JPWO2006132406A1 - 下痢を伴う疾患の治療剤としてのｎｐｙｙ２アゴニスト - Google Patents
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Abstract
下痢を伴う疾患の治療剤としてＮＰＹ Ｙ２アゴニストを使用する。また、ＮＰＹ Ｙ２受容体を標的とした化合物の評価を行うことにより、前記疾患の治療を可能とする化合物の評価、スクリーニングが可能となる。すなわち、本発明により、新規な作用メカニズムにより下痢の抑制を可能とする薬剤を提供すること、及び、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することが可能となる。
Description
本発明は、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストの、下痢を伴う疾患の治療を目的とした新規用途に関する。また、ＮＰＹ Ｙ２を標的とする、下痢を伴う疾患に治療に有効な化合物の評価方法に関する。
ＮＰＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ）は３６アミノ酸からなるペプチドであり、１９８２年、立元らにより豚脳より単離された（Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻、６５９頁、１９８２年：非特許文献１）。ＮＰＹは中枢神経系及び末梢神経系に広く分布し、神経系における最も多量に存在するペプチドの一つとして、生体において多様な機能を司っている。
すなわち、ＮＰＹは中枢において食欲促進物質として働くとともに、各種ホルモンの分泌又は神経系の作用を介して脂肪蓄積を顕著に促進する。例えば、ＮＰＹの脳室内連続投与はこれらの作用に基づき、肥満及びインスリン抵抗性を誘発することが知られている。また、ＮＰＹは、うつ病、不安、精神分裂、痛み、痴呆及び概日リズムの調節などの中枢作用を持つことが知られている。さらに、ＮＰＹは、末梢において、交感神経終末にノルエピネフリンと共存し、交感神経系の緊張性と関係している。ＮＰＹの末梢投与は血管収縮を引き起こし、またノルエピネフリンを初めとする他の血管収縮物質の作用を増強することが知られている。
ＮＰＹは、その類縁体であるペプタイドＹＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＹＹ：以下、ＰＹＹと称する）及びパンクレアティック・ポリペプタイド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：以下、ＰＰと称する）と一部共通の受容体を介して、多種多様な薬理作用を有する。これらＮＰＹによる薬理作用はＮＰＹ Ｙ１からＹ５といった、少なくとも５種類の受容体の単独あるいは相互作用を介して惹起されることが知られている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、２９４頁、１９９７年：非特許文献２）。
ＮＰＹ Ｙ２受容体は、１９９５年にＲｏｓｅらによってクローニングされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２２６６１頁、１９９５年：非特許文献３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２６７５８頁、１９９５年：非特許文献４、等）。ＮＰＹ Ｙ２受容体は７回膜貫通構造を有し、Ｙ１受容体とアミノ酸レベルで３１％の相同性を示す。ノーザン解析の結果から、脳に強く発現し、小腸で弱い発現が見られるが、Ｙ１受容体のような広範な組織での発現は見られない。脳においては、特に大脳皮質、海馬に強く発現する一方、小脳や脊髄では殆ど発現が見られない。
ＮＰＹ及び関連ペプチドの機能は、中枢又は末梢神経系に存在するＮＰＹ受容体に結合することにより発現される。したがって、ＮＰＹ及び関連ペプチドのＮＰＹ受容体との結合を阻害すればこれらの薬理作用発現を阻止することができる。その結果、ＮＰＹ及び関連ペプチドのＮＰＹ受容体結合に拮抗する物質はＮＰＹ及び関連ペプチドが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患又は緑内障等の予防又は治療における有用性が期待できる。
このように、ＮＰＹ及び関連ペプチドとその受容体の生体内の機能の解明が前述の各種疾患に対する治療薬や診断薬の開発に繋がることから、ＮＰＹやＮＰＹ受容体を標的とした創薬研究が急速に進められている。
一方、下痢症、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＩＢＳ）のような下痢を伴う疾患は、消化器の疾患としてのみならず、現代の生活習慣を反映した慢性病として問題となっており、その症状を抑えるために既に多くの医薬が利用されている。このような医薬としては、鎮痙薬、乳酸菌製剤、抗菌剤、抗炎症薬、消化管運動調律薬などが知られており、メカニズムの観点から、ムスカリン拮抗薬、セロトニン拮抗薬、μオピオイド作動薬などが知られている（Ｄｒｕｇ ＆ Ａｇｉｎｇ、１８巻、２０１頁、２００１年：非特許文献５）
Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻、６５９頁、１９８２年 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、２９４頁、１９９７年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２２６６１頁、１９９５年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２６７５８頁、１９９５年 Ｄｒｕｇ ＆ Ａｇｉｎｇ、１８巻、２０１頁、２００１年
すなわち、ＮＰＹは中枢において食欲促進物質として働くとともに、各種ホルモンの分泌又は神経系の作用を介して脂肪蓄積を顕著に促進する。例えば、ＮＰＹの脳室内連続投与はこれらの作用に基づき、肥満及びインスリン抵抗性を誘発することが知られている。また、ＮＰＹは、うつ病、不安、精神分裂、痛み、痴呆及び概日リズムの調節などの中枢作用を持つことが知られている。さらに、ＮＰＹは、末梢において、交感神経終末にノルエピネフリンと共存し、交感神経系の緊張性と関係している。ＮＰＹの末梢投与は血管収縮を引き起こし、またノルエピネフリンを初めとする他の血管収縮物質の作用を増強することが知られている。
