EA016041B1 - Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта - Google Patents

Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта Download PDF

Info

Publication number
EA016041B1
EA016041B1 EA200870424A EA200870424A EA016041B1 EA 016041 B1 EA016041 B1 EA 016041B1 EA 200870424 A EA200870424 A EA 200870424A EA 200870424 A EA200870424 A EA 200870424A EA 016041 B1 EA016041 B1 EA 016041B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
agonist
compound
receptor
less
test compound
Prior art date
Application number
EA200870424A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870424A1 (ru
Inventor
Чжи-Лян Чу
Джеймс Н. Леонард
Original Assignee
Арена Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арена Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Арена Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA200870424A1 publication Critical patent/EA200870424A1/ru
Publication of EA016041B1 publication Critical patent/EA016041B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам применения рецептора GPR119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта. Агонисты рецептора GPR119 можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, а также для увеличения костной массы субъекта. Агонисты рецептора GPR119 стимулируют костеобразование у субъекта.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам применения рецептора СРВ119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта. Агонисты рецептора СРВ119 можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, а также для увеличения костной массы субъекта. Агонисты рецептора СРВ119 стимулируют костеобразование у субъекта.
Уровень техники
Нижеследующее обсуждение приводится для облегчения понимания изобретения, однако не подразумевается, или не предполагается, что оно относится к предыдущему уровню техники изобретения.
A. Остеопороз.
Остеопороз представляет собой заболевание, которое приводит к потере дееспособности и характеризуется уменьшением костной массы и ухудшением микроархитектуры скелета, что приводит к уменьшению прочности кости и развитию предрасположенности пациента к повышенному риску переломов костей. Остеопороз поражает более 75 млн людей в Европе, Японии и Соединенных Штатах и является причиной более 2,3 млн переломов только в Европе и Соединенных Штатах. В Соединенных штатах остеопороз поражает по меньшей мере 25% всех постклимактерических белых женщин, причем данный процент увеличивается до 70% у женщин старше 80 лет. Одна из трех женщин старше 50 лет имеет остеопоретический перелом, что является серьезной социальной и финансовой проблемой для общества. Данное заболевание встречается не только у женщин, оно также может поражать пожилых мужчин. Ожидается, что к 2050 году встречаемость переломов костей тазобедренного сустава во всем мире увеличится у мужчин на 310% и у женщин на 240%. Общий риск зарегистрированных в клинике переломов костей тазобедренного сустава, предплечья и позвоночника на протяжении всей жизни составляет приблизительно 40% и является эквивалентным риску сердечно-сосудистых заболеваний. Таким образом, остеопоретические переломы вызывают значительную смертность и заболеваемость и сопровождаются большими экономическими затратами. Вследствие старения населения число остеопоретических переломов и затраты на их лечение в следующие 50 лет удвоятся, если не будут разработаны эффективные профилактические стратегии (см., например, Айк с1 а1., Сйи Оййор Рс1а1 Век (2006), 443:19-24; Ραίδζ. 1. С11П 1иуек! (2005), 115:3318-3325; \Уог1б Неа1!й ОгдагФабоп Тесйшса1 Верой 8епек 921 (2003), Ргеуеийои аиб Маиадетеи! о! Ок!еорогок1к).
B. Глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (С1Р).
Глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (С1Р, также известный как желудочный ингибиторный полипептид) представляет собой пептидный гормон инкретин из 42 аминокислот, который высвобождается из эндокринных К-клеток двенадцатиперстной кишки после проглатывания пищи. Количество высвобождаемого С1Р сильно зависит от количества потребляемой глюкозы. Показано, что С1Р стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы. Действие С1Р опосредуется специфическим рецептором, сопряженным с С-белком, а именно С1РВ.
Поскольку С1Р содержит аланин в положении 2, он является превосходным субстратом для дипептидилпептидазы-4 (ОРР-1У), фермента, регулирующего деградацию С1Р. Полноразмерный С1Р(1-42) быстро, в течение нескольких минут после секреции из К-клеток пищеварительного тракта, превращается в С1Р(3-42), не обладающий биологической активностью. Показано, что ингибирование ЭРР-1У увеличивает биологическую активность С1Р (см., например, Эгискег, Се11 Ме1аЬ (2006), 3:153-165; Мсш!окй е1 а1., Веди1 Рер! (2005), 128:159-165; Эеасои, Веди1 Рер! (2005), 128:117-124; Айгеи е! а1., Еибосгшо1оду (2005), 146:2055-2059). Определение полноразмерного биологически активного С1Р, например в крови, можно проводить с помощью специфических Ν-концевых анализов (см., например, Эеасои е! а1., 1. Сйи Еибоспио1 Ме1аЬ (2000), 85:3575-3581).
Недавно было показано, что С1Р стимулирует остеогенез. Также показано, что С1Р активирует рецепторы остеобластов, приводя к увеличению синтеза коллагена типа I и повышению активности щелочной фосфатазы, связанных с остеогенезом. Обнаружено, что С1Р ингибирует активность и дифференциацию остеокластов ш уйго. Показано, что введение С1Р предотвращает уменьшение костной массы, вызванное овариэктомией. У мышей с нокаутом гена рецептора С1Р (С1РВ) наблюдается уменьшение размера костей, снижение массы костей, изменение микроархитектуры и биохимических свойств костей, а также изменение параметров ремоделирования костей, особенно костеобразования (см., например, 2йоид е! а1., Ат 1. Рйукю1 Еибосгшо1 Ме1аЬ (2007), 292:Е543-Е548; Во11ад е! а1., Еибосйио1оду (2000), 141:12281235; Во11ад е! а1., Мо1 Се11 Еибосйио1 (2001), 177:35-41; Хе е! а1., Воие (2005), 37:759-769; и Ткикуата е! а1., Мо1 Еибосгто1 (2006), 20:1644-1651).
Пригодность С1Р для поддержания или увеличения плотности кости или костеобразования была подтверждена Бюро по патентам и товарным знакам США путем выдачи патента США № 6410508 на способ лечения пониженной минерализации кости путем введения пептида С1Р. Однако существующие в настоящее время агонисты пептида С1Р обладают недостаточной биодоступностью при пероральном применении, что негативно влияет на отношение пациента. Эффективный альтернативный подход заключается в разработке перорально активной композиции для увеличения уровня активности эндогенного С1Р.
- 1 016041
С. СРВ119.
СРК119 представляет собой С-белок-сопряженный рецептор (СРВ 119; например, человеческий СРВ119, СепВапк®, номер доступа ААР72125, и его аллели; например, мышиный СРВ119, СепВапк®, номер доступа ΑΥ288423 и его аллели). Активация СРВ119, например, под действием агониста, приводит к увеличению уровня внутриклеточного цАМФ, что согласуется с данными, свидетельствующими о сопряжении СРВ119 с С-белками. В патентной литературе СРВ119 упоминается как КИРЗ (например, в \νϋ 00/31258); СРК119 также называют глюкозозависимым инсулинотропным рецептором (СЭ1В).
Ό. Рецепторы, сопряженные с С-белком.
Хотя у людей обнаружено несколько классов рецепторов, наиболее многочисленным и терапевтически значимым является класс рецепторов, сопряженных с С-белком (СРСК). В человеческом геноме присутствует приблизительно 30000-40000 генов и приблизительно 2% из них кодируют СРСВ.
СРСВ составляют важную область разработки фармацевтических продуктов. Лекарственные средства, обладающие активностью в отношении СРСК, оказывают благоприятное терапевтическое действие на широкий спектр заболеваний человека, включающих в себя боль, когнитивную дисфункцию, гипертонию, язвенные болезни, риниты и астму. Примерно из 500 поставляемых в клинику лекарственных средств более 30% являются модуляторами функции СРСВ. Данные лекарственные средства способны воздействовать приблизительно на 30 полностью охарактеризованных СРСВ (см., например, ^ке е( а1., Аппи Ксу Рйагшасо1 Тох1со1 (2004), 44:43-66).
СРСВ имеют общий структурный мотив, содержащий семь последовательностей из 22-24 гидрофобных аминокислот, которые образуют семь альфа-спиралей, каждая из которых пронизывает мембрану (каждый трансмембранный участок имеет номер, например трансмембранный участок-1 (ТМ-1), трансмембранный участок-2 (ТМ-2) и др.). Трансмембранные спирали соединены аминокислотными цепями, находящимися между трансмембранным участком-2 и трансмембранным участком-3, трансмембранным участком-4 и трансмембранным участком-5 и трансмембранным участком-6 и трансмембранным участком-7 на внешней, или внеклеточной, стороне клеточной мембраны (их называют внеклеточные участки 1, 2 и 3 (ЕС-1, ЕС-2 и ЕС-3) соответственно). Трансмембранные спирали также соединены аминокислотными цепями, находящимися между трансмембранным участком-1 и трансмембранным участком-2, трансмембранным участком-3 и трансмембранным участком-4 и трансмембранным участком-5 и трансмембранным участком-6 на внутренней, или внутриклеточной, стороне клеточной мембраны (их называют внутриклеточные участки 1, 2 и 3 (1С-1, 1С-2 и 1С-3) соответственно). Карбокси- (С-) конец рецептора находится во внутриклеточном пространстве, а амино- (Ν-) конец рецептора находится во внеклеточном пространстве.
Как правило, при связывании лиганда с рецептором (данное событие часто называют активацией рецептора) происходит изменение конформации рецептора, которое обеспечивает соединение внутриклеточного участка с внутриклеточным С-белком. Обнаружено, что СРСВ являются промискуитентными по отношению к С-белкам, т.е. что СРСК могут взаимодействовать более чем с одним С-белком; см. Кепакш, ЬгГе 8с1епсек (1988), 43:1095-1101. В настоящее время идентифицированы С-белки Сд, Ск, С1, С/ и Со, хотя существуют и другие разновидности данного класса. Активируемое лигандом соединение СРСВ с С-белком инициирует каскад процессов сигнального пути (называемый передачей сигнала). В обычных условиях передача сигнала в конечном счете приводит к активации или ингибированию клеточных функций. Без связи с какой-либо теорией авторы полагают, что с С-белком взаимодействуют петля 1С-3 и карбоксильный конец рецептора.
Существуют также промискуитентные С-белки, которые связывают несколько классов СРСК с путем фосфолипазы С, такие как С15 или С16 (ОГГегшапгк & 81шоп, 1. Вю1 СНеш (1995), 270:15175-80), или химерные С-белки, способные связывать большое число разных СРСВ с одним путем, например, с путем фосфолипазы С (МШщап & Веек, ТгепЛ ш Рйагшасеи11са1 8с1епсек (1999), 20:118-24).
В физиологических условиях присутствующие в клеточной мембране СРСВ находятся в состоянии равновесия между двумя разными конформациями: соответствующими неактивному состоянию и активному состоянию. Рецептор в неактивном состоянии не способен связываться с внутриклеточным путем передачи сигнала и инициировать передачу сигнала, приводящую к биологическому ответу. Изменение конформации рецептора на конформацию, соответствующую активному состоянию, обеспечивает соединение с путем передачи сигнала (через С-белок) и последующий биологический ответ.
Активное состояние рецептора можно стабилизировать с помощью лиганда или соединения, такого как лекарственное средство. Сделанные в последнее время открытия, включающие в себя, без ограничения, модификации аминокислотной последовательности рецептора, представляют способы придания рецептору конформации активного состояния и стабилизации ее без применения лигандов и лекарственных средств. Данные способы позволяют эффективно стабилизировать рецептор в активном состоянии путем имитации эффекта связывания лиганда с рецептором. Стабилизацию с помощью таких лиганднезависимых способов называют конститутивной активацией рецептора.
- 2 016041
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к неожиданному открытию, сделанному авторами данного изобретения, которое заключается в том, что введение агониста СРК119 субъекту, например пероральное введение, может влиять на рецептор СРК119, увеличивая уровень С1Р у субъекта. Настоящее изобретение описывает способы применения СРК119 для идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, а также соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта. Агонист СРК119 можно использовать для стимуляции (например, увеличения) костеобразования у субъекта. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий полипептид СРК.119, описана в 8ЕО ΙΌ N0: 1. Аминокислотная последовательность человеческого полипептида СРК119, кодируемая вышеуказанной нуклеотидной последовательностью, описана в 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В первом аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) приведение тестируемого соединения в контакт с клеткой-хозяином, или с мембраной клеткихозяина, содержащей С-белок-сопряженный рецептор, где С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ΐϊϊ) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из образца человеческой ДНК с использованием специфических праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4;
(ν) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕС ΙΌ N0: 1;
(νί) варианта 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(νίί) аминокислотной последовательности (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента последовательности по любому из пунктов (ί)-(νίίί); и (b) определение способности тестируемого соединения стимулировать функционирование С-белок-сопряженного рецептора;
где способность тестируемого соединения стимулировать функционирование С-белоксопряженного рецептора указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕС ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8 ЕС ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8ЕС ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации средств, усиливающих секрецию СТР.
В некоторых воплощениях способ включает в себя идентификацию агониста рецептора.
В некоторых воплощениях способ включает в себя идентификацию частичного агониста рецептора.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, которые
- 3 016041 можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(б) приведение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), в контакт ίη νίΐτο с энтероэндокринной клеткой позвоночного, или с клеткой, способной секретировать С1Р; и (е) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать С1Р;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать С1Р, указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию С1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8опбЫ е1 а1., Рйагшасодепошюк 1. (2006), 6:131140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать С1Р, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью придания способности секретировать С1Р.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(б) введение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), позвоночному; и (е) определение того, увеличивает ли соединение уровень С1Р у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень С1Р у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию С1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию общего С1Р в крови или плазме. В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию биоактивного С1Р в крови или плазме.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(б) введение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), позвоночному; и (е) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы у позвоночного. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы проводят методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΆ). В некоторых воплощениях указан
- 4 016041 ное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе с помощью ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог1б Неайй Огдашхабоп Тесйшса1 Верой 8епе5 921 (2003), Ргеуепйоп апб Мападетеп! о! Об1еорого818).
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(б) необязательно предоставление соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(е) приведение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), в контакт ш νίΙΐΌ с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать О1Р; и (!) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию О1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОГР;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию ОГР энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОГР, указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8опбЫ е! а1., Рйагтасодепоткб 1. (2006), 6:131-140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать ОГР, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью придания способности секретировать ОГР.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(б) необязательно предоставление соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(е) введение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), позвоночному; и (!) определение того, увеличивает ли соединение уровень ОГР у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень ОГР у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень ОГР представляет собой концентрацию общего ОГР в крови или плазме. В некоторых воплощениях уровень ОГР представляет собой концентрацию биоактивного ОГР в крови или плазме.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением ко
- 5 016041 стной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а) и (Ь), описанные в первом аспекте, а также следующие стадии:
(с) необязательно синтез соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(0) необязательно предоставление соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь);
(е) введение соединения, стимулирующего функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), позвоночному; и (1) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы субъекта. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы включает в себя измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе методом ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог14 НеаИй ОгдашхаОоп Тес1ииса1 Верой 8епе5 921 (2003), РгеуеШюп ап0 Мападешеп! оГ ОйеорогоДк).
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях идентифицированное средство, усиливающее секрецию О1Р, или идентифицированное соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или идентифицированное соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта, представляет собой агонист рецептора. В некоторых воплощениях агонист представляет собой частичный агонист.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор связан с О-белком. В некоторых воплощениях активация О-белок-сопряженного рецептора увеличивает уровень внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях О-белок представляет собой О§.
В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую геномную ДНК.
В некоторых воплощениях полимеразная цепная реакция представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Методы ОТ-ПЦР хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую кДНК. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческой ткани, экспрессирующей ОРК.119. В некоторых воплощениях человеческая ткань, которая экспрессирует ОРК.119, представляет собой поджелудочную железу или панкреатический островок. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческих клеток, экспрессирующих ОРК.119. В некоторых воплощениях кДНК получают из бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых воплощениях кДНК получают из линии клеток поджелудочной железы.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой 8ЕО ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
- 6 016041
В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации включают в себя гибридизацию при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ ЫаС1, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 1,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК из молок лосося, с последующим промыванием при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С. Способы проведения гибридизации хорошо известны квалифицированным специалистам.
В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ΙΌ N0: 1, представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ОРСК. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор является частью гибридного белка, включающего в себя О-белок. Способы получения гибридной конструкции ОРСК:О хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, международную заявку \У0 02/42461).
В некоторых воплощениях клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, в состав которого входит полинуклеотид, кодирующий О-белок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях вектор экспрессии представляет собой рСМУ. Данный вектор помещен в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 13 октября 1998 г. (10801 Ишуегайу Β1νά., Мапаззаз, УЛ 20110-2209 И8Л) в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. В АТСС проведен анализ ДНК, который показал, что она является жизнеспособной. АТСС присвоила рСМУ следующий номер депонирования: АТСС #203351. Рядовым специалистам в данной области хорошо известно, что можно использовать и другие подходящие векторы экспрессии, многие из которых являются коммерчески доступными (например, от С1оп1ес11. Ра1о Л11о. СА; 8ба1адепе, Ьа 1о11а, СА; и Ιηνίΐτο^η, СайзЬаб, СА).
В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку позвоночного. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях клетка-хозяин млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клетки 293, клетки 293Т, клетки СНО, клетки МСВ3901 и клетки С08-7. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой меланофор. Рядовым специалистам в данной области хорошо известны и другие подходящие клетки-хозяева, причем широкий ряд клеточных линий можно приобрести в Американской коллекцию типовых культур, 10801 ипКегвйу Вои^агб, Мапаззаз, УА 20110-2209.
В некоторых воплощениях в указанном определении в качестве О-белок-сопряженного рецептора используют Оз-сопряженный рецептор.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят с использованием О-белоксопряженного рецептора, который через промискуитентный О-белок, такой как Оа15 или Оа16, соединен с путем фосфолипазы С. Промискуитентные О-белки хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, 0йегтаппз е1 а1., 1. ΒίοΙ. Сйет. (1995), 270:15175-15180). В некоторых воплощениях указанное определение проводят с использованием О-белок-сопряженного рецептора, который че
- 7 016041 рез химерный С-белок соединен, например, с путем фосфолипазы С. Химерные С-бслки хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, МШЦап с1 а1., Тгепбк ίη Рйагшасеийса1 Бшепсек (1999), 20:118-124; АО 02/42461).
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем измерения уровня вторичного мессенджера.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем измерения уровня вторичного мессенджера, выбранного из группы, состоящей из циклического АМФ (цАМФ), циклического ГМФ (цГМФ), инозитол 1,4,5-трифосфата (1Р3), диацилглицерина (ΌΑΟ), МАР-киназной активности, активности киназы МАРК/ЕРК 1 (МЕКК1) и Са2+. В некоторых предпочтительных воплощениях вторичный мессенджер представляет собой цАМФ. В некоторых воплощениях уровень внутриклеточного цАМФ повышается.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят с использованием мембраны, содержащей С-белок-сопряженный рецептор.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем анализа меланофоров. В некоторых воплощениях уровень диспергирования пигмента увеличивается.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем анализа репортера. В некоторых воплощениях указанный анализ репортера представляет собой анализ репортера СРЕ-Ьис.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем измерения активности, опосредованной увеличением уровня внутриклеточного цАМФ.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем анализа репортера СРЕ-Ьис. В некоторых воплощениях уровень активности люцеферазы повышается.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят путем измерения связывания ГТФуБ с мембраной, содержащей С-белок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях указанный ГТФу8 метят [358]. В некоторых воплощениях связывание указанного ГТФуБ с мембраной, содержащей СРСР, увеличивается.
В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом или липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид при условии, что полипептид не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой липид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного определения структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного предоставления названия или структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ дополнительно включает в себя стадию необязательного получения или синтеза средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях указанный способ дополнительно включает в себя стадию получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
Во втором аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(а) приведение соединения, идентифицированного по способу первого аспекта, с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать С1Р, в контакт ίη νίΐτο; и
- 8 016041 (Ь) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОГР;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать С1Р. дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8опбЫ с1 а1., Рйагтасодепот1С8 1. (2006), 6:131140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать ОГР, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью секреции С1Р.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) введение позвоночному соединения, причем указанное соединение идентифицировано способом по первому аспекту и (b) определение того, увеличивает ли соединение уровень С1Р у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень С1Р у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме общего С1Р. В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме биоактивного С1Р. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) введение позвоночному соединения, причем указанное соединение идентифицировано способом по первому аспекту и (b) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного; где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме общего С1Р. В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме биоактивного С1Р.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы у позвоночного. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы проводят методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΆ). В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе с помощью ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог1б НеаИй Огдашхайоп Тесйшса1 Верой 8епе5 921 (2003), РгеуепБоп апб МападешепГ о! Ойеорогощк). В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное
- 9 016041 от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом или липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид при условии, что полипептид не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой липид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В третьем аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) приведение агониста ОРЯ119 с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать С1Р, в контакт ίη νίΐτο и (b) определение того, действительно ли агонист ОРЯ 119 стимулирует секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать О1Р;
где способность агониста ОРЯ119 стимулировать секрецию О1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать О1Р, указывает на то, что агонист ОРЯ119 представляет собой средство, усиливающее секрецию О1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8опбЫ е1 а1., Рйагшасодепошюк ί. (2006), 6:131140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать О1Р, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью секреции О1Р.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) введение агониста ОРЯ119 позвоночному и (b) определение того, действительно ли агонист ОРЯ119 увеличивает уровень О1Р у позвоночного;
где способность агониста ОРЯ119 увеличивать уровень О1Р у позвоночного указывает на то, что агонист ОРЯ119 представляет собой средство, усиливающее секрецию О1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень О1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме общего О1Р. В некоторых воплощениях уровень О1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме биоактивного О1Р.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) введение агониста ОРЯ119 позвоночному и (b) определение того, действительно ли агонист ОРЯ119 увеличивает уровень костной массы у по
- 10 016041 звоночного;
где способность агониста ОРК119 увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что агонист СРК119 представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме общего С1Р. В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию в крови или плазме биоактивного С1Р.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы у позвоночного. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы проводят методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΆ). В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе с помощью ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, №от1б НеаНИ Огдашхабоп Тесйшеа1 Верой 8епе5 921 (2003), Ртеуепбоп апб Мападетеп! οί О51еорото515). В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях агонист ОРК.119 представляет собой агонист эндогенного ОРК119.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 представляет собой агонист человеческого ОРК119.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 представляет собой частичный агонист ОРК119.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 представляет собой селективный агонист ОРК119.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях низкомолекулярное соединение не является полипептидом. В некоторых воплощениях низкомолекулярное соединение не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях низкомолекулярное соединение не является липидом. В некоторых воплощениях низкомолекулярное соединение не является полипептидом или липидом.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 является доступным при пероральном введении.
В некоторых воплощениях агонист ОРК119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях агонист ОРК119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ при взаимодействии с человеческим ОРК119, имеющим последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях агонист ОРК119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ по данным аденилатциклазного анализа, проводимого с использованием человеческого ОРК119, имеющего последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2 (типичный аденилатциклазный анализ описан ниже в примерах 7 и 8). В некоторых воплощениях агонист ОРК119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ по данным анализа меланофоров, проводимого с использованием человеческого ОРК119, имеющего последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2 (типичный анализ меланофоров описан ниже в примере 9).
Примеры агонистов ОРК119 раскрыты, например, в международной заявке РСТ/и82004/001267
- 11 016041 (опубликованной как XV0 04/065380); международной заявке РСТ/Б82004/005555 (опубликованной как XV0 04/076413); международной заявке РСТ/и 82004/022327 (опубликованной как XV 0 05/007647); международной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как XV0 05/007658); международной заявке РСТ/Б82005/019318 (опубликованной как ν0 2005/121121); международной заявке РСТ/СВ2004/050046 (опубликованной как XV0 2005/061489); международной заявке РСТ/и806/00567 (опубликованной как XV0 2006/083491); международной заявке РСТ/СВ2005/050264 (опубликованной как XV0 2006/067531); международной заявке РСТ/СВ2005/050265 (опубликованной как ^0 2006/067532); международной заявке РСТ/СВ2005/050266 (опубликованной как XV0 2006/070208); международной заявке
РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как ^0 03/026661); международной заявке РСТ/1Р2005/018412 (опубликованной как XV0 06/040966); международной заявке РСТ/1Р2005/019000 (опубликованной как XV0 2006/043490); международной заявке РСТ/СВ2006/050176 (опубликованной как XV0 2007/003960); международной заявке РСТ/СВ2006/050177 (опубликованной как ^0 2007/003961); международной заявке РСТ/СВ2006/050178 (опубликованной как XV0 2007/003962); международной заявке
РСТ/СВ2006/050182 (опубликованной как XV0 2007/003964) и международной заявке РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как ^0 03/026661).
В некоторых воплощениях способ включает в себя предоставление агониста СРК119. В некоторых воплощениях агонист СРК119 можно идентифицировать с помощью способа, описанного в первом аспекте.
В некоторых воплощениях способ включает в себя проведение способа, описанного в первом аспекте, с целью идентификации агониста СРК119.
В некоторых воплощениях способ включает в себя идентификацию агониста СРК119 с помощью способа, описанного в первом аспекте.
В четвертом аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию СР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) приведение С-белок-сопряженного рецептора в контакт с необязательно меченым известным лигандом рецептора в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, где С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(ΐϊϊ) аминокислот 2-335 8ЕО ΙΌ N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕО ΙΌ N0: 3 и 8ЕО ΙΌ N0: 4;
(ν) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е6) ΙΌ N0: 1;
(νί) варианта 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(νίί) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере на 80% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента последовательности по любому из пунктов (ί)-(νίίί);
(b) детекция комплекса указанного известного лиганда с указанным рецептором; и (c) определение того, действительно ли в присутствии тестируемого соединения образуется меньше указанного комплекса, чем в отсутствие тестируемого соединения; где указанное определение указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е6) ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 Ш N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8Е0 ΙΌ N0: 2.
- 12 016041
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой лиганд или агонист эндогенного рецептора СРВ119 позвоночного, млекопитающего или человека. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой известный агонист эндогенного рецептора СРК119 позвоночного, млекопитающего или человека. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой лиганд или агонист эндогенного человеческого рецептора СРР119. В некоторых воплощениях известный лиганд идентичен соединению, раскрытому, например, в международной заявке РСТ/и82004/001267 (опубликованной как XVО 04/065380); международной заявке РСТ/И82004/005555 (опубликованной как XVО 04/076413); международной заявке РСТ/И82004/022327 (опубликованной как XVО 05/007647); международной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как XVО 05/007658); международной заявке РСТ/И82005/019318 (опубликованной как ^О 2005/121121); международной заявке РСТ/СВ2004/050046 (опубликованной как XVО 2005/061489); международной заявке РСТ/и 806/00567 (опубликованной как XVО 2006/083491); международной заявке РСТ/СВ2005/050264 (опубликованной как XVО 2006/067531); международной заявке РСТ/СВ2005/050265 (опубликованной как ^О 2006/067532); международной заявке РСТ/СВ2005/050266 (опубликованной как XV О 2006/070208); международной заявке
РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как ^О 03/026661); международной заявке РСТ/1Р2005/018412 (опубликованной как XVО 06/040966); международной заявке РСТ/ДР2005/019000 (опубликованной как ^О 2006/043490); международной заявке РСТ/СВ2006/050176 (опубликованной как ^О 2007/003960); международной заявке РСТ/СВ2006/050177 (опубликованной как XVО 2007/003961); международной заявке РСТ/СВ2006/050178 (опубликованной как ^О 2007/003962); международной заявке РСТ/СВ2006/050182 (опубликованной как ^О 2007/003964) или международной заявке РСТ/ДР02/09350 (опубликованной как XVО 03/026661). В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой эндогенный лиганд эндогенного рецептора СРР119 позвоночного, млекопитающего или человека.
В некоторых воплощениях необязательно меченый известный лиганд представляет собой меченый известный лиганд. В некоторых воплощениях меченый известный лиганд представляет собой известный лиганд, меченный радиоактивным изотопом. Способы мечения соединения радиоактивным изотопом, такие как мечение известного лиганда С-белок-сопряженного рецептора, данного изобретения хорошо известны квалифицированным специалистам; см., например, международную заявку XVО 04/065380 и также, например, приведенный ниже пример 11.
Способы детекции комплекса С-белок-сопряженного рецептора с соединением, заведомо являющимся лигандом С-белок-сопряженного рецептора, хорошо известны квалифицированным специалистам; см., например, международную заявку ^О 04/065380 и также, например, приведенный ниже пример 12.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(ά) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) приведение соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса, с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать С1Р, в контакт ίη νίίτο; и (ί) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать С1Р;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию С1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать С1Р, указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию С1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см.,
- 13 016041 например, 8оибЫ е! а1., Рйагтасодепотьск ί. (2006), 6:131-140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать ОГР, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью секреции ОГР.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(б) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) введение позвоночному соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса; и (!) определение того, увеличивает ли соединение уровень ОГР у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень ОГР у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(б) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) введение позвоночному соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса; и (!) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы субъекта. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы включает в себя измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе методом ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог1б Неайй ОгдашхаПоп Тес11шса1 Верой 8епе5 921 (2003), Ргеуеийои апб Мападетеп! о! ОкГеорогоык). В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(б) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) необязательно предоставление соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(!) приведение соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса, с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать ОГР, в контакт ш уйго; и (д) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию ОГР энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОГР;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию ОГР энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОГР, указывает на то, что тестируемое соедине
- 14 016041 ние представляет собой средство, усиливающее секрецию О1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8оп0Ы е1 а1., Рйагшасодепошюк 1. (2006), 6:131-140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать О1Р, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью секреции О1Р.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(0) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) необязательно предоставление соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(Г) введение позвоночному соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса; и (д) определение того, увеличивает ли соединение уровень О1Р у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень О1Р у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию О1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя стадии (а)-(с) четвертого аспекта, а также следующие стадии:
(0) необязательно синтез соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(е) необязательно предоставление соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса;
(Г) введение позвоночному соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса; и (д) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы субъекта. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы включает в себя измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе методом ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог10 Неа1111 ОгдашхаНоп Тес1ииса1 Верой 8епе5 921 (2003), Ргеуепйоп ап0 МападешепЬ оГ Ойеорогой5). В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую геномную ДНК.
В некоторых воплощениях полимеразная цепная реакция представляет собой полимеразную цеп
- 15 016041 ную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Способы проведения ОТ-ПЦР хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую кДНК. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческой ткани, экспрессирующей СРВ 119. В некоторых воплощениях человеческая ткань, которая экспрессирует СРВ 119, представляет собой поджелудочную железу или панкреатический островок. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческих клеток, экспрессирующих СРВ119. В некоторых воплощениях кДНК получают из бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых воплощениях кДНК получают из линии клеток поджелудочной железы.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой 8ЕО ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации (например, условия высокой жесткости) включают в себя гибридизацию при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ №С1, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 1,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С. Способы гибридизации хорошо известны квалифицированным специалистам.
В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой СРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является частью гибридного белка, включающего в себя С-белок. Способы получения гибридной конструкции СРСВ:С хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, международную заявку ν0 02/42461).
