TWI409458B

TWI409458B - 使用ｇｐｒ１１９受體鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法

Info

Publication number: TWI409458B
Application number: TW096112536A
Authority: TW
Inventors: Zhi-Liang Chu; James N Leonard
Original assignee: Arena Pharm Inc
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2013-09-21
Also published as: EP2402750A1; AR060406A1; US20100203577A1; US20100068700A1; US8026212B2; HRP20110068T1; EA200870424A1; DE602007010420D1; EP1971862A2; CN103536924A; ECSP088817A; EP2410330A2; MA30555B1; US20120059166A1; SI1971862T1; EA016041B1; ATE487940T1; GT200800207A; DK1971862T3; JP2009533055A

Description

使用GPR119受體鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法

本發明係關於使用GPR119受體鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法。GPR119受體之促效劑可用作用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)及用於增加個體骨質量之治療劑。GPR119受體之促效劑可促進個體骨形成。

以下論述旨在有利於理解本發明，但其並不意欲或認可為本發明之先前技術。

A.骨質疏鬆症

骨質疏鬆症係特徵為骨質量流失及骨架結構之微結構退化以致骨強度降低之致殘疾病，其易使患者脆性骨折之危險增加。骨質疏鬆症在歐洲、日本及美國侵害75,000,000人以上，且致使僅歐洲及美國有2,300,000人以上骨折。在美國，骨質疏鬆症侵害所有停經後之白人女性中之至少25%，且在80歲以上之女性中比例升至70%。三分之一的50歲以上之女性會患有骨質疏鬆性骨折，其在社會上造成相當大的社會及財政負擔。該疾病並不限於女性；年長男性亦可受侵害。到2050年為止，預測男性髖部骨折之全球發生率增加310%，且女性增加240%。臨床上呈現之髖部、前臂及脊椎骨折之組合壽命危險為約40%，相當於心血管疾病之危險。因此，骨質疏鬆性骨折引起相當大的死亡率、發病率及經濟花費。除非研發有效預防策略，否則隨著人口老齡化，骨質疏鬆性骨折之數量及其花費在下一個50年中將至少加倍。(參見(例如)Atik等人，Clin Orthop Relat Res(2006)443：19－24；Raisz,J Clin Invest(2005)115：3318－3325；及World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis。)

B.葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)

葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP，亦稱作抑胃多肽)係在攝取膳食後自十二指腸內分泌K細胞釋放之42個胺基酸的腸肽激素。所釋放之GIP之量主要視所消耗之葡萄糖的量而定。已顯示GIP刺激胰腺β細胞中之葡萄糖依賴性胰島素分泌。GIP經由特異性G蛋白偶合受體(亦即GIPR)介導其作用。

由於GIP在2位處含有丙胺酸，因此其為二肽基肽酶－4(DPP－IV)，調節GIP降解之酶的極佳受質。全長GIP(1－42)在自腸道K細胞分泌之數分鐘內快速轉化成生物非活性之GIP(3－42)。已顯示抑制DPP－IV增強GIP生物活性。(參見(例如)Drucker,Cell Metab(2006)3：153－165；McIntosh等人，Regul Pept(2005)128：159－165；Deacon,Regul Pept(2005)128：117－124；及Ahren等人，Endocrinology(2005)146：2055－2059。)分析例如血液中之全長生物活性GIP可使用N末端特異性檢定來進行(參見(例如)Deacon等人，J Clin Endocrinol Metab(2000)85：3575－3581)。

最近，已顯示GIP會促進骨形成。已顯示GIP活化成骨細胞受體，使得與骨形成均相關之I型膠原蛋白合成與鹼性磷酸酶活性增加。已顯示GIP於活體外會抑制蝕骨細胞活性及分化。已顯示投與GIP可預防因卵巢切除所引起之骨質流失。GIP受體(GIPR)基因剔除小鼠證明尤其在骨骼形成中骨尺寸減小，骨質量降低，骨微結構及生物化學特性改變，及骨骼轉換之參數改變。(參見(例如)Zhong等人，Am J Physiol Endocrinol Metab(2007)292：E543－E548；Bollag等人，Endocrinology(2000)141：1228－1235；Bollag等人，Mol Cell Endocrinol(2001)177：35－41；Xie等人，Bone(2005)37：759－769；及Tsukiyama等人，Mol Endocrinol(2006)20：1644－1651。)

GIP用於維持或增加骨密度或骨形成之效用已由美國商標及專利局(United State Trademark and Patent Office)藉由頒佈美國專利第6,410,508號而認可，該專利係藉由投與GIP肽來治療骨礦化減少。然而，當前GIP肽促效劑遭受口服生物可用性之不足，其負面影響了患者順應性。具吸引力之替代方法為開發用於增加GIP活性之內源性水平的口服活性組合物。

C. GPR119

GPR119係G蛋白偶合受體(GPR119；例如GenBank寄存編號AAP72125之人類GPR119及其等位基因；例如GenBank寄存編號AY288423之小鼠GPR119及其等位基因)。如由促效劑活化GPR119使細胞內cAMP含量升高，其與GPR119與GS偶合一致。在專利文獻中，GPR119已被稱作RUP3(例如WO 00/31258)；GPR119亦已被稱作葡萄糖依賴性促胰島素受體(GDIR)。

D. G蛋白偶合受體

儘管許多受體種類存在於人類中，但到目前為止，最豐富及與治療相關者由G蛋白偶合受體(GPCR)種類表示。據估計在人類基因組內存在大約30,000－40,000個基因，且據估計在此等基因中約2%編碼GPCR。

GPCR代表開發醫藥產品之重要領域。對GPCR有活性之藥物在廣泛範圍之人類疾病中具有治療效益，該等疾病多樣化至疼痛、認知功能障礙、高血壓、消化性潰瘍、鼻炎及哮喘。在約500種臨床用市場化藥物中，30%以上為GPCR功能之調節劑。此等藥物對約30種經充分鑑定之GPCR發揮其活性。(參見(例如)Wise等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol(2004)44：43－66。)

GPCR共用一共同結構基元，該結構基元具有七個形成七個α螺旋之介於22個至24個疏水性胺基酸之間的序列，該等序列中之每一者皆跨膜(每一跨越由數字鑑定，亦即跨膜－1(TM－1)、跨膜－2(TM－2)等)。跨膜螺旋由細胞膜之外部或"細胞外"側(此等分別被稱作"細胞外"區域1、2及3(EC－1、EC－2及EC－3))之跨膜－2與跨膜－3、跨膜－4與跨膜－5及跨膜－6與跨膜－7之間的胺基酸股連接。跨膜螺旋亦由細胞膜之內部或"細胞內"側(此等分別被稱作"細胞內"區域1、2及3(IC－1、IC－2及IC－3))之跨膜－1與跨膜－2、跨膜－3與跨膜－4及跨膜－5與跨膜－6之間的胺基酸股連接。受體之"羧基"("C")末端處於細胞內之胞內空間中，且受體之"胺基"("N")末端處於細胞外之胞外空間中。

一般而言，當配位體與受體結合(通常稱作受體之"活化")時，在受體構形中存在有利於細胞內區域與細胞外"G蛋白"之間的偶合之變化。已報導GPCR對於G蛋白為"混雜的"，亦即GPCR可與一種以上G蛋白相互作用。參見Kenakin,Life Sciences(1988)43：1095－1101。儘管存在其他G蛋白，但目前Gq、Gs、Gi、Gz及Go為已經確定之G蛋白。與G蛋白偶合之經配位體活化之GPCR引發信號級聯過程(稱作"信號轉導")。在正常條件下，信號轉導最終使細胞活化或細胞受抑制。儘管並不希望受理論束縛，但應瞭解，IC－3環以及受體之羧基末端與G蛋白相互作用。

亦存在似使若干種類之GPCR與磷脂酶C路徑偶合之混雜型G蛋白(諸如G15或G16)(Offermanns及Simon,J Biol Chem(1995)270：15175－80)，或經設計以使大量不同GPCR與相同路徑(例如磷脂酶C)偶合之嵌合型G蛋白(Milligan及Rees,Trends in Pharmaceutical Sciences(1999)20：118－24)。在生理條件下，GPCR以如下兩種不同構形之間的平衡存在於細胞膜中："非活性"狀態及"活性"狀態。處於非活性狀態之受體不能與細胞內信號轉導路徑連接以引發產生生物回應之信號轉導。受體構形變成活性狀態使得(經由G蛋白)與轉導路徑連接且產生生物回應。

處於活性狀態之受體可由配位體或化合物(諸如藥物)穩定。包括(但不排外性限於)對受體之胺基酸序列之修飾的新近發現提供除配位體或藥物以外之方式以促進及穩定處於活性狀態構形之受體。此等方式藉由刺激與受體結合之配位體之作用來有效穩定處於活性狀態之受體。由該等配位體非依賴性方式之穩定被稱作"組成性受體活化"。

本發明係關於申請者之意想不到之發現，該發現係將GPR119促效劑投予個體(諸如藉由經口投藥)可對GPR119受體起作用以增加個體之GIP含量。本發明係關於與鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)的化合物及可用於增加個體骨質量之化合物的GPR119相關之方法。GPR119促效劑可用於促進(例如增加)個體骨形成。在某些實施例中，該個體為人類。

編碼人類GPR119多肽之核苷酸序列係以SEQ ID NO：1給出。該經編碼之人類GPR119多肽之胺基酸序列係以SEQ ID NO：2給出。

在第一態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使測試化合物與包含G蛋白偶合受體之宿主細胞或與宿主細胞之膜接觸，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為G蛋白偶合受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；及(b)判定測試化合物刺激G蛋白偶合受體功能之能力；其中測試化合物刺激G蛋白偶合受體功能之能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為SEQ ID NO：2之等位基因。

在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為SEQ ID NO：2之直系同源基因(ortholog)。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為SEQ ID NO：2之哺乳動物直系同源基因。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，方法為鑑定GIP促分泌素之方法。

在某些實施例中，方法包含鑑定受體之促效劑。

在某些實施例中，方法包含鑑定受體之部分促效劑。

在某些實施例中，方法為鑑定可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀之化合物的方法。

在某些實施例中，方法為鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)使在步驟(b)中刺激受體功能之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸；及(e)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，脊椎動物腸內分泌細胞為哺乳動物腸內分泌細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞為K細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之K細胞富集區域之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含十二指腸或空腸組織(參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenomics J(2006)6：131－140)。在某些實施例中，腸內分泌細胞為腸內分泌細胞株。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為經工程化能分泌GIP之重組細胞。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)將在步驟(b)中刺激受體功能之化合物投予脊椎動物；及(e)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，GIP含量為總GIP之血液或血漿濃度。在某些實施例中，GIP含量為生物活性GIP之血液或血漿濃度。

在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。

另外，本發明係關於一種鑑定可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)將在步驟(b)中刺激受體功能之化合物投予脊椎動物；及(e)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力指示測試化合物係為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，該判定包含量測脊椎動物之骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用雙能X射線吸收測定法(DXA)量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值(T－score)。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物或哺乳動物為卵巢切除大鼠及卵巢切除小鼠。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)視情況提供在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(e)使在步驟(b)中刺激受體功能之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸；及(f)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。在某些實施例中，脊椎動物腸內分泌細胞為哺乳動物腸內分泌細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞為K細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之K細胞富集區域之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含十二指腸或空腸組織(參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenomics J(2006)6：131－140)。在某些實施例中，腸內分泌細胞為腸內分泌細胞株。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為經工程化能分泌GIP之重組細胞。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)視情況提供在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(e)將在步驟(b)中刺激受體功能之化合物投予脊椎動物；及(f)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第一態樣之步驟(a)及(b)，且進一步包含以下步驟：(c)視情況合成在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(d)視情況提供在步驟(b)中刺激受體功能之化合物；(e)將在步驟(b)中刺激受體功能之化合物投予脊椎動物；及(f)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力指示測試化合物為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，該判定包含量測個體骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用DXA量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。

在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物或哺乳動物為卵巢切除大鼠及卵巢切除小鼠。

在某些實施例中，經鑑定之GIP促分泌素或可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的經鑑定之化合物或可用於增加個體骨質量之經鑑定之化合物為受體之促效劑。在一些實施例中，該促效劑為部分促效劑。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體與G蛋白偶合。在某些實施例中，活化G蛋白偶合受體增加細胞內cAMP之含量。在某些實施例中，G蛋白為Gs。

在某些實施例中，人類DNA試樣為人類基因組DNA。

在一些實施例中，聚合酶鏈反應為反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)。RT－PCR技術為熟習此項技術者所熟知。在某些實施例中，人類DNA試樣為人類cDNA。在某些實施例中，cDNA來自表現GPR119之人類組織。在一些實施例中，表現GPR119之人類組織為胰腺或胰島。在某些實施例中，cDNA來自表現GPR119之人類細胞類型。在一些實施例中，cDNA來自胰腺β細胞。在一些實施例中，cDNA來自胰腺細胞株。

在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為SEQ ID NO：2之等位基因。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體。在一些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在某些實施例中，嚴格雜交條件包含在42℃下在包含50%甲醯胺、5×SSC(1×SSC＝150 mM NaCl、15 mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml經變性剪切之鮭魚精子DNA的溶液中雜交，接著在65℃下在包含0.1×SSC之溶液中洗滌。雜交技術為熟習此項技術者所熟知。

在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2之等位基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2之直系同源基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體。在一些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為GPCR。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在一些實施例中，G蛋白偶合受體為包含G蛋白之融合蛋白質之部分。用於製造GPCR：G融合構築體之技術為熟習此項技術者所熟知(參見(例如)國際申請案WO 02/42461)。

在某些實施例中，宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼G蛋白偶合受體之聚核苷酸。在一些實施例中，表現載體為pCMV。根據國際承認用於專利程序之微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)之條款，此載體於1998年10月13日寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110－2209 USA)。由ATCC測試DNA且判定其具活力。ATCC已給予pCMV以下寄存編號：ATCC #203351。其他合適之表現載體對一般技術者顯而易見，且多種表現載體市售可得(例如，得自Clontech,Palo Alto,CA；Stratagene,La Jolla,CA；及Invitrogen,Carlsbad,CA)。

在一些實施例中，宿主細胞為脊椎動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物宿主細胞係選自由293細胞、293T細胞、CHO細胞、MCB3901細胞及COS－7細胞組成之群。在一些實施例中，宿主細胞為酵母細胞。在一些實施例中，宿主細胞為黑色素細胞。其他合適之宿主細胞對一般技術者顯而易見，且多種細胞株可購自美國典型培養物保藏中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110－2209)。

在某些實施例中，該判定與G蛋白偶合受體為Gs偶合受體一致。

在一些實施例中，該判定與G蛋白偶合受體經由混雜型G蛋白(諸如Gα15或Gα16)與磷脂酶C路徑偶合一致。混雜型G蛋白為熟習此項技術者所熟知(參見(例如)Offermanns等人，J Biol Chem(1995)270：15175－15180)。在一些實施例中，該判定與G蛋白偶合受體經由嵌合型G蛋白(例如)與磷脂酶C路徑偶合一致。嵌合型G蛋白為熟習此項技術者所熟知(參見(例如)Milligan等人，Trends in Pharmaceutical Sciences(1999)20：118－124；及WO 02/42461)。

在一些實施例中，該判定係經由量測第二訊息量來進行。

在一些實施例中，該判定係經由量測第二訊息量來進行，該第二訊息係選自由環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、1,4,5－三磷酸肌醇酯(IP₃ )、二醯基甘油(DAG)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶－1(MEKK1)活性及Ca^2＋組成之群。在一些較佳實施例中，第二訊息為cAMP。在某些實施例中，細胞內cAMP之含量增加。

在某些實施例中，該判定係使用包含G蛋白偶合受體之膜來進行。

在某些實施例中，該判定係經由使用黑色素細胞檢定來進行。在某些實施例中，色素分散之程度增加。

在一些實施例中，該判定係經由報導體檢定來進行。在一些實施例中，該報導體檢定為CRE－Luc報導體檢定。

在一些實施例中，該判定係經由量測藉由增加細胞內cAMP含量所調節之活性來進行。

在一些實施例中，該判定係經由CRE－Luc報導體檢定來進行。在某些實施例中，螢光素酶活性程度增加。

在一些實施例中，該判定係經由量測與包含G蛋白偶合受體之膜結合的GTPγS來進行。在一些實施例中，該GTPγS以[³⁵ S]標記。在一些實施例中，該與包含GPCR之膜結合的GTPγS增加。

在一些實施例中，測試化合物為小分子。在一些實施例中，測試化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽。在一些實施例中，測試化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，測試化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為脂質。在一些實施例中，測試化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽或脂質。在一些實施例中，測試化合物為多肽。在一些實施例中，測試化合物為多肽，其限制條件為該多肽不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，測試化合物為脂質。在一些實施例中，測試化合物不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，測試化合物為抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，方法進一步包含視情況確定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物之結構的步驟。

在一些實施例中，方法進一步包含視情況提供GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物之名稱或結構的步驟。

在一些實施例中，該方法進一步包含視情況產生或合成GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的步驟。

在一些實施例中，該方法進一步包含將GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物調配成醫藥組合物之步驟。

在第二態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸，該化合物已由第一態樣之方法來鑑定；及(b)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將化合物投予脊椎動物，該化合物已由第一態樣之方法鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將化合物投予脊椎動物，該化合物已由第一態樣之方法鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力進一步指示測試化合物為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，該判定包含量測脊椎動物之骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用雙能X射線吸收測定法(DXA)量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物或哺乳動物為卵巢切除大鼠及卵巢切除小鼠。

在第三態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使GPR119促效劑活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸；及(b)判定GPR119促效劑是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中GPR119促效劑刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力指示GPR119促效劑為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將GPR119促效劑投予脊椎動物；及(b)判定GPR119促效劑是否增加脊椎動物之GIP含量；其中GPR119促效劑增加脊椎動物之GIP含量的能力指示GPR119促效劑為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將GPR119促效劑投予脊椎動物；及(b)判定GPR119促效劑是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中GPR119促效劑增加脊椎動物之骨質量水平的能力指示GPR119促效劑為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，GPR119促效劑為內源性GPR119之促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為GPR119部分促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為小分子。在一些實施例中，小分子不為多肽。在一些實施例中，小分子不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，小分子不為脂質。在一些實施例中，小分子不為多肽或脂質。

在某些實施例中，GPR119促效劑可口服使用。

在某些實施例中，GPR119促效劑具有以下EC₅₀ 值：小於約10 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約75 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約15 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，GPR119促效劑對具有SEQ ID NO：2之人類GPR119具有以下EC₅₀ 值：小於約10 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約75 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約15 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，在腺苷酸環化酶檢定中(例示性腺苷酸環化酶檢定提供於下文實例7及實例8中)，GPR119促效劑對具有SEQ ID NO：2之人類GPR119具有以下EC₅₀ 值：小於約10 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約75 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約15 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，在黑色素細胞檢定中(例示性黑色素細胞檢定提供於下文實例9中)，GPR119促效劑對具有SEQ ID NO：2之人類GPR119具有以下EC₅₀ 值：小於約10 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約75 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約15 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM或小於約1 nM。

例示性GPR119促效劑揭示於以下文獻中：例如國際申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 04/065380公開)；國際申請案第PCT/US2004/005555號(以WO 04/076413公開)；國際申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 05/007647公開)；國際申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 05/007658公開)；國際申請案第PCT/US2005/019318號(以WO 2005/121121公開)；國際申請案第PCT/GB2004/050046號(以WO 2005/061489公開)；國際申請案第PCT/US06/00567號(以WO 2006/083491公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050264號(以WO 2006/067531公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050265號(以WO 2006/067532公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050266號(以WO 2006/070208公開)；國際申請案第PCT/JP02/09350號(以WO 03/026661公開)；國際申請案第PCT/JP2005/018412號(以WO 06/040966公開)；國際申請案第PCT/JP2005/019000號(以WO 2006/043490公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050176號(以WO 2007/003960公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050177號(以WO 2007/003961公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050178號(以WO 2007/003962公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050182號(以WO 2007/003964公開)；及國際申請案第PCT/JP02/09350號(以WO 03/026661公開)。