ＮＰＹは、その類縁体であるペプタイドＹＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＹＹ：以下、ＰＹＹと称する）及びパンクレアティック・ポリペプタイド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：以下、ＰＰと称する）と一部共通の受容体を介して、多種多様な薬理作用を有する。これらＮＰＹによる薬理作用はＮＰＹ Ｙ１からＹ５といった、少なくとも５種類の受容体の単独あるいは相互作用を介して惹起されることが知られている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、２９４頁、１９９７年：非特許文献２）。
ＮＰＹ Ｙ２受容体は、１９９５年にＲｏｓｅらによってクローニングされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２２６６１頁、１９９５年：非特許文献３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２６７５８頁、１９９５年：非特許文献４、等）。ＮＰＹ Ｙ２受容体は７回膜貫通構造を有し、Ｙ１受容体とアミノ酸レベルで３１％の相同性を示す。ノーザン解析の結果から、脳に強く発現し、小腸で弱い発現が見られるが、Ｙ１受容体のような広範な組織での発現は見られない。脳においては、特に大脳皮質、海馬に強く発現する一方、小脳や脊髄では殆ど発現が見られない。
ＮＰＹ及び関連ペプチドの機能は、中枢又は末梢神経系に存在するＮＰＹ受容体に結合することにより発現される。したがって、ＮＰＹ及び関連ペプチドのＮＰＹ受容体との結合を阻害すればこれらの薬理作用発現を阻止することができる。その結果、ＮＰＹ及び関連ペプチドのＮＰＹ受容体結合に拮抗する物質はＮＰＹ及び関連ペプチドが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患又は緑内障等の予防又は治療における有用性が期待できる。
このように、ＮＰＹ及び関連ペプチドとその受容体の生体内の機能の解明が前述の各種疾患に対する治療薬や診断薬の開発に繋がることから、ＮＰＹやＮＰＹ受容体を標的とした創薬研究が急速に進められている。
一方、下痢症、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＩＢＳ）のような下痢を伴う疾患は、消化器の疾患としてのみならず、現代の生活習慣を反映した慢性病として問題となっており、その症状を抑えるために既に多くの医薬が利用されている。このような医薬としては、鎮痙薬、乳酸菌製剤、抗菌剤、抗炎症薬、消化管運動調律薬などが知られており、メカニズムの観点から、ムスカリン拮抗薬、セロトニン拮抗薬、μオピオイド作動薬などが知られている（Ｄｒｕｇ ＆ Ａｇｉｎｇ、１８巻、２０１頁、２００１年：非特許文献５）
Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻、６５９頁、１９８２年 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、２９４頁、１９９７年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２２６６１頁、１９９５年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０巻、２６７５８頁、１９９５年 Ｄｒｕｇ ＆ Ａｇｉｎｇ、１８巻、２０１頁、２００１年
しかしながら、下痢を抑える薬剤として、より副作用が少なく、新たなメカニズムの薬剤が望まれているのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、新規な作用メカニズムにより下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することを目的とする。また、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが腸の運動を抑制し、下痢を抑える働きをすることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、下痢を伴う疾患の治療剤であることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストがＮＰＹ類縁体であることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。
さらに、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記疾患が下痢症又は過敏性腸症候群であることを特徴とする。
また、本発明の下痢を伴う疾患の治療剤は、上述のＮＰＹ Ｙ２アゴニストを含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、該接触前と比較して、ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＮＰＹ Ｙ２に接触させる工程と、当該接触によるＮＰＹ Ｙ２の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、前記化合物がＮＰＹ Ｙ２アゴニストであることを特徴とする。
さらに、本発明のＮＰＹ Ｙ２リガンドは、上述の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とする。
本発明によれば、新規な作用メカニズムによる下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、下痢抑制作用を有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、新規な作用メカニズムにより下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することを目的とする。また、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが腸の運動を抑制し、下痢を抑える働きをすることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、下痢を伴う疾患の治療剤であることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストがＮＰＹ類縁体であることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。
