で使用したｒＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を生成する
ために使用されるＲＯＳ １７／２．８サブクローンの供給源であるので、ほと
んど確実にここで研究されたものと同じｒＰＴＨＲを発現する（Ａｂｏｕ−Ｓａ
ｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：
２７３２−２７３６（１９９２）、Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０９０−２０９８（１９９３）、Ｇｕｏ，Ｊ
．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９１（１９９５）
）。一方、ＲＯＳ １７／２細胞および脾臓細胞が、これらの細胞においてｈＰ
ＴＨ（１−３１）に対する応答に影響を与え得るＰＴＨについてのレセプターの
代替の種を発現することの可能性は高い。例えば、見かけのＣ末端特異性を有す
るが未だ十分に特徴づけられていないＰＴＨレセプターは、ＲＯＳ １７／２．
８細胞において記載されている（Ｉｎｏｍａｔａ，Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３６：４７３２−４７４０）。第３に、ＲＯＳ １７／２およびラ
ット脾臓細胞系は、研究されたｒＰＴＨＲトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１
細胞とは他の方法で異なる：（ａ）ＰＴＨＲの表面発現は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞
で使用されるものより低いことが公知であるかまたはおそらく低く、（ｂ）ｒＰ
ＴＨＲは、ブタＧタンパク質よりもむしろラットにカップリングされ、そして（
ｃ）発現されたＧタンパク質およびエフェクター酵素の種々のサブタイプの相対
量が非常に異なり得た。より低いＰＴＨＲ発現の問題は、特に重要であり得る。
データは、ラットＰＴＨＲを介するＰＬＣ／ＰＫＣ活性化のためのｈＰＴＨ（１
−３１）ペプチドの効力が、ｈＰＴＨ（１−３４）に対して中程度減少する（４
０％）ことを示唆する。ＰＬＣシグナル伝達においてレセプター密度の重要な影
響が記載されたならば、ｈＰＴＨ（１−３４）とｈＰＴＨ（１−３１）との間の
ＰＬＣについての効力におけるこの差が、ここで使用されるＬＬＣ−ＰＫ１細胞
よりも少ないｒＰＴＨＲを発現する細胞において増幅され得たことが可能なよう
である。一方、ｈＰＴＨ（１−３１）に対してヒトＰＴＨＲを介するＰＬＣを刺
激する効力の損失は、ヒトＰＴＨＲ表面密度がこのシグナルを検出するために必
要とされる最小に近づく細胞（ＨＫＲＫ Ｂ２８）においてでさえも見いだされ
なかった。

【００８２】 本明細書に記載のすべての参考文献は、開示において参考として援用される。
明確さおよび理解の目的のための例示および実施例によって本発明を現在完全に
記載すると、一定の変化および改変が開示された実施態様で行われ得、そしてこ
のような改変が本発明の範囲内にあることを意図することが、当業者に明らかで
ある。実施例として、好ましい実施態様は、本発明を行うことの１つの形態のみ
を構成する。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において安定に発現されるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプ
ターへの競合放射性リガンド結合。９５０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ
Ｂ７）（図１Ａ）または２８０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ Ｂ２８
）（図１Ｂ）を安定に発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、漸増濃度の非放射性リガ
ンドの存在または不在下で、結合緩衝液中で¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,18Ｔｙｒ³⁴］ｂ ＰＴＨ（１−３４）とともに１５℃にて６時間インキュベートした。スキャッチ
ャードプロットを、挿入図に示す。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを示す
。結合した総放射性リガンドは、１５，０００〜３０，０００ｃｐｍ／ウェルの
範囲であり、そして非特異的結合は、総結合の２〜５％であった。

【図１Ｂ】 ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において安定に発現されるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプ
ターへの競合放射性リガンド結合。９５０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ
Ｂ７）（図１Ａ）または２８０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ Ｂ２８
）（図１Ｂ）を安定に発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、漸増濃度の非放射性リガ
ンドの存在または不在下で、結合緩衝液中で¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,18Ｔｙｒ³⁴］ｂ ＰＴＨ（１−３４）とともに１５℃にて６時間インキュベートした。スキャッチ
ャードプロットを、挿入図に示す。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを示す
。結合した総放射性リガンドは、１５，０００〜３０，０００ｃｐｍ／ウェルの
範囲であり、そして非特異的結合は、総結合の２〜５％であった。