在某些實施例中，方法包含提供GPR119促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑可由第一態樣之方法鑑定。

在某些實施例中，方法包含進行第一態樣之方法以鑑定GPR119促效劑。

在某些實施例中，方法包含由第一態樣之方法鑑定GPR119促效劑。

在第四態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在有或無測試化合物存在之情況下使G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體接觸，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；及(b)偵測該已知配位體與該受體之間的複合物；及(c)判定在有測試化合物存在之情況下是否比在無測試化合物存在之情況下形成更少該複合物；其中該判定指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為SEQ ID NO：2之直系同源基因。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為SEQ ID NO：2之哺乳動物直系同源基因。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，方法為鑑定GIP促分泌素之方法。

在某些實施例中，方法為鑑定可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀之化合物的方法。

在某些實施例中，已知配位體為內源性脊椎動物、哺乳動物或人類GPR119受體之配位體或促效劑。在某些實施例中，已知配位體為內源性脊椎動物、哺乳動物或人類GPR119受體之已知促效劑。在某些實施例中，已知配位體為內源性人類GPR119受體之配位體或促效劑。在某些實施例中，已知配位體與以下文獻中所揭示之化合物相同：例如國際申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 04/065380公開)；國際申請案第PCT/US2004/005555號(以WO 04/076413公開)；國際申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 05/007647公開)；國際申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 05/007658公開)；國際申請案第PCT/US2005/019318號(以WO 2005/121121公開)；國際申請案第PCT/GB2004/050046號(以WO 2005/061489公開)；國際申請案第PCT/US06/00567號(以WO 2006/083491公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050264號(以WO 2006/067531公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050265號(以WO 2006/067532公開)；國際申請案第PCT/GB2005/050266號(以WO 2006/070208公開)；國際申請案第PCT/JP02/09350號(以WO 03/026661公開)；國際申請案第PCT/JP2005/018412號(以WO 06/040966公開)；國際申請案第PCT/JP2005/019000號(以WO 2006/043490公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050176號(以WO 2007/003960公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050177號(以WO 2007/003961公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050178號(以WO 2007/003962公開)；國際申請案第PCT/GB2006/050182號(以WO 2007/003964公開)；或國際申請案第PCT/JP02/09350號(以WO 03/026661公開)。在某些實施例中，已知配位體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，已知配位體為內源性脊椎動物、哺乳動物或人類GPR119受體之內源性配位體。

在某些實施例中，視情況經標記之已知配位體為經標記之已知配位體。在某些實施例中，經標記之已知配位體為經放射性標記之已知配位體。用於放射性標記化合物，諸如用於標記本發明之G蛋白偶合受體之已知配位體的技術為熟習此項技術者所熟知。參見(例如)國際申請案WO 04/065380。亦參見(例如)下文實例11。

用於偵測G蛋白偶合受體與已知為該G蛋白偶合受體之配位體之化合物之間的複合物為熟習此項技術者所熟知。參見(例如)國際申請案WO 04/065380。亦參見(例如)下文實例12。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物；(e)使在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸；及(f)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。在某些實施例中，脊椎動物腸內分泌細胞為哺乳動物腸內分泌細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞為K細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之K細胞富集區域之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含十二指腸或空腸組織(參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenomics J(2006)6：131－140)。在某些實施例中，腸內分泌細胞為腸內分泌細胞株。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為經工程化能分泌GIP之重組細胞。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物；(e)將在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物投予脊椎動物；及(f)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。

另外，本發明係關於一種鑑定可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物；(e)將在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物投予脊椎動物；及(f)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力指示測試化合物為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，該判定包含量測個體骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用DXA量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物或哺乳動物為卵巢切除大鼠及卵巢切除小鼠。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(e)視情況提供在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(f)使在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸；及(g)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。在某些實施例中，脊椎動物腸內分泌細胞為哺乳動物腸內分泌細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞為K細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之K細胞富集區域之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含十二指腸或空腸組織(參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenomics J(2006)6：131－140)。在某些實施例中，腸內分泌細胞為腸內分泌細胞株。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為經工程化能分泌GIP之重組細胞。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(e)視情況提供在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(f)將在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物投予脊椎動物；及(g)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含此第四態樣之步驟(a)至(c)，且進一步包含以下步驟：(d)視情況合成在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(e)視情況提供在化合物存在下根據步驟(c)形成較少該複合物之化合物；(f)將在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物投予脊椎動物；及(g)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力指示測試化合物為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，人類DNA試樣為人類基因組DNA。

在一些實施例中，聚合酶鏈反應為反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)。RT－PCR技術為熟習此項技術者所熟知。在某些實施例中，人類DNA試樣為人類cDNA。在某些實施例中，cDNA來自表現GPR119之人類組織。在一些實施例中，表現GPR119之人類組織為胰腺或胰島。在某些實施例中，cDNA來自表現GPR119之人類細胞類型。在一些實施例中，cDNA來自胰腺β細胞。在某些實施例中，cDNA來自胰腺細胞株。

在某些實施例中，嚴格雜交條件(例如高度嚴格條件)包含在42℃下在包含50%甲醯胺、5×SSC(1×SSC＝150 mM NaCl、15 mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml經變性剪切之鮭魚精子DNA的溶液中雜交，接著在65℃下在包含0.1×SSC之溶液中洗滌。雜交技術為熟習此項技術者所熟知。

在某些實施例中，該判定係使用包含G蛋白偶合受體之宿主細胞來進行。在某些實施例中，宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼GPCR之聚核苷酸。在一些實施例中，表現載體為pCMV。根據國際承認用於專利程序之微生物寄存布達佩斯條約之條款，此載體於1998年10月13日寄存於美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110－2209 USA)。由ATCC測試DNA且判定其具活力。ATCC已給予pCMV以下寄存編號：ATCC #203351。其他合適之表現載體對一般技術者顯而易見，且多種表現載體市售可得(例如，得自Clontech,Palo Alto,CA；Stratagene,La Jolla,CA；及Invitrogen,Carlsbad,CA)。

在第五態樣中，本發明係關於篩選測試化合物以鑑定GIP促分泌素、用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法特徵在於使用包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之G蛋白偶合受體：(a)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(b)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(c)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(d)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(e)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(f)SEQ ID NO：2之變異體；(g)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(f)之胺基酸序列：(i)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(ii)包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(h)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(i)(a)至(h)中之任一者之生物學活性片段。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，方法包含鑑定受體之促效劑。

在某些實施例中，方法包含鑑定受體之部分促效劑。

在第六態樣中，本發明係關於一種包含根據第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣或第五態樣鑑定GIP促分泌素、用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或用於增加個體骨質量之化合物，將該GIP促分泌素、該用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或該用於增加個體骨質量之化合物調配成醫藥組合物之方法。

在第七態樣中，本發明係關於使用G蛋白偶合受體篩選作為GIP促分泌素、用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或用於增加個體骨質量之化合物的測試化合物，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(b)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(c)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(d)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(e)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(f)SEQ ID NO：2之變異體；(g)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(f)之胺基酸序列：(i)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(ii)包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(h)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(i)(a)至(h)中之任一者之生物學活性片段。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，受體為重組性的。

在某些實施例中，測試化合物為小分子。

在某些實施例中，測試化合物為GPR119促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為內源性GPR119之促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為GPR119部分促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。

在某些實施例中，GPR119促效劑為小分子。

在某些實施例中，GPR119促效劑可口服使用。

在第八態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使刺激G蛋白偶合受體功能之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為G蛋白偶合受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第一態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，脊椎動物腸內分泌細胞為哺乳動物腸內分泌細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞為K細胞。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含來源於小腸之K細胞富集區域之組織。在某些實施例中，腸內分泌細胞包含十二指腸或空腸組織(參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenomics J(2006)6：131－140)。在某些實施例中，腸內分泌細胞為腸內分泌細胞株。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為胰腺細胞。參見(例如)Xie等人，Bone 2007 as relates to pancreatic expression of GIP。在某些實施例中，能分泌GIP之細胞為經工程化能分泌GIP之重組細胞。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將刺激G蛋白偶合受體功能之化合物投予脊椎動物，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為G蛋白偶合受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第一態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，GIP含量為總GIP之血液或血漿或血清濃度。在某些實施例中，GIP含量為生物活性GIP之血液或血漿或血清濃度。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將刺激G蛋白偶合受體功能之化合物投予脊椎動物，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為G蛋白偶合受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第一態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力進一步指示測試化合物為可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

在某些實施例中，該判定包含量測脊椎動物之骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用雙能X射線吸收測定法(DXA)量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。

在某些實施例中，人類DNA試樣為人類基因組DNA。

在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為小分子。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為脂質。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽或脂質。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為多肽。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為多肽，其限制條件為該多肽不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為脂質。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，刺激G蛋白偶合受體功能之化合物為抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，該方法進一步包含將GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物調配成藥物之步驟。

在第九態樣中，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使在有化合物存在之情況下比在無該化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或與能分泌GIP之細胞接觸，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第四態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP；其中測試化合物刺激自脊椎動物腸內分泌細胞或自能分泌GIP之細胞分泌GIP的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在某些實施例中，G蛋白偶合受體為重組性的。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將化合物投予脊椎動物，其中在有該化合物存在之情況下比在無該化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第四態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之GIP含量；其中測試化合物增加脊椎動物之GIP含量的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

另外，本發明係關於一種鑑定GIP促分泌素、可用於預防或治療特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)將化合物投予脊椎動物，其中在有該化合物存在之情況下比在無該化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物，其中該G蛋白偶合受體包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(iii)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其限制條件為受體不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iv)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(v)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(vi)SEQ ID NO：2之變異體；(vii)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(vi)之胺基酸序列：(a')與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(b')包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(viii)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(ix)(i)至(viii)中之任一者之生物學活性片段；該化合物已由第四態樣之方法確定或鑑定；及(b)判定化合物是否增加脊椎動物之骨質量水平；其中測試化合物增加脊椎動物之骨質量水平的能力進一步指示測試化合物為GIP促分泌素、可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀的化合物或可用於增加個體骨質量之化合物。

在某些實施例中，該判定包含量測脊椎動物之骨質量水平。在某些實施例中，該量測骨質量水平包含使用DXA量測骨質量水平。在某些實施例中，該使用DXA量測骨質量水平包含使用DXA量測T值。在某些實施例中，該使用DXA量測T值包含使用DXA在髖部量測T值。應明顯預期該量測骨質量水平可包含使用除DXA以外之技術(諸如單X射線吸收測定法(SXA))量測骨質量水平(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis)。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為非人類哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為非人類哺乳動物。

在某些實施例中，人類DNA試樣為人類基因組DNA。

在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為小分子。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為脂質。在一些實施例中，測試化合物為小分子，其限制條件為該小分子不為多肽或脂質。在一些實施例中，測試化合物為多肽。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為多肽，其限制條件為該多肽不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為脂質。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物不為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在有化合物存在之情況下比在無化合物存在之情況下形成更少G蛋白偶合受體與該受體之視情況經標記之已知配位體之間的複合物之化合物為抗體或其抗原結合片段。

在某些實施例中，方法為鑑定GIP促分泌素之方法。

在某些實施例中，視情況經標記之已知配位體為經標記之已知配位體。在某些實施例中，經標記之已知配位體為經放射性標記之已知配位體。諸如用於標記本發明之G蛋白偶合受體之已知配位體的用於放射性標記化合物之技術為熟習此項技術者所熟知。參見(例如)國際申請案WO 04/065380。亦參見(例如)下文實例11。

本發明係關於使用GPR119受體鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法。GPR119受體之促效劑可用作用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)及用於增加個體骨質量的治療劑。本發明係至少部分基於申請者之令人驚訝之發現，該發現係將GPR119促效劑投予個體(諸如藉由經口投予)可對GPR119受體起作用以增加個體之GIP含量。

如本文中所使用，術語"配位體"應意謂特異性結合多肽(諸如GPR119)之分子(例如測試化合物)。配位體可為(例如)多肽、脂質、小分子、抗體。化合物1為GPR119受體多肽之例示性配位體(參見表A，其陳述化合物1之化學結構及化學名稱)。化合物1與國際專利申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 2004/065380公開)所揭示之化合物相同。(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺(參見表A)為GPR119受體多肽之例示性配位體。化合物2為GPR119受體多肽之例示性配位體。化合物2與國際專利申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 2005/007658公開)所揭示之化合物相同。化合物3為GPR119受體多肽之例示性配位體。化合物3與國際專利申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 2005/007647公開)所揭示之化合物相同。內源性配位體為成為原生多肽(諸如GPR119)之內源性、天然配位體的配位體。配位體可為"拮抗劑"、"促效劑"、"部分促效劑"或"反向促效劑"，或其類似物。

如本文中所使用，術語"促效劑"應意謂藉助於結合GPCR而活化該GPCR以引起由GPCR介導之細胞內回應的試劑(例如配位體、測試化合物)。

如本文中所使用，術語"部分促效劑"應意謂藉助於結合GPCR而活化該GPCR以引起由GPCR介導之細胞內回應(儘管比完全促效劑所達到的程度更小)之試劑(例如配位體、測試化合物)。

術語"拮抗劑"應意謂在與促效劑或部分促效劑大致相同之位點處結合及較佳競爭性結合GPCR但並不活化由活性形式之GPCR所引發之細胞內回應，且可進而抑制由促效劑或部分促效劑所產生之細胞內回應的試劑(例如配位體、測試化合物)。在無促效劑或部分促效劑存在之情況下拮抗劑通常並不減少基線細胞內回應。

術語"反向促效劑"應意謂結合GPCR且抑制在無促效劑或部分促效劑存在之情況下所觀測到的由在正常基準活性以下之活性形式之受體所引發之基線細胞內回應的試劑(例如配位體、測試化合物)。

如本文中所使用，術語"GPR119促效劑"係指結合GPR119受體且充當促效劑之化合物。化合物1為例示性GPR119促效劑(參見表A，其陳述化合物1之化學結構及化學名稱)。化合物1與國際專利申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 2004/065380公開)所揭示之化合物相同。(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為例示性GPR119促效劑。化合物2為例示性GPR119促效劑。化合物2與國際專利申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 2005/007658公開)所揭示之化合物相同。化合物3為例示性GPR119促效劑。化合物3與國際專利申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 2005/007647公開)所揭示之化合物相同。

如本文中所使用，術語"選擇性GPR119促效劑"係指對GPR119受體具有高於對一或多種相關受體之選擇性的GPR119促效劑，該等相關受體諸如激腎上腺皮質素釋放因子－1(CRF－1)受體。化合物1為例示性選擇性GPR119促效劑(參見表A，其陳述化合物1之化學結構及化學名稱)。化合物1與國際專利申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 2004/065380公開)所揭示之化合物相同。(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為例示性選擇性GPR119促效劑。化合物2為例示性選擇性GPR119促效劑。化合物2與國際專利申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 2005/007658公開)所揭示之化合物相同。化合物3為例示性選擇性GPR119促效劑。化合物3與國際專利申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 2005/007647公開)所揭示之化合物相同。

術語"GIP促分泌素"應意謂促進例如腸內分泌細胞之細胞內GIP分泌或在投予諸如脊椎動物或哺乳動物之個體後增加例如血液或血漿GIP含量之總GIP含量的試劑，例如配位體、測試化合物。在某些實施例中，GIP促分泌素為適合於增加例如血液或血漿總GIP含量之個體之總GIP含量的化合物。

如本文中所使用，術語"個體"係指脊椎動物，其包括(但不限於)：魚(諸如市售養殖魚、觀賞魚等)、兩棲動物(諸如青蛙、蟾蜍、寵物型兩棲動物等)、爬行動物(諸如蛇、蜥蜴、海龜、寵物型爬行動物等)、鳥(諸如家雞、火雞、寵物鳥等)及哺乳動物(諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豬、狗、貓、馬、母牛、綿羊、山羊、非人類靈長類動物、非人類哺乳動物、寵物型非人類哺乳動物、人類等)。在某些實施例中，個體為魚。在某些實施例中，個體為兩棲動物。在某些實施例中，個體為爬行動物。在某些實施例中，個體為鳥。在某些實施例中，個體為火雞。在過去25年中，對於具有較大胸肌質量之火雞的商用選擇壓力對骨架完整性之需求增加。然而，胸肌質量增加尚未伴隨有骨骼之代償性變化，從而使火雞行業已經歷腿部問題之增加。已報導年輕成年雄性火雞長骨骨折。(參見(例如)Crespo等人，Poult Sci(2000)79：602－608。)在某些實施例中，個體為哺乳動物。在某些實施例中，個體為小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豬、狗、貓、馬、母牛、綿羊、山羊、非人類靈長類動物或人類(其可單獨或以任何組合包括於本發明之實施例中)。在某些實施例中，個體為馬。在諸如賽馬、溜蹄及其他競賽事件之活動中所涉及之馬的表演型馬易於骨折。在某些實施例中，個體為狗或貓。在某些實施例中，個體為人類伴侶動物(諸如狗、貓等)、家畜(諸如母牛、綿羊、山羊、豬、家雞等)、運動型動物(諸如馬、狗等)、馱畜(諸如騾、駱駝等)或外來動物(諸如動物園中所見之動物，等)，該等動物可單獨或以任何組合包括於本發明之實施例中。在某些實施例中，個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，個體為非人類靈長類動物(諸如獼猴、黑猩猩等)。在某些實施例中，個體為人類。

如本文中所使用，術語"需要預防或治療"係指個體需要或將受益於治療之由護理者(例如，在人類狀況下為醫師、護士、從業護士；在非人類脊椎動物狀況下及在非人類哺乳動物之特定實施例中為獸醫)所作出之判斷。

如本文中所使用，術語"治療有效量"或"治療有效劑量"係指引起研究者、獸醫、醫學博士或其他臨床醫師所尋求之組織、系統、動物、個體或人類之生物回應或藥物回應的活性化合物或醫藥劑之量，該生物回應或藥物回應包含以下回應中之一或多者：(1)預防疾病；例如預防易患疾病、病狀或病症而尚未經歷或顯示疾病之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症，(2)抑制疾病；例如抑制經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即遏止病理及/或症狀進一步發展)，及(3)改善疾病；例如改善經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即逆轉病理及/或症狀)。

如本文中所使用，術語"治療功效"係指引起研究者、獸醫、醫學博士或其他臨床醫師所尋求之組織、系統、動物、個體或人類之生物回應或藥物回應，該生物回應或藥物回應包含以下回應中之一或多者：(1)預防疾病；例如預防易患疾病、病狀或病症而尚未經歷或顯示疾病之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症，(2)抑制疾病；例如抑制經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即遏止病理及/或症狀進一步發展)，及(3)改善疾病；例如改善經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即逆轉病理及/或症狀)。

術語"預防有效量"係指將預防或降低設法預防之生物事件或藥物事件之發生危險的藥物量。在許多情況下，預防有效量與治療有效量相同。

術語"組合物"應意謂包含至少一種組份之物質。

術語"活性成份"應意謂在診斷、治癒、緩解、治療或預防疾病中提供藥理學活性或其他直接作用之任何組份。

術語"醫藥組合物"應意謂包含至少一種活性成份之組合物，藉以該組合物受哺乳動物中之研究及治療檢驗。

"醫藥學上可接受"意謂載劑、媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或鹽須與調配物之其他成份相容，且對其接受者無害。