В некоторых воплощениях указанное определение проводят с использованием клетки-хозяина, со
- 16 016041 держащей С-белок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, который, в свою очередь, содержит полинуклеотид, кодирующий СРСВ. В некоторых воплощениях вектор экспрессии представляет собой рСМУ. Данный вектор помещен в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 13 октября 1998 г. (10801 Итуегкйу В1уб., Маиаккак, УА 20110-2209 И8А) в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. В АТСС проведен анализ ДНК, который показал, что она является жизнеспособной. АТСС присвоила рСМУ следующий номер депонирования: АТСС #203351. Рядовым специалистам в данной области хорошо известно, что можно использовать и другие подходящие векторы экспрессии, многие из которых являются коммерчески доступными (например, от С1ои!есй, Ра1о А1!о, СА; 8!га!адеие, Ьа 1о11а, СА; и 1иуйгодеи, Саг1кЬаб, Са).
В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку позвоночного. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях клетка-хозяин млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клетки 293, клетки 293Т, клетки СНО, клетки МСВ3901 и клетки СО8-7. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой меланофор. Рядовым специалистам в данной области хорошо известны и другие подходящие клетки-хозяева, причем широкий ряд клеточных линий можно приобрести в Американской коллекцию типовых культур, 10801 Итуегкйу Вои1еуагб, Маиаккак, УА 20110-2209.
В некоторых воплощениях указанное определение проводят с использованием мембраны, содержащей С-белок-сопряженный рецептор.
В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом или липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид при условии, что полипептид не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой липид. В некоторых воплощениях тестируемое соединение не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного определения структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного предоставления названия или структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию необязательного получения или синтеза средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В пятом аспекте данное изобретение описывает способ скрининга тестируемых соединений с целью идентификации средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта, данный способ характеризуется применением Сбелок-сопряженного рецептора, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) аминокислот 1-335 8ЕЦ ΙΌ NО: 2;
(b) аминокислот 2-335 8ЕЦ ΙΌ NО: 2;
(c) аминокислот 2-335 8ЕЦ ΙΌ NО: 2, где СРСВ не содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ 2;
(б) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использо
- 17 016041 ванием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4;
(е) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО N0: 1;
(I) варианта 8ЕЦ ГО N0: 2;
(д) аминокислотной последовательности по пункту (Г), выбранной из группы, состоящей из:
(ί) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2; и (й) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 2;
(II) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО N0: 2; и (ί) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (а)-(1).
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой аллель 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях способ включает в себя идентификацию агониста рецептора.
В некоторых воплощениях способ включает в себя идентификацию частичного агониста рецептора.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В шестом аспекте данное изобретение описывает способ получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта, идентифицированных в соответствии с первым аспектом, вторым аспектом, третьим аспектом, четвертым аспектом или пятым аспектом.
В седьмом аспекте данное изобретение описывает применение С-белок-сопряженного рецептора, для скрининга тестируемых соединений как средств, усиливающих секрецию СГРз, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, где С-белоксопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) аминокислот 1-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(b) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(c) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2, где СРСР не содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 2;
(б) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4;
(е) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО N0: 1;
(Г) варианта 8ЕЦ ГО N0: 2;
(д) аминокислотной последовательности по пункту (Г), выбранной из группы, состоящей из:
(ί) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2; и (й) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 2;
(1) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО N0: 2; и (ί) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (а)-(1).
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ГО N0: 2.
- 18 016041
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение.
В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой агонист СРР119.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 представляет собой агонист эндогенного СРР119.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 представляет собой агонист человеческого СРР119.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 представляет собой частичный агонист СРР119.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 представляет собой селективный агонист СРР119.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 представляет собой низкомолекулярное соединение.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 является доступным при пероральном введении.
В некоторых воплощениях агонист СРР119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях агонист СРР119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ, при взаимодействии с человеческим СРР119, имеющим последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях агонист СРР119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ при взаимодействии с человеческим СРР119, имеющим последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, по данным аденилатциклазного анализа (типичный аденилатциклазный анализ описан ниже в примерах 7 и 8). В некоторых воплощениях агонист СРР119 имеет значение ЕС50 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 15 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ при взаимодействии с человеческим СРР119, имеющим последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, по данным анализа меланофоров (типичный анализ меланофоров описан выше в примере 9).
Примеры агонистов СРР119 раскрыты, например, в международной заявке РСТ/И82004/001267 (опубликованной как А0 04/065380); международной заявке РСТ/и82004/005555 (опубликованной как А0 04/076413); международной заявке РСТ/и82004/022327 (опубликованной как А0 05/007647); международной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как А0 05/007658); международной заявке РСТ/И82005/019318 (опубликованной как А0 2005/121121); международной заявке РСТ/СВ2004/050046 (опубликованной как А0 2005/061489); международной заявке РСТ/и806/00567 (опубликованной как А0 2006/083491); международной заявке РСТ/СВ2005/050264 (опубликованной как А0 2006/067531); международной заявке РСТ7СВ2005/050265 (опубликованной как А0 2006/067532); международной заявке РСТ/СВ2005/050266 (опубликованной как А0 2006/070208); международной заявке
РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как А0 03/026661); международной заявке РСТ/1Р2005/018412 (опубликованной как А0 06/040966); международной заявке РСТ/1Р2005/019000 (опубликованной как А0 2006/043490); международной заявке РСТ/СВ2006/050176 (опубликованной как А0 2007/003960); международной заявке РСТ/СВ2006/050177 (опубликованной как А0 2007/003961); международной заявке РСТ/СВ2006/050178 (опубликованной как А0 2007/003962); международной заявке
РСТ/СВ2006/050182 (опубликованной как А0 2007/003964) и международной заявке РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как А0 03/026661).
В восьмом аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию СГР, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(а) приведение соединения, которое стимулирует функционирование С-белок-сопряженного рецептора, где указанный С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
- 19 016041 (ΐ) аминокислот 1-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из образца человеческой ДНК с использованием специфических праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4;
(ν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ΙΌ N0: 1;
(νί) варианта 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(νίί) аминокислотной последовательности (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии О-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (ί)(νίίί); ίη νίίτο с энтероэндокринной клеткой позвоночного или с клеткой, способной секретировать ОГР, где указанное соединение определено или идентифицировано по способу первого аспекта; и (Ь) определение способности соединения стимулировать секрецию ОФ энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОФ;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию ОФ энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать ОФ, дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОФ, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8οηά1ιί е1 а1., Рйагтасодепотюз I. (2006), 6:131140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать ОФ, представляет собой клетку поджелудочной железы. Экспрессия ОФ в поджелудочной железе описана, например, в Х1е е1 а1., Вопе 2007. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать ОФ, представляет собой рекомбинантную клетку, полученную с целью секреции ОФ.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОФ, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(а) введение позвоночному соединения, которое стимулирует функционирование О-белоксопряженного рецептора, где указанный О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4;
(νίίί) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинук
- 20 016041 леотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО N0: 1;
(ίχ) варианта 8ЕЦ ГО N0: 2;
(χ) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (1)(νίίί);
где указанное соединение определено или идентифицировано по способу первого аспекта; и (Ь) определение того, увеличивает ли соединение уровень С1Р у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень СГР у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию С1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой аллель 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию общего С1Р в крови, в плазме или в сыворотке. В некоторых воплощениях уровень С1Р представляет собой концентрацию биоактивного С1Р в крови, в плазме или в сыворотке.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, соединений, пригодных для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(а) введение позвоночному соединения, которое стимулирует функционирование С-белоксопряженного рецептора, где указанный С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4;
(χί) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО N0: 1;
(χίί) варианта 8ЕЦ ГО N0: 2;
(χίίί) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (1)(νίίί);
где указанное соединение определено или идентифицировано по способу первого аспекта; и
- 21 016041 (Ь) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО N0: 2 представляет собой аллель 8Е0 ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО N0: 2 представляет собой ортолог 8Е0 ГО N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8Е0 ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы у позвоночного. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы проводят методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΆ). В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя в тазобедренном суставе с помощью ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, \Уог1б НеаНй 0гдашха1юп Тее11шеа1 Верой 8ег1ек 921 (2003), Ртеуепйоп апб Мападешеп! о£ 0к1еорогок1к).
В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую геномную ДНК.
В некоторых воплощениях полимеразная цепная реакция представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Способы проведения ОТ-ПЦР хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую кДНК. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческой ткани, экспрессирующей СРВ 119. В некоторых воплощениях человеческая ткань, которая экспрессирует СРВ 119, представляет собой поджелудочную железу или панкреатический островок. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческих клеток, экспрессирующих СРВ119. В некоторых воплощениях кДНК получают из бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых воплощениях кДНК получают из линии клеток поджелудочной железы.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой 8Е0 ГО N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой аллель 8Е0 ГО N0: 2. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации включают в себя гибридизацию при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ №С1, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК из молок лосося, с последующим промыванием при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С. Способы проведения гибридизации хорошо известны квалифицированным специалистам.
В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях
- 22 016041 высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, представляет собой аллель 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, представляет собой ортолог 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях СРСВ, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО N0: 1, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой СРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор является частью гибридного белка, включающего в себя С-белок. Способы получения гибридной конструкции СРСВ:С хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, международную заявку \У0 02/42461).
В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белоксопряженного рецептора, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является липидом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белоксопряженного рецептора, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом или липидом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой полипептид при условии, что полипептид не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белоксопряженного рецептора, представляет собой липид. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, стимулирующее функционирование С-белок-сопряженного рецептора, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного определения структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного предоставления названия или структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию необязательного получения или синтеза средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состоя
- 23 016041 ния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта в виде фармацевтического препарата.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию О1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В девятом аспекте данное изобретение описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию О1Р, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) приведение в контакт соединения, в присутствии которого образуется меньше комплекса Обелок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, где О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО N0: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4;
(ν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 81Т) ГО N0: 1;
(νί) варианта 8ЕЦ ГО N0: 2;
(νίί) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии О-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (1)(νίίί);
ίη νίύΌ с энтероэндокринной клеткой позвоночного, или с клеткой, способной секретировать О1Р, где указанное соединение определено или идентифицировано по способу четвертого аспекта; и (b) определение того, действительно ли соединение стимулирует секрецию О1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать О1Р;
где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию О1Р энтероэндокринной клеткой позвоночного или клеткой, способной секретировать О1Р, дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию О1Р, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 81Т) ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой аллель 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО N0: 2 представляет собой ортолог млекопитающих 8ЕЦ ГО N0: 2.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор является рекомбинантным.
В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка позвоночного представляет собой энтероэндокринную клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка представляет собой К-клетку. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани тонкого кишечника, обогащенной К-клетками. В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки (см., например, 8опбЫ е1 а1., Рйагшасодепошюк ί. (2006), 6:131140). В некоторых воплощениях энтероэндокринная клетка относится к линии энтероэндокринных клеток. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать О1Р представляет собой клетку поджелудочной железы. Экспрессия О1Р в поджелудочной железе описана, например, Х1е е1 а1., Вопе 2007. В некоторых воплощениях клетка, способная секретировать О1Р, представляет собой рекомбинантную
- 24 016041 клетку, полученную с целью секреции ОГР.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(a) введение позвоночному соединения, в присутствии которого образуется меньше комплекса Обелок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, где О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ΐ) аминокислот 1-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО ЫО: 3 и 8ЕЦ ГО ЫО: 4;
(νίίί) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1;
(ίχ) варианта 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(χ) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8ЕЦ ГО ЫО: 2; и (Ь') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии О-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8ЕЦ ГО ЫО: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (1)(νίίί);
где указанное соединение определено или идентифицировано по способу четвертого аспекта; и (b) определение того, увеличивает ли соединение уровень ОГР у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень ОГР у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
Данное изобретение также описывает способ идентификации средств, усиливающих секрецию ОГР, соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
(а) введение позвоночному соединения, в присутствии которого образуется меньше комплекса Обелок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, где О-белок-сопряженный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислот 1-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ГО ЫО: 2 при условии, что рецептор не содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(ίν) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ГО ЫО: 3 и 8ЕЦ ГО ЫО: 4;
(χί) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1;
(χίί) варианта 8ЕЦ ГО ЫО: 2;
(χίίί) аминокислотной последовательности по пункту (νί), выбранной из группы, состоящей из:
(а') аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей
- 25 016041 мере приблизительно на 80% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 2; и (Ь1) аминокислотной последовательности О-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(νίίί) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии О-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ίχ) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (1)(νίίί);
где указанное соединение определено или идентифицировано по способу четвертого аспекта; и (Ь) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного;
где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ОГР, соединение, пригодное для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединение, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное или млекопитающее представляет собой крысу или мышь с удаленными яичниками.
В некоторых воплощениях указанное определение включает в себя измерение уровня костной массы у позвоночного. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы включает в себя измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение уровня костной массы методом ΌΧΆ включает в себя измерение Т-показателя методом ΌΧΆ. В некоторых воплощениях указанное измерение Т-показателя методом ΌΧΆ включает в себя измерение Тпоказателя в тазобедренном суставе методом ΌΧΆ. Очевидно, что указанное измерение уровня костной массы можно осуществлять с помощью метода, отличного от ΌΧΆ, такого как моноэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (8ΧΆ) (см., например, №от1б НеаИй 0гдашхаиоп Тее11шеа1 Верой 8епе8 921 (2003), РгетепПоп апб Мападетеп! о£ 081еорото818). В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека позвоночное. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой отличное от человека млекопитающее.
В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую геномную ДНК.
В некоторых воплощениях полимеразная цепная реакция представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Способы проведения ОТ-ПЦР хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях образец человеческой ДНК представляет собой человеческую кДНК. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческой ткани, экспрессирующей ОРК 119. В некоторых воплощениях человеческая ткань, которая экспрессирует ОРК 119, представляет собой поджелудочную железу или панкреатический островок. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческих клеток, экспрессирующих ОРК119. В некоторых воплощениях кДНК получают из бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых воплощениях кДНК получают из линии клеток поджелудочной железы.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации включают в себя гибридизацию при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ №С1, 15 мМ тринатрия цитрат),
- 26 016041 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК из молок лосося, с последующим промыванием при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С. Способы проведения гибридизации хорошо известны квалифицированным специалистам.
В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, представляет собой 8Еф ГО N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, представляет собой аллель 8Еф ГО N0: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, представляет собой ортолог 8Еф ГО N0: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-йл}амин. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ГО N0: 1, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях вариант 8Еф ГО N0: 2 представляет собой ОРСК. В некоторых воплощениях вариант 8Еф ГО N0: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Еф ГО N0: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Еф ГО N0: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях О-белок-сопряженный рецептор является частью гибридного белка, включающего в себя О-белок. Способы получения гибридной конструкции ОРСК:О хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, международную заявку \У0 02/42461).
В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса Обелок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение при условии, что оно не является полипептидом или липидом. В некоторых воплощениях тестируемое соединение представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой полипептид при условии, что полипептид не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой липид. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, не является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях соединение, в присутствии которого образуется меньше комплекса О-белок-сопряженного рецептора с необязательно меченым известным лигандом рецептора, чем в отсутствие соединения, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
- 27 016041
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося снижением костной массы.
В некоторых воплощениях способ представляет собой способ идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой лиганд или агонист эндогенного рецептора СРЯ119 позвоночного, млекопитающего или человека. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой известный агонист эндогенного рецептора СРК119 позвоночного, млекопитающего или человека. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой лиганд или агонист эндогенного рецептора СРК119 человека. В некоторых воплощениях известный лиганд идентичен соединению, раскрытому, например, в международной заявке РСТ/и82004/001267 (опубликованной как ^О 04/065380); международной заявке РСТ/и82004/005555 (опубликованной как ^О 04/076413); международной заявке РСТ/и82004/022327 (опубликованной как ^О 05/007647); международной заявке РСТ/и82004/022417 (опубликованной как ^О 05/007658); международной заявке РСТ/И82005/019318 (опубликованной как ^О 2005/121121); международной заявке РСТ/СВ2004/050046 (опубликованной как ^О 2005/061489); международной заявке РСТ/И806/00567 (опубликованной как ^О 2006/083491); международной заявке РСТ/СВ2005/050264 (опубликованной как ^О 2006/067531); международной заявке РСТ/СВ2005/050265 (опубликованной как ^О 2006/067532); международной заявке РСТ/СВ2005/050266 (опубликованной как ^О 2006/070208); международной заявке РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как ^О 03/026661); международной заявке РСТ/1Р2005/018412 (опубликованной как ^О 06/040966); международной заявке РСТ/1Р2005/019000 (опубликованной как ^О 2006/043490); международной заявке РСТ/СВ2006/050176 (опубликованной как ^О 2007/003960); международной заявке РСТ/СВ2006/050177 (опубликованной как ^О 2007/003961); международной заявке РСТ/СВ2006/050178 (опубликованной как ^О 2007/003962); международной заявке РСТ/СВ2006/050182 (опубликованной как ^О 2007/003964); или международной заявке РСТ/1Р02/09350 (опубликованной как ^О 03/026661). В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6[4-(3-изопропил [1,2,4] оксадиазол-5 -ил)пиперидин-1 -ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях известный лиганд представляет собой эндогенный лиганд эндогенного рецептора СРК119 позвоночного, млекопитающего или человека.
В некоторых воплощениях необязательно меченый известный лиганд представляет собой меченый известный лиганд. В некоторых воплощениях меченый известный лиганд представляет собой известный лиганд, меченный радиоактивным изотопом. Способы мечения соединения радиоактивным изотопом, такие как мечение известного лиганда С-белок-сопряженного рецептора, данного изобретения хорошо известны квалифицированным специалистам; см., например, международную заявку ^О 04/065380 и также, например, приведенный ниже пример 11.
Способы детекции комплекса С-белок-сопряженного рецептора с соединением, заведомо являющимся лигандом С-белок-сопряженного рецептора, хорошо известны квалифицированным специалистам; см., например, международную заявку ^О 04/065380 и также, например, приведенный ниже пример 12.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного определения структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает в себя стадию необязательного предоставления названия или структуры средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию необязательного получения или синтеза средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта, в виде фармацевтического препарата.
В некоторых воплощениях указанный способ необязательно включает в себя стадию получения фармацевтической композиции на основе средства, усиливающего секрецию С1Р, соединения, пригодного для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, или соединения, которое можно использовать для увеличения костной массы субъекта.
- 28 016041
Краткое описание чертежей
Данное изобретение также иллюстрируется прилагающимися чертежами.
На фиг. 1 изображен фармакодинамический анализ влияния агониста ОРВ119 на уровень О1Р в крови мышей дикого типа. 1А. Динамический анализ, проводимый с использованием соединения 1 в качестве агониста ОРВ119. 1В. Динамический анализ, проводимый с использованием соединения 3 в качестве агониста ОРВ119. 1С. Дозо-титриметрический анализ, проводимый с использованием соединения 3 в качестве агониста ОРВ119.
На фиг. 2 показано влияние агониста ОРВ119 на уровень О1Р в крови ОРВ119-дефицитных (с нокаутом по гену ОРВ119) мышей по сравнению с мышами дикого типа. 2А. Сравнительный анализ проводят с использованием соединения 1 в качестве агониста ОРВ119. 2В. Сравнительный анализ проводят с использованием соединения 2 в качестве агониста ОРВ119.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение описывает способы применения рецептора ОРВ119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта. Агонисты рецептора ОРВ119 можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, а также для увеличения костной массы субъекта. Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, отчасти, на неожиданном открытии, сделанном заявителем, которое заключается в том, что введение агониста ОРВ119 субъекту, такое как пероральное введение, может влиять на рецептор ОРВ119, увеличивая уровень О1Р у субъекта.
Термин лиганд в данном описании относится к молекуле (например, тестируемого соединения), которая специфически связывается с полипептидом, таким как ОРВ119. Лиганд может представлять собой, например, полипептид, липид, низкомолекулярное соединение, антитело. Соединение 1 является типичным лигандом полипептида рецептора ОРВ119 (химическая структура и химическое название соединения 1 приведены в таблице А). Соединение 1 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/001267 (опубликованной как Ж') 2004/065380). (2-Фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин (см. табл. А) является типичным лигандом полипептида рецептора ОРВ119. Соединение 2 является типичным лигандом полипептида рецептора ОРВ119. Соединение 2 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как
Ж') 2005/007658). Соединение 3 является типичным лигандом полипептида рецептора ОРВ119. Соединение 3 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022327 (опубликованной как Ж') 2005/007647). Эндогенный лиганд представляет собой лиганд, который является эндогенным, природным лигандом нативного полипептида, такого как ОРВ119. Лиганд может представлять собой антагонист, агонист, частичный агонист, обратный агонист или т.п.
Термин агонист в данном описании относится к средству (например, лиганду, тестируемому соединению), которое, связываясь с ОРСВ, активирует его и инициирует внутриклеточный ответ, опосредованный ОРСВ.
Термин частичный агонист в данном описании относится к средству (например, лиганду, тестируемому соединению), которое, связываясь с ОРСВ, активирует его и инициирует внутриклеточный ответ, опосредованный ОРСВ, но в меньшей степени, или на более низком уровне, чем полный агонист.
Термин антагонист относится к средству (например, лиганду, тестируемому соединению), которое связывается, предпочтительно конкурентно, с ОРСВ приблизительно по тому же участку, что и агонист или частичный агонист, но не вызывает внутриклеточный ответ, инициируемый активной формой ОРСВ, и, следовательно, может ингибировать внутриклеточный ответ под действием агониста или частичного агониста. Антагонист обычно не уменьшает фоновый внутриклеточный ответ в отсутствие агониста или частичного агониста.
Термин обратный агонист относится к средству (например, лиганду, тестируемому соединению), которое связывается с ОРСВ и уменьшает фоновый внутриклеточный ответ, инициируемый активной
- 29 016041 формой рецептора, до уровня ниже нормальной базовой активности, наблюдающейся в отсутствие агониста или частичного агониста.
Термин агонист СРК119 в данном описании относится к соединению, которое связывается с рецептором СРК119 и действует как агонист. Соединение 1 является примером агониста СРК119 (химическая структура и химическое название соединения 1 приведены в табл. А). Соединение 1 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/001267 (опубликованной как ^0 2004/065380). (2-Фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин является примером агониста СРК119. Соединение 2 является примером агониста СРК119. Соединение 2 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как ^0 2005/007 658). Соединение 3 является примером агониста СРК119. Соединение 3 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/Б82004/022327 (опубликованной как ^0 2005/007647).
Термин селективный агонист СРК119 в данном описании относится к агонисту СРК119, обладающему избирательностью по отношению к рецептору СРК119 по сравнению с одним или несколькими родственными рецепторами, такими как рецептор кортикотропин-рилизинг фактора-1 (СКТ-1). Соединение 1 является примером селективного агониста СРК119 (химическая структура и химическое название соединения 1 приведены в табл. А). Соединение 1 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/0012 67 (опубликованной как ^0 2004/065380). (2-Фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин является примером селективного агониста СРК119. Соединение 2 является примером селективного агониста СРК119. Соединение 2 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как ^0 2005/007658). Соединение 3 является примером селективного агониста СРК119. Соединение 3 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022327 (опубликованной как ^0 2005/007647).
Термин средство, усиливающее секрецию СТР относится к средству (например, лиганду, тестируемому соединению), которое стимулирует секрецию СТР в клетке, например в энтероэндокринной клетке, или которое, увеличивает уровень общего СТР, например уровень общего СТР в крови или плазме, при введении субъекту, такому как позвоночное или млекопитающее. В некоторых воплощениях средство, усиливающее секрецию СТР, представляет собой соединение, подходящее для увеличения уровня общего СТР у субъекта, например уровня общего СТР в крови или плазме.
Термин субъект в данном описании относится к позвоночному и включает в себя, без ограничения, рыб (таких как разводимые с коммерческой целью рыбы, комнатные рыбы и др.), амфибий (таких как лягушки, жабы, домашние амфибии и др.), рептилий (таких как змеи, ящерицы, черепахи, домашние рептилии и др.), птиц (таких как куры, индейки, домашние птицы и др.) и млекопитающих (таких как мыши, крысы, хомяки, кролики, свиньи, собаки, кошки, лошади, коровы, овцы, козы, отличные от человека приматы, отличные от человека млекопитающие, отличные от человека домашние млекопитающие, люди и др.). В некоторых воплощениях субъект представляет собой рыбу. В некоторых воплощениях субъект представляет собой амфибию. В некоторых воплощениях субъект представляет собой рептилию. В некоторых воплощениях субъект представляет собой птицу. В некоторых воплощениях субъект представляет собой индейку. В течение последних 25 лет давление коммерческой селекции, направленное на выведение индеек с повышенной массой грудной мышцы, обусловливает возрастание требований по целостности скелета. Однако поскольку повышение массы грудной мышцы не сопровождается компенсаторными изменениями скелета, оно приводит к увеличению проблем, связанных с ногами. Описаны случаи переломов длинной трубчатой кости у молодых взрослых самцов индеек (см., например, Сгезро с1 а1., Рои11 8с1 (2000), 79:602-608). В некоторых воплощениях субъект представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях субъект представляет собой мышь, крысу, хомяка, кролика, свинью, собаку, кошку, лошадь, корову, овцу, козла, отличного от человека примата или человека (которые могут быть включены в воплощения данного изобретения по отдельности или в любых сочетаниях). В некоторых воплощениях субъект представляет собой лошадь. У лошадей для выступлений, участвующих в скачках, выездке и других видах соревнований, часто бывают переломы костей. В некоторых воплощениях субъект представляет собой собаку или кошку. В некоторых воплощениях субъект представляет собой животное-компаньона человека (такое как собака, кошка и др.), сельскохозяйственное животное (такое как корова, овца, коза, свинья, курица и др.), спортивное животное (такое как лошадь, собака и др.), вьючное животное (такое как мул, верблюд и др.) или экзотическое животное (такие как животное, находящееся в зоопарке, и др.), которые могут быть включены в воплощения данного изобретения по отдельности или в любых сочетаниях. В некоторых воплощениях субъект представляет собой отличное от человека млекопитающее. В некоторых воплощениях субъект представляет собой отличного от человека примата (такого как макак-резус, шимпанзе и др.). В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека.
Термин нуждающийся в профилактике или лечении в данном описании относится к субъекту, который по заключению лица, осуществляющего уход за больными (например, врача, медсестры, практикующей медсестры, если субъект представляет собой человека; ветеринара, если субъект представляет собой отличное от человека позвоночное, в конкретном воплощении отличное от человека млекопитаю
- 30 016041 щее), требует лечения или на которого лечение может оказать благоприятное воздействие.
Термин терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная доза в данном описании относится к количеству активного соединения или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский ответ в ткани, системе у животного, субъекта или человека, которого хочет достичь исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист, и который включает в себя один или несколько из следующих эффектов:
(1) профилактика заболевания; например профилактика заболевания, состояния или нарушения у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, состоянию или нарушению, но у которого еще не проявляется или не наблюдается патология или симптоматика заболевания;
(2) подавление заболевания, например подавление заболевания, состояния или нарушения у субъекта, у которого проявляется или наблюдается патология или симптоматика заболевания, состояния или нарушения (т.е. прекращение дальнейшего развития патологии и/или симптоматики), и (3) излечение заболевания; например излечение заболевания, состояния или нарушения у субъекта, у которого проявляется или наблюдается патология или симптоматика заболевания, состояния или нарушения (т. е. придание обратного хода патологии и/или симптоматики).
Термин терапевтическая эффективность в данном описании относится к получению биологического или медицинского ответа в ткани, системе у животного, субъекта или человека, которого хочет достичь исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист, и который включает в себя один или несколько из следующих эффектов:
(1) профилактика заболевания, например профилактика заболевания, состояния или нарушения у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, состоянию или нарушению, но у которого еще не проявляется или не наблюдается патология или симптоматика заболевания;
(2) подавление заболевания; например, подавление заболевания, состояния или нарушения у субъекта, у которого проявляется или наблюдается патология или симптоматика заболевания, состояния или нарушения (т.е. прекращение дальнейшего развития патологии и/или симптоматики), и (3) излечение заболевания; например излечение заболевания, состояния или нарушения у субъекта, у которого проявляется или наблюдается патология или симптоматика заболевания, состояния или нарушения (т. е. придание обратного хода патологии и/или симптоматики).
Термин количество, эффективное для профилактики относится к количеству лекарственного средства, предотвращающему или уменьшающему риск биологического или медицинского события, которое требуется предотвратить. Зачастую количество, эффективное для профилактики, равно терапевтически эффективному количеству.
Термин композиция относится к веществу, которое включает в себя по меньшей мере один компонент.
Термин активный ингредиент относится к любому компоненту, который обладает фармакологической активностью или оказывает другой непосредственный эффект, связанный с диагностикой, излечением, облегчением, лечением или профилактикой заболевания.
Термин фармацевтическая композиция относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один активный ингредиент, который позволяет использовать композицию для исследования и лечения млекопитающего.
Термин фармацевтически приемлемый относится к носителям, средам, разбавителям, наполнителям и/или солям, которые являются совместимыми с другими ингредиентами композиции и не оказывают вредного воздействия на реципиента.
Термин лекарственная форма относится к физической форме, содержащей лекарственное средство, такой как таблетка, капсула или препарат для инъекций.
Термин кость относится к плотной, полужесткой, пористой, кальцинированной соединительной ткани, образующей основную часть скелета большинства позвоночных, которая содержит плотную органическую основу и неорганические минеральные компоненты. Костью является любая из анатомически различных структур, составляющих скелет позвоночного.
Термины костная масса и минеральная плотность кости (МПК) в данном описании используются как взаимозаменяемые. МПК у людей обычно измеряют с помощью стандартного радиографического метода, двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΑ). Среди многих методов, разработанных для определения МПК, ΌΧΑ является самым совершенным в техническом отношении и наиболее проверенным с биологической точки зрения.
Метод ΌΧΑ с подходящим образом адаптированным программным обеспечением также можно использовать для надежного определения МПК у животных. ΌΧΑ используют при диагностике остеопороза, прогнозировании (предрасположенности к переломам), регистрации естественной истории нарушения и определения ответа на лечение.
Термин снижение костной массы в данном описании относится к любому уменьшению или снижению минеральной плотности кости (МПК) у субъекта и включает в себя как остеопороз, так и остеопению в соответствии с предложением Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ). По определению ВОЗ нормальному состоянию соответствует значение МПК, находящееся в пределах одной единицы
- 31 016041 стандартного отклонения от типичного значения молодого взрослого субъекта (Т-показатель >-1). ВОЗ определяет остеопению как состояние, при котором значение МПК ниже типичного значения для молодого взрослого субъекта более чем на 1 стандартное отклонение, но меньше чем на 2,5 стандартных отклонений (Т-показатель <-1 и >-2,5). ВОЗ классифицирует остеопороз как более тяжелую форму остеопении и определяет его как состояние, при котором значение МПК ниже типичного значения для молодого взрослого субъекта более чем на 2,5 стандартных отклонений (Т-показатель <-2,5) (см., например, \Уог1б Неайй 0гдашха1юп Тесйшса1 Керой 8епез 921 (2003), Ргеуепбоп апб Мападетеп! о£ 081еорого8щ, данная публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте). Чаще остеопению определяют как состояние, при котором Т-показатель меньше -1 и больше -2, а остеопороз определяют как состояние, при котором Т-показатель меньше или равен -2. В некоторых воплощениях настоящего изобретения Т-показатель измеряют в тазобедренном суставе методом ΌΧΑ.
Термин остеопороз в данном описании характеризуется значением МПК ниже типичного значения для молодого взрослого субъекта на 2 стандартных отклонения или более (Т-показатель <-2), или относится к диагнозу, установленному лицом, осуществляющим уход за больными (например, врачом, медсестрой, практикующей медсестрой, если субъект представляет собой человека; ветеринаром, если субъект представляет собой отличное от человека позвоночное).
