JP2002523090A

JP2002523090A - 異種ｇタンパク質共役受容体の増強された機能的発現

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Publication number: JP2002523090A
Application number: JP2000567691A
Authority: JP
Inventors: マーク、ヘンリー、ポウシュ; マーガレット、レイ; サンフォード、シルバーマン; カメリア、バーサン; ウィリアム、バウムバウフ; ユージェン、ツェン; アイリーン、マリー、カイコフスキー; ブラッドリー、オールトン、オゼンバーガー
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-09-01
Filing date: 1999-09-01
Publication date: 2002-07-30
Also published as: EP1112359A2; JP2002523091A; WO2000012704A9; AU756244B2; WO2000012705A9; WO2000012705A2; WO2000012705A3; CA2344591A1; WO2000012704A2; EP1123391A2; WO2000012704A3; AU5701199A; AU5700999A; CA2343046A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、構成的に活性な変異型Ｇタンパク質共役受容体、かかる受容体を発現する酵母細胞、かかる細胞を作出するのに有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

発明の分野本発明は活性化リガンドの不在下で受容体の機能的活性の検出を可能にする、
構成的に活性化させる突然変異を含む変異型Ｇタンパク質共役受容体、Ｇタンパ
ク質共役受容体の機能的活性を促進する突然変異を含む宿主細胞、かかる受容体
を発現する宿主細胞、かかる細胞を作出するのに有用なベクター、ならびにそれ
を作出および使用する方法に関する。本発明はまた、改変型Ｇαタンパク質およ
び特にキメラ酵母−哺乳類Ｇαタンパク質、これらの改変型Ｇαタンパク質を発
現する宿主細胞、かかる細胞を作出するためのベクター、ならびにそれを作出お
よび使用する方法に関する。

【０００２】背景技術神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、および光などの多くの細胞外シグナルの
作用は三つ組のタンパク質によって媒介されており、これは酵母から哺乳類にい
たる生物において同定されている。この三つ組は三量体グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質（Ｇタンパク質）に結合した受容体からなり、これが次に細
胞のエフェクターと結合する。これらの受容体は７つのトランスメンブラン・ド
メインを有し、それらのＧタンパク質との会合のために「Ｇタンパク質共役受容
体」（「ＧＰＣＲ」）と名づけられている。

【０００３】調節Ｇタンパク質は３つのサブユニット：グアニルヌクレオチド結合性αサブ
ユニット；βサブユニット；およびγサブユニットからなる(B.R. Conklin and
H.R.Bourne(1993))。Ｇタンパク質はＧＤＰまたはＧＴＰがαサブユニットに結
合しているかどうかによって２つの形態の間を循環する。ＧＤＰが結合している
場合には、Ｇタンパク質はへテロ三量体であるＧαβγ複合体として存在する。
ＧＴＰが結合している場合には、αサブユニットは解離し、Ｇβγ複合体が残る
。重要なことに、Ｇαβγ複合体は細胞膜において活性化されたＧタンパク質共
役受容体と機能し得る形で会合し、ＧＴＰと結合型ＧＤＰの交換率が高まるので
、Ｇβγ複合体からの結合したＧαサブユニットの解離率も高まる。遊離Ｇαサ
ブユニットおよびＧβγ複合体はシグナルを種々のシグナル変換経路の下流エレ
メントに伝達することができる。これら下流の細胞エフェクタータンパク質の例
としては、中でも、アデニレートシクラーゼ、イオンチャンネルおよびホスホリ
パーゼが挙げられる。現象のこの基本的なスキームが種々の細胞シグナル伝達現
象の多様性の基礎をなしている(H.G. Dohlman et al. (1991))。

【０００４】重要な生化学経路におけるそれらの遍在性により、Ｇタンパク質共役受容体は
新規治療薬の重要な標的に相当する。次に、かかる薬剤の発見には高い特異性の
スクリーニングアッセイおよび処理用語で高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）ア
ッセイが必ず必要となろう。Ｇタンパク質共役受容体の機能的発現がなされるよ
う遺伝的に改変された酵母系統などの微生物を利用するスクリーニングアッセイ
は種々の病状に関係する多数の受容体へのリガンド結合に関する研究に著しい利
点を与える。

【０００５】これらのスクリーニングアッセイは所望の宿主細胞におけるＧタンパク質共役
受容体の機能的発現に頼るものである。野生型Ｇタンパク質共役受容体の機能的
発現は、酵母がＧタンパク質共役受容体およびヘテロ三量体Ｇタンパク質を利用
して接合過程を調節するという観察結果に基づいてサッカロミセス・セレビシエ
細胞系おいて開発された、M. Pausch (1997)。半数体酵母細胞はＳＴＥ２および
ＳＴＥ３遺伝子によってコードされるＧタンパク質共役フェロモン受容体への結
合を通して、可能性ある接合パートナーによって分泌されたペプチド接合フェロ
モンの存在を認める。活性化されたフェロモン受容体はＧＰＡ１（α）、ＳＴＥ
４（β）およびＳＴＥ１８（γ）遺伝子によってコードされるヘテロ三量体Ｇタ
ンパク質の解離を触媒する。それにより、Ｇｐａｌｐによって媒介される負の調
節が軽減され、Ｓｔｅ４ｐおよびＳｔｅ１８ｐからなる複合体が有糸分裂活性化
タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）経路のシグナル伝達経路構成エレメント
の活性化が可能となる(M.C. Gustin et al. (1998))。この経路はＦＵＳ３およ
びＫＳＳ１遺伝子によってコードされるＭＡＰキナーゼ相同体およびＳＴＥ７（
ＭＡＰキナーゼまたはＭＥＫ）およびＳＴＥ１１（ＭＥＫキナーゼ）遺伝子によ
ってコードされる上流調節タンパク質キナーゼからなる。この経路の活性化の結
果は細胞周期停止状態およびフェロモン応答性遺伝子の転写誘導である。ＭＡＰ
キナーゼ経路のエレメントの突然変異によりこれらの応答は破壊される。

【０００６】ＦＡＲ１遺伝子産物はフェロモンに応答した細胞周期停止状態を媒介する。Ｆ
ＡＲ１はＧ１サイクリンの負のレギュレーターをコードしており、フェロモン応
答経路と細胞周期調節機構の間の主要な接点として役立っていると考えられてい
る(M.A. Peter et al. (1993))。ＦＡＲ１遺伝子の欠失により、活性化された接
合シグナル伝達経路の存在下での連続細胞増殖およびフェロモン応答性遺伝子の
転写誘導が見込まれる。

【０００７】フェロモン応答経路の慢性刺激に対する酵母細胞応答としては、特定の細胞脱
感作または適応機構の誘導がある。主要な適応機構はＳＳＴ２遺伝子産物、原型
のＲＧＳタンパク質によって媒介されている(H.G. Dohlman et al. (1997))。機
能的Ｓｓｔ２ｐを欠く酵母細胞はフェロモンの存在に対して過敏性を示し、フェ
ロモン誘導性細胞周期停止状態から回復できない。

【０００８】アゴニストに応答する酵母細胞を検出するにはさらなる改変、すなわち、フェ
ロモン応答性レポーター遺伝子の付加が必要である。選択可能な表現型を付与す
るために、ヒスチジン生合成に必要な酵素をコードするＨＩＳ３遺伝子のタンパ
ク質コードセグメントを用いてＦＵＳ１タンパク質コード領域を置換した。従っ
て、ヒスチジンを含まない培地での増殖に必須であるこの酵素の発現がフェロモ
ン応答経路の活性化に依存してなされる。ｈｉｓ３細胞におけるこのＦＵＳ−Ｈ
ＩＳ３レポーター遺伝子のアゴニスト活性化がヒスチジンを含まない培地での増
殖応答をもたらすと予想される。アゴニスト活性化の不在下では、ＦＵＳ−ＨＩ
Ｓ３レポーター遺伝子は大部分は不活性であり、わずかなＨｉｓ３遺伝子産物が
産生されるだけであり、細胞は十分なヒスチジンしを産生できないので増殖でき
ない。ヒスチジンを含むサンプル、例えば天然産物抽出物のスクリーニングを可
能にするには、誘導可能なＧ４１８耐性を付与するレポーター遺伝子を誘導して
もよい。この系において機能的なその他のレポーター遺伝子としては大腸菌ｌａ
ｃＺが挙げられ、これはβガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコード
する。アンタゴニストに関する直接スクリーニングは安定に合成されたＦＵＳ２
−ＣＡＮ１レポーター遺伝子を用いて達成することができる。

【０００９】この技術はこれまでに酵母において発現された、ソマトスタチンＳＳＴ２、ア
デノシンＡ２ａ、コレシストキニンＣＣＫ−Ｂおよび増殖ホルモン放出ホルモン
受容体を同定するために用いられている(L.A. Price et al. (1995), L.A. Pric
e et al. (1996), M.H. Pausch et al. (1998), E.M. Kajkowski et al. (1997)
)。その使用を通して、新規ＳＳＴＲ２選択性アゴニストおよびアンタゴニスト
が、ソマトスタチンのペプチド類似体を基にしてＳＡＲから、R.T. Bass et al.
(1996)、またｄ−アミノ酸ペプチドライブラリーのスクリーニングによって開
発されている(W.R. Baumbach et al. (1998))。この技術の改良法がＬＰＡのリ
ガンド、メラトニンおよびケモカイン受容体を同定するために用いられている(J
.R. Erickson et al. (1998), T. Kokkola et al. (1998), C. Klern et al. (1
998), T.J. Baranski et al. (1999))。

【００１０】しかしながら、野生型受容体で形質転換された微生物は増殖アッセイにおいて
、例えば、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用できないこと、不適当な局在化
および／または脱感作を示して、あまりうまく働かない場合もある。多くのＧＰ
ＣＲは慢性および持続性のアゴニスト刺激に応答してリン酸化されるが、これが
脱感作とそれに続く受容体の隔離またはインターナリゼーションをもたらすこと
も多い。ＧＰＣＲの脱感作はヘテロ三量体Ｇタンパク質との相互作用からの解放
を引き起こす。このプロセスはＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＰＫ）、タ
ンパク質キナーゼＡ（ＰＨＡ）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびカゼイ
ンキナーゼ（ＣＫ）をはじめとする種々の調節受容体タンパク質キナーゼによっ
て媒介されている。インターナリゼーションは受容体により媒介されるエンドサ
イトーシスによる原形質膜からのＧＰＣＲの除去を必要とする。インターナリゼ
ーションを受けた受容体は再循環して細胞表面に戻るか、または分解のためにリ
ソソーム／液胞コンパートメントに送達され得る。ユビキチンによって媒介され
る分解経路もこのプロセスに関与している。受容体リン酸化および隔離／インタ
ーナリゼーションの最終的な結果はしばしば細胞増殖の抑止であり、これにより
スクリーニングアッセイにおける遺伝的に改変された微生物の有用性は著しく低
いものとなる。

【００１１】増殖アッセイにおいて十分に働かないことに加え、その他の問題も多くの野生
型Ｇタンパク質共役受容体スクリーニングアッセイの有用性を妨げている。ヒト
およびその他の種由来のＧＰＣＲをクローニングする最近の努力により、同種リ
ガンドが同定されていないＧＰＣＲをコードすると思われる多数のＤＮＡ配列の
存在が明らかとなっている。これらのいわゆるオーファン受容体は薬剤発見産業
にとっては興味深い問題である。薬剤スクリーニングアッセイを開発する通常の
方法においては、ＧＰＣＲは既知の同種アゴニストとともに異種発現系、例えば
哺乳類細胞、酵母などにおいて発現される。ＧＰＣＲの、細胞内ヘテロ三量体Ｇ
タンパク質と機能的に相互作用する能力は、ＧＰＣＲをその同種アゴニストで活
性化し、次いで結果として得られるＧタンパク質により媒介されるエフェクター
酵素活性の活性化を測定することによって決定される。エフェクター活性の活性
化が好結果であればスクリーニングアッセイが有効であると確認され、薬剤開発
者はＧＰＣＲが適切に発現され機能的であることが確認できる。オーファンＧＰ
ＣＲに関する問題点はオーファンＧＰＣＲの同種アゴニストが知られていないの
で、その発現および機能的活性を確認できないという事実にある。

【００１２】

【発明の概要】

本発明の目的はいずれかの真核細胞、好ましくは酵母細胞において実施される
、高処理量スクリーニングアッセイにおいて十分に機能する改変型Ｇタンパク質
共役受容体およびＧタンパク質を提供することである。従って、本発明の第１の
態様は受容体をヘテロ三量体Ｇタンパク質とより有効に結合させ、かつ／または
細胞脱感作および／もしくは隔離／インターナリゼーション機構と相互作用でき
なくする、かつ／または原形質膜に適当に局在化させることによって、ＧＰＣＲ
の機能を向上させるよう改変されている、Ｇタンパク質共役受容体をコードする
ヌクレオチド配列に向けられる。好ましい態様では、かかる改変は改変型アゴニ
スト刺激性増殖促進能をもたらす。本発明に包含される、Ｇタンパク質共役受容
体をコードするヌクレオチド配列の１つの特定の改変は、いずれかの細胞内ドメ
インまたは内部ドメインに隣接する膜領域における変異である。

【００１３】本発明のもう１つの目的は、高処理量スクリーニングアッセイにおいてその特
異的な同種リガンドが未知であったとしても機能し得る改変型オーファンＧタン
パク質共役受容体を提供することである。従って、本発明の第２の態様では、本
発明に包含されるＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列は受容体活性化に関与
し、構成的に活性なＧＰＣＲの産生をもたらすアミノ酸の改変をコードする。か
かる突然変異はＧＰＣＲ配列全体に生じ得る。特に興味深いものは第２および第
３の細胞内ループに隣接する、およびその内部にある領域ならびにトランスメン
ブランドメイン内の領域における突然変異である。１つの特定の改変として、Ｇ
ＰＣＲ活性化に関与し、ＤＲＹボックスとして知られているロドプシンファミリ
ーＧＰＣＲに見出された保存されたモチーフ、すなわちアミノ酸残基Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒをコードする、第２の細胞内ループに隣接するドメインにおける突
然変異がある。

【００１４】本発明はまた、有利なＧタンパク質結合特性または酵母細胞脱感作および／も
しくは隔離／インターナリゼーション機構を受けないドメインを提供する異種Ｇ
ＰＣＲの細胞内ドメインを用いて、注目されるＧＰＣＲ中の匹敵するドメインが
置換されているキメラＧＰＣＲに向けられる。本発明はまた、改変型ヌクレオチ
ド配列を含んでなる発現ベクター、およびそれで形質転換された宿主細胞に関す
る。

【００１５】本発明の第３の態様では、酵母細胞などの宿主細胞は異種ＧＰＣＲのヘテロ三
量体Ｇタンパク質への結合の改変を促進し、かつ／あるいは受容体キナーゼまた
は脱感作および／もしくは隔離／インターナリゼーション機構に関するその他の
成分を除去する、欠失または点突然変異によって変異させることができる。本発
明の宿主細胞の１つのかかる改変は膜のステロール類の比率または性質に作用す
る突然変異を含む。本発明の宿主細胞の改変のその他の例としては、（１）異種
ＧＰＣＲとの結合を改変する、ヘテロ三量体Ｇタンパク質をコードする宿主細胞
遺伝子における突然変異；（２）受容体リン酸化を減少させる、Ｇタンパク質共
役受容体キナーゼ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣおよび／また
はカゼインキナーゼをはじめとする調節受容体タンパク質キナーゼをコードする
遺伝子の突然変異；および（３）受容体隔離／インターナリゼーションおよび／
または分解を低下させる、ユビキチンにより媒介される経路をはじめとするエン
ドサイトーシスおよび／または分解経路の成分をコードする遺伝子の突然変異が
挙げられる。これらの突然変異の結果として、異種ＧＰＣＲの機能的発現を助け
るよう改変された能力を示す宿主細胞が得られる。