さらに、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、前記疾患が下痢症又は過敏性腸症候群であることを特徴とする。
また、本発明の下痢を伴う疾患の治療剤は、上述のＮＰＹ Ｙ２アゴニストを含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、該接触前と比較して、ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＮＰＹ Ｙ２に接触させる工程と、当該接触によるＮＰＹ Ｙ２の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、前記化合物がＮＰＹ Ｙ２アゴニストであることを特徴とする。
さらに、本発明のＮＰＹ Ｙ２リガンドは、上述の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とする。
本発明によれば、新規な作用メカニズムによる下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、下痢抑制作用を有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。
図１は、ＮＰＹ又はＰＹＹ３−３６投与によって生じた消化能の変化を示す図である。
図２は、ＰＹＹ３−３６投与によって生じた排糞量の経時的な変化を示す図である。
図３は、ＰＹＹ３−３６投与後４時間の総排糞量を示す図である。
図４は、下痢モデル動物にＰＹＹ３−３６及び各種薬剤を投与した際の排糞量の変化を示す図である。
図５は、下痢モデル動物にＰＹＹ３−３６及び各種薬剤を投与後４時間の総排糞量を示す図である。
図２は、ＰＹＹ３−３６投与によって生じた排糞量の経時的な変化を示す図である。
図３は、ＰＹＹ３−３６投与後４時間の総排糞量を示す図である。
図４は、下痢モデル動物にＰＹＹ３−３６及び各種薬剤を投与した際の排糞量の変化を示す図である。
図５は、下痢モデル動物にＰＹＹ３−３６及び各種薬剤を投与後４時間の総排糞量を示す図である。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明にかかる「ＮＰＹ Ｙ２」とは、上述したように、ＮＰＹの受容体として機能する７回膜貫通構造の分子をいう。また、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストの投与対象や、化合物の評価における評価対象がヒトであることから、ヒトＮＰＹ Ｙ２であることが好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２遺伝子には、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子と同等の生理機能を有し、ＮＰＹ受容体としての機能するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２遺伝子には、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明における「下痢を伴う疾患」とは、下痢を伴う疾患・症状であれば特に制限はなく、急性疾患であるか慢性疾患であるかは問わない。このような疾患・症状としては、例えば、下痢症（寄生虫性、細菌性、ウイルス性、物理的刺激、消化不良、精神障害、胃酸分泌不良、消化管の炎症性又はアレルギーを原因とするもの等）、過敏性腸症候群又は潰瘍性大腸炎等が挙げられる。
（１）ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト
本発明における「ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト」とは、ＮＰＹ Ｙ２受容体を介して細胞内シグナル伝達を引き起こす物質をいい、ＮＰＹ Ｙ２作動剤ともいう。また、本発明にかかるＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、ＮＰＹ Ｙ２受容体に親和性を示し、アゴニストとして機能する分子であればその分子種は特に制限されない。このような分子としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチドを挙げることができる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。また、前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、ＮＰＹの類縁体であるペプタイドＹＹ（例えば、ＰＹＹ３−３６）、ＮＰＹ１３−３６、［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ、Ａｃ−ＮＰＹ（２４−３６）［Ｌｅｕ２８，Ｌｅｕ３１］が挙げられる。
前記のＰＹＹ３−３６（配列番号１）は、ＮＰＹと６９％の相同性を有するＰＹＹ（配列番号２）においてＮ末端の２アミノ酸が欠失したペプチドであり、摂食を抑制する分子として知られている（Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、６５０頁、２００２年）。ＰＹＹ３−３６及びＰＹＹはいずれもＮＰＹと類似の活性を有し、ＮＰＹ受容体に対してアゴニストとしての親和性を有する。
ＰＹＹ３−３６は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとしての機能を有し且つ当該アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドも本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストに含まれる。かかる置換、欠失、付加又は挿入のアミノ酸数としては、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとしての機能を有する限り特に制限はないが、１〜１０アミノ酸であることが好ましく、１〜８アミノ酸であることがより好ましく、１〜５アミノ酸であることがさらに好ましく、１〜３アミノ酸であることが特に好ましい。