【図２】 図２Ａ〜２Ｂ。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１
細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激。サイクリックＡＭＰを、所定のペプチドの添
加および３７℃にて２０分間のインキュベーションの後に調製された細胞の酸抽
出物中で測定した。図２Ａは、ＨＫＲＫＢ７細胞（黒丸；細胞当たり９５０，０
００レセプター）およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞（白丸；細胞当たり２８０，００
０レセプター）において、所定の濃度でのｈＰＴＨ（１−３４）に対する応答を
示す。図２Ｂは、ｈＰＴＨ（１−３４）（白丸）、ｈＰＴＨ（１−３１）（白三
角）、ｈＰＴＨ（３−３４）（黒三角）、ｈＰＴＨ（７−３４）（白四角）、ｈ
ＰＴＨｒｐ（１−３６）（黒菱形）、およびｓＣＴ（白三角）に対するＨＫＲＫ
Ｂ２８細胞における応答を示す。結果を、基準の倍数（ｆｏｌｄ ｂａｓａｌ
）として表した。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを表す。

【図３】 ヒトレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてＰＴＨによるＰＬＣの
最大活性化におけるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター密度の影響。基準のパーセン
トとして表した、ＩＰ₃産生に対する最大増加は、ヒト（黒四角）およびラット （白四角）ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターの異なる密度を発現するＬＬＣ−ＰＫ
１細胞について示される。細胞を、この応答の最大活性を誘起する、１０００ｎ
Ｍの濃度でｈＰＴＨ（１−３４）で３０分間刺激した（図４Ｂを参照のこと）。
各点は、３つ組で行った３実験の平均±ＳＥＭを示す。ＰＬＣ活性とレセプター
発現との間の関連は、ラット（左）およびヒト（右）レセプターについて破線に
よって図示される。

【図４】 図４Ａ〜４Ｂ。ＨＫＲＫ Ｂ７とＨＫＲＫ Ｂ２８細胞との間のＩＰ₃産生の 時間および用量依存性の比較。図４Ａは、所定の時間についてｈＰＴＨ（１−３
４）（１０００ｎＭ）で刺激されたＨＫＲＫ Ｂ７細胞（黒丸）およびＨＫＲＫ
Ｂ２８細胞（白丸）を示す。図４Ｂは、３０分（ＨＫＲＫ Ｂ７）または４分
（ＨＫＲＫ Ｂ２８）について所定の濃度でｈＰＴＨ（１−３４）で刺激した細
胞を示す。結果は、基準のパーセントとして表され、そして各点は、３つ組で行
われる３実験の平均±ＳＥＭである。

【図５】 図５Ａ〜５Ｄ。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１
細胞におけるｈＰＴＨに対する細胞質ゾルの遊離カルシウム応答。細胞質ゾルの
遊離カルシウムを、細胞のｆｕｒａ ２ＡＭロードしたコンフルエント単層で測
定した。応答を、ｈＰＴＨ（１−３４）（図５Ａ）またはｈＰＴＨ（１−３１）
（図５Ｂ）の添加後のＨＫＲＫ Ｂ７細胞において；ｈＰＴＨ（１−３４）後の
ＨＫＲＫ Ｂ２８細胞（図５Ｃ）において；ならびにｈＰＴＨ（１−３４）後の
ＡＢ４５細胞（図５Ｄ）において測定した。基準の細胞質ゾルの遊離カルシウム
濃度およびこれらの細胞株におけるｓＣＴの添加後の濃度は、実質的には同一−
すなわち、それぞれ２０〜５０ｎＭおよび４００〜５００ｎＭであった。示され
たこれらの結果は、各細胞株での少なくとも５つの独立した実験の代表例である
。

【図６】 図６Ａ〜６Ｂ。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞によるウロキナーゼ型のプラスミノーゲン
アクチベーター（ｕ−ＰＡ）分泌の刺激。ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンア
クチベーター活性を、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞（図６Ａ）またはＨＫＲＫ Ｂ２８細
胞（図６Ｂ）の馴化培地中で、以下のようなアゴニストの添加の１６時間後に測
定した：ｈＰＴＨ（１−３４）（ｎＭで示される濃度）、８ＢｒｃＡＭＰ（１ｍ
Ｍ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、またはｓＣＴ（１０００ｎＭ）。結果は、標準と
して精製したヒトウロキナーゼを使用するＰｌｏｕｇ単位／ウェルで表される。
各バーは、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を
、１０以上の個々の実験で得た。