【００１６】本発明の第４の態様はＨＴＳアッセイにおいて十分に機能的なキメラＧタンパ
ク質を発現する宿主細胞を提供することである。これらの宿主細胞はＧタンパク
質のそこで発現された異種ＧＰＣＲへの結合の改変を示し、従って、アゴニスト
の不在下で、発現された異種ＧＰＣＲの結合選択性に関してスクリーニングする
のに、またはオーファンＧＰＣＲの機能的発現を証明するのに有用である。１つ
の好ましいキメラＧタンパク質はＧｐａ１、酵母Ｇαタンパク質由来の配列から
なり、それでは５つのカルボキシ末端アミノ酸が、哺乳類およびその他の脊椎動
物種、昆虫およびその他の無脊椎動物種および種々の真菌種由来のものをはじめ
とする種々の異種Ｇタンパク質αサブユニット由来のもので置換されている。そ
の他の例としては、異種Ｇαタンパク質由来のカルボキシ末端受容体結合性ドメ
インに結合した、Ｇｐａ１由来のアミノ末端Ｇタンパク質βおよびγサブユニッ
ト結合性ドメインからなるキメラＧタンパク質αサブユニットが挙げられる。本発明のさらなる態様はアゴニストによって活性化された宿主細胞においてオ
ーファンＧＰＣＲを機能的に発現させる方法を含む。構成的に活性なＧＰＣＲは
アゴニストの不在下で増殖を促進し得るので、それらが機能的に発現されている
ことを証明するものである。機能的発現は、キメラＧαタンパク質を含む宿主細
胞において構成的に活性なＧＰＣＲを発現させ、それによってＧＰＣＲ−Ｇαタ
ンパク質結合選択性を改変することによってさらに増強され得る。両種の実験の
正の結果を組み合わせれば、ＧＰＣＲは宿主細胞において機能的に発現され得る
という説得力のある証拠が提供される。得られたこの証拠で、ＧＰＣＲは機能的
に発現されており、リガンドの存在に応答し得るという確信をもって、野生型Ｇ
ＰＣＲを用いるＨＴＳアッセイを続行することができる。従って、発現された構
成的ＧＰＣＲを含む宿主細胞は、リガンド結合に関する作用を測定して化合物を
アッセイする改変法に用いてもよい。構成的ＧＰＣＲの作用に帰することができ
る増殖過剰を促進する化合物はアゴニストであり、増殖を阻害するものはアンタ
ゴニストまたは逆アゴニストであると考えられる。

【００１７】

【発明の具体的説明】改変型Ｇタンパク質共役受容体Ｇタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列は、受容体をヘテロ三
量体Ｇタンパク質とより有効に結合させる、かつ／または細胞脱感作および／も
しくは隔離／インターナリゼーション機構と相互作用できなくすることによって
ＧＰＣＲの機能を向上させるよう改変し、下流のシグナル変換経路を活性化させ
ることができる。より高等な真核細胞では、これらの経路には細胞内の環状ＡＭ
Ｐ濃度を変化させるアデニルイルシクラーゼの刺激または阻害、細胞内イノシト
ール三リン酸および／またはカルシウムイオン濃度を高める、と同時にＧタンパ
ク質により調節されるカリウムおよびカルシウムチャンネル、ナトリウム／水素
交換、ならびにその他の膜局在化シグナル伝達タンパク質の活性化に変化をもた
らすホスホリパーゼＣβの刺激が挙げられる。好ましい態様では、かかる改変は
改変型アゴニスト刺激性酵母細胞増殖促進能をもたらす。宿主細胞におけるＧＰ
ＣＲ−Ｇタンパク質結合の改変および／または受容体リン酸化および／もしくは
隔離／インターナリゼーションの排除は有用な酵母細胞増殖応答を刺激できない
野生型異種ＧＰＣＲの機能を改変する手段を提供する。従って、その野生型形態
では機能できないＧＰＣＲが本発明の方法によって働くようになり得る。

【００１８】宿主細胞におけるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合の改変およびまたは受容体リン
酸化および／もしくは隔離／インターナリゼーションの排除は、以下に示される
実施例に記載されたもの、または当業者に公知のものなどの通常の技術を用いる
ことによって評価すればよい。例えば、野生型に対する変異型ＧＰＣＲの機能の
改変はノイズに対するシグナル率、および／または液体バイオアッセイの感度の
有意な増加として定量できる。ノイズに対するシグナル率はアゴニスト誘導性増
殖率とアゴニストの不在下で認められる増殖率とを比較することによって求めら
れる。変異型ＧＰＣＲのアゴニスト刺激に起因するノイズに対するシグナル率の
、野生型受容体を含む細胞から得られる同様の値に対する統計的に有意な増加は
変異型ＧＰＣＲの機能が改変されているということを示す。

【００１９】液体バイオアッセイの感度は半最大増殖率（ＥＤ５０またはＥＣ５０）をもた
らすのに必要なアゴニスト濃度として定義される。野生型ＧＰＣＲによって必要
とされるよりも統計的に有意に低いアゴニスト濃度で変異型ＧＰＣＲが半最大増
殖率を示すならばバイオアッセイの感度は、高まっている。

【００２０】同様に、より定量的な寒天ベースのバイオアッセイは、変異型ＧＰＣＲのアゴ
ニスト刺激によるノイズに対するシグナル率および／または感度の増加を反映す
る。寒天ベースのバイオアッセイでは、ノイズに対するシグナル率の増加は変異
型および野生型受容体の刺激に起因するアゴニスト誘導性増殖領域内の増殖度を
比較することによって求められる。バイオアッセイの感度は増殖領域の半径に比
例する。塗布される化合物は寒天の塗布部位から放射状に拡散するので、アゴニ
スト濃度は増殖領域の半径の二乗で変化する。従って、変異型ＧＰＣＲのアゴニ
スト活性化に応答した増殖領域が大きくなることは感度の上昇を反映している。

【００２１】本発明の実施には、いずれのＧタンパク質共役受容体を用いてもよい。かかる
受容体の例としては、限定されるものではないが、アデノシン受容体、ソマトス
タチン受容体、ドーパミン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン様コリ
ン作動性受容体、αアドレナリン作動性受容体、βアドレナリン作動性受容体、
アヘン受容体、カンナビノイド受容体、ヒスタミン受容体、増殖ホルモン放出因
子、グルカゴン、セロトニン受容体、バソプレシン受容体、メラノコルチン受容
体、およびニューロテンシン受容体が挙げられる。ある好ましい態様では、受容
体はムスカリン様アセチルコリン受容体であり、より好ましくは、このムスカリ
ン様アセチルコリン受容体はＭ３サブタイプのものである。

【００２２】同様に、いずれの好適な宿主細胞を本発明の改変型Ｇタンパク質共役受容体で
形質転換してもよい。好適な宿主細胞の例としては酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫
細胞、および細菌細胞がある。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、哺乳類細胞、
または昆虫細胞である。

【００２３】宿主細胞において発現されるＧＰＣＲの機能を改変する１つの一般化できる方
法として、Ｇタンパク質共役受容体の第３の細胞内ドメイン（ＩＣ３）配列など
のＧＰＣＲの細胞内ドメイン部分の改変または排除によるものがある。脱感作お
よびインターナリゼーション機構はＧＰＣＲの細胞内ドメインに作用するので、
ＧＰＣＲの細胞内ドメインの排除によって、より安定な受容体発現がもたらされ
る。このことは哺乳類細胞で行われた実験において証明されている。受容体イン
ターナリゼーションに関与すると考えられているそれらの第３の細胞内ループの
ドメインを欠くＭ３サブタイプをはじめとするムスカリン様アセチルコリン受容
体は野生型の対応物よりも高い程度まで原形質膜に維持されている(Moro et al.
(1993))。

【００２４】より有効に機能する公知のＧＰＣＲの改変をもたらすこと（例えば改変型のア
ゴニスト刺激性増殖促進能を有すること）に加え、本発明はまた、その機能的活
性がたとえその同種のリガンドが未知であったとしても証明できるオーファンＧ
ＰＣＲの改変を提供する。ＧＰＣＲ活性機構の調査はＧＰＣＲとＧタンパク質と
リガンドとの間の共同の相互作用を説明する三元モデルの提案するに至った(Get
her and B.K. Kobilka (1998))。この提案では配位していないＧＰＣＲはそれ自
体独特の状態、すなわち少なくとも他の２つの平衡状態に遷移中にあり得るＲ、
アゴニストによって安定化される活性状態であるＲ^＊、および逆アゴニストによ
って安定化される不活性状態であるＲ^０で見られる可能性がある。活性状態とは
ヘテロ三量体Ｇタンパク質、それに続くエフェクター酵素活性を刺激し得る形態
である。Ｒ状態にあるＧＰＣＲはそれら自体、他の状態との平衡状態で見られる
ので、リガンドの不在下でＲ^＊またはＲ^０のいずれかへの自然の遷移を受け得る
。

【００２５】ＧＰＣＲ活性化の実験的分析で構成的に活性なＧＰＣＲ変異体（ＣＡＭ）の発
見に至った。ＣＡＭＧＰＣＲは野生型受容体と比較して固有の活性を高めたが
、これはＲからＲ^＊のＲ^＊に向かう平衡状態のシフトと一致し、その結果、アゴ
ニストの不在下で野生型よりも遥かに活性の高いＣＡＭＧＰＣＲをもたらす。
これによりＣＡＭＧＰＣＲはアゴニストに依存的に細胞内ヘテロ三量体Ｇタン
パク質と相互作用してこれを活性化することができるようになる。下流で活性化
されるエフェクター酵素はＧＰＣＲの固有の活性の間接的測定として用いること
ができる。このようにＣＡＭＧＰＣＲは同種のアゴニストを用いる活性化に頼
らずに機能し得ることが示されるかもしれない。ＣＡＭＧＰＣＲのＲ^＊状態の
平衡特性によれば、逆アゴニストが活性化を逆転してＲ^０状態を安定化させ、Ｃ
ＡＭＧＰＣＲを効果的に不活性化し得る。中性のアゴニスト、すなわちアゴニ
ストの結合を阻害してＧＰＣＲの構成的活性レベルに作用することなくアゴニス
トを逆転する薬剤は受容体の活性化状態には作用しない。

【００２６】ＧＰＣＲの異なるいくつかのドメインは活性化プロセスに役割を果たしている
(U. Gether and B.K. Kobilka (1998))。特に注目されるのはＧＰＣＲの第２お
よび第３の細胞内ループに隣接する、またその内部のドメインである。第２の細
胞内ループに隣接し、トランスメンブランドメイン３（ＴＭＤ３）の細胞質側に
あるのはＤＲＹモチーフであり、これはロドプシンＧＰＣＲファミリーで高度に
保存されている。酸性のアスパラギン酸残基が陽子を得ると受容体が活性化する
と考えられる。実際に、α１ａアドレナリン作動性受容体におけるこの残基の突
然変異は受容体を構成的に活性なものとする(A. Scheer and S. Cotecchia (199
7))。最大程度の構成的活性化はＡｓｐ残基に取って代わるアミノ酸の疎水性と
相関している。従って、Ａｓｐ残基を位置指定突然変異誘発法によって疎水性Ｉ
ｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ残基で置換すると、ＣＡＭα１ａアドレナリ
ン作動性受容体が得られる。

【００２７】第３の細胞内ループもまたＧＰＣＲ活性化に役割を果たしている(Lefkowitz e
t al. (1993))。このドメインのＣ末端部分における突然変異はＣＡＭを作出す
る作用を有している。第３の細胞内ループにおけるα１ａアドレナリン作動性受
容体とα２ａアドレナリン作動性受容体の双方における位置指定突然変異は、お
そらくはこのドメインに維持される活性化上の拘束が解除させることによって構
成的活性をもたらす作用を有する。従って、本発明は構成的活性化をもたらすよ
うに改変されたＧＰＣＲを包含する。好ましい改変はＧＰＣＲのＤＲＹボックス
または第３の細胞内ループに対してなされ、構成的に活性な受容体が得られる。

【００２８】膜にまたがるらせんもリガンド結合とＧＰＣＲの活性化に役割を果たしている
。受容体の活性化におけるこれらのドメインの役割はトランスメンブランらせん
において突然変異を構成的に活性化する存在によって示される(Pauwels and T.
Wurch (1998))。実際に、受容体を構成的に活性化する突然変異は第６および第
７のトランスメンブランらせんで見出されている。

【００２９】第３のトランスメンブランらせん内では、重要なアスパラギン酸残基が、生物
起源のアミンリガンドおよびいくつかのペプチドのそれらと同種のＧＰＣＲへの
結合に関与することが知られている。トランスメンブランらせん７におけるこの
アスパラギン酸残基とリジン残基間の塩橋はα１アドレナリン作動性受容体の活
性を制限する(Porter et al. (1998))。この塩橋の形成を妨げる突然変異が構成
的な活性化をもたらす。興味深いことに、トリエチルアミンは部分アゴニスト同
様に働き、塩橋の制限の形成を妨げる。このような機構は、その第３のトランス
メンブランドメインに重要なアスパラギン酸残基を有するいずれのＧＰＣＲを活
性化するにも有用であり得る。

【００３０】第３のトランスメンブランドメイン内でさらなるアミノ酸残基を変異させて構
成的活性をもたらしてもよい。酵母に基づく遺伝子スクリーニングを用い、Ｃ５
ａ受容体の第３のトランスメンブランらせん内の２つの保存されているアミノ酸
における突然変異で構成的活性が得られる(Baranski et al. (1999))。この突然
変異は疎水性のアミノ酸残基を親水性の特徴を有するもので置き換えることであ
った（Ｉ１２４Ｎ、Ｌ１２７Ｑ）。疎水性の特徴はほとんどのＧＰＣＲにおいて
同様の位置で保存的であるので、これらの残基を親水性の特徴を有するものへ改
変することは、ＧＰＣＲを活性化するために一般化できるであろう。

【００３１】第６のトランスメンブランドメインにおける突然変異もまた、構成的活性をも
たらすことが証明されている。ｍ５ムスカリン様アセチルコリン受容体では、第
６のトランスメンブランドメインの系統的突然変異誘発により、構成的変異のホ
ットスポットが明らかになった(Spalding et al. (1998))。第６のトランスメン
ブランドメインのある面に一列に並んでいるアミノ酸残基のクラスターは、ＧＰ
ＣＲ活性化に関与するリガンド依存性のスイッチの形成に関与するものと思われ
る。このホットスポットの同定により、第６のトランスメンブランドメインの他
の受容体の突然変異がＧＰＣＲを活性化するために一般化できる方法をもたらす
ことが示唆される。さらに、ユビキチンにより媒介される、またはユビキチン依
存性の分解に作用する受容体における突然変異はシグナル伝達を増強するのに望
ましいものであると考えられる。さらに詳しくは、ＰＥＳＴ分解シグナルを変更
するＳＴＥ２またはＳＴＥ３におけるものと類似の突然変異が最も有用であろう
。