本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、化合物であれば化合物種に応じた当業者に公知の合成法により合成することができる。また、化合物が天然物由来であれば、当該天然物より所定の抽出方法により精製することができる。さらに、当該アゴニストがペプチドであれば、当業者に公知の方法により合成することができる。
本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストをヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該アゴニストがＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
ＮＰＹ Ｙ２アゴニストの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
（２）化合物の評価
ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はタンパク質を用いて、ＮＰＹ Ｙ２に作用する化合物の評価をすることができる。ＮＰＹ Ｙ２に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の化合物の評価方法は、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、ＮＰＹ Ｙ２が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内（細胞膜上を含む）に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＮＰＹ Ｙ２が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをＮＰＹ Ｙ２が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、ｃＡＭＰ、またはＣａ２＋の濃度変化（ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）等が使用できる）、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーション）を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子（ＮＰＹ Ｙ２も含む）の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ＮＰＹ Ｙ２を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＮＰＹ Ｙ２を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたＮＰＹ Ｙ２タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をＮＰＹ Ｙ２に接触させ、次に、接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＮＰＹ Ｙ２タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ＮＰＹ Ｙ２に対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＮＰＹ Ｙ２が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してＮＰＹ Ｙ２へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、下痢を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効であり、中でも、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとして機能する化合物は、特に下痢を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効である。
本発明にかかる「ＮＰＹ Ｙ２」とは、上述したように、ＮＰＹの受容体として機能する７回膜貫通構造の分子をいう。また、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストの投与対象や、化合物の評価における評価対象がヒトであることから、ヒトＮＰＹ Ｙ２であることが好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２遺伝子には、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子と同等の生理機能を有し、ＮＰＹ受容体としての機能するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２遺伝子には、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明における「下痢を伴う疾患」とは、下痢を伴う疾患・症状であれば特に制限はなく、急性疾患であるか慢性疾患であるかは問わない。このような疾患・症状としては、例えば、下痢症（寄生虫性、細菌性、ウイルス性、物理的刺激、消化不良、精神障害、胃酸分泌不良、消化管の炎症性又はアレルギーを原因とするもの等）、過敏性腸症候群又は潰瘍性大腸炎等が挙げられる。
（１）ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト
本発明における「ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト」とは、ＮＰＹ Ｙ２受容体を介して細胞内シグナル伝達を引き起こす物質をいい、ＮＰＹ Ｙ２作動剤ともいう。また、本発明にかかるＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、ＮＰＹ Ｙ２受容体に親和性を示し、アゴニストとして機能する分子であればその分子種は特に制限されない。このような分子としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチドを挙げることができる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。また、前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、ＮＰＹの類縁体であるペプタイドＹＹ（例えば、ＰＹＹ３−３６）、ＮＰＹ１３−３６、［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ、Ａｃ−ＮＰＹ（２４−３６）［Ｌｅｕ２８，Ｌｅｕ３１］が挙げられる。
