BRPI0710597A2 - método de uso do receptor gpr119 para identificar compostos úteis para aumento da massa óssea em um indivìduo - Google Patents

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Abstract

USO DE GPCR, DE UMA CéLULA HOSPEDEIRA OU DE UMA MEMBRANA DA MESMA E MéTODOS PARA IDENTIFICAçãO DE SECRETAGOGOS DE GIP, BEM COMO MéTODOS DE PREPARAçãO DE UMA COMPOSIçãO FARMACEUTICA COMPREENDENDO AGONISTA DE GPRII9. A presente invenção refere-se a métodos de uso do receptor GPRI 19 para identificar compostos úteis para aumento da massa óssea em um indivíduo. Agonistas do receptor GRPII9 são úteis como agentes terapêuticos para o tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e para aumentar a massa óssea em um individuo. Agonistas do receptor GPR1 19 promovem a formação de osso em um individuo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE GP- CR, DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA OU DE UMA MEMBRANA DA MESMA E MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE SECRETAGOGOS DE GIP, BEM COMO MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO AGONISTA DE GPR119"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos de uso do receptor GPR119 para identificar compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Agonistas do receptor GPR119 são úteis como agentes terapêuticos para o trata- mento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Agonistas do receptor GPR119 promovem a formação óssea em um indivíduo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A discussão a seguir se destina a facilitar a compreensão da invenção, mas não se destina, nem é admitida como sendo a técnica anterior à invenção.
A. Osteoporose
A osteoporose é uma doença incapacitante caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração da microarquitetura da estrutura es- quelética, levando à resistência óssea comprometida, a qual predispõe um paciente a um risco aumentado de fraturas por fragilidade. A osteoporose afeta mais de 75 milhões de pessoas na Europa, Japão e Estados Unidos e causa mais de 2,3 milhões de fraturas Europa e nos Estados Unidos apenas. Nos Estados Unidos, a osteoporose afeta pelo menos 25% de todas as mu- lheres brancas na pós-menopausa e a proporção se eleva para 70% em mu- lheres com mais de 80 anos. Uma em três mulheres de mais de 50 anos te- rão uma fratura osteoporótica que causa um fardo social e financeiro consi- derável para a sociedade. A doença não está limitada à mulheres; homens mais velhos também podem ser afetados. Em 2050, a incidência mundial de fratura de quadril em homens é projetada como aumentando em 310% e 240% em mulheres. O risco combinado ao longo da vida para fraturas verte- brais, de quadril e antebraço que se apresentam clinicamente é em torno de 40%, equivalente ao risco de doença cardíaca. Fraturas osteoporóticas, por tanto, causem mortalidade, morbidade e custo econômico substanciais. Com uma população em envelhecimento, o número de fraturas osteoporóticas é seus custos pelo menos duplicarão nos próximos 50 anos, a menos que es- tratégias preventivas eficientes sejam desenvolvidas (vide, por exemplo, Atik e outros, Clin Orthop Relat Res (2006) 443: 19-24; Raisz, J Clin Invest (2005) 115: 3318-3325; e World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).
B. Polipeptídeo insulinotrópico glicose-dependente (GIP)
O polipeptídeo insulinotrópico glicose-dependente (GIP, também conhecido como polipeptídeo inibitório gástrico) é um hormônio de incretina peptídico de 42 aminoácidos que é liberado de células K duodenais endócri- nas após ingestão de uma refeição. A quantidade de GIP liberado é gran- demente dependente da quantidade de glicose consumida. Foi mostrado que o GIP estimula a secreção de insulina glicose-dependente em células beta pancreáticas. O GIP media suas ações através de um receptor acopla- do à proteína G específico, isto é, GIPR.
Uma vez que o GIP contém uma alanina na posição 2, ele é um excelente substrato para a dipeptidil peptidase-4 (DPP-IV)1 uma enzima que regula a degradação de GIP. GIP de comprimento total (1-42) é rapidamente convertido em GIP (3-42) bioinativo dentro de minutos de secreção das célu- las K do intestino. Foi mostrado que a inibição de DPP-IV aumenta a bioati- vidade do GIP (vide, por exemplo, Drucker, Cell Metab (2006) 3: 153-165; Mclntosh e outros, Regul Pept (2005) 128: 159-165; Deacon, Regul Pept (2005) 128: 117-124; e Ahren e outros, Endocrinology (2005) 146: 2055- 2059). Análise do GIP bioativo de comprimento total, por exemplo, no san- gue, pode ser realizada usando ensaios N-terminais específicos (vide, por exemplo, Deacon e outros, J Clin Endocrinol Metab (2000) 85: 3575-3581).
Recentemente, foi mostrado que o GIP promove a formação de osso. Foi mostrado que o GIP ativa receptores osteoblásticos, resultando em aumentos na síntese de colágeno do tipo I e atividade de fosfatase alcalina, ambos associados à formação de osso. Foi mostrado que o GIP inibe a ati- vidade e diferenciação de osteoclasto in vitro. Foi mostrado que a adminis- tração de GIP previne a perda óssea em virtude de ovariectomia. Camun- dongos com "knock-out" para o receptor de GIP (GIPR) evidenciam um ta- manho de osso diminuído, menor massa óssea, microarquitetura óssea alte- rada e propriedades biomecânicas e parâmetros alterados para reconstitui- ção óssea, especialmente em formação de osso (vide, por exemplo, Zhong e outros, Am J Physiol Endocrinol Metab (2007) 292: E543-E548; Bollag e ou- tros, Endocrinology (2000) 141: 1228-1235; Bollag e outros, Mol Cell Endo- crinol (2001) 177: 35-41; Xie e outros, Bone (2005) 37: 759-769; e Tsukiya- ma e outros, Mol Endocrinol (2006) 20: 1644-1651).
A utilidade do GIP para manutenção ou aumento da densidade ou formação óssea é conhecida pelo United States Trademark and Patent Office através da emissão da Patente dos Estados Unidos No. 6.410.508 para o tratamento de mineralização óssea reduzida através de administração de peptídeo GIP. Contudo, os agonistas peptídicos de GIP atuais sofrem de uma falta de biodisponibilidade oral, tendo um impacto negativo sobre a a- ceitação do paciente. Uma abordagem alternativa atraente é desenvolver uma composição oralmente ativa para aumento do nível endógeno de ativi- dade de GIP.
C. GPR119
O GPR119 é um receptor acoplado à proteína G (GPR119; por exemplo, GPR119 humano, Acesso ao GenBank® No. AAP72125 e alelos do mesmo, por exemplo, GPR119 de camundongo, Acesso ao GenBank® No. AY288423 e alelos do mesmo). A ativação de GPR119, tal como através de um agonista, leva a uma elevação do nível de cAMP intracelular, consis- tente com GPR119 sendo acoplado a Gs. Na literatura de patente, o G- PR119 foi inferido como RUP3 (por exemplo, WO 00/31258); o GPR119 também foi inferido como um receptor insulinotrópico glicose-dependente (GDIR).
D. Receptores acoplados à proteína G
Embora exista uma série de classes de receptor em seres hu- manos, no momento, a mais abundante e terapeuticamente relevante é re- presentada pela classe dos receptores acoplados à proteína G (GPCR). Es- tima-se que existem pelo menos 30.000-40.00 genes dentro do genoma hu- mano e, desses, estima-se que aproximadamente 2% codifiquem GPCRs.
GPCRs representam uma área importante para o desenvolvi- mento de produtos farmacêuticos. Fármacos ativos em GPCRs têm benefí- cio terapêutico através de um amplo espectro de doenças humanas tão di- versas quanto dor, disfunção cognitiva, hipertensão, úlceras peptídicas, rinite e asma. De aproximadamente 500 fármacos clinicamente comercializados, mais de 30% são moduladores da função de GPCR. Esses fármacos exer- cem sua atividade em aproximadamente 30 GPCRs bem caracterizados (vi- de, por exemplo, Wise e outros, Annu Rev Pharmacol Toxicol (2004) 44: 43-66).
GPCRs compartilham um motivo estrutural em comum tendo sete seqüências de entre 22 a 24 aminoácidos hidrofóbicos que formam sete alfa hélices, cada uma das quais abrange a membrana (cada trecho é identi- ficado pelo número, isto é, transmembrana-1 (TM-1), transmembrana-2 (TM- 2), etc.). As hélices transmembrana são unidas por fitas de aminoácidos en- tre a transmembrana-2 e transmembrana-3, transmembrana-4 e transmem- brana-5 e transmembrana-6 e transmembrana-7 sobre o lado exterior ou "extracelular" da membrana celular (essas são também referidas como regi- ões "extracelulares" 1, 2 e 3 (EC-1, EC-2 e EC-3), respectivamente). As héli- ces transmembrana são também unidas por fitas de aminoácidos entre a transmembrana-1 e transmembrana-2, transmembrana-3 e transmembrana- 4 e transmembrana-5 e transmembrana-6 sobre o interior ou lado "intracelu- lar" da membrana celular (essas são referidas como regiões "intracelulares" 1, 2 e 3 (1C-1, IC-2 e IC-3), respectivamente). O "carbóxi" término ("C") do receptor repousa no espaço intracelular dentro da célula e o "amino" término ("N") do receptor repousa no espaço extracelular fora da célula.
Geralmente, quando um ligante se liga ao receptor (freqüente- mente referido como "ativação" do receptor), há uma alteração na conforma- ção do receptor que facilita o acoplamento entre a região intracelular e uma "proteína G" intracelular. Foi reportado que GPCRs são "promíscuos" com relação às proteínas G, isto é, que um GPCR pode interagir com mais de uma proteína G. Vide Kenakin, Life Sciences (1988) 43:1095-1101. Embora existam outras proteína G, atualmente, Gq, Gs, Gi, Gz e Go são as proteínas G que foram identificadas. Acoplamento de GPCR ligante-ativado com a pro- teína G inicia um processo de cascata de sinalização (referido como "trans- dução de sinal"). Sob condições normais, a transdução de sinal, por fim, re- sulta em ativação celular ou inibição celular. Embora não desejando estar preso à teoria, acredita-se que o loop IC-3, bem como o carbóxi término do receptor interajam com a proteína G.
Existem também proteínas G promíscuas, as quais parecem se acoplar à várias classes de GPCRs na via de fosfolipase C, tais como G15 ou G16 (Offermanns & Simon, J Biol Chem (1995) 270: 15175-80) ou proteí- nas G quiméricas projetadas para se acoplar a um grande número de dife- rentes GPCRs na mesma via, por exemplo, fosfolipase C (Milligan & Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20: 118-24).
Sob condições fisiológicas, GPCRs existem na membrana celu- lar em equilíbrio entre duas conformações diferentes: um estado "inativo" e um estado "ativo". Um receptor em um estado inativo é incapaz de se ligar à via de transdução de sinalização intracelular para iniciar a transdução de sinal que leva a uma resposta biológica. Alteração da conformação do recep- tor ao estado ativo permite ligação à via de transdução (via a proteína G) e produz uma resposta biológica.
Um receptor pode ser estabilizado em um estado ativo através de um ligante ou um composto, tal como um fármaco. Descobertas recentes incluindo, mas não exclusivamente limitado, a modificações na seqüência de aminoácido do receptor, proporcionam outros meios que não ligantes ou fármacos para promover e estabilizar o receptor em uma conformação ativa. Esses meios estabilizam eficazmente o receptor em um estado ativo simu- lando o efeito de ligação do receptor ao ligante. Estabilização através de tais meios ligante-dependentes é denominada "ativação constitutiva de receptor".
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere à descoberta inesperada pelo Re- querente de que a administração de um agonista de GPR119 a um indiví- duo, tal como através de administração oral, pode atuar no receptor GPR119 para aumentar o nível de GIP no indivíduo. A presente invenção se caracte- rizada por métodos referentes ao GPR119 para identificação de secretago- gos de GIP, compostos úteis para o tratamento ou prevenção de uma condi- ção caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose e compos- tos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Um agonista de GPR119 é útil para promover (por exemplo, aumentar) a formação óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
A seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo GPR119 humano é fornecida em SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácido do refe- rido polipeptídeo GPR119 humano codificado é fornecida em SEQ ID NO: 2.
Em um primeiro aspecto, a invenção se caracterizada por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas de:
(a) contato de um composto de teste com uma célula hospedeira ou com a membrana de uma célula hospedeira compreendendo um receptor acoplado à proteína G, em que o receptor acoplado à proteína G compreen- de uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor acoplado à proteína G does não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2; (iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(v) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à pro- teína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(vi) uma variante de SEQ ID NO: 2; (vii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b1) uma seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii); e
(b) determinação da capacidade do composto de teste de esti- mular a funcionalidade de o receptor acoplado à proteína G; em que a capa- cidade do composto de teste de estimular a funcionalidade de o receptor acoplado à proteína G é indicativa do composto de teste sendo um secreta- gogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condi- ção caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumen- tar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína
G é recombinante.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de secretagogos de GIP.
Em determinadas modalidades, o método compreende identifi- cação de um agonista do receptor.
Em determinadas modalidades, o método compreende identifi- cação de um agonista parcial do receptor.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indi- víduo.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(d) contato de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP; e
(e) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um com- posto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de ver- tebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas moda- lidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em determinadas modali- dades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compre- ende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogeno- mics J (2006) 6: 131-140). Em determinadas modalidades, a célula entero- endócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determinadas mo- dalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante mani- pulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(d) administração de um composto o qual estimula a funcionali- dade do receptor na etapa (b) a um vertebrado; e
(e) determinação se o composto aumenta um nível de GIP no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento de ou prevenção uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo. Em determi- nadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modali- dades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas moda- lidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas moda- lidades, o mamífero é um mamífero não-humano. A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumen- tar a massa óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(d) administração de um composto o qual estimula a funcionali- dade do receptor na etapa (b) a um vertebrado; e
(e) determinação se o composto aumenta um nível de massa óssea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível de massa óssea no vertebrado é indicativa de o composto de teste sendo um compos- to útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por bai- xa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no vertebrado. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando absormetria por raio X com energia dupla (DXA). Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende medição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T-escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa ós- sea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis). Em determinadas modalida- des, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o verte- brado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o ver- tebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o ma- mífero é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o verte- brado ou mamífero é um rato ovariectomizado ou um camundongo ovariec- tomizado.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP1 compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa(b);
(d) opcionalmente fornecimento de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(e) contato de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP; e
(f) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de se- cretar GIP é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a célula enteroen- dócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em de- terminadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em de- terminadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido deri- vado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula entero- endócrina compreende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e ou- tros, Pharmacogenomics J (2006) 6:131-140). Em determinadas modalida- des, a célula enteroendócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determinadas modalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante manipulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(d) opcionalmente fornecimento de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(e) administração de um composto o qual estimula a funcionali- dade do receptor na etapa (b) a um vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento de ou prevenção uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) e (b) desse primeiro aspecto e ainda compreendendo:
(c) opcionalmente síntese de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(d) opcionalmente fornecimento de um composto o qual estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b);
(e) administração de um composto o qual estimula a funcionali- dade do receptor na etapa (b) ao vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no indivíduo. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende me- dição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referi- da medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T- escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa óssea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Te- chnical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteopo- rosis).
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado ou mamífero é um rato ovariec- tomizado ou um camundongo ovariectomizado.
Em determinadas modalidades, o secretagogo de GIP identifica- do ou o composto identificado útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou o composto identificado útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo é um agonista do recep- tor. Em algumas modalidades, o agonista é um agonista parcial.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é acoplado a uma proteína G. Em determinadas modalidades, ativação do receptor acoplado à proteína G aumenta o nível de cAMP intracelular. Em determinadas modalidades, a proteína G é Gs.
Em determinadas modalidades, a amostra de DNA humano é DNA genômico humano.
Em algumas modalidades, a reação em cadeia de polimerase é reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Métodos de RT-PCR são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Em de- terminadas modalidades, a amostra de DNA humano é cDNA humano. Em determinadas modalidades, o cDNA é de um tecido humano que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhota pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de um tipo de célula humana que expressa GPR119. Em algumas modalida- des, o cDNA é de uma célula beta pancreática. Em algumas modalidades, o cDNA é de uma linhagem de célula pancreática.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em determi- nadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um po- linucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, um receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente à (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor para o qual (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é am- plificável através de reação em cadeia de polimerase exibe o nível detectá- vel de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitu- tiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalida- des, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo so- fram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, condições de hibridização es- tringente compreende hibridização a 42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5 χ SSC (1 χ SSC = NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x Solução de Denhardt, sul- fato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalha- do, desnaturado, seguido por lavagem a 65°C em uma solução compreen- dendo 0,1 χ SSC. Técnicas de hibridização são bem-conhecidas por aqueles versados.
Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um poli- nucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao com- plemento de SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência
ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotí- deo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP in- tracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. Métodos para fazer uma estrutura de fusão de GPCR/G são bem-conhecidos por a- queles versados (vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 02/42461).
Em determinadas modalidades, a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o receptor acoplado à proteína G. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é pCMV. Esse vetor foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC) em 13 de Outubro de 1998 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 EUA) sob as condições do Tra- tado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente. O DNA foi testado pela ATCC e determinado como sendo viável. A ATCC atribuiu o seguinte número de depósito ao pCMV: ATCC N9203351. Outros vetores de expres- são adequados serão prontamente evidentes para aqueles versados na téc- nica e uma ampla variedade de vetores de expressão estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Clontech1 Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; e Invitrogen, Carlsbad, CA).
Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de vertebrado. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de mamífero é selecionada do grupo consistindo em uma célula 293, uma célula 293T, uma célula CHO, uma célula MCB3901 e uma célula COS-7. Em algumas moda- lidades, a célula hospedeira é uma célula de levedo. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é uma célula de melanoforo. Outras células hospe- deiras adequadas serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica e uma ampla variedade de linhagens de célula estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.
Em determinadas modalidades, a referida determinação é con- sistente com o receptor acoplado à proteína G sendo um receptor Gs- acoplado.
Em algumas modalidades, a referida determinação é consistente com o receptor acoplado à proteína G sendo acoplado através de uma prote- ína G promíscua, tal como Gal5 ou Gal6, à via de fosfolipase C. Proteínas G promíscuas são bem-conhecidas por aqueles versados (vide, por exemplo, Offermanns e outros, J Biol Chem (1995) 270: 15175-15180). Em algumas modalidades, a referida determinação é consistente com o receptor acoplado à proteína G sendo acoplado através de uma proteína G quimérica, por e- xemplo, à via de fosfolipase C. Proteínas G quiméricas são bem-conhecidas por aqueles versados (vide, por exemplo, Milligan e outros, Trends in Phar- maceutical Sciences (1999) 20:118-124; e WO 02/42461).
Em algumas modalidades, a referida determinação é através da medição do nível de um segundo mensageiro.
Em algumas modalidades, a referida determinação é através da medição do nível de um segundo mensageiro selecionado do grupo consis- tindo em AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), 1,4,5-trifosfato de inosi- tol (IP3), diacilglicerol (DAG), atividade de quínase MAP1 atividade de quína- se-1 de MAPK/quínase ERK (MEKK1) e Ca2+. Em algumas modalidades pre- feridas, o segundo mensageiro é cAMP. Em determinadas modalidades, o nível de cAMP intracelular é aumentado.
Em determinadas modalidades, a referida determinação é reali- zada usando uma membrana compreendendo o receptor acoplado à proteí- na G.
Em determinadas modalidades, a referida determinação é atra- vés do uso de um ensaio de Melanoforo. Em determinadas modalidades, o nível de dispersão de pigmento está aumentado.
Em algumas modalidades, a referida determinação é através de
um ensaio repórter. Em algumas modalidades, o referido ensaio repórter é um ensaio repórter de CRE-Luc.
Em algumas modalidades, a referida determinação é através da medição de uma atividade mediada através de aumento do nível de cAMP intracelular.
Em algumas modalidades, a referida determinação é através de um ensaio repórter de CRE-Luc. Em determinadas modalidades, o nível de atividade de Iuciferase está aumentado.
Em algumas modalidades, a referida determinação é através da medição de ligação de GTPyS a uma membrana compreendendo o receptor acoplado à proteína G. Em determinadas modalidades, o referido GTPyS é rotulado com [35S]. Em determinadas modalidades, a referida ligação de GTPyS a uma membrana compreendendo o GPCR está aumentada.
Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, con- tanto que a pequena molécula não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo ou um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo, contanto que o polipeptídeo não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um lipí- dio. Em algumas modalidades, o composto de teste não é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, determinação da estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, fornecimento do nome ou estruturado secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição ca- racterizada por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, produção ou síntese do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêutica.
Em um segundo aspecto, a invenção se caracteriza por um mé- todo para identificação de secretagogos de GIP1 compostos úteis para tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas de:
(a) contato de um composto in vitro com uma célula enteroendó- crina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP1 o referido composto tendo sido identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e
(b) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP
é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de ver- tebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas moda- lidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em determinadas modali- dades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compre- ende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado.
Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogeno- mics J (2006) 6: 131-140). Em determinadas modalidades, a célula entero- endócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determinadas mo- dalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante mani- pulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um composto a um vertebrado, o referido composto tendo sido identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um composto a um vertebrado, o referido composto tendo sido identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento de ou prevenção uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no vertebrado. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando absormetria por raio X com energia dupla (DXA). Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende medição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T-escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa ós- sea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).Em determinadas modalida- des, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o verte- brado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o ver- tebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o ma- mífero é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o verte- brado ou mamífero é um rato ovariectomizado ou um camundongo ovariec- tomizado.
Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, con- tanto que a pequena molécula não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo ou um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo, contanto que o polipeptídeo não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um lipí- dio. Em algumas modalidades, o composto de teste não é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
Em um terceiro aspecto, a invenção se caracteriza por um méto- do para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para trata- mento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, com- preendendo as etapas de:
(a) contato de um agonista de GPR119 in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP; e
(b) determinação se o agonista de GPR119 estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de se- cretar GIP;
em que a capacidade do agonista de GPR119 de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é indicativa do agonista de GPR119 sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de ver- tebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas moda- lidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em determinadas modali- dades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compre- ende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado.
Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogeno- mics J (2006) 6:131-140). Em determinadas modalidades, a célula enteroen- dócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determinadas moda- lidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante manipu- lada para ser capaz de secretar GlP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um agonista de GPR119 a um vertebrado; e
(b) determinação se o agonista de GPR119 aumenta o nível de GIP no vertebrado;
em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar o nível de GIP no vertebrado é indicativa do agonista de GPR119 sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição ca- racterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP1 compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um agonista de GPR119 a um vertebrado;
e
(b) determinação se o agonista de GPR119 aumenta o nível de massa óssea no vertebrado;
em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é indicativa do agonista de GPR119 sendo um compos- to útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por bai- xa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no vertebrado. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando absormetria por raio X com energia dupla (DXA). Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende medição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T-escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa ós- sea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis). Em determinadas modalida- des, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o verte- brado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o ver- tebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o ma- mífero é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o verte- brado ou mamífero é um rato ovariectomizado ou um camundongo ovariec- tomizado.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista de um GPR119 endógeno.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista parcial de GPR119.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista seletivo de GPR119.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, a pequena molécula não é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, a pequena molécula não é um anti- corpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas mo- dalidades, a pequena molécula não é um lipídio. Em algumas modalidades, a pequena molécula não é um polipeptídeo ou um lipídio.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 está o- ralmente disponível.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC50 de menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 1 pM, menos do que cerca de 100 μΜ, menos do que cerca de 75 μΜ, menos do que cerca de 50 μΜ, menos do que cerca de 25 μΜ, menos do que cerca de 15 μΜ, menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 5 μΜ, menos do que cerca de 4 μΜ, menos do que cerca de 3 μΜ, menos do que 30 cerca de 2 μΜ ou menos do que cerca de 1 μΜ. Em determinadas modali- dades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 100 μΜ, menos do que cerca de 75 μΜ, menos do que cerca de 50 μΜ, menos do que cerca de 25 μΜ, menos do que cerca de 15 μΜ, menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 5 μΜ, menos do que cerca de 4 μΜ, menos do que cerca de 3 μΜ, menos do que cerca de 2 μΜ ou menos do que cerca de 1 μΜ no GPR119 humano tendo SEQ ID NO: 2. Em determinadas moda- lidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cer- ca de 10 μΜ, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 100 μΜ, menos do que cerca de 75 μΜ, menos do que cerca de 50 μΜ, menos do que cerca de 25 μΜ, menos do que cerca de 15 μΜ, menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 5 μΜ, menos do que cerca de 4 μΜ, menos do que cerca de 3 μΜ, menos do que cerca de 2 μΜ ou menos do que cerca de 1 μΜ no GPR119 humano tendo SEQ ID NO: 2 em um ensaio de adenilil ciclase (em um ensaio de adenilil ciclase exemplificativo é fornecido no E- xemplo 7 e no Exemplo 8, infra). Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 100 μΜ, menos do que cerca de 75 μΜ, menos do que cerca de 50 μΜ, menos do que cerca de 25 μΜ, menos do que cerca de 15 μΜ, menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 5 μΜ, menos do que cerca de 4 μΜ, menos do que cerca de 3 μΜ, menos do que cerca de 2 μΜ ou menos do que cerca de I μΜ no G- PR119 humano tendo SEQ ID NO: 2 em um ensaio de melanoforo (um en- saio de melanoforo exemplificativo é fornecido no Exemplo 9, infra).
Agonistas de GRP119 exemplificativos são descritos, por exem- plo, no Pedido Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional No. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022417 (pu- blicado como WO 05/007658); Pedido Internacional No. PCT/US2005/019318 (publicado como) WO 2005/121121; Pedido Interna- cional No. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido Internacional No. PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pe- dido Internacional No. PCT/GB2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); Pedido Internacional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido Inter- nacional No. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pe- dido Internacional No. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); e Pedido Internacional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661).
Em determinadas modalidades, o método compreende forneci- mento do agonista de GPR119.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é identi- ficável através de um método de acordo com o primeiro aspecto.
Em determinadas modalidades, o método compreende realiza- ção de um método de acordo com o primeiro aspecto para identificar o ago- nista de GPR119.
Em determinadas modalidades, o método compreende identifi- cação de um agonista de GPR119 através de um método de acordo com o primeiro aspecto.