術語"劑型"應意謂藥物產生及分配於其中之實體形態，諸如錠劑、膠囊或注射劑。

"骨"意謂形成多數脊椎動物之骨架之主要部分的緻密、半硬質、多孔、鈣化結締組織，其包含緻密有機基質及無機、礦物組份。骨為構成脊椎動物骨架之眾多解剖學獨特結構中之任一者。

術語"骨質量"及"骨礦密度(BMD)"在本文中可互換使用。人類BMD通常由標準放射照相技術，雙能X射線吸收測定法(DXA)來量測。在經發展以分析BMD之許多技術中，DXA在技術上發展最高且在生物學上最充分有效。具有合適相適應之軟體之DXA技術亦可用於在動物研究中可靠地分析BMD。DXA係在診斷骨質疏鬆症、預後(骨折預測)、監控病症之自然史及分析對治療之回應中使用。

如本文中所使用，術語"低骨質量"係指個體之骨礦密度(BMD)的任何減少或降低，且包括如由世界衛生組織(World Health Organization，WHO)之提案中所定義之骨質疏鬆症與骨質減少。WHO已將正常定義為在年輕成年參考平均值之一標準差內的BMD值(T值－1)。WHO已將骨質減少定義為在年輕成年平均值以下大於1標準差，但在此值以下小於2.5標準差之BMD值(T值<－1及>－2.5)。WHO已將骨質疏鬆症描繪為骨質減少之更嚴重形式，且已將其定義為在年輕成年平均值以下2.5標準差或更高之BMD值(T值－2.5)。(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis，其揭示內容係以引用的方式全部併入本文中)。更為通常地，將骨質減少定義為小於－1且大於－2之T值，且將骨質疏鬆症定義為小於或等於－2之T值。在本發明之某些實施例中，T值係用DXA在髖部量測。

如本文中所使用，術語"骨質疏鬆症"係由在年輕成年參考平均值以下2標準差或更低之BMD值(T值－2)來定義或係指由護理者(例如在人類狀況下為醫師、護士、從業護士；在非人類脊椎動物狀況下為獸醫)所作出之診斷。

骨質疏鬆症可分為原發性或繼發性的。(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis。)如本文中所使用，術語"骨質疏鬆症"涵蓋原發性骨質疏鬆症及繼發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。

如本文中所使用，"原發性骨質疏鬆症"與停經(自然、提前或手術)、變老或兩者相關。應瞭解，在本發明中，與停經(自然、提前或手術)相關之原發性骨質疏鬆症、與變老相關之原發性骨質疏鬆症及與停經及變老相關之原發性骨質疏鬆症可單獨或以任何組合包括於實施例中。

如本文中所使用，"繼發性骨質疏鬆症"係指並不與停經或變老相關而與醫學病況或與藥劑或藥物的使用相關之骨質疏鬆症。骨質疏鬆症之危險增加係與包括(但不限於)內分泌及代謝失調及惡性病之許多醫學病況相關，且與某些藥劑及藥物之使用相關，該等藥物及藥劑之實例為熟習此項技術者所熟知(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis；Williams Textbook of Endocrinology，第10版；其揭示內容係以引用的方式全部併入本文中)。繼發性骨質疏鬆症亦可與不動性相關。對醫學病況、對使用藥劑或藥物或對不動性而言為繼發性之骨質疏鬆症的診斷可由護理者(例如在人類狀況下為醫師、護士、從業護士；在非人類脊椎動物狀況下為獸醫)作出。

"骨折"意謂骨之完全或不完全破裂、斷裂或裂開。骨折之診斷通常視臨床檢查及放射學測定而定。在本發明中，骨折包括(但不限於)：創傷性骨折、長期骨折及病理性骨折。

如本文中所使用，"創傷性骨折"應指涉及具有超過骨天然彈性之局部暴力程度之閾上外傷的即刻性骨折。其可伴隨有同時軟組織及時常皮膚損傷。創傷性骨折可閉合性的(相鄰軟組織可受損傷而其覆蓋性軟部很大程度上被保留)。創傷性骨折可為開放性的(由於大範圍軟組織損傷而使骨之斷經游離使得來自外部之病原體可直接進入傷口)。

如本文中所使用，"長期骨折"應指慢性骨折、疲勞性骨折、應力骨折或I型自發性骨折。

如本文中所使用，"病理性骨折"應指II型自發性骨折。病理性骨折在無造成其之足夠外傷的情況下自發性出現。骨可能先前已由於全身性疾病(例如骨質疏鬆症、骨營養不良或佩吉特氏畸形性骨炎(Paget's osteitis deformans))或由於局部骨病變(例如癌轉移、放射性骨壞死或骨腫瘤)而受損。參見Adler,Claus－Peter,BONE DISEASES，第114頁(Springer－Verlag,Germany 2000)。

骨折亦包括(但不限於)：傾斜性扭轉骨折、橫斷骨折、粉碎性骨折、壓縮性骨折、肋骨骨折、蔓延性骨折及股骨頸骨折(Adler,Claus－Peter,BONE DISEASES,Springer－Verlag,Germany(2000))。

如本文中所使用，術語"特徵為低骨質量之病狀"包括(但不限於)：骨質減少、骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、骨關節炎、牙周病、牙槽骨質流失、截骨術骨質流失、兒童特發性骨質流失、脊柱彎曲及身高縮短。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與醫學病況相關。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與藥劑或藥物之使用相關。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與不動性相關。特徵為低骨質量之病狀亦包括(但不限於)：佩吉特氏病(Paget's disease)、由轉移性癌症所引起之骨質流失及溶骨病變(諸如由贅生性疾病、放射線療法或化學療法所引起之彼等溶骨病變)。特徵為低骨質量之病狀亦包括(但不限於)：骨質疏鬆症之長期併發症，諸如脊柱彎曲、身高縮短及修復手術。應瞭解，在本發明中，特徵為低骨質量之病狀可單獨或以任何組合包括於實施例中。(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis；Williams Textbook of Endocrinology，第10版，Larsen等人，編(2002),W.B.Saunders Company；及Endocrinology and Metabolism，第4版，Felig等人，編(2001),McGraw－Hill Book Company；其中各者之揭示內容均以引用的方式全部併入本文中。)

如本文中所使用，"骨病"係指與骨異常相關之病症或病狀。可根據本發明藉由增加骨質量或骨生長來治療之骨病包括(但不限於)：骨質減少、骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、骨關節炎、牙周病、牙槽骨質流失、截骨術骨質流失、兒童特發性骨質流失、脊柱彎曲及身高縮短。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與醫學病況相關。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與藥劑或藥物的使用相關。在某些實施例中，繼發性骨質疏鬆症與不動性相關。可根據本發明藉由增加骨質量或骨生長來治療之骨病亦包括(但不限於)：佩吉特氏病、由轉移性癌症所引起之骨質流失。可根據本發明藉由增加骨質量或生長來治療之破壞性骨病包括(但不限於)：骨質疏鬆症、骨關節炎及溶骨病變(諸如由贅生性疾病、放射線療法或化學療法所引起之彼等溶骨病變)。應瞭解，在本發明中，可根據本發明藉由增加骨質量或生長來治療之骨病可單獨或以任何組合包括於實施例中。(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis；Williams Textbook of Endocrinology，第10版，Larsen等人，編(2002),W.B.Saunders Company；及Endocrinology and Metabolism，第4版，Felig等人，編(2001),McGraw－Hill Book Company；其中各者之揭示內容均以引用的方式全部併入本文中。)

本發明亦係關於得益於根據本發明藉由增加骨質量或骨生長之治療的其他病狀，該治療包括(但不限於)：增強面部修復、上頜骨修復、下頜骨修復、牙周病或拔牙後之骨癒合，增強長骨伸長，增強修復性向內生長及增加骨性結合。

術語"內源性"應意謂個體(例如且並不限於人類)天然產生之物質。相反，"非內源性"應意謂並非由個體(例如且並不限於人類)天然產生之彼物質。

術語G蛋白偶合受體之"生物學活性片段"應意謂具有天然產生之GPCR之結構及生物化學功能之GPCR的片段。在某些實施例中，生物學活性片段與G蛋白偶合。在某些實施例中，生物學活性片段與GPCR之已知配位體結合。

術語"引子"在本文中用於表示與靶核苷酸序列互補且用於與靶核苷酸序列雜交之特異性核苷酸序列。引子充當由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶所催化之核苷酸聚合的引發點。

術語"表現載體"應意謂在表現載體之適當宿主細胞重組體中轉錄經選殖之DNA及轉譯經轉錄之mRNA所需的DNA序列。經適當建構之表現載體應含有宿主細胞中用於自主複製之複製起始點、可選擇標記、有限數目之適用限制酶位點、高複本數之潛能及活性啟動子。在表現載體內待轉錄之經選殖之DNA可操作地連接組成性或條件性活性啟動子。

術語"宿主細胞"應意謂能具有併入其中之載體的細胞。在本發明之內容中，載體將通常含有編碼與合適之啟動子序列可操作地連接之GPCR或GPCR融合蛋白質的核酸以使GPCR或GPCR融合蛋白質之表現發生。在特定實施例中，宿主細胞為真核宿主細胞。在某些實施例中，真核宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。在某些實施例中，真核宿主細胞為酵母宿主細胞。在某些實施例中，真核宿主細胞為黑色素宿主細胞。

術語"接觸"應意謂使至少兩個部分合在一起。

術語"調節"或"修飾"應用以指增加或減少特定活性、功能或分子之量、品質或作用。作為說明且並無限制，G蛋白偶合受體之促效劑、部分促效劑、反向促效劑及拮抗劑為受體之調節劑。

術語"小分子"應用以意謂具有小於約10,000公克/莫耳之分子量的化合物，包括肽、肽模擬物、胺基酸、胺基酸類似物、聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、有機化合物或無機化合物(亦即，包括雜合有機化合物或有機金屬化合物)，及其鹽、酯或其他醫藥學上可接受之形式。在某些實施例中，小分子為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物。在某些實施例中，小分子為具有小於約1,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物。在某些實施例中，小分子為具有小於約800公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物。在某些實施例中，小分子為具有小於約600公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物。在某些實施例中，小分子為具有小於約500公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物。

本文中所使用之胺基酸縮寫在表B中列出：

術語"多肽"應指胺基酸之聚合物而無需慮及聚合物之長度。因此，肽、寡肽及蛋白質包括於多肽之定義內。此術語亦不指定或排除多肽之表現後修飾。舉例而言，包括共價連接之糖基、乙醯基、磷酸酯基、脂質基團及其類似基團之多肽顯然由術語多肽所涵蓋。

術語"聚核苷酸"應指一種以上呈單鏈或雙鏈形式之核苷酸之RNA、DNA或RNA/DNA雜交序列。本發明之聚核苷酸可由包括合成、重組、離體產生或其組合之任何已知方法以及利用此項技術中已知之任何純化方法來製備。

術語"抗體"在本文中意欲涵蓋單株抗體及多株抗體。

術語"第二訊息"應意謂由於受體活化而產生之細胞內回應。第二訊息可包括(例如)1,4,5－三磷酸肌醇酯(IP₃ )、二醯基甘油(DAG)、環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶－1(MEKK1)活性及Ca^2＋。第二訊息可經量測用於測定受體活性。

術語"受體功能"應指受體接受刺激及緩和細胞內作用之正常操作，其包括(但不限於)：調節基因轉錄、調節離子流入或流出、實現催化反應及/或經由G蛋白調節活性(諸如引起第二訊息回應)。

與術語"回應"或"受體功能"相關之術語"刺激"應意謂與無化合物存在之情況下相反，在有化合物存在之情況下回應或受體功能增加。

與術語"回應"或"受體功能"相關之術語"抑制"應意謂與無化合物存在之情況下相反，在有化合物存在之情況下回應或受體功能減少或受阻。

術語"化合物功效"應意謂與受體結合親和性相反，化合物抑制或刺激受體功能之能力的量測。

在本文中可與"候選化合物"互換使用之術語"測試化合物"應意謂受篩選技術檢驗之分子(例如但並不限於化學化合物)。

與G蛋白偶合受體相關之術語"組成性活性"應意謂G蛋白偶合受體顯示促效劑非依賴性活性。

與短語"測試化合物"相關之術語"直接鑑定"或"經直接鑑定"應意謂在無G蛋白偶合受體之已知配位體(例如已知促效劑)存在的情況下篩選針對G蛋白偶合受體之化合物。

當提供值之範圍時，應瞭解，除非內容清楚指出，否則在彼範圍之上限與下限之間的每一居中值至下限十分之一及在彼規定範圍內之規定值或居中值涵蓋於本發明中。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，且亦涵蓋於本發明中，以規定範圍內之任何經特定排除之界限為條件。當規定範圍包括界限之一或兩者時，排除彼等所包括之界限之任一者或兩者的範圍亦包括於本發明中。

A.引言

以下部分之次序為達成表觀功效而陳述，且並不意欲亦不應視作限制本揭示案或以下申請專利範圍。

B.受體表現 1.所關注之GPCR多肽

本發明之GPCR可包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：2之胺基酸1－335；(b)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335；(c)SEQ ID NO：2之胺基酸2－335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(d)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸可由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(e)由聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體之胺基酸序列，該聚核苷酸在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交；(f)SEQ ID NO：2之變異體；(g)當選自由以下各胺基酸序列組成之群時(f)之胺基酸序列：(i)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；及(ii)包含SEQ ID NO：2之至少20個相連胺基酸的G蛋白偶合受體之胺基酸序列；(h)具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式的胺基酸序列；及(i)(a)至(h)中之任一者之生物學活性片段。

在某些實施例中，本發明之GPCR包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

在一些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為內源性G蛋白偶合受體。在一些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼且為內源性G蛋白偶合受體之G蛋白偶合受體為哺乳動物G蛋白偶合受體。在一些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼且為內源性G蛋白偶合受體之G蛋白偶合受體為哺乳動物GPR119受體。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為SEQ ID NO：2之等位基因。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體特異性結合化合物1(參見表A，其陳述化合物1之化學結構及化學名稱)。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在一些實施例中，由可由聚合酶鏈反應擴增之聚核苷酸編碼之G蛋白偶合受體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在一些實施例中，人類DNA為基因組DNA。

在一些實施例中，聚合酶鏈反應為反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)。RT－PCR技術為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，人類DNA為來源於表現GPR119之組織或細胞型的人類cDNA。在一些實施例中，表現GPR119之人類組織為胰腺或胰島。在某些實施例中，cDNA來自表現GPR119之人類細胞類型。在一些實施例中，cDNA來自胰腺β細胞株。在一些實施例中，本發明之GPCR為重組性的。在一些實施例中，重組性GPCR為重組性人類GPR119。

在一些實施例中，可在本發明方法中使用之GPCR顯示可偵測程度之組成性活性。

在一些實施例中，本發明之GPCR為內源性的。在一些實施例中，本發明之GPCR為哺乳動物GPR119。在一些實施例中，內源性之本發明之GPCR為哺乳動物GPR119。

作為說明且並無限制，預期N末端甲硫胺酸殘基之缺失提供可在本發明中使用之生物學活性片段。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及特異性結合化合物1之HA抗原決定基標記(來自血球凝集素流感病毒)之肽融合的片段。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記(來自血球凝集素流感病毒)之肽融合的片段，該HA抗原決定基標記特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記之肽融合的片段，該HA抗原決定基標記特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記之肽融合的片段，該HA抗原決定基標記特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記之肽融合的片段，(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為該HA抗原決定基標記之促效劑，其在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在視情況在其N末端與該肽融合之該片段處具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記之肽融合的片段，(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為該HA抗原決定基標記之促效劑，其在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在視情況在其N末端與該肽融合之該片段處具有以下EC₅₀ 值：小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在一些實施例中，本發明之生物學活性片段為視情況在其N末端與包含N末端甲硫胺酸殘基及顯示可偵測程度之組成性活性之HA抗原決定基標記之肽融合的片段。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。在某些實施例中，該片段在其N末端與基本上由N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記組成之肽融合。使包含N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記或基本上由N末端甲硫胺酸殘基及HA抗原決定基標記組成之肽與多肽片段之N末端融合的技術在此項技術中已為熟知且市售可得(例如Clontech,Mountain View,CA)。

預期SEQ ID NO：2之人類GPR119之等位基因變異體在本發明之範疇內。預期人類GPR119在本發明之範疇內。

預期SEQ ID NO：2之人類GPR119之脊椎動物直系同源基因之變異體在本發明之範疇內。預期SEQ ID NO：2之人類GPR119之哺乳動物直系同源基因之變異體在本發明之範疇內。作為說明且並無限制，預期小鼠GPR119(例如GenBank寄存編號AY288423)、大鼠GPR119(GenBank寄存編號AAN95195)、倉鼠GPR119、狗GPR119及非人類靈長類動物GPR119在本發明之範疇內。

在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為GPCR。

預期與SEQ ID NO：2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之SEQ ID NO：2之變異體在本發明之範疇內。在某些實施例中，與SEQ ID NO：2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之SEQ ID NO：2之變異體為GPCR。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為內源性GPCR。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為非內源性GPCR。在一些實施例中，為內源性GPCR之SEQ ID NO：2之變異體為哺乳動物GPCR。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合化合物1。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。一致性百分數可習知使用已知電腦程式來確定。

在某些實施例中，可在本發明方法中使用之變異GPCR具有與SEQ ID NO：2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之胺基酸序列。與SEQ ID NO：2具有(例如)95%"一致性"之變異GPCR意謂變異體之胺基酸序列除SEQ ID NO：2之每100個胺基酸可包括至多五個胺基酸變更以外與SEQ ID NO：2之胺基酸1－335相同。因此，為獲得(例如)與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列，與SEQ ID NO：2之胺基酸1－335相比，序列中至多5%(100個中之5個)胺基酸殘基可插入、缺失或經另一胺基酸取代。此等變更可在胺基或羧基末端或在彼等末端位置之間的任何地方發生，該等變更從屬地散佈於序列中之殘基之間或散佈於序列內之一或多個相連基團中。

在某些實施例中，可在本發明方法中使用之變異G蛋白偶合受體為具有來源於SEQ ID NO：2由一或多個胺基酸缺失、取代及/或添加而產生之胺基酸序列的G蛋白偶合受體。在某些實施例中，可在本發明方法中使用之變異G蛋白偶合受體為具有來源於SEQ ID NO：2由SEQ ID NO：2之胺基酸序列中不多於10個保守性胺基酸取代及/或不多於3個非保守性胺基酸取代所產生之胺基酸序列的G蛋白偶合受體。在某些實施例中，精胺酸、離胺酸及組胺酸可保守性地互相取代；麩胺酸及天冬胺酸可保守性地互相取代；麩醯胺酸及天冬醯胺酸可保守性地互相取代；白胺酸、異白胺酸及纈胺酸可保守性地互相取代；苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸可保守性地互相取代；且甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甲硫胺酸可保守性地互相取代。胺基酸取代、胺基酸缺失及胺基酸添加可在任何位置處(例如C末端或N末端，或在內部位置處)。在一些實施例中，變異體為內源性G蛋白偶合受體。在一些實施例中，變異體為內源性脊椎動物G蛋白偶合受體。在一些實施例中，變異體為內源性哺乳動物G蛋白偶合受體。在一些實施例中，變異體為內源性人類G蛋白偶合受體。在一些實施例中，變異體為非內源性G蛋白偶合受體。在一些實施例中，變異體限制可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。在某些實施例中，該具有來源於SEQ ID NO：2之胺基酸序列之G蛋白偶合受體為化合物1為其配位體之G蛋白偶合受體。在某些實施例中，該具有來源於SEQ ID NO：2之胺基酸序列之G蛋白偶合受體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其配位體之G蛋白偶合受體，該配位體在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，該具有來源於SEQ ID NO：2之胺基酸序列之G蛋白偶合受體為化合物1為其促效劑之G蛋白偶合受體。在某些實施例中，該具有來源於SEQ ID NO：2之胺基酸序列之G蛋白偶合受體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之G蛋白偶合受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。