Остеопороз можно классифицировать как первичный или вторичный (см., например, \Уог1б Неа1111 0гдашха1юп Тесйшса1 Керой 8епез 921 (2003), Ргеуепбоп апб Мападетеп! о£ 0з1еорого515). В данном описании термин остеопороз охватывает первичный остеопороз и вторичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз.
Первичный остеопороз в соответствии с данным описанием связан с менопаузой (естественной, преждевременной или хирургической), старением, или и с тем, и с другим. Следует понимать, что в настоящем изобретении первичный остеопороз, связанный с менопаузой (естественной, преждевременной или хирургической), первичный остеопороз, связанный со старением, и первичный остеопороз, связанный с менопаузой и со старением, может входить в объем воплощений по отдельности или в любых сочетаниях.
Вторичный остеопороз в данном описании относится к остеопорозу, который связан не с менопаузой или старением, а скорее с медицинскими состояниями или с применением медицинских препаратов или лекарственных средств. Повышенный риск остеопороза связан с множеством медицинских состояний, включающих в себя, без ограничения, эндокринные и метаболические нарушения и злокачественные заболевания, а также с применением некоторых медицинских препаратов и лекарственных средств, примеры которых хорошо известны специалистам в данной области (см., например, \Уог1б Неайй 0гдашха1юп Тесйшса1 Керой 8епез 921 (2003), РгеуеШюп апб Мападетеп! о£ 0з1еорого515; ХУбйатз Тех!Ьоок о£ Епбосппо1оду, 10'1' ЕбШоп; содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте). Вторичный остеопороз также может быть связан с уменьшением подвижности. Остеопороз, вторичный по отношению к медицинскому состоянию, применению медицинского препарата или лекарственного средства, или уменьшению подвижности, может диагностировать лицо, осуществляющее уход за больными (например, врач, медсестра, практикующая медсестра, если субъект представляет собой человека; ветеринар, если субъект представляет собой отличное от человека позвоночное).
Под переломом кости подразумевается полный или частичный разрыв, разлом или трещина кости. Диагностирование переломов обычно осуществляют на основе клинического обследования и результатов рентгенологического анализа. В данном изобретении переломы костей включают в себя, без ограничения, травматические переломы, долговременные переломы и патологические переломы.
Травматический перелом в данном описании относится к непосредственному перелому, который включает в себя надпороговую травму в результате приложения локального усилия, превышающего природную эластичность кости. Такой перелом может сопровождаться одновременным повреждением мягких тканей и очень часто кожи. Травматический перелом может быть закрытым (соседняя мягкая ткань может быть повреждена, но покрывные ткани в основном сохраняются). Травматический перелом может быть открытым (концы кости в месте перелома оголяются в результате экстенсивного повреждения мягкой ткани и патогены из внешней среды могут проникать непосредственно в рану).
Долговременный перелом в данном описании относится к хроническому перелому, усталостному перелому, маршевой стопе или спонтанному перелому типа Ι.
Патологический перелом в данном описании относится к спонтанному перелому типа ΙΙ. Патологический перелом возникает спонтанно, в отсутствие травмы, которая может быть его причиной. Кость может быть предварительно повреждена в результате системного заболевания (такого как остеопороз, остеодистрофия или деформирующий остит Педжета) или локального повреждения (такого как метастаз, лучевой остеонекроз или опухоль кости). См. Аб1ег, С1аи8-Ре1ег, В0НЕ ΌΙ8ΕΑ8Ε8, р. 114 (8рппдегУег1ад, Оегтапу 2000).
Переломы могут включать в себя, без ограничения, косой торсионный перелом, поперечный перелом, осколочный перелом, компрессионный перелом, перелом ребра, скользящий перелом и перелом
- 32 016041 шейки бедра (Аб1ег, С1аик-Ре1ег, В0Ж ΌΙ8ΒΑ8Β8, 8ргшдег-Уег1ад, Сегтапу (2000)).
В данном описании термин состояние, характеризующееся низкой костной массой включает в себя, без ограничения, остеопению, остеопороз, ревматоидный артрит, остеоартрит, периодонтальное заболевание, разрежение альвеолярной кости, остеотомическое разрежение кости, детское идиопатическое разрежение кости, искривление позвоночника и уменьшение массы. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с медицинским состоянием. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с применением медицинского препарата или лекарственного средства. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с уменьшением подвижности. Состояния, характеризующиеся снижением костной массы, также включают в себя, без ограничения, болезнь Педжета, разрежение кости вследствие метастатического рака и остеолитические повреждения, такие как повреждения, вызванные новообразованием, лучевой терапией или химиотерапией. Состояния, характеризующиеся снижением костной массы, также включают в себя, без ограничения, долгосрочные осложнения остеопороза, такие как искривление позвоночника, потеря массы и последствия протезной хирургии. Следует понимать, что состояния, характеризующиеся снижением костной массы, могут входить в объем воплощений настоящего изобретения по отдельности или в любых сочетаниях (см., например, Аог1б Неайй 0гдаш/абоп Тесйтса1 Рерой 8епек 921 (2003), РгетепПоп апб Мападетеп! οί 0к1еорогок1к; Абйатк ТехЛоок οί ЕпбосгшоЦду, 104й ЕбШоп, Ьагкеп е1 а1., Ебк (2002), А.В. 8аипбегк Сотрапу; и Епбосг1по1оду апб Ме1аЬойкт, 41й ЕбШоп, Рейд е! а1., Ебк (2001), МсСга^-НШ Воок Сотрапу; содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте).
В данном описании термин заболевание кости относится к нарушению или состоянию, связанному с аномалией кости. Заболевания костей, которые можно лечить с помощью способа данного изобретения путем увеличения костной массы или роста кости, включают в себя, без ограничения, остеопению, остеопороз, ревматоидный артрит, остеоартрит, периодонтальное заболевание, разрежение альвеолярной кости, остеотомическое разрежение кости, детское идиопатическое разрежение кости, искривление позвоночника и уменьшение массы. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с медицинским состоянием. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с применением медицинского препарата или лекарственного средства. В некоторых воплощениях вторичный остеопороз связан с уменьшением подвижности. Заболевания костей, которые можно лечить с помощью способа данного изобретения путем увеличения костной массы или роста кости, включают в себя, без ограничения, болезнь Педжета и разрежение кости вследствие метастатического рака. Деструктивные нарушения кости, которые можно лечить с помощью способа данного изобретения путем увеличения костной массы или роста кости, включают в себя, без ограничения, остеопороз, остеоартрит и остеолитические повреждения, такие как повреждения, вызванные новообразованием, лучевой терапией или химиотерапией. Следует понимать, что заболевания костей, которые можно лечить с помощью способа данного изобретения путем увеличения костной массы или роста кости, могут входить в объем воплощений настоящего изобретения по отдельности, или в любых сочетаниях (см., например, Аог1б Неайй 0гдашхайоп Тесйтса1 Керой 8епек 921 (2003), РгетепПоп апб Мападетеп! οί 0к1еорогок1к; Абйатк ТехЛоок οί Епбосг1по1оду, 101й Ебйюп, Ьагкеп е! а1., Ебк (2002), А.В. 8аипбегк Сотрапу; и ЕпбосгшоЦду апб Ме1аЬойкт, 41й Ебйюп, Рейд е! а1., Ебк (2001), МсСга^-НШ Воок Сотрапу; содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте).
Способы лечения настоящего изобретения путем повышения костной массы и роста кости также можно использовать для ускорения срастания кости после лицевой хирургии, верхнечелюстной хирургии, нижнечелюстной хирургии, периодонтального заболевания или удаления зуба, ускорения удлинения длинной кости, ускорения роста внутри протеза и ускорения сращения костей.
Термин эндогенный относится к веществу, которое в природе продуцирует субъект (например, без ограничения, человек). И наоборот, термин неэндогенный относится к веществу, которое субъект (например, без ограничения, человек) в природе не продуцирует.
Термин биологически активный фрагмент С-белок-сопряженного рецептора относится к фрагменту СРСР, выполняющему структурные и биохимические функции природного СРСР. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент сопряжен с С-белком. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент связывается с известным лигандом СРСР.
Термин праймер в данном описании относится к специфической нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой нуклеотидной последовательности, которая используется для гибридизации с целевой нуклеотидной последовательностью. Праймер обеспечивает точку инициации полимеризации нуклеотидов, катализируемой ДНК-полимеразой, РНК-полимеразой или обратной транскриптазой.
Термин вектор экспрессии относится к последовательности ДНК, необходимой для транскрипции клонированной ДНК и трансляции транскрибированной мРНК в подходящей рекомбинантной клеткехозяине, содержащей вектор экспрессии. Соответствующим образом сконструированный вектор экспрессии должен содержать точку начала репликации, обеспечивающую автономную репликацию в клетках-хозяевах, маркеры, облегчающие селекцию, небольшое число подходящих участков ферментативной
- 33 016041 рестрикции, последовательность, обеспечивающую высокое число копий, и активные промоторы. Входящая в состав вектора экспрессии и подлежащая транскрипции клонированная ДНК функционально связана с конститутивно активным промотором, или промотором, активность которого зависит от разных факторов.
Термин клетка-хозяин относится к клетке, способной содержать внедренный в нее вектор. В контексте настоящего изобретения вектор обычно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую СРСВ или гибридный белок СРСВ, функционально связанную с последовательностью подходящего промотора, чтобы обеспечить экспрессию СРСВ или гибридного белка СРСВ. В конкретном воплощении клеткахозяин представляет собой эукариотическую клетку. В некоторых воплощениях эукариотическая клеткахозяин представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых воплощениях эукариотическая клеткахозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях эукариотическая клеткахозяин представляет собой меланофор.
Термин контакт или приведение в контакт означает объединение по меньшей мере двух веществ.
Термины модулировать или модифицировать относятся к увеличению или уменьшению количества, качества или эффекта конкретной активности, функции или молекулы. В качестве иллюстрации, но без ограничения, агонисты, частичные агонисты, обратные агонисты и антагонисты С-белоксопряженного рецептора могут являться модуляторами рецептора. Термин низкомолекулярное соединение относится к соединению, имеющему молекулярную массу менее чем приблизительно 10000 г на моль, и включает в себя пептид, пептидомиметик, аминокислоту, аналог аминокислоты, полинуклеотид, аналог полинуклеотида, нуклеотид, аналог нуклеотида, органическое соединение или неорганическое соединение (например, включающее в себя гетероорганическое соединение или органометаллическое соединение), а также соли, сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые формы перечисленных соединений. В некоторых воплощениях низкомолекулярные соединения представляют собой органические или неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль. В некоторых воплощениях низкомолекулярные соединения представляют собой органические или неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем приблизительно 1000 г на моль. В некоторых воплощениях низкомолекулярные соединения представляют собой органические или неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем приблизительно 800 г на моль. В некоторых воплощениях низкомолекулярные соединения представляют собой органические или неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем приблизительно 600 г на моль. В некоторых воплощениях низкомолекулярные соединения представляют собой органические или неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем приблизительно 500 г на моль.
Сокращения, используемые в данном описании для обозначения аминокислот, приведены в табл. В.
Таблица В
Термин полипептид относится к полимеру из аминокислот, независимо от длины полимера. Так, определение полипептида охватывает пептиды, олигопептиды и белки. В объем данного термина также входят, хотя специально и не указываются, постэкспрессионные модификации полипептидов. Например,
- 34 016041 полипептиды, которые содержат ковалентно присоединенные гликозильные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, липидные группы и т.п., отдельно входят в объем термина полипептид.
Термин полинуклеотид относится к последовательности РНК, ДНК, или гибридной последовательности РНК/ДНК, содержащей более одного нуклеотида и находящейся в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Полинуклеотиды данного изобретения можно получить с помощью любого известного способа, включающего в себя синтетический способ, рекомбинантный способ, получение ех νίνο, или их сочетание, а также с использованием любых способов очистки, известных в данной области.
Термин антитело в данном описании охватывает моноклональное антитело и поликлональное антитело.
Термин вторичный мессенджер относится к внутриклеточному ответу, продуцируемому в результате активации рецептора. Вторичный мессенджер может включать в себя, например, инозитол 1,4,5трифосфат (1Р3), диацилглицерин (ЭЛС), циклический АМФ (цАМФ), циклический ГМФ (цГМФ), МАРкиназную активность, активность киназы-1 киназы МАРК/ЕКК (МЕКК1) и Са2+. Активацию рецептора можно определить путем измерения уровня вторичного мессенджера.
Термин функционирование рецептора относится к любой функции рецептора, выполняемой в ответ на получение стимула и опосредующей внутриклеточный эффект, которая включает в себя регуляцию транскрипции генов, регуляцию притока или оттока ионов, осуществление каталитической реакции и/или модулирование активности через С-белки, например, индуцирование ответа, опосредованного вторичным мессенджером.
Термин стимулировать или стимуляция в связи с терминами ответ или функционирование рецептора означает, что ответ или функционирование рецептора усиливается в присутствии соединения по сравнению с ответом или функционированием рецептора в отсутствие соединения.
Термин ингибировать или ингибирование в связи с терминами ответ или функционирование рецептора означает, что ответ или функционирование рецептора уменьшается в присутствии соединения по сравнению с ответом или функционированием рецептора в отсутствие соединения.
Термин эффективность соединения относится к способности соединения ингибировать или стимулировать функционирование рецептора в сравнении со сродством связывания рецептора.
Термин тестируемое соединение, используемый как взаимозаменяемый с термином соединениекандидат, относится к молекуле (например, и без ограничения, химического соединения), подвергаемой процедуре скрининга.
Термин конститутивно активный в отношении С-белок-сопряженного рецептора означает, что Сбелок-сопряженный рецептор, обладает агонист-независимой активностью.
Термин непосредственная идентификация или непосредственно идентифицированный в применении к тестируемому соединению обозначает скрининг соединения против С-белок-сопряженного рецептора в отсутствие известного лиганда (например, известного агониста) С-белок-сопряженного рецептора.
Если предлагается диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятой доли нижнего предела, если в контексте явно не указано иначе, между верхней и нижней границей данного интервала, а также любое другое указанное значение, или промежуточное значение указанного диапазона, входит в объем данного изобретения. Верхние и нижние границы данных меньших диапазонов могут быть независимо включены в более маленькие диапазоны и также входят в объем данного изобретения, с учетом всех специально исключенных границ указанного диапазона. Если в указанный диапазон включены одно или оба граничных значения, данное изобретение также охватывает диапазоны, в которые не входят одно или оба из упомянутых граничных значений.
A. Введение.
Нижеследующие разделы приведены с целью иллюстрации и не предназначаются для ограничения, или не должны истолковываться как ограничение описания или прилагающейся формулы изобретения.
B. Экспрессия рецептора.
I. Представляющие интерес полипептиды СРСК.
СРСК данного изобретения может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) аминокислот 1-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;
(b) аминокислот 2-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;
(c) аминокислот 2-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, где СРСК не содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;
(б) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием образца человеческой ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 4;
(е) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ΙΌ N0: 1;
- 35 016041 (ί) варианта 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(д) аминокислотной последовательности по пункту (ί), выбранной из группы, состоящей из:
(ί) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ίί) аминокислотной последовательности С-белок-сопряженного рецептора, которая содержит по меньшей мере 20 смежных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(к) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии С-белок-сопряженного рецептора, описанной как 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ί) биологически активного фрагмента любой из последовательностей, описанных в пунктах (а)-(й).
В некоторых воплощениях СРСЯ данного изобретения содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, и представляющий собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор, является С-белок-сопряженным рецептором млекопитающего. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, и представляющий собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор, является рецептором СРК119 млекопитающего. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемой полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой аллель 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает соединение Ι (химическая структура и химическое название соединения Ι приведены в таблице А). В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, представляет собой а рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях С-белок-сопряженный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, который можно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
- 36 016041
В некоторых воплощениях человеческая ДНК представляет собой геномную ДНК.
В некоторых воплощениях полимеразная цепная реакция представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Методы ОТ-ПЦР хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях человеческая ДНК представляет собой человеческую кДНК, полученную из ткани или клетки, экспрессирующей СРВ119. В некоторых воплощениях человеческая ткань, которая экспрессирует СРВ119, представляет собой поджелудочную железу или панкреатический островок. В некоторых воплощениях кДНК получают из человеческой клетки, экспрессирующей СРВ119. В некоторых воплощениях кДНК получают из линии бета-клеток поджелудочной железы.
В некоторых воплощениях СРСВ данного изобретения является рекомбинантным. В некоторых воплощениях рекомбинантный СРСВ представляет собой рекомбинантный человеческий СРВ119.
В некоторых воплощениях СРСВ, который можно использовать в предлагающихся способах, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности.
В некоторых воплощениях СРСВ данного изобретения является эндогенным. В некоторых воплощениях СРСВ данного изобретения представляет собой СРВ119 млекопитающего. В некоторых воплощениях эндогенный СРСВ данного изобретения представляет собой СРВ119 млекопитающего.
В качестве иллюстрации, но не для ограничения, осуществляют делецию ^концевого остатка метионина с целью получения биологически активного фрагмента, пригодного для использования в настоящем изобретении. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим N концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА (из гемагглютинина вируса гриппа), который специфически связывает соединение 1. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим ^концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА (из гемагглютинина вируса гриппа), который специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим ^концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА, который специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]5-нитропиримидин-4-ил}амин со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим №концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА (из гемагглютинина вируса гриппа), который специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим №концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4(3 -изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным фрагментом, необязательно соединенным по №концу с указанным пептидом, со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим ^концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным фрагментом, необязательно соединенным по №концу с указанным пептидом, со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях биологически активный фрагмент данного изобретения представляет собой фрагмент, необязательно соединенный по №концу с пептидом, содержащим ^концевой остаток метионина и маркер эпитопа НА, который обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах. В некото
- 37 016041 рых воплощениях фрагмент соединен по Ν-концу с пептидом, состоящим в основном из Ν-концевого остатка метионина и маркера эпитопа НА. Способы соединения пептида, содержащего в основном Νконцевой остаток метионина и маркер эпитопа НА, с Ν-концом фрагмента полипептида хорошо известны в данной области, кроме того, такие гибридные полипептиды имеются в продаже (например, от С1оп1ес11. Моип1ат У1ете, СА).
Объем данного изобретения включает в себя аллельный вариант человеческого ОРВ119 с последовательностью 8ЕО ΙΌ NО: 2. Человеческий ОРВ119 также входит в объем данного изобретения.
Вариант, который представляет собой присутствующий у позвоночных ортолог человеческого ОРВ119 с последовательностью 8ЕО ΙΌ NО: 2, входит в объем данного изобретения. Вариант, который представляет собой присутствующий у млекопитающих ортолог человеческого ОРВ119 с последовательностью 8Е0 ΙΌ NО: 2, входит в объем данного изобретения. Например, объем данного изобретения может включать в себя, без ограничения, мышиный ОРВ119 (например, ОепВапк®, № доступа ΑΥ288423), крысиный ОРВ119 (ОепВапк®, № доступа ΑΑΝ95195), ОРВ119 хомяков, собачий ОРВ119 и ОРВ119 отличных от человека приматов.
В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ NО: 2 представляет собой ОРСВ.
Вариант, идентичный 8Е0 ΙΌ NО: 2 по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%, входит в объем данного изобретения. В некоторых воплощениях вариант, идентичный 8ЕО ΙΌ NО: 2 по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%, представляет собой ОРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 представляет собой эндогенный ОРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 представляет собой не эндогенный ОРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2, который является эндогенным ОРСВ, представляет собой ОРСВ млекопитающего. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 специфически связывает соединение 1. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 специфически связывает (2фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 специфически связывает (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением Κ50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕО ΙΌ NО: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах. Процент идентичности можно определить традиционным способом с использованием известных компьютерных программ.
В некоторых воплощениях вариант ОРСВ, который можно использовать в описываемых способах, имеет аминокислотную последовательность, идентичную 8ЕО ΙΌ NО: 2 по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по
- 38 016041 меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%. Если вариант СРСВ идентичен 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, например, на 95%, это означает, что аминокислотная последовательность варианта идентична аминокислотам 1-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, но может содержать до пяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Так, например, аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 по меньшей мере на 95%, можно получить путем вставки, делеции или замены на другие остатки до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 1-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Данные изменения можно осуществлять по амино- или карбокси-концу, или в любом участке между концевыми положениями, либо вразброс, либо в одном или нескольких смежных положениях последовательности.
В некоторых воплощениях вариант С-белок-сопряженного рецептора, который можно использовать в описываемых способах, представляет собой С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 путем делеции, замены и/или добавления одной или нескольких аминокислот. В некоторых воплощениях вариант С-белок-сопряженного рецептора, который можно использовать в описываемых способах, представляет собой С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 путем осуществления в аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 не более 10 консервативных аминокислотных замен и/или не более 3 неконсервативных аминокислотных замен. В некоторых воплощениях аргинин, лизин и гистидин могут консервативно замещать друг друга; глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота могут консервативно замещать друг друга; глутамин и аспарагин могут консервативно замещать друг друга; лейцин, изолейцин и валин могут консервативно замещать друг друга; фенилаланан, триптофан и тирозин могут консервативно замещать друг друга; и глицин, аланин, серин, треонин и метионин могут консервативно замещать друг друга. Замены, делеции и добавления аминокислот можно осуществлять по любому положению (например, по С- или №концу, или в промежуточных положениях). В некоторых воплощениях вариант представляет собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях вариант представляет собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор позвоночного. В некоторых воплощениях вариант представляет собой эндогенный С-белок-сопряженный рецептор млекопитающего. В некоторых воплощениях вариант представляет собой эндогенный человеческий Сбелок-сопряженный рецептор. В некоторых воплощениях вариант представляет собой не эндогенный Сбелок-сопряженный рецептор.
В некоторых воплощениях вариант обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклетосного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах. В некоторых воплощениях указанный С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляет собой С-белоксопряженный рецептор, лигандом которого является соединение 1. В некоторых воплощениях указанный С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляет собой С-белок-сопряженный рецептор, лигандом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях указанный С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляет собой С-белок-сопряженный рецептор, агонистом которого является соединение 1. В некоторых воплощениях указанный С-белок-сопряженный рецептор, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляет собой Сбелок-сопряженный рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ΙΟ50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ.
Вариант 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляющий собой С-белок-сопряженный рецептор, который содержит по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 100, смежных аминокислот последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, входит в объем данного изобретения. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, который содержит по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 100 смежных аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, представляет собой СРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 представляет собой эндогенный СРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет собой не эндогенный СРСВ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ΙΌ
- 39 016041
ЫО: 2, являющийся эндогенным ОРСК, представляет собой ОРСК млекопитающего. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО ЫО: 2 специфически связывает соединение 1. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО ЫО: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин. В некоторых воплощениях вариант 8Е0 ГО ЫО: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ, менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО ЫО: 2 специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО ЫО: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО ЫО: 2 представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением ГС50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях вариант 8ЕЦ ГО ЫО: 2 обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах. В некоторых воплощениях Обелок-сопряженный рецептор, который содержит по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 100 смежных аминокислот 8ЕО ГО ЫО: 2, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях вариант ОРСК, который можно использовать в описываемых способах, представляет собой ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, представляет собой эндогенный ОРСК. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, представляет собой не эндогенный ОРСК. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, и являющийся эндогенным ОРСК, представляет собой эндогенный ОРСК млекопитающего. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕЦ ГО ЫО: 1, представляет собой 8ЕЦ ГО ЫО: 2 или его аллель. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, представляет собой аллель 8ЕЦ ГО ЫО: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, представляет собой ортолог 8ЕЦ ГО ЫО: 2. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, специфически связывает соединение 1. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, специфически связывает (2-фтор-4метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин4-ил}амин. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО ЫО: 1, специфически связывает (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин со значением ТС50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 50 мкМ, менее чем приблизительно 25 мкМ,
- 40 016041 менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ΙΌ N0: 1, специфически связывает (2фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 12 анализа связывания рецептора составляет менее чем приблизительно 10 мкМ, менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 500 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ или менее чем приблизительно 50 нМ. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ΙΌ N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 5 мкМ, менее чем приблизительно 1 мкМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ΙΌ N0: 1, представляет собой рецептор, агонистом которого является (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин, связывающийся с указанным рецептором со значением 1С50, которое по данным описанного в примере 8 аденилатциклазного анализа на целых клетках составляет менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 25 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ или менее чем приблизительно 1 нМ. В некоторых воплощениях ОРСК, кодируемый полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Еф ΙΌ N0: 1, обладает детектируемым уровнем конститутивной активности. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах. Способы гибридизации хорошо известны квалифицированным специалистам. В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации (например, условия высокой жесткости) включают в себя инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ №С1, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 1,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК спермы лосося; с последующим промыванием фильтра раствором, содержащим 0,1х88С, приблизительно при 65°С. В некоторых воплощениях жесткие условия гибридизации (например, условия высокой жесткости) включают в себя инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х88С (1х88С=150 мМ №С1, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной ДНК спермы лосося; с последующим промыванием 0,1х88С/0,1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) или 0,2х88С/0,1% 8Ό8, приблизительно при 50°С, приблизительно при 55°С, приблизительно при 60°С или приблизительно при 65°С. В некоторых воплощениях указанные условия высокой жесткости включают в себя промывание при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С. В некоторых воплощениях указанные условия высокой жесткости включают в себя промывание приблизительно при 50°С, приблизительно при 55°С, приблизительно при 60°С или приблизительно при 65°С раствором, содержащим 0,1х88С/0,1% 8Ό8 или 0,2х88С/0,1% 8Ό8.
В некоторых воплощениях ОРСК, пригодный для использования в описываемых способах, представляет собой не эндогенный, конститутивно активируемый рецептор, содержащий аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 2, где лейцин в аминокислотном положении 224 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2 заменен на аминокислоту, отличную от лейцина. В некоторых воплощениях аминокислота, отличная от лейцина, представляет собой лизин. В некоторых воплощениях аминокислота, отличная от лейцина, представляет собой аланин. В некоторых воплощениях аминокислота, отличная от лейцина, представляет собой аргинин. В некоторых воплощениях аминокислота, отличная от лейцина, представляет собой гистидин. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях ОРСК данного изобретения включает в себя конститутивно активную версию О-белок-сопряженного рецептора, имеющую последовательность 8Еф ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях конститутивно активная версия рецептора представляет собой эндогенную конститутивно активную версию, имеющую последовательность 8Еф ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях конститутивно активная версия рецептора представляет собой не эндогенную конститутивно активную версию, несущую мутацию в аминокислотном положении 224 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2. В некоторых воплощениях мутация остатка представляет собой замену на остаток, отличный от лейцина. В некоторых
- 41 016041 воплощениях мутация остатка представляет собой замену на остаток лизина. В некоторых воплощениях мутация остатка представляет собой замену на остаток аланина. В некоторых воплощениях мутация остатка представляет собой замену на остаток аргинина. В некоторых воплощениях мутация остатка представляет собой замену на остаток гистидина. В некоторых воплощениях конститутивная активность направлена на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В некоторых воплощениях конститутивная активность вызывает диспергирование пигмента в меланофорах.
В некоторых воплощениях ОРСЯ данного изобретения и О-белок образуют гибридный белок.
а. Идентичность последовательности.
В некоторых воплощениях процент идентичности определяют с помощью программного обеспечения Ваис Ьоса1 АНдпшеШ 8еагс11 Тоо1 (ВЬА8Т), хорошо известного в данной области [см., например, Кат1ш апб А1Фсйи1, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А (1990), 87:2264-2268; А1ксйи1 е1 а1., 1. Мо1 Бю1 (1990), 215:403-410; Л115с1и.11 е1 а1., №1Шге Оепейск (1993), 3:266-272; апб Л115с1и.11 е1 а1., №.1с1ею Ас1б§ Яе§ (1997), 25:3389-3402; содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте]. В программах ВЬА8Т можно использовать параметры по умолчанию или параметры, модифицированные пользователем. Предпочтительно используют параметры по умолчанию.
В некоторых воплощениях предпочтительный способ определения наилучшего общего соответствия исследуемой последовательности (например, аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2) и запрашиваемой из базы данных последовательности, также называемый глобальным выравниванием последовательности, можно осуществлять с помощью компьютерной программы ЕА8ТИВ на основе алгоритма Вги11ад е1 а1. (Сошр Арр ВюМ (1990), 6:237-245; содержание которого включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте). При выравнивании и исследуемая, и запрашиваемая последовательности являются аминокислотными последовательностями. С помощью указанного глобального выравнивания последовательностей определяют процент идентичности. В программе ЕА8ТИВ для аминокислотного выравнивания предпочтительно используются следующие значения параметров: матрица=РАМ 0, размер слова (к-1ир1е)=2, штраф за несовпадением, штраф за соединение=20, группа рандомизации=25, длина=0, балл отсечения Си1оГГ 8соге=1, размер окна=длине последовательности, штраф за открытие пробела=5, штраф за размер пробела=0,05, размер окна=247 или длине известной аминокислотной последовательности, независимо от того, какая последовательность короче. Если запрашиваемая последовательность короче исследуемой вследствие N или С-концевых, но не внутренних, делений, полученный процент идентичности следует откорректировать вручную, поскольку программа ЕА8ТИВ не учитывает И- и С-концевые усечения запрашиваемой последовательности при расчете процента глобальной идентичности. Если запрашиваемые последовательности усечены по N и С-концу по сравнению с исследуемой последовательностью, процент идентичности корректируют путем расчета числа остатков исследуемой поверхности, которые являются N и С-концевыми запрашиваемой последовательности, и которые не совпадают/выравниваются с соответствующими остатками запрашиваемой последовательности, в виде процента от общего числа остатков запрашиваемой последовательности.
Совпадение/выравнивание остатка определяют по результатам выравнивания последовательностей с помощью ЕА8ТОВ. Затем данный процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы ЕА8ТЭВ с использованием указанных параметров, и получают конечное значение процента идентичности. Данное конечное значение процента идентичности используют в целях настоящего изобретения. Только остатки на N и С-конце запрашиваемой последовательности, которые не совпадают/выравниваются с остатками исследуемой последовательности, учитываются при ручной корректировке значения процента идентичности. Т. е. только остатки исследуемой аминокислотной последовательности, находящиеся вне самых крайних N и С-концевых остатков запрашиваемой последовательности.
Например, чтобы определить процент идентичности, 90 аминокислотный остаток запрашиваемой последовательности выравнивают с 100 остатком исследуемой последовательности. На №конце запрашиваемой последовательности присутствует делеция и, следовательно, выравнивание с помощью ЕА8ТОВ не позволяет определять совпадение/проводить выравнивание с первыми остатками Оконца. 10 непарных остатков составляют 10% последовательности (число не совпадающих остатков на N и С-концах/общее число остатков исследуемой последовательности), поэтому 10% вычитают из значения процента идетичности, рассчитанного с помощью программы ЕА8ТЭВ. Если остальные 90 остатков полностью совпадают, конечный процент идентичности составляет 90%. В другом примере 90 остаток запрашиваемой последовательности сравнивают с 100 остатком исследуемой последовательности. На этот раз делеции находятся на внутренних участках, поэтому на N или С-конце запрашиваемой последовательности отсутствуют участки, которые не совпадают/выравниваются с участками исследуемой последовательности. В данном случае процент идентичности, рассчитанный с помощью ЕА8ТОВ, вручную не корректируют. Опять же, только положения остатков, находящиеся вне N и С-концевых областей анализируемой последовательности, выявленные при выравнивании с помощью ЕА8ТЭВ, которые не совпадают/выравниваются с участками исследуемой последовательности, корректируют вручную. В целях настоящего изобретения другие коррекции не производят.
- 42 016041
Ь. Гибридные белки.