【００３２】宿主細胞の改変本発明はまた、Ｇタンパク質共役受容体をより効果的に発現させるように宿主
細胞遺伝子を変異させる、または宿主細胞環境を操作することによる、宿主細胞
に対する改変を包含する。好適な宿主細胞の例としては酵母細胞、哺乳類細胞、
昆虫細胞および細菌細胞が挙げられる。

【００３３】 M.S. Brown and J.L. Goldstern (1976)の先駆的な研究以来、膜の特徴がエン
ドサイトーシス、すなわち種々の受容体のインターナリゼーションに作用し得る
ものと考えられている。膜におけるステロール類の比率または性質に作用するM.
S. Brown and J.L. Goldstern (1976)およびK. Tomita et al. (1985)により記
載されたもののような突然変異、またはA. Grider et al. (1996)によって記載
されたもののような処理はエンドサイトーシス効率を変化させる。ステロールの
涸渇も細胞へのウイルス侵入に作用し得る(M.T. Marquardi and M. Kielian (19
96))。哺乳類膜のコレステロールは少なくとも２つの機構、すなわち膜の流動性
の変化および／または特異的な受容体−ステロール相互作用によりＧタンパク質
共役受容体の機能を調整することができる(G. Gimple et al.)。さらに詳しくは
、受容体により媒介されるエンドサイトーシスはＧタンパク質共役受容体の再循
環のための主要な機構であり、継続的なリガンドの存在に対して脱感作をもたら
すことが知られている。酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serev
isiae)では、膜のステロールの性質を変化させるｅｒｇ６遺伝子における突然変
異は、小胞体−ゴルジ体分類における欠損を抑制する(K.G. Hardwick and H.R.B
. Pelham (1994))。最後に、酵母ステロール変異体はエンドサイトーシスおよび
接合効率に欠陥があると報告されている(H. Riezman et al. (1997); R. Gaber
et al. (1989))。

【００３４】宿主細胞膜におけるステロール類の比率または性質の変化はいくつかの方法で
変更でき、これらも本発明の範囲内にある。上記のように、このステロール比率
の変化に作用する機構の１つとして、宿主細胞遺伝子の突然変異によるものがあ
る。あるいは、環境における変化も原形質膜におけるステロールの性質および比
率を変化させてＧタンパク質共役受容体をより効率的に発現させることができ、
これらも本発明の範囲内に包含される。

【００３５】ｅｒｇ６欠失法による細胞ステロールの変更の他、好適な宿主細胞改変の他の
例としては、限定されるものではないが、（１）ＧＰＣＲシグナル伝達に作用す
る種々のステロール変化を有する細胞をもたらす、ｅｒｇ２、ｅｒｇ３、ｅｒｇ
４およびｅｒｇ５などの他のステロール酵母変異株の使用、および（２）外から
加えたステロールの存在下で細胞を増殖させる酵母変異株の使用が挙げられる。
具体的には、ＳＵＴ１、ＰＤＸ３、ＵＰＣ１またはＵＰＣ２（ＵＰＣ２０）遺伝
子における変異は、外から加えたステロールの存在下で宿主細胞を増殖させる有
用な変異体を提供する。さらに、ｈｅｍｅ（ｈｅｍ）変異体のいずれを使用して
もよく、特にｈｅｍ１およびｈｅｍ３変異体が外から加えたステロールの存在下
で宿主細胞を増殖させる。外から加えられる好適なステロールとしては、限定さ
れるものではないがコレステロールがあり、細胞が増殖する培地に加えられる。
細胞はかかるステロールを膜に取り込むので、以下の実施例で記載されるものと
同様の方法で、異種で発現したＧＰＣＲシグナル変換をこれらの細胞でアッセイ
される。

【００３６】宿主細胞ステロールの改変の他、本発明の宿主細胞に対する改変の他の例とし
ては、異種ＧＰＣＲとの結合を向上させるヘテロ三量体Ｇタンパク質をコードす
る宿主細胞遺伝子における突然変異；Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ、タンパ
ク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣおよび／またはカゼインキナーゼをはじ
めとする調節受容体タンパク質キナーゼをコードする遺伝子の、受容体のリン酸
化を減少させる突然変異；ならびにユビキチンにより媒介される経路をはじめと
するエンドサイトーシスおよび／または分解経路の成分をコードする遺伝子にお
ける、受容体の隔離／インターナリゼーションおよび／または分解を低下させる
突然変異が挙げられる。さらに詳しくは、多くの遺伝子における条件付き変異ま
たは機能獲得変異もしくは機能喪失変異はフェロモン経路のシグナル伝達の増強
ももたらし得る。かかる突然変異は、再循環する受容体を含み得る小胞体の分類
に作用することにより直接的または間接的にエンドサイトーシスに作用する。こ
の点で最も有用であると考えられる遺伝子としては、限定されるものではないが
、ＡＳＧ７、ＤＮＭ１、ＳＴＥ５、ＣＤＣ５、ＣＤＣ３０、ＤＰＭ１、ＣＡＳ１
、ＳＳＯ１、ＳＳＯ２、ＳＥＣ９、ＳＲＯ７、ＲＨＯ３、ＧＣＳ１、ＧＬＯ３、
ＧＬＬ４、ＡＫＲ１、ＹＣＫ１、ＹＣＫ２、ＥＮＤ３、ＵＤＩ１、ＳＣＤ５、Ｅ
ＮＤ４、ＥＮＤ５、ＶＰＳ２３（＝ＳＴＰ２２）、ＳＮＦ７、ＳＮＦ８、ＶＰＳ
２、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ１、ＶＰＳ８、ＶＰＳ２７、ＶＰＳ３６およびＫＡＰ１
０４が挙げられる。

【００３７】キメラＧαタンパク質本発明はまた、Ｇタンパク質とＧタンパク質共役受容体間の結合効率を向上さ
せるキメラＧαタンパク質を包含し、従ってこれを用いて宿主細胞におけるＧタ
ンパク質共役受容体の機能的発現を増強することができる。好ましい態様では、
キメラＧαタンパク質はＧＰＡ１対立遺伝子によってコードされる酵母−哺乳類
Ｇαタンパク質である。

【００３８】ＧＰＣＲが結合するＧタンパク質種はアゴニストの活性化に応答したエフェク
ター産生量を決定する。ＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を決定する現行の方
法は、複数の哺乳類細胞系統を構築して、いくつかのエフェクタータンパク質の
活性をアッセイする必要があるので、労力と時間がかかるものである。本発明は
単一のキメラＧαタンパク質を発現する宿主細胞を用いることによりＧＰＣＲ／
Ｇタンパク質結合特異性を決定するプロセスを簡略化かつ迅速化した。これらの
宿主細胞は酵母におけるＧＰＡ１遺伝子座など、Ｇαタンパク質をコードする染
色体の遺伝子座の組込み置換によって構築できる。この組込み置換の目的は、内
因性のアミノ末端Ｇβγとエフェクター分子相互作用ドメインが哺乳類Ｇαサブ
ユニット遺伝子由来のＤＮＡ配列によってコードされるカルボキシ末端ＧＰＣＲ
Ｇ相互作用ドメインと融合している、αタンパク質をコードするキメラ遺伝子を
作り出すことである。

【００３９】酵母では、このようなキメラ遺伝子は好ましくはＧＰＡ１遺伝子座に組み込ま
れる。安定状態のＧＰＡ１ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、接合シグナル変
換経路の活性化程度により決定される(G.F. Sprague et al. (1992), C. Dietze
l et al. (1997), I. Miyajima et al. (1987), M. Nakafuku et al. (1987))
。フェロモンが活性化されない場合、ＧＰＡ１対立遺伝子は低い基礎発現レベル
を維持する。経路が活性化されると、ＧＰＡ１ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル
は数倍高まり、応答の感受性に即座の増強をもたらす。さらにヘテロ三量体複合
体のＧβγサブユニットと相互作用するのに必要なものより過剰量のＧＰＡ１レ
ベルの増強はこの経路のダウンレギュレーションをもたらす。従って、接合応答
過程でのＧＰＡ１レベルの適当な調節は応答の感受性および持続時間の決定に重
要である。

【００４０】本発明のキメラＧＰＡ１遺伝子は、ＧＰＡ１のアミノ末端Ｇβγおよびエフェ
クター分子をコードする配列であって、限定されるものではないが、Ｇαｉ２、
Ｇαｉ３、Ｇα０、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇαｚ、Ｇα１１、Ｇα１１、Ｇα１２、
Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５およびＧα１６をはじめとする哺乳類Ｇタンパク
質αサブユニット由来のカルボキシ末端をコードする別の配列と融合した配列を
含み得る。あるいは、５カルボキシ末端アミノ酸をコードする配列は、限定され
るものではないが、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇα０、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１１、
Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５およびＧα１６をはじめとす
る哺乳類Ｇタンパク質αサブユニット由来の配列をコードする同等のもので置換
してもよい。

【００４１】キメラＧαタンパク質は、限定されるものではないが、ラット・ソマトスタチ
ンＳＳＴＲ２、ラット・アデノシンＡ２ａ、ラット・ムスカリン様アセチルコリ
ンＭ２およびＭ３、Ｄ．メラノガスタームスカリン様アセチルコリンＭ１、ラッ
ト・ニューロテンシンＮＴ−１、ヒト・バソプレシンＶ２、ラット・コレシスト
キニンＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂ、ヒト・ゴナドトロピン放出ホルモンＧｎＲ
Ｈ、ヒト・メラノコルチンＭＣＲ４、ヒト・アドレナリン作動性α２Ａ、アプリ
スタ・カリフォルニカ・オクトパミンＯＡ１、ヒト・ボンベシン受容体関連配列
３（ＢＲＳ３）、ヒト・ヒスタミンＨ３、ならびにヒトβ２アドレナリン作動性
受容体をはじめとする種々のＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を分析するのに
使用できる。例えば、上記のキメラＧＰＡ１遺伝子を含む酵母細胞は異種ＧＰＣ
Ｒの発現を付与するプラスミドで形質転換することができる。次ぎに同種のＧＰ
ＣＲアゴニストの活性はフェロモン応答性ＨＩＳ３レポーター遺伝子の用量依存
的誘導を通して検出できる。従って、キメラＧαタンパク質を発現する宿主細胞
は、Ｇタンパク質共役受容体のＧタンパク質結合活性を同定する一般的に有用な
手段を提供する。

【００４２】

【実施例】

以下、実施例において、本発明の代表的な態様を詳しく説明する。例１酵母における変異型ラットＭ３のムスカリン様アセチルコリン受容体（Ｍ
ＡＲ）の機能的発現ＧＰＣＲの第３の細胞内ループはＧタンパク質と相互作用してアゴニスト結合
の際にＧタンパク質の活性化に関与すると考えられている(J. Wess(1997))。酵
母接合フェロモン受容体Ｓｔｅ２およびＳｔｅ３のＩＣ３における突然変異はＧ
タンパク質の結合に対して著しい影響を及ぼす（C. Boone et al. (1993) and C
. Clark et al. (1994)）。重要なことは、哺乳類のＭＡＲ、特にラットＭ３
ＭＡＲのＩＣ３部分の欠失が、ヘテロ三量体Ｇタンパク質Ｇｑ（Ｇαβγ）と結
合するための十分な能力を保持する哺乳類細胞における改変された機能的発現と
相関していることである。変異型Ｍ３ＭＡＲはすべての外部ループを保持して
いる。トランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）およびＩＣ３以外の内部ドメイン
は変化しない。５番目と６番目の膜にまたがるらせんの間に見られるこのＩＣ３
は、改変された唯一のドメインであった。このドメインの大部分、ＩＣ３の中心
の９６個のアミノ酸（Ａｌａ２７３−Ｌｙｓ４６９）が欠失しており、５番目お
よび６番目のトランスメンブランらせん双方に隣接したわずか２２個のアミノ酸
が残っていた。このように、野生型Ｍ３ＭＡＲのＩＣ３のアミノ酸が２４０個
であるのに対し、ＩＣ３欠失（ＩＣ３Δ）を含むＭＡＲの第３の細胞内ループは
４４個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、細胞の脱感作機構と相互作用
して、より機能的なＭＡＲを細胞表面に持たせることが知られているドメインの
排除によるものかもしれない。

【００４３】このＩＣ３Δ変異も酵母における機能的発現を改変することができるかどうか
を検討するために、標準的な方法により、野生型およびＩＣ３ΔラットＭ３Ｍ
ＡＲをコードするＤＮＡ配列を、酵母発現プラスミドｐ４２６ＧＰＤ中のグリセ
ロール−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの近位にクローン化した。ラット
Ｍ３ＭＡＲ配列を、５’ＢｇＩII（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴ
ＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣ）（配列番号１）および３’Ｘ
ｈｏＩ（ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣ
ＧＧＣＡＣＴＣＧＣ）（配列番号２）部位を含むオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、精製してｐ４２６ＧＰＤの適当な部位に連結した。ラットＭ３
ＩＣ３Δを形成するために、３つのＭ３ＭＡＲ断片をＰＣＲ法により増幅した
。アミノ末端をコードする断片を５’ＢｇＩII（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡ
ＡＴＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣ）（配列番号１）お
よび３’ＡｇｅＩ（ＡＴＡＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＴ
ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣ）（配列番号３）部位を含むオリゴヌクレオチド
を用いて増幅した。カルボキシ末端をコードする断片は５’ＰｍＩＩ（ＧＣＣＴ
ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣ）（配列番号４）
および３’ＸｈｏＩ（ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧ
ＣＴＣＣＧＧＣＡＣＴＣＧＣ）（配列番号２）部位を含むオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。ＩＣ３をコードする断片は、Ｍ３ＩＣ３Δ配列を
用い、５’ＡｇｅＩ（ＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＴ
ＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＴＡＴ）（配列番号５）および３’ＰｍＩＩ（ＧＴ
ＴＧＴＡＧＧＧＧＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣ）（配列番号
６）部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて増幅した（J. Wess (1997)）。得ら
れたＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、精製してｐ４
２６ＧＰＤ中の適当な部位に連結した。プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ
マッピングおよびＤＮＡ配列決定法により確認した。得られたプラスミドを、従
来の酢酸リチウム形質転換法を用い、参照することにより本明細書の一部とされ
る米国特許第５，６９１，１８８号に記載のものなど、具体的にはPaush et al.
(1998)および例９の表３に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとするＧＰＣ
Ｒアゴニスト刺激性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した。

【００４４】ＭＡＲを含む酵母細胞を、ＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｈ）を用いて
液体培養液中でアッセイした。この細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培
地中で一晩培養した。基礎増殖速度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリ
アゾールを含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で細胞を
５００倍に希釈した。ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サンプル（１０ ^−１〜１０^−８Ｍ）２０μｌを含有する、滅菌９６ウェルマイクロタイターディ
ッシュのウェルに細胞懸濁液サンプル（１８０μｌ）を分注した。このプレート
を３０℃にて１８時間、振盪しつつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。増殖
はマイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ_６２０における記録値の増加により
モニターした。アッセイは２回行い、酵母細胞の対数増殖期に増殖速度を測定し
た。GraphPad Prismを用いて光学的密度の測定値を分析し、平均値±標準誤差と
して表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図１に示されるように、Ｍ３
ＭＡＲＩＣ３Δを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答をし、Ｍ３
ＭＡＲＩＣ３Δが機能していることが示されたが、酵母細胞のアゴニスト依存
性増殖が認められなかったので野生型ＭＡＲは機能していない。Ｍ３ＭＡＲ
ＩＣ３Δを含む細胞の増殖応答は用量依存的であり、カルバコール（ＣＣｈ）に
対するＥＣ_５０は３μＭに相当した。この値は、ＨＥＫ細胞において得られたＣ
Ｃｈに対するＫ_Ｄ値（７．９μＭ）および、ＣＣｈ誘導ＩＰ_３（イノシトール３
リン酸）蓄積に関するＥＣ_５０（４．０μＭ）に匹敵したが、このことはＭ３
ＭＡＲＩＣ３Δが酵母細胞膜で発現した場合、期待される薬理学的特性を保持
することを示唆するものである。さらに、増殖応答はＭＡＲ特異的アンタゴニス
トであるアトロピン（Ａｔ）により阻害される。