預期為包含SEQ ID NO：2之至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少75個或至少100個相連胺基酸之G蛋白偶合受體的SEQ ID NO：2之變異體在本文中範疇內。在某些實施例中，包含SEQ ID NO：2之至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少75個或至少100個相連胺基酸之SEQ ID NO：2之變異體為GPCR。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為內源性GPCR。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為非內源性GPCR。在一些實施例中，為內源性GPCR之SEQ ID NO：2之變異體為哺乳動物GPCR。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合化合物1。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在一些實施例中，SEQ ID NO：2之變異體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。在一些實施例中，包含SEQ ID NO：2之至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少75個或至少100個相連胺基酸之G蛋白偶合受體顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在一些實施例中，可在本發明方法中使用之變異GPCR為由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR。在一些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為內源性GPCR。在一些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為非內源性GPCR。在一些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼且為內源性GPCR之GPCR為哺乳動物內源性GPCR。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2之等位基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為SEQ ID NO：2之直系同源基因。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR特異性結合化合物1。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR特異性結合(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約50 μM、小於約25 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR特異性結合在根據下文實例12之受體結合檢定中具有以下IC₅₀ 值之(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺：小於約10 μM、小於約5 μM、小於約1 μM、小於約500 nM、小於約100 nM或小於約50 nM。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約5 μM、小於約1 μM、小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在某些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR為(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺為其促效劑之受體，該促效劑在根據下文實例8之全細胞腺苷酸環化酶檢定中在該受體處具有以下EC₅₀ 值：小於約100 nM、小於約50 nM、小於約25 nM、小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM。在一些實施例中，由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之補體雜交的聚核苷酸編碼之GPCR顯示可偵測程度之組成性活性。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。雜交技術為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，嚴格雜交條件(例如高度嚴格條件)包括在42℃下在包含以下各物之溶液中培養隔夜：50%甲醯胺、5×SSC(1×SSC＝150 mM NaCl、15 mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml經變性剪切之鮭魚精子DNA；接著在約65℃下在0.1×SSC中洗滌過濾物。在一些實施例中，嚴格雜交條件(例如高度嚴格條件)包括在42℃下在包含以下各物之溶液中培養隔夜：50%甲醯胺、5×SSC(1×SSC＝150 mM NaCl、15 mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml經變性剪切之鮭魚精子DNA；接著在約50℃下、在約55℃下、在約60℃下或在約65℃下在0.1×SSC/0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)中或在0.2×SSC/0.1% SDS中洗滌。在一些實施例中，該高度嚴格條件包含在65℃下用0.1×SSC洗滌。在一些實施例中，該高度嚴格條件包含在約50℃下、在約55℃下、在約60℃下或在約65℃下用0.1×SSC/0.1% SDS或用0.2×SSC/0.1% SDS洗滌。

在一些實施例中，可在本發明方法中使用之GPCR為包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的非內源性、組成上經活化之受體，其中在SEQ ID NO：2之胺基酸位置224處之白胺酸經除白胺酸外之胺基酸取代。在一些實施例中，除白胺酸外之胺基酸為離胺酸。在一些實施例中，除白胺酸外之胺基酸為丙胺酸。在一些實施例中，除白胺酸外之胺基酸為精胺酸。在一些實施例中，除白胺酸外之胺基酸為組胺酸。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在某些實施例中，本發明之GPCR包含具有SEQ ID NO：2之G蛋白偶合受體之組成性活性型式。在一些實施例中，受體之組成性活性型式為具有SEQ ID NO：2之內源性組成性活性型式。在一些實施例中，受體之組成性活性型式為具有位於SEQ ID NO：2之胺基酸位置224處之突變的非內源性組成性活性型式。在一些實施例中，經突變之殘基已突變成除白胺酸外之殘基。在一些實施例中，經突變之殘基已突變成離胺酸殘基。在一些實施例中，經突變之殘基已突變成丙胺酸殘基。在一些實施例中，經突變之殘基已突變成精胺酸殘基。在一些實施例中，經突變之殘基已突變成組胺酸殘基。在一些實施例中，組成性活性係用於增加細胞內cAMP之含量。在一些實施例中，組成性活性係用於使黑色素細胞經受色素分散。

在某些實施例中，本發明之GPCR與G蛋白形成融合蛋白質之部分。

a.序列一致性 在某些實施例中，一致性百分數係使用基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，"BLAST")來評估，其在此項技術中已為熟知[參見(例如)Karlin及Altschul,Proc Natl Acad Sci USA(1990)87：2264－2268；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215：403－410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3：266－272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)25：3389－3402；其中各者之揭示內容均以引用的方式全部併入本文中]。BLAST程式可以預設參數或以由使用者提供之經修改之參數使用。較佳地，該等參數為預設參數。

在某些實施例中，用於確定查詢序列(例如SEQ ID NO：2之胺基酸序列)與待詢問序列之間的最佳全面匹配(亦稱作全域序列比對)之較佳方法可使用基於Brutlag等人之演算法(Comp App Biosci(1990)6：237－245，其揭示內容係以引用的方式全部併入本文中)的FASTDB電腦程式來確定。在序列比對中，查詢序列與詢問序列均為胺基酸序列。該全域序列比對之結果為一致性百分數。在FASTDB胺基酸比對中所使用之較佳參數為：矩陣＝PAM 0，k元組＝2，錯配處罰＝1，連接處罰＝20，隨機化組＝25，長度＝0，截止分數＝1，窗口尺寸＝序列長度，空隙處罰＝5，空隙尺寸處罰＝0.05，窗口尺寸＝247或詢問胺基酸序列之長度，無論哪一者較短。

若詢問序列係由於N末端或C末端缺失，並非由於內部缺失而比查詢序列短時，則一致性百分數之結果須手動校正，此係由於FASTDB程式在計算全域一致性百分數時並不說明經查詢序列之N末端或C末端截斷。對於相對於查詢序列在N末端及C末端處截斷之詢問序列，一致性百分數係藉由將並不與相應詢問序列殘基匹配/對準、為詢問序列之N末端及C末端的查詢序列之殘基數計算查詢序列之總鹼基百分數來校正。殘基是否匹配/對準係由FASTDB序列比對之結果來確定。接著將此百分數自一致性百分數減去，由上述FASTDB程式使用指定參數來計算以得出最終一致性百分數計分。此最終一致性百分數計分為用於達成本發明目的之計分。為達成手動調整一致性百分數計分之目的，僅考慮並不與查詢序列匹配/對準之詢問序列之N末端及C末端之殘基。亦即，僅詢問序列之最遠N末端及C末端殘基以外之查詢胺基酸殘基。

舉例而言，90個胺基酸殘基之詢問序列與100個殘基查詢序列對準以確定一致性百分數。缺失發生在詢問序列之N末端處，且由此FASTDB比對並不與N末端處之第一殘基匹配/對準。10個不成對殘基相當於序列之10%(在N末端及C末端處不匹配之殘基數/查詢序列中之殘基總數)，因此自由FASTDB程式計算之一致性百分數計分減去10%。若剩餘90個殘基完全匹配，則最終一致性百分數將為90%。

在另一實例中，將90個殘基詢問序列與100個殘基查詢序列比較。此時缺失處於內部，因此在詢問序列之N末端或C末端不存在與查詢序列不匹配/不對準之殘基。在此狀況下，不手動校正由FASTDB計算之一致性百分數。再次，手動校正如FASTDB比對所顯示與查詢序列不匹配/不對準、僅在本發明序列之N末端及C末端外部之殘基位置。為達成本發明之目的，不進行其他校正。

b.融合蛋白質 在某些實施例中，所關注之多肽為融合蛋白質，且可含有(例如)親和標記域或報導體域。合適之親和標記包括可特異性結合另一部分(通常為另一多肽，最通常為抗體)之任何胺基酸序列。合適之親和標記包括抗原決定基標記，例如此項技術中已知之V5標記、FLAG標記、HA標記(來自血球凝集素流感病毒)、myc標記及其類似標記。合適之親和標記亦包括已知其結合受質之域，例如此項技術中已知之HIS、GST及MBP標記；及可購得其特異性結合搭配物(例如抗體，尤其單株抗體)之來自其他蛋白質之域。合適之親和標記亦包括任何蛋白質－蛋白質相互作用域，諸如IgG Fc區，其可特異性結合合適之結合搭配物(例如IgG Fc受體)且可使用該結合搭配物來偵測。顯然預期該融合蛋白質可含有與GPCR同框融合之異源性N末端域(例如抗原決定基標記)，該GPCR之N末端甲硫胺酸殘基已缺失或經替代性胺基酸取代。

合適之報導體域包括可報導多肽存在之任何域。儘管瞭解親和標記可用於使用(例如)特異性結合標記之經標記之抗體來報導多肽的存在，但更常使用發光報導體域。合適之發光報導體域包括螢光素酶(來自(例如)螢火蟲、彎喉螢(Vargula)、海三色堇(Renilla reniformis)或海洋微藻(Renilla muelleri))或其發光變異體。其他合適之報導體域包括螢光蛋白質(來自(例如)水母、珊瑚及其他腔腸動物，如來自多管水母屬(Aequoria)、海腎屬(Renilla)、海筆屬(Ptilosarcus)、海鰓屬(Stylatula)種之螢光蛋白質)或其發光變異體。此等報導體蛋白之發光變異體在此項技術中極為熟知且與原生報導體蛋白相比可更亮、更暗或具有不同激發及/或發射光譜。舉例而言，一些變異體經改變使得其不再呈現綠色，且可呈現藍色、青色、黃色、增強型黃色、紅色(分別稱作BFP、CFP、YFP、eYFP及RFP)或具有如此項技術中已知之其他發射光譜。其他合適之報導體域包括可經由生物化學或顏色變化報導多肽存在之域，諸如β－半乳糖苷酶、β－葡糖醛酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶及分泌型胚胎鹼性磷酸酶。

亦如此項技術中已知，親和標記或報導體域可存在於所關注之多肽中之任何位置處。然而，在多數實施例中，其可存在於所關注之多肽之C末端或N末端處。

2.編碼所關注之GPCR多肽之核酸

由於用於操縱核酸之遺傳密碼及重組技術為已知的且所關注之GPCR多肽之胺基酸序列如上所述，因此編碼所關注之GPCR多肽之核酸的設計及產生完全處於技工之技術範圍內。在某些實施例中，使用標準重組DNA技術(Ausubel，等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons,1995；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)方法。舉例而言，可使用無須在本文中描述之多種重組方法中之任一者或其組合，自GPCR編碼序列之庫分離GPCR編碼序列。編碼蛋白質之核酸序列中之核苷酸的隨後取代、缺失及/或添加亦可使用標準重組DNA技術來完成。

舉例而言，定位突變及次選殖可用於在編碼所關注之多肽之聚核苷酸中引入/刪去/取代核酸殘基。在其他實施例中，可使用PCR。編碼所關注之多肽之核酸亦可由完全自寡核苷酸之化學合成來製得(例如Cello等人，Science(2002)297：1016－8)。

在一些實施例中，使編碼所關注之多肽之核酸的密碼子最優化以在特定物種(尤其哺乳動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類動物或人類物種)之細胞中表現。在一些實施例中，使編碼所關注之多肽之核酸的密碼子最優化以在特定物種(尤其兩棲動物物種)之細胞中表現。

a.載體 本發明進一步提供包含本發明核酸之載體(亦被稱作"構築體")。在本發明之許多實施例中，在本發明核酸序列已可操作地連接表現控制序列(包括(例如)啟動子)後該等序列將在宿主中表現。本發明核酸亦通常位於表現載體中，該表現載體可以離合染色小體形式或以宿主染色體DNA之整合部分的形式在宿主細胞中複製。通常，表現載體將含有選擇標記(例如四環素或新黴素)以允許偵測到用所要DNA序列轉型之彼等細胞(參見(例如)美國專利第4,704,362號，其係以引用的方式併入本文中)。包括單表現卡匣載體及雙表現卡匣載體之載體在此項技術中已為熟知(Ausubel，等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons,1995；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。合適之載體包括病毒載體、質體、黏質體、人工染色體(人類人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體等)、微型染色體及其類似物。可使用反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒載體。

為達成在細胞中產生所關注之多肽的目的，多種表現載體可為熟習此項技術者所用且包括市售表現載體(例如，來自Invitrogen,Carlsbad,CA；Clontech,Mountain View,CA；Stratagene,La Jolla,CA)。以非限制性實例說明，市售表現載體包括基於CMV啟動子之載體。一合適之表現載體為pCMV。表現載體可為腺病毒。例示性腺病毒載體可以AdEasyTM購自Qbiogene(Carlsbad,CA)(He TC等人，Proc Natl Acad Sci USA(1998)95：2509－2514；及美國專利第5,922,576號，其中各者之揭示內容均以引用的方式全部併入本文中)。其他合適之表現載體對一般技術者為顯而易見的。

本發明核酸通常包含編碼所關注之本發明多肽之單一開放閱讀框架，然而，在某些實施例中，由於用於所關注之多肽表現之宿主細胞可為真核細胞(例如哺乳動物細胞，諸如人類細胞)，因此開放閱讀框架可由內含子中斷。本發明核酸通常為轉錄單位之部分，該轉錄單位除本發明核酸以外可含有3'及5'未轉譯區(UTR)，該等未轉譯區可引導RNA穩定性、轉譯效率等。本發明核酸亦可為表現卡匣之部分，該表現卡匣除本發明核酸以外含有引導所關注之多肽轉錄及表現的啟動子及轉錄終止子。

真核啟動子可為在真核宿主細胞中具功能性之任何啟動子，包括病毒啟動子及來源於真核基因之啟動子。例示性真核啟動子包括(但不限於)以下啟動子：小鼠金屬硫蛋白I基因序列之啟動子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.1：273－288,1982)；疱疹病毒之TK啟動子(McKnight,Cell 31：355－365,1982)；SV40早期啟動子(Benoist等人，Nature(London)290：304－310,1981)；酵母gall基因序列啟動子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971－6975,1982；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951－59SS,1984)；CMV啟動子；EF－1啟動子；蛻皮激素反應性啟動子；四環素反應性啟動子；及其類似啟動子。由於病毒啟動子一般為尤其強之啟動子，因此其特別受關注。在某些實施例中，所使用之啟動子為靶病原體之啟動子。在本發明中使用之啟動子經選擇使得其在其所引入之細胞類型(及/或動物)中具功能性。在某些實施例中，啟動子為CMV啟動子。

在某些實施例中，本發明載體亦可提供以表現可選擇標記。合適之載體及可選擇標記在此項技術中已為熟知且論述於Ausubel等人(Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons,1995)及Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，(2001)Cold Spring Harbor,N.Y.)中。多種不同基因已用作可選擇標記，且為方便起見首先選擇在本發明載體中用作可選擇標記之特定基因。已知之可選擇標記包括：胸苷激酶基因、二氫葉酸還原酶基因、黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因、CAD、腺苷脫胺酶基因、天冬醯胺酸合成酶基因、抗生素抗性基因(例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(胺基糖苷磷酸轉移酶基因))、潮黴素B磷酸轉移酶基因及其類似基因。

如上文所提及，所關注之多肽可為含有親和域及/或報導體域之融合蛋白質。用於(例如)在GPCR之C末端或N末端處產生報導體或標記與GPCR之間的融合之方法完全處於熟習此項技術者之技術範圍內(例如McLean等人，Mol.Pharma.Mol Pharmacol.1999 56：1182－91；Ramsay等人，Br.J.Pharmacology,2001,315－323)且將不再進一步描述。顯然預期該融合蛋白質可含有與GPCR同框融合之異源性N末端域(例如抗原決定基標記)，該GPCR之N末端甲硫胺酸殘基已缺失或經替代性胺基酸取代。應瞭解，所關注之多肽可首先自原生多肽製得且接著可操作地連接如上所述之合適之報導體/標記。

本發明核酸亦可含有限制性位點、多選殖位點、引子結合位點、可連接端、重組位點等，通常以有利於建構編碼所關注之多肽之核酸。

b.宿主細胞 本發明進一步提供包含載體之宿主細胞，該載體包含本發明核酸。合適之宿主細胞包括原核細胞，例如細菌細胞(例如大腸桿菌(E.coli)；以及真核細胞，例如動物細胞(例如昆蟲、哺乳動物、魚、兩棲動物、鳥或爬行動物細胞)、植物細胞(例如玉米或芥菜(Arabidopsis)細胞)或真菌細胞(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞)。在某些實施例中，適合於表現編碼所關注之多肽之核酸的任何細胞可用作宿主細胞。通常使用動物宿主細胞株，其實例如下：猴腎細胞(COS細胞)、由SV40轉型之猴腎CVI細胞(COS－7,ATCC CRL 165 1)；人類胚胎腎細胞(HEK－293["293"]，Graham等人J.Gen Virol.36：59(1977))；HEK－293T["293T"]細胞；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞(CHO，Urlaub及Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216,(1980))；敍利亞(Syrian)金倉鼠細胞MCB3901(ATCC CRL－9595)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.23：243－251(1980))；猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76,ATCC CRL－1587)；人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44－68(1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL－1658)；及小鼠L細胞(ATCC CCL－1)。

在某些實施例中，使用黑色素細胞。黑色素細胞為低等脊椎動物中所見之皮膚細胞。相關物質及方法將遵循美國專利第5,462,856號及美國專利第6,051,386號之揭示內容。此等專利揭示內容係以引用的方式全部併入本文中。

其他細胞株對一般技術者而言將變得顯而易見，且多種細胞株可購自美國典型培養物保藏中心(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209)。

C.篩選候選化合物 1.通用GPCR篩選檢定技術

當G蛋白受體變得有活性時，其結合G蛋白(例如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)且刺激GTP與G蛋白之結合。接著G蛋白充當GTPase且使GTP緩慢水解成GDP，藉以在正常條件下受體變成失活。然而，經活化之受體繼續使GDP變成GTP。GTP之不可水解類似物，[³⁵ S]GTPγS可用於監控與表現經活化受體之膜的結合增強。據報導[³⁵ S]GTPγS可用於監控在有或無配位體存在之情況下與膜偶合之G蛋白。除眾所熟知且可為熟習此項技術者所用之實例以外，此監控之一實例由Traynor及Nahorski於1995年報導。此檢定系統之一較佳用途為用於初始篩選候選化合物，此係由於該系統一般適用於所有G蛋白偶合受體，不考慮與受體之胞內域相互作用之特定G蛋白。