Em um quarto aspecto, a invenção se caracteriza por um méto- do para identificação de secretagogos de GIP1 compostos úteis para preven- ção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreen- dendo as etapas de:
(a) contato de um receptor acoplado à proteína G com um ligan- te conhecido opcionalmente rotulado ao receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o receptor acoplado à proteína G compre- ende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação
em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(v) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(vi) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(vii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii); e
(b) detecção do complexo entre o referido Iigante conhecido e o referido receptor; e
(c) determinação se menos do referido complexo é formado n presença do composto de teste do que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelode SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de
SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de secretagogos de GIP.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indi- víduo.
Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante ou agonista de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ago- nista conhecido de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante ou agonista de um receptor GPR119 endógeno de ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é idêntico a um composto descrito, por exemplo, no Pedido Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional No. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional No.; PCT/US06/00567; (publicado como WO 05/007658); Pedido Internacio- nal No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2006/083491); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 05/007647); Pedido Internacional No. PCT/US2005/019318 (publicado como WO 2005/121121); Pedido Internacional No. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); PCT/GB2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido Inter- nacional No. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pe- dido Internacional No. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); ou Pedido Internacional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661). Em determinadas moda- lidades, o ligante conhecido é (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante endógeno de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano.
Em determinadas modalidades, o ligante conhecido opcional- mente rotulado é um ligante conhecido rotulado. Em determinadas modali- dades, o ligante conhecido rotulado é um ligante conhecido radiorrotulado. Técnicas para radiorrotulação um composto, tal como para radiorrotulação de um ligante conhecido de um receptor acoplado à proteína G da invenção, são bem-conhecidas por aqueles versados. Vide, por exemplo, Pedido Inter- nacional WO 04/065380. Vide também, por exemplo, Exemplo 11, infra.
Técnicas para detecção do complexo entre um receptor acopla- do à proteína G e um composto conhecido como sendo um ligante de o re- ceptor acoplado à proteína G são bem-conhecidas por aqueles versados. Vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 04/065380. Vide também, por exemplo, Exemplo 12, infra.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c);
(e) contato de um composto na presença do qual menos do refe- rido complexo é formado na etapa (c) in vitro com uma célula enteroendócri- na de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP; e
(f) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um com- posto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é a K. cell. Em determinadas modali- dades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compre- ende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogeno- mics J (2006) 6: 131-140). Em determinadas modalidades, a célula entero- endócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determinadas mo- dalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante mani- pulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c);
(e) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento de ou prevenção uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumen- tar a massa óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c);
(e) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no indivíduo. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende me- dição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referi- da medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T- escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa óssea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Te- chnical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteopo- rosis). Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em de- terminadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c);
(e) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento de ou prevenção uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumen- tar a massa óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c);
(e) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(f) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no indivíduo. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende me- dição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referi- da medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T- escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa óssea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Te- chnical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteopo- rosis). Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em de- terminadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado ou mamífero é um rato ovariecto- mizado ou um camundongo ovariectomizado.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(e) opcionalmente fornecimento de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(f) contato de um composto na presença do qual menos do refe- rido complexo é formado de acordo com a etapa (c) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP; e
(g) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um com- posto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intes- tino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina com- preende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delga- do. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharma- cogenomics J (2006) 6: 131-140). Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determina- das modalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante manipulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(e) opcionalmente fornecimento de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(f) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(g) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas (a) a (c) desse quarto aspecto e ainda compreendendo:
(d) opcionalmente síntese de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(e) opcionalmente fornecimento de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado de acordo com a etapa (c);
(f) administração de um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) a um vertebrado; e
(g) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no indivíduo. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende me- dição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referi- da medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T- escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa óssea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Te- chnical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteopo- rosis). Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em de- terminadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado ou mamífero é um rato ovariecto- mizado ou um camundongo ovariectomizado.
Em determinadas modalidades, a amostra de DNA humano é DNA genômico humano.
Em algumas modalidades, a reação em cadeia de polimerase é reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Técni- cas de RT-PCR são bem-conhecidas por aqueles versados. Em determina- das modalidades, a amostra de DNA humano é cDNA humano. Em determi- nadas modalidades, o cDNA é de um tecido humano que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o tecido humano que expressa GPRI19 é pân- creas ou ilhota pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de um tipo de célula humana que expressa GPRI 19. Em algumas modalidades, o cDNA é de uma célula beta pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de uma linhagem de célula pancreática.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em determi- nadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um po- linucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o receptor a- copiado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente à (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor para o qual (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é am- plificável através de reação em cadeia de polimerase exibe o nível detectá- vel de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitu- tiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalida- des, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo so- fram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, condições de hibridização es- tringente (por exemplo, condições de alta estringência) compreende hibridi- zação a 42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5 x SSC (1 x SSC = 150mM NaCl, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x Solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem a 65°C em uma solução compreendendo 0,1 x SSC. Técnicas de hibridização são bem-conhecidas por aqueles versados.
Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um poli- nucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao com- plemento de SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: I é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência,
ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotí- deo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP in- tracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. Técnicas para fazer uma estrutura de fusão de GPCR:G são bem-conhecidas por a- queles versados (vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 02/42461).
Em determinadas modalidades, a referida determinação é reali- zada usando uma célula hospedeira compreendendo o receptor acoplado à proteína G. Em determinadas modalidades, a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o GPCR. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é pCMV. Esse vetor foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC) em 13 de Outubro de 1998 (10801 University Blvd., Ma- nassas, VA 20110-2209 USA) sob as condições do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente. O DNA foi testado pela ATCC e determi- nado como sendo viável. A ATCC atribuiu o seguinte número de depósito ao pCMV: ATCC Ng203351. Outros vetores de expressão adequados serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica e uma ampla vari- edade de vetores de expressão estão comercialmente disponíveis (por e- xemplo, da Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; e Invitrogen, Carlsbad, CA).
Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de vertebrado. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de mamífero é selecionada do grupo consistindo em uma célula 293, uma célula 293T, uma célula CHO, a MCB390I cell e uma célula COS-7. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de melanoforo. Outras células hospedeiras adequadas serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica e uma ampla variedade de linhagens de célula estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209.
Em determinadas modalidades, a referida determinação é reali- zada usando uma membrana compreendendo o receptor acoplado à proteína G.
Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, con- tanto que a pequena molécula não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo ou um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo, contanto que o polipeptídeo não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um lipí- dio. Em algumas modalidades, o composto de teste não é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, determinação da estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, fornecimento do nome ou estruturado secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição ca- racterizada por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, produção ou síntese do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêutica.
Em um quinto aspecto, a invenção se caracteriza por um método de seleção de compostos de teste para identificar um secretagogo de GIP, um composto para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou um composto para aumentar a massa óssea em um indivíduo, o qual é caracterizado pelo uso de um receptor acoplado à proteína G compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(a) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(b) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(c) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, em que o GPCR não compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(d) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(e) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1; (f) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(g) a seqüência de aminoácido de (f) quando selecionada do grupo consistindo em:
(i) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteí- na G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(ii) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(h) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamente ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(i) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (a) a (h).
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante.
Em determinadas modalidades, o método compreende identifi- cação de um agonista do receptor.
Em determinadas modalidades, o método compreende identifi- cação de um agonista parcial do receptor.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêutica.
Em um sexto aspecto, a invenção se caracteriza por um método compreendendo, tendo identificado um secretagogo de GIP, um composto para o tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto para aumentar a massa óssea em um indiví- duo de acordo com o primeiro aspecto, o segundo aspecto, o terceiro aspec- to, o quarto aspecto ou o quinto aspecto, formulação do referido secretagogo de GIP, do referido composto para o tratamento ou prevenção de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea ou do referido composto para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêuti- ca.
Em um sétimo aspecto, a invenção se caracteriza por use de um receptor acoplado à proteína G para selecionar compostos de teste como secretagogos de GIP, compostos para o tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos para aumentar a massa óssea em um indivíduo, em que o receptor acoplado à proteína G compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistin- do em:
(a) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(b) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(c) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, em que o GPCR não compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(d) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(e) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(f) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(g) a seqüência de aminoácido de (f) quando selecionada do grupo consistindo em: (i) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteí- na G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(ii) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(h) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamente ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(i) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (a) a (h).
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor é recombinante.
Em determinadas modalidades, o composto de teste é uma pe- quena molécula.
Em determinadas modalidades, o composto de teste é um ago- nista de GPR119.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista de um GPR119 endógeno.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista parcial de GPR119.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 seletivo. Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 é uma pequena molécula.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 está o- ralmente disponível.
Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 75 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 15 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM, me- nos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cer- ca de 2 nM ou menos do que cerca de I nM. Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 μΜ, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 75 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 15 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM, menos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cerca de 2 nM ou menos do que cerca de 1 nM no GPR119 humano tendo SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalida- des, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 u,M, menos do que cerca de 1 u.M, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 75 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 15 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM, menos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cerca de 2 nM ou menos do que cerca de 1 nM no GPR119 humano tendo SEQ ID NO: 2 em um ensaio de adenilil ciclase (em um ensaio de adenilil ciclase exemplificativo é fornecido no E- xemplo 7 e no Exemplo 8, infra). Em determinadas modalidades, o agonista de GPR119 tem um valor de EC5O de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 75 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 15 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM, menos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cerca de 2 nM ou menos do que cerca de 1 nM no G- PR119 humano tendo SEQ ID NO: 2 em um ensaio de melanoforo (um en- saio de melanoforo exemplificativo é fornecido no Exemplo 9, infra).
Agonistas de GRP119 exemplificativos são descritos, por exem- plo, no Pedido Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional No. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022417 (pu- blicado como WO 05/007658); Pedido Internacional No. PCT/US2005/019318 (publicado como) WO 2005/121121; Pedido Interna- cional No. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido Internacional No. PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pe- dido Internacional No. PCT/G B2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); Pedido Internacional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido Inter- nacional No. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pe- dido Internacional No. PCT/G B2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); e Pedido Internacional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661).
Em um oitavo aspecto, a invenção se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreen- dendo as etapas de:
(a) contato de um composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G, em que o referido receptor acoplado à proteína G compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor acoplado à proteína G não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à pro- teína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de rea- ção em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(v) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(vi) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(vii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b1) uma seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii);
in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GlΡ, o referido composto tendo sido determi- nado ou identificado através de um método de acordo com o primeiro aspec- to; e
(b) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de ma- mífero. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma célu- la K. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célu- la enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região rica em célu- las K do intestino delgado. Em determinadas modalidades, a célula entero- endócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogenomics J (2006) 6: 131-140). Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma linhagem de célula enteroen- dócrina. Em determinadas modalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula pancreática. Vide, por exemplo, Xie e outros, Bone 2007, uma vez que ele se refere à expressão pancreática de GIP. Em determinadas modalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula recombinante manipulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração, a um vertebrado, de um composto o qual es- timula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G, em que o re- ferido receptor acoplado à proteína G compreende uma seqüência de ami- noácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor acoplado à proteína G não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(viii) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à pro- teína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(ix) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(x) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b') uma seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à
proteína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii);
o referido composto tendo sido determinado ou identificado, a- través de um método de acordo com o primeiro aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado;
em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante.
Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma ou soro de GIP total. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é a concentração no sangue ou plasma ou soro de GIP bioativo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração, a um vertebrado, de um composto o qual es- timula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G, em que o re- ferido receptor acoplado à proteína G compreende uma seqüência de ami- noácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor acoplado à proteína G does não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(xi) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(xii) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(xiii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b') uma seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii); o referido composto tendo sido determinado ou identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado; em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado ou mamífero é um rato ovariec- tomizado ou um camundongo ovariectomizado.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no vertebrado. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando absormetria por raio X com energia dupla (DXA). Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende medição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T-escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa ós- sea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA1 tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).
Em determinadas modalidades, a amostra de DNA humano é
DNA genômico humano.
Em algumas modalidades, a reação em cadeia de polimerase é reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Técni- cas de RT-PCR são bem-conhecidas por aqueles versados. Em determina- das modalidades, a amostra de DNA humano é cDNA humano. Em determi- nadas modalidades, o cDNA é de um tecido humano que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o tecido humano que expressa GPR119 é pân- creas ou ilhota pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de um tipo de célula humana que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o cDNA é de uma célula beta pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de uma linhagem de célula pancreática.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em determi- nadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um po- linucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o receptor a- coplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente à (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- píperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é am- plificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- 30 piperidin-1-il-[5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas mo- dalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanofo- ro sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, condições de hibridização es- tringente (por exemplo, condições de alta estringência) compreende hibridi- zação a 42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5 χ SSC (1 χ SSC = NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x Solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem a 65°C em uma solução compreendendo 0,1 χ SSC. Técnicas de hibridização são bem-conhecidas por aqueles versados.
Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um poli- nucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao com- plemento de SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotí- deo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: I exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP in- tracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadia2»1-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. Técnicas para fazer uma estrutura de fusão de GPCR:G são bem-conhecidas por a- queles versados (vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 02/42461).
Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcio- nalidade de um receptor acoplado à proteína G é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acoplado à prote- ína G é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algu- mas modalidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um re- ceptor acoplado à proteína G é uma pequena molécula, contanto que a pe- quena molécula não seja um lipídio. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um poli- peptídeo ou um lipídio. Em algumas modalidades, o composto o qual estimu- la a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acoplado à proteína G é um polipeptídeo, contanto que o poli- peptídeo não seja um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcionali- dade de um receptor acoplado à proteína G é um lipídio. Em algumas moda- lidades, o composto o qual estimula a funcionalidade de um receptor acopla- do à proteína G não é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto o qual estimula a funcio- nalidade de um receptor acoplado à proteína G é um anticorpo ou um frag- mento de ligação a antígeno do mesmo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, determinação da estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, fornecimento do nome ou estruturado secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição ca- racterizada por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, produção ou síntese do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo co- mo um produto farmacêutico. Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêutica.
Em um nono aspecto, a invenção se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreen- dendo as etapas de:
(a) contato de um composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um Iigante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do com- posto, em que o receptor acoplado à proteína G compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(v) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(vi) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(vii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii);
in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de secretar GIP1 o referido composto tendo sido determi- nado ou identificado através de um método de acordo com o quarto aspecto-, e
(b) determinação se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G compreende a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor compreende a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um alelo de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO: 2.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é recombinante. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intes- tino delgado. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina com- preende tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delga- do. Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou jejuno (vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharma- cogenomics J (2006) 6:131-140). Em determinadas modalidades, a célula enteroendócrina é uma linhagem de célula enteroendócrina. Em determina- das modalidades, a célula capaz de secretar GIP é uma célula pancreática. Vide, por exemplo, Xie e outros, Bone 2007, uma vez que ele se refere à expressão pancreática de GIP. Em determinadas modalidades, a célula ca- paz de secretar GIP é uma célula recombinante manipulada para ser capaz de secretar GIP.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um composto a um vertebrado, em que na presença de o referido composto menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto, em que o receptor a- coplado à proteína G compreende uma seqüência de aminoácido seleciona- da do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(viii) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à pro- teína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(ix) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(x) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b1) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viií) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii);
o referido composto tendo sido determinado ou identificado atra- vés de um método de acordo com o quarto aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de GIP no ver- tebrado; em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um secre- tagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
A invenção, adicionalmente, se caracteriza por um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou com- postos úteis para aumentar a massa óssea em um indivíduo, compreenden- do as etapas de:
(a) administração de um composto a um vertebrado, em que na presença de o referido composto menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um Iigante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto, em que o receptor a- coplado à proteína G compreende uma seqüência de aminoácido seleciona- da do grupo consistindo em:
(i) aminoácidos 1 -335 de SEQ ID NO: 2;
(ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(iii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, contanto que o recep- tor não compreenda a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(iv) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(xi) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(xii) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(xii) a seqüência de aminoácido de (vi) quando selecionada do grupo consistindo em:
(a') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(b') a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(viii) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamen- te ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(ix) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) a (viii);
o referido composto tendo sido determinado ou identificado atra- vés de um método de acordo com o quarto aspecto; e
(b) determinação se o composto aumenta o nível de massa ós- sea no vertebrado; em que a capacidade do composto de teste de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste sendo um secretagogo de GIP, um composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou um composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, o vertebrado ou mamífero é um rato ovariec- tomizado ou um camundongo ovariectomizado.
Em determinadas modalidades, a referida determinação com- preende medição do nível de massa óssea no vertebrado. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea compreende me- dição do nível de massa óssea usando DXA. Em determinadas modalidades, a referida medição do nível de massa óssea usando DXA compreende me- dição de um T-escore usando DXA. Em determinadas modalidades, a referi- da medição de um T-escore usando DXA compreende medição de um T- escore no quadril usando DXA. Considera-se expressamente que a referida medição do nível de massa óssea pode compreender medição do nível de massa óssea usando uma outra técnica que não DXA, tal como absormetria por raio X simples (SXA) (vide, por exemplo, World Health Organization Te- chnical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteopo- rosis). Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Em de- terminadas modalidades, o vertebrado é um vertebrado não-humano. Em determinadas modalidades, o vertebrado é um mamífero não-humano. Em determinadas modalidades, o mamífero é um mamífero não-humano.
Em determinadas modalidades, a amostra de DNA humano é DNA genômico humano.
Em algumas modalidades, a reação em cadeia de polimerase é reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Técni- cas de RT-PCR são bem-conhecidas por aqueles versados. Em determina- das modalidades, a amostra de DNA humano é cDNA humano. Em determi- nadas modalidades, o cDNA é de um tecido humano que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o tecido humano que expressa GPR119 é pân- creas ou ilhota pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de um tipo de célula humana que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o cDNA é de uma célula beta pancreática. Em determinadas modalidades, o cDNA é de uma linhagem de célula pancreática.
Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em determi- nadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um po- linucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o receptor a- coplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente à (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é am- plificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, o receptor acoplado à proteína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas mo- dalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanofo- ro sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, condições de hibridização es- tringente (por exemplo, condições de alta estringência) compreende hibridi- zação a 42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5 χ SSC (1 χ SSC = NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x Solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem a 65°C em uma solução compreendendo 0,1 x SSC. Técnicas de hibridização são bem-conhecidas por aqueles versados.
Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um poli- nucleotídeo que se hibridíza, sob condições de alta estringência, ao com- plemento de SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência
ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotí- deo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: I exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP in- tracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Em algumas moda- lidades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. Técnicas para fazer uma estrutura de fusão de GPCR:G são bem-conhecidas por a- queles versados (vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 02/42461).
Em algumas modalidades, o composto na presença do qual me- nos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausên- cia do composto é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é uma pequena molé- cula, contanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo. Em algu- mas modalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcional- mente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é uma pequena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um anti- corpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é uma pe- quena molécula, contanto que a pequena molécula não seja um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma pequena molécula, con- tanto que a pequena molécula não seja um polipeptídeo ou um lipídio. Em algumas modalidades, o composto de teste é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é um poli- peptídeo, contanto que o polipeptídeo não seja um anticorpo ou um fragmen- to de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é um lipídio. Em algumas modali- dades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotu- lado ao receptor é formado do que na ausência do composto não é um anti- corpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o composto na presença do qual menos de um complexo entre um receptor acoplado à proteína G e um ligante conhecido opcionalmente rotulado ao receptor é formado do que na ausência do composto é um anti- corpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de secretagogos de GIP.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma con- dição caracterizada por baixa massa óssea.
Em determinadas modalidades, o método é um método para i- dentificação de compostos úteis para aumentar a massa óssea em um indi- víduo.
Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante ou agonista de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ago- nista conhecido de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante ou agonista de um receptor GPR119 endógeno de ser humano. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é idêntico a um composto descrito, por exemplo, no Pedido Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional No. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido Interna- cional No. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 05/007658); Pedido Internacional No. PCT/US2005/019318 (publicado como) WO 2005/121121; Pedido Internacional No. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido Internacional No. PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050264 (publica- do como WO 2006/067531); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido Internacional No. PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); Pedido Interna- cional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Inter- nacional No. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido Internacional No. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido Internacional No. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); e Pedido Interna- cional No. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661). Em determi- nadas modalidades, o ligante conhecido é (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)- {6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é um ligante en- dógeno de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou ser humano.
Em determinadas modalidades, o ligante conhecido opcional- mente rotulado é um ligante conhecido rotulado. Em determinadas modali- dades, o ligante conhecido rotulado é um ligante conhecido radiorrotulado. Técnicas para radiorrotulação um composto, tal como para radiorrotulação de um ligante conhecido de um receptor acoplado à proteína G da invenção, são bem-conhecidas por aqueles versados. Vide, por exemplo, Pedido Inter- nacional WO 04/065330. Vide também, por exemplo, Exemplo 11, infra.
Técnicas para detecção do complexo entre um receptor acopla- do à proteína G e um composto conhecido como sendo um ligante de o re- ceptor acoplado à proteína G são bem-conhecidas por aqueles versados. Vide, por exemplo, Pedido Internacional WO 04/065380. Vide também, por exemplo, Exemplo 12, infra.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, determinação da estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, fornecimento do nome ou estruturado secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição ca- racterizada por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de, opcionalmente, produção ou síntese do secretagogo de GIP, do composto útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteriza- da por baixa massa óssea ou do composto útil para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para o tra- tamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa ós- sea ou do composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo co- mo um produto farmacêutico.
Em algumas modalidades, o referido método ainda compreende a etapa de formulação do secretagogo de GIP, o composto útil para o trata- mento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea ou o composto útil para aumentar a massa óssea em um indivíduo em uma composição farmacêutica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A invenção é ilustrada com relação às figuras em anexo nas quais:
A Figura 1 mostra uma análise farmacodinâmica do efeito de administração de um agonista de GPR119 sobre o nível de GIP no sangue em camundongos do tipo silvestre. A.Uma análise de curso de tempo reali- zada usando Composto 1 corno o agonista de GPR119. B. Uma análise de curso de tempo realizada usando Composto 3 como o agonista de GPR119.
C. Uma análise de titulação de dose realizada usando Composto 3 como o agonista de GPR119.
A Figura 2 mostra o efeito de administração de agonista de G- PR119 sobre o nível de GIP no sangue em camundongos GPR119- deficientes (knockout) comparado com camundongos do tipo silvestre. A. A comparação foi realizada usando Composto 1 como o agonista de GPR119. Β. A comparação foi realizada usando Composto 2 como o agonista de G- PR119.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se caracteriza por métodos de uso do re- ceptor GPR119 para identificar compostos úteis para aumentar a massa ós- sea em um indivíduo. Agonistas do receptor GPR119 são úteis como agen- tes terapêuticos para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea, tal como osteoporose e para aumentar a mas- sa óssea em um indivíduo. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, sobre a descoberta surpreendente pelo Requerente de que a adminis- tração de um agonista de GPR119 a um indivíduo, tal como através de ad- ministração oral, pode atuar no receptor GPR119 para aumentar o nível de GIP no indivíduo.
O termo "ligante", conforme usado aqui, significará uma molécu- la (por exemplo, composto de teste) que se liga especificamente a um poli- peptídeo, tal como GPR119. Um ligante pode ser, por exemplo, um polipep- tídeo, um lipídio, uma pequena molécula, um anticorpo. O Composto 1 é um ligante exemplificativo do polipeptídeo do receptor GPR119 (vide Tabela A, a qual apresenta a estrutura química e nome químico do Composto 1). O Composto 1 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Inter- nacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina (vide Tabela A) é um ligante exemplificativo do polipeptídeo do receptor GPR119. O Composto 2 é um ligante exemplifi- cativo do polipeptídeo do receptor GPR119. O Composto 2 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658). O Composto 3 é um ligante exemplificativo do polipeptídeo do receptor GPR119. O Composto 3 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647). Um ligante endó- geno é um ligante que é um ligante natural endógeno para um polipeptídeo nativo, tal como GPR119. Um ligante pode ser um "antagonista", "agonista", "agonista parcial" ou "agonista inverso" ou similar.
TABELA A
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O termo "agonista", conforme usado aqui, significará um agente (por exemplo, ligante, composto de teste) que, em virtude de ligação a um GPCR, ativa o GPCR de modo a estimular uma resposta intracelular media- da pelo GPCR.
O termo "agonista parcial", conforme usado aqui, significará um agente (por exemplo, ligante, composto de teste) que, em virtude de ligação a um GPCR, ativa o GPCR de modo a estimular uma resposta intracelular mediada pelo GPCR, embora em um grau ou extensão menor do que um agonista total.
O termo "antagonista" significará um agente (por exemplo, ligan- te, composto de teste) que se liga e, de preferência, se liga competitivamen- te, a um GPCR em cerca do mesmo local que um agonista ou agonista par- cial, mas o qual não ativa uma resposta intracelular iniciada pela forma ativa do GPCR e pode, desse modo, inibir a resposta intracelular pelo agonista ou agonista parcial. Um antagonista, tipicamente, não diminui a resposta intra- celular de linha de base na ausência de um agonista ou agonista parcial.
O termo "agonista inverso" significará um agente (por exemplo, ligante, composto de teste) o qual se liga a um GPCR e o qual inibe a res- posta intracelular de linha de base iniciada pela forma ativa do receptor a- baixo da atividade de nível de base normal a qual é observada na ausência de um agonista ou agonista parcial.
O termo "agonista de GPR119," conforme usado aqui, se refere a um composto que se liga ao receptor GPR119 e atua como um agonista. O Composto 1 é um agonista de GPR119 exemplificativo (vide Tabela A, a qual apresenta a estrutura química e nome químico do Composto 1). O Composto 1 é idêntico ao composto descrito no Pedido de Patente Interna- cional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [l,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista de GPR119 exemplificativo. O Composto 2 é um agonista de GPR119 e- xemplificativo. O Composto 2 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658). O Composto 3 é um agonista de GPR119 exemplificativo. O Composto 3 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Inter- nacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647).
O termo "agonista seletivo de GPR119," conforme usado aqui, se refere a um agonista de GPR119 tendo seletividade pelo receptor G- PR119 com relação a um ou mais receptores relacionados, tal como recep- tor de fator-1 de liberação de corticotropina (CRF-1). O Composto 1 é um agonista seletivo exemplificativo de GPR119 (vide Tabela A, a qual apresen- ta a estrutura química e nome químico do Composto 1). O Composto 1 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2-Flúor-4- metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ 1,2,4]oxadiazol-5-il}piperidin-1 -il]-5- nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista seletivo exemplificativo de GPR119. O Composto 2 é um agonista seletivo exemplificativo de GPR119. O Com- posto 2 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacio- nal No. PCTVUS2004/022417 (publicado como WO 2005/007658). O Com- posto 3 é um agonista seletivo exemplificativo de GPR119. O Composto 3 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647).