【００４５】あるいは、Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む酵母細胞によるＣＣｈに対する応答
は、その発現がＭＡＲアゴニストにより刺激される緑色蛍光タンパク質レポータ
ー遺伝子の、アゴニストにより誘導される蛍光発光の増加量の測定により観察さ
れ得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はクラゲ(Aequorea)由来のタンパク質で
あり、酵母細胞内で発現した場合、内因的蛍光を有する。ＧＦＰ由来の蛍光は生
存酵母菌において検出可能で、その発現レベルは酵母細胞を損傷することなく測
定できる。この特徴は、その検出のために付加的な工程を必要としないのでレポ
ーター遺伝子アッセイにおいて特に有利である。酵母中で発現した異種ＧＰＣＲ
のアゴニスト活性化検出に有用な誘導性レポーター遺伝子は、シグナル変換経路
と交わることにより活性化される転写プロモーターを利用する。かかるプロモー
ターの１つがＦＵＳ２プロモーターである。アゴニスト刺激がない状態では、Ｆ
ｕｓ２タンパク質またはその発現がＦＵＳ２プロモーターによって命令される他
のいずれかのタンパク質の発現もほとんど、または全く検出されない。アゴニス
ト処理後、ＦＵＳ２プロモーターからの転写が７００倍にまで誘導され、Ｆｕｓ
２の発現、またはその発現がＦＵＳ２プロモーターの制御下にある遺伝子産物の
いずれかの発現の実質的な増加が起こる。このように、ＦＵＳ２−ＧＦＰレポー
ター遺伝子由来のＦＵＳ２プロモーター制御下でのＧＦＰ発現の結果得られる酵
母細胞の蛍光は異種ＧＰＣＲのアゴニスト活性化後のみに認められる。

【００４６】ＧＦＰレポーター遺伝子を産生するために、増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ、Cl
onetech）、ＦＵＳ２プロモーター、およびＦＵＳ２転写ターミネーター配列を
コードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅した。これらの断片をプラスミドｐ
ＲＳ４１４を含む動原体に組み込んで、ＥＧＦＰ発現をプラスミドｐＲＳ４１４
を含む動原体のフェロモン応答性ＦＵＳ２プロモーターの制御下に置いてｐＭＰ
２４１を作出した。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用
い、Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む細胞のＧＰＣＲアゴニスト刺激による増殖ア
ッセイを行うのに有用な、米国特許第５，６９１，１８８号に記載の種類の酵母
細胞中に導入した。

【００４７】Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む酵母細胞およびＦＵＳ２−ＥＧＦＰ受容体プラ
スミドを、液体培養液中でＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｂ）を用いてア
ッセイした。この細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養し
た。細胞を洗浄し、基礎増殖速度を低下させるために５ｍＭの３−アミノトリア
ゾールを含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５倍希釈
した。細胞懸濁液サンプル（１８０μｌ）を、ＣＣｈの連続希釈サンプル（１０ ^−１〜1０^−８Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイターディッ
シュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で６時間、振盪しつつ（６００
ｒｐｍ）インキュベートした。ＦＵＳ２−ＥＧＦＰレポーター遺伝子発現の刺激
は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、４８０ｎｍ光で励起した後の５３
０ｎｍにおける発光の増大を記録することによりモニターした。アッセイは２回
行い、測定値は酵母細胞の対数増殖期に得た。蛍光発光の測定値は、GraphPad P
rismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロ
ットした。図１Ｂに示されるように、Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む酵母細胞は
蛍光発光における用量依存的な増大を示し、それはアゴニスト誘導性ＦＵＳ２−
ＧＦＰレポーター遺伝子構築体由来のＥＦＧＰ発現の増大と一致していた。ＣＣ
ｈ刺激の蛍光発光に対するＥＣ_５０は４μＭであり、これは増殖アッセイにおい
て得られた値と同じであった。

【００４８】このように、ラットＭ３ＭＡＲにおけるＩＣ３部分の欠失は、酵母において
発現した場合に機能的ＧＰＣＲが産生されたが、このことは内部ドメインの改変
が酵母において発現した異種ＧＰＣＲの機能改変のために一般化できる方法であ
り得ることを示唆するものである。

【００４９】例２酵母における変異型Ｄ．メラノガスター・ムスカリン様アセチルコリン受
容体の機能的発現Ｇタンパク質共役昆虫ムスカリン様アセチルコリン受容体（ＭＡＲ）のアゴニ
ストは、実質的な殺虫力および殺ダニ力を有している（M.R. Dick et al. (1997
)）。これらの知見から、昆虫ＭＡＲに対して有効なアゴニストに関する酵母に
基づく高処理量スクリーニング法（ＨＴＳ）の開発は、新規の作用様式の殺虫剤
に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有用であることが示唆される。予
備実験から、昆虫のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である野生型Ｄ．メラ
ノガスターＭＡＲ（ＤＭＡＲ）は、酵母中では機能しないことが示されている。
このように、ＤＭＡＲＩＣ３をＭ３ＭＡＲＩＣ３Δ由来の機能的ＩＣ３と
置換することで、酵母におけるＤＭＡＲの機能を向上させる方法を開発する努力
が始められた。

【００５０】昆虫細胞において、ＤＭＡＲはヘテロ三量体Ｇｑタンパク質と相互作用し、ム
スカリン様アゴニストに応答して細胞内カルシウムを増加させる。酵母中でＤＭ
ＡＲが不活性であることに対する、可能性のある説明の１つに、酵母のヘテロ三
量体Ｇタンパク質と効率的に結合できないことが挙げられる。従って、酵母にお
いてＤＭＡＲ機能を改変する方法を考案するために、機能的発現の改変およびヘ
テロ三量体Ｇタンパク質との結合に働きを有するＧＰＣＲにおける選択的突然変
異を検討した。

【００５１】ＩＣ３置換体を構築するために、標準的な方法により３つのドメインをコード
するＰＣＲ断片を調製した。断片１は５番目のＴＭＤ内のショウジョウバエＭＡ
Ｒのアミノ末端コード部分からＡｇｅＩ部位までからなり、オリゴヌクレオチド
（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡ
ＡＣ）（配列番号７）および（ＣＣＡＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴ
ＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡ
ＧＴＧＣ）（配列番号８）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ＤＭＡＲの第２
の断片は、６番目のＴＭＤ中のＰｍII部位から始まるカルボキシ末端コード配列
からなり、オリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧ
ＴＡＣＡＡＣＡＴＣ）（配列番号９）および（ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣ
ＴＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＣ）（配列番号１０）を用いてＰＣＲ法により
増幅した。このＭ３ＭＡＲＩＣ３Δドメインを、例１に記載された断片１お
よび２とともにフレーム内にコード配列を有するＡｇｅＩ−ＰｍII断片として増
幅した。これらの断片をプラスミドｐ４２６ＧＰＤに組み込んで、変異型ＤＭＡ
ＲをＧＰＤプロモーターの制御下に置いた。この野生型ＤＭＡＲを、米国特許第
５，６９１，１８８号に記載された発現ベクターｐＭＰ３中にクローン化した。
得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，
６９１，１８８号に記載の種、特にPausch et al. (1998)および例９の表３に記
載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとする、ＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖アッ
セイを行うのに有用な酵母細胞に導入した。

【００５２】ＤＭＡＲを含む酵母細胞および野生型ＤＭＡＲを含むプラスミドを、液体培養
液中でＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｂ）を用いてアッセイした。この細
胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。この細胞を、基
礎増殖速度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ
−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地（ｐＨ６．８）に５００倍希釈した。細胞懸
濁液サンプル（１８０μｌ）を、ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サン
プル（１０^−１〜1０^−８Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイ
ターディッシュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１８時間、振盪し
つつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。アッセイは２回行い、増殖速度測定
は酵母細胞の対数増殖期に行った。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用い
て解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。
図２に示されたように、変異型ＤＭＡＲ、すなわちＭ３ＭＡＲＩＣ３Δを含
む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示し、ＤＭＡＲ−Ｍ３ＭＡＲＩ
Ｃ３Δは機能していることが示された。野生型のＤＭＡＲはアゴニスト依存性酵
母細胞増殖が起こらなかったことにより示されるように機能しなかった。

【００５３】例３酵母における変異型ラット・コレシストキニンＣＣＫＢ受容体の機能的発
現例１および２で示したように、哺乳類ＭＡＲ、特にラットＭ３ＭＡＲのＩＣ
３部分の欠失は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と結合するための完全な能力を保持
した哺乳類および酵母細胞の機能的発現の改変と相関する。このＩＣ３Δ突然変
異がまた酵母において他のＧＰＣＲの機能的発現を改変することができるかどう
かを検討するために、ラット野生型およびＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受
容体をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅して、標準的な方法により、
酵母発現プラスミドｐ４２６ＧＰＤ中のグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼプ
ロモーターの近位へクローン化した。野生型ＣＣＫＢＲは、オリゴヌクレオチド
（ＡＣＴＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣ
Ｇ）（配列番号１１）および（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ
ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）を用いてＰＣＲ法により増幅した。Ｉ
Ｃ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体は、２つの重複する断片を融合すること
により調製した。断片１は５番目のＴＭＤに隣接した２２個のアミノ酸を含むア
ミノ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＧＧ
ＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＧＣ）（配列番
号１３）および（ＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡ
ＣＣＧＴＴＧＧＧＣ）（配列番号１４）を用いてＰＣＲ法により増幅した。断片
２は６番目のＴＭＤに隣接した２２個のアミノ酸を含むカルボキシ末端コード配
列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド（ＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣ
ＣＧＣＧＧＣ）（配列番号１５）および（ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧ
ＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣ）（配列番号１６）を用いてＰＣＲ法によ
り増幅した。この２つの断片を、全長ＣＣＫＢ受容体の５’および３’末端でオ
リゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅させて融合させた。得られたプラ
スミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，６９１，１８
８号に記載のものなど、特にはPausch et al. (1998)および例９の表３に記載の
ＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとするＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖アッセイを
行うのに有用な酵母細胞中に導入した。

【００５４】野生型およびＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母株を、２ｍ
ｌのグルコース（２％）を含む合成完全液体培地およびウラシル欠損（ＳＣＤ−
ｕｒａ）培地で一晩増殖させた。この寒天ベースのプレートアッセイでは、０．
５ｍＭＡＴ（３−アミノトリアゾール）を含有する、融解させた（５０℃）Ｓ
ＣＤ−ｕｒａ−ｈｉｓ寒天培地（３５ｍｌ、オートクレーブにかける前に濃ＫＯ
ＨまたはＮＨ_４ＯＨを加えてｐＨ６．８に調整）に、一晩培養したもの（２×１
０^４細胞／ｍｌ）を播種し、正方形（９×９ｃｍ）のペトリプレートに注いだ。
ＤＭＳＯ（１ｍＭ、１０μｌ）中のＣＣＫアゴニスト溶液を固化した寒天の表面
に塗布した（上部左、ＣＣＫ８Ｓ；上部右、ＣＣＫ８ＵＳ；下部左、ＣＣＫ５；
下部右、ＣＣＫ４）。プレート表面に塗布した化合物は、塗布した部位から放射
状に拡散し、寒天中に包埋されている細胞表面で発現したＣＣＫＢ受容体と結合
し、その結果ＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現が誘導される。応答している細胞は高密度
の増殖領域を形成し、基礎的なＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現に応答して見られる限ら
れた細胞増殖とは容易に区別できる。プレートを３０℃で３日間インキュベート
した（図３）。図３ＡはＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母細
胞の強い増殖応答を示しているが、図３Ｂは野生型ＣＣＫＢ受容体を含む酵母細
胞の限られた増殖を示しているに過ぎず、このことより、ＣＣＫＢ受容体の第３
の細胞内ループ部分の欠失が酵母においてその機能を改変したことが示される。

【００５５】例４酵母における変異型ラット・ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）の機能的
発現第３の細胞内ループは、Ｇタンパク質共役、脱感作および様々な改変タンパク
質との相互作用を含む、多くのＧＰＣＲ機能に関与する。ソマトスタチン受容体
はＳＳＴＲ１−５と表示される５つのサブタイプにコードされている。ＳＳＴＲ
３サブタイプの第３の細胞内ループ内にはいくつかのアミノ酸が認められるが、
ＳＳＴＲ２サブタイプの同領域には認められない。ＳＳＴＲ２は酵母中で有効に
機能するため、ＩＣ３からのこれらのアミノ酸の欠失がＳＳＴＲ３にこの機能的
有効性を付与するものと考えられる。このように、８個のアミノ酸Ｇｌｎ−Ｔｒ
ｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１７）がｒＳＳＴＲ３
ｃＤＮＡの第３の細胞内ループから欠失しており、酵母内でより有効な受容体
シグナル伝達を可能にしている。

【００５６】ラットＳＳＴＲ３配列は、５’ＢｇＩIIおよび３’ＸｈｏＩ部位を含むオリゴ
ヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅した。得られた約１．３ｋｂのＰＣＲ
産物をＢｇＩIIおよびＸｈｏＩで消化して精製し、ｐ４２６ＧＰＤのＢａｍＨＩ
とＸｈｏＩ部位の間に挿入してプラスミドｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３を作出
した。組換えプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ配列決定法
により確認した。

【００５７】ｒＳＳＴＲ３ｃＤＮＡの増幅には標準的なＰＣＲ反応を用い、以下のような
３６ｂｐの重複を有する２つのＰＣＲ断片を得た。５’ＢｇＩオリゴヌクレオチ
ド（ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＴＡＴ
）（配列番号１８）および３’オリゴヌクレオチド（ＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣ
ＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＣＧ（配列番号１９））
を用いて、おおよそのサイズが７５０ｂｐのＰＣＲインサートＡを作出した。５
’オリゴヌクレオチドＧＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＴＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＧＣ
ＣＧＣＴＣＴＧＡＧ（配列番号２０）および３’ＸｈｏＩオリゴヌクレオチド
（ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴ）（
配列番号２１）を用いて、おおよそのサイズが５３０ｂｐのＰＣＲインサートＢ
を作出した。ＰＣＲ断片ＡおよびＢをゲル精製し、アニーリングして、フランキ
ング５’ＢｇＩIIおよび３’ＸｈｏＩオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法によ
り増幅し、約１．３ｋｂのｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３のＰＣＲ産物を得た。精し、Ｂ
ｇＩII−ＸｈｏＩで消化した後、ｒＳＳＴ３ΔＩＣ３インサートをｐ４２６ＧＰ
ＤのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に連結してプラスミドｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴ
Ｒ３ΔＩＣ３を作出した。制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定により、適切な
読み取り枠と配列を確認した。