前記のＰＹＹ３−３６（配列番号１）は、ＮＰＹと６９％の相同性を有するＰＹＹ（配列番号２）においてＮ末端の２アミノ酸が欠失したペプチドであり、摂食を抑制する分子として知られている（Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、６５０頁、２００２年）。ＰＹＹ３−３６及びＰＹＹはいずれもＮＰＹと類似の活性を有し、ＮＰＹ受容体に対してアゴニストとしての親和性を有する。
ＰＹＹ３−３６は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとしての機能を有し且つ当該アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドも本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストに含まれる。かかる置換、欠失、付加又は挿入のアミノ酸数としては、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとしての機能を有する限り特に制限はないが、１〜１０アミノ酸であることが好ましく、１〜８アミノ酸であることがより好ましく、１〜５アミノ酸であることがさらに好ましく、１〜３アミノ酸であることが特に好ましい。
本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストは、化合物であれば化合物種に応じた当業者に公知の合成法により合成することができる。また、化合物が天然物由来であれば、当該天然物より所定の抽出方法により精製することができる。さらに、当該アゴニストがペプチドであれば、当業者に公知の方法により合成することができる。
本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニストをヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該アゴニストがＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
ＮＰＹ Ｙ２アゴニストの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
（２）化合物の評価
ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はタンパク質を用いて、ＮＰＹ Ｙ２に作用する化合物の評価をすることができる。ＮＰＹ Ｙ２に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ Ｙ２に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の化合物の評価方法は、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、ＮＰＹ Ｙ２が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内（細胞膜上を含む）に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＮＰＹ Ｙ２が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをＮＰＹ Ｙ２が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、ｃＡＭＰ、またはＣａ２＋の濃度変化（ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）等が使用できる）、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーション）を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子（ＮＰＹ Ｙ２も含む）の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ＮＰＹ Ｙ２を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＮＰＹ Ｙ２を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたＮＰＹ Ｙ２タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をＮＰＹ Ｙ２に接触させ、次に、接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＮＰＹ Ｙ２タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたＮＰＹ Ｙ２の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ＮＰＹ Ｙ２に対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＮＰＹ Ｙ２が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してＮＰＹ Ｙ２へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るＮＰＹ Ｙ２を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ＮＰＹ Ｙ２への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、下痢を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効であり、中でも、ＮＰＹ Ｙ２アゴニストとして機能する化合物は、特に下痢を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効である。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による胃小腸運動能の検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による胃小腸運動能の変化を調べるため、下記の試験を行った。