2.特異性GPCR篩選檢定技術

一旦使用"通用"G蛋白偶合受體檢定(亦即選擇為促效劑或反向促效劑之化合物之檢定)鑑定候選化合物，在一些實施例中進一步篩選以確認在受體位點處已相互作用之化合物為較佳。舉例而言，由"通用"檢定所鑑定之化合物可能不結合受體，但可替代地僅使G蛋白自胞內域"去偶合"。

a. Gs、Gz及Gi Gs刺激酶腺苷酸環化酶。另一方面，Gi(及Gz及Go)抑制腺苷酸環化酶。腺苷酸環化酶催化ATP轉化成cAMP；由此，與Gs蛋白偶合之經活化之GPCR與cAMP之細胞含量增加相關。另一方面，偶合Gi(或Gz、Go)之經活化之GPCR與cAMP之細胞含量下降相關。一般參見"Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission,"Chpt.8,From Neuron To Brain (第3版)Nichols,J.G.等人編Sinauer Associates,Inc.(1992)。因此，偵測cAMP之檢定可用於判定候選化合物是否為(例如)受體之反向促效劑(亦即，該化合物會降低cAMP含量)。可利用用於量測cAMP之此項技術中已知之多種方法；在一些實施例中，一較佳方法依賴於使用呈基於ELISA格式之抗－cAMP抗體。可利用之另一類型之檢定為全細胞第二訊息報導體系統檢定。基因上之啟動子驅動特定基因編碼之蛋白質表現。環狀AMP藉由促進cAMP反應性DNA結合蛋白或轉錄因子(CREB)之結合來驅動基因表現，該結合蛋白或轉錄因子接著在稱作cAMP反應元件之特定位點處結合啟動子且驅動基因表現。可建構報導體系統，其在報導體基因(例如β－半乳糖苷酶或螢光素酶)之前具有含有多個cAMP反應元件之啟動子。因此，經活化之Gs連接之受體使cAMP積聚，其接著活化基因及報導體蛋白表現。可接著使用標準生物化學檢定(chen等人1995)偵測諸如β－半乳糖苷酶或螢光素酶之報導體蛋白。

b. Go及Gq Gq及Go與酶磷脂酶C之活化相關，其繼而使磷脂PIP₂ 水解，釋放兩個細胞內訊息：二醯基甘油(DAG)及1,4,5－三磷酸肌醇酯(IP₃ )。IP₃ 積聚增加與Gq及Go相關之受體的活化相關。一般參見"Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission,"Chpt.8,From Neuron To Brain (第3版)Nichols,J.G.等人編Sinauer Associates,Inc.(1992)。偵測IP₃ 積聚之檢定可用於判定候選化合物是否為Gq或Go相關之受體的反向促效劑(亦即，該化合物會降低IP₃ 含量)。Gq相關之受體亦可使用AP1報導體檢定來檢測，其中Gq依賴性磷脂酶C使含有AP1元件之基因活化；因此，經活化之Gq相關之受體將顯示該等基因之表現增加，藉以其反向促效劑將顯示該表現下降，且促效劑將顯示該表現增加。用於該偵測之市售檢定為可用的。

3. GPCR融合蛋白質 內源性、組成性活性GPCR或非內源性、組成上經活化之GPCR用於篩選候選化合物以直接鑑定反向促效劑或促效劑之用途提供令人關注之篩選前景，其中根據定義，受體甚至在無結合其之內源性配位體存在的情況下有活性。因此，為區分(例如)有候選化合物存在之情況下非內源性受體與無彼化合物存在之情況下非內源性受體，其中該區分之目的在於瞭解該化合物是否可為反向促效劑或促效劑或對該受體無影響，在一些實施例中較佳為利用可增強該區分之方法。在一些實施例中，一較佳方法為使用GPCR融合蛋白質。

一般而言，一旦使用上述檢定技術(以及熟習此項技術者已知之其他技術)確定非內源性GPCR已組成上經活化，即可能確定與內源性GPCR偶合之主要G蛋白。G蛋白與GPCR之偶合提供可分析之信號轉導路徑。在一些實施例中，較佳為篩選使用哺乳動物或黑色素細胞表現系統來進行，此係由於將預期該系統其中具有內源性G蛋白。因此，根據定義，在該系統中，非內源性、組成上經活化之GPCR將連續發信號。在一些實施例中，較佳為增強此信號使得在(例如)受體之反向促效劑存在下更有希望地將能夠更易於(尤其)在篩選之情形下當受體與反向促效劑接觸時區分受體。

GPCR融合蛋白質意欲增強與GPCR偶合之G蛋白之功效。GPCR融合蛋白質對於使用內源性、組成性活性GPCR或非內源性、組成上經活化之GPCR的篩選而言可為較佳的，此係由於該方法使在該等篩選技術中產生之信號增加。此在促進顯著"信雜"比方面為重要的；該顯著比率對於如本文中所揭示之候選化合物的篩選而言為較佳。

建構可用於表現GPCR融合蛋白質之構築體係在一般技術者之範圍內。市售表現載體及系統提供可符合研究者之特定需要之多種方法。建構該GPCR融合蛋白質構築體之重要準則包括(但不限於)GPCR序列與G蛋白序列同框(較佳地，內源性GPCR之序列在G蛋白序列之上游)，且GPCE之"終止"密碼子缺失或經置換使得在GPCR表現後G蛋白亦可表現。GPCR可直接連接G蛋白，或在兩者之間可存在間隔殘基(儘管此數目可易於由一般技術者確定，但較佳不大於約12個)。為方便起見，較佳使用間隔基。在一些實施例中，較佳為將在產生GPCR融合蛋白質構築體之前已鑑定與非內源性GPCR偶合之G蛋白。

如上所述，預期與Gi、Gz及Go偶合之經活化之GPCR抑制cAMP形成，使基於此等類型之GPCR的檢定有前景(亦即，活化後cAMP信號減少，由此使直接鑑定促效劑(其會進一步減少此信號)有前景)。如將在本文中所揭示，已確定對於此等類型之受體而言，在致力於建立基於環化酶之可行檢定中，可能產生並不基於GPCR之內源性G蛋白的GPCR融合蛋白質。因此，舉例而言，內源性Gi偶合受體可與Gs蛋白融合－該融合構築體在表現後"驅動"或"促使"內源性GPCR與(例如)Gs而非"天然"Gi蛋白偶合，使得可建立基於環化酶之檢定。因此，對於Gi、Gz及Go偶合之受體而言，在一些實施例中較佳為當使用GPCR融合蛋白質且檢定係基於偵測腺苷酸環化酶活性時，融合構築體用Gs(或刺激酶腺苷酸環化酶形成之等效G蛋白)來建立。

利用與Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合之Gq蛋白的G蛋白融合構築體同樣有效。在一些實施例中，較佳融合構築體可用Gq蛋白來達成，其中G蛋白α－次單位("Gαq")之開始六(6)個胺基酸缺失且在Gαq之C末端處之最後五(5)個胺基酸經所關注之G蛋白的Gα之相應胺基酸置換。舉例而言，融合構築體可具有與Gi蛋白融合之Gq(6個胺基酸缺失)，產生"Gq/Gi融合構築體"。此融合構築體將促使內源性Gi偶合受體與其非內源性G蛋白(Gq)偶合，使得可替代cAMP產生來量測第二訊息，例如三磷酸肌醇酯或二醯基甘油。

4.靶Gi偶合GPCR與信號強化子Gs偶合GPCR之共轉染(基於cAMP之檢定)

已知Gi偶合受體抑制腺苷酸環化酶且由此減少cAMP產生量，其可使cAMP含量之分析有前景。在某些實施例中，量測cAMP產生之減少作為主要偶合活化後Gi之受體活化之指示的有效技術可藉由使例如主要偶合活化後Gs(例如TSHR－A623I，見下文)之非內源性、組成上經活化之受體的信號強化子與Gi連接之GPCR共轉染來達成。顯而易見，Gs偶合受體活化可基於cAMP產生之增加來確定。Gi偶合受體活化使cAMP產生減少。因此，共轉染方法意欲有利地利用此等"相反"影響。舉例而言，非內源性、組成上經活化之Gs偶合受體("信號強化子")與單獨表現載體共轉染提供基線cAMP信號(亦即，儘管Gi偶合受體將減少cAMP含量，此"減少"將與由組成上經活化之Gs偶合信號強化子所建立之cAMP含量的實質增加相當)。藉由接著使信號強化子與"靶受體"共轉染，Gi偶合靶受體之反向促效劑將增加所量測之cAMP信號，而Gi偶合靶受體之促效劑將減少此信號。

使用此方法直接鑑定之候選化合物應獨立地加以分析以確保此等候選化合物並不靶向信號強化受體(此可在針對經共轉染之受體篩選之前或之後進行)。

組合物/調配物及治療方法

GPR119促效劑可調配成用於根據本發明使用此項技術中熟知之技術來使用之醫藥組合物及藥劑。適當之調配物視所選擇之投藥途徑而定。在某些實施例中，該投藥係針對非人類脊椎動物或對非人類哺乳動物。

如與本發明之療法有關，亦即與GPR119促效劑之療法有關，本發明之組合物可以任何合適之方式來投與。合適之投藥途徑包括使用此項技術中已知之方法經口、經鼻、經直腸、經黏膜、經皮或腸內投藥；非經腸傳遞，包括肌肉內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、肺內(吸入式)或眼內注射。其他合適之投藥途徑為氣溶膠及儲槽式調配物。顯然涵蓋本發明之藥劑之持續釋放調配物、尤其儲槽式調配物。在某些較佳實施例中，本發明之化合物經口投與。本發明之化合物可以固體或液體形式製成，諸如錠劑、膠囊、散劑、糖漿、酏劑及其類似物、氣溶膠、無菌溶液、懸浮液或乳液，及其類似物、在某些實施例中，GPR119促效劑經口投與。

用於經口投與之調配物除固體錠劑及膠囊調配物以外可呈水性溶液及懸浮液之形式。水性溶液及懸浮液可自無菌散劑或顆粒來製備。可將化合物溶解於水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化鈉及/或各種緩衝液中。其他佐劑在此項技術中熟知及廣泛已知。

GPR119促效劑之醫藥組合物可由此項技術中熟知之方法來製備，例如藉助於習知混合、溶解、粒化、製成糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、陷入、凍乾法或噴霧乾燥。

用於根據本發明使用之醫藥組合物可以習知方式使用一或多種包含賦形劑及助劑之生理學上可接受之載劑來調配，該等賦形劑及助劑有利於使活性化合物加工成可在醫藥學上使用之製劑。合適之醫藥學上可接受之載劑可為熟習此項技術者所用(參見(例如)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,(Gennaro等人，編)，第20版，2000,Lippincott Williams & Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(Rowe等人，編)，第4版，2003,Pharmaceutical Press；其各者之揭示內容均以引用的方式全部併入本文中)。適當之調配物視所選擇之投藥途徑而定。術語"載劑"物質或"賦形劑"物質在本文中意謂本身並非治療劑之任何物質，其用作載劑及/或稀釋劑及/或佐劑或媒劑以將治療劑傳遞至受檢者或添加至醫藥組合物中以改良其處理或儲存特性或允許或有利於組合物之劑量單位形成適合於經口投與之諸如膠囊或錠劑的離散物品。作為說明且並無限制，賦形劑可包括：稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、助流劑、經添加以遮蔽或中和不合意之口味或氣味的物質、香料、染料、芳香劑及經添加以改良組合物外觀之物質。可接受之賦形劑包括：硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠(acacia gum)、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質(諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷酯)、低熔點蠟、可可脂或散劑、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其他醫藥學上可接受之物質。醫藥組合物之組份可經囊封或壓片以便於投藥。

醫藥學上可接受係指就藥理學/毒物學觀點而言對患者可接受且就關於組合物、調配物、穩定性、患者接受性及生物可用性之物理/化學觀點而言對製造醫藥化學品可接受之彼等特性及/或物質。

糖衣藥丸核心具備合適之塗層。為達成此目的，可使用經濃縮之糖溶液，其可視情況含有阿拉伯膠(gum Arabic)、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯酸凝膠、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆液及合適之有機溶劑或溶劑混合物。可將染料或顏料添加至錠劑或糖衣藥丸塗層中以用於鑑定或表徵活性化合物劑量之不同組合。

可經口使用之醫藥組合物包括由明膠製成之配合插入膠囊，以及由明膠及增塑劑(諸如甘油或山梨糖醇)製成之軟密封明膠。配合插入膠囊可含有與填充劑(諸如乳糖)、黏合劑(諸如澱粉)及/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及視情況穩定劑混雜之活性成份。在軟膠囊中，可將活性化合物溶解或懸浮於諸如脂肪油、液體石蠟、液體聚乙二醇、十六醇聚氧乙烯醚、蒙克汀(capmul)、介質或長鏈甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯之合適之液體中。亦可將穩定劑添加至此等調配物中。

另外，可使用持續釋放系統傳遞GPR119促效劑。各種持續釋放物質已經確立且為熟習此項技術者所熟知。持續釋放錠劑或膠囊尤其較佳。舉例而言，可使用諸如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯之延時物質。劑型亦可由美國專利第4,256,108號、第4,166,452號及第4,265,874號所述之技術來塗佈以形成用於受控釋放之滲透性治療用錠劑。

顯然預期本發明之治療劑，亦即與GPR19促效劑有關之治療劑可單獨或以與其他醫藥學上或生理學上可接受之化合物組合來投與或提供。在本發明之一態樣中，其他醫藥學上或生理學上可接受之化合物不為GPR119促效劑。在本發明之一態樣中，其他醫藥學上或生理學上可接受之化合物係選自由以下各物組成之群的醫藥劑：鈣、維生素D、雌激素、替勃龍(tibolone)、選擇性雌激素受體調節劑(SERM，例如雷諾昔酚(raloxifene)、他莫西芬(tamoxifen))、雙膦酸鹽(例如依替膦酸鹽(etidronate)、阿侖膦酸鹽(alendronate)、利塞膦酸鹽(risedronate))、降血鈣素、維生素D之1α－羥基化代謝物、氟化物、噻嗪、同化類固醇、依普黃酮(ipriflavone)、維生素K、甲狀旁腺激素(PTH)、鍶、士他汀(statin)、骨保護素、EP4受體選擇性促效劑、大麻素受體2型(CB2)選擇性促效劑及p38 MAP激酶抑制劑。(參見(例如)World Health Organization Technical Report Series 921(2003),Prevention and Management of Osteoporosis。)

在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑或基本上由其組成的組合物。在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑及至少一種醫藥學上可接受之載劑或基本上由其組成的醫藥組合物。

在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑或基本上由其組成的組合物。在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑及至少一種醫藥學上可接受之載劑或基本上由其組成的醫藥組合物。本發明亦係關於組合物之劑型或醫藥組合物之劑型，其中GPR119促效劑之量足以提供治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)及/或增加個體骨質量之作用。

在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑或基本上由其組成的組合物。在一態樣中，本發明係關於一種包含一定量之本發明之GPR119促效劑及至少一種醫藥學上可接受之載劑或基本上由其組成的醫藥組合物。本發明亦係關於組合物之劑型或醫藥組合物之劑型，其中GPR119促效劑之量足以提供增加個體GIP含量之作用。

適合於在本發明中使用之醫藥組合物包括其中含有達成其所欲目的之量的活性成份之組合物。在一些實施例中，應瞭解，本發明之醫藥組合物可用於治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)或可用於增加個體骨質量。特徵為低骨質量之病狀係根據本發明。在一些實施例中，應瞭解，本發明之醫藥組合物可用於增加個體GIP含量。如與本發明有關，足以達成本發明之所欲目的之GPR119促效劑之量的確定(尤其)根據本文中所提供之詳細揭示內容而完全在熟習此項技術者之能力範圍內。

自包括(但不限於)使用小鼠、大鼠、兔、豬及非人類靈長類動物之研究的動物研究所獲得之資料可用於調配用於人類之劑量範圍。一般而言，熟習此項技術者應瞭解如何將動物模型系統中所獲得之活體內資料外推至另一者(諸如人類)。在一些情況下，此等外推可僅基於動物模型與另一者(諸如人類)相比之重量；在其他情況下，此等外推並不簡單基於重量而是將多種因素合併。代表性因素包括患者之類型、年齡、重量、性別、飲食及醫學病況；疾病嚴重性；投藥途徑；藥理學研究，諸如所使用之特定化合物之活性、功效、藥物動力學及毒物學概況；是否利用藥物傳遞系統；是否治療急性或慢性疾病病況抑或進行預防；或是否除本發明之化合物以外及作為藥物組合之部分投與其他活性化合物。用於使用本發明之化合物及/或組合物治療疾病病狀之給藥方案係根據如上所列之多種因素來選擇。因此，所使用之實際給藥方案可廣泛變化且由此可能偏離較佳給藥方案，且熟習此項技術者應瞭解，此等典型範圍以外之劑量及給藥方案可經測試且適當時可用於本發明之方法中。

例示性動物模型系統為大鼠卵巢切除(OVX)骨質流失模型。卵巢切除大鼠為正確模擬雌激素缺乏之人類骨骼之重要臨床特徵及治療劑之反應的極佳臨床前動物模型。在此模型中，當部分或完全預防與卵巢切除相關之骨質流失時達成治療功效。(參見(例如)Bollag等人，Mol Cell Endocrinol(2001)177：35－41；及Jee等人，J Musculoskel Neuron Interact(2001)1：193－207。)在某些實施例中，當至少約10%預防、至少約20%預防、至少約30%預防、至少約40%預防、至少約50%預防、至少約60%預防、至少約70%預防、至少約75%預防、至少約80%預防、至少約85%預防、至少約90%預防、至少約95%預防或100%預防與卵巢切除相關之骨質流失時達成治療功效。

另一例示性動物模型系統為在小鼠中葡萄糖挑戰後血液GIP含量之增加。在某些實施例中，血液GIP含量為血漿GIP含量。在某些實施例中，GIP含量為葡萄糖非依賴性GIP含量。在某些實施例中，GIP含量為葡萄糖依賴性GIP含量。在某些實施例中，GIP為總GIP。在某些實施例中，使用中心或C末端定點檢定來量測總GIP。在某些實施例中，GIP為生物活性GIP。在某些實施例中，使用N末端特異性檢定來量測生物活性GIP。在某些實施例中，生物活性GIP對促進骨形成具有活性。在某些實施例中，當血液GIP含量增加至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約100%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%或至少約500%時達成治療功效。

可調整劑量及時間間隔以提供所欲之治療作用。應瞭解，本發明之GPR119促效劑之精確劑量將視GPR119、其效能、投藥模式、患者年齡及重量及待治療病狀之嚴重性而改變。精確調配物、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者病狀來選擇。作為說明且並無限制，本發明之GPR119促效劑之量為小於約0.001 mg/kg體重、小於約0.005 mg/kg體重、小於約0.01 mg/kg體重、小於約0.05 mg/kg體重、小於約0.1 mg/kg體重、小於約0.5 mg/kg體重、小於約1 mg/kg體重、小於約5 mg/kg體重、小於約10 mg/kg體重、小於約50 mg/kg體重或小於約100 mg/kg體重。在某些實施例中，本發明之GPR119促效劑之量為小於約0.001－100 mg/kg體重、小於約0.001－50 mg/kg體重、小於約0.001－10 mg/kg體重、小於約0.001－5 mg/kg體重、小於約0.001－1 mg/kg體重、小於約0.001至0.5 mg/kg體重、小於約0.001－0.1 mg/kg體重、小於約0.001－0.05 mg/kg體重、小於約0.001－0.01 mg/kg體重或小於約0.001－0.005 mg/kg體重。

可以每日或定期為基礎來投與以達成所要結果之本發明之調節劑(例如GPR119促效劑)之量的較佳劑量範圍為0.1－100 mg/kg體重。其他較佳劑量範圍為0.1－30 mg/kg體重。其他較佳劑量範圍為0.1－10 mg/kg體重。其他較佳劑量範圍為0.1－3.0 mg/kg體重。當然，此等日劑量可在一日之過程中週期性地以少量傳遞或投與。應注意，此等劑量範圍僅為較佳範圍且並不意欲限制本發明。

可個別調整劑量及時間間隔以提供達成所欲之治療作用的本發明之GPR119促效劑之血漿量。亦可使用對於GPR119促效劑濃度之選定範圍之值來確定給藥時間間隔以達成所欲之治療作用。應使用對於10－90%之時間、較佳30－99%之間的時間及最佳50－90%之間的時間使血漿量維持在GPR119促效劑濃度之選定範圍內之方案來投與GPR119促效劑。在局部投藥或選擇性吸收之狀況下，提供所欲之治療作用的GPR119促效劑濃度之範圍可與血漿濃度無關。

當然，所投與之組合物之量將視所治療之個體、個體重量、病痛嚴重性、投藥方式及處方醫師之判斷而定。

在一態樣中，因此本發明係關於一種治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)或增加骨質量之方法，該方法包含將包含一定量之本發明之GPR119促效劑或基本上由其組成之治療有效量之組合物投予需要其之個體。在某些實施例中，該組合物為醫藥組合物。