【００５８】米国特許第５，６９１，１８８号に記載の、ＧＰＣＲの発現のために有用なタ
イプの酵母細胞、特にPausch et al. (1998)および例９の表３に記載のＭＰＹ５
７８ｆｃを、標準的な方法を用いて、ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３およびｐ４
２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換した。この細胞を、例３に記載の
寒天に基づくバイオアッセイ法を用いてアッセイした。ソマトスタチン（Ｓ−１
４、１ｍＭ）のサンプル（１０μｌ）をＳＳＴＲ３を発現する酵母細胞を含有す
る選択寒天培地の表面に塗布した。このプレートを３０℃で３日間インキュベー
トした。ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３とともにｐＬＰ８２で形質転換された酵
母細胞（Ｇｐａｌ／Ｇａｉ２キメラＧタンパク質発現プラスミドを含有）は、Ｓ
−１４に対して弱い増殖応答を示したが（図４Ａ）、ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴ
Ｒ３ΔＩＣ３を同条件下でアッセイした場合にはより強い応答が認められた（図
４Ｂ）。これらの結果は、ＩＣ３部分の欠失により、酵母におけるＳＳＴＲ３の
機能が改変されることを示す。

【００５９】例５ＩＣ３欠失ヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体および酵母において機能
的に発現されるその構成的に活性な変異体例１〜４で示したように、哺乳類ＧＰＣＲのＩＣ３部分の欠失は、ヘテロ三量
体Ｇタンパク質との結合に関して十分な能力を保持した哺乳類および酵母細胞に
おける改変型の機能的発現と相関している。変異型ＭＡＲ、ＣＣＫＢＲ、および
ＳＳＴＲ３は全外部ループを保持している。ＩＣ３以外のトランスメンブランド
メインおよび内部ドメインは変化していない。膜にまたがるらせんの５番目と６
番目の間に見出されるＩＣ３が、改変された唯一のドメインである。５番目と６
番目のトランスメンブランらせんの双方に隣接する２２個のアミノ酸だけを残し
て、このドメインの大部分が欠失していた。このように、ＩＣ３欠失（ＩＣ３Δ
）を含むＧＰＣＲのＩＣ３は４４個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、
細胞脱感作機構と相互作用することが知られているドメインが除去されて、より
機能的なＭＡＲが細胞表面に保持されることによるものであろう。

【００６０】他のＩＣ３Δ変異も酵母における他のＧＰＣＲの機能的発現を改変するかどう
かを検討するために、ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体をコードす
るＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅して、標準的な方法により、酵母発現プラス
ミドｐ４２６ＧＰＤのグリセロール−リン酸ジヒドロゲナーゼプロモーターの近
位にクローン化した。このＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体は、２
つの重複する断片を融合させることにより作出した。断片１は５番目のＴＭＤに
隣接する３９個のアミノ酸を含むアミノ末端コード配列を含んでおり、これはオ
リゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＧＧＡＣＧＣ）（配列番号１３）および（ＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧ
ＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＧＧＣ）（配列番号１４）を用
いてＰＣＲ法により増幅した。第２の断片は６番目のＴＭＤに隣接した４１個の
アミノ酸を含むカルボキシ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオ
チド（ＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣ）（配列番号１５）および
（ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣ）
（配列番号１６）を用いてＰＣＲ法により増幅した。この２つの断片を、全長α
２Ａアドレナリン作動性受容体の５’および３’末端でオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲ法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢酸
リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，６９１，１８８号に記載のもの、特
にPausch et al. (1998)および例９の表３に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞などの
ＧＰＣＲアゴニスト−刺激性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した
。

【００６１】構成的に活性なＧＰＣＲの、同種のアゴニストの不在下で酵母増殖応答を誘導
する能力を検討するため、構成的に活性な変異体（ＣＡＭ）ヒトα２Ａアドレナ
リン作動性受容体から同様の構築体を作出した。このＣＡＭ受容体はトレオニン
残基３７３からリジンへ変化する点突然変異（Ｔ３７３Ｋ）を含んでおり、これ
はアゴニスト誘導性のかなりの活性を維持したままアゴニストの不在下で受容体
に高い活性を与える。ＣＡＭＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を
、重複する２つの断片を融合することにより調製した。断片１は５番目のＴＭＤ
に隣接した３８個のアミノ酸を含むアミノ末端コード配列を含んでいた。断片２
は６番目のＴＭＤに隣接した３３個のアミノ酸を含むカルボキシ末端コード配列
を含んでいた。この２つの断片を、全長α２Ａアドレナリン作動性受容体の５’
および３’末端でオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅させて融合さ
せた。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許
第５，６９１，１８８号に記載のもの、特にPausch et al. (1998)および例９の
表３に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞などのＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖アッセ
イを行うのに有用な酵母細胞中に導入した。

【００６２】野生型ＩＣ３ΔおよびＣＡＭＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体
を含む酵母細胞を、液体培養液中で、αアドレナリン作動性完全アゴニストＵＫ
１４３０４（ＲＢ１）および部分アゴニストであるクロリジンを用いてアッセイ
した。この細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。細
胞をＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５００倍に希釈した。
この細胞を、基礎増殖速度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリアゾール
を含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５００倍希釈し
た。細胞懸濁液サンプル（１８０μｌ）を、アドレナリン作動性受容体アゴニス
トＵＫ１４３０４（１０^−３〜1０^−１０Ｍ）および部分アゴニストクロニジン
（１０^−３〜1０^−９Ｍ）の連続希釈サンプル２０μｌを含有する滅菌９６ウェ
ルマイクロタイターディッシュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１
８時間、振盪しつつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。増殖はマイクロプレ
ートリーダーを用いて、ＯＤ_６２０における記録値の増大によりモニターした。
アッセイは２回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期に得た。光学
的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、
アゴニスト濃度に対してプロットした。

【００６３】野生型ＩＣ３ΔおよびＣＡＭＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体
を含む酵母細胞は用量依存性の増殖応答を示し、このことよりこのＩＣ３欠失が
機能していることが示された（図５）。興味深いことに、アゴニスト依存性増殖
応答をもたらすには低いＵＫ１４３０４レベルで、ＣＡＭ受容体を含む細胞の基
礎増殖速度は野生型受容体を含む細胞のもより高く、このことはＣＡＭ受容体が
アゴニストの不在下でより有効なことを示すものである。図６では、野生型ＩＣ
３ΔおよびＣＡＭ変異体を含む細胞の双方の基礎増殖を排除し、なおＵＫ１４３
０４誘導性増殖応答を許容する十分な濃度である５ｍＭのＡＴの存在下で（図６
）、唯一ＣＡＭＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体だけが部分アゴ
ニストであるクロニジンに応答する増殖をもたらすことができ（図６Ｂ）、これ
はＣＡＭ受容体の高い活性と一致するものである。ＵＫ１４３０４とクロニジン
双方に関して、ＥＤ_５０はＣＡＭ受容体を含む系統においてより低いアゴニスト
濃度にシフトされるが、このことはＣＡＭヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体
の予測させる活性と一致している。増殖応答はアドレナリン作動性アンタゴニス
トであるヨヒムビンにより逆転された。

【００６４】ＩＣ３Δ α２Ａアドレナリン作動性受容体は機能的であることが分かったが
、このことは記載されているように第３の細胞内ループの改変が機能的なＧＰＣ
Ｒをもたらすことを示している。ＣＡＭ型のＩＣ３Δ α２Ａアドレナリン作動
性受容体は適用されたアゴニストに依存する酵母細胞増殖誘導能を持っており、
このことはＣＡＭＧＰＣＲのいずれの構成的活性も、アゴニストの不在下で起
こる酵母細胞の増殖レベルを評価することによって簡単に測定され得ることを示
唆している。ＧＰＣＲにおけるＣＡＭのこの作用は、同種のアゴニストが知られ
ていないオーファンＧＰＣＲの試験に特に有用であり得る。従って、オーファン
ＧＰＣＲを第３の細胞内ループにおいて変異させてこれをＣＡＭＧＰＣＲとし
、アゴニストの不在下で酵母の増殖応答を刺激する能力に関して試験すればよい
。ＣＡＭオーファンＧＰＣＲが酵母細胞の増殖応答を刺激できるならば、それは
機能的であるはずであり、従って薬剤のスクリーニングアッセイに含めるのに適
したものであるにちがいない。

【００６５】例６酵母におけるＣＡＭＭ３ムスカリン様アセチルコリン受容体（Ｍ３Ｍ
ＡＲ）の発現例５では、ＣＡＭα２Ａアドレナリン作動性受容体はアゴニストの添加なしで
酵母細胞の増殖応答を刺激することができることが示された。ＣＡＭは第３の細
胞内ループにおいて、ＧＰＣＲの活性化とＧタンパク質との相互作用の双方に関
与することが知られているドメインであった。第２の細胞内ループおよびそれに
隣接した領域もまたＧＰＣＲの活性化に関与することが知られている。この領域
内では、ＤＲＹボックスとして知られる保存された三ペプチドモチーフＡｓｐ−
Ａｒｇ−ＴｙｒはロドプシンファミリーのＧＰＣＲの活性化に関与することが分
かっている。Ａｓｐ残基がＩｌｅをはじめとする疎水性アミノ酸に改変されたα
１アドレナリン作動性受容体の位置指定変異体は高い構成的活性に関連していた
。第３の細胞内ループのカルボキシ末端に隣接する６番目のトランスメンブラン
ドメインの部位の突然変異によって作出したＣＡＭＭ５−ＭＡＲを哺乳類細胞
培養で評価した(Spauldin et al. (1995))。ＣＡＭによって高められた基礎シグ
ナル伝達は、アトロピンをはじめとする種々の逆アゴニストによって逆転された
が、このことはＣＡＭＭ５−ＭＡＲの固有の活性の増強を確実なものとする。

【００６６】公知の機能のＧＰＣＲにおいてＤＲＹボックス突然変異の作用を検討するため
、ラットＭ３ＭＡＲを、ＤＲＹボックスのＡｓｐ残基をＩｌｅ残基で置換する
ことで改変した。例１に記載のラットＭ３−ＭＡＲ酵母発現プラスミドをＤＲＹ
ボックスにおけるＤ（Ａｓｐ）からＩ（Ｉｌｅ）への変異の鋳型として用い、製
造業者の説明書に従いStratagene QuikChangeキットを用いた位置指定突然変異
誘発により達成した。米国特許第５，６９１，１８８号に記載の種の機能的発現
ＧＰＣＲに反応する酵母細胞、特にPausch et al. (1998)および例９の表３に記
載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞を、従来の酢酸リチウム法を用いて改変型Ｍ３ＭＡ
Ｒ発現プラスミドで形質転換した。

【００６７】ＤＲＹボックスで変異させたＭ３−ＭＡＲ発現プラスミドを含む酵母細胞の増
殖応答を、寒天ベースのバイオアッセイ法で、非改変型Ｍ３−ＭＡＲを含むもの
と比較した。酵母細胞を、２ｍｌのグルコース（２％）を含有する合成完全液体
培地およびウラシル欠損培地（ＳＣＤ−ｕｒａ）で一晩培養した。この寒天ベー
スのプレートバイオアッセイでは、０．５ｍＭのＡＴを含有する融解した（５０
℃）ＳＣＤ−ｕｒａ−ｈｉｓ寒天培地（３５ｍｌ、オートクレーブにかける前に
濃ＫＯＨを添加することによりｐＨ６．８に調整）に一晩培養したものを播種し
（２ｘ１０^４細胞／ｍｌ）、角型（９ｘ９ｃｍ）のペトリプレートに分注した。
ＭＡＲアゴニストであるカルバコール（１０ｍＭ、１０μｌ）および逆アゴニス
トであるアトロピン（１ｍＭまたは１０ｍＭ、１０μｌ）の溶液をプレートの表
面に塗布した。プレートの表面に塗布した化合物は塗布した部位から放射状に拡
散し、寒天に包埋された細胞の表面で発現したＭＡＲ受容体と結合し、ＦＵＳ１
−ＨＩＳ３発現のアゴニスト誘導か、逆アゴニストによる増殖阻害を示した。こ
れらのプレートを３０℃で３日間インキュベートした。

【００６８】ＣＡＭＭ３−ＭＡＲはアゴニストの不在下で酵母細胞の増殖速度の上昇を促
進するが、これはアゴニストまたはアンタゴニストで処理しなかったプレートの
領域とＣＡＭＭ３−ＭＡＲ以外のプレートの同様の部分とを比較することで観
察できる。高い増殖応答はＣＡＭＭ３−ＭＡＲによるものであることは、逆ア
ゴニストであるアトロピンによる逆のアゴニスト依存性の増殖によって確認され
る（図７Ａ）。アトロピンはヒスチジンの存在下で増殖させた場合、ＣＡＭＭ
３−ＭＡＲを発現する酵母細胞の増殖に対して有害な作用を持っていなかった。
ＣＡＭＭ３−ＭＡＲ以外はアゴニストによって刺激されるような能力を保持し
ていなかったが、ＣＡＭＭ３−ＭＡＲはもはらアゴニストに応答しなかった。

【００６９】これらの結果はＧＰＣＲのＤＲＹボックスにＣＡＭを導入すると、上昇したそ
の構成的活性によってアゴニスト依存性の酵母細胞の増殖に測定可能な増大がも
たらされることを示している。このような増殖速度の増大は変異型ＧＰＣＲがア
ゴニストの不在下で機能的に活性であることを示すものである。ＧＰＣＲにおけ
るＤＲＹボックスＣＡＭのこの作用は、ＤＲＹボックスが広く保存されており、
大部分のオーファン受容体で存在しているはずであるから、オーファンＧＰＣＲ
の試験に特に有用であり得る。従って、オーファンＧＰＣＲをそのＤＲＹボック
スで変異させてこれをＣＡＭＧＰＣＲとし、アゴニストの不在下で酵母の増殖
応答を刺激する能力に関して試験すればよい。ＣＡＭオーファンＧＰＣＲが酵母
細胞の増殖応答を刺激できるならば、それは機能的であるはずであり、従って薬
剤のスクリーニングアッセイに含めるのに適したものであるにちがいない。

【００７０】例７ラット・ニューロテンシンＮＴ１受容体の末端切断はアゴニスト感受性を
増強させる例１〜４において、第３の細胞内ループの改変により、酵母において発現した
種々の異種ＧＰＣＲの機能的発現が向上した。アゴニスト誘導性のＧＰＣＲの脱
感作もまた、部分的には、細胞内カルボキシ末端テールのような第３の細胞内ル
ープ以外のＧＰＣＲ内部ドメインにより媒介されている。

【００７１】ＧＰＣＲからのカルボキシ末端ドメインの除去により、酵母および哺乳類細胞
における機能的発現が向上することが示されている。α−接合型酵母細胞に発現
したＧタンパク質共役α接合フェロモン受容体のカルボキシ末端テールの末端切
断は、接合フェロモンの存在に対する過敏性を引き起こす（Reneke et al. (198
8); Konopka et al.(1988)）。これらの知見と一致して、そのカルボキシ末端テ
ールを欠く変異型ラット・ニューロテンシンＮＴ１受容体（ｒＮＴＲ1）は、哺
乳類細胞において発現した場合に、アゴニスト誘導性のインターナリゼーション
に対し耐性を有する（Hermans et al. (1996)）。