В некоторых воплощениях представляющий интерес полипептид является гибридным белком и может содержать, например, домен аффинного маркера или репортерный домен. Подходящие аффинные маркеры включают в себя любые аминокислотные последовательности, которые могут специфически связываться с другим фрагментом, обычно, с другим полипептидом, чаще всего, с антителом. Подходящие аффинные маркеры хорошо известны в данной области и включают в себя эпитопные маркеры, например маркер У5, маркер РЬАО, маркер НА (из гемагглютинина вируса гриппа), маркер тус и т.п. Как известно в данной области, подходящие аффинные маркеры также включают в себя домены, связывающиеся с известными субстратами, например маркеры ΗΙ8, О8Т и МВР, и домены других белков, имеющие коммерчески доступных специфических партнеров по связыванию, например антитела, особенно моноклональные антитела. Подходящие аффинныые маркеры также включают в себя любые домены, участвующие в белок-белковом взаимодействии, такие как участок Рс ^О, который можно детектировать после связывания с подходящим партнером, например рецептором Рс ^О. Специально предусматривается, что такой гибридный белок может содержать гетерологичный ^концевой домен (например, эпитопный маркер), соединенный в рамке считывания с ОРСК, у которого ^концевой остаток метионина удален или заменен на альтернативную аминокислоту.
Подходящие репортерные домены включают в себя любые домены, которые могут указывать на присутствие полипептида. Хотя известно, что для обнаружения присутствия полипептида можно использовать аффинный маркер, например меченое антитело, которое специфически связывается с меткой, чаще используют светоизлучающие репортерные домены. Подходящие светоизлучающие репортерные домены включают в себя люциферазу (например, из жука-светляка, Уатди1а, КепШа гешГогшк или КепШа тие11еп) или ее светоизлучающие варианты. Другие подходящие репортерные домены включают в себя флуоресцентные белки (например, из медуз, кораллов и других кишечнополостных, таких как виды Лес.|иопа. КепШа. РШокатсик, 81у1а1и1а) или их светоизлучающие варианты. Светоизлучающие варианты указанных репортерных белков хорошо известны в данной области, они могут иметь более яркое или более темное излучение, чем природный репортерный белок, или другой спектр возбуждения и/или эмиссии. Например, некоторые варианты после изменения имеют не зеленое, а синее, голубое, желтое, ярко желтое или красное (называемые ВРР, СРР, УРР еУРР и КРР, соответственно) излучение, или имеют другой спектр эмиссии, как известно в данной области. Другие подходящие репортерные домены включают в себя домены, которые могут указывать на присутствие полипептида посредством биохимического или цветового изменения, такие как β-галактозидаза, β-глюкуронидаза, хлорамфеникол ацетилтрансфераза и секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза.
В данной области также известно, что аффинные маркеры или репортерные домены могут присутствовать в любом положении представляющего интерес полипептида. Однако в большинстве воплощений они присутствуют в С- или ^концевой области представляющего интерес полипептида.
2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие представляющие интерес полипептиды ОРСК.
Поскольку генетический код и способы рекомбинации нуклеиновых кислот известны, а аминокислотные последовательности представляющих интерес полипептидов ОРСК описаны, как указано выше, конструирование и получение нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес полипептиды ОРСК, находится в сфере компетенции специалистов данной области. В некоторых воплощениях используют стандартные способы рекомбинации ДНК (Ли8иЬе1, е! а1., 81юг1 Рго!осок ίπ Мо1еси1аг Вю1оду, 3гб еб., №беу & 8оп§, 1995; 8атЬтоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Еббюп, (1989), Со1б 8ртшд НагЬог, N. Υ.). Например, последовательности, кодирующие ОРСК, можно выделить из библиотеки ОРСК-кодирующих последовательностей с использованием любого рекомбинантного способа, или сочетания нескольких рекомбинантных способов, которые нет необходимости описывать в данном документе. Последующие замены, делеции и/или добавления нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, также можно осуществить с помощью стандартных методов рекомбинантных ДНК. Например, для введения/делеции/замены нуклеотидных остатков в полинуклеотиде, кодирующем представляющий интерес полипептид, можно использовать направленный мутагенез и субклонирование. В других воплощениях можно использовать метод ПЦР. Нуклеиновые кислоты, кодирующие представляющий интерес полипептид, также можно получить путем полного химического синтеза или химического синтеза из олигонуклеотидов (например, Се11о е! а1., 8с1епсе (2002), 297:1016-8). В некоторых воплощениях кодоны нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес полипептиды, оптимизируют для экспрессии в клетках конкретных видов, в частности видов млекопитающих, таких как мышь, крыса, хомяк, отличный от человека примат или человек. В некоторых воплощениях кодоны нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес полипептиды, оптимизируют для экспрессии в клетках конкретных видов, в частности видов амфибий.
а. Векторы.
Далее данное изобретение предлагает векторы (также называемые конструкции), содержащие исследуемую нуклеиновую кислоту. В разных воплощениях данного изобретения последовательности исследуемой нуклеиновой кислоты, функционально связанные с последовательностью, регулирующей экспрессию, включающей в себя, например, промотор, экспрессируют в хозяине. Исследуемые нуклеиновые
- 43 016041 кислоты обычно помещают в вектор экспрессии, который способен реплицироваться в клетке-хозяине либо в виде эписомы, либо в виде составного элемента хромосомальной ДНК хозяина. Векторы экспрессии зачастую содержат маркеры селекции, например гены устойчивости к тетрациклину или неомицину, чтобы обеспечить детекцию клеток, трансформированных желательными последовательностями ДНК (см., например, патент США № 4704362, который включен в данное описание в качестве ссылки). Векторы, в том числе одинарные и двойные кассетные векторы экспрессии, хорошо известны в данной области (АикиЬе1, е! а1., 81юг1 Рго!осо1к шМо1еси1аг Вю1оду, 3гД еД., М1еу & 8опк, 1995; 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопД ЕДНюп (1989), Со1Д 8рппд НагЬог, ΚΥ.). Подходящие векторы включают в себя вирусные векторы, плазмиды, космиды, искусственные хромосомы (человеческие искусственные хромосомы, бактериальные искусственные хромосомы, дрожжевые искусственные хромосомы и др.), мини-хромосомы и т. п. Можно использовать ретровирусные, аденовирусные и аденоассоциированные векторы.
Для продуцирования представляющего интерес полипептида в клетке можно использовать ряд векторов экспрессии, которые включают в себя коммерчески доступные векторы экспрессии (например, поставляемые Луйгодеп, Саг1кЬаД, СА; С1оп!ес1, Моип1ат У1ете, СА; 8!га!адепе, Ьа 1о11а, СА).
Коммерчески доступные векторы экспрессии включают в себя, без ограничения, векторы, содержащие промотор СМУ. Подходящим вектором экспрессии является рСМУ. Вектор экспрессии может быть аденовирусным. Типичный аденовирусный вектор можно получить в виде АДЕакуТМ от ОЬюдепе (СагкЬаД, СА) (Не Т.С. е! а1., Ргос. №ί1. АсаД. 8οΐ. И8А (1998), 95:2509-2514; и патент США № 5922576; содержание каждой из указанных публикаций включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте). Другие подходящие векторы экспрессии могут быть легко выбраны рядовым специалистом в данной области.
Рассматриваемые нуклеиновые кислоты обычно содержат одну открытую рамку считывания, кодирующую исследуемый представляющий интерес полипептид, однако в некоторых воплощениях, если клетка-хозяин, используемая для экспрессии представляющего интерес полипептида, представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, такую как человеческая клетка, открытая рамка считывания может прерываться интронами. Исследуемые нуклеиновые кислоты обычно являются частью единицы транскрипции, которая может содержать помимо исследуемой нуклеиновой кислоты 3'и 5'-нетранслируемые участки (ИТВ), контролирующие стабильность РНК, эффективность трансляции и др. Исследуемая нуклеиновая кислота также может являться частью кассеты экспрессии, которая содержит, помимо исследуемой нуклеиновой кислоты, промотор, контролирующий транскрипцию и экспрессию представляющего интерес полипептида, и терминатор транскрипции.
Эукариотическими промоторами могут являться любые промоторы, функционирующие в эукариотической клетке-хозяине, в том числе вирусные промоторы и промоторы эукариотических генов. Примеры эукариотических промоторов включают в себя, без ограничения: промотор генной последовательности мышиного металлотионеина Ι (Натег е! а1., 1. Мо1. Арр1. Сеп. 1:273-288, 1982); промотор ТК вируса герпеса (МсКшдй!, Се11 31:355-365, 1982); ранний промотор 8У40 (Вепой! е! а1., №!иге (ЬопДоп) 290:304310, 1981); промотор генной последовательности дрожжевого даН (1ойпк!оп е! а1., Ргос. №ί1. АсаД. δα. (И8А) 79:6971-6975, 1982); 8Нуег е! а1., Ргос. №ί1. АсаД. 8οΐ. (И8А) 81:5951-5988, 1984), промотор СМУ, промотор ЕЕ-Ι, экдизон-чувствительный промотор(ы), тетрациклин-чувствительный промотор и т.п. Вирусные промоторы могут представлять особый интерес, поскольку они, как правило, являются высокоэффективными. В некоторых воплощениях используют промотор патогена-мишени. В настоящем изобретении используют промоторы, которые могут функционировать в клетках (и/или животных), в которые их вводят. В некоторых воплощениях промотор представляет собой промотор СМУ.
В некоторых воплощениях вектор также может обеспечивать экспрессию маркера селекции. Подходящие векторы и маркеры селекции хорошо известны в данной области и описаны в АикиЬе1, е! а1., (81юП Рго!осо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду, 3гД еД., ^Деу & 8опк, 1995) и 8атЬгоок, е! а1., (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, ТЫгД ЕДНюп (2001), Со1Д 8рппд НагЬог, ΚΥ.). В качестве маркеров селекции используют ряд разных генов, причем выбор конкретного гена, используемого в рассматриваемых векторах в качестве маркера селекции, зависит от удобства. Известные гены маркеров селекции включают в себя: ген тимидинкиназы, ген дигидрофолатредуктазы, ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы, САО, ген аденозиндеаминазы, ген аспарагинсинтетазы, гены устойчивости к антибиотикам, например !е!г, атрг, Стг или са!, капг или пеог (гены аминогликозидфосфотрансферазы), ген гидромицин Вфосфотрансферазы и т.п. Как указано выше, представляющие интерес полипептиды могут представлять собой гибридные белки, которые содержат аффинный домен и/или репортерный домен. Способы получения гибридов репортера или маркера и СРСВ, например, по С- или №концу СРСВ, находятся в компетенции специалистов в данной области (например, МсЬеап е! а1., Мо1. РНагта. Мо1 Р1агтасо1. 1999, 56:1182-91; Ваткау е! а1., Вг. 1. Р1агтасо1оду, 2001, 315-323) и в данном документе подробно не описываются. Специально предусматривается, что такой гибридный белок может содержать гетерологичный №концевой домен (например, эпитопный маркер), соединенный в рамке считывания с СРСВ, у которого №концевой остаток метионина удален или заменен на альтернативную аминокислоту. Представляющий интерес полипептид вначале может быть получен из нативного полипептида и затем функционально свя
- 44 016041 зан с подходящим описанным выше репортером/маркером.
Рассматриваемые нуклеиновые кислоты также могут содержать участки рестрикции, несколько участков клонирования, участки связывания праймеров, лигируемые концы, центры рекомбинации и др., которые обычно расположены так, чтобы обеспечить конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид.
b. Клетки-хозяева.
Данное изобретение также предлагает клетки-хозяева, содержащие вектор, в состав которого входит исследуемая нуклеиновая кислота. Подходящие клетки-хозяева включают в себя прокариотические, например, бактериальные клетки (например, Е. сой), а также эукариотические клетки, например клетки животных (такие как клетки насекомых, млекопитающих, рыб, амфибий, птиц или рептилий), клетки растений (такие как клетки кукурузы или АгаЫборык) или клетки грибов (такие как клетки 8. сегеуШае). В некоторых воплощениях в качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, подходящую для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид. Обычно используют линии животных клеток-хозяев, примерами которых являются клетки почки обезьяны (клетки СО8), клетки почки обезьяны СУ1, трансформированные 8У40 (СО8-7, АТСС СВЬ 165 1); клетки почки человеческого эмбриона (НЕК-293 [293], Сгайат е! а1. 1. Сеи У1го1. 36:59 (1977)); клетки НЕК-293Т [293Т]; клетки почки детеныша хомяка (ВНК, АТСС ССЬ 10); клетки яичника китайского хомячка (СНО, Иг1аиЬ аиб Сйакш, Ргос. Ν!1. Асаб. 8с1. (И8А) 77:4216, (1980); клетки сирийского золотого хомячка МСВ3901 (АТСС СВЬ-9595); мышиные клетки Сертоли (ТМ4, Ма!йег, Вю1. Вергоб. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (СУ1 АТСС ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕВО-76, АТСС СВЬ-1587); клетки карциномы шейки матки человека (НЕЬА, АТСС ССЬ 2); клетки почки собаки (МОСК, АТСС ССЬ 34); клетки печени крысы Ьийа1о (ВВЬ 3 А, АТСС СВЬ 1442); клетки легкого человека (\У1 38, АТСС ССЬ 75); клетки печени человека (йер С2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССЬ 51); клетки ТВ1 (Ма!йег е! а1., Аииа1к Ν. Υ. Асаб. 8а 383:44-68 (1982)); клетки NIН/3Т3 (АТСС СВЬ-1658) и мышиные Ь-клетки (АТСС ССЬ-Ι). В некоторых воплощениях используют меланофоры. Меланофоры представляют собой клетки кожи, обнаруженные у низших позвоночных. Описание подходящих материалов и методов можно найти в патенте США № 5462856 и патенте США № 6051386. Содержание данных патентов включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте.
Специалистам в данной области известны и другие линии клеток, причем широкий ряд клеточных линий можно получить от Американской коллекции типовых культур, 10801 Итуегкйу Вои1еуагб, Маиаккак, Уа. 20110-2209.
c. Скрининг соединений-кандидатов.
1. Способы аналитического скрининга общего СРСВ.
Если ассоциированный с С-белком рецептор становится активным, он связывается с С-белком (например, Сд, Ск, С1, Сζ, Со) и стимулирует связывание ГТФ с С-белком. Затем С-белок действует как ГТФ-аза и медленно гидролизует ГТФ до ГДФ, в результате чего в нормальных условиях происходит дезактивация рецептора. Однако активированные рецепторы продолжают преобразовывать ГДФ в ГТФ. Негидролизуемый аналог ГТФ, [358]ГТФу8, можно использовать для мониторинга повышенного связывания с мембранами, на которых экспрессируются активированные рецепторы. Описано, что [358]ГТФу8 можно использовать для мониторинга связывания С-белка с мембранами в отсутствие и присутствии лиганда. Пример такого мониторинга, в числе других примеров, хорошо известных и доступных специалистам в данной области, описан Тгауиог аиб №1йогкк| в 1995. Предпочтительно данную систему анализа используют для первичного скрининга соединений-кандидатов, поскольку данная система, как правило, применима ко всем С-белок-сопряженным рецепторам, независимо от типа конкретного С-белка, взаимодействующего с внутриклеточным доменом рецептора.
2. Способы аналитического скрининга конкретных СРСВ.
После идентификации соединений-кандидатов с помощью анализа общий С-белок-сопряженного рецептора (т. е. анализа, позволяющего выбрать соединения, являющиеся агонистами или обратными агонистами) в некоторых воплощениях предпочтительно проводят дополнительный скрининг, чтобы подтвердить, что соединения взаимодействуют по рецепторному участку. Например, соединение, идентифицированное в общем анализе, может не связываться с рецептором, а лишь отсоединять С-белок от внутриклеточного домена.
а. Ск, Сζ и С1.
Ск стимулирует фермент аденилатциклазу. С1 (а также Сζ и Со), наоборот, ингибирует аденилатциклазу. Аденилатциклаза катализирует превращение АТР в цАМФ; следовательно, активация СРСВ, сопряженных с белком Ск, связана с увеличением уровня внутриклеточного цАМФ. С другой стороны, активация СРСВ, сопряженных с белком С1 (или Сζ, Со), связана с уменьшением уровня внутриклеточного цАМФ. Общее описание можно найти в ΙιΦίΐΌα Месйашктк о! 8уиарйс Тгаикт1ккюи, Сйр!. 8, Егот №игои То Вгаш (3гб Еб.) №сйо1к, ЕС. е! а1. ебк. 8таиег Аккоаа!ек, Фс. (1992). Таким образом, с помощью анализов, позволяющих детектировать цАМФ, можно определить, является ли соединение
- 45 016041 кандидат, например, обратным агонистом рецептора (т.е. соединением, которое уменьшает уровень цАМФ). Для измерения цАМФ можно использовать ряд способов, известных в данной области; в некоторых воплощениях предпочтительный способ основан на применении антител против цАМФ в формате ЕЫ8А. Можно использовать и анализ другого типа, например анализ репортерной системы вторичного мессенджера на целых клетках. Промоторы генов регулируют экспрессию белков, кодируемых конкретными генами. Циклический АМФ регулирует экспрессию генов, стимулируя связывание цАМФзависимого ДНК-связывающего белка или фактора транскрипции (СКЕВ) с промотором по специфическим участкам, называемым цАМФ-зависимые элементы. Можно сконструировать репортерные системы, в которых перед репортерным геном, например β-галактозидазы или люциферазы, находится промотор, содержащий несколько цАМФ-зависимых элементов. Таким образом, активация Ск-сопряженного рецептора вызывает накопление цАМФ, который впоследствии активирует ген и экспрессию репортерного белка. Затем репортерный белок, такой как β-галактозидаза или люцифераза, можно детектировать с помощью стандартных биохимических анализов (Сйеп еί а1. 1995).
Ь. Со и Сд.
Сд и Со связаны с активацией фермента фосфолипазы С, который, в свою очередь, гидролизует фосфолипид Р1Р2, высвобождая два внутриклеточных мессенджера: диацилглицерин (ОАС) и инозитол 1,4,5-трифосфат (1Р3). Повышенное накопление 1Р3 связано с активацией Сд- и Со-ассоциированных рецепторов. Общее описание можно найти в Ιηάπΐοί Месйашктк οί 8упарйс Ттапкткыоп, ΟιρΙ. 8, Егот Ыеигоп То Втат (3Γά Εά.), МсйоЕ. ЕС. еί а1. еЙ5. 8таиет Л55ос1а1е5. 1пс. (1992). С помощью анализов, позволяющих детектировать 1Р3, можно определить, является ли соединение-кандидат, например, обратным агонистом Сд- или Со-ассоциированного рецептора (т.е. соединением, которое уменьшает уровень 1Р3). Сд-ассоциированные рецепторы можно определить с помощью анализа репортера АР1, в котором Сд-зависимая фосфолипаза С вызывает активацию генов, содержащих элементы АР1; поскольку активация Сд-ассоциированных рецепторов приводит к увеличению экспрессии таких генов, обратные агонисты уменьшают такую экспрессию, а агонисты увеличивают такую экспрессию. Анализы, с помощью которых можно осуществить указанную детекцию, являются коммерчески доступными.
3. Гибридный белок СРСК.
Применение эндогенного, конститутивно активного СРСК, или неэндогенного, конститутивно активируемого СРСК, в скрининге соединений-кандидатов с непосредственной идентификацией обратных агонистов или агонистов, является интересным способом скрининга, в котором, по определению, рецептор активен даже в отсутствие связанного с ним эндогенного лиганда. Так, чтобы выявить различие между, например, неэндогенным рецептором в присутствии соединения-кандидата и неэндогенным рецептором в отсутствие такого соединения и, руководствуясь таким различием, понять, является ли такое соединение обратным агонистом, агонистом или соединением, не оказывающим влияния на такой рецептор, предпочтительно использовать способ, позволяющий эффективно выявить такое различие. В некоторых воплощениях предпочтительный способ заключается в применении гибридного белка СРСК.
Как правило, после того, как с помощью описанных методов анализа (а также других методов, известных специалистам в данной области) определено, что неэндогенный СРСК конститутивно активируется, можно детектировать преобладающий С-белок, связанный с эндогенным СРСК. Соединение Сбелка с СРСК инициирует сигнальный путь, который можно оценить. В некоторых воплощениях скрининг предпочтительно проводить с использованием системы экспрессии, полученной из клеток млекопитающих, или из меланофоров, поскольку такая система предположительно содержит эндогенный Сбелок. Таким образом, по определению, в такой системе неэндогенный, конститутивно активируемый СРСК обеспечивает непрерывный сигнал. В некоторых воплощениях предпочтительно, чтобы такой сигнал усиливался так, чтобы в присутствии, например, обратного агониста рецептора, можно было бы легче различить, особенно в процессе скрининга, рецептор, находящийся в контакте с обратным агонистом.
Предполагается, что гибридный белок СРСК увеличивает эффективность сопряжения С-белка с СРСК. Гибридный белок СРСК может быть предпочтительным для скрининга, проводимого с использованием эндогенного конститутивно активного СРСК или неэндогенного конститутивно активируемого СРСК, поскольку он обеспечивает увеличение сигнала, генерируемого в процессе скрининга. Это важно для получения значимого отношения сигнала к шуму; при скрининге соединений-кандидатов, как описано в данном документе, такое соотношение предпочтительно должно быть значимым.
Получение конструкции, обеспечивающей экспрессию гибридного белка СРСК, относится к сфере компетенции специалистов данной области. С использованием коммерчески доступных векторов и систем экспрессии такие конструкции можно получить с помощью ряда способов, которые могут быть приспособлены к конкретным потребностям исследователя. Важные условия при получении такой конструкции гибридного белка СРСК включают в себя, без ограничения, объединение последовательности СРСК с последовательностью С-белка в одной рамке считывания (предпочтительно, последовательность эндогенного СРСК находится выше последовательности С-белка) и делецию или замену стоп-кодона СРСК, чтобы при экспрессии СРСК также экспрессировался и С-белок. СРСК может быть связан с Сбелком непосредственно или через спейсерные остатки (предпочтительно приблизительно не более 12,
- 46 016041 хотя данное число может быть уточнено специалистом в данной области). Для удобства предпочтительно использовать спейсер. В некоторых воплощениях предпочтительно, чтобы С-белок, сопряженный с неэндогенным ОРСК, был идентифицирован перед получением конструкции гибридного белка ОРСК. Как указано выше, активированные СРСК, сопряженные с С1, С/ и Со, могут ингибировать образование цАМФ, делая анализы с использованием данных типов СРСК перспективными (т.е. сигнал, опосредуемый цАМФ уменьшается при активации, что делает непосредственную идентификацию, например, агонистов (которые дополнительно уменьшают данный сигнал) перспективной). Как описано в данном документе, при попытке разработать осуществимый циклазный анализ, было установлено, что для указанных типов рецепторов можно получить гибридный белок СРСК, который не содержит С-белок, эндогенный для СРСК. Так, например, эндогенный С1-сопряженный рецептор можно гибридизовать с белком Сз, причем полученная гибридная конструкция при экспрессии заставляет или вынуждает эндогенный СРСК предпочтительнее соединяться, например, с Сз, чем с природным Сйбелком, что делает возможным проведение циклазного анализа. Таким образом, в случае С1-, С/- и Со-сопряженных рецепторов, при использовании гибридного белка и проведении анализа на основе определения аденилатциклазной активности, в некоторых воплощениях предпочтительно, чтобы гибридная конструкция содержала Сз (или эквивалентный С-белок, который стимулирует образование фермента аденилатциклазы).
Таблица С
6белок
Изменение продукции цАМФ при активации
СРСК (например, при конститутивном
Изменение накопления 1Р3 при активации
СРСК (например, при конститутивном
Изменение продукции цАМФ при контакте с обратным агонистом
Изменение накопления
1Р3 при контакте с обратным агонистом активации, или активации, или при связывании при связывании агониста)
Сз
Увеличение
Уменьшение
Οζ
Со
Сд
Уменьшение
Уменьшение
Ν/Α
Ν/Α
Ν/Α
Ν/Α
Увеличение
Увеличение
Уменьшение
Увеличение
Увеличение
Увеличение
Ν/Α
Ν/Α
Ν/Α
Ν/Α
Уменьшение
Уменьшение
Одинаково эффективными являются С-белок-гибридные конструкции, которые содержат белок Сц, гибридизованный с белком Сз; С1, С/ или Со. В некоторых воплощениях предпочтительная гибридная конструкция может содержать белок Сн], в котором первые шесть аминокислот α-субъединицы С-белка (Сац) удалены, а последние пять аминокислот на С-конце Сац заменены на соответствующие аминокислоты Са представляющего интерес С-белка. Например, гибридная конструкция может содержать Сц (6 аминокислот удалены), гибридизованный с белком СИ с получением гибридной конструкции СфСИ. Данная гибридная конструкция вынуждает эндогенный Сйсопряженный рецептор связываться с неэндогенным по отношению к нему С-белком, Сц, так что вместо продукции цАМФ можно измерять уровень такого вторичного мессенджера, как, например, инозитолтрифосфат или диацилглицерин.
4. Совместная трансфекция целевого Сйсопряженного СРСК и сигнального энхансера Сзсопряженного СРСК (анализ на основе измерения цАМФ).
Известно, что Сйсопряженный рецептор ингибирует аденилатциклазу и, следовательно, уменьшает уровень продукции цАМФ, что может сделать определение уровня цАМФ перспективным анализом. В некоторых воплощениях эффективный способ измерения уменьшения продукции цАМФ как показателя активации рецептора, который преимущественно связывается с С1 при активации, можно проводить путем совместной трансфекции сигнального энхансера, например, неэндогенного, конститутивно активируемого рецептора, который преимущественно связывается с Сз при активации (например, Т8ΗК-Α623I; см. ниже), и Сйсвязанным СРСК. Очевидно, что активацию Сз-сопряженного рецептора можно определить по увеличению продукции цАМФ. Активация С1-сопряженного рецептора приводит к уменьшению продукции цАМФ. Таким образом, совместную трансфекцию предпринимают с целью успешного применения указанных противоположных эффектов. Например, совместная трансфекция неэндогенного, конститутивно активированного Сз-сопряженного рецептора (сигнальный энхансер) с одним вектором экспрессии дает фоновый сигнал цАМФ (т.е. хотя Сйсопряженный рецептор уменьшает уровень цАМФ, данное уменьшение сравнимо с существенным увеличением уровня цАМФ, вызываемым конститутивно активированным Сз-сопряженным сигнальным энхансером). При последующей совместной трансфекции сигнального энхансера и целевого рецептора обратный агонист Сйсопряженного целевого рецептора увеличивает измеряемый сигнал цАМФ, хотя агонист С1-сопряженного целевого рецептора
- 47 016041 уменьшает данный сигнал.
Соединения-кандидаты, которые непосредственно идентифицируют с помощью данного способа, следует анлизировать независимо, чтобы удостовериться, что они не связываются с сигнальным энхансерным рецептором (такой анализ можно провести до или после скрининга против совместно трансфицированных рецепторов).
Композиции/составы и способы лечения.
На основе агониста ОРК119, используя известные в данной области методы, можно получить фармацевтические композиции и лекарственные средства для применения в соответствии с настоящим изобретением. Используемый состав зависит от выбранного способа введения. В некоторых воплощениях указанное введение осуществляют отличному от человека позвоночному или отличному от человека млекопитающему.
В соответствии со способами лечения настоящего изобретения, а именно способами лечения, связанными с применением агониста ОРК119, соединения данного изобретения можно вводить любым подходящим способом. Подходящие способы введения включают в себя пероральный, назальный, ректальный, через слизистую оболочку, чрезкожный или кишечный способы введения, парентеральную доставку, в том числе внутримышечные, подкожные, внутримозговые инъекции, а также интратекальные, непосредственные внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные, внутрилегочные (путем вдыхания) или внутриглазные инъекции, осуществляемые с помощью известных в данной области способов. Другие подходящие способы введения включают в себя применение аэрозолей и композиций-депо. Отдельно рассматриваются композиции с замедленным высвобождением, в частности композиции-депо, содержащие лекарственные средства настоящего изобретения. В некоторых предпочтительных воплощениях соединения настоящего изобретения вводят перорально. Соединения настоящего изобретения можно получить в твердой или жидкой форме, такой как таблетки, капсулы, порошки, сиропы, эликсиры и т.п., аэрозоли, стерильные растворы, суспензии или эмульсии и т.п. В некоторых воплощениях агонист ОРК119 вводят перорально.
Композиции для перорального введения могут находиться в виде водных растворов и суспензий, помимо твердых композиций таблеток и капсул. Водные растворы и суспензии можно получить из стерильных порошков или гранул. Соединения можно растворить в воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, хлопковом масле, арахисовом масле, кунжутном масле, бензиловом спирте, растворе хлорида натрия и/или разных буферах. Другие вспомогательные средства хорошо известны и широко применяются в данной области.
Фармацевтические композиции агониста ОРК119 можно получить с помощью хорошо известных в данной области способов, например, с использованием традиционных процессов смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, заключения в капсулы, улавливания, лиофилизации или сушки распылением.
Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением можно получить традиционным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включающих в себя наполнители и вспомогательные средства, облегчающие обработку активных соединений с получением фармацевтических препаратов. Подходящие фармацевтически приемлемые носители доступны для специалистов в данной области (см., например, Кеттд1оп: Т1е 8с1епсе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу, (Оеппаго е! а1., ебз.), 20'1' Ебйюп, 2000, ЫрртсоИ ^ййатз & ХУПктз; и НапбЬоок о£ Рйагтасеийса1 Ехс1р1еп!з (Коме е! а1., ебз), 4'1' Ебйюп, 2003, Рйагтасеийса1 Ргезз; содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте). Используемый состав зависит от выбранного способа введения. Термин вещество-носитель или вещество-наполнитель в данном описании относится к любому веществу, которое само не является терапевтическим средством, но используется в качестве носителя, и/или разбавителя, и/или вспомогательного средства, или среды для доставки терапевтического средства субъекту, или добавляется к фармацевтической композиции для придания свойств, облегчающих манипулирование или улучшающих хранение, или для обеспечения или облегчения получения из композиции лекарственной формы в виде дискретных изделий, таких как капсулы или таблетки, подходящие для перорального введения. Примеры наполнителей могут включать в себя, без ограничения, разбавители, дезинтегрирующие средства, связующие средства, склеивающие средства, увлажняющие средства, полимеры, смазывающие средства, средства, обеспечивающие скольжение, средства, добавляемые для маскировки или нейтрализации неприятного вкуса или запаха, ароматизаторы, красители, отдушки и вещества, добавляемые для улучшения внешнего вида композиции. Приемлемые носители включают в себя стеариновую кислоту, стеарат магния, оксид магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, карбонат магния, тальк, желатин, гуммиарабик, альгинат натрия, пектин, декстрин, маннит, сорбит, лактозу, сахарозу, крахмалы, желатин, производные целлюлозы, такие как эфиры целлюлозы и алкановых кислот и алкильные сложные эфиры целлюлозы, низкоплавкий воск, масло или порошок какао, полимеры, такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и полиэтиленгликоли, а также другие фармацевтически приемлемые вещества. Компоненты фармацевтической композиции могут быть заключены в капсулы или таблетки, подходящие для конкретного способа введения.
- 48 016041
Термин фармацевтически приемлемый относится к свойствам и/или веществам, которые являются приемлемыми для пациента с точки зрения фармакологии/токсикологии, а также для получающего их химика-фармацевта с точки зрения физических/химических свойств, связанных с композицией, составом, стабильностью, одобрением пациента и биодоступностью.
Внутреннюю часть драже обычно снабжают подходящим покрытием. Для получения таких покрытий можно использовать концентрированные растворы сахаров, которые необязательно содержат гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гелеобразный карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лаковые растворы, а также подходящие органические растворители или смеси растворителей. Покрытия таблеток или драже также могут содержать красители или пигменты, позволяющие идентифицировать или отличить разные сочетания доз активных соединений.