在一態樣中，本發明係關於一種治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)或增加骨質量之方法，該方法包含將包含一定量之本發明之GPR119促效劑或基本上由其組成之治療有效量之組合物投予需要其之個體。在一相關態樣中，本發明係關於該方法，其中GPR119促效劑係以足以提供增加個體GIP含量之作用的量來投與。在某些實施例中，該組合物為醫藥組合物。

本發明之療法，亦即與GPR119促效劑有關之療法可用於治療或預防個體之特徵為低骨質量之病狀及增加個體骨質量。

特徵為低骨質量之病狀包括(但不限於)：骨質減少、骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、骨關節炎、牙周病、牙槽骨質流失、截骨術骨質流失、兒童特發性骨質流失、佩吉特氏病、由轉移性癌症所引起之骨質流失、溶骨病變、脊柱彎曲及身高縮短。在某些實施例中，特徵為低骨質量之病狀為骨質疏鬆症。在某些實施例中，特徵為低骨質量之病狀為骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。特徵為低骨質量之病狀亦包括(但不限於)：骨質疏鬆症之長期併發症，諸如脊柱彎曲、身高縮短及修復手術。應瞭解，特徵為低骨質量之病狀可個別或以任何組合包括於實施例中。在某些實施例中，特徵為低骨質量之病狀為原發性骨質疏鬆症。

在某些實施例中，需要增加骨質量之個體具有在年輕成年參考平均值以下大於1(T值<－1)、大於或等於1.5(T值－1.5)、大於或等於2(T值－2)或大於或等於2.5(T值－2.5)之標準差的骨礦密度(BMD)。在某些實施例中，需要增加骨質量之個體有治療骨折之需要。在某些實施例中，需要治療骨折之個體患有創傷性骨折、長期骨折或骨質疏鬆性骨折。在某些實施例中，個體有治療骨病之需要。在某些實施例中，需要治療骨病之個體患有骨質減少、骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、骨關節炎、牙周病、牙槽骨質流失、截骨術骨質流失、兒童特發性骨質流失、佩吉特氏病、由轉移性癌症所引起之骨質流失、溶骨病變、脊柱彎曲或身高縮短。在某些實施例中，需要治療骨病之個體患有骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。可根據本發明來治療之破壞性骨病包括(但不限於)：骨質疏鬆症、骨關節炎及溶骨病變(諸如由贅生性疾病、放射線療法或化學療法所引起之彼等溶骨病變)。在某些實施例中，骨質疏鬆症為原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中，骨質疏鬆症為繼發性骨質疏鬆症。

本發明之療法，亦即與GPR119促效劑有關之療法另外可用於增強個體之面部修復、上頜骨修復、下頜骨修復、牙周病或拔牙後骨癒合，增強個體長骨伸長，增強個體修復性向內生長及增加個體骨性結合。

在某些實施例中，個體為脊椎動物。在某些實施例中，為脊椎動物之個體為魚、兩棲動物、爬行動物、鳥或哺乳動物。在某些實施例中，個體或脊椎動物為哺乳動物。在某些實施例中，為哺乳動物之個體或脊椎動物為小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豬、狗、貓、馬、母牛、綿羊、山羊、非人類哺乳動物、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，人類為停經後女性或年過50之男性。

在未進一步詳述之情況下，咸信熟習此項技術者可使用上述描述充分實施本發明。由於在本發明之範疇內之修改對熟習此項技術者而言可變得顯而易見，因此上述詳細描述僅出於清楚理解而給出，且自其應瞭解無不必要之限制。

本申請案主張經美國快遞(U.S.Express Mail)由美國專利及商標局(United States Patent and Trademark Office)在指定日期申請之以下臨時專利申請案的優先權益：美國臨時專利申請案第60/791,550號，申請於2006年4月11日。上述臨時專利申請案之揭示內容係以引用的方式全部併入本文中。

貫穿本申請案，引用各種公開案、專利及專利申請案。本申請案中所參考之此等公開案、專利及專利申請案之揭示內容係以引用的方式全部併入本揭示案中。由公開案、專利或專利申請案之申請者在本文中之引用並未由作為先前技術之該公開案、專利或專利申請案之申請者所承認。

實例

在未進一步詳述之情況下，咸信熟習此項技術者可利用上述描述充分實施本發明。以下詳細實例僅視作說明性的，且決不以任何方式限制上述揭示內容。熟習此項技術者應即時瞭解該等程序之適當變更。

實例1：投與GPR119促效劑對野生型小鼠之血液GIP含量之影響的藥效分析

A. 使C57blk/6雄性小鼠禁食18小時，且隨機分配成十四組，每組n＝6。如圖1A 所指示，將20 mg/kg之媒劑(PET；80% PEG400，10%乙醇，10% Tween80)或20 mg/kg之本發明之GPR119促效劑(化合物1 ；(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺)經口投予小鼠。處理三十分鐘後，經口傳遞3 g/kg之葡萄糖大丸劑，且在葡萄糖大丸劑傳遞後0(無葡萄糖大丸劑)、2、5、10、20、40及60分鐘時收集血漿。藉由使用購自Linco Research Laboratory之齧齒動物GIP ELISA套組[大鼠/小鼠抑胃多肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP-55K]，按照供應商提供之說明書來測定血漿GIP含量。由圖1A 所示之結果可知，顯然投與GPR119促效劑增加小鼠血液中之葡萄糖依賴性GIP含量與葡萄糖非依賴性GIP含量。化合物1 刺激小鼠之血漿總GIP。化合物1 與國際專利申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 2004/065380公開)所揭示之化合物相同。

B. 使C57blk/6雄性小鼠禁食18小時，且隨機分配成十四組，每組n=6。如圖1B 所指示，將10 mg/kg之媒劑(20%羥丙基-β-環糊精(HPCD))或10 mg/kg之本發明之GPR119促效劑(化合物3 ；4-[6-(2-氟-4-甲烷磺醯基-苯氧基)-5-甲基-嘧啶-4-基氧基]-哌啶-1-羧酸異丙酯)經口投予小鼠。處理三十分鐘後，經口傳遞3 g/kg之葡萄糖大丸劑，且在葡萄糖大丸劑傳遞後0(無葡萄糖大丸劑)、5、10、20、60及120分鐘時收集血漿。藉由使用購自Linco Research Laboratory之齧齒動物GIP ELISA套組[大鼠/小鼠抑胃多肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP-55K]，按照供應商提供之說明書來測定血漿GIP含量。使用Excel程式進行統計分析。基於以每組六隻小鼠之結果計算GIP濃度之平均值且示作平均值±SEM。由圖1B 所示之結果可知，顯然投與GPR119促效劑增加小鼠血液中之葡萄糖依賴性GIP含量與葡萄糖非依賴性GIP含量。化合物3 刺激小鼠之血漿總GIP。化合物3 與國際專利申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 2005/007647公開)所揭示之化合物相同。

C. 使C57blk/6雄性小鼠禁食18小時，且隨機分配成十四組，每組n＝6。將1、3或10 mg/kg之媒劑(20%羥丙基－β－環糊精(HPCD))或1、3或10 mg/kg之本發明之GPR119促效劑(化合物3)經口投予小鼠。處理三十分鐘後，經口傳遞3 g/kg之葡萄糖大丸劑，且在葡萄糖大丸劑傳遞後0(無葡萄糖大丸劑)或5分鐘時收集血漿。藉由使用購自Linco Research Laboratory之齧齒動物GIP ELISA套組[大鼠/小鼠抑胃肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP－55K]，按照供應商提供之說明書來測定血漿GIP含量。使用Excel程式進行統計分析。基於以每組六隻小鼠之結果計算GIP濃度之平均值且展示於圖1C 中。由圖1C 可知，顯然GPR119促效劑(化合物3 )以劑量依賴性方式刺激小鼠之血漿總GIP。化合物3 與國際專利申請案第PCT/US2004/022327號(以WO 2005/007647公開)所揭示之化合物相同。

實例2：與野生型小鼠相比，投與GPR119促效劑對GPR119缺失(基因剔除)小鼠之血液GIP含量的影響

A. 使GPR119缺失雄性小鼠及野生型同窩出生仔禁食18小時。如所指示(n＝5)，將20 mg/kg之媒劑(PET；80% PEG400，10%乙醇，10% Tween80)或20 mg/kg之本發明之GPR119促效劑(化合物1；(2－氟－4－甲烷磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺)經口投予小鼠。處理三十分鐘後，(時間：0)經眼睛之後眼眶靜脈收集血液(100微升)，繼之投與3 g/kg之葡萄糖大丸劑(經口)。傳遞葡萄糖後五分鐘，(時間：5分鐘)收集另一血樣(100微升)。離心後收集血漿且藉由使用購自Linco Research Laboratory之齧齒動物GIP ELISA套組[大鼠/小鼠抑胃多肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP-55K]，按照供應商提供之說明書來測定GIP含量。由圖2A 所示之結果可知，顯然由於所投與之GPR119促效劑增加小鼠血液中之葡萄糖非依賴性GIP含量及葡萄糖依賴性GIP含量，因此功能性GPR119受體為必需的。化合物1 刺激野生型小鼠之血漿總GIP。化合物1 與國際專利申請案第PCT/US2004/001267號(以WO 2004/065380公開)所揭示之化合物相同。

B. 使GPR119缺失雄性小鼠及野生型同窩出生仔禁食18小時。如所指示(n=5)，將30 mg/kg之媒劑(40%羥丙基-β-環糊精(HPCD))或30 mg/kg之本發明之GPR119促效劑(化合物2 ；4-[1-(2-氟-4-甲烷磺醯基-苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基]-哌啶-1-羧酸異丙酯)經口投予小鼠。處理三十分鐘後，(時間：0)經眼睛之後眼眶靜脈收集血液(100微升)，繼之投與3 g/kg之葡萄糖大丸劑(經口)。傳遞葡萄糖後五分鐘，(時間：5分鐘)收集另一血樣(100微升)。離心後收集血漿且藉由使用購自Linco Research Laboratory之齧齒動物GIP ELISA套組[大鼠/小鼠抑胃多肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP-55K]，按照供應商提供之說明書來測定GIP含量。基於以每組五隻小鼠之結果來計算GIP濃度之平均值。由圖2B 所示之結果可知，顯然由於所投與之GPR119促效劑增加小鼠血液中之葡萄糖非依賴性GIP含量及葡萄糖依賴性GIP含量，因此功能性GPR119受體為必需的。化合物2 刺激野生型小鼠之血漿總GIP。化合物2 與國際專利申請案第PCT/US2004/022417號(以WO 2005/007658公開)所揭示之化合物相同。

實例3：投與GPR119促效劑對卵巢切除大鼠之骨質量的影響

使用下述活體內卵巢切除(OVX)大鼠模型，可顯示本發明之GPR119促效劑有效治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)及/或增加個體骨質量(參見(例如)Bollag等人，Mol Cell Endocrinol(2001)177：35－41)。

20隻未交配雌性OVX及20隻未交配非OVX Sprague－Dawley大鼠(150－175 g)(年齡8週)係購自Harlan Sprague－Dawley,Inc.(Indianapolis,IN)。隨意喂給動物正常商用小球狀膳食，Teklab齧齒動物膳食(1.46%鈣)，自由進水。將大鼠隨機分成四個重量匹配型實驗組且經選擇以經口接收媒劑或本發明之GPR119促效劑。以每日為基礎持續處理6週。

1.對照. 將媒劑經口投予十隻非OVX大鼠。

2.對照＋處理. 將GPR119經口投予十隻非OVX大鼠。

3. OVX. 將媒劑經口投予十隻OVX大鼠。

4. OVX＋處理. 將GPR119經口投予十隻OVX大鼠。

在基線時將大鼠稱重及量測長度，且在6週時再次將大鼠稱重及量測長度。在治療開始之前及在6週時對所有動物進行使用Hologic QDR 1000/W(Waltham,MA)之雙能X射線吸收測定法(DXA)，且使用軟體大鼠整體(Rat Whole Body)版本5.53來分析資料。在脊柱處測定骨礦密度(BMD)。

確定治療6週後脊椎骨密度之變化百分數。顯示投與GPR119促效劑削弱卵巢切除對脊椎骨密度之負面影響。卵巢切除對脊椎骨密度之負面影響的削弱指示該處理有效治療或預防特徵為低骨質量之病狀(諸如骨質疏鬆症)及/或增加個體骨質量。

實例4：投與GPR119促效劑對骨折癒合之影響

使用下述活體內檢定，可顯示本發明之GPR119促效劑有效治療骨折。

骨折技術 用氯胺酮(Ketamine)使3月齡之Sprague－Dawley大鼠麻醉。在右脛骨或股骨之近端部分之前內側上產生1 cm切口。以下描述脛骨術技術。完成切口直至骨，且使1 mm孔鑽過脛骨粗隆之4 mm近側至遠側、2 mm內側至前脊。用0.8 mm不銹鋼管(在與骨相同之條件下測試，最大負荷36.3 N，最大硬度61.8 N/mm)進行骨髓內骨折釘固術。不進行髓管鉸孔。使用具有鈍鉗口之經特別設計之可調節鉗子由三點彎曲在脛腓接合處上方2 mm產生標準閉合性骨折。為使軟組織損傷最小，應小心不使骨折移位。用單絲耐綸縫合線將皮膚閉合。在無菌條件下進行手術。釘固術後立即獲取所有骨折之放射線照片，且排除在指定骨幹區域外部患有骨折或具有移位之釘的大鼠。將剩餘動物隨機分成以下各組，對每個小組10－12隻動物在每個時間點測試骨折癒合。以每日為基礎用媒劑或用GPR119促效劑經口投予大鼠。GPR119促效劑係以介於0.001 mg/kg體重與100 mg/kg體重之間的量使用。持續處理10、20、40及80日。

第10、20、40及80日，用氯胺酮使來自每組之10－12隻大鼠麻醉且藉由放血使其死亡。藉由解剖移除脛腓骨且剝去所有軟組織。將來自每組5－6隻大鼠之骨骼儲存於70%乙醇中用於組織學分析，且將來自每組另外5－6隻大鼠之骨骼儲存於緩衝林格氏液(buffered Ringer's solution)(＋4℃，pH 7.4)中用於放射線照相及所進行之生物機械學測試。

組織學分析 用於骨折骨骼之組織學分析之方法先前已由Mosekilde及Bak(Bone(1993)14：19－27)公開。簡而言之，將骨折部位鋸8 mm至骨折線之每一側，未脫鈣包埋於甲基丙烯酸甲酯中，且在8 μm厚之Reichert－Jung Polycut切片機上切割額狀切片(frontals section)。使用經Masson－Trichome染色之正中額狀切片(mid－frontal section)(包括脛骨與腓骨)觀測在有或無處理之情況下對骨折癒合之細胞或組織回應。使用經天狼星紅(Sirius red)染色之切片證明骨痂結構之特徵且區分骨折部位處之織網骨與板層骨。進行以下量測：(1)骨折間隙－量測為骨折之皮層骨端之間的最短距離，(2)骨痂長度及骨痂直徑，(3)骨痂之全骨大面積，(4)骨痂區域內部單位組織面積之骨組織，(5)骨痂中之纖維組織，及(6)骨痂中之軟骨面積。

用於生物機械學分析之方法先前已由Bak及Andreassen(Calcif Tissue Int(1989)45：292－297)公開。簡單而言，在生物機械學測試之前獲取所有骨折之放射線照片。癒合骨折之機械特性由破壞性三點或四點彎曲程序來分析。測定最大負荷、硬度、最大符合下之能量、最大負荷下之撓曲及最大應力。

實例5

內源性人類GPR119之全長選殖 編碼內源性人類GPR119之聚核苷酸係藉由PCR使用以下GPR119特異性引子：5'－GTCCTGCCACTTCGAGACATGG－3'(SEQ ID NO：3；有義股，ATG作為起始密碼子)5'－GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC－3'(SEQ ID NO：4；反義股，3'為終止密碼子)及人類基因組DNA作為模板來選殖。使用TaqPlus Precision^TM DNA聚合酶(Stratagene)由以下循環以步驟2至步驟4重複35次來擴增：94℃，3分鐘；94℃，1分鐘；58℃，1分鐘；72℃，2分鐘；72℃，10分鐘。

將預測尺寸之1.0 Kb PCR片段分離且選殖於pCRII－TOPO^TM 載體(Invitrogen)中且使用T7 DNA定序酶套組(Amersham)來完全定序。參見核酸序列之SEQ ID NO：1及經推導之胺基酸序列之SEQ ID NO：2。

實例6

受體表現 儘管多種細胞對G蛋白偶合受體表現之技術而言為可用的，但最佳為利用真核細胞。在某些實施例中，利用哺乳動物細胞或黑色素細胞。以下為說明性的；咸信一般技術者能確定對技工之需要而言優先有利的彼等技術。參見(例如)以下實例9，其係關於黑色素細胞。

a.瞬時轉染 第1日，塗佈6×10⁶ /10 cm培養皿之293細胞。第2日，製備兩個反應管(對於每一管所遵循之比例係根據塗佈)：管A係藉由在0.5 ml無血清DMEM(Gibco BRL)中混合4 μg DNA(例如pCMV載體，具有受體cDNA之pCMV載體，等)來製備；管B係藉由在0.5 ml無血清DMEM中混合24 μl脂質轉染劑(lipofectamine)(Gibco BRL)來製備。管A及B藉由倒置(數次)來混雜，接著在室溫下培養30－45 min。混雜物係指"轉染混合物"。將經塗佈之293細胞用1×PBS洗滌，接著添加5 ml無血清DMEM。將1 ml轉染混合物添加至細胞中，接著在37℃/5% CO₂ 下培養4小時。藉由吸出移除轉染混合物，接著添加10 ml DMEM/10%胎牛血清。在37℃/5% CO₂ 下培養細胞。培養48小時後，將細胞收集且用於分析。

b.穩定細胞株 將約12×10⁶ 293細胞塗佈於15 cm組織培養盤上。在含有10%胎牛血清及1%丙酮酸鈉、L－麩胺醯胺及抗生素之DME高葡萄糖培養基中生長。塗佈293細胞後24小時(或達約80%融合)，使用12 μg DNA(例如具有受體cDNA之pCMV－neo^r 載體)轉染細胞。將12 μg DNA與60 μl脂質轉染劑及2 ml無血清DME高葡萄糖培養基組合。自培養盤吸出培養基且將細胞用無血清培養基洗滌一次。將DNA、脂質轉染劑及培養基混合物連同10 ml無血清培養基一起添加至培養盤中。在37℃下培養四至五小時後，吸出培養基且添加25 ml含血清培養基。轉染後24小時，再次吸出培養基，且添加新鮮有血清培養基。轉染後48小時，吸出培養基且添加含有遺傳黴素(G418藥物)之有血清培養基，將最終濃度之約12×10⁶ 293細胞塗佈於15 cm組織培養盤上。在含有10%胎牛血清及1%丙酮酸鈉、L－麩胺醯胺及抗生素之DME高葡萄糖培養基中生長。塗佈293細胞後24小時(或達約80%融合)，使用12 μg DNA(例如具有受體cDNA之pCMV載體)轉染細胞。將12 μg DNA與60 μl脂質轉染劑及2 ml無血清DME高葡萄糖培養基組合。自培養盤吸出培養基且將細胞用無血清培養基洗滌一次。將DNA、脂質轉染劑及培養基混合物連同10 ml無血清培養基一起添加至培養盤中。在37℃下培養四至五小時後，吸出培養基且添加25 ml含血清培養基。轉染後24小時，再次吸出培養基，且添加新鮮有血清培養基。轉染後48小時，吸出培養基且以500 μg/ml之最終濃度添加含有遺傳黴素(G418藥物)之有血清培養基。現在，經轉染之細胞經受對含有G418抗性基因之經陽性轉染之細胞的選擇。每四至五日當選擇發生時置換培養基。選擇期間，使細胞生長以產生穩定彙集，或使其分裂用於穩定純系選擇。