O termo "secretagogo de GIP" significará um agente (por exem- plo, ligante, composto de teste) que promove a secreção de GIP em uma célula, por exemplo, uma célula enteroendócrina ou que aumenta o nível de GIP total, por exemplo, o nível de GIP total no sangue ou plasma, quando de administração a um indivíduo, tal como um vertebrado ou um mamífero. Em determinadas modalidades, um secretagogo de GIP é um composto ade- quado para aumento do nível de GIP total em um indivíduo, por exemplo, o nível de GIP total no sangue ou plasma.
O termo "indivíduo", conforme usado aqui, se refere a um verte- brado incluindo, mas não limitado a, peixe (tal como peixe criado comercial- mente, peixe de estimação, etc.), anfíbios (tais como rãs, sapos, anfíbios de estimação, etc.), répteis (tais como cobras, lagartos, répteis de estimação, etc.), pássaros (tais como galinhas, perus, pássaros de estimação, etc.) e mamíferos (tais como camundongos, ratos, hâmsters, porcos, cães, gatos, cavalos, vacas, ovelha, cabras, primatas não-humanos, mamíferos não- humanos, mamíferos não-humanos de estimação, seres humanos, etc.). Em determinadas modalidades, o indivíduo é um peixe. Em determinadas moda- lidades, o indivíduo é um anfíbio. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um réptil. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um pássaro. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um peru. Nos últimos 25 anos, a pressão por seleção comercial de perus com maior massa muscular no peito tem aumentado as demandas sobre a integridade do esqueleto. A massa muscular do peito aumentada, contudo, não tem sido acompanhada por alte- rações compensatórias no esqueleto, com o resultado de que a indústria de perus tem experimentado um aumento em problemas nas pernas. Fraturas de osso longo em perus machos adultos têm sido reportadas (vide, por e- xemplo, Crespo e outros, Poult Sci (2000) 79: 602-608.) Em determinadas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um camundongo, um rato, um hâmster, um coelho, um porco, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um primata não-humano ou um ser humano (os quais podem ser incluídos em modali- dades da invenção individualmente ou em qualquer combinação). Em de- terminadas modalidades, o indivíduo é um cavalo. Cavalos de desempenho, os quais são cavalos envolvidos em atividades tais como corrida e outros eventos competitivos, são suscetíveis de fratura óssea. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um cão ou um gato. Em determinadas modalida- des, o indivíduo é um animal de companhia (tal como um cão, um gato, etc.), um animal de fazenda (tal como uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um por- co, uma galinha, etc.), um animal esportivo (tal como um cavalo, um cão, etc.), um animal de carga (tal como uma mula, um camelo, etc.) ou um ani- mal exótico (tal como um animal encontrado em um zôo, etc.), os quais po- dem ser incluídos em modalidades da invenção individualmente ou em qual- quer combinação. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um mamífe- ro não-humano. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um primata não-humano (tal como um macaco rhesus, um chimpanzé, etc.). Em deter- minadas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
O termo "que precisa de prevenção ou tratamento", conforme usado aqui, se refere a um julgamento feito por um profissional de saúde (por exemplo, médico, enfermeiro, praticante de enfermagem no caso de seres humanos; veterinário no caso de vertebrados não-humanos e, em uma modalidade particular, mamíferos não-humanos) de que um indivíduo requer ou se beneficiará de tratamento.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeu- ticamente eficaz", conforme usado aqui, se refere à quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que estimula a resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal, indivíduo ou ser humano que está sendo considerado por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico, o qual inclui um ou mais dos seguintes: (1) Prevenção da doença, por exemplo, prevenção de uma do- ença, condição ou distúrbio em um indivíduo que pode estar pré-disposto à doença, condição ou distúrbio, mas ainda não experimenta ou mostra a pa- tologia ou sintomatologia da doença;
(2) Inibição da doença, por exemplo, inibição de uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou mos- trando a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, interrupção de desenvolvimento adicional da patologia e/ou sintomatologi- a); e
(3) Alívio da doença, por exemplo, alívio de uma doença, condi- ção ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou mostrando a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, rever- são da patologia e/ou sintomatologia).
O termo "eficácia terapêutica", conforme usado aqui, se refere à estimulação da resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, ani- mal, indivíduo ou ser humano que é considerado por um pesquisador, vete- rinário, médico ou outro clínico, o qual inclui um ou mais dos seguintes:
(1) Prevenção da doença, por exemplo, prevenção de uma do- ença, condição ou distúrbio em um indivíduo que pode estar pré-disposto à doença, condição ou distúrbio, mas ainda não experimenta ou mostra a pa- tologia ou sintomatologia da doença,
(2) Inibição da doença, por exemplo, inibição de uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou mos- trando a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, interrupção de desenvolvimento adicional da patologia e/ou sintomatologi- a); e
(3) Alívio da doença, por exemplo, alívio de uma doença, condi- ção ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou mostrando a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, rever- são da patologia e/ou sintomatologia).
O termo "quantidade que é eficaz para prevenir" se refere àquela quantidade de fármaco que prevenirá ou reduzirá o risco de ocorrência do evento biológico ou médico que é considerado como sendo prevenido. Em muitos casos, a quantidade que é eficaz para prevenir é a mesma que a quantidade terapeuticamente eficaz.
O termo "composição" significará um material compreendendo pelo menos um componente.
O termo "ingrediente ativo" significará qualquer componente que proporciona atividade farmacológica ou outro efeito direto no diagnóstico, cura, alívio, tratamento ou prevenção de uma doença.
O termo "composição farmacêutica" significará uma composição compreendendo pelo menos um ingrediente ativo, pelo que a composição é passível de investigação e tratamento em um mamífero.
Por "farmaceutícamente aceitável" entenda-se que o carreador, veículo, diluente, excipientes e/ou sal devem ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não prejudiciais ao recipiente da mesma.
O termo "forma de dosagem" significará a forma física na qual um fármaco é produzido e distribuído, tal como um comprimido, cápsula ou injetável.
Por "osso" entenda-se um tecido conectivo denso, semi-rígido, poroso, calcificado que forma a principal porção do esqueleto da maioria dos vertebrados, compreendendo uma matriz orgânica densa e um componente mineral inorgânico. Osso é qualquer uma de numerosas estruturas anatomi- camente distintas que compõem o esqueleto de um vertebrado.
O termos "massa óssea" e "densidade mineral óssea (BMD)" são usados permutaveImente aqui. A BDM em seres humanos é usualmente medida através de uma técnica radiográfica padrão, absormetria por raio X com energia dupla (DXA). Das muitas técnicas desenvolvidas para avaliar a BMD, DXA é a mais altamente desenvolvida tecnicamente e a mais ampla- mente validade biologicamente. A tecnologia de DXA, com um software ade- quadamente aceito, pode também ser usada para avaliar confiavelmente a BDM em estudos com animais. DXA é usado no diagnóstico de osteoporose, prognóstico (previsão de fratura), monitoramento da história natural do dis- túrbio e avaliação de resposta ao tratamento. O termo "baixa massa óssea", conforme usado aqui, se refere a qualquer diminuição ou redução na densidade mineral óssea (BMD) em um indivíduo e inclui osteoporose e osteopenia, conforme definido nas propostas da Organização Mundial de Saúde (OMS). A OMS definiu normal como um valor de BMD dentro de um desvio padrão da média de referência para um adulto jovem (T-escore > -1). A OMS definiu osteopenia como um valor de BMD maior do que 1 desvio padrão abaixo da média para um adulto jovem, mas menos do que 2,5 desvios padrões abaixo desse valor (T-escore < -1 e > -2,5). A OMS caracterizou como uma forma mais grave de osteopenia e definiu a mesma por um valor de BMD de 2,5 desvios padrões ou mais abai- xo da média para um adulto jovem (T-escore < -2,5) (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis, a descrição do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade). Mais comumente, a osteopenia é definida como um T-escore de menos do que -1 e mais do que -2 e osteoporose é definida como um T-escore de menos do que ou igual a -2. Em determina- das modalidades da presente invenção, o T-escore é medido no quadril com DXA.
O termo "osteoporose", conforme usado aqui, é definido por um valor de desvios padrão de BMD 2 ou mais abaixo da média de referência para um adulto jovem (T-escore < -2) ou se refere a um diagnóstico feito por um profissional de saúde (por exemplo, médico, enfermeiro, praticante de enfermagem no caso de seres humanos; veterinário no caso de vertebrados não-humanos).
Osteoporose pode ser classificada como primária ou secundária (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis.) Conforme usado a- qui, o termo "osteoporose" abrange osteoporose primária e osteoporose se- cundária. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose primá- ria. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose secundária.
"Osteoporose primária", conforme usado aqui, está associada à menopausa (natural, prematura ou cirúrgica), envelhecimento ou ambos. Deverá ser entendido que, na presente invenção, osteoporose primária as- sociada à menopausa (natural, prematura ou cirúrgica), osteoporose primá- ria associada ao envelhecimento e osteoporose primária associada à meno- pausa e envelhecimento podem ser incluídas em modalidades individual- mente ou em qualquer combinação.
Osteoporose secundária", conforme usado aqui, se refere à os- teoporose a qual está associada não à menopausa ou envelhecimento, mas antes com condições médicas ou ao uso de medicamentos ou fármacos. Um risco aumentado de osteoporose está associado a uma série de condições médicas incluindo, mas não limitado a, distúrbios endócrinos e metabólicos e doença maligna e ao uso de determinados medicamentos e fármacos, e- xemplos dos quais são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, 10ã Edição; a descrição dos quais é aqui incorporada por re- ferência em sua totalidade). Osteoporose secundária também pode estar associada à imobilização. Um diagnóstico de osteoporose secundária a uma condição médica, ao uso de um medicamento ou fármaco ou à imobilização pode ser feito por um profissional de saúde (por exemplo, médico, enfermei- ro, praticante de enfermagem no caso de seres humanos; veterinário no ca- so de vertebrados não-humanos).
Por "fratura óssea" entenda-se uma quebra, ruptura ou rachadu- ra completa ou incompleta de um osso. O diagnóstico de fraturas normal- mente depende de exame clínico e achados radiológicos. Na invenção, fratu- ras ósseas incluem, mas não estão limitadas a, fraturas traumáticas, fraturas a longo prazo e fraturas patológicas.
"Fratura traumática", conforme usado aqui, se referirá a uma fra- tura imediata a qual envolve um trauma supraliminal com um grau de violên- cia local que excede a elasticidade natural do osso. Ela pode ser acompa- nhada por lesão simultânea aos tecidos moles e, muito freqüentemente, a pele. Uma fratura traumática pode ser fechada (o tecido mole adjacente po- de ser lesado, mas as partes moles de cobertura são grandemente preser- vadas). Uma fratura traumática pode ser exposta (as extremidades quebra- das do osso são liberadas através de lesão extensiva ao tecido moles, de modo que patógenos do exterior podem entrar no ferimento diretamente).
"Fratura a longo prazo", conforme usado aqui, se referirá a uma fratura crônica, fratura por fadiga, fratura por tensão ou fratura espontânea do tipo I.
"Fratura patológica", conforme usado aqui, se referirá a uma fra- tura espontânea do tipo II. Uma fratura patológica surge espontaneamente, sem trauma adequado respondendo por ela. O osso pode ter sido previa- mente danificado, quer através de uma doença sistêmica (por exemplo, os- teoporose, osteodistrofia ou osteíte deformans de Paget) ou através de uma lesão óssea local (por exemplo, metástase, radio-osteonecrose ou tumor ósseo). Vide, Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, página 114 (Springer- Verlag, Alemanha 2000).
Fraturas também incluem, mas não estão limitadas a, fratura por torção oblíqua, fratura transversa, fratura por esmagamento, fratura por compressão, fraturas da costela, fratura por deformação e cabeça femoral fraturada (Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, Springer-Verlag, Alemanha (2000)).
Conforme usado aqui, o termo "condição caracterizada por baixa massa óssea" inclui, mas não está limitado a, osteopenia, osteoporose, artri- te reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática na infância, curvatura da espi- nha e perda de altura. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteo- porose primária. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose secundária. Em determinadas modalidades, osteoporose secundária está associada à condições médicas. Em determinadas modalidades, osteoporo- se secundária está associada ao uso de um medicamento ou fármaco. Em determinadas modalidades, osteoporose secundária está associada à imobi- lização. Condições caracterizadas por baixa massa óssea também incluem, mas não estão limitadas a, doença de Paget e perda óssea em virtude de câncer metastático e lesões osteolíticas, tais como aquelas causadas por doença neoplásica, radioterapia ou quimioterapia. Condições caracterizadas por baixa massa óssea também incluem, mas não estão limitadas a, compli- cações a longo prazo de osteoporose, tais como curvatura da espinha, perda de altura e cirurgia protética. Deverá ser entendido que, na presente inven- ção, condições caracterizadas por baixa massa óssea podem ser incluídas em modalidades individualmente ou em qualquer combinação (vide, por e- xemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Pre- vention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrino- logy, 10ã Edição, Larsen e outros, Eds. (2002), W.B. Saunders Company; e Endocrinology and Metabolism, 4ã Edição, Felig e outros, Eds. (2001), Mc- Graw-Hill Book Company; a descrição de cada um dos quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade).
Conforme usado aqui, "doença óssea" se refere a um distúrbio ou condição referente a uma anormalidade do osso. Doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com a invenção, através de aumento da mas- sa óssea ou crescimento ósseo incluem, mas não estão limitadas a, osteo- penia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, per- da óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática na infância, curvatura da espinha e perda de altura. Em determinadas modali- dades, osteoporose é osteoporose primária. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose secundária. Em determinadas modalidades, os- teoporose secundária está associada à condições médicas. Em determina- das modalidades, osteoporose secundária está associada ao uso de um medicamento ou fármaco. Em determinadas modalidades, osteoporose se- cundária está associada à imobilização. Doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com a invenção através de aumento da massa óssea ou crescimento ósseo também incluem, mas não estão limitadas a, doença de Paget e perda óssea em virtude de câncer metastático. Distúrbios ósseos destrutivos que podem ser tratados de acordo com a invenção através de aumento da massa ou crescimento ósseo incluem, mas não estão limitados a, osteoporose, osteoartrite e lesões osteolíticas, tais como aquelas causa- das por doença neoplásica, radioterapia ou quimioterapia. Deverá ser enten- dido que, na presente invenção, doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com a invenção, através de aumento ou crescimento da massa ós- sea, podem ser incluídas em modalidades individualmente ou em qualquer combinação (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, 10â Edição, Larsen e outros, Eds. (2002), W.B. Saunders Company; e Endocrinology and Metabolism, A- Edição, Felig e outros, Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; a descrição de cada um dos quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade).
A presente invenção também se refere à outras condições que derivam um benefício de tratamento de acordo com a invenção, através de aumento da massa óssea ou crescimento ósseo incluindo, mas não limitado a, cicatrização óssea intensificada após reconstrução facial, reconstrução do maxilar, reconstrução da mandíbula, doença periodontal ou extração de den- te, extensão de osso longo intensificada, crescimento protético interno inten- sificado e sinostose óssea aumentada.
O termo "endógeno" significará um material que um indivíduo (por exemplo e sem limitação, um ser humano) produz naturalmente. Em contraste, "não-endógeno" significará aquilo que não é naturalmente produ- zido por um indivíduo (por exemplo e sem limitação, um ser humano).
O termo "fragmento biologicamente ativo" de um receptor aco- plado à proteína G significará um fragmento do GPCR tendo funções estru- turais e bioquímicas de um GPCR que ocorre naturalmente. Em determina- das modalidades, o fragmento biologicamente ativo se acopla a uma proteí- na G. Em determinadas modalidades, o fragmento biologicamente ativo se liga a um Iigante conhecido do GPCR.
O termo "iniciador" é usado aqui para denotar uma seqüência de nucleotídeo específica a qual é complementar a uma seqüência de nucleotí- deo alvo e usada para se hibridizar à seqüência de nucleotídeo alvo. Um iniciador serve como um ponto de início para polimerização de nucleotídeo catalisada por DNA polimerase, RNA polimerase ou transcriptase reversa.
O termo "vetor de expressão" significará uma seqüência de DNA que é requerida para transcrição de DNA clonado e tradução do mRNA transcrito em uma célula hospedeira recombinante apropriada para o vetor de expressão. Um vetor de expressão apropriadamente construído deverá conter uma origem de replicação para replicação autônoma em células hos- pedeiras, marcadores selecionáveis, um limite limitado de sítios de enzima de restrição úteis, um potencial por alto número de cópias e promotores ati- vos. O DNA clonado a ser transcrito é operavelmente ligado a um promotor constitutiva ou condicionalmente ativo dentro do vetor de expressão.
O termo "célula hospedeira" significará uma célula capaz de ter um vetor incorporado na mesma. No presente contexto, o vetor conterá, tipi- camente, um ácido nucléico que codifica um GPCR ou proteína de fusão de GPCR em conexão operável com uma seqüência promotora adequada para permitir que expressão do GPCR ou proteína de fusão de GPCR ocorra. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eu- cariota. Em determinadas modalidades, a célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de mamífero. Em determinadas modalidades, a célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de levedo. Em determinadas modalidades, a célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de me- lanoforo.
O termo "contato" ou "contato de" significará manter pelo menos duas porções juntas.
Os termos "modular" ou "modificar" serão tomados para se refe- rir a um aumento ou diminuição na quantidade, qualidade ou efeito de uma atividade, função ou molécula em particular. À guisa de ilustração e não Iimi- tação, agonistas, agonistas parciais, agonistas inversos e antagonistas de um receptor acoplado à proteína G são moduladores do receptor.
O termo "pequena molécula" deverá ser tomado para significar um composto tendo um peso molecular de menos do que cerca de 10.000 gramas por mol, incluindo um peptídeo, peptidomimético, aminoácido, aná- logo de aminoácido, polinucleotídeo, análogo de polinucleotídeo, nucleotí- deo, análogo de nucleotídeo, composto orgânico ou composto inorgânico (isto é, incluindo um composto heterorgânico ou um composto organometáli- co) e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis dos mes- mos. Em determinadas modalidades, pequenas moléculas são compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 5.000 gramas por mol. Em determinadas modalidades, pequenas molécu- las são compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 1.000 gramas por mol. Em determinadas modalida- des, pequenas moléculas são compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 800 gramas por mol. Em deter- minadas modalidades, pequenas moléculas são compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 600 gra- mas por mol. Em determinadas modalidades, pequenas moléculas são com- postos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 500 gramas por mol.
Abreviações de amínoácidos usadas aqui são apresentadas na Tabela B:
TABELA B
<table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table>
O termo "polipeptídeo" se referirá a um polímero de aminoácidos sem considerar o comprimento do polímero. Assim, oligopeptídeos e proteí- nas estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Esse termo também não especifica ou exclui modificações pós-expressão de polipeptídeos. Por exemplo, os polipeptídeos que incluem a fixação covalente de grupos glicosi- la, grupos acetila, grupos fosfato, grupos lipídicos e similares são expressa- mente abrangidos pelo termo polipeptídeo.
O termo "polinucleotídeo" se referirá a RNA, DNA ou uma se- qüência híbrida de RNA/DNA de mais de um nucleotídeo, na forma de ca- deia simples ou dupla. Os polinucleotídeos da invenção podem ser prepara- dos através de qualquer método conhecido, incluindo recombinante, geração ex vivo ou uma combinação dos mesmos, bem como utilizando quaisquer métodos de purificação conhecidos na técnica.
O termo "anticorpo" se destina aqui a abranger anticorpo mono- clonal e anticorpo policlonal.
O termo "segundo mensageiro" significará uma resposta intrace- lular produzida como um resultado de ativação de receptor. Um segundo mensageiro pode incluir, por exemplo, 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacil- glicerol (DAG), AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), atividade de quí- nase MAP, atividade de quínase-1 de MAPK/quínase ERK (MEK.K1) e Ca2+. A resposta do segundo mensageiro pode ser medida para uma determina- ção de ativação do receptor.
O termo "funcionalidade do receptor" se referirá à operação normal de um receptor para receber um estímulo e moderar um efeito na célula incluindo, mas não limitado a, regulação de transcrição de gene, regu- lação do influxo ou efluxo de íons, afetar uma reação catalítica e/ou modular a atividade através de proteínas G, tal como estimulação da resposta de um segundo mensageiro. O termo "estimula" ou "estimulação", em relação ao termo "res- posta" ou "funcionalidade do receptor", significará que a resposta ou funcio- nalidade do receptor é aumentada na presença de um composto em oposi- ção à ausência do composto.
O termo "inibe" ou "inibição", em relação ao termo "resposta" ou "funcionalidade do receptor", significará que a resposta de funcionalidade do receptor é diminuída ou impedida na presença de um composto em oposição à ausência do composto.
O termo "eficácia do composto" significará uma medição da ca- pacidade de um composto de inibir ou estimular a funcionalidade do recep- tor, em oposição à afinidade de ligação do receptor.
O termo "composto de teste," usado permutavelmente aqui com "composto candidato", significará uma molécula (por exemplo e sem limita- ção, um composto químico) a qual é passível de uma técnica de seleção.
O termo "constitutivamente ativo", em relação a um receptor a- coplado à proteína G, significará que o receptor acoplado à proteína G exibe atividade agonista-independente.
O termo "identificação direta de" ou "diretamente identificado", em relação à frase "composto de teste," significará a seleção de um compos- to contra um receptor acoplado à proteína G na ausência de um Iigante co- nhecido (por exemplo, um agonista conhecido) ao receptor acoplado à prote- ína G.
Onde uma faixa de valores é fornecida, deve ser entendido que cada valor interveniente, ao décimo do limite mínimo, a menos que o contex- to indique claramente de outro modo, entre os limite máximo e mínimo dessa faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nessa faixa esta- belecida, é abrangido dentro da invenção. Os limites máximo e mínimo des- sas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas me- nores e também são abrangidos dentro da invenção, sujeitos a qualquer limi- te especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo um ou ambos esses limites incluídos também são incluídas na invenção. A. Introdução
A ordem das seções a seguir é apresentada para eficiência de apresentação e não se destina, nem deverá ser construída, como uma limi- tação sobre a descrição ou as reivindicações que seguem.
B. Expressão de Receptor
1. polipeptídeo de GPCR de interesse
Um GPCR da invenção pode compreender uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
(a) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2;
(b) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2;
(c) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2, em que o GPCR não compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;
(d) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usan- do iniciadores específicos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4;
(e) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1;
(f) uma variante de SEQ ID NO: 2;
(g) a seqüência de aminoácido de (f) quando selecionada do grupo consistindo em:
(i) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à proteí- na G tendo pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2; e
(ii) a seqüência de aminoácido de um receptor acoplado à prote- ína G compreendendo pelo menos 20 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2;
(h) a seqüência de aminoácido de uma versão constitutivamente ativa de um receptor acoplado à proteína G tendo SEQ ID NO: 2; e
(i) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (a) a
(h).
Em determinadas modalidades, um GPCR da invenção compre- ende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G co- dificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor acoplado à proteína G endógeno. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotí- deo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase e que é um receptor acoplado à proteína G endógeno é um receptor acoplado à pro- teína G de mamífero. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à pro- teína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase e que é um receptor acoplado à proteína G endó- geno é um receptor GPR119 de mamífero. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplifi- cável através de reação em cadeia de polimerase é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à pro- teína G codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de rea- ção em cadeia de polimerase é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determina- das modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinu- cleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente ao Composto I (vide Tabela A, a qual apresenta a estru- tura química e nome químico do Composto 1). Em determinadas modalida- des, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especifica- mente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol- 5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determinadas modalida- des, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especifica- mente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5- il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC5o no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cer- ca de 50 nM. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil- fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4- il}-amina com um valor de IC50 no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido receptor no ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cer- ca de 1 nM. Em determinadas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimerase é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil- fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4- il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido receptor no en- saio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G codificado pelo polinucleotídeo que é amplificável a- través de reação em cadeia de polimerase exibe o nível detectável de ativi- dade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a ativida- de constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento. Em algumas modalidades, o DNA humano é DNA genômico.
Em algumas modalidades, a reação em cadeia de polimerase é reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Técni- cas de RT-PCR são bem-conhecidas por aqueles versados. Em algumas modalidades, o DNA humano é cDNA humano derivado de um tecido ou tipo de célula que expressa GPR119. Em algumas modalidades, o tecido huma- no que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhota pancreática. Em determina- das modalidades, o cDNA é de um tipo de célula humana que expressa G- PR119. Em algumas modalidades, o cDNA é de uma linhagem de célula be- ta pancreática.
Em algumas modalidades, um GPCR da invenção é recombi- nante. Em algumas modalidades, o GPCR recombinante é GPR119 recom- binante humano.
Em determinadas modalidades, um GPCR que pode ser usado nos métodos em questão exibe o nível detectável de atividade constitutiva.
Em algumas modalidades, um GPCR da invenção é endógeno.
Em algumas modalidades, um GPCR da invenção é um GPR119 de mamífe- ro. Em algumas modalidades, um GPCR da invenção que é endógeno é um GPR119de mamífero.
À guisa de ilustração e não limitação, deleção de um resíduo de metionina N-terminal é considerado como proporcionando um fragmento bio- logicamente ativo que pode ser usado na presente invenção. Em determina- das modalidades, um fragmento biologicamente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N-término, a um peptídeo com- preendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA (de hemaglutinina do vírus da influenza) que se liga especificamente ao Composto 1. Em determinadas modalidades, um fragmento biologicamente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N-término, a um peptídeo compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA (de hemaglutinina do vírus da influenza) que se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, um fragmento biologicamente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N-término, a um peptídeo com- preendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA que se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC50 no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 25 uM, me- nos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 ηM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, um fragmento biologicamente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N-término, a um peptídeo compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA que se liga especificamen- te à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC50 no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, me- nos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, um fragmento biologi- camente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N-término, a um peptídeo compreendendo um resíduo de metionina N- terminal e uma tag de epitopo de HA para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil- fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4- il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido fragmento opcio- nalmente fundido em seu N-término ao referido peptídeo em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, me- nos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em determinadas modalidades, um fragmento biologicamen- te ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N- término, a um peptídeo compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6- [4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC50 no referido fragmento opcionalmente fundido em seu N-término ao referido peptídeo em um ensaio de adenilil ci- clase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em algumas modalidades, um fragmento biologica- mente ativo da invenção é um fragmento opcionalmente fundido, em seu N- término, a um peptídeo compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA que exibe o nível detectável de atividade consti- tutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constituti- va é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmen- to. Em determinadas modalidades, o fragmento é fundido, em seu N-término, a um peptídeo consistindo essencialmente em um resíduo de metionina N- terminal e uma tag de epitopo de HA. Métodos para fusão de um peptídeo compreendendo ou consistindo essencialmente em um resíduo de metionina N-terminal e uma tag de epitopo de HA ao N-término de um fragmento de polipeptídeo são bem-conhecidos na técnica e podem ser obtidos comerci- almente (por exemplo, Clontech, Mountain View, CA).