Фармацевтические композиции для перорального применения могут быть заключены во вставные капсулы, полученные из желатина, а также в мягкие, герметически закрытые капсулы, полученные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Вставные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующим средством, таким как крахмал, и/или смазывающим средством, таким как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин, жидкие полиэтиленгликоли, кремофор, Сарти1, средне- или длинноцепочечные моно-, ди- или триглицериды. Такие композиции также могут содержать стабилизаторы.
Кроме того, агонист СРК119 также можно доставлять с помощью системы, обеспечивающей замедленное высвобождение. Замедленное высвобождение могут обеспечивать разные вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Особенно предпочтительны таблетки или капсулы с замедленным высвобождением. Например, можно использовать вещества, обеспечивающие задержку высвобождения, такие как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина. На лекарственную форму также можно нанести покрытие с помощью способов, описанных в патентах США № 4256108, 4166452 и 4265874, с получением осмотических терапевтических таблеток с контролируемым высвобождением.
Специально предусматривается, что способы лечения настоящего изобретения, а именно способы лечения, связанные с применением агониста СРК119, можно осуществлять или проводить по отдельности, или в сочетании с применением одного или нескольких других фармацевтически или физиологически приемлемых соединений. В одном аспекте настоящего изобретения другое фармацевтически или физиологически приемлемое соединение не является агонистом СРК119. В одном аспекте настоящего изобретения другое фармацевтически или физиологически приемлемое соединение представляет собой фармацевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из кальция, витамина Ό, эстрогена, тиболона, селективного модулятора рецептора эстрогена (8ЕКМ; такого как ралоксифен, тамоксифен), бифосфоната (такого как этидронат, алендронат, ризедронат), кальцитонина, 1а-гидроксилированного метаболита витамина Ό, фторида, тиазида, анаболического стероида, иприфлавона, витамина К, паращитовидного гормона (РТН), стронция, статина, остеопротеририна, селективного агониста рецептора ЕР4, селективного агониста рецептора каннабиноидов типа 2 (СВ2) и ингибитора киназы МАР р38 (см., например, \Уог1б НеаИй 0гдашха1юп Тесйшса1 Керой 8епез 921 (2003), Р^еνеηйοη апб Мападетеп! оГ 0з1еоρΟΓΟδίδ).
В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста. В одном аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста. В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к лекарственной форме композиции или фармацевтической композиции, которая содержит агонист СРК119 в количестве, достаточном для оказывания эффекта при лечении или профилактике состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, и/или при увеличении костной массы у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста. В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, содержащую количество агониста СРК119 настоящего изобретения, или по существу состоящую из количества такого агониста, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к лекарственной форме композиции или фармацевтической композиции, которая содержит агонист СРК119 в количестве, достаточном для увеличения уровня СГР у субъекта.
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя композиции, которые содержат активные ингредиенты в количествах, эффективных для достиже
- 49 016041 ния предполагаемой цели. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция настоящего изобретения рассматривается как пригодная для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, или для увеличения костной массы субъекта. Условия, характеризующиеся снижением костной массы, входят в объем настоящего изобретения. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция настоящего изобретения рассматривается как пригодная для увеличения уровня ШР у субъекта. В соответствии с настоящим изобретением, определение количества агониста СРВ119, достаточного для достижения предполагаемой в соответствии с данным изобретением цели, относится к компетенции специалистов в данной области, особенно с учетом приведенного в данном документе подробного описания.
При определении диапазона доз, применяемых для людей, используют результаты, полученные в исследованиях на животных, включающих в себя, без ограничения, исследования, проводимые с использованием мышей, крыс, кроликов, свиней и отличных от человека приматов. Как правило, специалисты в данной области понимают, как экстраполировать данные, полученные ίη νίνο на системе животной модели, на другое животное, такое как человек. В некоторых случаях такие экстраполяции можно осуществлять только на основе сравнения массы животной модели с массой другого животного, такого как человек; в других случаях при такой экстраполяции учитывают не только массу, но и ряд других факторов. Примеры таких факторов включают в себя тип, возраст, массу, пол, диету и медицинское состояние пациента, тяжесть заболевания, способ введения, фармакологические параметры, такие как активность, эффективность, фармакокинетические и токсикологические профили конкретного используемого соединения, применение системы доставки лекарственного средства, проведение лечения острого или хронического болезненного состояния или профилактики, а также введение других активные соединений помимо соединений настоящего изобретения, как часть сочетания лекарственных средств. Дозировочный режим для лечения болезненного состояния с помощью соединений и/или композиций данного изобретения выбирают с учетом ряда факторов, как указано выше. Таким образом, используемый реальный дозировочный режим может широко варьировать и, следовательно, отклоняться от предпочтительного дозировочного режима, причем специалистам в данной области следует понимать, что дозу и дозировочный режим, находящиеся вне указанных типичных диапазонов, можно использовать в способах данного изобретения, если тестирование покажет, что они пригодны для этого.
Примером системы животной модели является модель разрежения кости крыс после овариэктомии (0УХ). Крыса после овариэктомии является превосходной предклинической животной моделью, которая корректно имитирует клиническое состояние скелета человека при недостатке эстрогенов и ответ на терапевтические средства. У данной модели терапевтическая эффективность достигается, если разрежение кости, связанное с овариэктомией, частично или полностью предотвращается (см., например, Во11ад с1 а1., Мо1 Сс11 Епбоеппо1 (2001), 177:35-41; и 1сс с1 а1., I Ми8си1о8ке1 №игоп !п1сгас1 (2001), 1:193-207). В некоторых воплощениях терапевтическая эффективность достигается, если разрежение кости, связанное с овариэктомией, предотвращается по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95 или на 100%.
Другим примером системы животной модели является увеличение уровня ШР в крови мышей после введения глюкозы. В некоторых воплощениях уровень СГО в крови представляет собой уровень ШР в плазме. В некоторых воплощениях уровень ШР представляет собой глюкозонезависимый уровень ШР. В некоторых воплощениях уровень ШР представляет собой глюкозозависимый уровень СЕР. В некоторых воплощениях ШР представляет собой общий ШР. В некоторых воплощениях общий ШР измеряют с помощью центрального или С-концевого анализа. В некоторых воплощениях ШР представляет собой биоактивный ШР. В некоторых воплощениях биоактивный ШР измеряют методом ^концевого анализа. В некоторых воплощениях биоактивный СГО стимулирует костеобразование. В некоторых воплощениях терапевтическая эффективность достигается, если уровень ШР в крови увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 100%, по меньшей мере приблизительно на 150%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 400% или по меньшей мере приблизительно на 500%.
Величину и диапазон доз можно корректировать, чтобы получить предполагаемый терапевтический эффект. Понятно, что точная доза агониста СРВ119 в соответствии с настоящим изобретением зависит от агониста СРВ119, его активности, способа введения, возраста и массы пациента, а также тяжести состояния, подлежащего лечению. Точную композицию, способ введения и дозу может выбрать лечащий врач с учетом состояния пациента. Например, количество агониста СРВ 119 в соответствии с настоящим изобретением, составляет, без ограничения, менее чем приблизительно 0,001 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,005 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,01 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,05 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,1 мг/кг массы тела, менее чем при
- 50 016041 близительно 0,5 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 1 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 5 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 10 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 50 мг/кг массы тела или менее чем приблизительно 100 мг/кг массы тела. В некоторых воплощениях количество агониста СРВ119 в соответствии с настоящим изобретением составляет менее чем приблизительно 0,001-100 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-50 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-10 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-5 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-1 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-0,5 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-0,1 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-0,05 мг/кг массы тела, менее чем приблизительно 0,001-0,01 мг/кг массы тела или менее чем приблизительно 0,001-0,005 мг/кг массы тела.
Предпочтительный диапазон доз модулятора данного изобретения (например, агониста СРВ 119), которые можно вводить ежедневно или с регулярными интервалами времени с достижением желательного результата, составляет 0,1-100 мг/кг массы тела. Другой предпочтительный диапазон доз составляет 0,1-30 мг/кг массы тела. Другой предпочтительный диапазон доз составляет 0,1-10 мг/кг массы тела. Другой предпочтительный диапазон доз составляет 0,1-3,0 мг/кг массы тела. Конечно, указанные суточные дозы можно доставлять или вводить в небольших количествах периодически в течение дня. Следует отметить, что указанные дозировочные диапазоны являются только предпочтительными диапазонами и не предназначаются для ограничения данного изобретения.
Величину и диапазон доз можно корректировать индивидуально до получения уровня агониста СРВ119 настоящего изобретения в плазме, обеспечивающего предполагаемый терапевтический эффект. Дозировочные диапазоны также можно определять с использованием значения выбранного интервала концентрации агониста СРВ119 так, чтобы достичь предполагаемого терапевтического эффекта. Агонист СРВ119 следует вводить с использованием режима, который позволяет поддерживать уровни в плазме в выбранном диапазоне концентраций агониста СРВ119 в течение 10-90% времени, предпочтительно 3099% времени, наиболее предпочтительно 50-90% времени. В случаях локального введения или селективного поглощения диапазон концентраций агониста СРВ119, обеспечивающий предполагаемый терапевтический эффект, может не соответствовать концентрации в плазме.
Разумеется, количество вводимой композиции зависит от субъекта, подлежащего лечению, массы субъекта, тяжести повреждения, способа введения и заключения лечащего врача.
В одном аспекте настоящее изобретение соответственно описывает способ лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, или увеличения костной массы, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей количество агониста СРВ119 настоящего изобретения, или по существу состоящей из количества такого агониста. В некоторых воплощениях композиция представляет собой фармацевтическую композицию.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, или увеличения костной массы, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей количество агониста СРВ119 настоящего изобретения, или по существу состоящей из количества такого агониста. В родственном аспекте настоящее изобретение описывает такой способ, в котором агонист СРВ119 вводят в количестве, достаточном для увеличения уровня С1Р у субъекта. В некоторых воплощениях композиция представляет собой фармацевтическую композицию.
Способы лечения настоящего изобретения, а именно способы лечения, связанные с применением агониста СРВ119, можно использовать для лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы субъекта, а также для увеличения костной массы субъекта.
Состояния, характеризующиеся низкой костной массой, включают в себя, без ограничения, остеопению, остеопороз, ревматоидный артрит, остеоартрит, периодонтальное заболевание, разрежение альвеолярной кости, остеотомическое разрежение кости, детское идиопатическое разрежение кости, болезнь Педжета, разрежение кости вследствие метастатического рака, остеолитические повреждения, искривление позвоночника и потерю массы. В некоторых воплощениях состояние, характеризующееся низкой костной массой, представляет собой остеопороз. В некоторых воплощениях состояние, характеризующееся низкой костной массой, представляет собой остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз. Состояния, характеризующиеся низкой костной массой, также включают в себя, без ограничения, долгосрочные осложнения остеопороза, такие как искривление позвоночника, потеря массы и последствия протезной хирургии. Следует понимать, что состояния, характеризующиеся снижением костной массы, могут входить в объем воплощений настоящего изобретения по отдельности или в любых сочетаниях. В некоторых воплощениях состояние, характеризующееся низкой костной массой, представляет собой первичный остеопороз.
В некоторых воплощениях минеральная плотность кости (МПК) субъекта, нуждающегося в увеличении костной массы, ниже типичного значения для молодого взрослого субъекта более чем на 1 (Тпоказатель <-1), не менее чем на 1,5 (Т-показатель <-1,5), не менее чем на 2 (Т-показатель <-2) или не
- 51 016041 менее чем на 2,5 (Т-показатель <-2,5) стандартных отклонений. В некоторых воплощениях субъект, нуждающийся в увеличении костной массы, нуждается в лечении перелома кости. В некоторых воплощениях субъект, нуждающийся в лечении перелома кости, имеет травматический перелом кости, долговременный перелом кости или остеопоротический перелом кости. В некоторых воплощениях субъект нуждается в лечении заболевания кости. В некоторых воплощениях субъект, нуждающийся в лечении заболевания кости, имеет остеопению, остеопороз, ревматоидный артрит, остеоартрит, периодонтальное заболевание, разрежение альвеолярной кости, остеотомическое разрежение кости, детское идиопатическое разрежение кости, болезнь Педжета, разрежение кости вследствие метастатического рака, остеолитические повреждения, искривление позвоночника или потерю массы. В некоторых воплощениях субъект, нуждающийся в лечении заболевания кости, имеет остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз. Деструктивные заболевания костей, которые можно лечить с помощью способа данного изобретения, включают в себя, без ограничения, остеопороз, остеоартрит и остеолитические повреждения, например, вызванные новообразованием, лучевой терапией или химиотерапией. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой первичный остеопороз. В некоторых воплощениях остеопороз представляет собой вторичный остеопороз.
Способы лечения настоящего изобретения, а именно способы лечения, связанные с применением агониста СРР119, также используют для ускорения заживления кости после лицевой хирургии, верхнечелюстной хирургии, нижнечелюстной хирургии, периодонтального заболевания или удаления зуба, ускорения удлинения длинной кости, ускорения роста внутри протеза и ускорения сращения костей у субъекта.
В некоторых воплощениях субъект представляет собой позвоночное. В некоторых воплощениях субъект, являющийся позвоночным, представляет собой рыбу, амфибию, рептилию, птицу или млекопитающее. В некоторых воплощениях субъект или позвоночное представляет собой млекопитающее. В некоторых воплощениях субъект или позвоночное, являющееся млекопитающим, представляет собой мышь, крысу, хомяка, кролика, свинью, собаку, кошку, лошадь, корову, овцу, козу, отличное от человека млекопитающее, отличного от человека примата или человека. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека. В некоторых воплощениях человек представляет собой женщину в постменопаузе или мужчину старше 50 лет.
Предполагается, что с помощью приведенного выше описания специалист в данной области сможет осуществить настоящее изобретение в самой полной степени без дополнительных исследований. Поскольку вышеизложенное подробное описание приведено только для наглядного объяснения и не предназначено для излишнего ограничения, специалисты в данной области могут осуществлять модификации в пределах объема данного изобретения.
Примеры
Предполагается, что с помощью приведенного выше описания специалист в данной области сможет осуществить настоящее изобретение в самой полной степени без дополнительных исследований. Нижеследующие подробные примеры приведены только для иллюстрации, но не для ограничения каким-либо образом предшествующего описания. Специалисты в данной области смогут легко осуществить соответствующие модификации описанных способов.
Пример 1. Фармакодинамический анализ влияния агониста СРК119 на уровень СР в крови мышей дикого шипа.
A. Самцов мышей С57Ь1к/6 держат на голодной диете в течение 18 ч и случайным образом распределяют в четырнадцать групп по 6 животных в каждой группе (п=6). Мышам перорально вводят среду (РЕТ; 80% РЕС400, 10% этанола, 10% твина 80) или агонист СРК119 настоящего изобретения (соединение 1; (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3-изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5нитропиримидин-4-ил}амин) в дозе 20 мг/кг, как указано на фиг. 1А. Через 30 мин после обработки перорально вводят болюс глюкозы в дозе 3 г/кг, и через 0 (отсутствие болюса глюкозы), 2, 5, 10, 20, 40 и 60 мин после введения болюса глюкозы собирают плазму. Уровни СР в плазме измеряют с помощью набора ЕЫ8А для определения СР у грызунов, полученного от Ьтсо Рекеагсй ЬаЬогаФгу 1ЕЫ8А для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу ΒΖРМСIР-55К], в соответствии с инструкциями поставщика. Из результатов, показанных на фиг. 1А, видно, что введение агониста СРР119 приводит к увеличению как глюкозозависимого, так и глюкозонезависимого уровня СР в крови мышей. Соединение 1 стимулирует общий СР в плазме мышей. Соединение 1 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/001267 (опубликованной как А0 2004/065380).
B. Самцов мышей С57Ь1к/6 держат на голодной диете в течение 18 ч и случайным образом распределяют в четырнадцать групп по 6 животных в каждой группе (п=6). Мышам перорально вводят среду (20% гидроксипропил-в-циклодекстрин (НРСЭ)) или агонист СРК119 настоящего изобретения (соединение 3) в дозе 10 мг/кг, как указано на фиг. 1В. Через 30 мин после обработки перорально вводят болюс глюкозы в дозе 3 г/кг, и через 0 (отсутствие болюса глюкозы), 5, 10, 20, 60 и 120 мин после введения болюса глюкозы собирают плазму. Уровни СР в плазме измеряют с помощью набора ЕЫ8А для опреде
- 52 016041 ления СТР у грызунов, полученного от Ьтсо ВекеагсЬ ЬаЬогаГогу |ЕЫ8Л для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу Е2КМСТР-55К], в соответствии с инструкциями поставщика. Статистический анализ проводят с помощью программы Ехсе1. Средние значения концентрации СТР рассчитывают на основе результатов, полученных от шести мышей в каждой группе, и выражают в виде среднего значения±8ЕМ. Из результатов, показанных на фиг. 1В, видно, что введение агониста СРВ119 приводит к увеличению как глюкозозависимого, так и глюкозонезависимого уровня СТР в крови мышей. Соединение 3 стимулирует общий СТР в плазме мышей.
Соединение 3 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022327 (опубликованной как \\'0 2005/007647).
С. Самцов мышей С57Ь1к/6 держат на голодной диете в течение 18 ч и случайным образом распределяют в четырнадцать групп по 6 животных в каждой группе (п=6). Мышам перорально вводят среду (20% гидроксипропил-в-циклодекстрин (НРСИ)) или агонист СРВ 119 настоящего изобретения (соединение 3) в дозе 1, 3 или 10 мг/кг. Через 30 мин после обработки перорально вводят болюс глюкозы в дозе 3 г/кг, и через 0 (отсутствие болюса глюкозы) или 5 мин после введения болюса глюкозы собирают плазму. Уровни СТР в плазме измеряют с помощью набора ЕЫ8Л для определения СТР у грызунов, полученного от Ьтсо ВекеагсЬ ЬаЬогаГогу [ЕЫЗЛ для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу Е2КМС[Р-55К| в соответствии с инструкциями поставщика. Статистический анализ проводят с помощью программы Ехсе1. Средние значения концентрации СТР, приведенные на фиг. 1С, рассчитывают на основе результатов, полученных от шести мышей в каждой группе. Из результатов, показанных на фиг. 1С, видно, что агонист СРВ119 (соединение 3) стимулирует общий СТР в плазме мышей в дозо-зависимой манере. Соединение 3 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022327 (опубликованной как \\'0 2005/007647).
Пример 2. Влияние агониста СРВ119 на уровень СТР в крови СРЯ119-дефицитных (с нокаутом по гену СРВ119) мышей по сравнению с мышами дикого типа.
A. Самцов СРВ119-дефицитных мышей и детенышей одного помета дикого типа держат на голодной диете в течение 18 ч. Мышам перорально вводят среду (РЕТ; 80% РЕС400, 10% этанол, 10% твин 80) или агонист СРВ119 настоящего изобретения (соединение 1; (2-фтор-4-метансульфонилфенил)-{6-[4-(3изопропил[1,2,4]оксадиазол-5-ил)пиперидин-1-ил]-5-нитропиримидин-4-ил}амин) в дозе 20 мг/кг, как указано (п=5). Через 30 мин после обработки собирают кровь (100 мкл) через ретроорбитальную вену глаза (время 0) и затем вводят (перорально) болюс глюкозы в дозе 3 г/кг. Через 5 мин после введения глюкозы собирают другой образец крови (100 мкл) (время 5 мин). После центрифугирования собирают плазму и измеряют уровни СТР в плазме с помощью набора ЕЫ8Л для определения СТР у грызунов, полученного от Ьтсо ВекеагсЬ ЬаЬогаГогу [ЕЫ8Л для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу Е2КМСТР-55К] в соответствии с инструкциями поставщика. Из результатов, показанных на фиг. 2А, видно, что присутствие функционального рецептора СРВ119 необходимо для увеличения глюкозонезависимого и глюкозозависимого уровня СТР в крови мышей под действием агониста СРВ119. Соединение 1 стимулирует общий СТР в плазме мышей дикого типа. Соединение 1 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/001267 (опубликованной как \0 2004/065380).
B. Самцов СРВ119-дефицитных мышей и детенышей одного помета дикого типа держат на голодной диете в течение 18 ч. Мышам перорально вводят среду (40% гидроксипропил-в-циклодекстрин (НРСИ)) или агонист СРВ119 настоящего изобретения (соединение 2) в дозе 30 мг/кг, как указано (п=5). Через 30 мин после обработки собирают кровь (100 мкл) через ретроорбитальную вену глаза (время 0) и затем вводят (перорально) болюс глюкозы в дозе 3 г/кг. Через 5 мин после введения глюкозы собирают другой образец крови (100 мкл) (время 5 мин). После центрифугирования собирают плазму и измеряют уровни СТР в плазме с помощью набора ЕЫ8Л для определения СТР у грызунов, полученного от Ьтсо ВекеагсЬ ЬаЬогаГогу [ЕЫ8Л для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу Е2КМСТР-55К], в соответствии с инструкциями поставщика. Средние значения концентрации СТР рассчитывают на основе результатов, полученных от пяти мышей в каждой группе. Из результатов, показанных на фиг. 2В, видно, что присутствие функционального рецептора СРВ119 необходимо для увеличения глюкозонезависимого и глюкозозависимого уровня СТР в крови мышей под действием агониста СРВ119. Соединение 2 стимулирует общий СТР в плазме мышей дикого типа. Соединение 2 идентично соединению, раскрытому в международной патентной заявке РСТ/И82004/022417 (опубликованной как \0 2005/007658).
Пример 3. Влияние агониста СРВ119 на костную массу крыс с удаленными яичниками.
С помощью описанной ниже крысиной модели с удаленными яичниками (0νΧ) (см., например, Во11ад еГ а1., Мо1 Се11 Епбосппо1 (2001), 177:35-41) можно показать, что агонист СРВ119 настоящего изобретения является эффективным при лечении или профилактике состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, и/или при увеличении костной массы у субъекта.
девственных самок 0νΧ и 20 девственных не 0νΧ крыс 8ргадие-0а\\'1еу (150-175 г) возрастом 8
- 53 016041 недель получают от Наг1ап 8ргадие-ОаМеу, Мс. (Мб1апаро1М ТЫ). Животных вволю кормят коммерческим сухим кормом, диета для грызунов Тек1аЬ (1,46% кальция), со свободным доступом к воде. Крыс случайным образом распределяют в четыре экспериментальные группы, содержащие животных сходной массы, после чего им вводят перорально среду или агонист ОРК119 настоящего изобретения. Введение осуществляют ежедневно в течение 6 недель.
1. Контроль. Десять не ОVX крыс получают перорально среду.
2. Контроль + обработка. Десять не ОVX крыс получают перорально агонист ОРК119.
3. ОVX. Десять ОVX крыс получают перорально среду.
4. ОVX + обработка. Десять ОVX крыс получают перорально агонист ОРК119.
Крыс взвешивают ежедневно, а длину измеряют в исходный момент и затем через 6 недель. Всех животных подвергают анализу методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ΌΧΆ) с помощью Но1одю ОЭК 1000/\У (^аИБат, МА) перед началом обработки и через 6 недель, полученные результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения Ка! \У1ю1е Вобу, версия 5.53.
Измеряют минеральную плотность кости позвоночника (МПК).
Через 6 недель после начала обработки определяют процент изменения плотности кости позвоночника. Показано, что введение агониста ОРК119 приводит к уменьшению негативного влияния овариэктомии на плотность кости позвоночника. Уменьшение негативного влияния овариэктомии на плотность кости позвоночника указывает на то, что обработка является эффективной с точки зрения лечения или профилактики состояния, характеризующегося снижением костной массы, такого как остеопороз, и/или увеличения костной массы субъекта.
Пример 4. Влияние агониста ОРК119 на заживление перелома кости.
С помощью описанного ниже анализа ίπ νί\Ό можно показать, что агонист ОРК119 настоящего изобретения является эффективным для лечения перелома кости.
Способ получения перелома.
Крыс 8ргадие-ОаМеу возрастом 3 месяца анестезируют кетамином. Разрез длиной 1 см делают на переднемедиальной стороне проксимальной части над правой большеберцовой костью или бедренной костью. Ниже описан способ хирургии большеберцовой кости. Делают разрез до кости и просверливают отверстие размером 1 мм на 4 мм проксимальнее дистальной поверхности бугорка большеберцовой кости и на 2 мм медиальнее переднего отростка. Вводят интрамедуллярный штифт в виде трубки из нержавеющей стали диаметром 0,8 мм (максимальная нагрузка 36,3 Н, максимальная жесткость 61,8 Н/мм, тестируют в тех же условиях, что и кости). Рассверливание костно-мозговой полости не производят. Стандартизованный закрытый перелом производят на 2 мм выше соединения большеберцовой и малоберцовой костей путем трехточечного изгиба с помощью специально сконструированных регулируемых щипцов с тупыми концами. Чтобы минимизировать повреждение мягкой ткани, нужно постараться избежать смещения перелома. Кожу зашивают нейлоновыми мононитями. Операцию проводят в стерильных условиях. Сразу после штифтования делают рентгеновские снимки всех переломов и исключают крыс с переломами вне указанной диафизарной области или со смещенными штифтами. Оставшихся животных случайным образом распределяют на группы по 10-12 животных в каждой подгруппе, соответствующей временной точке при тестировании заживления перелома. Крысам каждый день перорально вводят среду или агонист ОРК119. Агонист ОРК119 используют в количестве от 0,001 мг/кг массы тела до 100 мг/кг массы тела. Обработку проводят в течение 10, 20, 40 и 80 дней.
Через 10, 20, 40 и 80 дней 10-12 крыс из каждой группы анестезируют кетамином и умерщвляют путем обескровливания. Оба сочленения большеберцовой и малоберцовой костей удаляют после вскрытия и очищают от мягких тканей. Кости от 5-6 крыс из каждой группы хранят в 70% этаноле для последующего гистологического анализа, а кости от других 5-6 крыс из каждой группы хранят в забуференном растворе Рингера (+4°С, рН 7,4) для получения рентгеновских снимков и биомеханического тестирования.
Гистологический анализ.
Способы гистологического анализа сломанной кости ранее описаны МокекПбе апб Вак (Вопе (1993), 14:19-27). Коротко говоря, в участке перелома делают распилы на расстоянии 8 мм с каждой стороны линии перелома, не производя декальцинирования, погружают в метилметакрилат и делают фронтальные срезы толщиной 8 мкМ с помощью микротома КеюЬеп-Типд Ро1уси!. Среднефронтальные срезы, окрашенные Маккоп-ТгюТюте (как большеберцовой кости, так и малоберцовой кости), используют для визуализации клеточного и тканевого ответа, связанного с заживлением перелома, в присутствии и отсутствие лечения. Срезы, окрашенные Сириусом красным, используют для демонстрации характеристик структуры костной мозоли и для различения сплошной кости и расслаивающейся кости в участке перелома. Проводят измерения следующих параметров: (1) зазор перелома - самое короткое расстояние между концами кортикального слоя кости в участке перелома, (2) длина и диаметр костной мозоли, (3) общий объем кости в участке костной мозоли, (4) костная ткань на участке ткани вне области костной мозоли, (5) фиброзная ткань в костной мозоли и (6) площадь хряща в костной мозоли.
Биомеханический анализ.
Способы биомеханического анализа описаны ранее Вак апб Апбгеаккеп (Са1сТ! Тюыю Ш! (1989),
- 54 016041
45:292-297). Коротко говоря, перед биомеханическим тестированием делают рентгеновские снимки всех переломов. Механические свойства заживающих переломов анализируют путем деструктивного трехили четырехточечного изгиба. Определяют максимальную нагрузку, жесткость, энергию при максимальной нагрузке, деформацию при максимальной нагрузке и максимальное усилие.
Пример 5. Клонирование полноразмерного эндогенного человеческого ОРК119.
Полинуклеотид, кодирующий эндогенный человеческий ОРК119, клонируют методом ПЦР с использованием ОРК119-специфических праймеров 5'-ОТССТОССАСТТСОАОАСАТОО-8' (8Еф ΙΌ N0: 3; смысловая последовательность, АТО - инициирующий кодон) 5'-ОАААСТТСТСТОСССТТАССОТС8' (8Еф ΙΌ N0: 4; антисмысловая последовательность, 3' - стоп-кодон) и человеческой геномной ДНК в качестве матрицы. Для проведения амплификации используют ДНК-полимеразу Тас.|Р1и5 РгесШоп™ (81га!адепе) и нижеследующий цикл, повторяющийся 35 раз от стадии 2 до стадии 4: 94°С, 3 мин; 94°С, 1 мин; 58°С, 1 мин; 72°С, 2 мин; 12°С, 10 мин. Полученный методом ПЦР фрагмент с предсказанным размером 1,0 т.о. выделяют и клонируют в векторе рСКП-Т0Р0™ Цпуйгодеп), после чего его подвергают полному секвенированию с использованием набора, содержащего ДНК-секвеназу Т7 (Атегайат). Нуклеотидная последовательность описана как 8Еф ΙΌ N0: 1, а кодируемая ею аминокислотная последовательность описана как 8Еф ΙΌ N0: 2.
Пример 6. Экспрессия рецептора.
Хотя в данной области доступен ряд клеток, пригодных для экспрессии О-белок-сопряженных рецепторов, наиболее предпочтительно использовать эукариотические клетки. В некоторых воплощениях используют клетки млекопитающих или меланофоры. Нижеследующее описание является иллюстративным; специалисты в данной области могут определить, какие методы лучше всего подходят для решения конкретных задач. Применение меланофоров описано, например, ниже в примере 9.
a. Транзиентная трансфекция.
В первый день клетки 293 высевают в чашки с плотностью 6х 106/10 см. На второй день получают реакционные смеси для двух пробирок (пропорции, приведенные для каждой чашки, соответствуют одной чашке): смесь для пробирки А содержит 4 мкг ДНК (например, вектора рСМУ; вектора рСМУ, содержащего кДНК, кодирующую рецептор и др.) в 0,5 мл бессывороточной среды ЭМЕМ (О1Ьсо ВВЬ); смесь для пробирки В содержит 24 мкл липофектамина (О1Ьсо ВКЬ) в 0,5 мл бессывороточной среды ЭМЕМ. Пробирки А и В смешивают путем переворачивания (несколько раз) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30-45 мин. Полученную смесь называют смесью для трансфекции. Находящиеся на чашках клетки 293 промывают 1хРВ8 и добавляют 5 мл бессывороточной среды ЭМЕМ. К клеткам добавляют 1 мл смеси для трансфекции и инкубируют в течение 4 ч при 37°С/5% С02. Смесь для трансфекции удаляют отсасыванием, затем добавляют 10 мл ЭМЕМ/10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубируют при 37°С/5% С02. Через 48 ч клетки собирают и используют для анализа.
b. Стабильные клеточные линии.