【００７２】カルボキシ末端の末端切断が酵母において発現した異種ＧＰＣＲの機能的応答
を改変するかどうか検討するために、カルボキシ末端テールを構成する５２個の
アミノ酸を欠失させて、受容体を３７２アミノ酸長に縮めることによりラットＮ
ＴＲ１を改変した。野生型および末端切断型ニューロテンシン受容体（ｒＮＴＲ
１Ｃ−ｔｅｒｍΔ）のコード配列を、共通アミノ末端コード配列を指定する５’
オリゴヌクレオチドプライマー（ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡ
ＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣ）（配列番号２２）および
野生型を定義する分離型オリゴヌクレオチド（ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡ
ＧＴＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣ）（配列番号２３）、および末端切断型カ
ルボキシ末端（ＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣ
ＡＡＡＧＧＣ）（配列番号２４）を用いてＰＣＲ法により増幅した。標準的な方
法により、これらの断片を酵母発現ベクターｐＰＧＫ中のＰＧＫプロモーターの
近位にクローン化した（Y-S. Kang et al. (1990)）。得られたプラスミドを、
従来の酢酸リチウム形質転換法を用いて、ＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖アッセ
イを行うのに有用な米国特許第５，６９１，１８８号に記載の種の酵母細胞、特
にPausch et al. (1998)および例９の表３に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞に導入
した。

【００７３】ＮＴ受容体アゴニストであるアセチルニューロテンシン８−１３（ＡｃＮｔ８
−１３）を用いて、ＮＴＲ１を含む酵母細胞を液体培養液中でアッセイした。こ
の細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。細胞を基礎
増殖速度を低下させるための２ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ−
グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地（ｐＨ６．８）で５００倍希釈した。細胞懸濁
液サンプル（１８０μｌ）を、ＡｃＮＴ８−１３の連続希釈サンプル（１０^−３〜1０^−１０Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイターディッシ
ュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１８時間、振盪しつつ（６００
ｒｐｍ）インキュベートした。増殖はマイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ _６２０における記録値の増大によりモニターした。増殖速度測定値は酵母細胞増
殖の対数増殖期に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、
平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図６に示さ
れたように、ＮＴＲ１を含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を引き起こ
し、このことは野生型およびカルボキシ末端における末端切断型ＮＴＲ１の双方
が機能していることを示している。ｒＮＴＲ１Ｃ−ｔｅｒｍΔを含む細胞の増
殖応答は用量依存的であり、ＡｃＮＴ８−１３のＥＣ_５０は５２０ｎＭに相当し
た。この値は野生型ＮＴＲ１を発現している細胞において観察された値（２．１
μＭ）の５分の１であった。カルボキシ末端の欠失により、より低い濃度のＮＴ
Ｒアゴニストに応答するｒＮＴＲ１が産生され、酵母バイオアッセイの感受性が
向上した。このように、ラットＮＴＲ１のカルボキシ末端の細胞内ドメイン部分の欠失が
、酵母において発現した場合にアゴニスト感受性が増強される機能的ＧＰＣＲが
産生されたが、このことはこの内部ドメインの改変が、酵母において発現した異
種ＧＰＣＲの機能改変のために一般化できる方法であることを示唆するものであ
る。

【００７４】例８酵母ステロール変異体の作出酵母ステロール変異体がＧタンパク質共役受容体シグナル伝達の効率を高める
ことを証明するため、アゴニスト依存性の増殖応答を与えるＭＰＹ５７８ｆｃか
ら構築したｅｒｇ６変異体で異種Ｇタンパク質共役受容体を発現させた(M. Paus
ch et al. (1998))。この系統は内因性のＥＲＧ６遺伝子を欠損させたｅｒｇ６
欠損カセットを含むＤＮＡでＭＰＹ５７８ｆｃを形質転換することによって(M.
Pausch et al. (1998))構築した。このカセットはＰＣＲ反応においてプライマ
ーとして以下のＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて構築した。５’ＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＣＣ
ＣＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴ
ＴＡＣＧＴＡＣＡＡＴＣ３’ （配列番号２５）および５’ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＴ
ＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＣ３’（配列番号２６）。

【００７５】プラスミドｐＲＳ４０４(Stratagene company)ＤＮＡを用いるこのＰＣＲ反応
では、ＥＲＧ６遺伝子の周囲の５’および３’配列に相同な配列を含むが、全Ｔ
ＲＰ１遺伝子が介在してＥＧＲ６配列に取って代わっているＤＮＡ断片が合成さ
れることとなる。このカセットの形質転換から得られる系統はＹＭＬ１０３と呼
ばれる。

【００７６】異種発現したＧＰＣＲのシグナル変換程度を調べるため、かかる受容体を含む
いくつかのプラスミド構築体をPausch et al. (1998)および例９の表３に記載の
ＭＰＹ５７８ｆｃ細胞系およびＹＭＬ１０３系統へ形質転換した。ヒトＶ１およ
びＶ２バソプレシン受容体、ヒト・メラノコルチン受容体（ＭＣ４）、ラット・
ソマトスタチン（ＳＳＴＲ２）受容体、ラットＭ３ＭＡＲおよびラットＣＣＫ
Ｂ受容体をはじめとするＧＰＣＲ遺伝子を、前記例に記載の方法でプラスミドｐ
４２６ＧＰＤに挿入した。Ｖ１ａおよびＶ２受容体で形質転換された系統はｅｒ
ｇ６が欠損したＹＭＬ１０３系統においてバソプレシン依存性の増殖応答を示す
。このような応答は野生型ＭＰＹ５７８ｆｃ系統では検出されない（図９Ａ〜Ｄ
）。ラット・ソマトスタチンＳＳＴＲ２受容体、ラットＭ３ＭＡＲ受容体およ
びラットＣＣＫＢ受容体形質転換系統では、ノイズに対するシグナル率（アゴニ
ストが存在しないプレートのバックグラウンドにおける増殖に対するアゴニスト
により誘導される増殖）高まり、明確なシグナルがもたらされる（図１０Ａ〜Ｂ
）。

【００７７】例９キメラＧαタンパク質を含む酵母系統において発現される異種ＧＰＣＲの
機能的活性種々のキメラＧαタンパク質を含む酵母細胞は、同時発現した異種ＧＰＣＲと
選択培地での増殖のためのフェロモン応答経路の下流エレメントの、アゴニスト
により刺激される活性化への依存を与えるものであった。この技術を活用してリ
ガンド−受容体の態様および受容体−Ｇタンパク質相互作用を検討した。プラスミドの構築

【００７８】ラット・ソマトスタチンＳＳＴＲ２およびラット・アデノシンＡ２ａ発現プラ
スミド（ｐＪＨ２、ｐＬＰ１１０）は他所に記載されている(L.A. Price et al.
(1995), L.A. Price et al. (1996))。酵母において有効に発現させるため、ラ
ットＮＴＲ１のタンパク質コード領域(K. Tanaka et al. (1990))をＰＣＲ法に
よって改変した。５’末端に５’ＨｉｎｄIII部位と酵母転写開始共通配列を付
加するオリゴヌクレオチド（ＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣ
ＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＧ）（配列番号２７）、および終結コ
ドンの後に３’末端にＢａｌII部位を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣ
ＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧ）（
配列番号２８）を用いてＮＴＲ１配列を増幅した。得られた断片を精製し、適当
な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐＰＧＫＨ(Y.S. Kang et al
. (1990)を含むホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーターのＨｉｎ
ｄIIIとＢａｍＨＩ部位の間に挿入してｐＭＰ１９８を作出した。

【００７９】酵母において有効に発現させるため、ヒトＭＣＲ４のタンパク質コード領域(I
. Gantz et al. (1993))をＰＣＲ法により改変した。５’末端に５’ＨｉｎｄII
I部位と酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＴＣＴＣＡＡＧ
ＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＧ
）（配列番号２７）、および終結コドンの後に３’末端にＢａｌII部位を付加す
るオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧ
ＣＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧ）（配列番号２８）を用いてＭＣＲ４配列を増幅
した。得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベ
クターｐＰＧＫＨ(Y.S. Kang et al. (1990)を含むホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ１）プロモーターのＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ部位の間に挿入してｐＭ
Ｐ２２３を作出した。野生型ラットＣＣＫ−Ｂ−Ｒ発現プラスミドｐＭＰ２０３
はＰＣＲ法によりラットＣＣＫ−Ｂ−Ｒのタンパク質コード領域(S.A. Wank et
al. (1992)を増幅することで構築した。５’末端に５’ＨｉｎｄIII部位と酵母
転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡ
ＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（
配列番号２９）および終結コドンの後に３’末端にＢａｌII部位を付加するオリ
ゴヌクレオチド（ＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ
ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号３０）を用いてＣＣＫ−Ｂ−Ｒ配列を増
幅した。得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現
ベクターｐＰＧＫＨ(Y.S. Kang et al. (1990)を含むホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ１）プロモーターのＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ部位の間に挿入してｐ
ＭＰ２０３を作出した。

【００８０】第２のラットＣＣＫ−Ｂ−Ｒ発現プラスミドｐＭＰ２５８は、５’オリゴヌク
レオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオ
チド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣ
ＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列番号３１）を用いて構築した。３’オ
リゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付加することによる終結コドンの後の３’
末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ
ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）。上記のオリゴヌクレオチドを
用いて得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベ
クターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al. (1995)を含むグリセロールホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に
挿入した。

【００８１】酵母において有効に発現させるため、ヒトＣＣＫ−Ａ受容体のタンパク質コー
ド領域(A. de Weerth et al. (1993))をＰＣＲ法により改変した。５’末端にＨ
ｉｎｄIII部位と酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＣＡＧ
ＣＣＴＴ）（配列番号３２）、および終結コドンの後に３’末端にＢａｌII部
位を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＣ
ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴ）（配列番号３３）を用いてＣＣＫ−Ａ受容体
配列番号を増幅した。得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで
消化し、発現ベクターｐＰＧＫＨ(Y.S. Kang et al. (1990)を含むホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーターのＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ部位の間
に挿入してｐＭＰ２０９を作出した。

【００８２】ラットＭ３ムスカリン様アセチルコリン受容体(T.I. Bonner et al. (1987))
発現プラスミドｐＥＫ２９０は、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と
酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴ
ＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＣ）（配列番号３
４）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＸｈｏＩ部位を付加するこ
とによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴ
ＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣ）（配列番号３５）。上記の
オリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al. (1995)を含むグ
リセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターのＢａｍＨＩ
とＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８３】ショウジョウバエ・ムスカリン様アセチルコリン受容体(R.A. Shapiro et al.
(1989))発現プラスミドｐＥＫ２８９は、５’オリゴヌクレオチドに５’Ｂｇｌ
II部位と酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＣＣＡＧ
ＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡ
ＣＧＧ）（配列番号３６）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、Ｘ
ｈｏＩ部位を付加することによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＡＡ
ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＣ
Ｇ）（配列番号３７）。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精
製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D
.Mumberg et al. (1995)を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＰＤ）プロモーターのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８４】ヒトＧｎＲＨ受容体(S.S. Kakar et al. (1992))発現プラスミドｐ４２６ＧＰ
Ｄ−ｈＧｎＲＨＲは、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写開
始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡ
ＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列
番号３１）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付加
することによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡ
ＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号
１２）。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制限
エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al.
(1995)を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモータ
ーのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８５】ヒト・バソプレシンＶ２受容体(M. Birnbaumer et al. (1992))発現プラスミ
ドｐ４２６ＧＰＤ−ｈＶ２Ｒは、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と
酵母転写開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣ
ＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣ
Ｇ）（配列番号３１）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI
部位を付加することによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧ
ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）
（配列番号１２）。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、
適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumbe
rg et al. (1995)を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）
プロモーターのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８６】ヒト・ヒスタミンＨ３受容体(T.W. Lovenberg et al. (1999))発現プラスミド
ｐＥＴ１９は、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写開始共通
配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡ
ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列番号３
１）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付加するこ
とによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴ
ＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）
。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al. (1995)
を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターのＢ
ａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８７】ヒト・アドレナリン作動性α２Ａ受容体(C.A. Guyer et al. (1990))発現プラ
スミドｐＭＰ２４９は、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写
開始共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配
列番号３１）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付
加することによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧ
ＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番
号１２）。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制
限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al
. (1995)を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモー
ターのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８８】ヒトβ２アドレナリン作動性受容体(B.K. Kobika et al. (1987))発現プラス
ミドｐＥＴ１９は、５’オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写開始
共通配列を付加するオリゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡ
ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列番
号３１）を用いて構築した。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付加す
ることによる終結コドンの後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣ
ＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１
２）。上記のオリゴヌクレオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al. (1
995)を含むグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター
のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入した。

【００８９】アプリシア・カリフォルニカ・オクトパミンＯＡ１受容体(E. Kandel, Columb
ia University, personal communication)発現プラスミドｐＭＰ２５５は、５’
オリゴヌクレオチドに５’ＢｇｌII部位と酵母転写開始共通配列を付加するオリ
ゴヌクレオチド（ＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴ
ＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列番号３１）を用いて構築し
た。３’オリゴヌクレオチドは、ＳａｌI部位を付加することによる終結コドン
の後の３’末端を指定した（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧ
ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）。上記のオリゴヌク
レオチドを用いて得られた断片を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化
し、発現ベクターｐ４２６ＧＰＤ(D.Mumberg et al. (1995)を含むグリセロール
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ
部位の間に挿入した。

【００９０】染色体ＧＰＡ１配列を、哺乳類Ｃ末端アミノ酸をコードするキメラ遺伝子で置
換するのに適したベクターを作出した。このベースベクターは以下のようにして
作出した。プロモーターおよびコード配列からなるＧＰＡ１遺伝子の断片(C. Di
etzel et al. (1987), I. Miyajima et al. (1987), M. Nakafuku et al. (1987
))をｐＰＧＫＨ−ＳＣＧ１(Y.S. Kang et al (1990))から単離した。ＢａｍＨＩ
部位を形成したサイレント変異を、Ｇタンパク質αサブユニットコード配列にお
いて保存されたＢａｍＨＩ部位がよく見られる位置のＧＰＡ１オープンリーディ
ングフレーム内に置いた。一方の０．５ｋｂのＧＰＡ１断片を、ＢａｍＨＩおよ
びＸｂａＩを付加したオリゴヌクレオチド（ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡ
ＡＣＴＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡ）（配列番号３８）および（Ａ
ＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡ）（配
列番号３９）を用いて３’調節配列からなる配列から増幅した。ＸｂａＩおよび
ＳａｌＩ部位を有する（ＡＴＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴ
ＴＡＡＴＴＧＡ）（配列番号４０）および（ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡ
ＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＡ）（配列番号４１）もう１
つの０．５ｋｂのＧＰＡ１断片も作出した。これらの断片を、ＵＲＡ３を含む組
込みベクターＹＩｐ５(M.F. Rose et al. (1990))の相当する部位に連続して挿
入してｐＬＰ１３６を作出した。得られた構築体は３’断片間に挿入した人為的
なＸｂａＩ部位を用いて線状化すればよい。

【００９１】キメラＧタンパク質組込みベクターはｐＬＰ１３６に、哺乳類Ｇタンパク質の
５つのカルボキシ末端アミノ酸とともにＧｐａ１のカルボキシ末端をコードする
ＢａｍＨＩ断片を付加することによって構築した。これらのＢａｍＨＩ断片は、
以下の表１で示されるように、フレーム内の両末端にＢａｍＨＩ部位を置いたオ
リゴヌクレオチドを用いて増幅した。