Considera-se uma variante alélica de GPR119 humano de SEQ ID NO: 2 como estando dentro do escopo da invenção. GPR119 humano considerado como estando dentro do escopo da invenção.
Uma variante a qual é um ortólogo de vertebrado de GPR119 humano de SEQ ID NO: 2 é considerada como estando dentro do escopo da invenção. Uma variante a qual é um ortólogo de mamífero de GPR119 hu- mano de SEQ ID NO: 2 é considerada como estando dentro do escopo da invenção. À guisa de ilustração e não limitação, GPR119 de camundongo (por exemplo, Acesso ao GenBank® No. AY288423), GPR119 de rato (A- cesso ao GenBank® No. AAN95195), GPR119 de hâmster, GPR119 de cão e GPR119 de primata não-humano são considerados como estando dentro do escopo da invenção.
Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR.
Uma variante de SEQ ID NO: 2 tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cer- ca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade a SEQ ID NO: 2 é considerada como estando dentro do escopo da invenção. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cer- ca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade a SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR endógeno. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR não-endógeno. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 que é um GPCR endógeno é um GPCR de mamífero. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente ao Com- posto 1. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC5o no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC50 no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, a va- riante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano- sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[l ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido recep- tor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exem- plo 8, infra, de menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano- sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido recep- tor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exem- plo 8, infra, de menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em algumas modali- dades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento. A identidade percentual pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos.
Em determinadas modalidades, uma variante GPCR que pode ser usada nos métodos em questão tem uma seqüência de aminoácido ten- do pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, de pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade a SEQ ID NO: 2. Por uma variante GPCR tendo, por exemplo, 95% de "identidade" à SEQ ID NO: 2 entenda-se que a seqüência de amino- ácido da variante é idêntica aos aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2, exceto que ela pode incluir até cinco alterações de aminoácido por cada 100 ami- noácidos de SEQ ID NO: 2. Assim, para obter, por exemplo, uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade à seqüência de amino- ácido de SEQ ID NO: 2, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácido na seqüência podem ser inseridos, deletados ou substituídos por outro aminoá- cido comparado com os aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2. Essas altera- ções podem ocorrer no amino ou carbóxi término ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, interespaçadas subjetivamente entre resíduos na seqüência ou em um ou mais grupos contínuos dentro da seqüência.
Em determinadas modalidades, uma variante de receptor aco- piado à proteína G que pode ser usada nos métodos em questão é um re- ceptor acoplado à proteína G tendo uma seqüência de aminoácido derivada de SEQ ID NO: 2 através de deleção, substituição e/ou adição de um ou vá- rios aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma variante de receptor acoplado à proteína G que pode ser usada nos métodos em questão é um receptor acoplado à proteína G tendo uma seqüência de aminoácido deriva- da de SEQ ID NO: 2 através de não mais do que 10 substituições conserva- tivas de aminoácido e/ou não mais do que 3 substituições não conservativas de aminoácido na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Em determi- nadas modalidades, arginina, Iisina e histidina podem substituir conservati- vãmente uns aos outros; ácido glutâmico e ácido aspártico podem substituir conservativamente um ao outro; glutamina e asparagina podem substituir conservativamente um ao outro; leucina, isoleucina e valina podem substituir conservativamente uns aos outros; fenilalanina, triptofano e tirosina podem substituir conservativamente uns aos outros; e glicina, alanina, serina, treo- nina e metionina podem substituir conservativamente uns aos outros. As substituições de aminoácido, deleções de aminoácido e adições de aminoá- cido podem ser em qualquer posição (por exemplo, o C- ou N-término ou em posições internas). Em algumas modalidades, a variante é um receptor aco- plado à proteína G endógeno. em some modalidades, a variante é um recep- tor acoplado à proteína G de vertebrado endógeno. Em algumas modalida- des, a variante é um receptor acoplado à proteína G de mamífero endógeno. Em algumas modalidades, a variante é um receptor acoplado à proteína G humano endógeno. Em algumas modalidades, a variante é um receptor aco- plado à proteína G não-endógeno. Em algumas modalidades, a variante exi- be o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento da cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de mela- noforo sofram dispersão de pigmento. Em determinadas modalidades, o re- ferido receptor acoplado à proteína G tendo uma seqüência de aminoácido derivada de SEQ ID NO: 2 é um receptor acoplado à proteína G para o qual o Composto 1 é um ligante. Em determinadas modalidades, o referido recep- tor acoplado à proteína G tendo uma seqüência de aminoácido derivada de SEQ ID NO: 2 é um receptor acoplado à proteína G para o qual o (2-Flúor-4- metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5- nitro-pirimidin-4-il}-amina é um ligante tendo um valor de IC5o no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50u.M, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, o referido receptor acoplado à prote- ína G tendo uma seqüência de aminoácido derivada de SEQ ID NO: 2 é um receptor acoplado à proteína G para o qual o Composto 1 é um agonista. Em determinadas modalidades, o referido receptor acoplado à proteína G tendo uma seqüência de aminoácido derivada de SEQ ID NO: 2 é um receptor a- coplado à proteína G para o qual o (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 5 nM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM.
Uma variante de SEQ ID NO: 2 que é um receptor acoplado à proteína G compreendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2 é considerada como estando dentro do escopo da inven- ção. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 compreen- dendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2 é um GPCR. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR endógeno. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR não-endógeno. Em algumas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 que é um GPCR endógeno é um GPCR de mamífero. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente ao Com- posto 1. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC5o no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 25u.M, menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC50 no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, a va- riante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano- sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido recep- tor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exem- plo 8, infra, de menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em determinadas modalidades, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano- sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC50 no referido recep- tor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exem- plo 8, infra, de menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em algumas modali- dades, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para au- mento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento. Em algumas modalidades, o receptor acoplado à proteína G com- preendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em algumas modalidades, uma variante GPCR que pode ser usada nos métodos em questão é um GPCR codificado por um polinucleotí- deo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinu- cleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao comple- mento de SEQ ID NO: 1 é um GPCR endógeno. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um GPCR não- endógeno. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleo- tídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: I e que é um GPCR endógeno é um GPCR endógeno de mamífero. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um poli- nucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao com- plemento de SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2 ou um alelo do mesmo. Em de- terminadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um alelo de SEQ ID NO: 2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleo- tídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: se liga especificamente ao Composto 1. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em determi- nadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibri- diza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-pipeNdin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC5O no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5pM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou me- nos do que cerca de 50 nM. Em determinadas modalidades, o GPCR codifi- cado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estrin- gência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 se liga especificamente à (2- Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin- 1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de IC5o no ensaio de ligação a receptor de acordo com Exemplo 12, infra, de menos do que cerca de 10 uM, menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM ou menos do que cer- ca de 50 nM. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4- metano-sulfonil4enil)-{6-[4-(3-isopropN-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5- nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC5O no referido receptor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 5 uM, menos do que cerca de 1 uM, menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em determinadas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 é um receptor para o qual (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ 1,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin- 4-il}-amina é um agonista tendo um valor de EC50 no referido receptor em um ensaio de adenilil ciclase com célula inteira de acordo com Exemplo 8, infra, de menos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 5 nM ou menos do que cerca de 1 nM. Em algumas modalidades, o GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1 exibe o nível detectável de atividade constitutiva. Em algumas modali- dades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que cé- lulas de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Técnicas de hibridização são bem-conhecidas por aqueles ver- sados. Em algumas modalidades, condições de hibridização estringente (por exemplo, condições de alta estringência) incluem incubação durante a noite a 42°C em uma solução compreendendo: formamida a 50%, 5 x SSC (1 x SSC= NaCl a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5 x Solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado; seguido por Iava- gem do filtro em 0,1 x SSC a cerca de 65°C. Em algumas modalidades, con- dições de hibridização estringente (por exemplo, condições de alta estrin- gência) incluem incubação durante a noite a 42°C em uma solução compre- endendo: formamida a 50%, 5 χ SSC (1 χ SSC = NaCl a 150 mM, citrato tris- sódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x Solução de De- nhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado; seguido por uma lavagem em 0,1 χ SSC/SDS a 0,1% (dodecil sulfato de sódio) ou em 0,2 χ SSC/SDS a 0,1% a cerca de 50°C, a cerca de 55°C, a cerca de 60°C ou a cerca de 65°C. Em algumas modalidades, as referidas condições de alta estringência compreende lava- gem a 65°C com 0,1 χ SSC. Em algumas modalidades, as referidas condi- ções de alta estringência compreendem lavagem a cerca de 50°C, a cerca de 55°C, a cerca de 60°C ou a cerca de 65 0C com 0,1 χ SSC/SDS a 0,1 % ou com 0,2 χ SSC/SDS a 0,1%.
Em algumas modalidades, um GPCR que pode ser usada nos métodos em questão é um receptor não-endógeno constitutivamente ativado compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, em que a leucina na posição de aminoácido 224 de SEQ ID NO: 2 é substituída por um outro aminoácido que não-leucina. Em algumas modalidades, o outro aminoácido que não-leucina é lisina. Em algumas modalidades, o outro ami- noácido que não-leucina é alanina. Em algumas modalidades, o outro ami- noácido que não-leucina é arginina. Em algumas modalidades, o outro ami- noácido que não-leucina é histidina. Em algumas modalidades, a atividade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algumas mo- dalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanofo- ro sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, um GPCR da invenção compre- ende uma versão constitutivamente ativa de um receptor acoplado à proteí- na G tendo SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a versão constitutiva- mente ativa do receptor é uma versão endógena constitutivamente ativa ten- do SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a versão constitutivamente ati- va do receptor é uma versão não-endógena constitutivamente ativa tendo uma mutação posicionada na posição de aminoácido 224 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o resíduo com mutação sofreu mutação para um outro resíduo que não-leucina. Em algumas modalidades, o resíduo com mutação sofreu mutação para um resíduo de lisina. Em algumas modalida- des, o resíduo com mutação sofreu mutação para um resíduo de alanina. Em algumas modalidades, o resíduo com mutação sofreu mutação para um resíduo de arginina. Em algumas modalidades, o resíduo com mutação so- freu mutação para um resíduo de histidina. Em algumas modalidades, a ati- vidade constitutiva é para aumento do nível de cAMP intracelular. Em algu- mas modalidades, a atividade constitutiva é para fazer com que células de melanoforo sofram dispersão de pigmento.
Em determinadas modalidades, um GPCR da invenção forma parte de uma proteína de fusão com uma proteína G.
a. Identidade de seqüência
* Em determinadas modalidades, a identidade percentual é avali- ada usando a Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), a qual é bem- conhecida na técnica [vide, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 2264-2268; Altschul e outros J Mol Biol (1990) 215: 403- 410; Altschul e outros, Nature Genetics (1993) 3: 266-272; e Altschul e ou- tros, Nucleic Acids Res (1997) 25: 3389-3402; a descrição de cada um dos quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade]. O programa BLAST pode ser usado com os parâmetros de previamente selecionados ou com parâmetros modificados fornecidos pelo usuário. De preferência, os pa- râmetros são parâmetros de previamente selecionados.
Em determinadas modalidades, um método preferido para de- terminação da melhor combinação global entre uma seqüência de pesquisa (por exemplo, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2) e uma seqüên- cia a ser interrogada, também referida como um alinhamento de seqüência global, pode ser determinada usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag e outros (Comp App Biosci (1990) 6: 237- 245; a descrição de do qual é incorporada aqui por referência em sua totali- dade). No alinhamento de seqüência, as seqüências de pesquisa e interro- gadas são ambas seqüências de aminoácido. Os resultados do referido ali- nhamento de seqüência global são a identidade percentual. Parâmetros pre- feridos usados em um alinhamento de aminoácido pelo FASTDB são: Matriz = PAM O, k-tuple = 2, Penalidade por Combinação Errônea = 1, Penalidade por União = 20, Grupo de Randomização = 25, Comprimento = 0, Escore de Corte = 1, Tamanho de Janela = comprimento de seqüência, Penalidade por Gap = 5, Penalidade por Tamanho de Gap = 0,05, Tamanho de Janela = 247 ou o comprimento da seqüência de aminoácido interrogada, qualquer que seja mais curta. Se a seqüência interrogada é mais curta do que a seqüência de pesquisa em virtude de deleções N- ou C-terminais, não em virtude de deleções internas, os resultados, na identidade percentual, devem ser ma- nualmente corrigidos porque o programa FASTDB não leva em conta trun- camentos N- e C-terminais da seqüência interrogada quando de cálculo da identidade percentual global. Para seqüências interrogadas nos N- e C- términos, com relação à seqüência de pesquisa, a identidade percentual é correlacionada calculando o número de resíduos da seqüência de pesquisa que são N- e C-terminais da seqüência interrogada, que não são combina- dos/alinhados com um resíduo da seqüência interrogada correspondente, como um percentual das bases total da seqüência de pesquisa. Se um resí- duo é combinado/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de seqüência pelo FASTDB. Esse percentual é, então, subtraído da identi- dade percentual, calculado através do programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar em um escore final de identidade percentual. Esse escore de identidade percentual final é aquele usado para fins da presente invenção. Apenas resíduos nos N- e C-términos da seqüên- cia interrogada, os quais não são alinhados/combinados com a seqüência de pesquisa, são considerados para fins de ajuste manual do escore de identi- dade percentual. Isto é, resíduos de aminoácido de pesquisa fora dos resí- duos N- e C-terminais mais distantes da seqüência interrogada.
Por exemplo, uma seqüência interrogada de 90 aminoácidos é alinhada com uma seqüência de pesquisa de 100 resíduos para determinar a identidade percentual. A deleção ocorre no N-término da seqüência inter- rogada e, portanto, o alinhamento pelo FASTDB não combina/alinha com os primeiros resíduos no N-término. Os 10 resíduos não-emparelhados repre- sentam 10% da seqüência (número de resíduos no N- e C-términos não combinados/número total de resíduos na seqüência de pesquisa), de modo que 10% são subtraídos do escore de identidade percentual calculado pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduo restantes são perfeitamente combina- dos, a identidade percentual final seria de 90%. Em outro exemplo, uma se- qüência interrogada de 90 resíduos é comparada com uma seqüência de pesquisa de 100 resíduos. Nesse momento, as deleções são internas, de modo que não há resíduos no N- ou C-términos da seqüência interrogada, os quais não são combinados/alinhados com a pesquisa. Nesse caso, a i- dentidade de percentual calculada pelo FASTDB não é manualmente corri- gida. Mais uma vez, apenas posições de resíduo fora das extremidades C- e N-terminais da seqüência em questão, conforme visualizado no alinhamento pelo FASTDB, as quais não são combinadas/alinhadas com a seqüência de pesquisa são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção é feita para fins da presente invenção. b. Proteínas de Fusão
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de interesse é uma proteína de fusão e pode conter, por exemplo, um domínio de tag de afinidade ou um domínio repórter. Tags de afinidade adequados incluem qualquer seqüência de aminoácido que pode ser especificamente ligada à outra porção, usualmente outro polipeptídeo, mais usualmente um anticorpo. Tags de afinidade adequados incluem tags de epitopo, por exemplo, o tag V5, o tag FLAG, o tag HA (de hemaglutinina do vírus da influenza), o tag myc e similares, conforme é conhecido na técnica. Tags de afinidade ade- quadas também incluem domínios para os quais substratos de ligação são conhecidos, por exemplo, tags HIS, GST e MBP, conforme é conhecido na técnica e domínios de outras proteínas para as quais os parceiros de ligação específicos, por exemplo, anticorpos, particularmente anticorpos monoclo- nais, estão disponíveis. Tags de afinidade adequadas também incluem qual- quer domínio de interação de proteína-proteína, tal como uma região Fc de IgG, o qual pode ser especificamente ligado e detectado usando um parceiro de ligação adequado, por exemplo, o receptor Fc de IgG. Considera-se ex- pressamente que tal proteína de fusão pode conter um domínio N-terminal heterólogo (por exemplo, uma tag de epitopo) fundido em-rede com um GP- CR que tenha tido seu resíduo de metionina N-terminal deletado ou substitu- ído por um aminoácido alternativo.
Domínios-repórter adequados incluem qualquer domínio que pode reportar a presença de um polipeptídeo. Embora seja reconhecido que uma tag de afinidade pode ser usada para reportar a presença de um poli- peptídeo usando, por exemplo, um anticorpo rotulado que se liga especifi- camente à tag, domínios repórteres que emitem luz são mais usualmente usados. Domínios repórteres que emitem luz adequados incluem Iuciferase (por exemplo, de vagalume, Vargula, Renilla reniformis ou Renilla muelleri) ou variantes que emitem luz da mesma. Outros domínios-repórter adequa- dos incluem proteínas fluorescentes (por exemplo, de água-viva, corais e outros celenterados, tais como aquelas de espécies Aequoria, Renilla, Ptilo- sarcus, Stylatula) ou variantes que emitem luz das mesmas. Variantes que emitem luz dessas proteínas repórteres são muito bem-conhecidas na técni- ca e podem ser mais claras, mais turvas ou ter diferentes espectros de exci- tação e/ou emissão quando comparado com uma proteína-repórter nativa. Por exemplo, algumas variantes são alteradas, de modo que elas não pare- cem mais verde e podem se tornar azul, ciano, amarelo, amarelo-vermelho intensificado (denominadas BFP, CFP, YFP e YFP e RFP, respectivamente) ou ter outros espectros de emissão, conforme é conhecido na técnica. Ou- tros domínios-repórter adequados incluem domínios que podem reportar a presença de um polipeptídeo através de uma alteração bioquímica ou na cor, tal como p-galactosidase, p-glucuronidase, acetil transferase de cloran- fenicol e fosfatase alcalina embriônica secretada.
Também, conforme é conhecido na técnica, as tags de afinidade ou um domínio-repórter podem estar presentes em qualquer posição em um polipeptídeo de interesse. Contudo, na maioria das modalidades, elas estão presentes na extremidade C- ou N-terminal de um polipeptídeo de interesse.
2. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de GPCR de interesse
Uma vez que o código genético e técnicas recombinantes para manipulação de ácido nucléico são conhecidas e a seqüência de aminoáci- dos de polipeptídeos de GPCR de interesse descrita conforme acima, o de- sign e produção de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de GP- CR de interesse está bem dentro da capacidade do técnico. Em determina- das modalidades, métodos-padrão de tecnologia de DNA recombinante (Au- subel e outros, Short Protocols in Molecular Biology1 3ã ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook e outros , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segun- da Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.) são usados. Por exemplo, se- qüências de codificação de GPCR podem ser isoladas de uma biblioteca de seqüência de codificação de GPCR usando qualquer um ou uma combina- ção de uma variedade de métodos recombinantes que não precisam ser descritos aqui. Subseqüente substituição, deleção e/ou adição de nucleotí- deos na seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína também po- dem ser feitas usando técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, mutagênese sítio dirigida e subclonagem podem ser usados para introdu- zir/deletar/substituir resíduos de ácido nucléico em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse. Em outras modalidades, PCR pode ser usada. Ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de interesse também podem ser feitos através de síntese química inteiramente a partir de oligonucleotídeos (por exemplo, Cello e outros, Science (2002) 297: 1016-8). Em algumas modalidades, os códons dos ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de interesse são otimizados para expressão em células de uma espécie em particular, particularmente um mamífero, por exemplo, ca- mundongo, rato, hâmster, primata não-humano ou ser humano. Em algumas modalidades, os códons dos ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de interesse são otimizados para expressão em células de uma espécie em particular, particularmente uma espécie de anfíbio. a. Vetores
A invenção ainda proporciona vetores (também referidos como "construtos") compreendendo um ácido nucléico em questão. Em muitas modalidades da invenção, as seqüências de ácido nucléico em questão se- rão expressas em um hospedeiro após as seqüências terem sido operavel- mente ligadas a uma seqüência de controle de expressão incluindo, por e- xemplo, um promotor. Os ácidos nucléicos em questão são também, tipica- mente, colocados em um vetor de expressão que pode se replicar em uma célula hospedeira, quer como um epissoma ou como uma parte integral do DNA cromossômico do hospedeiro. Comumente1 vetores de expressão con- terão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina ou neomicina, para permitir detecção daquelas células transformadas com as seqüências de DNA desejadas (vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.704.362, a qual é incor- porada aqui por referência). Vetores, incluindo vetores com cassete de ex- pressão simples e duplos são bem-conhecidos na técnica (Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3â ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook e outros , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Vetores adequados incluem vetores virais, plas- mídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais (cromossomas artificiais huma- nos, cromossomas artificiais bacterianos, cromossomas artificiais de levedo, etc.), minicromossomas e similares. Vetores virais retrovirais, adenovirais e adeno-associados podem ser usados.
Uma variedade de vetores de expressão está disponível para aqueles na técnica para fins de produção de um polipeptídeo de interesse em uma célula e incluem vetores de expressão os quais estão comercial- mente disponíveis (por exemplo, da Invitrogen, Carlsbad, CA; Clontech, Mountain View, CA; Stratagene, La Jolla, CA).
Vetores de expressão comercialmente disponíveis incluem, à guisa de exemplo não limitativo, vetores baseados em promotor de CMV. Um vetor de expressão adequado é pCMV. O vetor de expressão pode ser adenoviral. Um vetor adenoviral exemplificativo pode ser adquirido como AdEasyTM da Qbiogene (Carlsbad, CA) (He TC e outros, Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95: 2509-2514; e Patente US No. 5.922.576; a descrição de ca- da um dos quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Ou- tros vetores de expressão adequados serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica.
Os ácidos nucléicos em questão usualmente compreendem uma rede de leitura aberta única que codifica um polipeptídeo de interesse em questão, contudo, em determinadas modalidades, uma vez que uma célula hospedeira para expressão do polipeptídeo de interesse pode ser uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de mamífero, tal como uma célula huma- na, a rede de leitura aberta pode ser interrompida por íntrons. Ácidos nucléi- cos em questão são, tipicamente, parte de uma unidade transcricional a qual pode conter, além do ácido nucléico em questão, regiões não-traduzidas 3' e 5' (UTRs) as quais podem dirigir a estabilidade do RNA, eficiência de tradu- ção, etc. O ácido nucléico em questão pode também ser parte de um casse- te de expressão o qual contém, além do ácido nucléico em questão, um promotor, o qual direciona a transcrição e expressão de um polipeptídeo de interesse e um terminador de transcrição.
Promotores eucariotas podem ser qualquer promotor que é fun- cional em uma célula hospedeira eucariota, incluindo promotores virais e promotores derivados de genes eucariotas. Promotores eucariotas exempli- ficativos incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: o promotor da seqüência do gene de lotioneína I de metal de camundongo (Hamer e ou- tros, J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982); o promotor TK do vírus do Herpes (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982); o promotor precoce de SV40 (Benoist e outros, Nature (Londres) 290: 304-310, 1981); o promotor da seqüência do gene gaM de Ievedo (Johnston e outros, Proc. Natl, Acad. Sei. (USA) 79: 6971-6975, 1982); Silver e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81: 5951- 59SS, 1984), o promotor de CMV, o promotor EF-1, promotores Ecdisona- responsivos), promotor tetraciclina-responsivo e similares. Promotores virais podem ser de interesse particular, uma vez que eles geralmente são promo- tores particularmente fortes. Em determinadas modalidades, um promotor é usado que é um promotor do patógeno alvo. Promotores para uso na pre- sente invenção são selecionados de modo que eles são funcionais no tipo de célula (e/ou animal) no qual eles estão sendo introduzidos. Em determi- nadas modalidades, o promotor é um promotor de CMV.
Em determinadas modalidades, um vetor em questão pode tam- bém proporcionar expressão de um marcador selecionável. Vetores e mar- cadores selecionáveis adequados são bem-conhecidos na técnica e discuti- dos em Ausubel, e outros, (Short Protocols in Molecular Biology, 3§ ed., Wi- ley & Sons, 1995) e Sambrook e outros, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição (2001) Cold Spring Harbor1 N.Y.). Uma variedade de diferentes genes têm sido empregados como marcadores selecionáveis e o gene empregado em particular nos vetores em questão como um marca- dor selecionável é escolhido primariamente como uma questão de conveni- ência. Genes marcadores selecionáveis conhecidos incluem: o gene de qui- nase de timidina, o gene de reductase de dihidrofolato, o gene de fosforibosil transferase de xantina-guanina, CAD, o gene de desaminase de adenosina, o gene de sintetase de asparagina, os genes de resistência a antibiótico, por exemplo, tetr, ampr, Cmr ou cat, kanr ou neor (genes de fosfotransferase de aminoglicosídeo), o gene de fosfotransferase de higromicina B e similares. Conforme mencionado acima, polipeptídeos de interesse podem ser proteí- nas de fusão que contêm um domínio de afinidade e/ou um domínio repórter. Métodos para fazer fusões entre um repórter ou tag e um GPCR, por exem- plo, no C- ou N-término do GPCR, estão bem dentro da capacidade daque- les versados na técnica (por exemplo, McLean et al., Mol. Pharma. Mol Pharmacol. 1999 56: 1182-91; Ramsay e outros , Br. J. Pharmacology, 2001, 315-323) e não serão descritos. Considera-se expressamente que tal proteí- na de fusão pode conter um domínio N-terminal heterólogo (por exemplo, uma tag de epitopo) fundido em-rede com um GPCR que tenha tido seu re- síduo de metionina N-terminal deletado ou substituído por um aminoácido alternativo. É apreciado que um polipeptídeo de interesse pode primeiro ser feito de um polipeptídeo nativo e, então, operavelmente ligado a um repór- ter/tag adequado, conforme descrito acima.