Приблизительно 12х106 клеток 293 помещают в чашку для культивирования тканей диаметром 15 см. Выращивают в среде ЭМЕ с высокой концентрацией глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пирувата натрия, Ь-глутамин и антибиотики. Через 24 ч после начала культивирования клеток 293 (или после достижения ~80% слияния) клетки трансфицируют, используя 12 мкг ДНК (например, вектор рСМУ-пеог, содержащий кДНК, кодирующую рецептор). 12 мкг ДНК объединяют с 60 мкл липофектамина и 2 мл бессывороточной среды ЭМЕ с высоким содержанием глюкозы. Среду отсасывают с чашек и клетки промывают один раз бессывороточной средой. В чашки добавляют смесь ДНК, липофектамина и среды, а также 10 мл бессывороточной среды. После инкубации при 37°С в течение 4-5 ч среду отсасывают и добавляют 25 мл среды, содержащей сыворотку. Через 24 ч после трансфекции среду снова отсасывают и добавляют свежую среду с сывороткой. Через 48 ч после трансфекции среду отсасывают и добавляют новую среду, содержащую сыворотку и генетицин (лекарственное средство О418) в конечной концентрации 500 мкг/мл. Приблизительно 12х106 клеток 293 помещают в чашку для культивирования тканей диаметром 15 см. Выращивают в среде ЭМЕ с высокой концентрацией глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пирувата натрия, Ь-глутамин и антибиотики. Через 24 ч после начала культивирования клеток 293 (или после достижения ~80% слияния) клетки трансфицируют, используя 12 мкг ДНК (например, вектор рСМУ, содержащий кДНК рецептора). 12 мкг ДНК объединяют с 60 мкл липофектамина и 2 мл бессывороточной среды ЭМЕ с высоким содержанием глюкозы. Среду отсасывают с чашек и клетки промывают один раз бессывороточной средой. В чашки добавляют смесь ДНК, липофектамина и среды, а также 10 мл бессывороточной среды. После инкубации при 37°С в течение 4-5 ч среду отсасывают и добавляют 25 мл среды, содержащей сыворотку. Через 24 ч после трансфекции среду снова отсасывают и добавляют свежую среду с сывороткой. Через 48 ч после трансфекции среду отсасывают и добавляют новую среду, содержащую сыворотку и генетицин (лекарственное средство О418) в конечной концентрации 500 мкг/мл. Трансфицированные клетки подвергают селекции, выбирая положительно трансфицированные клетки, содержащие ген устойчивости к О418. При проведении селекции среду меняют каждые 4-5 дней. В процессе селекции клетки выращивают до получения стабильных пулов или делят на части для проведения селекции стабильных клонов.
- 55 016041
Пример 7. Анализы, используемые при проведении скрининга соединений-кандидатов, таких как, например, агонисты ОРК119.
Существует ряд способов скрининга соединений-кандидатов, таких как, например, ОРК119 агонисты. Нижеследующее описание является иллюстративным; специалисты в данной области могут определить, какие методы лучше всего подходят для решения конкретных задач. Анализы, используемые для проведения скрининга соединений, таких как агонисты О-белок-сопряженного рецептора, хорошо известны квалифицированным специалистам (см., например, международную заявку \У0 02/42461).
1. Анализы связывания с мембраной. Анализ [358]ГТФу8.
Если О-белок-сопряженный рецептор находится в активном состоянии, либо в результате связывания лиганда, либо в результате конститутивной активации, рецептор соединяется с О-белком и стимулирует высвобождение ГДФ и последующее связывание ГТФ с О-белком. Альфа-субъединица комплекса О-белок-рецептор действует как ГТФ-аза, медленно гидролизуя ГТФ до ГДФ, после чего обычно происходит дезактивация рецептора. Активированные рецепторы продолжают превращать ГДФ в ГТФ. Негидролизуемый аналог ГТФ, [358]ГТФу8, можно использовать для демонстрации увеличения связывания [358]ГТФу8 с мембранами, на которых экспрессируются активированные рецепторы. Преимущество определения активации путем измерения связывания [358]ГТФу8 заключается в том, что: (а) оно, как правило, применимо ко всем О-белок-сопряженным рецепторам; (Ь) его проводят вблизи мембранной поверхности, что уменьшает вероятность поглощения молекул, влияющих на внутриклеточный каскад.
В данном анализе используется способность О-белок-сопряженных рецепторов стимулировать связывание [358]ГТФу8 с мембранами, на которых экспрессируются рассматриваемые рецепторы. Анализ является общим и применяется для разработки лекарственных средств, действующих на все О-белоксопряженные рецепторы.
Получение мембран.
В некоторых воплощениях мембраны, содержащие О-белок-сопряженный рецептор данного изобретения и применяющиеся для идентификации соединений-кандидатов, таких как, например, агонисты рецептора, предпочтительно получают следующим образом.
a. Материалы.
Буфер для соскабливания мембран содержит 20 мМ НЕРЕ8 и 10 мМ ЕЭТА, рН 7,4; буфер для промывания мембран содержит 20 мМ НЕРЕ8 и 0,1 мМ ЕЭТА, рН 7,4; буфер для связывания содержит 20 мМ НЕРЕ8, 100 мМ ЫаС1 и 10 мМ МдС12, рН 7,4.
b. Метод.
Во время проведения метода все материалы держат на льду. Вначале из монослоя слившихся клеток удаляют среду, затем промывают 10 мл холодного РВ8 с последующим отсасыванием буфера. Затем, чтобы соскоблить клетки, добавляют 5 мл буфера для соскабливания мембран; после этого клеточный экстракт переносят в центрифужные пробирки объемом 50 мл (центрифугируют при 20000 об/мин в течение 17 мин при 4°С). Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 30 мл буфера для промывания мембран с последующим центрифугированием при 20000 об/мин в течение 17 мин при 4°С. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в буфере для связывания. Затем полученную суспензию гомогенизируют с помощью гомогенизатора Вппкшап Ро1у1гоп™ (с использованием 15-20-секундных импульсов до суспендирования всего вещества). Полученный препарат в данном описании называют мембранный белок.
Анализ белка по Брэдфорду.
После гомогенизации концентрацию мембранного белка определяют по методу Брэдфорда (белок разбавляют приблизительно до 1,5 мг/мл, берут аликвоты, замораживают (-80°С) и хранят до последующего применения; в случае замороженного препарата используют следующую методику: в день анализа замороженный мембранный белок оттаивают при комнатной температуре, встряхивают и гомогенизируют с помощью Ро1у!гоп приблизительно при 12x1000 об/мин в течение приблизительно 5-10 с; следует отметить, что в случае обработки нескольких препаратов гомогенизатор нужно тщательно промыть перед гомогенизацией другого препарата).
a. Материалы.
Буфер для связывания (как описано выше); окрашивающий реагент для анализа Брэдфорда; стандартный белок для анализа Брэдфорда используют в соответствии с инструкциями производителя (Вюгаб, № по каталогу 500-0006).
b. Метод.
Готовят пробирки с дубликатами, одна пробирка содержит мембранный препарат, а другая содержит контрольный пустой раствор. Каждая пробирка содержит 800 мкл буфера для связывания. Затем в каждую пробирку добавляют 10 мкл раствора стандартного белка для анализа Брэдфорда (1 мг/мл), а 10 мкл мембранного белка добавляют только в одну пробирку (не контрольную). Затем во все пробирки добавляют 200 мкл окрашивающего реагента для анализа Брэдфорда и встряхивают. Через 5 мин пробирки снова встряхивают и находящееся в них вещество переносят в кюветы. Кюветы прочитывают на спектрофотометре СЕСЧЬ 3041 при длине волны 595.
- 56 016041
Идентификационный анализ.
a. Материалы.
Получают буфер ГДФ путем смешивания 37,5 мл буфера для связывания и 2 мг ГДФ (81дта, № по каталогу О-7127) и затем делают серийные разбавления буфером для связывания до получения концентрации ГДФ 0,2 мкМ (конечная концентрация ГДФ в каждой лунке составляет 0,1 мкМ); конечный объем реакционной смеси в каждой лунке, содержащей соединение-кандидат, составляет 200 мкл и включает в себя 100 мкл буфера ГДФ (конечная концентрация ГДФ 0,1 мкМ), 50 мкл мембранного белка в буфере для связывания и 50 мкл [358]ГТФу8 (0,6 нМ) в буфере для связывания (2,5 мкл [358]ГТФу8 на 10 мл буфера для связывания).
b. Метод.
Предпочтительно скрининг соединений-кандидатов проводят в формате 96-луночного планшета (соединения могут быть заморожены при -80°С). Мембранный белок (или мембраны с вектором экспрессии, не содержащие целевого ОРСК, в качестве контроля) быстро гомогенизируют до получения суспензии. Затем с помощью описанного выше метода Брэдфорда определяют концентрацию белка. Мембранный белок (и контроль) разбавляют буфером для связывания до получения концентрации 0,25 мг/мл (конечная концентрация в аналитической смеси 12,5 мкг/лунку). В каждую лунку №а11ас ЗспШйпр™ (№а11ас) добавляют 100 мкл буфера ГДФ. Затем с помощью пипетки на 5 мкл в каждую лунку вносят 5 мкл соединения-кандидата (5 мкл составляет 1:40 часть от общего объема аналитической смеси, следовательно, конечная концентрация соединения-кандидата, используемая в скрининге, составляет 10 мкМ). Опять же, чтобы избежать загрязнения, после каждого переноса пипетку следует промывать в трех резервуарах, содержащих воду (1х), этанол (1х) и воду (2х), причем после каждого промывания избыток жидкости нужно удалять и сушить пипетку с помощью бумаги и безворсовых салфеток. Затем в каждую лунку добавляют 50 мкл мембранного белка (контрольная лунка содержит мембраны без целевого ОРСК) и преинкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют 50 мкл [358]ГТФу8 (0,6 нМ) в буфере для связывания и инкубируют на шейкере в течение 60 мин при комнатной температуре (в данном примере планшеты накрывают фольгой). Реакцию останавливают путем центрифугирования планшетов при 4000 об/мин в течение 15 мин при 22°С. Среду из лунок отсасывают 8-канальным коллектором, и планшеты закрывают крышками для планшетов. Затем планшеты прочитывают на №а11ас 1450, используя установку Рго!. #37 (в соответствии с инструкциями производителя).
2. Аденилатциклазный анализ.
Набор для определения аденилатциклазы Р1а§й Р1а!е™ (№\ν Епд1апб М1с1еаг; № по каталогу 8МР004А), разработанный для анализов клеток, можно модифицировать в применении к неочищенным плазматическим мембранам. Лунки Р1а§й Р1а!е могут содержать сцинтилляционное покрытие, в состав которого также входит антитело, специфически распознающее цАМФ. Количество образующегося в лунках цАМФ можно определить путем анализа непосредственной конкуренции с радиоактивно меченным цАМФ за связывание с антителом против цАМФ. Ниже приведено краткое описание методики измерения изменений уровней цАМФ в клетках, экспрессирующих рецепторы.
В некоторых воплощениях для идентификации соединений-кандидатов, таких как, например, агонисты ОРК119, используют модифицированный набор для определения аденилатциклазы Р1а§й Р1а!е™ (№\ν Епд1апб М1с1еаг; № по каталогу 8МР004А) в соответствии с нижеследующей методикой.
Клетки, трансфицированные геном, кодирующим О-белок-сопряженный рецептор данного изобретения, собирают примерно через три дня после трансфекции. Мембраны получают путем гомогенизации клеток, суспендированных в буфере, содержащем 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4 и 10 мМ МдС12. Гомогенизацию проводят на льду с помощью Вгшктаи Ро1у!гоп™ в течение приблизительно 10 с. Полученный гомогенат центрифугируют при 49000хд в течение 15 мин при 4°С. Затем полученный осадок ресуспендируют в буфере, содержащем 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4 и 0,1 мМ БЭТА, гомогенизируют 10 с и центрифугируют при 49000хд в течение 15 мин при 4°С. Полученный осадок хранят при -80°С до использования. Непосредственно в день идентификационного анализа мембранный осадок медленно оттаивают при комнатной температуре и ресуспендируют в буфере, содержащем 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, и 10 мМ МдС12, с получением конечной концентрации 0,60 мг/мл (ресуспендированные мембраны помещают на лед до применения).
Стандартные растворы цАМФ и буфер для детекции (содержащий 2 мкКи метки ([125ЦцАМФ (100 мкл) в 11 мл буфера для детекции)) получают и хранят в соответствии с инструкциями производителя. Для скрининга используют свежеполученный буфер для анализа, содержащий 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 10 мМ МдС12, 20 мМ фосфокреатин (81дта), 0,1 единиц/мл креатинфосфокиназы (81дта), 50 мкМ ГТФ (81дта) и 0,2 мМ АТФ (81дта); буфер для анализа хранят на льду до использования.
Предпочтительно соединения-кандидаты добавляют, например, в лунки 96-луночного планшета (3 мкл/лунку; конечная концентрация в аналитической смеси 12 мкМ) вместе с 40 мкл препарата мембранного белка (30 мкг/лунку) и 50 мкл буфера для анализа. Затем полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при легком встряхивании.
После инкубации в каждую лунку добавляют 100 мкл буфера для детекции и инкубируют в течение
- 57 016041
2-24 ч. Затем планшеты считают с помощью планшет-ридера \Уа11ас МюгоВеЬа™, используя РгоЬ. #31 (в соответствии с инструкциями производителя).
3. Анализ репортера СВЕ-Ьис.
Клетки 293 и 293Т высевают на 96-луночные планшеты с плотностью 2х104 клеток на лунку и на следующий день проводят трансфекцию с использованием реагента липофектамина (ВВЕ) в соответствии с инструкциями производителя. Смесь ДНК/липид для каждой б-луночной трансфекции получают следующим образом: 260 нг плазмидной ДНК в 100 мкл ИМЕМ осторожно смешивают с 2 мкл липида в 100 мкл ИМЕМ (260 нг плазмидной ДНК включают в себя 200 нг репортерной плазмиды 8XСВΕ-^ис, 50 нг рСМУ, содержащего последовательность, кодирующую О-белок-сопряженный рецептор данного изобретения, или только рСМУ, и 10 нг экспрессионной плазмиды ОРВ8 (ОРВ8 в рс^NΑ3 Дпуйгодеп)). Репортерную плазмиду 8XСВΕ-^ис получают следующим образом: вектор 8В1Е-в-да1 получают путем клонирования промотора крысиного соматостатина (-71/+51) в участке ВдРУ-НшОШ вектора рвдаЕВазю (С1оп1ес11). Восемь копий цАМФ-чувствительного элемента, полученных методом ПЦР с использованием в качестве матрицы аденовируса А0рСЕ12 6ССВЕ8 (см., 8ιιζι.ι1<ί е1 а1., Ниш Оепе ТЬег (1996), 7:1883-1893; содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте), клонируют в векторе 8ВIΕ-β-да1 в участке Крп-ВдЬУ и получают репортерный вектор 8хСВЕ-в-да1. Репортерную плазмиду 8хСВЕ-Ьис получают путем замены гена бета-галактозидазы в репортерном векторе 8хСВЕ-в-да1 геном люциферазы, полученным из вектора рОЬ3-Ьа8Ю (Ргошеда), участок НшОШ-ВашШ. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре смесь ДНК/липид разбавляют 400 мкл ЭМЕМ и 100 мкл разбавленной смеси вносят в каждую лунку.
После 4 ч инкубации в инкубаторе для клеточных культур в каждую лунку добавляют 100 мкл ЭМЕМ, содержащей 10% ЕС8. На следующий день среду для трансфицированных клеток заменяют на 200 мкл/лунку ЭМЕМ, содержащей 10% ЕС8. Через 8 ч среду в лунках заменяют на 100 мкл/лунку ИМЕМ, не содержащей фенолового красного, после одного промывания РВ8. Активность люциферазы измеряют на следующий день, используя набор для анализа репортерного гена ЬисЬНе™ (РаскагО), в соответствии с инструкциями производителя, планшеты считают на сцинтилляционном и люминесцентном счетчике 1450 МюгоВеЬа™ (^а11ас).
Пример 8. Аденилатциклазный анализ на целых клетках, например, активности агониста ОРВ119.
Измерение циклического АМФ проводят с использованием набора для определения аденилатциклазной активности Е1а§Ь Р1аЬе™ (№\ν Епд1ап0 №.1с1еаг) в соответствии с инструкциями поставщика. Клетки НЕК293 высевают в чашки для культивирования тканей диаметром 15 см с плотностью 12х106 клеток на чашку в обычной питательной среде (ИМЕМ/10% ЕВ8). На следующий день 10 мкг либо пустого ДНК-вектора, либо экспрессионной ДНК-плазмиды трансфицируют в клетки с использованием липофектамина Дпуйгодеп, СагИЬаО, СА) в соответствии с инструкциями производителя. После культивирования в течение 24 ч трансфицированные клетки собирают и помещают в буфер для диссоциации клеток ОШСО (№ по каталогу 13151-014), осаждают путем центрифугирования в течение 5 мин при 1100 об/мин и осторожно ресуспендируют в подходящем объеме буфера для анализа (50% 1хРВ8 и 50% буфера для стимуляции) до получения конечной плотности клеток 2х106/мл. Получают препараты тестируемых соединений в 50 мкл буфера для анализа с желательной концентрацией, если она указана, и вносят их в лунки 96-луночного планшета Е1а§Ь Р1аЬе. Затем добавляют полученную ранее суспензию клеток (50 мкл на лунку). После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре в лунки добавляют 100 мкл смеси для детекции, содержащей меченый [125Ц-цАМФ. Планшеты инкубируют еще 2 ч и считают в сцинтилляционном счетчике \Уа11ас МюгоВеЬа. Значения количества цАМФ/лунку определяют с помощью стандартной кривой цАМФ, которая прилагается к каждому аналитическому планшету.
Повышение уровня цАМФ в ОРВ119-трансфицированных клетках НЕК293 по сравнению с клетками НЕК293, трансфицированными пустым вектором, указывает на то, что тестируемое соединение стимулирует функционирование рецептора ОРВ119.
Пример 9. Анализ, например, агонистической активности ОРВ119 с использованием меланофоров.
Меланофоры культивируют, как описано Ро1епха е1 а1. [Р1дшепЬ Се11 ВекеагсЬ (1992), 5:372-378], и трансфицируют вектором экспрессии, кодирующим рецептор ОРВ119 (ОРВ119; например, человеческий ОРВ119, ОепВапк®, № доступа ААР72125, и его аллели), используя метод электропорации. После электропорации трансфицированные клетки помещают в 96-луночные аналитические планшеты. Затем клетки оставляют расти в течение 48 ч, чтобы они восстановились после процедуры электропорации, а экспрессия рецептора достигла максимального уровня.
В день анализа питательную среду заменяют на бессывороточный буфер, содержащий 10 нМ мелатонина. Мелатонин действует в меланофорах через эндогенный О1-сопряженный ОРСВ, снижая уровень внутриклеточного цАМФ. В ответ на снижение уровня цАМФ пигмент в меланофорах перемещается в центр клетки. Результатом этого является уменьшение поглощения, измеряемого для монослоя клеток в лунке при 600-650 нМ.
После инкубации в течение 1 ч в среде, содержащей мелатонин, в клетках наблюдается завершение агрегации пигмента. В данный момент измеряют исходный уровень поглощения. Затем в планшет добав
- 58 016041 ляют серийные разведения тестируемых соединений; соединения, обладающие агонистической активностью в отношении СРВ119, вызывают увеличение уровня внутриклеточного цАМФ. В ответ на увеличение уровня внутриклеточного цАМФ пигмент в меланофорах перемещается обратно к периферии клеток. Через час в стимулированных клетках завершается диспергирование пигмента. Монослой клеток с диспергированным пигментом абсорбирует гораздо больше света в диапазоне 600-650 нм. Измерение увеличения поглощения по сравнению с исходным уровнем позволяет количественно оценить степень стимуляции рецептора и построить кривую доза-ответ.
Описание материалов и методов, используемых в анализе меланофоров, можно найти в патентах США № 5462856 и 6051386, содержание каждого из них включено в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.
Увеличение диспергирования пигмента в СРВ119-трансфицированных меланофорах по сравнению с меланофорами, трансфицированными пустым вектором, указывает на то, что тестируемое соединение стимулирует функционирование рецептора СРВ119.
Специалистам в данной области известны и другие анализы, которые можно использовать для идентификации соединения, такого как агонист СРВ119 (см., например, приведенный выше пример 7).
Пример 10. Анализ, например, активности агониста СРВ119 с использованием дрожжевого репортера.
Анализ репортера на основе дрожжевых клеток описан в литературе (например, см. Мпе! е! а1., ί. Вю1 Сйет (2002), 277:6881-6887; СатрЬе11 е! а1., Вюогд Меб Сйет Ьей (1999), 9:2413-2418; Ктд е! а1., 8с1еисе (1990), 250:121-123; \УО 99/14344; \УО 00/12704 и И8 6100042). Коротко говоря, методом генной инженерии получают дрожжевые клетки, в которых эндогенный дрожжевой С-альфа (СРА1) заменен на сконструированные разными способами химерные С-белки. Кроме того, эндогенный СРСВ дрожжевых альфа-клеток, 8!е3, удаляют, чтобы обеспечить гомологичную экспрессию представляющего интерес СРСВ млекопитающих. В дрожжах элементы пути передачи сигнала феромона, которые являются консервативными для эукариотических клеток (например, путь митоген-активируемой протеинкиназы), управляют экспрессией Еик1. Путем помещения гена β-галактозидазы (Ьас2) под контроль промотора Еик1 (Еик1р) получают систему, в которой активация рецептора приводит к считыванию фермента.
Дрожжевые клетки трансформируют с помощью адаптированного способа с использованием ацетата лития, описанного Ада!ер е! а1. (Ада!ер е! а1., 1998, ТгаикГогтайои о! 8ассйаготусек сегеуШае Ьу !йе 1йй1ит асе!а!е/ктд1е-к!гаибеб сатег ^NА/ро1уеΐйу1еие д1усо1 (^^Ас/кк-^NА/РЕС) рго!осо1. Тесйтса1 Т1рк Ои1те, Тгеибк 1оигиа1к, Е1кеу1ег). Коротко говоря, дрожжевые клетки выращивают в течение ночи на планшетах с дрожжевым триптоном (ΥΓ). Носитель одноцепочечную ДНК (10 мкг), 2 мкг каждой из двух репортерных плазмид Еик1р-Ьас2 (одна содержит маркер селекции ИВА, а другая - ТВР), 2 мкг СРВ119 (например, человеческого рецептора) в дрожжевом векторе экспрессии (2 мкг точки начала репликации) и буфер, содержащий ацетат лития/полиэтиленгликоль/ТЕ, вносят пипеткой в пробирку Эппендорфа. В состав дрожжевой экспрессионной плазмиды, содержащей рецептор, или контрольной плазмиды, не содержащей рецептор, входит маркер ЬЕИ. Дрожжевые клетки вносят в полученную смесь и инкубируют при 30°С в течение 60 мин. Затем дрожжевые клетки подвергают тепловому удару при 42°С в течение 15 мин. Затем клетки промывают и переносят на планшеты для селекции. Планшеты для селекции содержат синтетическую дрожжевую среду определенного состава, не содержащую ЬЕИ, ИВА и ТВР (δϋ-ЬиТ). После инкубации при 30°С в течение 2-3 дней колонии, выращенные на планшетах для селекции, тестируют, используя анализ Ьас2.
Чтобы провести флуориметрический ферментативный анализ β-галактозидазы, дрожжевые клетки, несущие исследуемый рецептор СРВ119, выращивают в течение ночи в жидкой среде 8Э-ЬиТ до концентрации, не достигающей насыщения (т.е. клетки еще делятся, не достигнув стационарной фазы). Затем клетки разбавляют свежей средой до оптимальной для анализа концентрации и 90 мкл суспензии дрожжевых клеток вносят в 96-луночные черные планшеты из полистирола (Сок!аг). В планшеты добавляют тестируемые соединения, растворенные в ИМ8О и разбавленные 10х 10% раствором ИМ8О, после чего планшеты инкубируют при 30°С в течение 4 ч. Через 4 ч в каждую лунку добавляют субстрат βгалактозидазы. В данных экспериментах используют диф-Э-галактопиранозид) флуоресцеина (ЕИС), субстрат фермента, высвобождающего флуоресцеин, позволяющий проводить флуориметрические измерения. В каждую лунку добавляют 20 мкл смеси, содержащей 500 мкМ ЕИС/2,5% тритон Х100 (детергент необходим для придания клеткам проницаемости). После инкубации клеток с субстратом в течение 60 мин в каждую лунку добавляют 20 мкл 1М раствора карбоната натрия, чтобы остановить реакцию и увеличить флуоресцентный сигнал. Затем планшеты прочитывают на флуориметре при 485/535 нМ.
Увеличение флуоресцентного сигнала в СРВ119-трансформированных дрожжевых клетках по сравнению с дрожжевыми клетками, трансформированными пустым вектором, указывает на то, что тестируемое соединение стимулирует функционирование рецептора СРВ119 (например, соединение, которое представляет собой агонист или частичный агонист СРВ119). В некоторых воплощениях соединения данного изобретения увеличивают флуоресцентный сигнал до уровня, превышающего исходный сигнал (сигнал, полученный в присутствии только среды).
- 59 016041
Пример 11. Соединение, меченное радиоактивным изотопом.
В некоторых воплощениях соединение, заведомо являющееся лигандом О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, метят радиоактивной меткой. Как указано в данном описании, меченное радиоактивным изотопом соединение можно использовать в скрининге, проводимом с целью идентификации/характеристики соединений. В общих чертах, способность впервые синтезированного или идентифицируемого соединения (т.е. тестируемого соединения) уменьшать связывание меченного радиоактивным изотопом известного лиганда рецептора можно оценить по уменьшению образования комплекса меченного радиоактивным изотопом известного лиганда с рецептором.
Подходящие радионуклиды, которые можно ввести в состав соединений настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, 3Н (также обозначаемый Т), С. 14С, 18Р, 125Ι, 82Вг, 123Ι, 124Ι, 125Ι, 131Ι, 75Вг, 76Вг, 150, +, 358 и 77Вг. Чаще всего используют соединения, содержащие 3Н, 14С, 125Ι, 131Ι, 358 или 82Вг.
Следует понимать, что меченное радиоактивным изотопом соединение представляет собой соединение, которое содержит по меньшей мере один радионуклид. В некоторых воплощениях радионуклид выбран из группы, состоящей из 3Н, 14С, 125Ι, 358 и 82Вг. В некоторых воплощениях радионуклид представляет собой 3Н или 14С. Кроме того, следует понимать, что все атомы, присутствующие в соединениях, заведомо являющихся лигандами О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, могут представлять собой либо наиболее часто встречающиеся изотопы таких атомов, либо реже встречающиеся радиоактивные изотопы или нерадиоактивные изотопы.
Синтетические способы введения радиоактивных изотопов в состав органических соединений, например трития в целевые молекулы, в том числе способы, применимые к соединениям, заведомо являющимся лигандами О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, хорошо известны в данной области и включают в себя следующее.
A. Каталитическое восстановление газообразным тритием. Данный способ обычно позволяет получать продукты с высокой удельной активностью и требует наличия галогенированных или ненасыщенных предшественников.
B. Восстановление боргидридом [Н] натрия. Данный способ является более дешевым и требует наличия предшественников, содержащих восстанавливаемые функциональные группы, такие как альдегиды, кетоны, лактоны, сложные эфиры и т. п.
C. Восстановление гидридом [3Н] лития алюминия. Данный способ позволяет получать продукты почти с теоретической удельной активностью. Он также требует наличия предшественников, содержащих восстанавливаемые функциональные группы, такие как альдегиды, кетоны, лактоны, сложные эфиры и т. п.
Ό. Мечение путем воздействия газообразного трития. Данный способ включает в себя воздействие на предшественники, содержащие заменяемые протоны, газообразного трития в присутствии подходящего катализатора.
Е. ^метилирование в присутствии метилиодида [3Н]. Данный способ обычно используют для получения О-метилированных или ^метилированных (3Н) продуктов путем обработки подходящих предшественников метилиодидом [3Н] с высокой удельной активностью. Данный способ, как правило, позволяет получать соединения с высокой удельной активностью, такой как приблизительно 80-87 Ки/ммоль.
Синтетические способы введения изотопов 125Ι в целевые молекулы включают в себя следующее.
A. Способ Сандмейера и подобные реакции. Данный способ позволяет превратить арил или гетероариламин в соль диазония, такую как тетрафторборат, и затем в 125Ьмеченное соединение с использованием Ка125! Данный способ описан 2Пи, Ό.-О. с соавторами в 1. 0гд. СПеш. 2002, 67, 943-948.
B. Орто-125иодинирование фенолов. Данный способ позволяет осуществлять введение 125Ι в ортоположение фенола, как описано СоШег, Т.Ь. с соавторами в 1. ЬаЬеПеб Сошрб ЯабюрПагш. 1999, 42, 8264-8266.
C. Замена брома в арил- и гетероарилбромидах на 125Ι. Данный способ обычно проводят в две стадии. Первая стадия включает в себя превращение арил- или гетероарилбромида в соответствующее промежуточное соединение триалкилолова с помощью, например, катализируемой Рб реакции (например, Рб(РП3Р)4), или через арил или гетероарил лития, в присутствии галогенида триалкилолова или гексаалкилдиолова (например, (СН3)з8п8п(СН3)з). Данный способ описан Вак, М.-Ό. с соавторами в 1. ЬаЬеПеб Сошрб ЯабюрПагш. 2001, 44, 8280-8282.
Вышеописанные способы предназначаются для иллюстрации, но не для ограничения. Другие методы радиоактивного мечения соединений, заведомо являющихся лигандами О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, хорошо известны квалифицированным специалистам.
Пример 12.
Анализ связывания рецептора.
Тестируемое соединение можно охарактеризовать по его способности уменьшать образование комплекса соединения, заведомо являющегося лигандом О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, с рецептором. В некоторых воплощениях известный лиганд содержит радиоактивный изотоп. Меченный радиоактивным изотопом известный лиганд можно использовать в скрининге, проводимом для
- 60 016041 идентификации/характеристики соединений. В общих чертах, способность впервые синтезированного или идентифицируемого соединения (т.е. тестируемого соединения) уменьшать связывание меченного радиоактивным изотопом известного лиганда рецептора можно оценить по уменьшению образования комплекса меченного радиоактивным изотопом известного лиганда с рецептором.
Уменьшение уровня специфического связывания меченного радиоактивным изотопом известного лиганда в присутствии тестируемого соединения по сравнению с уровнем специфического связывания меченного радиоактивным изотопом известного лиганда в отсутствие тестируемого соединения, указывает на то, что в присутствии тестируемого соединения образуется меньше комплекса указанного меченного радиоактивным изотопом известного лиганда с указанным рецептором, чем в отсутствие тестируемого соединения.
Способ детекции комплекса соединения, заведомо являющегося лигандом О-белок-сопряженного рецептора данного изобретения, с рецептором.
A. Получение рецептора.
Клетки 293 транзиентно трансфицируют 10 мкг вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий С-белок-сопряженный рецептор данного изобретения, с использованием 60 мкл липофектамина (на 15-см чашке). После выращивания транзиентно трансфицированных клеток на чашках в течение 24 ч (до 75% слияния) среду удаляют и заменяют буфером Нерез-ЕЭТА 10 мл/чашку (20 мМ НЕРЕ8+10 мМ ЕЭТА, рН 7,4). Затем клетки центрифугируют в центрифуге Весктап Сои11ег в течение 20 мин при 17000 об/мин (ротор 1А-25.50). Осадок ресуспендируют в 20 мМ НЕРЕ8+1 мМ ЕЭТА, рН 7,4, гомогенизируют с помощью 50-мл гомогенизатора Эоипсе и снова центрифугируют. После удаления супернатанта осадки хранят при -80°С до использования в анализе связывания. Для проведения анализа мембраны оттаивают на льду в течение 20 мин и затем добавляют 10 мл буфера для инкубации (20 мМ Нерез, 1 мМ МдС12, 100 мМ КаС1, рН 7,4). Затем мембраны встряхивают, чтобы суспендировать осадок неочищенных мембран и гомогенизируют с помощью гомогенизатора Вппктапп РТ-3100 Ро1у1гоп в течение 15 с в режиме б. Концентрацию мембранного белка определяют методом Брэдфорда ВКЬ.