【図７】 プロテインキナーゼＡの優勢なネガティブ阻害を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞
におけるｕ−ＰＡ活性の刺激。ｕ−ＰＡの分泌を、ヒトＰＴＨＲおよびＲＥＶ
ＡＢ（ＰＫＡの優勢なネガティブインヒビター）を同時発現する、ＡＢ４５細胞
へのアゴニストの添加の１６時間後に測定した。結果は、標準として精製したヒ
トウロキナーゼを使用するＰｌｏｕｇ単位／ウェルで表される。各点は、３つ組
みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を、少なくとも５実
験から得た。

【図８】 ＨＫＲＫ Ｂ７およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞におけるＰＴＨによるリン酸取り
込みの調節。リン酸取り込みを、ビヒクル、ｈＰＴＨ／ＰＴＨｒｐペプチド（１
０００ｎＭ）、８ＢｒｃＡＭＰ（１ｍＭ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、またはｓＣ
Ｔ（１０００ｎＭ）を含む無血清培地中での６時間のインキュベーション後にＨ
ＫＲＫ Ｂ７細胞（黒棒）およびＨＫＲＫ Ｂ２８細胞（白棒）で測定した。予
備実験（示さず）は、１０００ｎＭ以上の濃度でのｈＰＴＨ／ＰＴＨｒｐペプチ
ドに対する最大応答を示した。結果は、基準のパーセントとして表され、そして
各棒は、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を、
少なくとも５つの個々の実験から得た。

【図９】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４
）によるｕ−ＰＡ分泌の刺激。ウロキナーゼ型のＰＡ活性を、所定の濃度でのｈ
ＰＴＨ（１−３４）（黒丸）またはｈＰＴＨ（１−３１）（白三角）の添加の１
６時間後に測定し、そして、標準として、精製したヒトウロキナーゼを使用する
Ｐｌｏｕｇ単位／ウェルで表した。各点は、３つ組みで行われた代表的実験の平
均±ＳＥＭである。同様の結果を、少なくとも６つの個々の実験で得た。

【図１０】 ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３１）
およびｈＰＴＨ（１−３４）によるサイクリックＡＭＰ蓄積の刺激。サイクリッ
クＡＭＰ蓄積を、細胞当たり３２０，０００ラットＰＴＨＲを発現するＥＷ５細
胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）（黒丸）またはｈＰＴＨ（１−３１）（白三角
）に対する応答で測定した。結果は、基準の倍数として表される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 タカス， ヒサシ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， マサチューセ ッツ アベニュー 950， アパートメン ト 317 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA36 DA77 DA80 4B024 AA11 BA16 CA04 DA02 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QQ79 QR16 QR48 QR58 QR77 QR80 QX02 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA46

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連ペプチドレセ
   プター（ＰＴＨＲ）を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を含む安定にトランスフェク
   トした細胞株。
2. 【請求項２】 目的の化合物がＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターの
   アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、 （ａ）ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現
   する細胞株を提供する工程； （ｂ）ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配
   列を含む発現ベクターを提供する工程であって、該レセプターが、工程（ａ）の
   該細胞株で正常に発現されない、工程； （ｃ）該細胞株に該発現ベクターを導入し、それによって安定にトランスフェ
   クトした細胞を提供する工程； （ｄ）該安定にトランスフェクトした細胞を該目的の化合物と接触させる工程
   ；および （ｅ）工程（ｄ）の該細胞の細胞培養上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、 を包含する、方法。
3. 【請求項３】 前記ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、Ｇｓタン
   パク質結合レセプターである、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、Ｇｑタン
   パク質結合レセプターである、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、Ｇｓおよ
   びＧｑタンパク質結合レセプターの両方である、請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記細胞株がＬＬＣ−ＰＫ１である、請求項２に記載の方法
   。
7. 【請求項７】 前記ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、ヒトＰＴ
   ＨＲである、請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、ヒトＰＴ
   ＨＲである、請求項６に記載の方法。