實例7

用於篩選作為(例如)GPR119促效劑之候選化合物的檢定 多種方法可用於篩選作為(例如)GPR119促效劑之候選化合物。以下為說明性的；咸信一般技術者能確定對技工之需要而言優先有利的彼等技術。用於篩選作為G蛋白偶合受體之促效劑之化合物的檢定為熟習此項技術者所熟知(參見(例如)國際申請案WO 02/42461)。

1.膜結合檢定：[ ³⁵ S]GTPγS檢定 當由於配位體結合或組成性活化使得G蛋白偶合受體處於其活性狀態時，受體與G蛋白偶合且刺激釋放GDP及隨後使GTP與G蛋白結合。G蛋白受體複合物之α次單位充當GTPase且使GTP緩慢水解成GDP，此時通常使受體失活。經活化之受體繼續使GDP變成GTP。不可水解GTP類似物([³⁵ S]GTPγS)可用於證明[³⁵ S]GTPγS與表現經活化受體之膜的結合增強。使用[³⁵ S]GTPγS結合量測活化之優勢在於：(a)其一般適用於G蛋白偶合受體；(b)其最接近膜表面使得極少可能採集影響細胞內級聯之分子。

該檢定利用G蛋白偶合受體刺激[³⁵ S]GTPγS與表現相關受體之膜結合的能力。檢定為通用的且適用於所有G蛋白偶合受體之藥物傳遞。

膜製備 在一些實施例中，包含本發明之G蛋白偶合受體及用於鑑定作為(例如)受體促效劑之候選化合物之膜較佳如下製備：a.物質 "刮膜緩衝液"包含20 mM HEPES及10 mM EDTA,pH 7.4；"膜洗滌緩衝液"包含20 mM HEPES及0.1 mM EDTA,pH 7.4；"結合緩衝液"包含20 mM HEPES、100 mM NaCl及10 mM MgCl₂ ,pH 7.4。

b.程序 將整個程序中將所有物質保持於冰上。首先，自細胞之匯合單層吸出培養基，接著用10 ml冷PBS沖洗，接著吸出。其後，添加5 ml刮膜緩衝液以刮細胞；接著將細胞提取物轉移至50 ml離心管中(在4℃下以20,000 rpm離心17分鐘)。其後，吸出上清液且將小球再懸浮於30 ml膜洗滌緩衝液中，接著在4℃下以20,000 rpm離心17分鐘。接著吸出上清液且將小球再懸浮於結合緩衝液中。接著使用Brinkman Polytron^TM 均化器使其均化(15－20秒脈衝直至所有物質處於懸浮狀態)。此在本文中係指"膜蛋白"。

Bradford蛋白質檢定均化後，膜之蛋白質濃度將使用Bradford蛋白質檢定來測定(可將蛋白質稀釋至約1.5 mg/ml，等分且冷凍(－80℃)用於稍後使用；冷凍時，使用方案如下：檢定當日，在室溫下使經冷凍之膜蛋白解凍，接著渦旋，且接著用Polytron以約12×1,000 rpm均化約5－10秒；應注意對於多種製劑而言，在均化不同製劑之間應徹底清潔均化器)。

a.物質 按照製造商說明書(Biorad，目錄號500－0006)，將利用結合緩衝液(如上)、Bradford染料試劑、Bradford蛋白質標準品。

b.程序 製備兩個管，一者包括膜，且一者作為對照"空白"。每一者含有800 μl結合緩衝液。其後，將10 μl Bradford蛋白質標準品(1 mg/ml)添加至每一管中，且接著將10 μl膜蛋白添加至僅一管(非空白)中。其後，將200 μl Bradford染料試劑添加至每一管中，接著使每一者渦旋。五(5)分鐘後，使該等管反渦旋且將其中之物質轉移至比色管中。接著使用CECIL 3041分光光度計在波長595處讀取比色管。

鑑定檢定a.物質 GDP緩衝液由37.5 ml結合緩衝液及2 mg GDP(Sigma，目錄號G－7127)組成，接著在結合緩衝液中進行一系列稀釋以獲得0.2 μM GDP(每一孔中GDP之最終濃度為0.1 μM GDP)；包含候選化合物之每一孔具有200 μl之最終體積，其由100 μl GDP緩衝液(最終濃度為0.1 μM GDP)、於結合緩衝液中之50 μl膜蛋白及於結合緩衝液中之50 μl[³⁵ S]GTPγS(0.6 nM)(每10 ml結合緩衝液2.5 μl[³⁵ S]GTPγS)組成。

b.程序 候選化合物較佳將使用96孔培養盤格式來篩選(此等候選化合物可在－80℃下冷凍)。膜蛋白(或具有表現載體而不包括靶GPCR之膜，作為對照物)將簡單均化直至處於懸浮狀態。接著將使用上文所陳述之Bradford蛋白質檢定來測定蛋白質濃度。接著將膜蛋白(及對照物)在結合緩衝液(最終檢定濃度為12.5微克/孔)中稀釋至0.25 mg/ml。其後，將100 μl GDP緩衝液添加至Wallac Scintistrip^TM (Wallac)之每一孔中。接著使用5 μl針具將5 μl候選化合物轉移至該孔中(亦即，200 μl總檢定體積中之5 μl為1：40之比率，使得候選化合物之最終篩選濃度為10 μM)。此外，為避免污染，在每個轉移步驟後，應將針具在包含水(1×)、乙醇(1×)及水(2×)之三個儲集器中沖洗－應將過量液體自工具震落且用紙及擦拭紙(kimwipe)乾燥。其後，將50 μl膜蛋白添加至每一孔中(亦利用包含膜而無靶GPCR之對照孔)，且在室溫下預培養5－10分鐘。其後，將於結合緩衝液中之50 μl[³⁵ S]GTPγS(0.6 nM)添加至每一孔中，接著在室溫下在震盪器上培養60分鐘(此外，在此實例中，用箔覆蓋培養盤)。接著在22℃下藉由使培養盤以4000 RPM旋轉15分鐘來終止檢定。接著在Wallac 1450上使用設定"第37號方案"讀取培養盤(按照製造商說明書)。

2.腺苷酸環化酶檢定 經設計用於基於細胞之檢定的Flash Plate^TM 腺苷酸環化酶套組(New England Nuclear，目錄號SMP004A)可經修改以與粗質膜一起使用。Flash Plate孔可含有閃爍體塗層，該閃爍體塗層亦含有識別cAMP之特異性抗體。該等孔中所產生之cAMP可由放射性cAMP示蹤劑與cAMP抗體之結合的直接競爭來定量。以下充當用於量測表現受體之細胞中cAMP含量變化之簡要方案。

在某些實施例中，經修改之Flash Plate^TM 腺苷酸環化酶套組(New England Nuclear，目錄號SMP004A)係用於根據以下方案鑑定作為(例如)GPR119促效劑之候選化合物。

轉染後約三日收集經本發明之G蛋白偶合受體轉染之細胞。藉由在含有20 mM HEPES(pH 7.4)及10 mM MgCl₂ 之緩衝液中均化經懸浮之細胞來製備膜。使用Brinkman Polytron^TM 在冰上進行均化歷時約10秒。在4℃下使所得均漿以49,000×g離心15分鐘。接著將所得小球再懸浮於含有20 mM HEPES(pH 7.4)及0.1 mM EDTA之緩衝液中，均化10秒，接著在4℃下以49,000×g離心15分鐘。接著將所得小球儲存於－80℃下直至利用。直接鑑定篩選當日，將膜小球在室溫下緩慢解凍，再懸浮於含有20 mM HEPES(pH 7.4)及10 mM MgCl₂ 之緩衝液中，以得到0.60 mg/ml之最終蛋白質濃度(將再懸浮之膜置放於冰上直至使用)。

根據製造商說明書製備及維持cAMP標準品及偵測緩衝液(包含2 μCi示蹤劑([¹²⁵ I]cAMP(100 μl)至11 ml偵測緩衝液))。新鮮製備檢定緩衝液用於篩選且其含有20 mM HEPES(pH 7.4)、10 mM MgCl₂ 、20 mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1單位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50 μM GTP(Sigma)及0.2 mM ATP(Sigma)；接著將檢定緩衝液儲存於冰上直至利用。

較佳將候選化合物連同40 μl膜蛋白(30微克/孔)及50 μl檢定緩衝液一起添加至(例如)96孔培養盤孔中(3微升/孔，12 μM最終檢定濃度)。接著在溫和震盪下將此混雜物在室溫下培養30分鐘。

培養後，將100 μl偵測緩衝液添加至每一孔中，接著培養2－24小時。接著使用"第31號方案"在Wallac MicroBeta^TM 培養盤讀取器中對培養盤計數(按照製造商說明書)。

3. CRE－Luc報導體檢定 將293及293T細胞以2×10⁴ 個細胞/孔之密度塗佈於96孔培養盤上且次日根據製造商說明書使用脂質轉染劑試劑(BRL)轉染。對於每6孔轉染如下製備DNA/脂質混合物：將於100 μl DMEM中之260 ng質體DNA與於100 μl DMEM中之2 μl脂質緩緩混合(260 ng質體DNA由200 ng 8×CRE－Luc報導體質體、包含本發明之G蛋白偶合受體之50 ng pCMV或單獨pCMV及10 ng GPRS表現質體(於pcDNA3中之GPRS(Invitrogen))組成)。如下製備8×CRE－Luc報導體質體：藉由在pβgal－Basic載體(Clontech)中在BglV－HindIII位點處選殖大鼠生長抑素啟動子(－71/＋51)來獲得載體SRIF－β－gal。由自腺病毒模板AdpCF126CCRE8之PCR獲得cAMP反應元件之八(8)個複本[參見Suzuki等人，Hum Gene Ther(1996)7：1883－1893，其揭示內容係以引用的方式全部併入本文中]，且在Kpn－BglV位點處選殖於SRIF－β－gal載體中，產生8×CRE－β－gal報導體載體。藉由用在HindIII－BamHI位點處自pGL3－basic載體(Promega)獲得之螢光素酶基因置換8×CRE－β－gal報導體載體中之β－半乳糖苷酶基因來產生8×CRE－Luc報導體質體。在室溫下培養30 min後，用400 μl DMEM稀釋DNA/脂質混合物且將100 μl經稀釋之混合物添加至每一孔中。在細胞培養恆溫箱中培養4小時後，將具有10% FCS之100 μl DMEM添加至每一孔中。次日將經轉染之細胞與具有10% FCS之200微升/孔之DMEM交換。八(8)小時後，在用PBS洗滌一次後，將孔換成100微升/孔之無酚紅DMEM。次日使用LucLite^TM 報導體基因檢定套組(Packard)按照製造商說明書量測螢光素酶活性且在1450 MicroBeta^TM 閃爍及發光計數器(Wallac)上讀取。

實例8：對於(例如)GPR119促效劑活性之全細胞腺苷酸環化酶檢定

環狀AMP量測係根據供應商方案用Flash Plate^TM 腺苷酸環化酶套組(New England Nuclear)來完成。將HEK293細胞以12×10⁶ 個細胞/培養皿塗佈於規則生長培養基(DMEM/10% FBS)中之15－cm組織培養皿中。次日，根據製造商方案用脂質轉染劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)將10 μg空載體DNA或表現質體DNA轉染至細胞中。培養24小時後，將經轉染之細胞收集於GIBCO細胞解離緩衝液(目錄號13151－014)中，藉由以1,100 rpm離心5分鐘來粒化，且小心地再懸浮於適當體積之檢定緩衝液(50% 1×PBS及50%螢光放射增強緩衝液)中以得到2×10⁶ 個細胞/毫升之最終細胞計數。若指示，則在所要檢定濃度之50 μl檢定緩衝液中製備測試化合物，且用移液管移至96孔Flash Plate之孔中。接著添加上文所製備之細胞懸浮液(50微升/孔)。在室溫下60分鐘之培養時間後，接著將含有示蹤劑[¹²⁵ I]－cAMP之100 μl偵測混合物添加至孔中。將培養盤再培養2小時，接著在Wallac MicroBeta閃爍計數器中計數。cAMP/孔之值自每一檢定培養盤所包括之標準cAMP曲線外推而得。

經GPR119轉染之HEK293細胞中cAMP含量的增加高於經空載體轉染之HEK293細胞中彼cAMP含量的增加指示測試化合物為刺激GPR119受體功能性之化合物。

實例9：對於(例如)GPR119促效劑活性之黑色素細胞檢定

如由Potenza等人[Pigment Cell Research(1992)5：372－378]報導將黑色素細胞維持於培養物中，且使用電穿孔以編碼GPR119受體(GPR119；例如GenBank寄存編號AAP72125之人類GPR119及其等位基因)之表現載體轉染。電穿孔後，將經轉染之細胞塗佈於96孔培養盤中用於檢定。接著使細胞生長48小時以自電穿孔程序回收並達到最大受體表現量。

檢定當日，用含有10 nM褪黑激素之無血清緩衝液置換細胞之生長培養基。褪黑激素經由黑色素細胞中之內源性Gi偶合GPCR起作用以降低細胞內cAMP含量。回應cAMP含量降低，黑色素細胞將其顏料移至細胞中心。其淨效應為在600－650 nM處所量測之孔中細胞單層之吸光度讀數顯著降低。

在褪黑激素中培養1小時後，細胞變成完全顏料聚集的。此時，收集基線吸光度讀數。接著將連續稀釋之測試化合物添加至培養盤中，且具有GPR119促效劑活性之化合物引起細胞內cAMP含量增加。回應此等cAMP含量增加，黑色素細胞將其顏料移回細胞周邊。1小時後，經刺激之細胞為完全顏料分散的。處於分散狀態之細胞單層在600－650 nm範圍內吸收更多光。與基線讀數相比所量測之吸光度增加使吾人定量受體刺激之程度且繪製劑量回應曲線。

關於黑色素細胞檢定之物質及方法見於美國專利第5,462,856號及第6,051,386號中，其各者之揭示內容係以引用的方式全部併入本文中。

經GPR119轉染之黑色素細胞中顏料分散的增加高於經空載體轉染之黑色素細胞中彼顏料分散的增加指示測試化合物為刺激GPR119受體功能性之化合物。

用於鑑定作為GPR119促效劑之化合物的其他檢定將對熟習此項技術者顯而易見(參見(例如)上文實例7)。

實例10：對於(例如)GPR119促效劑活性之酵母報導體檢定

基於酵母細胞之報導體檢定先前已描述於文獻中(例如，參見Miret等人，J Biol Chem(2002)277：6881－6887；Campbell等人，Bioorg Med Chem Lett(1999)9：2413－2418；King等人，Science(1990)250：121－123；WO 99/14344；WO 00/12704；及US 6,100,042)。簡而言之，酵母細胞已經工程化使得內源性酵母G－α(GPA1)已缺失且經使用多種技術建構之G蛋白嵌合體置換。另外，內源性酵母α細胞GPCR,Ste3已缺失以使得同源表現所選擇之哺乳動物GPCR。在酵母中，保存於真核細胞中之信息素信號轉導路徑(例如經有絲分裂原活化之蛋白激酶路徑)之元件驅動Fus1之表現。藉由將β－半乳糖苷酶(LacZ)置放於Fus1啟動子(Fus1p)控制下，已使系統發展，藉以受體活化產生酶讀數。

藉由修改由Agatep等人(Agatep等人，1998,Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single－stranded carrier DNA/polyethylene glycol(LiAc/ss－DNA/PEG)protocol.Technical Tips Online,Trends Journals,Elsevier)所述之乙酸鋰方法使酵母細胞轉型。簡而言之，使酵母細胞在酵母胰蛋白腖培養盤(YT)上生長隔夜。將於酵母表現載體(2 μg複製源)及乙酸鋰/聚乙二醇/TE緩衝液中之載體單股DNA(10 μg)、各2 μg之兩種Fus1p－LacZ報導體質體(一者具有URA選擇標記且一者具有TRP)、2 μg GPR119(例如人類受體)用移液管移至Eppendorf管中。含有受體之酵母表現質體/無受體對照具有LEU標記。將酵母細胞接種至此混合物中且反應係在30℃下進行60 min。接著使酵母細胞在42℃下熱休克15 min。接著將細胞洗滌且展布於選擇培養盤上。選擇培養盤為不含LEU、URA及TRP(SD－LUT)之合成界定酵母培養基。在30℃下培養2－3日後，接著在LacZ檢定中測試在選擇培養盤上生長之群落。

為進行對β－半乳糖苷酶之螢光酶檢定，使載運本發明GPR119受體之酵母細胞在液體SD－LUT培養基中生長隔夜至不飽和濃度(亦即，細胞仍分開且尚未到達生長停滯期)。將其在新鮮培養基中稀釋至最佳檢定濃度且將90 μl酵母細胞添加至96孔黑聚苯乙烯培養盤(Costar)中。將溶解於DMSO中及在10% DMSO溶液中稀釋至10×濃度之測試化合物添加至培養盤中，且將培養盤在30℃下置放4 h。4 h後，將β－半乳糖苷酶之受質添加至每一孔中。在此等實驗中，使用螢光素二(β－D－吡喃半乳糖苷)(FDG)，釋放螢光素之酶之受質，產生螢光讀數。添加20微升/孔之500 μM FDG/2.5% Triton X100(清潔劑對使細胞可滲透為必需的)。在細胞與受質一起培養60 min後，添加20微升/孔之1 M碳酸鈉以終止反應且增強螢光信號。接著在485/535 nm處在螢光計中讀取培養盤。

經GPR119轉型之酵母細胞中螢光信號的增加高於經空載體轉型之酵母細胞中彼螢光信號的增加指示測試化合物為刺激GPR119受體功能性之化合物(例如為GPR119之促效劑或部分促效劑之化合物)。在某些實施例中，本發明之化合物產生高於背景信號(在單獨媒劑存在下所獲得之信號)增加之螢光信號的增加。

實例11：經放射性標記之化合物

在某些實施例中，已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體的化合物經放射性標記。如本文中所述之經放射性標記之化合物可用於篩選檢定中以鑑定/評估化合物。大體而言，經新合成或鑑定之化合物(亦即測試化合物)可評估其藉由其能減少形成經放射性標記之已知配位體與受體之間的複合物來減少經放射性標記之已知配位體與受體結合的能力。可併入本發明之化合物中之合適之放射性核種包括(但不限於)：³ H(亦寫作T)、¹¹ C、¹⁴ C、¹⁸ F、¹²⁵ I、⁸² Br、¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、⁷⁵ Br、⁷⁶ Br、¹⁵ O、¹³ N、³⁵ S及⁷⁷ Br。合併有³ H、¹⁴ C、¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S或⁸² Br之化合物一般最適用。

應瞭解，"經放射性標記之化合物"為已合併有至少一種放射性核種之化合物。在一些實施例中，放射性核種係選自由³ H、¹⁴ C、¹²⁵ I、³⁵ S及⁸² Br組成之群。在一些實施例中，放射性核種為³ H或¹⁴ C。此外，應瞭解，在已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體的化合物中所呈現之所有原子可為該等原子之最常產生之同位素或更稀有之放射性同位素或非放射性同位素。

用於將放射性同位素併入有機化合物中之合成方法(包括適用於已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體之彼等化合物的彼等方法)在此項技術中已為熟知且包括將活性程度之氚併入靶分子中，該等方法包括：A. 用氚氣催化還原－此程序通常得到比活性產物且需要經鹵化或不飽和前驅物。B. 用硼氫化鈉[³ H]還原－此程序相當便宜且需要含有可還原官能基之前驅物，諸如醛、酮、內酯、酯及其類似物。C. 用氫化鋁鋰[³ H]還原－此程序得到最接近理論比活性之產物。其亦需要含有可還原官能基之前驅物，諸如醛、酮、內酯、酯及其類似物。D. 氚氣暴露標記－此程序包括在合適之催化劑存在下將含有可交換質子之前驅物暴露於氚氣中。E. 使用碘代甲烷[³ H]之N－甲基化－此程序通常用於藉由用高比活性碘代甲烷(³ H)處理適當前驅物來製備O－甲基或N－甲基(³ H)產物。此方法一般產生高比活性，諸如約80－87 Ci/mmol。