【００９２】表１改変型カルボキシ末端をコードする配列を含むキメラＧＰＡ１対立遺伝子
構築に使用したオリゴヌクレオチド

【表１】

【００９３】この３’オリゴヌクレオチドは、各哺乳類Ｇαタンパク質由来の５カルボキシ
末端アミノ酸をコードする配列を指定した。ＢａｍＨＩでこの断片を消化し、ｐ
ＬＰ１３６中の唯一のＢａｍＨＩ部位に正しい方向で挿入し、以下の表２に示さ
れた組込みプラスミドを作出する。

【００９４】表２ＧＰＡ１遺伝子と、改変型カルボキシ末端をコードする配列を含むキメラ
ＧＰＡ１対立遺伝子との置換に使用したプラスミド

【表２】

【００９５】哺乳類のＧαタンパク質のカルボキシ末端をコードするＤＮＡ断片は、既存の
発現プラスミドから得た（Y.S. Kang et al. (1990)）。この断片をｐＬＰ１３
６中の唯一のＢａｍＨＩ部位に正しい方向で挿入した。

【００９６】ｐＳＬ３０７由来のＰｓｔ１−ＳａｌＩＦＵＳ１−ＬａｃＺ断片を（G. McC
affrey et al. (1987)）、ベクターｐＲＳ４２６を含む多重コピーＴＲＰＩ中の
相当する部位に転移させることにより（T.W. Christianson et al）、ＦＵＳ１
−ＬａｃＺレポーター遺伝子を有するプラスミド（ｐＭＰ２８３）を構築した。

【００９７】系統の構築酵母系統を構築し、増殖培地および培養条件は標準的な方法に従った（M.F. R
ose et al. (1990)）。ＧＰＡ１遺伝子座の２工程による組込み置換により、キ
メラＧタンパク質を含む酵母系統を構築した。ＧＰＡ１遺伝子座に組込むため、
この構築体を標的化する目的で、キメラＧタンパク質発現プラスミドをＸｈｏＩ
で消化した。ＤＮＡにより媒介される、線状断片を用いるＭＰＹ５７８ｆｃ細胞
のウラシル原栄養性株への形質転換は、酢酸リチウム法により行った（A St Jea
n et al. (1991)）。ＧＰＡ１遺伝子座の置換のための選択は、ＦＯＡ培地上で
の培養により行った（M.F. Rose et al. (1990)）。この方法で生存した酵母細
胞を、改変型ＧＰＡ１対立遺伝子の存在を証明するためにＰＣＲ法で調べた。

【００９８】キメラＧＰＡ１遺伝子を含む酵母シャトルベクターを構築するために、ＧＰＡ
１遺伝子の３’断片を、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。３
’をコードする断片は、５つのカルボキシ末端アミノ酸が哺乳類のＧαタンパク
質と置換された、ＧＰＡ１のカルボキシ末端ＧＰＣＲ結合ドメインをコードする
配列を含んでいた。得られた断片を、ＹＩｐ５に基づく組込みシャトルベクター
ｐＬＰ１３６、ａＵＲＡ３中にサブクローニングした（M.F. Rose et al. (1990
)）。ＧＰＡ１遺伝子座における組込みを促進するためにＸｈａＩを用いて、得
られた構築体を線状化し、これを用いてＭＰＹ５７８ｆｃ細胞を形質転換し（M.
H. Paush et al. (1998)）、以下の表３に示した酵母系統を作製した。

【００９９】表３試験に用いた酵母系統

【表３】

【０１００】Ｕｒａ^＋形質転換株をＦＯＡ培地上で継代接種し、ＧＰＡ１遺伝子座における
キメラ対立遺伝子との置換を確かなものとした。次いで、得られた系統（表３）
を種々の異種ＧＰＣＲ発現を付与するプラスミドで形質転換した。この酵母系統
を寒天または液体中で、適当な同種アゴニストを用いてアッセイした。各ＧＰＣ
Ｒ／Ｇタンパク質αサブユニット系統が増殖促進シグナルを形質導入する能力を
測定し、得られた結果を図１１に示した。

【０１０１】酵母でアッセイしたＧＰＣＲは、それらの本来の挙動から予想されるＧタンパ
ク質αサブユニット結合選択性を示した。例えば、哺乳類細胞のＧｑ共役受容体
であるニューロテンシンＮＴＲ１（K. Tanaka et al. (1990)）はＧｐａ１−Ｇ
ｑ／１１を含む酵母系統で増殖を促進するが、Ｇｐａ１−Ｇｓ系統では増殖を促
進できない。哺乳類細胞において与えられたＧ１６の無差別の結合挙動から予想
されるように、ＮＴＲ１はＧｐａ１−Ｇ１６系統の増殖を促進する（G. Milliga
n et al. (1996)）。逆に、哺乳類細胞のＧｓ共役受容体であるバソプレシンＶ
Ｚ受容体（M. Birnoaumer et al. (1992)）はＧｐａ１−Ｇｓを含む酵母系統の
増殖を促進するが、Ｇｐａ１−Ｇｑ／１１系統の増殖は促進しない。これらを考
え合わせると、これらのデータは、酵母中で発現されたＧＰＣＲはＧタンパク質
αサブユニット結合選択性を保持していることを示す。従って、本明細書に記載
の酵母系統はＧＰＣＲのＧタンパク質αサブユニット結合選択性を示すために有
用な便宜な手段であることを意味している。

【０１０２】例１０キメラＧαタンパク質を含む酵母系統中で過剰発現したアデノシンＡ２
ａ受容体により刺激されるアゴニスト非依存性増殖ＨＴＳアッセイにおいてオーファンＧＴＣＲを用いるためには、アゴニスト不
在下でのＧＰＣＲの機能的活性を証明しなければならない。前記の例において、
ＧＰＣＲに導入された突然変異は構成的に活性化された状態を付与し、これによ
りアゴニスト不在下での酵母細胞増殖速度の増大がもたらされる。ある野生型Ｇ
ＰＣＲが哺乳類細胞中で過剰発現した場合に下流情報伝達経路の構成的活性化が
もたらされるという知見から、もう１つのアプローチが考えられる。このアプロ
ーチは、アゴニスト不在下で構成的活性を導き、かつ下流情報伝達経路の活性化
をもたらすものである。

【０１０３】この現象は、自発的に活性状態に切り替えられたＧＰＣＲの蓄積の増大により
説明される。ＧＰＣＲ活性化を説明する単純な３つの状態モデルにおいて、該受
容体は、独自の状態Ｒ、活性状態Ｒ^＊、および不活性状態Ｒ^○の間の平衡状態で
存在し、アゴニスト不在下では不活性状態が優勢である。該ＧＰＣＲはＲおよび
活性および不活性形態の間で自発的に切り替わっているのであろう。アゴニスト
は活性形態を安定化させ、ＧＰＣＲに下流情報伝達分子を刺激させる。野生型発
現レベルにおいては、活性形態への自発的変換は、基底レベルを超える下流情報
伝達経路の検出可能な活性化を行うに十分なレベルまでＧＰＣＲが蓄積するのを
許さない。ＧＰＣＲが過剰発現された場合、より多くの受容体が存在して活性形
態へ自発的に形質転換でき、かくして多数の行動により下流情報伝達経路が活性
化される。

【０１０４】本明細書記載の酵母細胞発現系におけるこの試みの適用は、ＧＰＣＲの過剰発
現によりアゴニスト不在下でも増殖が活性化されるであろうことを示唆する。こ
の増殖の活性化は発現された受容体量に比例すると考えられ、多くの受容体が発
現されるほどアゴニスト不在下での増殖速度が速くなる。同様に、増殖の活性化
はＧＰＣＲとＧタンパク質が効率的に結合できる細胞内においてのみ、認められ
るであろう。

【０１０５】この試みを検討するために、高レベル（Price L.A., Strnad J., Pausch M.H.
, and Hadcock J.R., Pharmacological characterization of the rat A2a aden
osine receptor functionally coupled to the Yeast pheromone response path
way, Mol.Pharmacol. SO,829-837, 1996に記載のマルチコピープラスミドｐＬＰ
１１６)および低レベル（Paush et alに記載のコピー数の少ない、動原体を含む
プラスミドｐＭＰ１４５）の受容体を付与するラット・アデノシンＡ２ａ受容体
発現プラスミドを、米国特許番号第５，６９１，１８８号に記載の、ＧＰＣＲア
ゴニスト刺激性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞中に導入した。特には、
Pausch et al.により記載されたＭＰＹ５７８ｆｃ細胞（Pausch, M.H., Price,
L.A., Kajkowski, E.M., Strnad, J., Delacruz, F., Heinrich, J.A., Ozenber
ger, B.A., and Hadcock, J. R., Heterologous G protein-coupled receptors
in Saccharomyces cerevisiae, Methods for genetic analysis and ligand ide
ntification, Identification and expression of G protein-coupled receptor
s, Lynch, K.R., Ed., Wiley-Liss, New York, NY, 1998, 196-212）および例９
に記載の、キメラＧタンパク質を含む系統をｐＬＰ１１６、ｐＭＰ１４５および
エンプティベクターｐＲＳ４２６で、従来の酢酸リチウム形質転換法により形質
転換した。

【０１０６】ＭＰＹ５７８ｆｃおよび関連するキメラＧタンパク質を含み、アデノシンＡ２
ａ受容体を発現する系統を液体培養液中でアッセイした。それぞれプラスミドを
含む系統の、８つの個々の形質転換体を０．２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ
培地中で一晩培養した。この細胞を、２，５または１０ｍＭの３−アミノトリア
ゾールを含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ（ｐＨ６．８）培地で５０
０倍に希釈し、その０．２ｍｌを９６ウェルプレートに分注した。酵母により産
生されるアデノシンを分解し、不活性化するためアデノシンデアミナーゼ（０．
１３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。増殖は、マイクロプレートリーダーを用いて、Ｏ
Ｄ５７０における記録値の増大によりモニターした。増殖速度の測定値は、酵母
細胞増殖の対数増殖期に得た。光学的密度の測定値は、Graphpad Prismを用いて
解析した。図１１に示されるように、アデノシンＡ２ａ受容体を含む酵母細胞は
アゴニスト非依存性増殖応答を示し、このことはアデノシンＡ２ａ受容体の機能
的活性はアゴニスト不在下でも検出できることを示す。予期された通り、該アデ
ノシンＡ２ａ受容体は、それが効率的に結合できるＧαタンパク質、例えばＧｐ
ａ１およびＧｐａ１−ｓ５およびＧｐａ１−α１６を含む細胞において高レベル
に発現された場合に最も速い増殖速度を示した。このアゴニスト非依存性増殖応
答はまた、産生されたアデノシンＡ２ａ受容体の量に比例し、すなわち多重コピ
ーアデノシンＡ２ａ受容体発現プラスミドｐＬＰ１１６を含む細胞は、少ないコ
ピー数のプラスミドｐＭＰ１４５を含む細胞よりも速く増殖する。

【０１０７】これらの結果は、オーファンＧＰＣＲの機能的活性は、種々のキメラＧタンパ
ク質構築体を含む酵母細胞中で過剰発現することにより、アゴニスト不在下でも
検出できることを示す。このように、オーファンＧＰＣＲはアゴニスト不在下で
、種々のキメラＧタンパク質を含む酵母細胞中で過剰発現される。もしオーファ
ンＧＰＣＲがキメラＧタンパク質のサブセットとの結合を介して選択的に酵母細
胞増殖を刺激することができるのであれば、それは機能するに違いなく、従って
薬物スクリーニングアッセイに含めるに好適である。かかるスクリーニングアッ
セイは、アゴニストの刺激作用が基底増殖速度を超えて検出される、経験的に決
定された受容体発現条件下で行われる。

【０１０８】本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の明細書および実施を考慮
すれば当業者には明らかとなろう。明細書および例は以下の請求項により示され
る本発明の真の範囲および精神の範囲内で単に例示としてみなすものとする。

【０１０９】本明細書で引用された参照文献は、参照することによりそのまま本明細書の一
部とする。

【０１１０】参考文献

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、ラットＭ３ムスカリン
様アセチルコリン受容体（ＭＡＲ）を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの
結果を示す。第３の細胞内ループ（ＩＣ３Δ）に欠失のあるＭ３ＭＡＲを含む酵
母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型ＭＡＲはそうで
はなく、このことはＭ３ＭＡＲＩＣ３Δは機能的なＧＰＣＲであるということを
示すものである。

【図１Ｂ】ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、ラットＭ３ＭＡＲＩＣ
３ΔおよびＦＵＳ２−ＧＦＰ受容体プラスミドを含む酵母細胞に対する液体培養
蛍光誘導アッセイの結果を示す。酵母において発現したＭ３ＭＡＲＩＣ３ΔのＣ
Ｃｈ活性化に応答して緑色蛍光タンパク質の発現の用量依存性増大が認められる
。

【図２】ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、キイロショウジョウバ
エ・ムスカリン様アセチルコリン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセ
イの結果を示す。Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む変異型キイロショウジョウバエＭＡ
Ｒを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型キイ
ロショウジョウバエＭＡＲではアゴニスト依存性の酵母細胞増殖応答はなかった
。

【図３Ａ】寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。ＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母細胞の強い増殖応答を示
す。

【図３Ｂ】寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。野生型ＣＣＫＢ受容体を含む酵母細胞による増殖は限定されたものでしかなく
、このことは酵母においてはＣＣＫＢ受容体の第３の細胞内ループの一部の欠失
がその機能を改変するということを示すものである。

【図４Ａ】ｒＳＳＴＲ３およびｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換された酵母細胞を示す。ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３を含む酵母細胞はソマトスタチン（Ｓ−１４）
に対して弱い応答しか示さないことを証明するものである。

【図４Ｂ】ｒＳＳＴＲ３およびｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換された酵母細胞を示す。同様の条件下でアッセイされたｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３を含む
酵母細胞によるずっと強い応答を証明するものである。

【図５】 αアドレナリン作動性受容体完全アゴニストＵＫ１４３０４を用いた、野生型
ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞に対する液体培養
アッセイの結果を示す。野生型およびＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受
容体を含む酵母細胞は用量依存性の増殖応答を示し、このことはＩＣ３の欠失が
機能的であるということを示すものである。

【図６Ａ】ＡＴ（３−アミノチリアゾール）の存在下で、αアドレナリン作動性受容体完
全アゴニスト、ＵＫ１４３０４を用いる、野生型ＩＣ３Δおよび構成的に活性な
変異型（ＣＡＭ）ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞
に対する液体培養アッセイの結果を示す。

【図６Ｂ】ＡＴの存在下で、αアドレナリン作動性受容体部分アゴニスト、クロニジンを
用いる、野生型ＩＣ３Δおよび構成的に活性な変異型（ＣＡＭ）ＩＣ３Δヒトα
２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの結果
を示す。ＣＡＭα２Ａ−ＡＲのみがクロニジンに応答し、ＣＡＭＧＰＣＲの予
測されたアゴニストに対する応答性亢進と一致する。

【図７Ａ】ＭＡＲアゴニスト、カルバコールおよび逆アゴニスト、アトロピンの存在下で
、非改変型Ｍ３−ＭＡＲと比較した、改変型（ＣＡＭ）Ｍ３−ＭＡＲを含む酵母
細胞に対する寒天ベースのプレートのバイオアッセイの結果を示す。ＣＡＭＭ３−ＭＡＲはアゴニストの不在下で酵母増殖速度の上昇を促進する
ということおよび逆アゴニスト、アトロピンの存在下におけるアゴニスト非依存
性増殖という逆転を示す。