B. Анализ связывания.
Для определения общего связывания в 96-луночные полипропиленовые планшеты для микротитрования вносят соответствующим образом разбавленные мембраны в общем объеме 50 мкл (разбавляют буфером для анализа, содержащим 50 мМ Тпз НС1 (рН 7,4), 10 мМ МдС12 и 1 мМ ЕЭТА; 5-50 мкг белка), затем 100 мкл буфера для анализа и 50 мкл меченного радиоактивным изотопом известного лиганда. При определении неспецифического связывания добавляют не 100, а 50 мкл буфера для анализа и перед добавлением 50 мкл меченного радиоактивным изотопом известного лиганда добавляют 50 мкл 10 мкМ раствора немеченного указанного известного лиганда. Затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 60-120 мин. Реакцию связывания останавливают путем фильтрования аналитических планшетов с использованием устройства для фильтрования микропланшетов СЕ/С и коллектора для 96-луночных планшетов Вгап<!е11, с последующим промыванием холодным буфером 50 мМ Тпз НС1, рН 7,4, содержащим 0,9% NаС1. Затем дно фильтрационных планшетов герметично закрывают, в каждую лунку добавляют 50 мкл ОрОрйазе 8ирегт1х, закрывают верх и планшеты считают в сцинтилляционном счетчике Тп1их М1сгоВе1а. Чтобы определить, действительно ли в присутствии тестируемого соединения образуется меньше комплекса меченного радиоактивным изотопом известного лиганда с указанным рецептором, в соответствующие лунки вместо 100 мкл буфера для анализа добавляют 100 мкл соответствующим образом разбавленного раствора указанного тестируемого соединения и затем 50 мкл указанного меченного радиоактивным изотопом известного лиганда.
C. Вычисления.
Тестируемые соединения вначале анализируют в концентрациях 10, 1 и 0,1 мкМ, затем в диапазоне концентраций, выбранном так, чтобы средняя доза вызывала приблизительно 50% ингибирование связывания меченного радиоактивным изотопом известного лиганда (т.е. соответствовала 1С50). Специфическое связывание в отсутствие тестируемого соединения (В0) определяют как разность общего связывания (Вт) и неспецифического связывания (~Ν8β), аналогично специфическое связывание (в присутствии тестируемого соединения) (В) определяют как разность замещенного связывания (ВЭ) и неспецифического связывания (У8В). 1С50 определяют с помощью кривой ингибирования, зависимости 1о§11-1о§%В/Во от концентрации тестируемого соединения.
К; рассчитывают путем трансформации Ченга и Прустофа:
К1=1С50/(1+[Ъ]/Кп) где [Б] обозначает используемую в анализе концентрацию меченного радиоактивным изотопом известного лиганда, а Ко обозначает константу диссоциации меченного радиоактивным изотопом известного лиганда, определяемую независимо в таких же условиях связывания.
Пример 13. Влияние агониста СРК119 на секрецию С1Р в линии энтероэндокринных клеток или в клетках ткани, полученной из обогащенного К-клетками участка тонкого кишечника.
С помощью описанного здесь анализа т νίίΐΌ можно показать, что агонист СРК119 настоящего изобретения стимулирует секрецию С1Р в линии энтероэндокринных клеток или в клетках ткани, полу
- 61 016041 ченной из обогащенного К-клетками участка тонкого кишечника [например, ткани двенадцатиперстной кишки или тощей кишки; см., например, 8опбЫ е! а1., Рйагтасодепебск 1. (2006), 6:131-140]. В первый день энтероэндокринные клетки или клетки ткани, полученной из обогащенного К-клетками участка тонкого кишечника, помещают в 24-луночные планшеты в полной культуральной среде (ИМЕМ/10% ЕВ8). На второй день культуральную среду заменяют средой с низким содержанием глюкозы (ΌΜΕΜ/ 3 мМ глюкоза/10% РВ8). На третий день клетки дважды промывают 1хРВ8. Промытые клетки стимулируют средой, агонистом СРВ119 в разных концентрациях (например, в интервале от 1 нМ до 20 мкМ) или форсколином (1 мкМ) в качестве положительного контроля, в бессывороточной среде, содержащей 15 мМ глюкозу, в течение 1 ч при 37°С и 5% С02, в инкубаторе для тканевых культур. Затем супернатанты собирают и осветляют путем центрифугирования при 500 д и 4°С в течение 5 мин. Высвобождение С1Р в супернатант определяют методом ЕЬ18Л с использованием реагентов, полученных от БШСЮ ВекеагсН ЬаЬога!огу [ЕЫ8Л для определения крысиного/мышиного желудочного ингибиторного полипептида (общего), № по каталогу Е2ВМС1Р-55К], в соответствии с инструкциями поставщика.
Вышеизложенное описание разъясняет принципы настоящего изобретения наряду с примерами, приведенными с целью иллюстрации, однако следует понимать, что осуществление данного изобретения включает в себя все традиционные вариации, адаптации или модификации, входящие в объем нижеследующей формулы изобретения.

Claims (116)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение клетки-хозяина или мембраны клетки-хозяина, содержащих СРСВ для идентификации средств, усиливающих секрецию С1Р, где клетка-хозяин или ее мембрана предназначены для контакта с тестируемым соединением, где СРСВ содержит:
    (ί) аминокислоты 1-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
    (ίί) аминокислоты 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (ίίί) аминокислотную последовательность СРСВ, кодируемую полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1;
    (ίν) аминокислотную последовательность СРСВ, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 2 по всей своей длине; и (ν) аминокислотную последовательность конститутивно активной версии СРСВ, имеющей 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    и где способность тестируемого соединения стимулировать функционирование рецептора указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СГР.
  2. 2. Применение по п.1, дополнительно включающее:
    (с) приведение соединения, обладающего способностью стимулировать функционирование рецептора, определенное на стадии (Ь), в контакт ίη νίΐΐΌ с энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного; и (б) определение того, стимулирует ли соединение секрецию СШ энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного;
    где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию ШР энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СШ.
  3. 3. Применение по п.1, дополнительно включающее:
    (с) определение того, увеличивает ли соединение уровень ШР у позвоночного, путем измерения уровня ШР в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили соединение, стимулирующее функционирование рецептора на стадии (Ь);
    где способность тестируемого соединения увеличивать уровень ШР у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ШР.
  4. 4. Применение по п.1, дополнительно включающее:
    (с) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы у позвоночного путем измерения уровня костной массы в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили соединение, стимулирующее функционирование рецептора на стадии (Ь);
    где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного дополнительно указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СШ.
  5. 5. Применение по п.3 или 4, где позвоночным является человек.
  6. 6. Применение по п.3 или 4, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  7. 7. Применение по любому из пп.1-6, где рецептор является рекомбинантным.
  8. 8. Применение по любому из пп.1-7, где клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, а указанный вектор экспрессии содержит полинуклеотид, кодирующий СРСВ.
  9. 9. Применение по любому из пп.1-8, где указанное определение проводят путем измерения уровня
    - 62 016041 вторичного мессенджера.
  10. 10. Применение по п.9, где вторичный мессенджер выбран из группы, состоящей из циклического АМФ (цАМФ), циклического ГМФ (цГМФ), инозитол-1,4,5-трифосфата ДР3), диацилглицерина (ОАС), активности киназы МАР, активности киназы-1 киназы МАРК/ЕКК (МЕКК1) и Са2+.
  11. 11. Применение по п.10, где уровень цАМФ повышается.
  12. 12. Применение по любому из пп.1-8, где указанное определение проводят посредством анализа меланофоров путем измерения связывания ГТФу8 с мембраной, содержащей указанный СРСК, или посредством анализа репортера.
  13. 13. Применение по любому из пп.1-12, где клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего.
  14. 14. Применение по любому из пп.1-12, где клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клеткухозяина.
  15. 15. Применение по любому из пп.1-12, где клетка-хозяин представляет собой меланофор.
  16. 16. Применение по любому из пп.1-15, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  17. 17. Применение по любому из пп.1-16, где рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
  18. 18. Применение по любому из пп.1-17, где рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0: 2.
  19. 19. Способ идентификации средств, усиливающих секрецию С!Р, включающий в себя следующие стадии:
    (a) приведение агониста СРК119 ш νίΐτο в контакт с энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного; и (b) определение того, стимулирует ли агонист СРК119 секрецию ШР энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного;
    где способность агониста СРК119 стимулировать секрецию СШ энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ШР, позвоночного указывает на то, что агонист СРК119 представляет собой средство, усиливающее секрецию СШ.
  20. 20. Способ идентификации средств, усиливающих секрецию ШР, включающий в себя стадию:
    (а) определения того, увеличивает ли агонист СРК119 уровень ШР у позвоночного, путем измерения уровня ШР в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили агонист СРК119;
    где способность агониста СРК119 увеличивать уровень ШР у позвоночного указывает на то, что агонист СРК119 представляет собой средство, усиливающее секрецию ШР.
  21. 21. Способ идентификации средств, усиливающих секрецию ШР, включающий в себя стадию:
    (а) определения уровня костной массы в биологическом образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили агонист СРК119;
    где способность агониста СРК119 увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что агонист СРК119 представляет собой средство, усиливающее секрецию ШР.
  22. 22. Способ по п.20 или 21, где позвоночным является человек.
  23. 23. Способ по п.20 или 21, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  24. 24. Способ по любому из пп.19-23, где агонист СРК119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  25. 25. Способ по любому из пп.19-23, где агонист СРК119 представляет собой агонист человеческого СРК119.
  26. 26. Способ по любому из пп.19-25, где агонист СРК119 представляет собой селективный агонист СРК119.
  27. 27. Способ по любому из пп.19-26, где агонист СРК119 обладает избирательностью по отношению к СРК119, большей, чем к рецептору кортикотропин-рилизинг фактора-1 (СКЕ-1).
  28. 28. Способ по любому из пп.19-27, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 10 мкМ.
  29. 29. Способ по любому из пп.19-27, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 1 мкМ.
  30. 30. Способ по любому из пп.19-27, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  31. 31. Способ по любому из пп.19-27, где агонист СРК119 является перорально активным и имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  32. 32. Способ по любому из пп.19-31, где агонист СРК119 является перорально активным.
  33. 33. Способ по п.19, включающий перед стадией (а) следующие дополнительные стадии ш νίΐτο:
    (х) приведение тестируемого соединения в контакт с клеткой-хозяином или с мембраной клеткихозяина, содержащими СРСК, где СРСК содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (ΐ) аминокислот 1-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;
    (ίί) аминокислот 2-335 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;
    - 63 016041 (ίίί) аминокислотной последовательности СРСК, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8ЕО ГО N0: 1;
    (ίν) аминокислотной последовательности СРСК, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ГО N0: 2; и (ν) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии СРСК, описанной как 8ЕО ГО N0: 2; и (у) определение способности тестируемого соединения стимулировать функционирование рецептора;
    где способность тестируемого соединения стимулировать функционирование рецептора указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СТР, и где агонист СРК119 стадии (а) представляет собой тестируемое соединение, идентифицированное как стимулирующее функционирование рецептора на стадии (у).
  34. 34. Способ по п.20 или 21, включающий перед стадией (а) следующие дополнительные стадии ίη νίГго:
    (x) приведение тестируемого соединения в контакт с клеткой-хозяином или с мембраной клеткихозяина, содержащими СРСК, где СРСК содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (ΐ) аминокислот 1-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (ίίί) аминокислотной последовательности СРСК, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ГО N0: 1;
    (ίν) аминокислотной последовательности СРСК, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ГО N0: 2; и (ν) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии СРСК, описанной как 8ЕО ГО N0: 2; и (y) определение способности тестируемого соединения стимулировать функционирование рецептора;
    где способность тестируемого соединения стимулировать функционирование рецептора указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СТР, и где агонист СРК119 стадии (а) представляет собой тестируемое соединение, идентифицированное как стимулирующее функционирование рецептора на стадии (у).
  35. 35. Способ по п.34, где позвоночным является человек.
  36. 36. Способ по п.34, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  37. 37. Способ по любому из пп.33-36, где рецептор является рекомбинантным.
  38. 38. Способ по любому из пп.33-37, где клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, а указанный вектор экспрессии содержит полинуклеотид, кодирующий СРСК.
  39. 39. Способ по любому из пп.33-38, где указанное определение проводят путем измерения уровня вторичного мессенджера.
  40. 40. Способ по п.39, где вторичный мессенджер выбран из группы, состоящей из циклического АМФ (цАМФ), циклического ГМФ (цГМФ), инозитол-1,4,5-трифосфата (ГО3), диацилглицерина (ОАС), активности киназы МАР, активности киназы-1 киназы МАРК/ЕКК (МЕКК1) и Са2+.
  41. 41. Способ по п.40, где уровень цАМФ повышается.
  42. 42. Способ по любому из пп.33-38, где указанное определение проводят посредством анализа меланофоров путем измерения связывания ГТФу8 с мембраной, содержащей указанный СРСК, или посредством анализа репортера.
  43. 43. Способ по любому из пп.33-42, где клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего.
  44. 44. Способ по любому из пп.33-42, где клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клеткухозяина.
  45. 45. Способ по любому из пп.33-42, где клетка-хозяин представляет собой меланофор.
  46. 46. Способ по любому из пп.33-45, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  47. 47. Способ по любому из пп.33-46, где рецептор содержит аминокислотную последовательность Сбелок-сопряженного рецептора, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ГО N0: 2.
  48. 48. Способ по любому из пп.33-47, где рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 2.
  49. 49. Применение СРСК для идентификации средств, усиливающих секрецию СТР, в способе ίη νιΙΐΌ, включающем в себя следующие стадии:
    (а) приведение СРСК в контакт с необязательно меченым известным лигандом рецептора в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, где СРСК содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    - 64 016041 (ΐ) аминокислот 1-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
    (й) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (ίίί) аминокислотной последовательности СРСК, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 1;
    (ίν) аминокислотной последовательности СРСК, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 2; и (ν) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии СРСР, описанной как 816) ΙΌ N0: 2; и (b) детекция комплекса указанного известного лиганда с указанным рецептором; и (c) определение того, образуется ли в присутствии тестируемого соединения меньше указанного комплекса, чем в отсутствие тестируемого соединения;
    где упомянутое определение указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СР.
  50. 50. Применение по п.49, где указанный способ дополнительно включает:
    (б) приведение соединения, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса ш ν Нго в контакт с энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать СР, позвоночного; и (е) определение того, стимулирует ли соединение секрецию СР энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать СР, позвоночного;
    где способность тестируемого соединения стимулировать секрецию СР энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать СР, позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СР.
  51. 51. Применение по п.49, где указанный способ дополнительно включает:
    (б) определение того, увеличивает ли соединение уровень СР у позвоночного, путем измерения уровня СР в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили соединение, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса, где способность тестируемого соединения увеличивать уровень СР у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СР.
  52. 52. Применение по п.49, где указанный способ дополнительно включает:
    (б) определение того, увеличивает ли соединение уровень костной массы в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили соединение, в присутствии которого на стадии (с) образуется меньшее количество указанного комплекса, где способность тестируемого соединения увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СР.
  53. 53. Применение по п.51 или 52, где позвоночным является человек.
  54. 54. Применение по п.51 или 52, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  55. 55. Применение по любому из пп.49-54, где рецептор является рекомбинантным.
  56. 56. Применение по любому из пп.49-55, где клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, а указанный вектор экспрессии содержит полинуклеотид, кодирующий СРСР.
  57. 57. Применение по любому из пп.49-55, где известным лигандом является агонист СРК119.
  58. 58. Применение по п.57, где агонист СРК119 представляет собой агонист человеческого СРК119.
  59. 59. Применение по п.57 или 58, где указанный агонист СРК119 представляет собой селективный агонист СРК119.
  60. 60. Применение по любому из пп.57-59, где агонист СРК119 обладает избирательностью по отношению к СРК119, большей, чем к СКР-1.
  61. 61. Применение по любому из пп.57-60, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 10 мкМ.
  62. 62. Применение по любому из пп.57-60, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 1 мкМ.
  63. 63. Применение по любому из пп.57-60, где агонист СРК119 имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  64. 64. Применение по любому из пп.57-63, где агонист СРК119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  65. 65. Применение по любому из пп.49-64, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  66. 66. Применение по любому из пп.49-65, где рецептор содержит аминокислотную последовательность С-белок-сопряженного рецептора, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную 8Е0 ΙΌ N0: 2.
  67. 67. Применение по любому из пп.49-66, где рецептор содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
  68. 68. Способ по п.19, включающий перед стадией (а) следующие дополнительные стадии ш гйго:
    (х) приведение СРСК в контакт с необязательно меченым известным лигандом рецептора в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, где СРСК содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    - 65 016041 (ί) аминокислот 1-335 8ЕО ΙΌ N0: 2;
    (ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (ίίί) аминокислотной последовательности СРСВ, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ГО N0: 1;
    (ίν) аминокислотной последовательности СРСВ, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ГО N0: 2; и (ν) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии СРСВ, описанной как 8ЕО ГО N0: 2; и (у) детекция комплекса указанного известного лиганда с указанным рецептором; и (ζ) определение того, образуется ли в присутствии тестируемого соединения меньше указанного комплекса, чем в отсутствие тестируемого соединения;
    где упомянутое определение указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию СГР, и где агонист СРВ119 стадии (а) представляет собой тестируемое соединение, определенное на стадии (ζ) как соединение, в присутствии которого образуется меньше указанного комплекса.
  69. 69. Способ по п.20 или 21, включающий перед стадией (а) следующие дополнительные стадии 1п νί!го:
    (x) приведение СРСВ в контакт с необязательно меченым известным лигандом рецептора в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, где СРСВ содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (ί) аминокислот 1-335 8Е0 ГО N0: 2;
    (ίί) аминокислот 2-335 8Е0 ГО N0: 2;
    (ίίί) аминокислотной последовательности СРСВ, кодируемой полинуклеотидом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной 8Е0 ГО N0: 1;
    (ίν) аминокислотной последовательности СРСВ, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична 8Е0 ГО N0: 2; и (ν) аминокислотной последовательности конститутивно активной версии СРСВ, описанной как 8ЕО ГО N0: 2; и (y) детекция комплекса указанного известного лиганда с указанным рецептором; и (ζ) определение того, образуется ли в присутствии тестируемого соединения меньше указанного комплекса, чем в отсутствие тестируемого соединения;
    где упомянутое определение указывает на то, что тестируемое соединение представляет собой средство, усиливающее секрецию ШР, и где агонист СРВ119 стадии (а) представляет собой тестируемое соединение, определенное на стадии (ζ) как соединение, в присутствии которого образуется меньше указанного комплекса.
  70. 70. Способ по п.69, где позвоночным является человек.
  71. 71. Способ по п.69, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  72. 72. Способ по любому из пп.68-71, где рецептор является рекомбинантным.
  73. 73. Способ по любому из пп.68-72, где клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, а указанный вектор экспрессии содержит полинуклеотид, кодирующий СРСВ.
  74. 74. Способ по любому из пп.68-73, где известным лигандом является агонист СРВ119.
  75. 75. Способ по п.70, где агонист СРВ119 представляет собой агонист человеческого СРВ119.
  76. 76. Способ по п.74 или 75, где указанный агонист СРВ119 представляет собой селективный агонист СРВ119.
  77. 77. Способ по любому из пп.74-76, где агонист СРВ119 обладает избирательностью по отношению к СРВ119, большей, чем к СВР-1.
  78. 78. Способ по любому из пп.74-77, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 10 мкМ.
  79. 79. Способ по любому из пп.74-77, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 1 мкМ.
  80. 80. Способ по любому из пп.74-77, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  81. 81. Способ по любому из пп.74-80, где агонист СРВ119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  82. 82. Способ по любому из пп.68-81, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  83. 83. Способ по любому из пп.68-82, где рецептор содержит аминокислотную последовательность Сбелок-сопряженного рецептора, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную 8Е0 ГО N0: 2.
  84. 84. Способ по любому из пп.68-83, где рецептор содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 2.
  85. 85. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей агонист СРВ119, обладающий эффектом усиления секреции ШР, включающий приготовление эффективного количества агониста СРВ119, предварительно идентифицированного как средство, обладающее эффектом усиления секреции ШР, в способе по п.19, с фармацевтически приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции.
    - 66 016041
  86. 86. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей агонист ОРК119, обладающий эффектом усиления секреции ОФ, включающий приготовление эффективного количества агониста ОРК119, предварительно идентифицированного как средство, обладающее эффектом усиления секреции ОФ, в способе по п.20, с фармацевтически приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции.
  87. 87. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей агонист ОРК119, обладающий эффектом усиления секреции ОФ, включающий приготовление эффективного количества агониста ОРК119, предварительно идентифицированного как средство, обладающее эффектом усиления секреции ОФ, в способе по п.21, с фармацевтически приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции.
  88. 88. Способ по п.86 или 87, где позвоночным является человек.
  89. 89. Способ по п.86 или 87, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  90. 90. Способ по любому из пп.85-89, где агонист ОРК119 представляет собой агонист человеческого ОРК119.
  91. 91. Способ по любому из пп.85-90, где указанный агонист ОРК119 представляет собой селективный агонист ОРК119.
  92. 92. Способ по п.91, где агонист ОРК119 обладает избирательностью по отношению к ОРК119, большей, чем к СКР-1.
  93. 93. Способ по любому из пп.85-92, где агонист ОРК119 имеет ЕС50 менее чем 10 мкМ.
  94. 94. Способ по любому из пп.85-92, где агонист ОРК119 имеет ЕС50 менее чем 1 мкМ.
  95. 95. Способ по любому из пп.85-92, где агонист ОРК119 имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  96. 96. Способ по любому из пп.85-92, где агонист ОРК119 является перорально активным и имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  97. 97. Способ по любому из пп.85-96, где агонист ОРК119 является перорально активным.
  98. 98. Способ по любому из пп.85-97, где агонист ОРК119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
  99. 99. Способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединений, пригодных для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
    (a) приведение агониста ОРК119 ш νίΙΐΌ в контакт с энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ОФ, позвоночного; и (b) определение того, стимулирует ли агонист ОРК119 секрецию ОФ энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ОФ, позвоночного;
    где способность агониста ОРК119 стимулировать секрецию ОФ энтероэндокринной клеткой или клеткой, способной секретировать ОФ, позвоночного указывает на то, что агонист ОРК119 представляет собой соединение, пригодное для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединение, пригодное для увеличения костной массы субъекта.
  100. 100. Способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединений, пригодных для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
    (а) определения того, увеличивает ли агонист ОРК119 уровень ОФ у позвоночного, путем измерения уровня ОФ в образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили агонист ОРК119;
    где способность агониста ОРК119 увеличивать уровень ОФ у позвоночного указывает на то, что агонист ОРК119 представляет собой соединение, пригодное для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединение, пригодное для увеличения костной массы субъекта.
  101. 101. Способ идентификации соединений, пригодных для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединений, пригодных для увеличения костной массы субъекта, включающий в себя следующие стадии:
    (а) определения уровня костной массы в биологическом образце, полученном от позвоночного, которому предварительно вводили агонист ОРК119;
    где способность агониста ОРК119 увеличивать уровень костной массы у позвоночного указывает на то, что агонист ОРК119 представляет собой соединение, пригодное для профилактики или лечения состояния, характеризующегося пониженной костной массой, или соединение, пригодное для увеличения костной массы субъекта.
  102. 102. Способ по п.100 или 101, где позвоночным является человек.
  103. 103. Способ по п.100 или 101, где позвоночное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
  104. 104. Способ по любому из пп.99-103, где агонист ОРК119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 5000 г на моль.
    - 67 016041
  105. 105. Способ по любому из пп.99-104, где агонист СРВ119 представляет собой агонист человеческого СРВ119.
  106. 106. Способ по любому из пп.99-105, где агонист СРВ119 представляет собой селективный агонист СРВ119.
  107. 107. Способ по любому из пп.99-106, где агонист СРВ119 обладает избирательностью по отношению к СРВ119, большей, чем к рецептору кортикотропин-рилизинг фактора-1 (СКЕ-1).
  108. 108. Способ по любому из пп.99-107, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 10 мкМ.
  109. 109. Способ по любому из пп.99-107, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 1 мкМ.
  110. 110. Способ по любому из пп.99-107, где агонист СРВ119 имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  111. 111. Способ по любому из пп.99-107, где агонист СРВ119 является перорально активным и имеет ЕС50 менее чем 100 нМ.
  112. 112. Способ по любому из пп.99-110, где агонист СРВ119 является перорально активным.
  113. 113. Применение по любому из пп.1-15, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 10000 г на моль.
  114. 114. Способ по любому из пп.19-23, где агонист СРВ119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 10000 г на моль.
  115. 115. Способ по любому из пп.33-45, где тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 10000 г на моль.
  116. 116. Применение по любому из пп.57-63, где агонист СРВ119 представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее молекулярную массу менее чем приблизительно 10000 г на моль.
    Фармакодинамический анализ СИР у мышей, обработанных агонистом СРВ119, по сравнению с необработанными мышами
EA200870424A 2006-04-11 2007-04-10 Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта EA016041B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79155006P 2006-04-11 2006-04-11
PCT/US2007/008902 WO2007120689A2 (en) 2006-04-11 2007-04-10 Methods of using gpr119 receptor to identify compounds useful for increasing bone mass in an individual

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870424A1 EA200870424A1 (ru) 2009-06-30
EA016041B1 true EA016041B1 (ru) 2012-01-30

Family

ID=38442009

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870424A EA016041B1 (ru) 2006-04-11 2007-04-10 Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта
EA201101475A EA201101475A1 (ru) 2006-04-11 2007-04-10 Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101475A EA201101475A1 (ru) 2006-04-11 2007-04-10 Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта

Country Status (36)

Country Link
US (5) US7833730B2 (ru)
EP (4) EP2369341A3 (ru)
JP (6) JP4521838B2 (ru)
KR (1) KR101281962B1 (ru)
CN (3) CN103536924A (ru)
AR (1) AR060406A1 (ru)
AT (1) ATE487940T1 (ru)
AU (1) AU2007238805B2 (ru)
BR (1) BRPI0710597A2 (ru)
CA (1) CA2618488C (ru)
CL (1) CL2007001011A1 (ru)
CR (1) CR10337A (ru)
CY (1) CY1111123T1 (ru)
DE (1) DE602007010420D1 (ru)
DK (1) DK1971862T3 (ru)
EA (2) EA016041B1 (ru)
EC (1) ECSP088817A (ru)
ES (1) ES2354390T3 (ru)
GT (1) GT200800207A (ru)
HK (1) HK1117911A1 (ru)
HR (1) HRP20110068T1 (ru)
MA (1) MA30555B1 (ru)
ME (1) MEP27308A (ru)
MX (1) MX2008013120A (ru)
NO (1) NO20084746L (ru)
NZ (1) NZ571110A (ru)
PL (1) PL1971862T3 (ru)
PT (1) PT1971862E (ru)
RS (1) RS51745B (ru)
SG (1) SG10201404220TA (ru)
SI (1) SI1971862T1 (ru)
TN (1) TNSN08396A1 (ru)
TW (1) TWI409458B (ru)
UA (1) UA97479C2 (ru)
WO (1) WO2007120689A2 (ru)
ZA (1) ZA200807997B (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2295816T3 (es) 2003-01-14 2008-04-16 Arena Pharmaceuticals, Inc. Derivados arilo y heteroarilo 1,2,3-trisustituidos como moduladores del metabolismo, y profilaxis y tratamiento de transtornos relacionados con los mismos, tales como la diabetes y la hiperglucemia.
DOP2006000008A (es) * 2005-01-10 2006-08-31 Arena Pharm Inc Terapia combinada para el tratamiento de la diabetes y afecciones relacionadas y para el tratamiento de afecciones que mejoran mediante un incremento de la concentración sanguínea de glp-1
KR101281962B1 (ko) 2006-04-11 2013-07-08 아레나 파마슈티칼스, 인크. 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 ｇｐｒ119 수용체를 사용하는 방법
PE20071221A1 (es) * 2006-04-11 2007-12-14 Arena Pharm Inc Agonistas del receptor gpr119 en metodos para aumentar la masa osea y para tratar la osteoporosis y otras afecciones caracterizadas por masa osea baja, y la terapia combinada relacionada a estos agonistas
MX2010003117A (es) 2007-09-20 2010-04-01 Irm Llc Compuestos y composiciones como moduladores de la actividad de gpr119.
EP2108960A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-14 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods of using A G protein-coupled receptor to identify peptide YY (PYY) secretagogues and compounds useful in the treatment of conditons modulated by PYY
TW201113269A (en) 2009-06-24 2011-04-16 Boehringer Ingelheim Int New compounds, pharmaceutical composition and methods relating thereto
EP2445878A1 (en) 2009-06-24 2012-05-02 Boehringer Ingelheim International GmbH New compounds, pharmaceutical composition and methods relating thereto
AR077642A1 (es) 2009-07-09 2011-09-14 Arena Pharm Inc Moduladores del metabolismo y el tratamiento de trastornos relacionados con el mismo
EP2547339A1 (en) 2010-03-18 2013-01-23 Boehringer Ingelheim International GmbH Combination of a gpr119 agonist and the dpp-iv inhibitor linagliptin for use in the treatment of diabetes and related conditions
AU2011237775A1 (en) 2010-04-06 2012-11-22 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the GPR119 receptor and the treatment of disorders related thereto
WO2012025811A1 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Lupin Limited Indolylpyrimidines as modulators of gpr119
CN103539791B (zh) 2010-09-22 2017-01-11 艾尼纳制药公司 Gpr119 受体调节剂和对与其相关的障碍的治疗
AU2011333472A1 (en) 2010-11-26 2013-06-06 Lupin Limited Bicyclic GPR119 modulators
US20140018371A1 (en) 2011-04-01 2014-01-16 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators Of The GPR119 Receptor And The Treatment Of Disorders Related Thereto
WO2012145361A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto
US20140038889A1 (en) 2011-04-22 2014-02-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators Of The GPR119 Receptor And The Treatment Of Disorders Related Thereto
WO2012145604A1 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto
WO2012170702A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto
KR101913619B1 (ko) 2011-06-09 2018-12-28 리젠 파마슈티컬스 소시에떼 아노님 Gpr-119의 조절제로서의 신규한 화합물
WO2013055910A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto
AR091739A1 (es) 2012-07-11 2015-02-25 Elcelyx Therapeutics Inc Composiciones y metodos para reducir el riesgo cardiometabolico
WO2014074668A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of gpr119 and the treatment of disorders related thereto
CN107405332A (zh) 2015-01-06 2017-11-28 艾尼纳制药公司 治疗与s1p1受体有关的病症的方法
KR200481746Y1 (ko) 2015-01-21 2016-11-04 큰길엔터프라이즈 주식회사 가습대
US10301262B2 (en) 2015-06-22 2019-05-28 Arena Pharmaceuticals, Inc. Crystalline L-arginine salt of (R)-2-(7-(4-cyclopentyl-3-(trifluoromethyl)benzyloxy)-1,2,3,4-tetrahydrocyclo-penta [b]indol-3-yl)acetic acid(Compund1) for use in SIPI receptor-associated disorders
EP3582772A1 (en) 2017-02-16 2019-12-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for treatment of primary biliary cholangitis
JP2020524181A (ja) 2017-06-19 2020-08-13 アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｎａｆｌｄおよびｎａｓｈの治療のための化合物および方法
MX2022014505A (es) 2020-05-19 2022-12-13 Kallyope Inc Activadores de la ampk.