Os ácidos nucléicos em questão também podem conter sítios de restrição, sítios de clonagem múltipla, sítios de ligação de iniciador, extremi- dades passíveis de ligação, sítios de recombinação, etc., usualmente de forma a facilitar a construção de um ácido nucléico que codifica um polipep- tídeo de interesse.
b. Células hospedeiras
A invenção ainda proporciona células hospedeiras compreen- dendo um vetor compreendendo um ácido nucléico em questão. Células hospedeiras adequadas incluem procariotas, por exemplo, células bacteria- nas (por exemplo, E. coli), bem como células eucariotas, por exemplo, uma célula de animal (por exemplo, uma célula de inseto, mamífero, peixe, anfí- bio, pássaro ou réptil), uma célula de planta (por exemplo, uma célula de milho ou Arabidopsis) ou uma célula fúngica (por exemplo, uma célula de S. cerevisiae). Em determinadas modalidades, qualquer célula adequada para expressão de um polipeptídeo de interesse que codifica ácido nucléico pode ser usada com uma célula hospedeira. Usualmente, uma linhagem de célula hospedeira de animal é usada, exemplos das quais são como segue: células de rim de macaco (células COS), células CVI de rim de macaco transforma- das por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de rim embriônico humano (HEK-293 ["293"], Graham e outros J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células HEK-293T ["293T"]; células de rim de hâmster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hâmster Chinês (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. A- cad. Sei. (USA) 77: 4216, (1980); células de hâmster dourado Sírio MCB3901 (ATCC CRL-9595); células de Sertoli de camundongo (TM4, Ma- ther, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco African Green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato bú- falo (BRL 3 A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Ma- ther e outros , Annals Ν. Y. Acad. Sci 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); e células L de camundongo (ATCC CCL-1). Em determi- nadas modalidades, melanoforos são usados. Melanoforos são células da pele encontradas em vertebrados inferiores. Materiais e métodos relevantes serão seguidos de acordo com a descrição da Patente U.S. Número 5.462.856 e Patente U.S. Número 6.051.386. Essas divulgações de patente são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
Linhagens de células adicionais se tornarão evidentes para a- queles versados na técnica e uma ampla variedade de linhagens de célula estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.
C. Seleção de Compostos Candidatos
1. Técnicas genéricas de ensaio de seleção de GPCR
Quando um receptor de proteína G se torna ativo, ele se liga a uma proteína G (por exemplo, Gq, Gs, Gi, Gz, Go) e estimula a ligação de GTP a uma proteína G. A proteína G, então, atua como uma GTPase e len- tamente hidrolisa o GTP em GDP, pelo que o receptor, sob condições nor- mais, se torna desativado. Contudo, receptores ativados continuam a trocar GDP por GTP. Um análogo não hidrolisável de GTP, [35S]GTPyS, pode ser usado para monitorar a ligação intensificada a uma membrana a qual ex- pressa receptores ativados. É reportado que o [35SjGTPyS pode ser usado para monitorar o acoplamento de proteína G a uma membrana na ausência e presença de ligante. Um exemplo desse monitoramento, entre outros e- xemplos bem-conhecidos e disponíveis para aqueles versados na técnica, foi reportado por Traynor e Nahorski em 1995. Um uso preferido desse sis- tema de ensaio é para a seleção inicial de compostos candidatos porque o sistema é genericamente aplicável a todos os receptores acoplados à prote- ína G, a despeito da proteína G em particular que interage com o domínio intracelular do receptor.
2. Técnicas específicas de ensaio de seleção de GPCR
Uma vez que compostos candidatos foram identificados usando o ensaio "genérico" de receptor acoplado à proteína G (isto é, um ensaio para selecionar compostos que são agonistas ou agonistas inversos), em algumas modalidades, seleção adicional para confirmar que os compostos interagiram no sítio do receptor é preferida. Por exemplo, um composto iden- tificado pelo ensaio "genérico" pode não se ligar ao receptor, mas antes, me- ramente "desacoplar" uma proteína G do domínio intracelular.
a. Gs. Gz e Gi
Gs estimula a enzima adenilil ciclase. Gi (e Gz e Go), por outro lado, inibem a adenilil ciclase. A adenilil ciclase catalisa a conversão de ATP em cAMP; assim, GPCRs ativados que se acoplam à proteína Gs estão as- sociados a níveis celulares aumentados de cAMP. Por outro lado, GPCRs ativados que se acoplam à proteína Gi (ou Gz, Go) estão associados a ní- veis celulares diminuídos de cAMP. Vide, de modo geral, "lndirect Mecha- nisms of Synaptic Transmission," Capítulo 8, From Neuron To Brain (3ê Ed.) Nichols, J.G. e outros eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Assim, ensaios que detectam cAMP podem ser utilizados para determinar se um composto candidato é, por exemplo, um agonista inverso do receptor (isto é, um com- posto que diminuirá os níveis de cAMP). Uma variedade de abordagens co- nhecidas na técnica para medição de cAMP podem ser utilizadas; em algu- mas modalidades, uma abordagem preferida conta com o uso de anticorpos anti-cAMP em um formato baseado em ELISA. Outro tipo de ensaio que po- de ser utilizado é um ensaio de sistema-repórter de segundo mensageiro com células inteiras. Promotores sobre genes acionam a expressão das pro- teínas que um gene em particular codifica. AMP cíclico aciona a expressão de gene através de promoção da ligação de uma proteína de ligação a DNA ou fator de transcrição (CREB) cAMP-responsivo que, então, se liga ao pro- motor em sítios específicos denominados elementos de resposta a cAMP e acionam a expressão do gene. Sistemas-repórter podem ser construídos, os quais têm um promotor contendo múltiplos elementos de resposta ao cAMP antes do gene-repórter, por exemplo, β-galactosidase ou luciferase. Assim, um receptor Gs-Iigado ativado causa o acúmulo de cAMP que, então, ativa o gene e a expressão da proteína-repórter. A proteína-repórter, tal como p- galactosidase ou luciferase pode, então, ser detectada usando ensaios bio- químicos padrão (Chen e outros 1995). b. Go e Ga
Gq e Go estão associadas à ativação da enzima fosfolipase C a qual, por sua vez, hidrolisa o fosfolipídio PIP2, liberando dois mensageiros intracelulares: diaciclglicerol (DAG) e 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3). Acúmu- lo aumentado de IP3 está associado à ativação de receptores Gq- e Go- associados. Vide, de modo geral, "lndirect Mechanisms of Synaptic Trans- mission," Capítulo 8, From Neuron To Brain (3§ Ed.) Nichols, J.G. e outros eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Ensaios que detectam o acúmulo de IP3 podem ser utilizados para determinar se um composto candidato é, por exemplo, um agonista inverso de um receptor Gq- ou Go-associado (isto é, um composto que diminuirá os níveis de IP3). Receptores Gq-associados também podem ser examinados usando um ensaio repórter de API, em que a fosfolipase C Gq-dependente causa ativação de genes contendo elemen- tos API, assim, receptores Gq-associados ativados evidenciarão um aumen- to na expressão de tais genes, pelo que agonistas inversos ao mesmo evi- denciarão uma diminuição na expressão e agonistas evidenciarão um au- mento em tal expressão. Ensaios comercialmente disponíveis para tal detec- ção estão disponíveis.
3. Proteína de fusão de GPCR
O uso de um GPCR endógeno constitutivamente ativo ou um GPRC não-endógeno constitutivamente ativado para uso em seleção de compostos candidatos para a identificação direta de agonistas inversos ou agonistas proporciona um desafio de seleção interessante pelo fato de que, por definição, o receptor é ativo mesmo na ausência de um Iigante endógeno ligado ao mesmo. Assim, de forma a diferenciar, por exemplo, entre o recep- tor não-endógeno na presença de um composto candidato e o receptor não- endógeno na ausência desse composto, com o objetivo de que tal diferenci- ação permita uma compreensão se tal composto pode ser um agonista in- verso ou agonista ou não ter efeito sobre tal receptor, em algumas modali- dades, é preferido que uma abordagem seja utilizada que pode intensificar tal diferenciação. Em algumas modalidades, uma abordagem preferida é o uso de uma proteína de fusão de GPCR.
Geralmente, uma vez que se determinou que um GPCR não- endógeno foi constitutivamente ativado usando as técnicas de ensaio apre- sentadas acima (bem como outras conhecidas por aqueles versados), é possível determinar a proteína G predominante que se acopla ao GPCR en- dógeno. Acoplamento de uma proteína G ao GPCR proporciona uma via de sinalização que pode ser avaliada. Em algumas modalidades, é preferido que a seleção ocorra usando um sistema de expressão de mamífero ou me- lanoforo, uma vez que será esperado que tal sistema tenha proteína G en- dógena no mesmo. Assim, por definição, em tal sistema, o GPCR não- endógeno constitutivamente ativado sinalizará continuamente. Em algumas modalidades, é preferido que esse sinal seja intensificado de modo que, na presença, por exemplo, de um agonista inverso do receptor, seja mais pro- vável que ele seja capaz de diferenciar mais prontamente, particularmente no contexto de seleção, entre o receptor quando ele é contatado com o ago- nista inverso.
A proteína de fusão de GPCR se destina a intensificar a eficácia de acoplamento à proteína G ao GPCR. A proteína de fusão de GPCR pode ser preferida para seleção com um GPRC endógeno constitutivamente ativo ou um GPCR não-endógeno constitutivamente ativado porque tal aborda- gem aumenta o sinal que é gerado em tais técnicas de seleção. Isso é im- portante para facilitar uma proporção significativa de "sinal para ruído"; tal proporção significativa é preferida para a seleção de compostos candidatos conforme descrito aqui.
A construção de tal estrutura útil para expressão de uma proteí- na de fusão de GPCR está dentro da visão daqueles versados na técnica. Vetores de expressão e sistemas comercialmente disponíveis oferecem uma variedade de abordagens que podem se adaptar às necessidades particula- res de um investigador. Critérios importantes na construção de tal estrutura de proteína de fusão de GPCR incluem, mas não estão limitados a, que a seqüência do GPCR e a seqüência da proteína G estejam ambas em-rede (de preferência, a seqüência para o GPCR endógeno está a montante da seqüência da proteína G) e que o códon "terminal" do GPCR seja deletado ou substituído de modo que, quando de expressão do GPCR, a proteína G também possa ser expressa. O GPCR pode ser ligado diretamente à proteí- na G ou podem haver resíduos espaçadores entre os dois (de preferência, não mais do que cerca de 12, embora esse número possa ser prontamente determinado por aqueles versados na técnica). Baseado na conveniência, é preferido usar um espaçador. Em determinadas modalidades, é preferido que a proteína G que se acopla ao GPCR não-endógeno tenha sido identifi- cada antes da criação da estrutura de proteína de fusão de GPCR.
Conforme notado acima, espera-se que GPCRs ativados que se acoplam à Gi, Gz e Go inibam a formação de cAMP fazendo ensaios basea- dos nesses tipos de estimulação de GPCRs (isto é, o sinal de cAMP diminui quando de ativação, assim, fazendo a identificação direta, por exemplo, de estimulação com agonistas (os quais diminuiriam adicionalmente esse sinal). Conforme será descrito aqui, foi determinado que, para esses tipos de re- ceptores, é possível criar uma proteína de fusão de GPCR que não é basea- da na proteína G endógena de GPCR, em um esforço para estabelecer um ensaio baseado em ciclase viável. Assim, por exemplo, um receptor acopla- do à Gi endógeno pode ser fundido a uma proteína Gs - tal estrutura de fu- são, quando de expressão, "aciona" ou "força" o GPCR endógeno a acoplar, por exemplo, com Gs ao invés de a proteína Gi "natural", de modo que um ensaio baseado em ciclase possa ser estabelecido. Assim, para receptores acoplados a Gi, Gz e Go, em algumas modalidades, é preferido que, quando uma proteína de fusão de GPCR é usada e o ensaio é baseado em detecção de atividade de adenilil ciclase, a estrutura de fusão seja estabelecida com Gs (ou uma proteína G equivalente que estimula a formação da enzima ade- nilil ciclase).
TABELA C
<table>table see original document page 116</column></row><table>
Igualmente eficaz é um construto de fusão de proteína G que utiliza uma proteína Gq fundida com uma proteína Gs, Gi, Gz ou Go. Em algumas modalidades, um construto de fusão preferido pode ser obtido com uma proteína Gq, em que os primeiros seis (6) aminoácidos da subunidade α da proteína G ("Gaq") são deletados e os últimos cinco (5) aminoácidos da extremidade C-terminal da Gaq sejam substituídos pelos aminoácidos cor- respondentes da Ga de uma proteína G de interesse. Por exemplo, um cons- truto de fusão pode ter uma Gq (deleção de 6 aminoácidos) fundida com uma proteína Gi, resultando em um "construto de fusão Gq/Gi". Esse cons- truto de fusão forçará o receptor acoplado à Gi endógeno a se acoplar à sua proteína G não-endógena, Gq, de modo que o segundo mensageiro, por e- xemplo, trifosfato de inositol ou diacilglicerol, pode ser medido em lugar da produção de cAMP.
4. Co-transfeccão de um GPCR acoplado a Gi alvo com um GPCR acoplado a Gs intensificador de sinal (ensaios baseados em cAMP)
Um receptor acoplado a Gi é conhecido por inibir a adenilil cicla- se e, portanto, diminui o nível de produção de cAMP, o que pode fazer a avaliação de estimulação dos níveis de cAMP. Em determinadas modalida- des, uma técnica eficaz na medição da diminuição na produção de cAMP como uma indicação de ativação de um receptor que se acopla predominan- temente a Gi quando de ativação pode ser realizada através de co- transfecção de um intensificador de sinal, por exemplo, um receptor constitu- tivamente ativado não-endógeno que se acopla predominantemente com a Gs quando de ativação (por exemplo, TSHR-A623I; vide infra), com o GPCR ligado à Gi. Conforme é evidente, ativação de um receptor acoplado à Gs pode ser determinada baseada em aumento na produção de cAMP. Ativação de um receptor acoplado a Gi leva a uma diminuição na produção de cAMP. Assim, a abordagem de co-transfecção se destina a explorar, vantajosamen- te, esses efeitos "opostos". Por exemplo, co-transfecção de um receptor a- coplado a Gs constitutivamente ativado não-endógeno (o "intensificador de sinal" com vetor de expressão apenas proporciona um sinal de cAMP de li- nha de base (isto é, embora o receptor acoplado à Gi diminua os níveis de cAMP, essa "diminuição" será com relação ao aumento substancial nos ní- veis de cAMP estabelecido pelo intensificador de sinal acoplado à Gs consti- tutivamente ativado). Então, co-transfectando o intensificador de sinal com o "receptor-alvo", um agonista inverso do receptor alvo acoplado à Gi aumen- tará o sinal de cAMP medido, enquanto que um agonista do receptor alvo acoplado a Gi diminuirá esse sinal.
Compostos candidatos que são diretamente identificados usan- do essa abordagem serão avaliados independentemente para assegurar que esses não objetivam o receptor de intensificação de sinal (isso pode ser feito antes ou após seleção contra os receptores co-transfectados). Composição/formulação e métodos de tratamento
Um agonista de GPR119 pode ser formulado em composições farmacêuticas e medicamentos para uso de acordo com a presente invenção usando métodos bem-conhecidos na técnica. A formulação apropriada é de- pendente da via de administração escolhida. Em determinadas modalidades, a referida administração é a um vertebrado não-humano ou to um mamífero não-humano.
Quando se refere a terapias da presente invenção, isto é, terapi- as referentes a um agonista de GPR119, os compostos de acordo com a invenção podem ser administrados em qualquer forma adequada. Vias de administração adequadas incluem administração oral, nasal, retal, transmu- cosal, transdérmica ou intestinal, distribuição parenteral, incluindo injeções intramusculares, intraperitoneais, intramedulares, bem como injeções intra- tecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intrapul- monar (inalada) ou intra-ocular usando métodos conhecidos na técnica. Ou- tras vias de administração adequadas são formulação em aerossol e depósi- to. Formulações com liberação sustentada, particularmente depósito, dos medicamentos inventados são expressamente consideradas. Em determina- das modalidades preferidas, os compostos de acordo com a presente inven- ção são administrados oralmente. Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser feitos em uma forma sólida ou líquida, tal como com- primidos, cápsulas, pós, xaropes, elixires e similares, aerossóis, soluções estéreis, suspensões ou emulsões e similares. Em determinadas modalida- des, o agonista de GPR119 é administrado oralmente. Formulações para administração oral podem estar na forma de soluções e suspensões aquosas, além de formulações em comprimido sóli- do e cápsula. As soluções e suspensões aquosas podem ser preparadas a partir de pós estéreis ou grânulos. Os compostos podem ser dissolvidos em água, polietileno glicol, propileno glicol, etanol, óleo de milho, óleo de se- mente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, álcool benzílico, cloreto de sódio e/ou vários tampões. Outros adjuvantes são bem e ampla- mente conhecidos na técnica.
Composições farmacêuticas do agonista de GPR119 podem ser preparadas através de métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigação, emulsificação, encapsulação, contenção, liofilização ou secagem por atomização.
Composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e au- xiliares os quais facilitam o processamento dos compostos ativos em prepa- rados os quais podem ser usados farmaceuticamente. Veículos farmaceuti- camente aceitáveis adequados estão disponíveis para aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Phar- macy, (Gennaro e outros , eds.), 20§ Edição, 2000, Lippincott Williams & Wil- kins; e Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe e outros , eds), 4ã E- dição, 2003, Pharmaceutical Press; a descrição de cada um dos quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade). A formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida. O termo material "veículo" ou material "excipiente" aqui significa qualquer substância, não em si um agente terapêutico, usada como um veículo e/ou diluente e/ou adjuvante ou veículo para a distribuição de um agente terapêutico a um indivíduo ou adicionado a uma composição farmacêutica para melhorar suas propriedades de manipu- lação ou armazenamento ou permitir ou facilitar a formação de uma unidade de dose da composição em um artigo distinto, tal como uma cápsula ou comprimido adequado para administração oral. Excipientes podem incluir, à guisa de ilustração e não limitação, diluentes, desintegrantes, agentes aglu- tinantes, adesivos, agentes de umedecimento, polímeros, lubrificantes, gli- dantes, substâncias adicionadas para disfarçar ou contra-atuar um sabor ou odor desagradável, flavorizantes, corantes, fragrâncias e substâncias adicio- nadas para melhorar a aparência da composição. Excipientes aceitáveis in- cluem ácido esteárico, estearato de magnésio, oxido de magnésio, sais de sódio e de cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, carbonato de magnésio, tal- co, gelatina, goma acácia, alginato de sódio, pectina, dextrina, manitol, sorbi- tol, lactose, sacarose, amidos, gelatina, materiais celulósicos, tais como és- teres de celulose de ácidos alcanóicos e alquil ésteres de celulose, manteiga ou pó de cacau, cera com baixo ponto de fusão, polímeros, tais como polivi- nilpirrolidona, álcool polivinílico e polietileno glicóis e outros materiais farma- ceuticamente aceitáveis. Os componentes da composição farmacêutica po- dem ser encapsulados ou transformados em comprimido para administração conveniente.
Farmaceuticamente aceitável se refere àquelas propriedades e/ou substâncias as quais são aceitáveis para o paciente do ponto de vista farmacológico/toxicológico e para o químico farmacêutico que fabrica do ponto de vista físico/químico com relação às composição, formulação, esta- bilidade, aceitação pelo paciente e biodisponibilidade.
Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequa- dos. Para essa finalidade, soluções de açúcar concentradas podem ser usa- das, as quais podem, opcionalmente, conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequadas. Matérias corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de com- primido ou drágea para identificação ou caracterizar diferentes combinações das doses de composto ativo.
Composições farmacêuticas as quais podem ser usadas oral- mente incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas vedadas moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sor- bitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativos em mistu- ra com um enchedor, tal como lactose, um aglutinante, tal como amido e/ou um lubrificante, tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvi- dos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, polietileno glicóis líquidos, cremophor, capmul, mono-, di- ou triglice- rídeos de cadeia média ou longa. Estabilizantes podem ser adicionados nes- sas formulações também.
Adicionalmente, um agonista de GPR119 pode ser distribuído usando um sistema com liberação sustentada. Vários materiais com libera- ção sustentada foram estabelecidos e são bem-conhecidos por aqueles ver- sados na técnica. Comprimidos ou cápsulas com liberação sustentada são particularmente preferidos. Por exemplo, um material de retardo com o tem- po, tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, pode ser empregado. A forma de dosagem pode também ser revestidas através de técnicas descritas nas Patentes U.S. Nos. 4.256.108, 4.166.452 e 4.265.874 para formar comprimidos terapêuticos osmóticos para liberação sustentada.
Considera-se expressamente que as terapias da presente inven- ção, isto é, terapias referentes a um agonista de GPR119, podem ser admi- nistradas ou fornecidas sozinhas ou em combinação com um ou mais de outros compostos fisiológica ou farmaceuticamente aceitável. Em um aspec- to da presente invenção, o outro composto fisiológica ou farmaceuticamente aceitável não é um agonista de GPR119. Em um aspecto da presente inven- ção, o outro composto fisiológica ou farmaceuticamente aceitável é um a- gente farmacêutico selecionado do grupo consistindo em cálcio, vitamina D, estrogênio, tibolona, um modulador seletivo do receptor de estrogênio (SERM; por exemplo, raloxifeno, tamoxifeno), bifosfonato (por exemplo, eti- dronato, alendronato, risedronato), calcitonina, metabólito 1a-hidroxilado de vitamina D, fluoreto, tiazida, esteróide anabólico, ipriflavona, vitamina K, hormônio da paratireóide (PTH), estrôncio, estatina, osteoprotererina, ago- nista seletivo do receptor EP4, agonista seletivo do receptor de canabinóide do tipo 2 (CB2) e inibidor de quínase MAP p38 (vide, por exemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).
Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quanti- dade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição farma- cêutica compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quantidade de um agonista de GPR119, de acordo com a presente invenção e pelo me- nos um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quanti- dade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição farma- cêutica compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção e pelo me- nos um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também se refere a uma forma de dosagem da composição ou da composição far- macêutica em que o agonista de GPR119 está em uma quantidade suficien- te para proporcionar um efeito no tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose e/ou para au- mentar a massa óssea em um indivíduo.
Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quanti- dade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção se caracteriza por uma composição farma- cêutica compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção e pelo me- nos um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também se refere a uma forma de dosagem da composição ou da composição far- macêutica em que o agonista de GPR119 é em uma quantidade suficiente para proporcionar um efeito em aumento do nível de GIP em um indivíduo.
Composições farmacêuticas adequadas para uso na presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade para obter sua finalidade pretendida. Em algumas mo- dalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é entendida como sendo útil para o tratamento ou prevenção de uma condição caracteri- zada por baixa massa óssea, tal como osteoporose ou para aumentar a massa óssea em um indivíduo. Condições caracterizadas por baixa massa óssea são de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é entendida como sen- do útil para aumento do nível de GIP em um indivíduo. Quando se refere à presente invenção, determinação da quantidade de um agonista de GPR119 suficiente para obter uma finalidade pretendida de acordo com a invenção está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica, especialmen- te à luz da descrição detalhada fornecida aqui.
Os dados obtidos de estudos com animais incluindo, mas não limitado a, estudos usando camundongos, ratos, coelhos, porcos e primatas não-humanos, podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. Em geral, aqueles versados na técnica com- preenderão como extrapolar dados ex vivo obtidos em um sistema modelo com animais para outro, tal como um ser humano. Em algumas circunstân- cias, essas extrapolações podem ser meramente baseadas no peso do mo- delo animal em comparação com outro, tal como um ser humano; em outras circunstâncias, essas extrapolações não são simplesmente baseadas nos pesos, mas antes, incorporam uma variedade de fatores. Fatores represen- tativos incluem o tipo, idade, peso, sexo, dieta e condição médica do pacien- te, a gravidade da doença, a via de administração, considerações farmaco- lógicas, tais como a atividade, eficácia, farmacocinética e perfis de toxicolo- gia do composto empregado em particular, se um sistema de distribuição de fármaco for utilizado, se um estado doentio crônico ou agudo estiver sendo tratado ou profilaxia for conduzida ou se outros compostos ativos forem ad- ministrados além dos compostos da presente invenção e como parte de uma combinação de fármaco. O regime de dosagem para tratamento de uma condição doentia com os compostos e/ou composições da presente inven- ção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores, conforme citado acima. Assim, o regime de dosagem real empregado pode variar amplamen- te e, portanto, pode se desviar de um regime de dosagem preferido e aque- les versados na técnica reconhecerão que a dosagem e um regime de dosa- gem fora dessas faixas típicas podem ser testados e, onde apropriado, po- dem ser usados nos métodos da presente invenção.
Um sistema modelo com animais exemplificativo é o modelo de perda óssea em rato ovariectomizado (OVX). O rato ovariectomizado é um modelo animal pré-clínico excelente que simula corretamente a característi- ca clínica importante do esqueleto humano privado de estrogênio e a respos- ta de agentes terapêuticos. Nesse modelo, uma eficácia terapêutica é obtida quando a perda óssea associada à ovariectomia é parcial ou complemente impedida (vide, por exemplo, Bollag e outros, Mol Cell Endocrinol (2001) 177: 35-41; e Jee e outros, J Musculoskel Neuron Interact (2001) 1: 193- 207.) Em determinadas modalidades, eficácia terapêutica é obtida quando a perda óssea associada à ovariectomia é pelo menos cerca de 10% impedi- da, pelo menos cerca de 20% impedida, pelo menos cerca de 30% impedi- da, pelo menos cerca de 40% impedida, pelo menos cerca de 50% impedi- da, pelo menos cerca de 60% impedida, pelo menos cerca de 70% impedi- da, pelo menos cerca de 75% impedida, pelo menos cerca de 80% impedi- da, pelo menos cerca de 85% impedida, pelo menos cerca de 90% impedi- da, pelo menos cerca de 95% impedida ou 100% impedida.