用於將活性程度之¹²⁵ I併入靶分子中之合成方法包括：A. Sandmeyer及其類似反應－此程序使芳基或雜芳基胺轉化成重氮鹽，諸如四氟硼酸鹽，且隨後使用Na¹²⁵ I轉化成經¹²⁵ I標記之化合物。代表性程序由Zhu,D.－G.及共同工作者報導於J.Org.Chem.2002 ,67,943－948中。B. 酚之鄰¹²⁵ 碘化－如由Collier,T.L.及共同工作者報導於J.Labelled Compd Radiopharm.1999 ,42,S264－S266中，此程序使得在酚之鄰位處併入¹²⁵ I。C. 芳基或雜芳基溴與¹²⁵ I交換－此方法一般為兩步法。第一步為在三烷基鹵化錫或六烷基二錫[例如(CH₃ )₃ SnSn(CH₃ )₃ ]存在下使用(例如)Pd催化反應[亦即Pd(Ph₃ P)₄ ]或經芳基或雜芳基鋰使芳基或雜芳基溴轉化成相應三烷基錫中間物。代表性程序由Bas,M.－D.及共同工作者報導於J.Labelled Compd Radiopharm.2001 ,44,S280－S282中。

上述技術旨在說明且並非限制。用於放射性標記已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體之化合物的其他技術為熟習此項技術者所熟知。

實例12：受體結合檢定

測試化合物可評估其減少形成已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體之化合物與受體之間的複合物之能力。在某些實施例中，已知配位體經放射性標記。經放射性標記之已知配位體可用於篩選檢定中以鑑定/評估化合物。大體而言，經新合成或鑑定之化合物(亦即測試化合物)可評估其藉由其能減少形成經放射性標記之已知配位體與受體之間的複合物來減少經放射性標記之已知配位體與受體結合的能力。

在有測試化合物存在之情況下經放射性標記之已知配位體之特異性結合程度小於在無該測試化合物存在之情況下經放射性標記之已知配位體之特異性結合程度指示在有測試化合物存在之情況下比在無測試化合物存在之情況下形成更少該經放射性標記之已知配位體與該受體之間的複合物。

用於偵測已知為本發明之G蛋白偶合受體之配位體之化合物與受體之間的複合物之檢定方案A.製備受體 使用60 μl脂質轉染劑(每15－cm培養皿)以包含編碼本發明之G蛋白偶合受體之聚核苷酸的10 μg表現載體瞬時轉染293細胞。使經瞬時轉染之細胞在培養皿中生長24小時(75%融合)同時改變培養基，且用10毫升/培養皿之Hepes－EDTA緩衝液(20 mM Hepes＋10 mM EDTA，pH 7.4)來移除。接著將細胞在Beckman Coulter離心機中以17,000 rpm(JA－25.50轉子)離心20分鐘。隨後，將小球再懸浮於20 mM Hepes＋1 mM EDTA(pH 7.4)中且用50－ml Dounce均化器均化且再次離心。移除上清液後，將小球儲存於－80℃下直至用於結合檢定。當用於檢定時，將膜在冰上解凍20分鐘且接著添加培養緩衝液(20 mM Hepes,1 mM MgCl₂ ,100 mM NaCl,pH 7.4)。接著使膜渦旋以使粗膜小球再懸浮且在設定為6下用Brinkmann PT－3100 Polytron均化器均化15秒。使用BRL Bradford蛋白質檢定測定膜蛋白濃度。

B.結合檢定 對於總結合而言，將總體積50 μl之經適當稀釋之膜(在含有50 mM Tris HCl(pH 7.4)、10 mM MgCl₂ 及1 mM EDTA之檢定緩衝液中稀釋；5－50 μg蛋白質)添加至96孔聚丙烯微量滴定培養盤中，接著添加100 μl檢定緩衝液及50 μl經放射性標記之已知配位體。對於非特異性結合而言，添加50 μl檢定緩衝液而非100 μl，且再添加50 μl未經放射性標記之10 μM該已知配位體，隨後添加50 μl該經放射性標記之已知配位體。接著將培養盤在室溫下培養60－120分鐘。藉由經具有Brandell 96孔培養盤收集器之微定量盤裝置GF/C Unifilter濾板過濾檢定培養盤，接著用含有0.9% NaCl之冷50 mM Tris HCl(pH 7.4)洗滌來終止結合反應。接著，密封濾板底部，將50 μl Optiphase Supermix添加至每一孔中，密封培養盤頂部，且在Trilux MicroBeta閃爍計數器中對培養盤計數。為判定是否在測試化合物存在下形成較少該經放射性標記之已知配位體與該受體之間的複合物，將100 μl經適當稀釋之該測試化合物添加至適當孔中，以替代添加100 μl檢定緩衝液，接著添加50 μl該經放射性標記之已知配位體。

C.計算 最初在10、1及0.1 μM下及接著在所選擇之濃度範圍下檢定測試化合物以使中間劑量會引起約50%抑制經放射性標記之已知配位體的結合(亦即IC₅₀ )。在無測試化合物存在之情況下特異性結合(B_O )為總結合減去非特異性結合(NSB)之差，且類似地，特異性結合(在有測試化合物存在之情況下)(B)為置換結合(B_D )減去非特異性結合(NSB)之差。自抑制回應曲線，% B/B_O 對測試化合物濃度之雙對數(logit－log)曲線確定IC₅₀ 。

由Cheng及Prustoff轉換計算K_i ：K_i ＝IC₅₀ /(1＋[L]/K_D )

其中[L]為檢定中所使用之經放射性標記之已知配位體的濃度且K_D 為在相同結合條件下獨立地測定之經放射性標記之已知配位體的解離常數。

實例13

GPR119促效劑對腸內分泌細胞株中或來源於小腸之K細胞富集區域之組織中之細胞中GIP分泌的影響 使用在此所述之活體外檢定，可顯示本發明之GPR119促效劑刺激腸內分泌細胞株中或來源於小腸[例如，十二指腸或空腸組織；參見(例如)Sondhi等人，Pharmacogenetics J(2006)6：131－140]之K細胞富含區域之組織中之細胞中的GIP分泌。第1日，將腸內分泌細胞或來源於小腸之K細富集區域之組織中之細胞塗佈於24孔培養盤中之完全培養基(DMEM/10% FBS)中。第2日，用低葡萄糖培養基(DMEM/3 mM葡萄糖/10% FBS)置換培養基。第3日，將細胞用1×PBS洗滌兩次。在37℃及5% CO₂ 下在組織培養恆溫箱中在具有15 mM葡萄糖之無血清DMEM中用媒劑或用GPR119促效劑以不同濃度(例如，在1 nM至20 μM範圍內)或用弗斯可林(forskolin)(1 μM)作為陽性對照來刺激經洗滌之細胞，歷時1小時。接著收集上清液且藉由以500 g及在4℃下離心來淨化5分鐘。由使用購自Linco Research Laboratory之試劑的ELISA[大鼠/小鼠抑胃多肽(總)ELISA，目錄號EZRMGIP－55K]，按照供應商提供之說明書來測定釋放於上清液中之GIP。

儘管上述說明以為達成說明之目的所提供之實例教示本發明之原則，但應瞭解，本發明之實施涵蓋處於所附申請專利範圍之範疇內的所有常見變更、修改或修正及其等效物。

圖1展示投與GPR119促效劑對野生型小鼠之血液GIP含量之影響的藥效分析。A. 使用化合物1作為GPR119促效劑進行時程分析。B. 使用化合物3作為GPR119促效劑進行時程分析。C. 使用化合物3作為GPR119促效劑進行劑量滴定分析。

圖2展示與野生型小鼠相比投與GPR119促效劑對GPR119缺失(基因剔除)小鼠之血液GIP含量的影響。A. 使用化合物1作為GPR119促效劑進行比較。B. 使用化合物2作為GPR119促效劑進行比較。

<110 >美商艾尼納製藥公司 <120 >使用GPR119受體鑑定可用於增加個體骨質量之化合物之方法 <130 >122.WO1 <140 >096112536 <141 >2007－04－10 <150> 60/791,550 <151> 2006－04－11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213> 智人<400> 1<210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> 智人<400> 2 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 3<210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 4

Claims

一種G蛋白偶合受體(GPCR)用以在活體外方法中鑑定葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)促分泌素之用途，該方法包含以下步驟：(a)使測試化合物與包含該GPCR之宿主細胞或與宿主細胞之膜接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(b)判定該測試化合物刺激該受體功能的能力；其中該測試化合物刺激該受體功能之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項1之用途，其中該方法方法進一步包含：(c)使在步驟(b)中可刺激受體功能之化合物於活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞接觸；及(d)判定該化合物是否刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP；其中該測試化合物刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項1之用途，其中該方法進一步包含：(c)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中GIP含量以判定在步驟(b)中刺激受體功能之化合物是否增加該脊椎動物之GIP含量，該脊椎動物係經先前投予該化合物；其中該測試化合物增加該脊椎動物之GIP含量的能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項1之用途，其中該方法進一步包含：(c)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中骨質量含量以判定在步驟(b)中刺激受體功能之化合物是否增加該脊椎動物之骨質量含量，該脊椎動物係經先前投予該化合物；其中該測試化合物增加該脊椎動物之骨質量含量的能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項3或4之用途，其中該脊椎動物為人類。
如請求項3或4之用途，其中該脊椎動物為非人類哺乳動物。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該受體為重組性的。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼該GPCR之聚核苷酸。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該判定係經由量測第二傳訊者含量來進行。
如請求項9之用途，其中該第二傳訊者係選自由環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、1,4,5-三磷酸肌醇酯(IP₃ )、二醯基甘油(DAG)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)活性及Ca²⁺ 組成之群。
如請求項10之用途，其中cAMP含量係增加的。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該判定係經由使用黑色素細胞檢定、經由量測與包含該GPCR之膜結合的GTPγS或經由報導體檢定來進行。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該宿主細胞為酵母菌宿主細胞。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該宿主細胞為黑色素宿主細胞。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
一種鑑定GIP促分泌素之方法，其包含以下步驟：(a)使G蛋白偶合受體119(GPR119)促效劑於活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞接觸；及(b)判定該GPR119促效劑是否刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP；其中該GPR119促效劑刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP之能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素。
一種鑑定GIP促分泌素之方法，其包含以下步驟：(a)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中GIP含量以判定GPR119促效劑是否增加該脊椎動物之GIP含量，該脊椎動物係經先前投予該GPR119促效劑；其中該GPR119促效劑增加該脊椎動物之GIP含量的能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素。
一種鑑定GIP促分泌素之方法，其包含以下步驟：(a)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中骨質量含量以判定GPR119促效劑是否增加該脊椎動物之骨質量含量，該脊椎動物係經先前投予GPR119促效劑；其中該GPR119促效劑增加該脊椎動物之骨質量含量的能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素。
如請求項20或21之方法，其中該脊椎動物為人類。
如請求項20或22之方法，其中該脊椎動物為非人類哺乳動物。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑對於GPR119受體具有相對於CRF-1受體至少約100倍之選擇性。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於10 μM之EC₅₀ 。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於1 μM之EC₅₀ 。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有口服活性，且具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有口服活性。
如請求項19之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟：(x)使測試化合物與包含GPCR之宿主細胞或與宿主細胞之膜接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)判定該測試化合物刺激該受體功能的能力；其中該測試化合物刺激該受體功能之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(y)所鑑定之可刺激該受體功能之測試化合物。
如請求項20之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟： (x)使測試化合物與包含GPCR之宿主細胞或與宿主細胞之膜接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)判定該測試化合物刺激該受體功能的能力；其中該測試化合物刺激該受體功能之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(y)所鑑定之可刺激該受體功能之測試化合物。
如請求項21之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟：(x)使測試化合物與包含GPCR之宿主細胞或與宿主細胞之膜接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)判定該測試化合物刺激該受體功能的能力；其中該測試化合物刺激該受體功能之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(y)所鑑定之可刺激該受體功能之測試化合物。
如請求項34或35之方法，其中該脊椎動物為人類。
如請求項34或35之方法，其中該脊椎動物為非人類哺乳動物。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該受體為重組性的。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼該GPCR之聚核苷酸。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該判定係經由量測第二傳訊者含量來進行。
如請求項40之方法，其中該第二傳訊者係選自由環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、1,4,5-三磷酸肌醇酯(IP₃ )、二醯基甘油(DAG)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)活性及Ca²⁺ 組成之群。
如請求項41之方法，其中cAMP含量係增加的。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該判定係經由使用黑色素細胞檢定、經由量測與包含該GPCR之膜結合的GTPγS或經由報導體檢定來進行。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該宿主細胞為酵母菌宿主細胞。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該宿主細胞為黑色素宿主細胞。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
一種GPCR用以在活體外方法中鑑定GIP促分泌素之用途，該方法包含以下步驟：(a)在有或無測試化合物存在之情況下使GPCR與該受體之視情況經標記之已知配位體接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(b)偵測該已知配位體與該受體之間的複合物；及(c)判定在有該測試化合物存在之情況下是否比在無該測試化合物存在之情況下形成更少該複合物；其中該判定指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項50之用途，其中該方法進一步包含：(d)使在化合物存在下在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物於活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞接觸；及(e)判定該化合物是否刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP；其中該測試化合物刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項50之用途，其中該方法進一步包含：(d)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中GIP含量以判定在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物是否增加該脊椎動物之GIP含量，該脊椎動物係經先前投予該化合物；其中該測試化合物增加該脊椎動物之GIP含量的能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項50之用途，其中該方法進一步包含：(d)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中骨質量含量以判定在步驟(c)中形成較少該複合物之化合物是否增加該脊椎動物之骨質量含量，該脊椎動物係經先前投予該化合物；其中該測試化合物增加該脊椎動物之骨質量含量的能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項52或53之用途，其中該脊椎動物為人類。
如請求項52或53之用途，其中該脊椎動物為非人類哺乳動物。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該受體為重組性的。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼該GPCR之聚核苷酸。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該已知配位體為GPR119促效劑。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑對於GPR119受體具有相對於CRF-1受體至少約100倍之選擇性。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑具有小於10 μM之EC₅₀ 。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑具有小於1 μM之EC₅₀ 。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項58之用途，其中該GPR119促效劑為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。
如請求項50至53中任一項之用途，其中該受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
如請求項19之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟：(x)在有或無測試化合物存在之情況下使GPCR與該受體之視情況經標記之已知配位體接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列； (vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)偵測該已知配位體與該受體之間的複合物；及(z)判定在有該測試化合物存在之情況下是否比在無該測試化合物存在之情況下形成更少該複合物；其中該判定指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(z)所判定之在其存在之情況下形成較少該複合物之測試化合物。
如請求項20之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟：(x)在有或無測試化合物存在之情況下使GPCR與該受體之視情況經標記之已知配位體接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交； (v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)偵測該已知配位體與該受體之間的複合物；及(z)判定在有該測試化合物存在之情況下是否比在無該測試化合物存在之情況下形成更少該複合物；其中該判定指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(z)所判定之在其存在之情況下形成較少該複合物之測試化合物。
如請求項21之方法，其包含以下在步驟(a)前之額外活體外步驟：(x)在有或無測試化合物存在之情況下使GPCR與該受體之視情況經標記之已知配位體接觸，其中該GPCR包含選自由以下各胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335；(iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係由聚合酶鏈反應(PCR)在人類DNA試樣上使用特異性引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4擴增；(iv)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(v)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；(vi)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vii)(i)或(ii)之生物學活性片段；及(y)偵測該已知配位體與該受體之間的複合物；及(z)判定在有該測試化合物存在之情況下是否比在無該測試化合物存在之情況下形成更少該複合物；其中該判定指示該測試化合物為GIP促分泌素，且其中該步驟(a)之GPCR促效劑為步驟(z)所判定之在其存在之情況下形成較少該複合物之測試化合物。
如請求項70或71之方法，其中該脊椎動物為人類。
如請求項70或71之方法，其中該脊椎動物為非人類哺乳動物。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該受體為重組性的。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼該GPCR之聚核苷酸。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該已知配位體為GPR119促效劑。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑對於GPR119受體具有相對於CRF-1受體至少約100倍之選擇性。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑具有小於10 μM之EC₅₀ 。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑具有小於1 μM之EC₅₀ 。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項76之方法，其中該GPR119促效劑為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。
如請求項69至71中任一項之方法，其中該受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
一種包含GPCR之宿主細胞或宿主細胞之膜用以鑑定GIP促分泌素之用途，其中該宿主細胞或宿主細胞之膜係用於與測試化合物接觸，其中該GPCR包含：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸1-335；(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-335； (iii)由聚核苷酸編碼之GPCR之胺基酸序列，該聚核苷酸係在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1之互補體雜交；(iv)與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之GPCR的胺基酸序列；及(v)具有SEQ ID NO：2之GPCR之組成性活性型式的胺基酸序列；及(vi)(i)至(v)中之任一者之具有GPR119生物學活性之片段其中該測試化合物刺激該受體功能之能力指示該測試化合物為GIP促分泌素。
如請求項87之用途，其中該受體為重組性的。
如請求項87或88之用途，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼該GPCR之聚核苷酸。
如請求項87或88之用途，其中該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項87或88之用途，其中該宿主細胞為酵母菌宿主細胞。
如請求項87或88之用途，其中該宿主細胞為黑色素宿主細胞。
如請求項87或88之用途，其中該測試化合物為具有小於約10,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項93之用途，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。
如請求項87或88之用途，其中該受體包含與SEQ ID NO：2具有至少約80%一致性之G蛋白偶合受體的胺基酸序列。
如請求項87或88之用途，其中該受體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
一種製備醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包含具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑，該方法包含：(a)使GPR119促效劑於活體外與脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞接觸；(b)判定該GPR119促效劑是否刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP，其中該GPR119促效劑刺激自該脊椎動物腸內分泌細胞或可分泌GIP之細胞分泌GIP之能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素；及(c)調配該具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑與醫藥學上可接受之載劑。
一種製備醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包含具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑，該方法包含：(a)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中GIP含量以判定GPR119促效劑是否增加該脊椎動物之GIP含量，該脊椎動物係經先前投予該GPR119促效劑，其中該GPR119促效劑增加該脊椎動物之GIP含量的能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素；及(b)調配該具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑與醫藥學上可接受之載劑。
一種製備醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包含具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑，該方法包含：(a)藉由量測由脊椎動物獲得之試樣中骨質量含量以判定GPR119促效劑是否增加該脊椎動物之骨質量含量，該脊椎動物係經先前投予GPR119促效劑，其中該GPR119促效劑增加該脊椎動物之骨質量含量的能力指示該GPR119促效劑為GIP促分泌素；及(b)調配該具有GIP促分泌素功效之GPR119促效劑與醫藥學上可接受之載劑。
如請求項98或99之方法，其中該脊椎動物為人類。
如請求項98或99之方法，其中該脊椎動物非人類哺乳動物。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑為人類GPR119之促效劑。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑為選擇性GPR119促效劑。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑對於GPR119受體具有相對於CRF-1受體至少約100倍之選擇性。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於選自由10 μM、1 μM及100 nM組成之群之值的EC₅₀ 。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於1 μM之EC₅₀ 。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有口服活性，且具有小於100 nM之EC₅₀ 。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該GPR119促效劑具有口服活性。
如請求項97至99中任一項之方法，其中該測試化合物為具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的小分子。