先ず、試験に用いるマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を準備した。マウスは環境を制御した動物室（温度 ２３℃、相対湿度 ５５％、照明時間 ７：００から１９：００）にて床敷をいれたケージに個別飼育し、げっ歯類用餌（ＣＥ−２、日本クレア社）および飲料水は自由摂取させた。
次に、マウスにＮＰＹ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）又はＰＹＹ３−３６（０．３ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した後、胃小腸運動能を測定した。同時に、溶媒のみを投与したコントロールマウス（ｖｅｈｉｃｌｅ）を準備し、これについても同様に試験を行った。胃小腸運動能は、次のように測定した。すなわち、チャコール粉末を０．５％メチルセルロース溶液に懸濁してマウスに経口投与し、３０分経過後、胃に入ったチャコールが腸管のどこまで移動したかを解剖して計測した。同時に、胃幽門部から盲腸起始部までの小腸の全長も計測し、チャコールの移動距離の小腸全長に対する割合（％）をＧＩ（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）ｍｏｔｉｌｉｔｙとしてグラフにプロットした。
図１に示すとおり、ＮＰＹ又はＰＹＹ３−３６を投与したマウスはコントロールマウスと比較してＧＩ ｍｏｔｉｌｉｔｙが低いことが明らかとなった。すなわち、ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与により、胃小腸運動能が抑制されたことが確認できた。
［実施例２］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による結腸運動の指標として、排糞量の変化の検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による結腸運動の指標として、排糞量の変化を調べるため、下記の試験を行った。
試験にはマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を使用し、実施例１と同様の条件で飼育、給餌を行った。
次に、マウスにＰＹＹ３−３６（３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、経時的（１、２、３及び４時間）に排糞量を測定した。同時に、溶媒のみを投与したコントロールマウスについても排糞量の測定を行った。
図２に示すとおり、投与後１時間ですでに排糞量に差が生じはじめ、その後もコントロールマウスと比較してＰＹＹ３−３６を投与したマウスの排糞量が有意に少なかった。また、図３に示すとおり、ＰＹＹ３−３６投与後４時間の総排糞量についてもコントロールマウスと比較して顕著な差が見られた。すなわち、ＰＹＹ３−３６投与によって結腸腸管運動が抑制され、排便が抑制されたことが確認できた。
［実施例３及び比較例１〜２］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する抑制作用を検討するため、下記の試験を行った。
試験にはマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を使用し、実施例１と同様の条件で飼育、給餌を行った。
次に、マウスにＰＹＹ３−３６（３ｍｇ／ｋｇ）及びその他の被験薬（ロペラミド（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）１ｍｇ／ｋｇ（比較例１）及びアトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）１０ｍｇ／ｋｇ（比較例２））を腹腔内投与し、その投与１５分後にひまし油（０．３ｍｌ／ａｎｉｍａｌ）を経口投与した。経時的（１、２、及び４時間）に排糞量及び下痢スコア（正常０、軟便１、水状便２）を測定した。同時に、溶媒のみを投与しひまし油を投与しなかったマウスについても同様の測定を行った。
図４に示すとおり、ＰＹＹ３−３６前投与マウスはひまし油処置１時間後ですでに排糞量に抑制が生じており、その後も溶媒＋ひまし油処置コントロールマウスと比較して排糞量が有意に少なかった。また、図５に示すとおり、ひまし油処置から４時間後までに観察された最大下痢スコアは、溶媒＋ひまし油処置コントロールマウスと比較してＰＹＹ３−３６前投与マウスで顕著に抑制された。すなわち、ＰＹＹ３−３６投与によって結腸腸管運動が抑制され、下痢症状の抑制が確認できた。また、既存の止瀉薬であるロペラミド及びアトロピンとの比較においてもＰＹＹ３−３６の下痢症状の高い抑制効果が見られた。
［実施例１］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による胃小腸運動能の検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による胃小腸運動能の変化を調べるため、下記の試験を行った。
先ず、試験に用いるマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を準備した。マウスは環境を制御した動物室（温度 ２３℃、相対湿度 ５５％、照明時間 ７：００から１９：００）にて床敷をいれたケージに個別飼育し、げっ歯類用餌（ＣＥ−２、日本クレア社）および飲料水は自由摂取させた。
次に、マウスにＮＰＹ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）又はＰＹＹ３−３６（０．３ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した後、胃小腸運動能を測定した。同時に、溶媒のみを投与したコントロールマウス（ｖｅｈｉｃｌｅ）を準備し、これについても同様に試験を行った。胃小腸運動能は、次のように測定した。すなわち、チャコール粉末を０．５％メチルセルロース溶液に懸濁してマウスに経口投与し、３０分経過後、胃に入ったチャコールが腸管のどこまで移動したかを解剖して計測した。同時に、胃幽門部から盲腸起始部までの小腸の全長も計測し、チャコールの移動距離の小腸全長に対する割合（％）をＧＩ（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）ｍｏｔｉｌｉｔｙとしてグラフにプロットした。