【図７Ｂ】ＭＡＲアゴニスト、カルバコールおよび逆アゴニスト、アトロピンの存在下で
、非改変型Ｍ３−ＭＡＲと比較した、改変型（ＣＡＭ）Ｍ３−ＭＡＲを含む酵母
細胞に対する寒天ベースのプレートのバイオアッセイの結果を示す。アトロピンはヒスチジンの存在下ではＣＡＭＭ３−ＭＡＲの基本的な増殖に
影響を及ぼさないということを示す。

【図８】ニューロテンシン受容体アゴニスト、ＡｃＮＴ８−１３を用いる、野生型およ
びカルボキシ末端切断型ラットＮＴ１−ニューロテンシン受容体を含む酵母細胞
に対する液体培養アッセイの結果を示す。ラットＮＴ１−ニューロテンシン受容
体の末端切断は野生型受容体を用いて認められたものよりも感度の高いアゴニス
ト依存性増殖応答をもたらす。

【図９Ａ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、バソプレシン受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。Ｖ２受容体で形質転換したＭＰＹ５７８ｆｃ（ＥＲＧ６）系統を示す。

【図９Ｂ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、バソプレシン受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。Ｖ２受容体で形質転換したＹＭＬ１０３（ｅｒｇ６）系統を示す。

【図９Ｃ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、バソプレシン受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。Ｖ１ａ受容体で形質転換したＭＰＹ５７８ｆｃ（ＥＲＧ６）系統を示す。

【図９Ｄ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、バソプレシン受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。Ｖ１ａ受容体で形質転換したＹＭＬ１０３（ｅｒｇ６）系統を示す。１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。

【図１０Ａ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。メラノコルチンＭＣ４受容体で形質転換されたＭＰＹ５７８ｆｃ（ＥＲＧ６）
系統を示す。

【図１０Ｂ】１ｍＭアミノトリアゾールの不在（左）および存在（右）下での、寒天に包埋
された、受容体プラスミドを含む酵母細胞を示す。メラノコルチンＭＣ４受容体で形質転換されたＹＭＬ１０３（ｅｒｇ６）系統
を示す。これらの結果はｅｒｇ６突然変異によって引き起こされる膜特性の変化
がバソプレシンＶ２およびＶ１ａ受容体およびメラノコルチンＭＣ４受容体によ
る応答の改変をもたらすということを証明する。

【図１１】キメラＧαタンパク質を有する酵母系統において異種ＧＰＣＲがアッセイされ
た実験の結果を示す。各指標に示されるＧＰＣＲに関しては、＋は液体形式でア
ッセイした場合に、同種アゴニストに対する用量依存性増殖応答が認められたと
いうことを示し；−は検出可能なアゴニスト用量依存性増殖応答がないことを示
す。これらの結果は酵母において発現された異種ＧＰＣＲに結合したキメラＧタ
ンパク質の機能的活性を証明する。

【図１２】種々のキメラＧαタンパク質を含む酵母細胞における高および低レベルアデノ
シンＡ２ａ受容体発現に対するアゴニスト非依存性増殖応答を示す。高レベルで
発現された場合には、アデノシンＡ２ａ受容体はキメラＧタンパク質を含む酵母
細胞の一部のみの増殖を促進し、このことはこの受容体が酵母細胞において発現
した場合にＧαタンパク質結合選択性を保持するということを示すものである。
増殖促進活性はアデノシンＡ２ａ受容体が高レベルで発現される場合に最大とな
り、アデノシンＡ２ａ受容体発現が減少すると低下する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ４Ｈ０４５ 33/50 33/566 33/566 (Ｃ１２Ｎ 1/19 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マーガレット、レイアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、クラークスビル、ロード、ピー．オー．ボックス、400、アメリカン、サイアナミッド、カンパニー内 (72)発明者サンフォード、シルバーマンアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、クラークスビル、ロード、ピー．オー．ボックス、400、アメリカン、サイアナミッド、カンパニー内 (72)発明者カメリア、バーサンアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、クラークスビル、ロード、ピー．オー．ボックス、400、アメリカン、サイアナミッド、カンパニー内 (72)発明者ウィリアム、バウムバウフアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、クラークスビル、ロード、ピー．オー．ボックス、400、アメリカン、サイナミッド、カンパニー内 (72)発明者ユージェン、ツェンアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、クラークスビル、ロード、ピー．オー．ボックス、400、アメリカン、サイアナミッド、カンパニー内 (72)発明者アイリーン、マリー、カイコフスキーアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、シーエヌ8000、ワイス‐エアスト、リサーチ内 (72)発明者ブラッドリー、オールトン、オゼンバーガーアメリカ合衆国ニュージャージー州、プリンストン、シーエヌ8000、ワイス‐エアスト、リサーチ内Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB21 DA36 DA77 GC30 4B024 AA11 BA63 CA01 CA04 DA12 EA04 FA10 GA11 GA19 4B063 QA01 QA18 QQ61 QR48 QR60 QR76 QS05 QS36 QS38 QX02 4B064 AG20 CA06 CA19 CC24 DA13 4B065 AA80X AA90Y AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 CA51 DA50 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構成的に活性な異種Ｇタンパク質共役受容体を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２】宿主細胞が真核細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】異種Ｇタンパク質共役受容体がＧタンパク質共役受容体の細胞内ドメインで改
変されている、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】細胞内ドメインが第３の細胞内ループである、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】宿主細胞が酵母である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項６】異種Ｇタンパク質共役受容体がオーファン受容体である、請求項１〜５のいず
れか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】異種Ｇタンパク質共役受容体が、Ｇタンパク質共役受容体の第２の細胞内ルー
プに隣接するドメインのアミノ酸残基Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒで改変されている
、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】改変型Ｇタンパク質共役受容体がヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体であっ
て、その改変がアミノ酸残基３７３におけるトレオニンからリジンへの点突然変
異を含んでなる、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項９】改変が４４個のアミノ酸を有する第３の細胞内ループの末端切断型をさらに含
んでなる、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】異種Ｇタンパク質共役受容体がＭ３ムスカリン様アセチルコリン受容体である
、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１１】アスパラギン酸残基が疎水性アミノ酸によって置換されている、請求項１０に
記載の宿主細胞。
【請求項１２】疎水性アミノ酸がイソロイシンである、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】Ｇタンパク質共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であっ
て、（ａ）請求項１に記載の宿主細胞を試験化合物に曝し、さらに（ｂ）細胞増
殖に対する試験化合物の作用を測定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１４】宿主細胞が酵母である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】異種Ｇタンパク質共役受容体と、細胞に基づくアッセイでＧタンパク質共役受
容体の機能的応答の改変をもたらす宿主細胞遺伝子の突然変異とを含んでなる、
宿主細胞。
【請求項１６】突然変異がアゴニストにより刺激される増殖促進能の改変をもたらす、請求項
１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】突然変異が異種Ｇタンパク質共役受容体とヘテロ三量体Ｇタンパク質の間の結
合の改変をもたらすか、または受容体が細胞脱感作もしくは隔離−インターナリ
ゼーション機構と相互作用できないようにするか、または適切な原形質膜局在化
をもたらす、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】宿主細胞遺伝子が調節受容体タンパク質キナーゼをコードし、かつ、突然変異
が受容体のリン酸化を減少させる、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１９】調節受容体タンパク質キナーゼがＧタンパク質共役受容体キナーゼ、タンパク
質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、およびカゼインキナーゼからなる群から
選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】宿主細胞遺伝子がエンドサイトーシスまたは分解経路の成分をコードし、かつ
、突然変異が受容体の隔離、インターナリゼーションまたは分解を低下させる、
請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項２１】突然変異が宿主細胞膜のステロール類の比率または性質に作用する、請求項１
５に記載の宿主細胞。
【請求項２２】宿主細胞が酵母であって、宿主細胞遺伝子がＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ４、
ＥＲＧ５およびＥＲＧ６からなる群から選択される、請求項２１に記載の宿主細
胞。
【請求項２３】宿主細胞遺伝子がＥＲＧ６である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】異種Ｇタンパク質共役受容体がヒト・メラノコルチン受容体、ラット・ソマト
スタチンＳＳＴＲ２受容体、ラットＭ３ムスカリン様アセチルコリン受容体、お
よびラットＣＣＫＢ受容体からなる群から選択される、請求項２３に記載の宿主
細胞。
【請求項２５】宿主細胞が酵母であって、宿主細胞遺伝子がＨＥＭ１、ＨＥＭ３、ＳＵＴ１、
ＰＤＸ３、ＵＰＣ１およびＵＰＣ２（ＵＰＣ２０）からなる群から選択され、か
つ、突然変異が外から添加されたステロール類の存在下で宿主細胞を増殖させる
、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２６】Ｇタンパク共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であって
、（ａ）請求項１５、１８、２０または２１に記載の宿主細胞を試験化合物に曝
し、さらに（ｂ）細胞増殖に対する試験化合物の作用を測定する工程を含んでな
る、方法。
【請求項２７】宿主細胞内で構成的に活性な異種Ｇタンパク質共役受容体を発現させる方法で
あって、（ａ）改変型異種Ｇタンパク質共役受容体（この改変は構成的に活性なＧタン
パク質共役受容体をもたらす）をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターで
宿主細胞を形質転換し、さらに（ｂ）形質転換宿主細胞を培養して異種Ｇタンパク質共役受容体を発現させる
ことを含んでなる、方法。
【請求項２８】宿主細胞が酵母である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子がキメラＧαタンパク質をコードす
る、改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子を含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】宿主細胞が真核細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】酵母である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子が内因性Ｇαタンパク質のアミノ末
端ドメインをコードする第１の核酸配列を、異種Ｇαタンパク質のカルボキシ末
端をコードする第２の核酸配列と結合して含んでなる、請求項２９に記載の宿主
細胞。
【請求項３３】改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子が、内因性Ｇαタンパク質の５つの
カルボキシ末端アミノ酸をコードする第１の核酸配列と異種Ｇαタンパク質の５
つのカルボキシ末端アミノ酸配列をコードする第２の核酸配列との置換を含んで
なる、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３４】Ｇαタンパク質のアミノ末端ドメインがＧβタンパク質、Ｇγタンパク質およ
びエフェクター分子の相互作用ドメインを含んでなる、請求項３２に記載の宿主
細胞。
【請求項３５】改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子がＧＰＡ１である、請求項３２また
は３３に記載の宿主細胞。
【請求項３６】異種Ｇタンパク質共役受容体をさらに含んでなる、請求項３２または３３に記
載の宿主細胞。
【請求項３７】改変型Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子がＧＰＡ１であって、宿主細胞が酵
母である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】異種Ｇαタンパク質が哺乳類タンパク質である、請求項３６に記載の宿主細胞
。
【請求項３９】改変型ＧＰＡ１遺伝子が内因性Ｇαタンパク質のアミノ末端ドメインをコード
する第１の核酸配列を、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇαｚ
、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５およびＧα１６からなる
群から選択される哺乳類Ｇαタンパク質のカルボキシ末端をコードする第２の核
酸配列と結合して含んでなる、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項４０】改変型ＧＰＡ１遺伝子が、内因性Ｇαタンパク質の５つのカルボキシ末端アミ
ノ酸をコードする第１の核酸配列と、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇ
αｑ、Ｇα１１、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５およびＧα
１６からなる群から選択される哺乳類Ｇαタンパク質の５つのカルボキシ末端ア
ミノ酸配列をコードする第２の核酸配列との置換を含んでなる、請求項３７に記
載の宿主細胞。
【請求項４１】異種Ｇタンパク質共役受容体がラット・ソマトスタチンＳＳＴＲ２、ラット・
アデノシンＡ２ａ、ラット・ムスカリン様アセチルコリンＭ２およびＭ３、Ｄ．
メラノガスター(D. melanogaster)ムスカリン様アセチルコリンＭ１、ラット・
ニューロテンシンＮＴ−１、ヒト・バソプレシンＶ２、ラット・コレシストキニ
ンＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂ、ヒト・ゴナドトロピン放出ホルモンＧｎＲＨ、
ヒト・メラノコルチンＭＣＲ４、ヒト・アドレナリン作動性α２Ａ、アプリスタ
・カリフォルニカ(Aplysta californica)オクトパミンＯＡ１、ヒト・ボンベシ
ン受容体関連配列３（ＢＲＳ３）、ヒト・ヒスタミンＨ３、ならびにヒトβ２ア
ドレナリン作動性受容体からなる群から選択される、請求項３６に記載の宿主細
胞。
【請求項４２】第１の種のＧαタンパク質のアミノ末端ドメインをコードする第１の核酸配列
と、第１の種とは異なる第２の種のＧαタンパク質のカルボキシ末端をコードす
る第２の核酸配列とを含んでなる、キメラＧαタンパク質をコードする単離ＤＮ
Ａ配列。
【請求項４３】第１の種のＧαタンパク質のアミノ末端ドメインがＧβタンパク質、Ｇγタン
パク質およびエフェクター分子の相互作用ドメインを含んでなる、請求項４２に
記載のＤＮＡ配列。
【請求項４４】第１の種由来のＧαタンパク質の５つのカルボキシ末端アミノ酸をコードする
第１の核酸配列が、第１の種とは異なる第２の種由来のＧαタンパク質の５つの
カルボキシ末端アミノ酸配列をコードする第２の核酸配列に置換している、キメ
ラＧαタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項４５】請求項４２または４４に記載のＤＮＡにコードされているポリペプチド。
【請求項４６】宿主細胞においてアゴニストにより刺激される異種Ｇタンパク質共役受容体の
活性化を測定する方法であって、（ａ）異種Ｇタンパク質共役受容体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベク
ターで、請求項２９に記載の宿主細胞を形質転換し、（ｂ）形質転換宿主細胞を異種Ｇタンパク質共役受容体に特異的なアゴニスト
の存在下で培養し、さらに（ｃ）アゴニストに応答する宿主細胞の増殖を測定して、アゴニストにより刺
激される異種Ｇタンパク質共役受容体の活性化を決定することを含んでなる、方法。
【請求項４７】異種Ｇタンパク質共役受容体に対するＧαタンパク質の結合特異性を測定する
方法であって、（ａ）異種Ｇタンパク質共役受容体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベク
ターで、請求項２９に記載の宿主細胞を形質転換し、（ｂ）形質転換宿主細胞を異種Ｇタンパク質共役受容体に特異的なアゴニスト
の存在下で培養し、さらに（ｃ）アゴニストに応答する宿主細胞の増殖を測定して、異種Ｇタンパク質共
役受容体に対するＧαタンパク質の結合特異性を決定することを含んでなる、方法。
【請求項４８】宿主細胞が酵母である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】宿主細胞においてアゴニストにより刺激される異種Ｇタンパク質共役受容体の
活性化を測定する方法であって、（ａ）請求項３６に記載の宿主細胞を異種Ｇタンパク質共役受容体に特異的な
アゴニストの存在下で培養し、さらに（ｂ）アゴニストに応答する宿主細胞の増殖を測定して、アゴニストにより刺
激される異種Ｇタンパク質共役受容体の活性化を決定することを含んでなる、方法。
【請求項５０】異種Ｇタンパク質共役受容体に対するＧαタンパク質の結合特異性を測定する
方法であって、（ａ）請求項３６に記載の宿主細胞を異種Ｇタンパク質共役受容体に特異的な
アゴニストの存在下で培養し、さらに（ｂ）アゴニストに応答する宿主細胞の増殖を測定して、異種Ｇタンパク質共
役受容体に対するＧαタンパク質の結合特異性を決定することを含んでなる、方法。
【請求項５１】宿主細胞が酵母である、請求項４９または５０に記載の方法。