Um sistema modelo com animal exemplificativo adicional é au- mento do nível de GIP no sangue após estimulação com glicose em camun- dongos. Em determinadas modalidades, o nível de GIP no sangue é um ní- vel plasmático de GIP. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é um nível de GIP glicose-independente. Em determinadas modalidades, o nível de GIP é um nível de GIP glicose-dependente. Em determinadas modalida- des, o GIP é GIP total. Em determinadas modalidades, o GIP total é medido usando um ensaio central ou C-terminalmente dirigido. Em determinadas modalidades, o GIP é GIP bioativo. Em determinadas modalidades, o GIP bioativo é medido usando um ensaio N-terminal-específico. Em determina- das modalidades, o GIP bioativo tem atividade para promover a formação óssea. Em determinadas modalidades, a eficácia terapêutica é obtida quan- do o nível de GIP no sangue é aumentado em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou pelo menos cerca de 500%.
A quantidade de dosagem e intervalo podem ser ajustados de forma a proporcionar um efeito terapêutico pretendido. Será apreciado que a dosagem exata de um agonista de GPR119 de acordo com a presente in- venção variará, dependendo do agonista de GPR119, sua potência, o modo de administração, a idade e peso do paciente e a gravidade da condição a ser tratada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico em vista da condição do paciente. À guisa de ilustra- ção e não limitação, uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção é menos do que cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,005 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 1 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 5 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 10 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 50 mg/kg de peso corporal ou menos do que cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Em determinadas modalidades, uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção é menos do que cerca de 0,001-100 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-50 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-10 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-5 mg/kg de peso corporal, menos do que cer- ca de 0,001-1 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001 a 0,5 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-0,1 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-0,05 mg/kg de peso corporal, menos do que cerca de 0,001-0,01 mg/kg de peso corporal ou menos do que cerca de 0,001-0,005 mg/kg de peso corporal.
Uma faixa de dosagem preferida para a quantidade de um mo- dulador da invenção (por exemplo, um agonista de GPR119) o qual pode ser administrado em uma base diária ou regular para obter os resultados dese- jados é 0,1-100 mg/kg de massa corporal. Outra faixa de dosagem preferida é 0,1-30 mg/kg de massa corporal. Outra faixa de dosagem preferida é 0,1- 10 mg/kg de massa corporal. Outra faixa de dosagem preferida é 0,1-3,0 mg/kg de massa corporal. Naturalmente, essas dosagens diárias podem ser distribuídas ou administradas em pequenas quantidades periodicamente du- rante o curso de um dia. É notado que essas faixas de dosagem são apenas faixas preferidas e não se destinam a limitar a invenção.
A quantidade de dosagem e intervalo podem ser ajustados indi- vidualmente para proporcionar níveis no plasma de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção os quais obtêm um efeito terapêutico pretendido. Intervalos de dosagens podem também ser determinados usan- do o valor para uma faixa selecionada de concentração de agonista de G- PR119, de modo a obter o efeito terapêutico pretendido. Um agonista de GPR119 deverá ser administrado usando um regime que mantém os níveis no plasma dentro da faixa selecionada de concentração de agonista de G- PR119 durante 10-90% do tempo, de preferência entre 30-99% do tempo e, mais preferivelmente, entre 50-90% do tempo. Nos casos de administração local ou captação seletiva, a faixa de concentração de agonista de GPR119 que proporciona o efeito terapêutico pretendido pode não estar relacionada à concentração no plasma.
A quantidade de composição administrada, naturalmente, será dependente do indivíduo que está sendo tratado, do peso do indivíduo, da gravidade da enfermidade, da maneira de administração e do julgamento do médico que faz a prescrição.
Em um aspecto, a presente invenção, conseqüentemente, se caracteriza por um método de tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose ou para aumen- tar a massa óssea compreendendo administração, a um indivíduo que preci- sa do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi- ção compreendendo ou consistindo essencialmente em uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Em determi- nadas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica.
Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose ou para aumentar a massa óssea compreen- dendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo ou con- sistindo essencialmente em uma quantidade de um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Em um aspecto relacionado, a presente invenção se caracteriza pelo referido método, em que o agonista de GPR119 é administrado em uma quantidade suficiente para proporcionar um efeito no aumento do nível de GIP no indivíduo. Em determinadas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica.
Terapias da presente invenção, isto é, terapias referentes a um agonista de GPR119, são úteis no tratamento ou prevenção de uma condi- ção caracterizada por baixa massa óssea em um indivíduo e para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
Condições caracterizadas por baixa massa óssea incluem, mas não estão limitadas a, osteopenia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoar- trite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática na infância, doença de Paget, perda óssea em virtude de câncer metastático, lesões osteolíticas, curvatura da espinha e perda de altura. Em determinadas modalidades, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose. Em determinadas modalidades, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose. Em determinadas mo- dalidades, osteoporose é osteoporose primária. Em determinadas modalida- des, osteoporose é osteoporose secundária. Condições caracterizadas por baixa massa óssea também incluem, mas não estão limitadas a, complica- ções a longo prazo de osteoporose, tais como curvatura da espinha, perda de altura e cirurgia protética. Deve ser entendido que condições caracteriza- das por baixa massa óssea podem ser incluídas em modalidades individu- almente ou em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose primária.
Em determinadas modalidades, o indivíduo que precisa de mas- sa óssea aumentada tem uma densidade óssea mineral (BMD) de mais de 1 (T-escore < -1), mais do que ou igual a 1,5 (T-escore < -1,5), mais do que ou igual a 2 (T-escore < -2) ou mais do que ou igual a 2,5 (T-escore < -2,5) des- vios-padrão abaixo da média de referência para um adulto jovem. Em de- terminadas modalidades, o indivíduo que precisa de massa óssea aumenta- da precisa de tratamento para fratura óssea. Em determinadas modalidades, o indivíduo que precisa de tratamento de uma fratura óssea tem fratura ós- sea traumática, uma fratura de osso a longo prazo ou uma fratura óssea os- teoporótica. Em determinadas modalidades, o indivíduo precisa de tratamen- to para uma doença óssea. Em determinadas modalidades, o indivíduo que precisa de tratamento para uma doença óssea tem osteopenia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática na infância, doença de Paget, perda óssea em virtude de câncer metastático, lesões osteolíticas, curvatura da espinha e perda de altura. Em determinadas modalidades, o indivíduo que precisa de tratamento para uma doença óssea tem osteoporo- se. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose primária. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose secundária. Distúr- bios ósseos destrutivos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, osteoporose, osteoartrite e lesões os- teolíticas, tais como aquelas causadas por doença neoplásica, radioterapia ou quimioterapia. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporo- se primária. Em determinadas modalidades, osteoporose é osteoporose se- cundária.
As terapias da presente invenção, isto é, terapias referentes a um agonista de GPR119, são adicionalmente úteis na intensificação de cica- trização óssea após reconstrução facial, reconstrução do maxilar, reconstru- ção mandibular, doença periodontal ou extração de dente, intensificação de extensão de ossos longos, intensificação de crescimento protético interno ou aumento da sinostose óssea em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um vertebrado. Em determinadas modalidades, o indivíduo que é um vertebrado é um peixe, um anfíbio, um réptil, um pássaro ou um mamífero. Em determinadas modalida- des, o indivíduo ou vertebrado é um mamífero. Em determinadas modalida- des, o indivíduo ou vertebrado que é um mamífero é um camundongo, um rato, um hâmster, um coelho, um porco, um cão, um cavalo, uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um mamífero não-humano, um primata não-humano ou um ser humano. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um ser huma- no. Em determinadas modalidades, o ser humano é uma mulher na pós- menopausa ou um homem acima da idade de 50 anos.
Sem outra elaboração, acredita-se que aqueles versados na técnica podem, usando a descrição precedentes, praticar a presente inven- ção até sua extensão mais completa. A descrição detalhada precedentes é fornecida para clareza de compreensão apenas e nenhuma limitação desne- cessária deverá ser depreendida da mesma, uma vez que modificações den- tro do escopo da invenção podem se tornar evidentes para aqueles versados na técnica.
EXEMPLOS
Sem outra elaboração, acredita-se que aqueles versados na técnica podem, usando a descrição precedente, praticar a presente invenção até sua extensão mais completa. Os exemplos detalhados a seguir devem ser construídos como meramente ilustrativos e não limitações da descrição precedente de qualquer maneira. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente variações apropriadas a partir dos procedimentos.
EXEMPLO 1: ANÁLISE FARMACODINÂMICA DE UM EFEITO DE ADMI- NISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE O NÍVEL DE GIP NO SANGUE EM CAMUNDONGOS DO TIPO SILVESTRE
A. Camundongos machos C57blk/6 foram submetidos a jejum durante 18 horas e aleatoriamente atribuídos a catorze grupos com η = 6 para cada grupo. Os camundongos foram administrados oralmente com veí- culo (PET; PEG400 a 80%, etanol a 10%, Tween80 a 10%) ou com um ago- nista de GPR119 de acordo com a presente invenção (Composto 1; (2-Flúor- 4-metano-sulfonil-fenH)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]- 5-nitro-pirimidin-4-il}-amina) a 20 mg/kg, conforme indicado na Figura 1A. Trinta minutos após tratamento, um bolo de glicose a 3 g/kg foi distribuído oralmente e o plasma foi coletado a 0 (sem bolo de glicose), 2, 5, 10, 20, 40 e 60 minutos após o bolo de glicose. Os níveis de GIP no plasma foram de- terminados usando um kit ELISA GIP para roedor adquirido da Linco Rese- arch Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Ca- tálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instruções fornecidas pelo fornece- dor. A partir dos resultados mostrados na Figura 1A, é evidente que a admi- nistração do agonista de GPR119 aumentou o nível de GIP glicose- dependente e glicose-independente no sangue dos camundongos. O Com- posto 1 estimulou o GIP total no plasma nos camundongos. O Composto 1 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380).
B. Camundongos machos C57blk/6 foram submetidos a jejum durante 18 horas e aleatoriamente atribuídos a catorze grupos com η = 6 para cada grupo. Os camundongos foram administrados oralmente com veí- culo (hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPCD) a 20%) ou com um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção (Composto 3) a 10 mg/kg, con- forme indicado na Figura 1B. Trinta minutos após tratamento, um bolo de glicose a 3 g/kg foi distribuído oralmente e o plasma foi coletado a 0 (sem bolo de glicose), 5, 10, 20, 60 e 120 minutos após o bolo de glicose. Os ní- veis de GIP no plasma foram determinados usando um kit ELISA GIP para roedor adquirido da Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instru- ções fornecidas pelo fornecedor. Análise estatística foi realizada usando o programa Excel. Os valores médio de concentração de GIP foram calculados baseado nos resultados com seis camundongos em cada grupo e mostrados como a média ± SEM. A partir dos resultados mostrados na Figura 1B, é e- vidente que a administração do agonista de GPR119 aumentou o nível de GIP glicose-dependente e glicose-independente no sangue dos camundon- gos. O Composto 3 estimulou o GIP total no plasma nos camundongos. O Composto 3 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Inter- nacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647).
C. Camundongos machos C57blk/6 foram submetidos a jejum durante 18 horas e aleatoriamente atribuídos a catorze grupos com η = 6 para cada grupo. Os camundongos foram administrados oralmente com veí- culo (hidroxipropil-(-ciclodextrina (HPCD) a 20%) ou com um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção (Composto 3) a 1, 3 ou 10 mg/kg. Trinta minutos após tratamento, um bolo de glicose a 3 g/kg foi distri- buído oralmente e o plasma foi coletado a 0 (sem bolo de glicose) ou 5 minu- tos após o bolo de glicose. Os níveis de GIP no plasma foram determinados usando um kit ELISA GIP para roedor adquirido da Linco Research Labora- tory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instruções fornecidas pelo fornecedor. Análise estatística foi realizada usando o programa Excel. Os valores médio de con- centração de GIP foram calculados baseado nos resultados com seis ca- mundongos em cada grupo e mostrados na Figura 1C. A partir da Figura 1C, é evidente que a administração do agonista de GPR119 (Composto 3) esti- mulou o GIP total no plasma nos camundongos de uma maneira dose- dependente. O Composto 3 é idêntico a um composto descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647).
EXEMPLO 2: EFEITO DE ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE O NÍVEL DE GIP NO SANGUE EM CAMUNDONGOS GPR119- DEFICIENTES (KNOCKOUT) COMPARADO COM CAMUNDONGOS DO TIPO SILVESTRE
A. Camundongos machos GPR119-deficientes e filhotes do tipo silvestre foram submetidos a jejum durante 18 horas. Os camundongos fo- ram administrados oralmente com veículo (PET; PEG400 a 80%, etanol a 10%, Tween80 a 10%) ou com um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção (Composto 1; (2-Flúor-4-metano-sulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina) a 20 mg/kg, conforme indicado (n = 5).Trinta minutos após tratamento, sangue (100 microlitros) foi coletado através da veia retro-orbital do olho (tempo 0), seguido por um bolo de glicose a 3 g/kg (oralmente). Cinco minutos após distribuição de glicose, outra amostra de sangue (100 microlitros) foi coleta- da (tempo de 5 minutos). O plasma foi coletado após centrifugação e os ní- 1veis de GIP foram determinados usando um kit ELISA GIP para roedor ad- quirido da Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypep- tide (Total) ELISA Catálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instruções for- necidas pelo fornecedor. A partir dos resultados mostrados na Figura 2A, é evidente que o receptor GPR119 funcional era necessário para que o ago- nista de GPR119 administrado aumentasse o nível de GIP glicose- independente e glicose-dependente no sangue dos camundongos. Compos- to 1 estimulou o GIP total no plasma em camundongos do tipo silvestre. Composto 1 é idêntico ao composto descrito no Pedido de Patente Interna- cional No. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380).
B. Camundongos machos GPR119-deficientes e filhotes do tipo silvestre foram submetidos a jejum durante 18 horas. Os camundongos fo- ram administrados oralmente com veículo (hidroxipropil-(-ciclodextrina (HPDC) a 40%) ou com um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção (Composto 2) a 30 mg/kg, conforme indicado (n = 5).Trinta minutos após tratamento, sangue (100 microlitros) foi coletado através da veia retro- orbital do olho (tempo 0), seguido por um bolo de glicose a 3 g/kg (oralmen- te). Cinco minutos após distribuição de glicose, outra amostra de sangue (100 microlitros) foi coletada (tempo de 5 minutos). O plasma foi coletado após centrifugação e os níveis de GIP foram determinados usando um kit ELISA GIP para roedor adquirido da Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instruções fornecidas pelo fornecedor. Os valores médios de concentração de GIP foram calculados baseado nos resultados com cinco camundongos em cada grupo. A partir dos resultados mostrados na Figura 2B, é evidente que o receptor GPR119 funcional era necessário para que o agonista de GPR119 administrado aumentasse o nível de GIP glicose- independente e glicose-dependente no sangue dos camundongos. Compos- to 2 estimulou o GIP total no plasma em camundongos do tipo silvestre. Composto 2 é idêntico ao composto descrito no Pedido de Patente Interna- cional No. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658).
EXEMPLO 3: EFEITO DE ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE A MASSA ÓSSEA EM RATOS OVARIECTOMIZADOS
Um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção pode ser mostrado como sendo eficaz no tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose e/ou para aumentar a massa óssea em um indivíduo usando o modelo com rato ovariectomizado in vivo (OVX) descrito abaixo (vide, por exemplo, Bollag e outros, Mol Cell Endocrinol (2001) 177: 35-41).
Vinte ratos Sprague-Dawley virgens OVX e 20 virgens não-OVX (150-175 g), com idade de 8 semanas, são adquiridos da Harlan Sprague- Dawley, Inc. (Indianápolis, IN). Os animais são alimentados ad Iibitum com uma dieta em pelota comercial normal, dieta Teklab Rodent (1,46% de cál- cio), com acesso livre à água. Os ratos são aleatoriamente divididos em qua- tro grupos experimentais combinados por peso e selecionados para receber veículo oralmente ou um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção. Tratamento é continuado em uma base diária durante 6 semanas.
1. Controle. Dez ratos não-OVX são administrados oralmente com veículo.
2. Controle + tratamento. Dez ratos não-OVX são administrados oralmente com agonista de GPR119.
3. OVX. Dez ratos OVX são administrados com veículo oralmente.
4. OVX + tratamento. Dez ratos OVX são administrados oral- mente com agonista de GPR119.
Os ratos são pesados diariamente e o comprimento medido na linha de base e novamente a 6 semanas. Absormetria por raios-X com ener- gia dupla (DXA) usando a Hologic QDR 1000/W (Waltham, MA) é realizada em todos os animais antes de início de tratamento e a 6 semanas e os da- dos são analisados usando o software Rat Whole Body versão 5.53. A den- sidade mineral óssea (BMD) é determinada na espinha.
A alteração percentual na densidade óssea vertebral após 6 se- manas de tratamento é determinada. É mostrado que a administração de um agonista de GPR119 atenua os efeitos negativos de ovariectomia sobre a densidade óssea mineral. Atenuação dos efeitos negativos de ovariectomia sobre a densidade óssea vertebral é indicativa do tratamento tendo eficácia no tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa mas- sa óssea, tal como osteoporose e/ou para aumentar a massa óssea em um indivíduo.
EXEMPLO 4: EFEITO DE ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE A CICATRIZACÃO DE FRATURA ÓSSEA
Um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção pode mostrar ser eficaz no tratamento de fratura óssea usando o ensaio in vivo descrito abaixo.
Técnica de Fratura
Ratos Sprague-Dawley a 3 meses de idade são anestesiados com Cetamina. Uma incisão de 1 cm é feita sobre o aspecto anteromediano da parte proximal da tíbia ou fêmur direito. O seguinte descreve a técnica cirúrgica tibial. A incisão é realizada através do osso e um furo de 1 mm é perfurado 4 mm proximal ao aspecto distai da tuberosidade tibial 2 mm me- diana ao sulco anterior. Aperto com parafusos intramedular é realizado com um tubo de aço inoxidável de 0,8 mm (carga máxima de 36,3 N, rigidez má- xima de 61,8 N/mm, testado sob as mesmas condições que os ossos). Ne- nhum aumento adicional do furo existente do canal medular é realizado. Uma fratura fechada padronizada é produzida 2 mm acima da junção tíbio- fibular através de uma curvatura de três pontos usando um fórceps ajustável especialmente projetado com dentes cegos. Para minimizar dano ao tecido mole, cuidado é tomado para não deslocar a fratura. A pele é fechada com suturas de náilon em monofilamento. A operação é realizada sob condições estéreis. Radiografias de todas as fraturas são tomadas imediatamente após aperto com parafusos e os ratos com fraturas foram da área de diafiseal es- pecificada ou com parafusos deslocados são excluídos. Os animais restan- tes são divididos aleatoriamente aos seguintes grupos, com 10-12 animais por cada subgrupo por ponto de tempo para testagem da cicatrização de fratura. Os ratos são administrados em uma base diária com veículo oral- mente ou com um agonista de GPR119. O agonista de GPR119 é usado em uma quantidade entre 0,001 mg/kg de peso corporal e 100 mg/kg de peso corporal. O tratamento é continuado durante 10, 20, 40 e 80 dias.
A 10, 20, 40 e 80 dias, 10-12 ratos de cada grupo são anestesi- ados com Cetamina e sacrificados através de flebotomia. Ambos os ossos tíbio-fibulares são removidos através de dissecção e todo o tecido mole é retirado. Ossos de 5-6 ratos para cada grupo são armazenados em etanol a 70% para análise histológica e ossos de outros 5-6 ratos para cada grupo são armazenados em uma solução de Ringer tamponada (+ 4 °C, pH de 7,4) para radiografias e testagem biomecânica, a qual é realizada.
Análise Histológica
Os métodos para análise histológica do osso fraturado foram anteriormente publicados por Mosekilde e Bak (Bone (1993) 14: 19-27). Re- sumidamente, o local da fratura é serrado 8 mm de cada lado da linha de fratura, incrustado não-descalcificado em metacrilato de metila e cortado em seções frontais sobre um micrótomo Reichert-Jung Polycut em uma espes- sura de 8 um. Seções medianas-frontais coradas com Masson-Trichome (incluindo a tíbia e a fíbula) são usadas para visualização da resposta celular e tecidual à cicatrização da fratura com e sem tratamento. Seções coradas de vermelho Sírio são usadas para demonstrar as características da estrutu- ra do calo ósseo e diferenciar entre osso poroso e osso lamelar no local da fratura. As seguintes medições são realizadas: (1) vão da fratura - medido como a distância mais curta entre as extremidades ósseas corticais na fratu- ra, (2) comprimento do calo ósseo e diâmetro do calo ósseo, (3) área volu- métrica total de osso do calo ósseo, (4) tecido ósseo por área tecidual dentro da área do calo ósseo, (5) tecido fibroso no calo ósseo e (6) área de cartila- gem no calo ósseo.
Análise biomecânica
Os métodos para análise biomecânica foram anteriormente pu- blicados por Bak e Andreassen (Calcif Tissue Int (1989) 45: 292-297). Re- sumidamente, radiografias de todas as fraturas são tomadas antes do teste biomecânico. As propriedades mecânicas das fraturas em cicatrização são analisadas através de um procedimento de curvatura com três ou quatro pontos destrutiva. A carga máxima, rigidez, energia em carga máxima, defle- xão em carga máxima e tensão máxima são determinados.
EXEMPLO 5: CLONAGEM DE COMPRIMENTO TOTAL DE GPR119 HU- MANO ENDÓGENO
Polinucleotídeo que codifica o GPR119 humano endógeno foi clonado através de PCR usando os iniciadores GPR119-específicos 5'- GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3' (SEQ ID NO: 3; senso, ATG como có- don iniciai) Si-Gaaacttctctgcccttaccgtc-S' (seq id no: 4; anti- sentido, 3' do códon terminal) e DNA genômico humano como modelo. DNA polimerase TaqPIus Precision™ (Stratagene) foi usada para amplificação através do seguinte ciclo, com a etapa 2 à etapa 4 repetidas 35 vezes: 94°C, 3 minutos; 94°C, 1 minuto; 58°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos; 72°C, 10 minu- tos. Um fragmento de PCR de 1,0 Kb de tamanho previsto foi isolado e clo- nado no vetor pCRIl-TOPO™ (Invitrogen) e completamente seqüenciado usando o kit de seqüenciamento com DNA T7 (Amersham). Vide SEQ ID NO: 1 para seqüência de ácido nucléico e SEQ ID NO: 2 para a seqüência de aminoácido deduzida.
EXEMPLO 6: EXPRESSÃO DE RECEPTOR
Embora uma variedade de células estejam disponíveis na técni- ca para a expressão de receptores acoplados à proteína G, é mais preferido que células eucariotas sejam utilizadas. Em determinadas modalidades, cé- lulas de mamífero ou melanoforos são utilizados. Os seguintes são ilustrati- vos; aqueles versados na técnica estão creditados com a capacidade de de- terminar aquelas técnicas que são preferencialmente benéficas para as ne- cessidades do técnico. Vide, por exemplo, Exemplo 9, infra, uma vez que ele se refere a melanoforos. a. Transfecção transitória
No dia um, disco de 6x 106/10 cm de células 293 são colocados em lâminas. No dia dois, dois tubos de reação são preparados (as propor- ções a seguir para cada tubo são por lâmina): o tubo A é preparado através de mistura de 4 μg de DNA (por exemplo, vetor pCMV, vetor pCMV com cDNA de receptor, etc.) em 0,5 ml de soro isento de DMEM (Gibco BRL); o tubo B é preparado através de mistura de 24 ml de Iipofectamina (Gibco BRL) em 0,5 ml de soro isento de DMEM. Os tubos A e B são misturados através de inversões (várias vezes), seguido por incubação em temperatura ambiente durante 30-45 min. A mistura é referida como a "mistura de trans- fecção". Células 293 colocadas em lâminas são lavadas com 1XPBS, segui- das pela adição de 5 ml de soro isento de DMEM. 1 ml da mistura de trans- fecção é adicionado às células, seguido por incubação durante 4 horas a 37°C/5% de CO2. A mistura de transfecção é removida através de aspiração, seguido pela adição de 10 ml de DMEM/Soro Fetal Bovino a 10%. As células são incubadas a 37°C/5% de CO2. Após 48 horas, as células são coletadas e utilizadas para análise.
b. Linhagens de célula estáveis
Aproximadamente 12 χ 106 células 293 são colocadas sobre uma lâmina de cultura tecidual de 15 cm e crescidas em Meio DME de Alta Glicose contendo soro fetal bovino a dez por cento e piruvato de sódio a um por cento, L-glutamina e antibióticos. Vinte e quatro horas após colocação em lâminas das células 293 (ou até -80% de confluência), as células são transfectadas usando 12 μg de DNA (por exemplo, vetor pCMV-neor com cDNA de receptor). 12 μg de DNA são combinados com 60 μΙ de Iipofecta- mina e 2 ml de Meio DME High Glucose sem soro. O meio é aspirado das lâminas e as células são lavadas uma vez com meio sem soro. O DNA, Iipo- fectamina e mistura de meio são adicionados à lâmina, junto com 10 ml de meio sem soro. Após incubação a 37°C durante quatro a cinco horas, o meio é aspirado e 25 ml de meio contendo soro são adicionados. Vinte e quatro horas após transfecção, o meio é aspirado novamente e meio fresco sem soro é adicionado. Quarenta e oito horas após transfecção, o meio é aspirado e meio sem soro é adicionado contendo geneticina (fármaco G418) em uma concentração final de aproximadamente 12 X 106 células 293 são colocadas sobre uma lâmina de cultura tecidual de 15cm. Crescidas em meio DME de Alta Glicose contendo soro fetal bovino a dez por cento e piru- vato de sódio a um por cento, L-glutamina e antibióticos. Vinte e quatro ho- ras após colocação em lâminas das células 293 (ou até ~80% de confluên- cia), as células são transfectadas usando 12 μ9 de DNA (por exemplo, vetor pCMV com cDNA de receptor). 12 μ9 de DNA são combinados com 60 μl de lipofectamina e 2 mL de Meio DME de Alta Glicose sem soro. O meio é aspi- rado das lâminas e as células são lavadas uma vez com meio sem soro. O DNA, lipofectamina e mistura de meio são adicionados à lâmina, junto com 10 mL de meio sem soro. Após incubação a 37°C durante quatro a cinco horas, o meio é aspirado e 25 ml de meio contendo soro são adicionados. Vinte e quatro horas após transfecção, o meio é aspirado novamente e meio fresco sem soro é adicionado. Quarenta e oito horas após transfecção, o meio é aspirado e meio sem soro é adicionado contendo geneticina (fármaco G418) em uma concentração final de 500 μg/ml. As células transfectadas agora sofrem seleção para células positivamente transfectadas contendo o gene de resistência à G418. O meio é substituído de cada quatro a cinco dias à medida que seleção ocorre. Durante seleção, as células são crescidas para criar reservatórios estáveis ou divididos para seleção clonal estável.
EXEMPLO 7: ENSAIO PARA SELEÇÃO DE COMPOSTOS CANDIDATOS COMO AGONISTAS DE GPR119
Uma variedade de abordagens estão disponíveis para seleção de compostos candidatos, por exemplo, como agonistas de GPR119. As se- guintes são ilustrativas; aqueles versados na técnica estão creditados com a capacidade de determinar aquelas técnicas que são preferencialmente bené-
1. Ensaios de ligação à membrana: ensaio com [35S]GTPyS
Quando um receptor acoplado à proteína G está em seu estado ativado, quer como um resultado de ligação a ligante ou ativação constituti- va, o receptor se acopla a uma proteína G e estimula a liberação de GDP e subseqüente ligação de GTP a uma proteína G. A subunidade alfa de um complexo de proteína G-receptor atua como uma GTPase e lentamente hi- drolisa a GTP em GDP1 ponto no qual o receptor normalmente é desativado.
Receptores ativados continuam a trocar GDP por GTP. O análogo de GTP não hidrolisável, [35S]GTPyS, pode ser utilizado para demonstrar ligação in- tensificada de [35SJGTPyS a uma membrana que expressa receptores ativa- dos. A vantagem de usar ligação de [35S]GTPyS para medir a ativação é que: (a) ele é genericamente aplicável a todos os receptores acoplados à proteína G; (b) ele está proximal à superfície da membrana, tornando-o me- nos provável de captar moléculas as quais afetam a cascata intracelular.
O ensaio utiliza a capacidade de receptores acoplados à proteí- na G de estimular a ligação de [35SJGTPyS a uma membrana expressando os receptores relevantes. O ensaio é genérico e tem aplicação à descoberta de fármacos em todos os receptores acoplados à proteína G.
Preparação de membrana
Em algumas modalidades, membranas compreendendo um re- ceptor acoplado à proteína G da invenção e para uso na identificação de compostos candidatos, por exemplo, como agonistas do receptor são, de preferência, preparadas como segue:
a. Materiais
"Tampão de Raspagem de Membrana" é compreendido de HE- PES a 20 mM e EDTA a 10 mM, pH de 7,4; "Tampão de Lavagem de Mem- brana" é compreendido de HEPES a 20 mM e EDTA a 0,1 mM, pH de 7,4; "Tampão de Ligação" é compreendido de HEPES a 20 mM, NaCI a 100 mM e MgCI2 a 10 mM, pH de 7,4.
b. Procedimento
Todos os materiais deverão ser mantidos sobre gelo por todo o procedimento. Primeiramente, os meios serão aspirados de uma monoca- mada confluente de células, seguido por enxágüe com 10 ml de PBS gelado, seguido por aspiração. Após o que, 5 ml de tampão de raspagem de mem- brana serão adicionados para raspar as células; isso será seguido por trans- ferência do extrato celular para tubos para centrífuga de 50 ml (centrifugado a 20.000 rpm durante 17 minutos a 4°C). Após o que, o sobrenadante será aspirado e o pélete será ressuspensa em 30 ml de tampão de lavagem de membrana, seguido por centrifugação a 20.000 rpm durante 17 minutos a 4°C. O sobrenadante, então, será aspirado e a pelota ressuspensa em tam- pão de ligação. Essa, então, será homogeneizada usando um homogenei- zador Brinkman Polytron® (ciclos de 15-20 segundos até que todo o material esteja em suspensão). Essa é referida aqui como "proteína de membrana".
Ensaio de proteína de Bradford
Após a homogeneização, a concentração de proteína das mem- branas será determinada usando o ensaio de proteína de Bradford (proteína pode ser diluída para cerca de 1,5 mg/ml, transformada em alíquotas e con- gelada (-80°C) para uso posterior); quando congelada, o protocolo para uso será como segue: no dia do ensaio, proteína de membrana congelada é descongelada em temperatura ambiente, seguido por turbilhonamento e, então, homogeneizada com um Polytron a cerca de 12 χ 1.000 rpm durante cerca de 5-10 segundos; é notado que, para múltiplas preparações, o homo- geneizador deverá ser totalmente limpo entre a homogeneização de diferen- tes preparações.
a. Materiais
Tampão de ligação (conforme acima); Reagente Bradford Dye; Padrão de Proteína Bradford serão utilizados, seguindo as instruções do fa- bricante (Biorad, cat. no. 500-0006).
b. Procedimento
Tubos em duplicata serão preparados, um incluindo a membrana e um como um "branco" de controle, cada um continha 80 μΙ de tampão de ligação. Após o que, 10 μΙ de Padrão de Proteína de Bradford (1 mg/ml) se- rão adicionados a cada tubo e 10 μΙ de proteína de membrana serão, então, adicionados para ajustar um tubo (não-branco). Após o que, 200 μΙ de Rea- gente Bradford Dye serão adicionados a cada tubo, seguido por turbilhona- mento de cada um. Após cinco (5) minutos, os tubos serão submetidos a returbilhonamento e o material no mesmo será transferido para cadinhos. Os cadinhos, então, serão lidos usando um espectrofotômetro CECIL 3041, em um comprimento de onda de 595.
Ensaio de Identificação
a. Materiais
Tampão de GDP consiste em 37,5 ml de tampão de ligação e 2 mg de GDP (Sigma, cat. no. G-7127), seguido por uma série de diluições em tampão de ligação para obter GDP a 0,2 μΜ (concentração final de GDP em cada cavidade era de GDP a 0,1 μΜ); cada cavidade compreendendo um composto candidato, tem um volume final de 200 μΙ consistindo em 100 μΙ de tampão de GDP (concentração final, GDP a 0,1 μΜ), 50 μl de proteína de membrana em tampão de ligação e 50 μl de [35S]GTPyS (0,6 nM) em tam- pão de ligação (2,5 μl de [35S]GTPyS por 10 ml de tampão de ligação).
b. Procedimento
Compostos candidatos serão, de preferência, selecionados u- sando um formato de lâmina com 96 cavidades (essas podem ser congela- das a -80 °C). Proteína de membrana (ou membranas com vetor de expres- são, excluindo o GPCR alvo, como controle) será homogeneizada rapida- mente até em suspensão. A concentração de proteína, então, será determi- nada usando o Ensaio de Proteína de Bradford apresentado acima. Proteína de membrana (e controle) serão, então, diluídos para 0,25 mg/ml em tampão de ligação (concentração final do ensaio, 12,5 μl/cavidade). Após o que, 100 μl de tampão de GDP foram adicionados a cada cavidade de uma Wallac Scintistrip® (Wallac). Uma pipeta de 5 μl será, então, usada para transferir 5 μl de um composto candidato para tal cavidade (isto é, 5 μl em um volume total de ensaio de 200 μl é uma proporção de 1:40, de modo que a concen- tração final de seleção do composto candidato seja de 10 μΜ). Novamente, para evitar contaminação, após cada etapa de transferência, a pipeta deverá ser enxaguada em três reservatórios compreendendo água (1X), etanol (1X) e água (2X) - líquido em excesso deverá ser agitado da pipeta após cada enxágüe e seco com toalhas e lenços de papel. Após o que, 50 μl de proteí- na de membrana serão adicionados a cada cavidade (uma cavidade de con- trole compreendendo membranas sem o GPCR alvo foi também utilizada) e pré-incubada durante 5-10 minutos em temperatura ambiente. Após o que, 50 μl de [35SJGTPyS (0,6 nM) em tampão de ligação serão adicionados a cada cavidade, seguido por incubação sobre um agitador durante 60 minutos em temperatura ambiente (novamente, nesse exemplo, as lâminas foram cobertas com uma folha). O ensaio será, então, terminado através de centri- fugação das lâminas a 4000 RPM durante 15 minutos a 22°C. As lâminas, então, serão aspiradas com uma derivação de 8 canais e vedadas com Ia- mínulas. As lâminas, então, serão lidas em um Wallac 1450 usando o ajuste "Prot. N0 37" (conforme as instruções do fabricante);
2. Ensaio de adenilil ciclase
Um kit Fiash Plate® Adenylyl Cyclase (New England Nuclear; Cat. No. SMP004A) projetado para ensaios baseados em célula pode ser modificado para uso com membranas plasmáticas brutas. As cavidades Fla- sh Plate podem conter um revestimento cintilante o qual também contém um anticorpo específico que reconhece cAMP. O cAMP gerado nas cavidades pode ser quantificado através de uma competição direta pela ligação de ras- treador cAMP radioativo ao anticorpo de cAMP. O seguinte serve como um rápido protocolo para a medição de alterações nos níveis de cAMP em célu- las que expressam os receptores.
Em determinadas modalidades, um kit Flash Plate® Adenylyl Cy- clase (New England Nuclear; Cat. No. SMP004A) modificado é utilizado para identificação de compostos candidatos, por exemplo, como agonistas de GPR119 de acordo com o protocolo a seguir.
Células transfectadas com um receptor acoplado à proteína G da invenção são coletadas aproximadamente três dias após transfecção. As membranas são preparadas através de homogeneização de células suspen- sas em tampão contendo HEPES a 20 mM, pH de 7,4 e MgCI2 a 10 mM. Homogeneização é realizada sobre gelo usando um Brinkman Polytron® du- rante aproximadamente 10 segundos. O homogenato resultante é centrifu- gado a 49.000 X g durante 15 minutos a 4°C. O pélete resultante é, então, ressuspenso em tampão contendo HEPES a 20 mM, pH de 7,4 e EDTA a 0,1 mM, homogeneizado durante 10 segundos, seguido por centrifugação a 49.000 X g durante 15 minutos a 4°C. O pélete resultante é, então, armaze- nado a -80 0C até utilizado. No dia de seleção para identificação direta, o pélete de membrana é lentamente descongelada em temperatura ambiente, ressuspensa em tampão contendo HEPES a 20 mM, pH de 7,4 e MgCI2 a 10 mM, para proporcionar uma concentração final de proteína de 0,60 mg/ml (as membranas ressuspensas são colocadas sobre gelo até uso).
Padrões de cAMP e tampão de detecção (compreendendo 2 μCi de rastreador ([125l]cAMP (100 μl) a 11 ml de tampão de detecção)) são pre- parados e mantidos de acordo com as instruções do fabricante. Tampão de ensaio foi preparado fresco para seleção e continha HEPES a 20 mM, pH de 7,4, MgCI2 a 10 mM, fosfocreatina a 20 mM (Sigma), 0,1 unidade/ml de fos- foquinase de creatina (Sigma), GTP a 50 μΜ (Sigma) e ATP a 0,2 mM (Sig- ma); tampão de ensaio foi, então, armazenado sobre gelo até utilizado.
Compostos candidatos são adicionados, de preferência, por e- xemplo, à lâminas com 96 cavidades (2 μl/cavidade; concentração final do ensaio de 12 μΜ), junto com 40 μl de proteína de membrana (30 μg/cavidade) e 50 μl de tampão de ensaio. Essa mistura foi, então, incubada durante 30 minutos em temperatura ambiente, com ligeira agitação.
Após incubação, 100 μl de tampão de detecção são adicionados a cada cavidade, seguido por incubação durante 2-24 horas. As lâminas são, então, contadas em um leitor para lâmina Wallac MicroBeta® usando "Prot. N0 31" (conforme as instruções do fabricante).
3. Ensaio-repórter de CRE-Luc
Células 293 e 293T são colocadas sobre lâminas com 96 cavi- dades em uma densidade de 2 χ 104 células por cavidade e transfectadas usando Lipofectamina Reagent (BRL) no dia seguinte de acordo com as ins- truções do fabricante. Uma mistura de DNA/lipídio é preparada para cada transfecção de 6 cavidades, como segue: 260 ng de DNA de plasmídeo em 100 μl de DMEM são gentilmente misturados com 2 μl de lipídio em 100 μl de DMEM (260 ng de DNA de plasmídeo consistem de 200 ng de plasmí- deo-repórter 8xCRE-Luc, 50 ng de pCMV compreendendo um receptor aco- plado à proteína G da invenção ou pCMV apenas e 10 ng de um plasmídeo de expressão de GPRS (GPRS em pcDNA3 (Invitrogen)). O plasmídeo- repórter 8xCRE-Luc foi preparado como segue: vetor SRIF-p-gal foi obtido através de clonagem do promotor de somatostatina de rato (-71/+51) no sítio BgIV-HindIII no pPgal-Basic Vector (Clontech). Oito (8) cópias do elemento de resposta a cAMP foram obtidas através de PCR a partir de um modelo de adenovírus AdpCF126CCRE8 [vide Suzuki e outros , Hum Gene Ther (1996) 7: 1883-1893; a descrição do qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade] e clonado no vetor SRIF-P-gal no sítio Kpn-BgIV1 resultando no vetor-repórter 8xCRE-P-gal. O plasmídeo-repórter 8xCRE-Luc foi gerado substituindo o gene de beta-galactosidase no vetor-repórter 8xCRE-P-gal pelo gene de Iuciferase obtido do vetor pGL3-básico (Promega) no sítio Hin- dlll-BamHI. Após 30 min de incubação em temperatura ambiente, a mistura de DNA/lipídio é diluída com 400 μl de DMEM e 100 μl da mistura diluída são adicionados a cada cavidade. 100 μl de DMEM com FCS a 10% são adicionados a cada cavidade após uma incubação de 4 horas em uma incu- badora de cultura de células. No dia seguinte, as células transfectadas são trocadas com 200 μl/cavidade de DMEM com FCS a 10%. Oito (8) horas depois, as cavidades são trocadas para 100 μl/cavidade de DMEM sem vermelho fenol, após uma lavagem com PBS. A atividade de luciferase é medida no dia seguinte usando o kit de ensaio de gene repórter LucLite® (Packard) seguindo as instruções de fabricante e lida sobre um contador de cintilação e luminescência 1450 MicroBeta® (Wallac).
EXEMPLO 8: ENSAIO DE ADENILIL CICLASE COM CÉLULAS INTEIRAS PARA. POR EXEMPLO. ATIVIDADE AGONISTA DE GPR119
Medições de AMP cíclico são feitas com um kit Flash Plate® A- denylyl Cyclase (New England Nuclear) de acordo com o protocolo do forne- cedor. Células HEK293 são colocadas em um disco de cultura tecidual de 15 cm a 12 x 106 células por disco em meio de crescimento regular (DMEM/FBS a 10%). No dia seguinte, 10 μl de DNA de vetor vazio ou DNA de plasmídeo de expressão são transfectados nas células com lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas em cultura, as células transfectadas são coletadas em um tampão de dissociação de células GIBCO (Cat N0 13151-014), transformadas em pelota através de centrifugação durante 5 minutos a 1.100 rpm e cuidadosamente ressuspensas em um volume apropriado de tampão de ensaio (1xPBS a 50% e tampão de estimulação a 50%) para proporcionar uma contagem final de células a 2 χ 106 células/ml. Compostos de teste são preparados em 50 μl de tampão de ensaio na concentração de ensaio desejada onde indicado e pipeteados nas cavidades da Flash Plate com 96 cavidades. A suspensão de células preparada acima foi, então, adicionada (50 μl por cavidade). Após um tempo de incubação de 60 minutos em temperatura ambiente, 100 μl de mistura de detecção contendo rastreador [125I] -cAMP são, então, adiciona- dos às cavidades. As lâminas são incubadas durante mais 2 horas, seguido por contagem em um contador de cintilação Wallac MicroBeta. Os valores de cAMP/cavidade são extrapolados a partir de uma curva padrão de cAMP a qual é incluída em cada lâmina de ensaio.
Um aumento no nível de cAMP em células HEK293 transfecta- das com GPR119 com relação à células HEK293 transfectadas com vetor vazio é indicativo de um composto de teste sendo um composto que estimu- la funcionalidade do receptor GPR119.
EXEMPLO 9: ENSAIO COM MELANOFORO PARA, POR EXEMPLO. ATI- VIDADE AGONISTA DE GPR119
Melanoforos são mantidos em cultura conforme reportado por Potenza e outros [Pigment Cell Research (1992) 5: 372-378] e transfectados com um vetor de expressão que codifica um receptor GPR119 (GPR119; por exemplo, GPR119 humano, Acesso ao GenBank® No. AAP72125 e alelos do mesmo) usando eletroporação. Após eletroporação, as células transfec- tadas são colocadas em lâminas com 96 cavidades para o ensaio. As célu- las são, então, deixadas crescer durante 48 horas de forma a se recuperar do procedimento de eletroporação e obter níveis máximos de expressão de receptor.
No dia do ensaio, o meio de crescimento sobre as células é substituído por tampão isento de soro contendo melatonina a 10 nM. A mela- tonina atua via um GPCR Gi-acoplado endógeno nos melanoforos para di- minuir os níveis de cAMP intracelular. Em resposta aos níveis diminuídos de cAMP, os melanoforos translocam seu pigmento para o centro da célula. O efeito líquido disso é uma diminuição significativa na leitura de absorbância da monocamada de células na cavidade, medida a 600-650 nM.
Após uma incubação de 1 hora em melatonina, as células se tornam completamente pigmento-agregadas. Nesse ponto, uma leitura de absorbância de linha de base é coletada. Diluições seriais dos compostos de teste são, então, adicionadas à lâmina e compostos tendo atividade agonista de GPR119 produzem aumentos nos níveis intracelulares de cAMP. Em res- posta a esses níveis aumentados de cAMP, os melanoforos translocam seu pigmento de volta para a periferia da célula. Após uma hora, as células esti- muladas são totalmente pigmento-dispersas. A monocamada de células no estado disperso absorve muito mais luz na faixa de 600-650 nM. O aumento medido na absorbância comparado com a leitura de linha de base permite quantificar o grau de estimulação do receptor e plotar uma curva de dose- resposta.
Materiais e métodos relativos ao ensaio de melanoforo são en- contrados nas Patentes U.S. Nos. 5.462.856 e 6.051.386, as divulgações de cada uma das quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
Um aumento na dispersão de pigmento em melanoforos G- PR119-transfectados com relação àquele em melanoforos transfectados com vetor vazio é indicativo de um composto de teste sendo um composto que estimula a funcionalidade do receptor GPR119.
Outros ensaios para identificação de um composto como agonis- ta de GPR119 serão prontamente evidentes para o técnico versado (vide, por exemplo, Exemplo 7, supra).
EXEMPLO 10: ENSAIO-REPÓRTER COM LEVEDO. POR EXEMPLO. PA- RA ATIVIDADE AGONISTA DE GPR119
Os ensaios-repórter baseados em célula de levedo foram anteri- ormente descritos na literatura (por exemplo, vide Miret e outros, J Biol Chem (2002) 277: 6881-6887; Campbell e outros, Bioorg Med Chem Lett (1999) 9: 2413-2418; King e outros, Science (1990) 250: 121-123; WO 99/14344; WO 00/12704; e US 6.100.042). Resumidamente, células de Ie- vedo foram manipuladas de modo que G-alfa de levedo endógeno (GPA1) tenha sido deletado e substituído por quimeras de proteína G construídas usando múltiplas técnicas. Adicionalmente, o GPCR de alfa-célula de Ievedo endógeno, Ste3, foi deletado para permitir a expressão homóloga de um GPCR de mamífero de escolha. Em levedo, elementos da via de transdução de sinalização de ferormônio, os quais são conservados em células eucario- tas (por exemplo, a via de quínase de proteína mitógeno-ativada), acionam a expressão de Fusl. Colocando β-galactosidase (LacZ) sob o controle do promotor Fusl (FusIp)1 um sistema foi desenvolvido, pelo qual a ativação do receptor leva a uma leitura enzimática.
Células de levedo são transformadas através de uma adaptação do método com acetato de lítio descrito por Agatep e outros (Agatep e ou- tros, 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the Iithium aceta- te/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) proto- col. Technical Tips Online, Trends Journals, Elsevier). Resumidamente, célu- las de levedo são crescidas durante a noite sobre lâminas com triptona de levedo (YT). DNA de filamento simples veículo (10 μg), 2 μg de cada um de dois plasmídeos-repórter FusIp-LacZ (um com marcador de seleção URA e um com TRP), 2 μg de GPR119 (por exemplo, receptor humano) em vetor de expressão de levedo (2 μg de origem de replicação) e um tampão de ace- tato de lítio/polietileno glicol/TE são pipeteados em um tubo de Eppendorf. O plasmídeo de expressão de levedo contendo o receptor/controle sem recep- tor tem um marcador LEU. Células de levedo são inoculadas nessa mistura e a reação se processa a 30 0C durante 60 min. As células de levedo são, então, submetidas a choque térmico a 42°C durante 15 min. As células são, então, lavadas e dispersas sobre lâminas de seleção. As lâminas de seleção são sintetizadas em meio de levedo definido menos LEU, URA e TRP (SD- LUT). Após incubação a 30°C durante 2-3 dias, colônias que crescem sobre as lâminas de seleção são, então, testadas no ensaio LacZ.
De modo a realizar ensaios com enzima fluorimétrica para β- galactosidase, células de levedo trazendo o receptor GPR119 em questão são crescidas durante a noite em meio SD-LUT líquido até uma concentra- ção insaturada (isto é, as células ainda estão em divisão e não atingiram uma fase estacionária). Elas são diluídas em meio fresco para uma concen- tração ótima de ensaio e 90 μΙ de células de levedo são adicionados à lâmi- nas de poliestireno com 96 cavidades de fundo preto (Costar). Compostos de teste, dissolvidos em DMSO e diluídos em uma solução de DMSO a 10% para uma concentração de 10X, são adicionados às lâminas e as lâminas colocadas a 30°C durante 4 horas. Após 4 horas, o substrato para a β- galactosidase é adicionado a cada cavidade. Nesses experimentos, fluores- ceína (β-D-galactopiranosídeo) é usada (FDG)1 um substrato para a enzima que libera fluoresceína, permitindo uma leitura fluorimétrica. 20 μl por cavi- dade de FDG a 500 μm/Triton X100 a 2,5% são adicionados (o detergente é necessário para tornar as células permeáveis). Após incubação das células com o substrato durante 60 min, 20 μΙ por cavidade de carbonato de sódio a 1 M são adicionados para terminar a reação e intensificar o sinal fluorescen- te. As lâminas são, então, lidas em um fluorímetro a 485/535 nM.
Um aumento no sinal fluorescente nas células de levedo G- PR119-transformadas com relação à células de levedo transformadas com vetor vazio é indicativo de um composto de teste sendo um composto que estimula funcionalidade do receptor GPR119 (por exemplo, um composto que é um agonista ou agonista parcial de GPR119). Em determinadas moda- lidades, compostos da invenção proporcionam um aumento no sinal fluores- cente acima do sinal de base (o sinal obtido na presença de veículo apenas).
EXEMPLO 11: COMPOSTO RADIORROTULADOS
Em determinadas modalidades, um composto conhecido por ser um ligante de um receptor acoplado à proteína G da invenção é radiorrotula- do. Um composto radiorrotulado, conforme descrito aqui, pode ser usado em um ensaio de seleção para identificar/avaliar compostos em termos gerais, um composto recentemente identificado ou sintetizado (isto é, composto de teste) pode ser avaliado com relação à sua capacidade de reduzir a ligação do ligante radiorrotulado conhecido ao receptor, por sua capacidade de re- duzir a formação do complexo entre o ligante radiorrotulado conhecido e o receptor. Radionuclídeos adequados que podem ser incorporados em com- postos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, 3H (tam- bém escrito como T), 13C, 14C, 18F, 125I, 82Br, 123I, 124I, 125I, 131I, 75Br, 76Br, 15O,13N1 35S e 77Br. Compostos que incorporam 3H, 14C, 121I, 131I, 35S ou 82Br ge- ralmente serão mais úteis.
Deve ser entendido que um composto "radiorrotulado" é um composto que tem incorporado pelo menos um radionuclídeo. Em algumas modalidades, o radionuclídeo é selecionado do grupo consistindo em 3H,14C, 125I, 35S e 82Br. Em algumas modalidades, o radionuclídeo é 3H ou 14C. Além disso, deve ser entendido que todos os átomos representados nos compos- tos conhecidos por serem Iigantes de um receptor acoplado à proteína G da invenção podem ser o isótopo que ocorre mais comumente de tais átomos ou o radioisótopo mais raro ou isótopo não radioativo.
Métodos sintéticos para incorporação de radioisótopos em com- postos orgânicos, incluindo aqueles aplicáveis a compostos conhecidos por serem Iigantes de um receptor acoplado à proteína G da invenção, são bem- conhecidos na técnica e incluem incorporação dos níveis de atividade de trítio em moléculas alvo, incluindo:
A. Redução catalítica com gás trítio - Esse procedimento nor- malmente proporciona produtos com elevada atividade específica e requer precursores halogenados ou insaturados.
B. Redução com borohidreto de sódio [3H] - Esse procedimento é barato e requer precursores contendo grupos funcionais reduzíveis, tais como aldeídos, cetonas, lactonas, ésteres e similares.
C. Redução com hidreto de lítio alumínio [3H] - Esse procedi- mento oferece produtos em atividades específicas teóricas máxima. Ele também requer precursores contendo grupos funcionais reduzíveis, tais co- mo aldeídos, cetonas, lactonas, ésteres e similares.
D. Rotulação através de exposição ao gás trítio - Esse procedi- mento envolve exposição de precursores contendo prótons permutáveis ao gás trítio na presença de um catalisador adequado.
E. N-metilação usando iodeto de metila [3H] - Esse procedimen- to é usualmente empregado para preparar produtos de O-metila ou N-metila (3H) através de tratamento de precursores apropriados com iodeto de metila (3H) de elevada atividade específica. Esse método, em geral, permite alta atividade específica, tal como cerca de 80-87 Ci/mmol.
Métodos sintéticos para incorporação de níveis de atividade de 125I em moléculas alvo incluem:
A. Reação de Sandmeyer e similares - Esse procedimento trans- forma uma aril ou heteroaril amina em um sal de diazônio, tal como um sal de tetrafluoroborato e, subseqüentemente, em um composto 125I rotulado usando Na125I. Um procedimento representativo foi reportado por Zhu, D.-G. e outros em J. Org. Chem. 2002, 67, 943-948.
B. Orto 125lodinação de fenóis - Esse procedimento permite a incorporação de 125I na posição orto de um fenol, conforme reportado por Collier, T. L. e outros em J. Labelled Compd Radiopharm. 1999, 42, S264- S266.
C. Troca com brometo de arila ou heteroarila com 125I - Esse mé- todo é geralmente um processo em duas etapas. A primeira etapa é a con- versão de brometo de arila ou heteroarila ao intermediário de trialquil esta- nho correspondente usando, por exemplo, uma reação catalisada por Pd (isto é, Pd(Ph3P)4] ou através de um aril ou heteroaril lítio, na presença de um haleto de trialquil estanho ou hexaalquil diestanho [por exemplo, (CH3)3SnSn(CH3)3). Um procedimento representativo foi reportado por Bas, M.-D. e outros em J. Labelled Compd Radiopharm. 2001, 44, S280-S282.
As técnicas precedentes se destinam a ser ilustrativas e não- limitativas. Outras técnicas para radiorrotulação de um composto conhecido como sendo um Iigante de um receptor acoplado à proteína G da invenção são bem-conhecidas por aqueles versados.
EXEMPLO 12: ENSAIO DE LIGAÇÃO A RECEPTOR
Um composto de teste pode ser avaliado com relação à sua ca- pacidade de reduzir a formação do complexo entre um composto conhecido como sendo um Iigante de um receptor acoplado à proteína G da invenção e o receptor. Em determinadas modalidades, o ligante conhecido é radiorrotu- lado. O ligante conhecido radiorrotulado pode ser usado em um ensaio de seleção para identificar/avaliar compostos. Em termos gerais, um composto recentemente sintetizado ou identificado (isto é, composto de teste) pode ser avaliado com relação à sua capacidade de reduzir a ligação do ligante ra- diorrotulado conhecido ao receptor, por sua capacidade de reduzir a forma- ção do complexo entre o ligante radiorrotulado conhecido e o receptor.
Um nível de ligação específica do ligante radiorrotulado conheci- do na presença do composto de testes menor do que o nível de ligação es- pecífica do ligante radiorrotulado conhecido na ausência de composto de teste é indicativo de menos do complexo entre o referido ligante radiorrotula- do conhecido e o referido receptor sendo formado na presença do composto de teste do que na ausência do composto de teste.
Protocolo de ensaio para detecção do complexo entre um composto conhe- cido como sendo um ligante de um receptor acoplado à proteína G da inven- cão e o receptor
A. Preparo do receptor
Células 293 são transitoriamente transfectadas com 10 μg de vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um re- ceptor acoplado à proteína G da invenção usando 60 μl de Lipofectamina (por disco de 15 cm).
As células transitoriamente transfectadas são crescidas no disco durante 24 horas (75% de confluência) com uma troca de meio e removidas com 10 ml/disco de tampão de Hepes-EDTA (Hepes a 20 mM + EDTA a 10 mM, pH de 7,4). As células são, então, centrifugadas em uma centrífuga Beckman Coulter durante 20 minutos, 17.000 rpm (rotor JA-25.50). Subse- qüentemente, o pélete é ressuspenso em Hepes a 20 mM + EDTA a 1 mM, pH de 7,4 e homogeneizado com um homogeneizador Dounce de 50 ml e novamente centrifugado. Após remoção do sobrenadante, os péletes são armazenados a -80°C, até usadas no ensaio de ligação. Quando usadas no ensaio, as membranas são descongeladas sobre gelo durante 20 minutos e, então, 10 mL de tampão de incubação (Hepes a 20 mM, MgCl2 a 1 mM, Na- Cl a 100 mM, pH de 7,4) adicionados. As membranas são, então, submeti- das a turbilhonamento para resuspender o pélete de membrana bruta e ho- mogeneizadas com um homogeneizador Brinkmann PT-3100 Polytron du- rante 15 segundos no ajuste 6. A concentração de proteína de membrana é determinada usando o ensaio de proteína BRL Bradford.
B. Ensaio de ligação
Para ligação total, um volume total de 50 μl de membranas a- propriadamente diluídas (diluídas em tampão de ensaio contendo Tris-HCI a 50 mM (pH de 7,4), MgCI2 a 10 mM e EDTA a 1 mM; 5-50 μg de proteína) é adicionado às lâminas de microtitulação de polipropileno com 96 cavidades, seguido pela adição de 100 μl de tampão de ensaio e 50 μl de um ligante conhecido radiorrotulado. Para a ligação não específica, 50 μl de tampão de ensaio são adicionados ao invés de 100 μl e mais 50 μl do referido ligante conhecido a 10 μΜ, o qual não é radiorrotulado, são adicionados antes que 50 μl do referido ligante conhecido radiorrotulado sejam adicionados. As lâ- minas são, então, incubadas em temperatura ambiente durante 60-120 mi- nutos. A reação de ligação é terminada através de filtração das lâminas de ensaio através de uma lâmina de filtração Microplate Devices GF/C Unifilter com um coletor de lâminas com 96 cavidades Brandell, seguido por lavagem com Tris-HCI a 50 mM gelado, pH de 7,4, contendo NaCI a 0,9%. Então, o fundo da lâmina de filtração é vedado, 50 μl de Optiphase Supermix são adi- cionados a cada cavidade, a parte superior das lâminas é vedada e as lâmi- nas são contadas em um contador de cintilação Trilux MicroBeta. Para de- terminação se menos do complexo entre o referido ligante conhecido radior- rotulado e o referido receptor é formado na presença de composto de teste, ao invés de adicionar 100 μl de tampão de ensaio, 100 μl do referido com- posto de teste apropriadamente diluído são adicionados às cavidades apro- priadas, seguido pela adição de 50 μl do referido ligante conhecido radiorro- tulado.
C. Cálculos
Os compostos de teste são inicialmente ensaiados a 10, 1 e 0,1 μΜ e, então, em uma faixa de concentrações escolhidas, de modo que a dose mediana causaria uma inibição de cerca de 50% da ligação do ligante radiorrotulado conhecido (isto é, IC50). A ligação específica na ausência de composto de teste (B0) é a diferença da ligação total (Bt) menos a ligação não específica (NSB) e, similarmente, a ligação específica (na presença do Composto de teste) (B) é a diferença da ligação de deslocamento (Bd) me- nos a ligação não específica (NSB). A IC50 é determinada a partir da curva de resposta de inibição, plotagem logit-log de % B/B0 vs a concentração de composto de teste.
A Ki é calculada através de transformação de Cheng e Prustoff:
Ki = IC50 /(I + [L]/Kn)
onde [L] é a concentração de ligante radiorrotulado conhecido usada no en- saio e Kd é a constante de dissociação do ligante conhecido radiorrotulado determinada independentemente sob as mesmas condições.
EXEMPLO 13: EFEITO DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE A SECREÇÃO DE GIP NA LINHAGEM DE CÉLULA ENTEROENDÓCRINA OU EM CÉLU- LAS EM TECIDO DERIVADO DE UMA REGIÃO RICA EM CÉLULAS K DO INTESTINO DELGADO
Um agonista de GPR119 de acordo com a presente invenção pode mostrar estimular a secreção de GIP em uma linhagem de célula ente- roendócrina ou em células em tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado [por exemplo, tecido do duodeno ou jejuno; vide, por exemplo, Sondhi e outros, Pharmacogenetics J (2006) 6: 131-140] usando o ensaio in vivo descrito aqui. Células enteroendócrinas ou células em tecido derivado de uma região rica em células K do intestino delgado são coloca- das em lâminas com 24 cavidades no dia um em meio de cultura completo (DMEM/FBS a 10%). No dia dois, o meio de cultura é substituído por um meio com baixo teor de glicose (DMEM/glicose a 3 mM/FBS a 10%). No dia três, as células são lavadas duas vezes com 1 χ PBS. As células lavadas são estimuladas com veículo ou com agonista de GPR119 em várias con- centrações (por exemplo, na faixa de 1 nM a 20 μΜ) ou com forskolina (1 μΜ) como um controle positivo em DMEM isento de soro com glicose a 15 mM durante uma hora a 37°C e 5% de CO2 em uma incubadora de cultura tecidual. Os sobrenadantes são, então, coletados e clarificados através de centrifugação a 500 g e 4 0C durante 5 minutos. O GIP liberado no sobrena- dante é determinado através de ELISA usando reagentes adquiridos da LINCO Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (To- tal) ELISA Catálogo N0 EZRMGIP-55K], seguindo as instruções fornecidas pelo fornecedor.
Embora a especificação precedente ensine os princípios da pre- sente invenção, com exemplos fornecidos para fins de ilustração, deve ser entendido que a prática da invenção abrange todas as variações, adapta- ções ou modificações usuais que venham a estar dentro do escopo das rei- vindicações a seguir. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Arena Pharmaceuticals, Inc.
Chu, Zhi-Liang
Leonard, James
<120> MÉTODO DE USO DO RECEPTOR GPR119 PARA IDENTIFICAR COMPOSTOS
TEIS PARA AUMENTO DA MASSA ÓSSEA EM UM INDIVÍDUO <130> 122.WOl
<150> 60/791,550
<151> 2006-04-11
<160> 4
<170> PatentIn versão 3.2
<210> 1 <211> 1008 <212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 1
atggaatcat ctttctcatt tggagtgatc cttgctgtcc tggcctccct catcattgct 60
actaacacac tagtggctgt ggctgtgctg ctgttgatcc acaagaatga tggtgtcagt 120 ctctgcttca ccttgaatct ggctgtggct gacaccttga ttggtgtggc catctctggc 180 ctactcacag accagctctc cagcccttct cggcccacac agaagaccct gtgcagcctg 240 cggatggcat ttgtcacttc ctccgcagct gcctctgtcc tcacggtcat gctgatcacc 300 tttgacaggt accttgccat caagcagccc ttccgctact tgaagatcat gagtgggttc 360 gtggccgggg cctgcattgc cgggctgtgg ttagtgtctt acctcattgg cttcctccca 420 ctcggaatcc ccatgttcca gcagactgcc tacaaagggc agtgcagctt ctttgctgta 480 tttcaccctc acttcgtgct gaccctctcc tgcgttggct tcttcccagc catgctcctc 540 tttgtcttct tctactgcga catgctcaag attgcctcca tgcacagcca gcagattcga 600 aagatggaac atgcaggagc catggctgga ggttatcgat ccccacggac tcccagcgac 660 ttcaaagctc tccgtactgt gtctgttctc attgggagct ttgctctatc ctggaccccc 720 ttccttatca ctggcattgt gcaggtggcc tgccaggagt gtcacctcta cctagtgctg 780 gaacggtacc tgtggctgct cggcgtgggc aactccctgc tcaacccact catctatgcc 840 tattggcaga aggaggtgcg actgcagctc taccacatgg ccctaggagt gaagaaggtg 900 ctcacctcat tcctcctctt tctctcggcc aggaattgtg gcccagagag gcccagggaa 960 agttcctgtc acatcgtcac tatctccagc tcagagtttg atggctaa
<210> 2
<211> 335
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 2
Met Glu Ser Ser Phe Ser Phe Gly Val Ile Leu Ala Val Leu Ala Ser 1 5 10 15
Leu Ile Ile Ala Thr Asn Thr Leu Val Ala Val Ala Val Leu Leu Leu
20 25 30
Ile His Lys Asn Asp Gly Val Ser Leu Cys Phe Thr Leu Asn Leu Ala
35 40 45
Val Ala Asp Thr Leu Ile Gly Val Ala Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp
50 55 60
Gln Leu Ser Ser Pro Ser Arg Pro Thr Gln Lys Thr Leu Cys Ser Leu 65 70 75 80
Arg Met Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Met Leu Ile Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Lys Gln Pro Phe Arg
100 105 110
Tyr Leu Lys Ile Met Ser Gly Phe Val Ala Gly Ala Cys Ile Ala Gly
115 120 125
Leu Trp Leu Val Ser Tyr Leu Ile Gly Phe Leu Pro Leu Gly Ile Pro
130 135 140
Met Phe Gln Gln Thr Ala Tyr Lys Gly Gln Cys Ser Phe Phe Ala Val 145 150 155 160
Phe His Pro His Phe Val Leu Thr Leu Ser Cys Val Gly Phe Phe Pro
165 170 175
Ala Met Leu Leu Phe Val Phe Phe Tyr Cys Asp Met Leu Lys Ile Ala
180 185 190
Ser Met His Ser Gln Gln Ile Arg Lys Met Glu His Ala Gly Ala Met 195 200 205 Ala Gly Gly Tyr Arg Ser Pro Arg Thr Pro Ser Asp Phe Lys Ala Leu
210 215 220
Arg Thr Val Ser Val Leu Ile Gly Ser Phe Ala Leu Ser Trp Thr Pro 225 230 235 240
Phe Leu Ile Thr Gly Ile Val Gln Val Ala Cys Gln Glu Cys His Leu
245 250 255
Tyr Leu Val Leu Glu Arg Tyr Leu Trp Leu Leu Gly Val Gly Asn Ser
260 265 270
Leu Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Tyr Trp Gln Lys Glu Val Arg Leu
275 280 285
Gln Leu Tyr His Met Ala Leu Gly Val Lys Lys Val Leu Thr Ser Phe
290 295 300
Leu Leu Phe Leu Ser Ala Arg Asn Cys Gly Pro Glu Arg Pro Arg Glu 305 310 315 320
Ser Ser Cys His Ile Val Thr Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asp Gly 325 330 335
<210> 3
<211> 22 <212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 3
gtcctgccac ttcgagacat gg <210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 4
gaaacttctc tgcccttacc gtc

Claims (108)

1. Uso de um receptor acoplado à proteína G (GPCR), caracteri- zado pelo fato de ser para identificação de secretagogos de polipeptídeo insulinotrópico glicose-dependente (GIP), em um método in vitro compreen- dendo as seguintes etapas: (a) colocar em contato um composto de teste com uma célula hospedeira ou com a membrana de uma célula hospedeira compreendendo o referido GPCR, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoá- cidos selecionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 da SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 da SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1; (v) a seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (ii); e (b) determinar a capacidade do composto de teste de estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste de estimular a fun- cionalidade do receptor é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (c) colocar em contato um composto que estimula a funcionali- dade do receptor na etapa (b) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de secretar GIP; e (d) determinar se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular a se- creção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP é uma indicação de que o composto de teste é um secreta- gogo de GIP.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (c) determinar se o composto aumenta um nível de GIP em um vertebrado, pela medição do nível de GIP em uma amostra obtida a partir de um vertebrado previamente administrado com um composto que estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b); em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível de GIP no vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (c) determinar se o composto aumenta um nível de massa óssea em um vertebrado, pela medição do nível de massa óssea em uma amostra obtida a partir de um vertebrado previamente administrado com um compos- to que estimula a funcionalidade do receptor na etapa (b); em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível massa óssea no vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um humano.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o receptor é recombinante.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um polinucleotí- deo que codifica o GPCR.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida determinação é através da medição do nível de um segundo mensageiro.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o segundo mensageiro é selecionado do grupo compreendendo AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), atividade de MAP quinase, atividade de quínase-1 de MAPK/ERK quinase (MEKK1) e Ca2+.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um nível de cAMP é aumentado.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida determinação é através do uso de um ensaio de Melanoforo, através da medição de ligação de GTPyS a uma membrana compreendendo o referido GPCR ou através de um ensaio repórter.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedo.
15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de melanoforo.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de ami- noácidos de um receptor acoplado à proteína G apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade a SEQ ID NO: 2.
18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 2.
19. Método para identificação de secretagogos de GIP1 caracte- rizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) colocar em contato um agonista de GPR119 in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de secretar GIP; e (b) determinar se o agonista de GPR119 estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do agonista de GPR119 de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula ca- paz de secretar GIP é uma indicação de que o agonista de GPR119 é um secretagogo de GIP.
20. Método para identificação de secretagogos de GIP, caracte- rizado pelo fato de que compreende a etapa de: (a) determinar se o agonista de GPR119 aumenta um nível de GIP em um vertebrado, pela medição do nível de GIP em uma amostra obti- da a partir de um vertebrado previamente administrado com um agonista de GPR119; em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar um nível de GIP no vertebrado é uma indicação de que o agonista de GPR119 é um secretagogo de GIP.
21. Método para identificação de secretagogos de GIP, caracte- rizado pelo fato de que compreende a etapa de: (a) determinar um nível de massa óssea em uma amostra obtida a partir de um vertebrado previamente administrado com um agonista de GPR119; em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar um nível de massa óssea no vertebrado é uma indicação de que o agonista de GPR119 é um secretagogo de GIP.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracteri- zado pelo fato de que o vertebrado é um humano.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracteri- zado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 seletivo.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma seleti- vidade para agonista GPR119 sobre um receptor CRF-1 de pelo menos cer- ca de 100 vezes.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 10 μΜ.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC5O inferior a 1 μΜ.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 100 nM.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é oralmente ati- vo e tem uma EC50 inferior a 100 nM.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 31, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é oralmente ati- vo.
33. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende, antes da etapa (a), as seguintes etapas in vi- tro adicionais: (x) colocar em contato um composto de teste com uma célula hospedeira ou com a membrana de uma célula hospedeira compreendendo um GPCR, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 da SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 da SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1; (v) seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (ü); e (y) determinar a capacidade do composto de teste de estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste de estimular a fun- cionalidade do receptor é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP e em que o agonista GPR119 da etapa (a) é um com- posto de teste identificado como estimulante da funcionalidade do recepetor na etapa (y).
34. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende, antes da etapa (a), as seguintes etapas in vitro adicionais: (x) colocar em contato um composto de teste com uma célula hospedeira ou com a membrana de uma célula hospedeira compreendendo um GPCR, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1; (v) seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (iii); e (y) determinar a capacidade do composto de teste de estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste de estimular a fun- cionalidade do receptor é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP e em que o agonista GPR119 da etapa (a) é um com- posto de teste identificado como estimulante da funcionalidade do receptor na etapa (y).
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é humano.
36. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o receptor é recombinante.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um poli- nucleotídeo que codifica o GPCR.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizado pelo fato de que a referida determinação é através da medição do nível de um segundo mensageiro.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o segundo mensageiro é selecionado do grupo compreen- dendo AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), atividade de MAP quinase, atividade de quínase-1 de MAPK/ERK quinase (MEKK1) e Ca2+.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que um nível de cAMP é aumentado.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que a referida determinação é através do uso de um ensaio de Melanoforo, através da medição de ligação de GTPyS a uma membrana compreendendo o referido GPCR ou através de um ensaio repórter.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hos- pedeira de mamífero.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hos- pedeira de levedo.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hos- pedeira de melanoforo.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 45, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 46, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos de um receptor acoplado à proteína G apresentando pelo me- nos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 47, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
49. Uso de um GPCR, caracterizado pelo fato de que é para i- dentificação de secretagogos de GlP, em um método in vitro compreenden- do as seguintes etapas: (a) colocar em contato um GPCR com um Iigante conhecido op- cionalmente rotulado ao receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento da SEQ ID NO: 1; (v) a seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (ii); e (b) detectar o complexo entre o referido ligante conhecido e o referido receptor; e (c) determinar se menos do referido complexo é formado na pre- sença do composto de teste do que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é uma indicação de que o com- posto de teste é um secretagogo de GlP.
50. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o referido método ainda compreende: (d) colocar em contato de composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c) in vitro com uma célula entero- endócrina de vertebrado ou uma célula capaz de secretar GlP; e (e) determinar se o composto estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP; em que a capacidade do composto de teste de estimular secre- ção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
51. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (d) determinar se o composto aumenta um nível de GIP em um vertebrado, pela medição do nível de GIP em uma amostra obtida de um vertebrado previamente administrado com um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado na etapa (c); em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível de GIP no vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
52. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (d) determinar se o composto aumenta um nível de massa óssea em uma amostra obtida de um vertebrado, pela medição do nível de massa óssea em uma amostra obtida de um vertebrado previamente administrado com um composto na presença do qual menos do referido complexo é for- mado na etapa (c); em que a capacidade do composto de teste de aumentar um nível de massa óssea no vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP.
53. Uso, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um humano.
54. Uso, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
55. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -54, caracterizado pelo fato de que o receptor é recombinante.
56. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -55, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um polinucleo- tídeo que codifica o GPCR.
57. Uso, de acordo com a reivindicação 49 a 56, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um agonista de GPR119.
58. Uso, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista de GRP119 humano.
59. Uso, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 seletivo.
60. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a -59, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma seletivi- dade para agonista GPR119 sobre um receptor CRF-1 de pelo menos cerca de 100 vezes.
61. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -60, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 in- ferior a 10 μΜ.
62. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -60, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC5O in- ferior a 1 μΜ.
63. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -60, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC5O in- ferior a 100 nM.
64. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -53, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
65. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -64, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é uma pequena mo- lécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
66. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -65, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de iden- tidade com a SEQ ID NO: 2.
67. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a -66, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
68. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende, antes da etapa (a), as seguintes etapas in vi- tro adicionais: (x) colocar em contato um GPCR com um Iigante conhecido op- cionalmente rotulado ao receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 da SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 da SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento da SEQ ID NO: 1; (ν) seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (iii); e (y) detectar o complexo entre o referido Iigante conhecido e o referido receptor; e (z) determinar se menos do referido complexo é formado na pre- sença do composto de teste do que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é uma indicação de que o com- posto de teste é um secretagogo de GIP e em que o agonista GPR119 da etapa (a) é um composto de teste determinado na etapa (z) para ser um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado.
69. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende, antes da etapa (a), as seguintes etapas in vitro adicionais: (x) colocar em contato um GPCR com um Iigante conhecido op- cionalmente rotulado ao receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o GPCR compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo compreendendo: (i) aminoácidos 1-335 da SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 da SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que é amplificável através de reação em cadeia de polimera- se (PCR) sobre uma amostra de DNA humano usando iniciadores específi- cos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; (iv) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento da SEQ ID NO: 1; (v) seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (vi) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vii) um fragmento biologicamente ativo de qualquer um de (i) ou (ii); e (y) detectar o complexo entre o referido Iigante conhecido e o referido receptor; e (z) determinar se menos do referido complexo é formado na pre- sença do composto de teste do que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é uma indicação de que o com- posto de teste é um secretagogo de GIP e em que o agonista GPR119 da etapa (a) é um composto de teste determinado na etapa (z) para ser um composto na presença do qual menos do referido complexo é formado.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um humano.
71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 71, caracterizado pelo fato de que o receptor é recombinante.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um poli- nucleotídeo que codifica o GPCR.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 73, caracterizado pelo fato de que o ligante conhecido é um agonista de GPR119.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
76. Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, caracteri- zado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonista seletivo.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 76, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma seleti- vidade para agonista GPR119 sobre um receptor CRF-1 de pelo menos cer- ca de 10O vezes.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 10 μΜ.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 1 μΜ.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 100 nM.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 80, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 81, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é uma pequena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 82, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos de um receptor acoplado à proteína G apresentando pelo me- nos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 83, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
85. Uso de uma célula hospedeira ou uma membrana de uma célula hospedeira compreendendo GPCR, caracterizado pelo fato de ser para identificação de GIP, em que a célula hospedeira ou a membrana da mesma é para contatar um composto de teste, em que o GPCR compreen- de: (i) aminoácidos 1-335 da SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 da SEQ ID NO: 2; (iii) seqüência de aminoácidos de um GPCR codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, ao complemento de SEQ ID NO: 1; (iv) a seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e (v) a seqüência de aminoácidos de uma versão constitutivamen- te ativa de um GPCR apresentando SEQ ID NO: 2; e (vi) um fragmento de qualquer um de (i) a (iv) apresentando um atividade biológica de GPR119; e em que a capacidade do composto de teste de estimular a fun- cionalidade do GPCR é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GlP.
86. Uso, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o receptor é recombinante.
87. Uso, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão, o referido vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o GPCR.
88. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a - 87, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospe- deira de mamífero.
89. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a - 87, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospe- deira de levedo.
90. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a - 87, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospe- deira de melanoforo.
91. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a - 90, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é uma pequena mo- lécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 10.000 gramas por mol.
92. Uso, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o peso molecular é inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
93. Uso1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a -92, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos de um GPCR apresentando pelo menos cerca de 80% de iden- tidade com a SEQ ID NO: 2.
94. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a -93, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
95. Método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um agonista de GPR119 apresentando o efeito de um se- cretagogo de GIP, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato o agonista de GPR119 com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de secretar GIP in vitro; e (b) determinar se o agonista de GPR119 estimula a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de secretar GIP, em que a capacidade do agonista de GPR119 de estimular a secreção de GIP da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de se- cretar GIP é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP; e (c) misturar o agonista de GPR119 apresentando o efeito de um secretagogo de GIP com um veículo farmacologicamente aceitável.
96. Método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um agonista de GPR119 apresentando o efeito de um se- cretagogo de GIP, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar um nível de GIP sangüíneo de uma amostra obti- da de um vertebrado que foi administrado com o agonista de GPR119, em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar o nível de GIP san- güíneo na amostra biológica obtida do vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretagogo de GIP; e (b) misturar o agonista de GPR119 apresentando o efeito de um secretagogo de GIP com um veículo farmacologicamente aceitável.
97. Método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um agonista de GPR119 apresentando o efeito de um se- cretagogo de GIP1 caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar um nível de massa óssea de uma amostra obtida de um vertebrado que foi administrado com o agonista de GPR119, em que a capacidade do agonista de GPR119 de aumentar o nível de massa óssea no vertebrado é uma indicação de que o composto de teste é um secretago- go de GIP; e (b) misturar o agonista de GPR119 apresentando o efeito de um secretagogo de GIP com um veículo farmacologicamente aceitável.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96 ou 97, caracteri- zado pelo fato de que o vertebrado é um humano.
99. Método, de acordo com a reivindicação 96 ou 97, caracteri- zado pelo fato de que o vertebrado é um mamífero não-humano.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações - 95 a 99, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um agonis- ta de GPR119 humano.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações - 95 a 100, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é um ago- nista seletivo.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma seletividade para agonista GPR119 sobre um receptor CRF-1 de pelo menos cerca de 100 vezes.
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações - 95 a 102, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC5O inferior a 10 μΜ.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações - 95 a 102, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 1 μΜ.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações - 95 a 102, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 tem uma EC50 inferior a 100 nM.
106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -95 a 102, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é oralmente ativo e tem uma EC5O inferior a 100 nM.
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -95 a 106, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é oralmente ativo.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -95 a 107, caracterizado pelo fato de que o agonista de GPR119 é uma pe- quena molécula apresentando um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol.
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