図１に示すとおり、ＮＰＹ又はＰＹＹ３−３６を投与したマウスはコントロールマウスと比較してＧＩ ｍｏｔｉｌｉｔｙが低いことが明らかとなった。すなわち、ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与により、胃小腸運動能が抑制されたことが確認できた。
［実施例２］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による結腸運動の指標として、排糞量の変化の検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与による結腸運動の指標として、排糞量の変化を調べるため、下記の試験を行った。
試験にはマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を使用し、実施例１と同様の条件で飼育、給餌を行った。
次に、マウスにＰＹＹ３−３６（３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、経時的（１、２、３及び４時間）に排糞量を測定した。同時に、溶媒のみを投与したコントロールマウスについても排糞量の測定を行った。
図２に示すとおり、投与後１時間ですでに排糞量に差が生じはじめ、その後もコントロールマウスと比較してＰＹＹ３−３６を投与したマウスの排糞量が有意に少なかった。また、図３に示すとおり、ＰＹＹ３−３６投与後４時間の総排糞量についてもコントロールマウスと比較して顕著な差が見られた。すなわち、ＰＹＹ３−３６投与によって結腸腸管運動が抑制され、排便が抑制されたことが確認できた。
［実施例３及び比較例１〜２］
（ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する検討）
ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する抑制作用を検討するため、下記の試験を行った。
試験にはマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を使用し、実施例１と同様の条件で飼育、給餌を行った。
次に、マウスにＰＹＹ３−３６（３ｍｇ／ｋｇ）及びその他の被験薬（ロペラミド（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）１ｍｇ／ｋｇ（比較例１）及びアトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）１０ｍｇ／ｋｇ（比較例２））を腹腔内投与し、その投与１５分後にひまし油（０．３ｍｌ／ａｎｉｍａｌ）を経口投与した。経時的（１、２、及び４時間）に排糞量及び下痢スコア（正常０、軟便１、水状便２）を測定した。同時に、溶媒のみを投与しひまし油を投与しなかったマウスについても同様の測定を行った。
図４に示すとおり、ＰＹＹ３−３６前投与マウスはひまし油処置１時間後ですでに排糞量に抑制が生じており、その後も溶媒＋ひまし油処置コントロールマウスと比較して排糞量が有意に少なかった。また、図５に示すとおり、ひまし油処置から４時間後までに観察された最大下痢スコアは、溶媒＋ひまし油処置コントロールマウスと比較してＰＹＹ３−３６前投与マウスで顕著に抑制された。すなわち、ＰＹＹ３−３６投与によって結腸腸管運動が抑制され、下痢症状の抑制が確認できた。また、既存の止瀉薬であるロペラミド及びアトロピンとの比較においてもＰＹＹ３−３６の下痢症状の高い抑制効果が見られた。
以上説明したように、本発明のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト及び化合物の評価方法によれば、新規な作用メカニズムによる下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、下痢抑制作用を有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。
［配列表］
［配列表］
Claims (13)
- 下痢を伴う疾患の治療剤であることを特徴とするＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストがＮＰＹ類縁体であることを特徴とする請求項１に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 前記ＮＰＹ Ｙ２アゴニストが、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 前記疾患が下痢症又は過敏性腸症候群であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニスト。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のＮＰＹ Ｙ２アゴニストを含むことを特徴とする下痢を伴う疾患の治療剤。
- 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＮＰＹ Ｙ２に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ Ｙ２遺伝子を導入し、ＮＰＹ Ｙ２を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
該接触前と比較して、ＮＰＹ Ｙ２又はＮＰＹ Ｙ２を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
被検化合物を、ＮＰＹ Ｙ２に接触させる工程と、
該接触によるＮＰＹ Ｙ２の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 前記化合物がＮＰＹ Ｙ２アゴニストであることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
- 請求項８〜１２のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とするＮＰＹ Ｙ２リガンド。
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