JP2023531726A (ja) 2020-06-26 2023-07-25 キャリーオペ，インク． Ａｍｐｋアクチベーター

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001087929A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human dopamine-like g protein-coupled receptor
US6410508B1 (en) * 1998-10-07 2002-06-25 Med College Georgia Res Inst Glucose-dependent insulinotropic peptide for use as an osteotropic hormone
WO2005007647A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-27 Arena Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted aryl and heteroaryl derivatives as modulators of metabolism and the prophylaxis and treatment of disorders related thereto

Family Cites Families (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166452A (en) 1976-05-03 1979-09-04 Generales Constantine D J Jr Apparatus for testing human responses to stimuli
US4256108A (en) 1977-04-07 1981-03-17 Alza Corporation Microporous-semipermeable laminated osmotic system
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4265874A (en) 1980-04-25 1981-05-05 Alza Corporation Method of delivering drug with aid of effervescent activity generated in environment of use
US4495002A (en) * 1981-05-27 1985-01-22 Westinghouse Electric Corp. Three-step treatment of stainless steels having metastable austenitic and martensitic phases to increase resistance to chloride corrosion
US5462856A (en) 1990-07-19 1995-10-31 Bunsen Rush Laboratories, Inc. Methods for identifying chemicals that act as agonists or antagonists for receptors and other proteins involved in signal transduction via pathways that utilize G-proteins
ATE349461T1 (de) 1991-10-22 2007-01-15 New England Medical Center Inc Inhibitoren der dipeptidyl-aminopeptidase vom typ iv
MX9206628A (es) 1991-11-22 1993-05-01 Boehringer Ingelheim Pharma Ester de prolinaboronato y metodo para su preparacion.
US6100042A (en) 1993-03-31 2000-08-08 Cadus Pharmaceutical Corporation Yeast cells engineered to produce pheromone system protein surrogates, and uses therefor
US20020006899A1 (en) 1998-10-06 2002-01-17 Pospisilik Andrew J. Use of dipeptidyl peptidase IV effectors for lowering blood pressure in mammals
DE122010000020I1 (de) 1996-04-25 2010-07-08 Prosidion Ltd Verfahren zur Senkung des Blutglukosespiegels in Säugern
TW492957B (en) 1996-11-07 2002-07-01 Novartis Ag N-substituted 2-cyanopyrrolidnes
US6100234A (en) 1997-05-07 2000-08-08 Tufts University Treatment of HIV
US6040145A (en) 1997-05-07 2000-03-21 Tufts University Potentiation of the immune response
US6183974B1 (en) 1997-07-31 2001-02-06 The General Hospital Corporation Screening assays for G protein coupled receptor agonists and antagonists
GB9719496D0 (en) 1997-09-13 1997-11-19 Glaxo Group Ltd G protien chimeras
WO1999025719A1 (fr) 1997-11-18 1999-05-27 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Substance physiologiquement active, la sulphostine, procede de fabrication et utilisation
CA2819705C (en) 1998-02-02 2014-07-08 Trustees Of Tufts College Method of regulating glucose metabolism, and reagents related thereto
US5922576A (en) 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
US6304621B1 (en) 1998-05-13 2001-10-16 Broadcom Corporation Multi-mode variable rate digital cable receiver
DE19823831A1 (de) 1998-05-28 1999-12-02 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Neue pharmazeutische Verwendung von Isoleucyl Thiazolidid und seinen Salzen
DE19828114A1 (de) 1998-06-24 2000-01-27 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Produgs instabiler Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19834591A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Verfahren zur Steigerung des Blutglukosespiegels in Säugern
AU5190499A (en) 1998-08-06 2000-02-28 Shmuel Peltz Method and appliances for electrostimulation
KR20010079669A (ko) 1998-08-21 2001-08-22 바바라 피. 월너 기질 활성의 조절
AU756244B2 (en) 1998-09-01 2003-01-09 Basf Aktiengesellschaft Methods for improving the function of heterologous G protein-coupled receptors
US6242422B1 (en) 1998-10-22 2001-06-05 Idun Pharmacueticals, Inc. (Substituted)Acyl dipeptidyl inhibitors of the ice/ced-3 family of cysteine proteases
KR100963367B1 (ko) 1998-11-20 2010-06-14 아레나 파마슈티칼스, 인크. 사람의 오르판 ｇ 단백질 커플링 수용체
CO5150173A1 (es) 1998-12-10 2002-04-29 Novartis Ag Compuestos n-(glicilo sustituido)-2-cianopirrolidinas inhibidores de peptidasa de dipeptidilo-iv (dpp-iv) los cuales son efectivos en el tratamiento de condiciones mediadas por la inhibicion de dpp-iv
JP2000191616A (ja) 1998-12-24 2000-07-11 Senju Pharmaceut Co Ltd 新規ジペプチジルアルデヒド誘導体およびそれを含有する医薬
US20030125539A1 (en) 1999-02-22 2003-07-03 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding SNORF25 receptor
US6221660B1 (en) 1999-02-22 2001-04-24 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding SNORF25 receptor
JP4121215B2 (ja) 1999-05-17 2008-07-23 財団法人微生物化学研究会 スルフォスチン類縁体、並びにスルフォスチン及びその類縁体の製造方法
JP4028135B2 (ja) 1999-05-27 2007-12-26 本田技研工業株式会社 物体検出装置
US6617340B1 (en) 1999-07-29 2003-09-09 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-pyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
DE19940130A1 (de) 1999-08-24 2001-03-01 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Neue Effektoren der Dipeptidyl Peptidase IV zur topischen Anwendung
US6653064B1 (en) 1999-09-23 2003-11-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for identifying compounds useful in the therapy of bone disorders
GB9923177D0 (en) 1999-09-30 1999-12-01 Pfizer Ltd Novel polypeptide
AU1916401A (en) 1999-11-12 2001-06-06 Guilford Pharmaceuticals Inc. Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors
US6380398B2 (en) 2000-01-04 2002-04-30 Novo Nordisk A/S Therapeutically active and selective heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme DPP-IV
ATE346613T1 (de) 2000-01-21 2006-12-15 Novartis Pharma Gmbh Zusammensetzungen bestehend aus dipeptidylpeptidase-iv inhibitoren und antidiabetica
US6395767B2 (en) 2000-03-10 2002-05-28 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl-fused pyrrolidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
US6608038B2 (en) 2000-03-15 2003-08-19 Novartis Ag Methods and compositions for treatment of diabetes and related conditions via gene therapy
AU5716901A (en) 2000-04-21 2001-11-07 New England Medical Ct G protein coupled receptor (gpcr) agonists and antagonists and methods of activating and inhibiting gpcr using the same
GB0010188D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
GB0010183D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
US6432969B1 (en) 2000-06-13 2002-08-13 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2 cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
TW583185B (en) 2000-06-13 2004-04-11 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines and pharmaceutical composition for inhibiting dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) or for the prevention or treatment of diseases or conditions associated with elevated levels of DPP-IV comprising the same
AU2001268958B2 (en) 2000-07-04 2006-03-09 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds, which are inhibitors of the enzyme dpp-iv
JP2004513076A (ja) 2000-07-25 2004-04-30 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 糖尿病治療で有用なｎ−置換インドール類
HU227882B1 (hu) 2000-08-10 2012-05-29 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Prolinszármazékok és gyógyszerként való alkalmazásuk
US20040005555A1 (en) 2000-08-31 2004-01-08 Rothman Richard E. Molecular diagnosis of bactermia
JP2004035574A (ja) 2000-10-06 2004-02-05 Tanabe Seiyaku Co Ltd 脂肪族含窒素五員環化合物
JP4329290B2 (ja) 2000-10-06 2009-09-09 田辺三菱製薬株式会社 脂肪族含窒素五員環化合物
JP4329291B2 (ja) 2000-10-06 2009-09-09 田辺三菱製薬株式会社 含窒素五員環化合物
AU9419701A (en) 2000-10-06 2002-04-22 Tanabe Seiyaku Co Aliphatic nitrogenous five-membered ring compounds
TWI243162B (en) 2000-11-10 2005-11-11 Taisho Pharmaceutical Co Ltd Cyanopyrrolidine derivatives
CN1549858A (zh) 2000-11-27 2004-11-24 阿伦纳药品公司 内源和非内源型人g蛋白偶联受体
EP1338651B9 (en) 2000-12-01 2007-05-09 Astellas Pharma Inc. Method of screening remedy for diabetes
EP1354882A1 (en) 2000-12-27 2003-10-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dipeptidyl peptidase iv inhibitor
JP4823431B2 (ja) 2001-01-30 2011-11-24 東レ・ダウコーニング株式会社 室温硬化性シリコーンゴム組成物
JP4213390B2 (ja) 2001-02-02 2009-01-21 武田薬品工業株式会社 縮合複素環化合物
EA007485B1 (ru) 2001-02-24 2006-10-27 Берингер Ингельхайм Фарма Гмбх Унд Ко. Кг Производные ксантина, способ их получения, фармацевтическая композиция на их основе и способ ее получения
JP2002265439A (ja) 2001-03-08 2002-09-18 Mitsubishi Pharma Corp シアノピロリジン誘導体およびその医薬用途
ATE395912T1 (de) 2001-03-27 2008-06-15 Merck & Co Inc Dipeptidylpeptidase-hemmer für die behandlung oder prävention von diabetes
US6911474B2 (en) 2001-03-27 2005-06-28 The Regents Of The University Of California Methods, compounds, and compositions for reducing body fat and modulating fatty acid metabolism
FR2822826B1 (fr) 2001-03-28 2003-05-09 Servier Lab Nouveaux derives sulfonyles d'alpha-amino-acides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US6573287B2 (en) 2001-04-12 2003-06-03 Bristo-Myers Squibb Company 2,1-oxazoline and 1,2-pyrazoline-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
US20020192206A1 (en) 2001-05-05 2002-12-19 Kozarov Emil V. Methods and compositions for angioproliferative disorder treatment
FR2824825B1 (fr) 2001-05-15 2005-05-06 Servier Lab Nouveaux derives d'alpha-amino-acides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP2003000977A (ja) 2001-06-26 2003-01-07 Juki Corp 玉縁縫製用ミシンの袋布地供給装置
US20030130199A1 (en) 2001-06-27 2003-07-10 Von Hoersten Stephan Dipeptidyl peptidase IV inhibitors and their uses as anti-cancer agents
US7368421B2 (en) 2001-06-27 2008-05-06 Probiodrug Ag Use of dipeptidyl peptidase IV inhibitors in the treatment of multiple sclerosis
US6869947B2 (en) 2001-07-03 2005-03-22 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme DPP-IV
UA74912C2 (en) 2001-07-06 2006-02-15 Merck & Co Inc Beta-aminotetrahydroimidazo-(1,2-a)-pyrazines and tetratriazolo-(4,3-a)-pyrazines as inhibitors of dipeptylpeptidase for the treatment or prevention of diabetes
US6740250B2 (en) 2001-07-13 2004-05-25 Hazard Control Technologies Fire suppressant having foam stabilizer
DE10143840A1 (de) 2001-09-06 2003-03-27 Probiodrug Ag Neue Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase I
US6844316B2 (en) 2001-09-06 2005-01-18 Probiodrug Ag Inhibitors of dipeptidyl peptidase I
US20040259883A1 (en) 2001-09-14 2004-12-23 Hiroshi Sakashita Thiazolidine derivative and medicinal use thereof
JPWO2003026661A1 (ja) 2001-09-14 2005-01-06 山之内製薬株式会社 インスリン分泌促進剤及び新規なピリミジン誘導体
AU2002331311A1 (en) 2001-09-19 2003-04-01 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme dpp-iv
US7238671B2 (en) 2001-10-18 2007-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions
EP1572892A4 (en) 2001-10-18 2007-08-22 Bristol Myers Squibb Co HUMAN GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-1 MIMICS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF DIABETES AND RELATED CONDITIONS
GB0125446D0 (en) 2001-10-23 2001-12-12 Ferring Bv Novel anti-diabetic agents
US6861440B2 (en) 2001-10-26 2005-03-01 Hoffmann-La Roche Inc. DPP IV inhibitors
US20030125304A1 (en) 2001-11-09 2003-07-03 Hans-Ulrich Demuth Substituted amino ketone compounds
CA2468192A1 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Trustees Of Tufts College Peptidomimetic inhibitors of post-proline cleaving enzymes
EP1487471A4 (en) 2001-11-26 2010-03-10 Tufts College METHOD FOR TREATING AUTOIMMUNE DISEASES AND ASSOCIATED REAGENTS
AU2002360732A1 (en) 2001-12-26 2003-07-24 Guilford Pharmaceuticals Change inhibitors of dipeptidyl peptidase iv
US6727261B2 (en) 2001-12-27 2004-04-27 Hoffman-La Roche Inc. Pyrido[2,1-A]Isoquinoline derivatives
CA2475653A1 (en) 2002-02-08 2003-09-04 Idun Pharmaceuticals, Inc. (substituted)acyl dipeptidyl inhibitors of the ice/ced-3 family of cysteine proteases
BR0307665A (pt) 2002-02-13 2005-01-04 Hoffmann La Roche Compostos, processo para a sua manufatura, composições farmacêuticas que compreendem os mesmos, método para o tratamento e/ou profilaxia de enfermidades associadas com dpp iv e utilização dos compostos
CN1308311C (zh) 2002-02-13 2007-04-04 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新型吡啶－和喹啉－衍生物
US6906074B2 (en) 2002-02-22 2005-06-14 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. 2-phenylpiperazine derivatives
US7074798B2 (en) 2002-02-25 2006-07-11 Eisai Co., Ltd Xanthine derivative and DPPIV inhibitor
JP2004043429A (ja) 2002-02-25 2004-02-12 Eisai Co Ltd 新規キサンチン誘導体およびｄｐｐｉｖ阻害剤
ES2278944T3 (es) 2002-02-28 2007-08-16 Prosidion Ltd. Inhibidores de dpiv basados en glutaminilo.
HUP0200849A2 (hu) 2002-03-06 2004-08-30 Sanofi-Synthelabo N-aminoacetil-2-ciano-pirrolidin-származékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás előállításukra
WO2003082817A2 (en) 2002-03-25 2003-10-09 Merck & Co., Inc. Beta-amino heterocyclic dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment or prevention of diabetes
WO2003080633A1 (en) 2002-03-25 2003-10-02 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Novel $g(a)-amino-n-(diaminophosphinyl)lactam derivative
JP4329382B2 (ja) 2002-04-04 2009-09-09 田辺三菱製薬株式会社 医薬組成物
JP4329381B2 (ja) 2002-04-04 2009-09-09 田辺三菱製薬株式会社 医薬組成物
EP1492777A1 (en) 2002-04-08 2005-01-05 Torrent Pharmaceuticals Ltd Thiazolidine-4-carbonitriles and analogues and their use as dipeptidyl-peptidase inhibitors
JP2003300977A (ja) 2002-04-10 2003-10-21 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd キサンチン誘導体
JP2004026820A (ja) 2002-05-09 2004-01-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd ジペプチジルペプチダーゼｉｖ阻害剤
JP2003327532A (ja) 2002-05-10 2003-11-19 Takeda Chem Ind Ltd ペプチダーゼ阻害剤
US6710040B1 (en) 2002-06-04 2004-03-23 Pfizer Inc. Fluorinated cyclic amides as dipeptidyl peptidase IV inhibitors
WO2003101449A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Pfizer Products Inc. Process for the preparation of 3,3,4,4-tetrafluoropyrrolidine and derivatives thereof
CN100469778C (zh) 2002-06-06 2009-03-18 卫材R&D管理有限公司 新的稠合咪唑衍生物
JP2004026678A (ja) 2002-06-24 2004-01-29 Microbial Chem Res Found ２型糖尿病治療剤
US6833973B2 (en) 2002-06-27 2004-12-21 International Business Machines Corporation Apparatus and method to calibrate a servo sensor
WO2004007468A1 (en) 2002-07-15 2004-01-22 Merck & Co., Inc. Piperidino pyrimidine dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment of diabetes
JP4542757B2 (ja) 2002-08-08 2010-09-15 武田薬品工業株式会社 縮合複素環化合物
AU2003296895A1 (en) 2002-08-20 2004-05-04 The Regents Of The University Of California Combination therapy for controlling appetites
DE10238243A1 (de) 2002-08-21 2004-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg 8-[3-Amino-piperidin-1-yl]-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
US7407955B2 (en) 2002-08-21 2008-08-05 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions
DE10238477A1 (de) 2002-08-22 2004-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Purinderivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
DE10238470A1 (de) 2002-08-22 2004-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Xanthinderivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
US20060039974A1 (en) 2002-09-11 2006-02-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sustained release preparation
JPWO2004024943A1 (ja) 2002-09-11 2006-01-12 アステラス製薬株式会社 インスリン含量増加剤スクリーニング方法
DE10251927A1 (de) 2002-11-08 2004-05-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Xanthinderivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
US7482337B2 (en) 2002-11-08 2009-01-27 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Xanthine derivatives, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions
WO2004046106A1 (en) 2002-11-18 2004-06-03 Pfizer Products Inc. Dipeptidyl peptidase iv inhibiting fluorinated cyclic amides
DE10256264A1 (de) 2002-12-03 2004-06-24 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue substituierte Imidazo-pyridinone und Imidazo-pyridazinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
WO2004050022A2 (en) 2002-12-04 2004-06-17 Merck & Co., Inc. Phenylalanine derivatives as dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment or prevention of diabetes
US20060052382A1 (en) 2002-12-20 2006-03-09 Duffy Joseph L 3-Amino-4-phenylbutanoic acid derivatives as dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment or prevention of diabetes
ES2295816T3 (es) 2003-01-14 2008-04-16 Arena Pharmaceuticals, Inc. Derivados arilo y heteroarilo 1,2,3-trisustituidos como moduladores del metabolismo, y profilaxis y tratamiento de transtornos relacionados con los mismos, tales como la diabetes y la hiperglucemia.
CA2512546A1 (en) 2003-01-17 2004-08-05 Merck & Co., Inc. 3-amino-4-phenylbutanoic acid derivatives as dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment or prevention of diabetes
JP2004244412A (ja) 2003-01-20 2004-09-02 Kotobuki Seiyaku Kk ４位に置換基を有する２−シアノピロリジン誘導体及びその製造方法並びにそれを含有する薬剤
JP2006516573A (ja) 2003-01-31 2006-07-06 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 糖尿病の治療および予防のためのジペプチジルペプチダーゼ阻害薬としての３−アミノ−４−フェニルブタン酸誘導体
JP2006518763A (ja) 2003-02-24 2006-08-17 アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グルコース代謝のモジュレーターとしてのフェニル−およびピリジルピペリジン誘導体
JP2004269468A (ja) 2003-03-12 2004-09-30 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd ピリミジン誘導体又はその塩
JP2004269469A (ja) 2003-03-12 2004-09-30 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd ピリミジン誘導体又はその塩
ZA200508439B (en) 2003-05-05 2007-03-28 Probiodrug Ag Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases
US7083933B1 (en) 2003-05-09 2006-08-01 Prosidion Limited Methods for identification of modulators of OSGPR116 activity
JP2007511467A (ja) 2003-05-14 2007-05-10 タケダ サン ディエゴ インコーポレイテッド ジペプチジルペプチダーゼインヒビター
EP1624874B1 (en) 2003-05-14 2009-11-04 Merck & Co., Inc. 3-amino-4-phenylbutanoic acid derivatives as dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment or prevention of diabetes
US20060293297A1 (en) 2003-05-15 2006-12-28 Hiroshi Fukushima Cyanofluoropyrrolidine derviative
DE10327439A1 (de) 2003-06-18 2005-01-05 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Imidazopyridazinon- und Imidazopyridonderivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
AU2004251829B2 (en) 2003-06-20 2009-12-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Hexahydropyridoisoqinolines as DPP-IV inhibitors
KR100730867B1 (ko) 2003-06-20 2007-06-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｄｐｐ-ⅳ 억제제로서의 피리도[2,1-ａ]이소퀴놀린 유도체
JP2005019000A (ja) 2003-06-23 2005-01-20 Inter Media:Kk 照明制御システム
JO2625B1 (en) 2003-06-24 2011-11-01 ميرك شارب اند دوم كوربوريشن Phosphoric acid salts of dipeptidyl betidase inhibitor 4
JP2005018412A (ja) 2003-06-26 2005-01-20 Toppan Printing Co Ltd 電子購買システム及び方法
JP2005023038A (ja) 2003-07-04 2005-01-27 Taisho Pharmaceut Co Ltd 慢性腎疾患治療薬
EP2287165A3 (en) 2003-07-14 2011-06-22 Arena Pharmaceuticals, Inc. Fused-aryl and heteroaryl derivatives as modulators of metabolism and the prophylaxis and treatment of disorders related thereto
US7008957B2 (en) 2003-07-25 2006-03-07 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Bicyclic cyanoheterocycles, process for their preparation and their use as medicaments
DE10333935A1 (de) 2003-07-25 2005-02-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Neue bicyclische Cyanoheterocyclen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US7094800B2 (en) 2003-07-25 2006-08-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cyanopyrrolidides, process for their preparation and their use as medicaments
US6995183B2 (en) 2003-08-01 2006-02-07 Bristol Myers Squibb Company Adamantylglycine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and methods
WO2005019168A2 (en) 2003-08-20 2005-03-03 Pfizer Products Inc. Fluorinated lysine derivatives as dipeptidyl peptidase iv inhibitors
HU227684B1 (en) 2003-08-29 2011-11-28 Sanofi Aventis Adamantane and azabicyclo-octane and nonane derivatives and their use as dpp-iv inhibitors
US20070082908A1 (en) 2003-08-29 2007-04-12 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Bicycle pyrazole derivative
EP1671649B1 (en) 2003-10-03 2011-11-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase IV inhibitors for treating diabetic patients with sulfonylurea secondary failure
DE10355304A1 (de) 2003-11-27 2005-06-23 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue 8-(Piperazin-1-yl)-und 8-([1,4]Diazepan-1-yl)-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
US7217711B2 (en) 2003-12-17 2007-05-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Piperazin-1-yl and 2-([1,4]diazepan-1-yl)-imidazo[4,5-d]-pyridazin-4-ones, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions
AU2004303604B2 (en) 2003-12-24 2011-03-24 Prosidion Limited Heterocyclic derivatives as GPCR receptor agonists
US7501426B2 (en) 2004-02-18 2009-03-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, their preparation and their use as pharmaceutical compositions
DE102004009039A1 (de) 2004-02-23 2005-09-08 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg 8-[3-Amino-piperidin-1-yl]-xanthine, deren Herstellung und Verwendung als Arzneimittel
UA92150C2 (ru) 2004-06-04 2010-10-11 Арена Фармасьютикалз, Инк. Замещенные производные арила и гетероарила как модуляторы метаболизма и для профилактики и лечения связанных с ним расстройств
CA2568857A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Galapagos N.V. Lxr agonists to promote bone homeostasis
US20060024313A1 (en) 2004-07-06 2006-02-02 Xin Chen Agents that disrupt dimer formation in DPP-IV family of prolyl dipeptidases
WO2006019965A2 (en) 2004-07-16 2006-02-23 Takeda San Diego, Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors
US20060046978A1 (en) 2004-08-31 2006-03-02 Morphochem Ag Novel compounds that inhibit dipeptidyl peptidase (DPP-IV) and neprilysin (NEP) and/or angiotensin converting enzyme (ACE)
DE102004044221A1 (de) 2004-09-14 2006-03-16 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue 3-Methyl-7-butinyl-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
CN101048368A (zh) 2004-10-07 2007-10-03 默克公司 作为大麻素受体调节剂的非环状酰肼
JP4862654B2 (ja) 2004-10-08 2012-01-25 アステラス製薬株式会社 芳香環縮合ピリミジン誘導体
TW200621257A (en) 2004-10-20 2006-07-01 Astellas Pharma Inc Pyrimidine derivative fused with nonaromatic ring
US7411093B2 (en) 2004-12-20 2008-08-12 Hoffman-La Roche Inc. Aminocycloalkanes as DPP-IV inhibitors
WO2006068978A2 (en) 2004-12-21 2006-06-29 Takeda Pharmaceutial Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
JP4980928B2 (ja) 2004-12-24 2012-07-18 プロシディオン・リミテッド Ｇタンパク質共役受容体（ｇｐｒ１１６）作動薬および肥満および糖尿病治療のためのその使用
JP5065908B2 (ja) 2004-12-24 2012-11-07 プロシディオン・リミテッド Ｇタンパク質結合受容体作動薬
US7589088B2 (en) 2004-12-29 2009-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Pyrimidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and methods
GB0428514D0 (en) 2004-12-31 2005-02-09 Prosidion Ltd Compounds
DOP2006000008A (es) 2005-01-10 2006-08-31 Arena Pharm Inc Terapia combinada para el tratamiento de la diabetes y afecciones relacionadas y para el tratamiento de afecciones que mejoran mediante un incremento de la concentración sanguínea de glp-1
MY148521A (en) 2005-01-10 2013-04-30 Arena Pharm Inc Substituted pyridinyl and pyrimidinyl derivatives as modulators of metabolism and the treatment of disorders related thereto
US20070032420A1 (en) 2005-02-09 2007-02-08 Entelos, Inc. Treating diabetes with glucagon-like peptide-1 secretagogues
JPWO2006132406A1 (ja) 2005-06-09 2009-01-08 萬有製薬株式会社 下痢を伴う疾患の治療剤としてのｎｐｙｙ２アゴニスト
EP1909791A1 (en) 2005-06-30 2008-04-16 Prosidion Limited G-protein coupled receptor agonists
AU2006264649A1 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Prosidion Limited GPCR agonists
WO2007003961A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Prosidion Limited Gpcr agonists
US20090325924A1 (en) 2005-06-30 2009-12-31 Stuart Edward GPCR Agonists
US7708191B2 (en) * 2005-07-28 2010-05-04 Edwin Vega Telebanking apparatus for transferring money or cash value between two parties in the same country or across national borders, for paying bills and browsing the internet
PE20071221A1 (es) 2006-04-11 2007-12-14 Arena Pharm Inc Agonistas del receptor gpr119 en metodos para aumentar la masa osea y para tratar la osteoporosis y otras afecciones caracterizadas por masa osea baja, y la terapia combinada relacionada a estos agonistas
KR101281962B1 (ko) 2006-04-11 2013-07-08 아레나 파마슈티칼스, 인크. 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 ｇｐｒ119 수용체를 사용하는 방법
US20080058339A1 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Biovitrum New compounds
EP2108960A1 (en) 2008-04-07 2009-10-14 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods of using A G protein-coupled receptor to identify peptide YY (PYY) secretagogues and compounds useful in the treatment of conditons modulated by PYY

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410508B1 (en) * 1998-10-07 2002-06-25 Med College Georgia Res Inst Glucose-dependent insulinotropic peptide for use as an osteotropic hormone
WO2001087929A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human dopamine-like g protein-coupled receptor
WO2005007647A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-27 Arena Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted aryl and heteroaryl derivatives as modulators of metabolism and the prophylaxis and treatment of disorders related thereto

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAYET S. ET AL.: "GPR119 activation increases glucose-dependent insulin secretion in insulin-producing cells and isolated rat islets". DIABETOLOGIA, vol. 48, no. Suppl. 1, 2005, page A166, XP002449852 & 41ST ANNUAL MEETING OF THE EUROPEAN-ASSOCIATION-FOR-THE-STUDY-OF-DIABETES; ATHENS, GREECE; SEPTEMBER 10-15, 2005, ISSN: 0012-186X, abstract *
OVERTON HILARY A. ET AL.: "Deorphanization of a G protein-coupled receptor for oleoylethanolamide and its use in the discovery of small-molecule hypophagic agents". CELL METABOLISM, vol. 3, no. 3, March 2006 (2006-03), pages 167-175 URL, XP002449851, ISSN: 1550-4131, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1971862B1 (en) 2010-11-10
GT200800207A (es) 2010-03-09
ZA200807997B (en) 2011-05-25
JP2009240328A (ja) 2009-10-22
US8017574B2 (en) 2011-09-13
JP4762359B2 (ja) 2011-08-31
MA30555B1 (fr) 2009-07-01
AR060406A1 (es) 2008-06-11
CN101421618B (zh) 2013-11-20
HRP20110068T1 (hr) 2011-02-28
US20120059166A1 (en) 2012-03-08
TNSN08396A1 (en) 2010-04-14
AU2007238805A1 (en) 2007-10-25
RS51745B (en) 2011-10-31
CN103536924A (zh) 2014-01-29
JP2011101640A (ja) 2011-05-26
US8580526B2 (en) 2013-11-12
JP4521838B2 (ja) 2010-08-11
EP2369341A2 (en) 2011-09-28
ATE487940T1 (de) 2010-11-15
DK1971862T3 (da) 2011-02-14
EP2410330A2 (en) 2012-01-25
PT1971862E (pt) 2011-02-14
ES2354390T3 (es) 2011-03-14
JP5415856B2 (ja) 2014-02-12
US8026074B2 (en) 2011-09-27
WO2007120689A2 (en) 2007-10-25
PL1971862T3 (pl) 2011-04-29
KR101281962B1 (ko) 2013-07-08
EP2410330A3 (en) 2012-06-13
TW200809200A (en) 2008-02-16
JP2009533055A (ja) 2009-09-17
BRPI0710597A2 (pt) 2012-06-19
EA201101475A1 (ru) 2012-07-30
MEP27308A (en) 2010-06-10
US20100203038A1 (en) 2010-08-12
ECSP088817A (es) 2008-11-27
CA2618488A1 (en) 2007-10-25
CN101421618A (zh) 2009-04-29
NZ571110A (en) 2011-03-31
US8026212B2 (en) 2011-09-27
KR20090007409A (ko) 2009-01-16
JP2009254375A (ja) 2009-11-05
CL2007001011A1 (es) 2008-05-16
CA2618488C (en) 2010-07-13
EP2402750A1 (en) 2012-01-04
EA200870424A1 (ru) 2009-06-30
EP2369341A3 (en) 2012-01-04
UA97479C2 (ru) 2012-02-27
HK1117911A1 (en) 2009-01-23
JP2011072312A (ja) 2011-04-14
NO20084746L (no) 2009-01-09
DE602007010420D1 (de) 2010-12-23
EP1971862A2 (en) 2008-09-24
US20100203037A1 (en) 2010-08-12
US7833730B2 (en) 2010-11-16
US20100203577A1 (en) 2010-08-12
SI1971862T1 (sl) 2011-02-28
US20100068700A1 (en) 2010-03-18
WO2007120689A3 (en) 2008-05-29
SG10201404220TA (en) 2014-10-30
CY1111123T1 (el) 2015-06-11
AU2007238805B2 (en) 2012-04-05
MX2008013120A (es) 2008-10-27
TWI409458B (zh) 2013-09-21
JP2011103887A (ja) 2011-06-02
CR10337A (es) 2009-01-19
CN103323606A (zh) 2013-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016041B1 (ru) Способы применения рецептора gpr119 для идентификации соединений, которые можно использовать для увеличения костной массы субъекта
Greenhalgh et al. SOCS2 negatively regulates growth hormone action in vitro and in vivo
US7700101B2 (en) Reagents and method for modulating Dkk-mediated interactions
AU2002342734B2 (en) Reagents and methods for modulating Dkk-mediated interactions
US7063954B2 (en) Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using corticotropin releasing factor receptors
NZ529560A (en) Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein
US20070224127A1 (en) Human G protein-coupled receptor and modulators thereof for the treatment of ischemic heart disease and congestive heart failure
JP2009051847A (ja) 代謝関連障害を処置するためのｇｐｒ４３およびその調節因子
JP2011162567A (ja) 心血管障害の処置のためのヒトｇタンパク質共役型レセプターおよびそのモジュレーター
JP2008536880A (ja) 哺乳動物の中枢神経系におけるｇｐｒ３９遺伝子の機能および使用
EP1867341A1 (en) Therapeutic agent for non-alcoholic fatty liver disease, and screening method for drug candidate compound for treatment or prevention of non-alcoholic fatty liver disease
US7098372B1 (en) Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein
Stranieri et al. Comparison between the diagnostic accuracy of clinico-pathological and molecular tests for feline infectious peritonitis (FIP)
US20040005997A1 (en) Methods for identifying compounds for regulating muscle mass of function using amylin receptors
KR20050053628A (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU