PT1971862E - Métodos de utilização do receptor gpr119 para identificar compostos úteis para aumentar a massa óssea num indivíduo - Google Patents

Métodos de utilização do receptor gpr119 para identificar compostos úteis para aumentar a massa óssea num indivíduo Download PDF

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Description

ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Métodos de utilização do receptor GPR119 para identificar compostos úteis para aumentar a massa óssea num indivíduo"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a métodos de utilização do receptor GPR119 para identificar secretagogos de GIP, que podem ser úteis para aumentar a massa óssea num indivíduo. Agonistas do receptor GPR119 são úteis como agentes terapêuticos para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e para aumento da massa óssea num indivíduo. Agonistas do receptor GPR119 promovem a formação de osso num indivíduo.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Pretende-se que a seguinte discussão facilite a compreensão do invento, mas não se pretende nem se admite que seja arte anterior ao invento. A. Osteoporose A osteoporose é uma doença incapacitante caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração microarquitectural da estrutura esquelética conduzindo a uma força óssea comprometida, que predispõe um paciente a maior risco de fracturas de fragilidade. A osteoporose afecta mais de 75 milhões de pessoas na Europa, no Japão e nos Estados Unidos, e causa mais de 2,3 milhões de fracturas apenas na Europa e nos Estados Unidos. Nos Estados Unidos, a osteoporose afecta pelo menos 25% de todas as mulheres brancas em pós-menopausa, e a proporção sobe até 70% em mulheres com mais de 80 anos. Uma em cada três mulheres com mais de 50 anos terá uma fractura osteoporótica o que causa um considerável fardo social e financeiro na sociedade. A doença não está limitada às mulheres; homens mais velhos podem também ser afectados. Em 2050, a incidência mundial de fractura da anca em homens está projectada aumentar em 310% e 240% nas mulheres. O risco combinado ao longo da vida de fractura da anca, do antebraço e 2 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ de vértebras apresentados clinicamente está em torno de 40%, equivalente ao risco de doença cardiovascular. As fracturas osteoporóticas causam portanto uma substancial mortalidade, morbidez e custo económico. Com uma população envelhecida, o número de fracturas osteoporóticas e seus custos pelo menos duplicarão nos próximos 50 anos a menos que sejam desenvolvidas estratégias preventivas eficazes. (Ver, p.ex., Atik et al., Clin. Orthop. Relat. Res. (2006) 443: 19-24; Raisz, j. Clin. invest. (2005) 115: 3318-3325; e World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis"). B. Polipéptido Insulinotrópico dependente de Glicose (GIP) O polipéptido insulinotrópico dependente de glicose (GIP, também conhecido como polipéptido inibidor gástrico) é uma hormona peptidica incretina de 42 aminoácidos que é libertada das células endócrinas K duodenais após ingestão de uma refeição. A quantidade de GIP libertado é grandemente dependente da quantidade de glicose consumida. Foi mostrado que GIP estimula a secreção de insulina dependente de glicose em células beta pancreáticas. GIP medeia as suas acções através de um receptor acoplado a proteína G específico, nomeadamente GIPR.
Uma vez que GIP contém uma alanina na posição 2, é um excelente substrato para a dipeptidil-peptidase-4 (dpp-iv), uma enzima que regula a degradação de GIP. O GIP(1-42) inteiro é rapidamente convertido no GIP(3-42) bioinactivo em minutos após secreção da célula K intestinal. Mostrou-se que a inibição de DPP-IV aumenta a bioactividade de GIP. (Ver, p.ex., Drucker, Cell Metab. (2006) 3: 153-165; Mcintosh et al., Regul. Pept. (2005) 128: 159-165; Deacon, Regul. Pept. (2005) 128: 117-124; e Ahren et al., Endocrinology (2005) 146: 2055-2059). A análise do GIP inteiro bioactivo, por exemplo no sangue, pode ser realizada utilizando ensaios específicos do terminal N (ver, p.ex., Deacon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (2000) 85: 3575-3581).
Recentemente, mostrou-se que GIP promove a formação de osso. Foi mostrado que GIP activa receptores osteoblásticos, resultando em aumentos na síntese de colagénio de tipo I e na 3 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ actividade da fosfatase alcalina, ambos associados a formação de osso. Foi mostrado que GIP inibe a actividade e a diferenciação in vitro dos osteoclastos . Mostrou-se que a administração de GIP impede a perda de osso devida a ovariectomia. Ratinhos knock-out para o receptor de GIP (GIPR) evidenciam uma diminuição do tamanho dos ossos, menor massa óssea, microarquitectura e propriedades bioquímicas ósseas alteradas, e parâmetros alterados para a renovação óssea, especialmente na formação de osso. (Ver, p.ex., zhong et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. (2007) 292: E543-E548;
Bollag et al., Endocrinology (2000) 141: 1228-1235; Bollag et al., Mol. Cell. Endocrinol. (2001) 177: 35-41; Xie et al.,
Bone (2005) 37: 759-769; e Tsukiyama et al., Mol. Endocrinol. (2006) 20: 1644-165 I.) A utilidade de GIP para manutenção ou aumento da densidade ou formação de osso foi reconhecida pelo United State Trademark and Patent Office através da outorga da Patente dos Estados Unidos N°. 6410508 para o tratamento de reduzida mineralização óssea através da administração de péptido GIP. No entanto, os actuais agonistas do péptido GIP sofrem de uma falta de biodisponibilidade oral, com impacto negativo na adesão dos pacientes. Uma abordagem alternativa atractiva é o desenvolvimento de uma composição oralmente activa para aumento de um nível endógeno de actividade de GIP. C. GPR119 GPR119 é um receptor acoplado a proteína G (GPR119; p.ex., GPR119 humano, N°. de Entrada em GenBank® AAP72125 e alelos deste; p.ex., GPR119 de ratinho, N°. de Entrada em GenBank® AY288423 e alelos deste). A activação de GPR119 por um agonista conduz à elevação do nível de AMPc intracelular, consistente com GPR119 estar ligado a Gs. Na literatura de patentes, GPR119 foi referido como RUP3 (p.ex., WO 00/31258); GPR119 foi também referido como Receptor Insulinotrópico Dependente de Glicose (GDIR).
D. Receptores Acoplados à Proteína G
Embora existam várias classes de receptores em humanos, de longe os mais abundantes e terapeuticamente relevantes são 4 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ representados pela classe de receptores acoplados à proteína G (GPCR). Estima-se que existam cerca de 30000-40000 genes dentro do genoma humano, e destes, estima-se que aproximadamente 2% codifiquem para GPCRs.
Os GPCRs representam uma importante área para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Fármacos activos em GPCRs têm benefício terapêutico ao longo de um amplo espectro de doenças humanas tão diversas como dor, disfunção cognitiva, hipertensão, úlceras pépticas, rinite e asma. Dos aproximadamente 500 fármacos clinicamente comercializados, mais de 30% são moduladores da função de GPCR. Estes fármacos exercem a sua actividade em aproximadamente 30 GPCRs bem caracterizados. (Ver, p.ex., Wise et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2004) 44: 43-66).
Os GPCRs partilham um motivo estrutural comum, possuindo sete sequências de entre 22 a 24 aminoácidos hidrófobos que formam sete hélices alfa, cada uma das quais atravessa a membrana (cada troço é identificado por um número, i.e., transmembranar-1 (TM-1), transmembranar-2 (TM-2), etc.). As hélices transmembranares são unidas através de cadeias de aminoácidos entre a transmembranar-2 e a transmembranar-3, a transmembranar-4 e a transmembranar-5, e a transmembranar-6 e a transmembranar-7 no lado exterior ou "extracelular", da membrana celular (estas são referidas como regiões "extracelulares" 1, 2 e 3 (EC-1, EC-2 e EC-3), respectivamente). As hélices transmembranares são também unidas através de cadeias de aminoácidos entre a transmembranar-1 e a transmembranar-2, a transmembranar-3 e a transmembranar-4, e a transmembranar-5 e a transmembranar-6 no lado interior ou "intracelular", da membrana celular (estas são referidas como regiões "intracelulares" 1, 2 e 3 (IC-1, IC-2 e IC-3), respectivamente). O terminal "carboxilo" ("C") do receptor reside no espaço intracelular dentro da célula, e o terminal "amino" ("N") do receptor reside no espaço extracelular fora da célula.
Geralmente, quando um ligando se liga ao receptor (frequentemente referido como "activação" do receptor), ocorre uma alteração na conformação do receptor que facilita a ligação entre a região intracelular e uma "proteína G" 5 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ intracelular. Foi relatado que os GPCRs são "promíscuos" em relação às proteínas G, i.e., que um GPCR pode interagir com mais de uma proteina G. Ver, Kenakin, Life Sciences (1988) 43: 1095-1101. Embora existam outras proteínas G, actualmente Gq, Gs, Gi, Gz e Go são as proteínas G que foram identificadas. O acoplamento de GPCR activado pelo ligando com a proteína G inicia um processo de cascata de sinalização (referido como "transdução de sinal"). Sob condições normais, a transdução de sinal resulta finalmente em activação celular ou inibição celular. Embora não desejando estar ligado à teoria, pensa-se que a volta IC-3 bem como o terminal carboxilo do receptor interagem com a proteína G.
Existem também proteínas G promíscuas, que parecem acoplar várias classes de GPCRs à via da fosfolipase C, tais como G15 ou G16 (Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. (1995) 270: 15175-80), ou proteínas G quiméricas desenhadas para acoplarem um grande número de GPCRs diferentes à mesma via, p.ex. fosfolipase C (Milligan & Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20: 118-24).
Sob condições fisiológicas, os GPCRs existem na membrana celular em equilíbrio entre duas conformações diferentes: um estado "inactivo" e um estado "activo". Um receptor num estado inactivo é incapaz de se ligar à via de transdução de sinal intracelular para iniciar a transdução de sinal conduzindo a uma resposta biológica. A alteração da conformação do receptor para o estado activo permite ligação à via de transdução (através da proteína G) e produz uma resposta biológica.
Um receptor pode ser estabilizado num estado activo através de um ligando ou um composto tal como um fármaco. Descobertas recentes, incluindo mas não limitadas exclusivamente a modificações na sequência de aminoácidos do receptor, proporcionam um meio diferente do dos ligandos ou fármacos para promover e estabilizar o receptor na conformação de estado activo. Estes meios estabilizam eficazmente o receptor num estado activo através da simulação do efeito de um ligando que se liga ao receptor. A estabilização através de tais meios independentes do ligando é designada "activação constitutiva do receptor". 6 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se à descoberta inesperada pelo Requerente de que a administração de um agonista de GPR119 a um indivíduo, tal como através de administração oral, pode actuar no receptor GPR119 para aumentar um nivel de GIP no indivíduo. 0 presente invento apresenta métodos relacionados com GPR119 para identificação de secretagogos de GIP. Um agonista de GPR119 é útil para a promoção (p.ex., aumento) da formação de osso num indivíduo. Em certas concretizações, o indivíduo é um humano.
A sequência nucleotídica codificando o polipéptido GPR119 humano é dada em SEQ ID N0:1. A sequência de aminoácidos do referido polipéptido GPR119 humano codificada é dada em SEQ ID NO: 2 .
Num primeiro aspecto, o invento apresenta a utilização de um receptor acoplado a proteína G para identificação de secretagogos de GIP, num método in vitro compreendendo os passos de: (a) contacto de um composto de teste com uma célula hospedeira ou com a membrana de uma célula hospedeira compreendendo um receptor acoplado a proteína G, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID N0:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID N0:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que seja amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; 7 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar ao composto A; e (b) determinação da capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor acoplado a proteína G; em que a capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor acoplado a proteína G é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 .
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um alelo de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é recombinante.
Em certas concretizações, o método compreende a identificação de um agonista do receptor.
Em certas concretizações, o método compreende a identificação de uma agonista parcial do receptor. O invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos (a) e (b) deste primeiro aspecto, e compreendendo ainda: 8 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (c) opcionalmente a síntese de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (d) o contacto de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP; e (e) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos (a) e (b) deste primeiro aspecto, e compreendendo ainda: (c) opcionalmente a síntese de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (d) a determinação de se o composto aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto que estimula a funcionalidade do receptor no passo (b), 9 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP total. Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP bioactivo.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano. 0 invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos (a) e (b) deste primeiro aspecto, e compreendendo ainda: (c) opcionalmente a síntese de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (d) proporcionar opcionalmente um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (e) o contacto de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b) in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP; e (f) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende 10 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ tecido do duodeno ou do jejuno (Ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos (a) e (b) deste primeiro aspecto, e compreendendo ainda: (c) opcionalmente a síntese de um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (d) proporcionar opcionalmente um composto que estimule a funcionalidade do receptor no passo (b); (e) a determinação de se o composto aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto que estimula a funcionalidade do receptor no passo (b); em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP total. Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP bioactivo.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano.
Em certas concretizações, o secretagogo de GIP identificado é um agonista do receptor. Nalgumas concretizações, o agonista é um agonista parcial.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G está acoplado a uma proteína G. Em certas 11 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ concretizações, a activação do receptor acoplado a proteína G aumenta um nível de AMPc intracelular. Em certas concretizações, a proteína G é Gs.
Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADN genómico humano.
Nalgumas concretizações, a reacção em cadeia da polimerase é transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). As técnicas de RT-PCR são bem conhecidas dos peritos na arte. Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é um ADNc humano. Em certas concretizações, o ADNc é de um tecido humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhéus pancreáticos. Em certas concretizações, o ADNc é de um tipo celular humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma célula beta pancreática. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma linha celular pancreática.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2, 4] — oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2, 4] — oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade 12 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, condições rigorosas de hibridação compreendem hibridação a 42°C numa solução compreendendo formamida a 50%, SSC 5χ (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, fragmentado, seguido de lavagem a 65°C numa solução compreendendo SSC 0,lx. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos peritos na arte.
Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é SEQ ID NO:2 ou um alelo deste. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro- 13 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID N0:2 exibe um nivel detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nivel de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. As técnicas para produção de uma construção de fusão GPCR:G são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Pedido Internacional WO 02/42461).
Em certas concretizações, a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o receptor acoplado a proteína G. Nalgumas concretizações, o vector de expressão é pCMV. Este vector foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC) a 13 de Outubro de 1998 (10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins de Processos de Patentes. O adn foi testado pela ATCC que determinado como sendo viável. A ATCC atribuiu o seguinte número de depósito a pCMV: ATCC #203351. Outros vectores de expressão adequados serão facilmente aparentes aos peritos na arte, e uma ampla variedade de vectores de expressão está comercialmente disponível (p.ex., em Clontech, Paio Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; e Invitrogen, Carlsbad, CA).
Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de vertebrado. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira de mamífero é seleccionada a partir do grupo que consiste numa célula 293, uma célula 293T, uma célula CHO, uma célula MCB3901, e uma célula COS-7. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula melanóforo. 14 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Outras células hospedeiras adequadas serão facilmente aparentes aos vulgares peritos na arte, e uma ampla variedade de linhas celulares está disponível na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209 .
Em certas concretizações, a referida determinação é consistente com o receptor acoplado a proteína G ser um receptor acoplado à Gs.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é consistente com o receptor acoplado a proteína G estar acoplado através de uma proteína G promíscua, tal como Gal5 ou Gal6, à via da fosfolipase C. As proteínas G promíscuas são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Offermanns et al., J. Biol. Chem. (1995) 270: 15175-15180). Nalgumas concretizações, a referida determinação é consistente com o receptor acoplado a proteína G estar acoplado através de uma proteína G quimérica, p.ex. à via da fosfolipase C. As proteínas G quiméricas são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Milligan et al., Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20: 118-124; e WO 02/42461).
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através da medição de um nível de um mensageiro secundário.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através da medição de um nível de um mensageiro secundário seleccionado a partir do grupo que consiste em AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), actividade de MAP-cinase, actividade de MAPK/ERK-cinase-cinase-1 (MEKK1), e Ca2+. Nalgumas concretizações preferidas, o mensageiro secundário é AMPc. Em certas concretizações, é aumentado um nível de AMPc intracelular.
Em certas concretizações, a referida determinação é realizada utilizando membrana compreendendo o receptor acoplado a proteína G. 15 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, a referida determinação é através da utilização de um ensaio de melanóforos. Em certas concretizações, é aumentado um nivel de dispersão de pigmento.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através de um ensaio repórter. Nalgumas concretizações, o referido ensaio repórter é o ensaio repórter CRE-Luc.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através da medição de uma actividade mediada através do aumento de um nivel de AMPc intracelular.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através do ensaio repórter CRE-Luc. Em certas concretizações, é aumentado um nivel de actividade de luciferase.
Nalgumas concretizações, a referida determinação é através da medição da ligação de GTPyS à membrana compreendendo o receptor acoplado a proteína G. Em certas concretizações, o referido GTPyS é marcado com [35S] . Em certas concretizações, é aumentada a referida ligação de GTPyS à membrana compreendendo o GPCR.
Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um lípido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido nem um lípido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido, com a condição de que o polipéptido não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um lípido. Nalgumas concretizações, o composto de teste não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. 16 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Nalgumas concretizações, ο composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de determinar opcionalmente a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de proporcionar opcionalmente o nome ou a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de produzir ou sintetizar opcionalmente o secretagogo de GIP, o composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou o composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formular o secretagogo de GIP, o composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou o composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo numa composição farmacêutica.
Num segundo aspecto, o invento apresenta um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto de um composto in vitro com a célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP, tendo o referido composto sido identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e (b) determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em gue a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de 17 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) determinação de se um composto aumenta um nivel de GIP num vertebrado, através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto, tendo o referido composto sido identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP total. Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP bioactivo.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano. 18 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Nalgumas concretizações, ο composto de teste é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um lípido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido nem um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido, com a condição de que o polipéptido não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste.
Num terceiro aspecto, o invento apresenta um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto de um agonista de GPR119 in vitro com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP; e (b) determinação de se o agonista de GPR119 estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do agonista de GPR119 para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é indicativa do agonista de GPR119 ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido 19 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: determinação de se o agonista de GPR119 aumenta um nivel de GIP no vertebrado, através da medição de um nivel de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um agonista de GPR119 em que a capacidade do agonista de GPR119 para aumentar um nivel de GIP no vertebrado é indicativa do agonista de GPR119 ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o nivel de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP total. Em certas concretizações, o nivel de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática de GIP bioactivo.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano.
Em certas concretizações, 0 agonista de GPR119 é um agonista de um GPR119 endógeno. Em certas concretizações, 0 agonista de GPR119 é um agonista do GPR119 humano. Em certas concretizações, 0 agonista de GPR119 é um agonista parcial de GPR119. Em certas concretizações, 0 agonista de GPR119 é um agonista selectivo de GPR119. 20 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, o agonista de GPR119 é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, a molécula pequena não é um polipéptido. Nalgumas concretizações, a molécula pequena não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, a molécula pequena não é um lipido. Nalgumas concretizações, a molécula pequena não é um polipéptido nem um lipido.
Em certas concretizações, o agonista de GPR119 está oralmente disponível.
Em certas concretizações, o agonista de GPR119 tem um valor de CE50 de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 75 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 15 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 4 nM, menos de cerca de 3 nM, menos de cerca de 2 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, o agonista de GPR119 tem um valor de CE50 de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 75 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 15 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 4 nM, menos de cerca de 3 nM, menos de cerca de 2 nM, ou menos de cerca de 1 nM no GPR119 humano possuindo SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o agonista de GPR119 tem um valor de CE50 de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 75 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 cm, menos de cerca de 15 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 4 nM, menos de cerca de 3 nM, menos de cerca de 2 nM, ou menos de cerca de 1 nM no GPR119 humano possuindo SEQ ID NO:2 no ensaio de adenilil-ciclase (um exemplo de ensaio de adenilil-ciclase é proporcionado no Exemplo 7 e no Exemplo 8, infra). Em certas concretizações, o agonista de GPR119 tem um valor de CE50 de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 75 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 15 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 4 nM, menos de cerca de 3 nM, menos de cerca de 2 nM, ou menos de cerca de 1 nM no GPR119 humano possuindo SEQ ID NO: 2 no 21 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ ensaio de melanóforos (um exemplo de ensaio de melanóforos é proporcionado no Exemplo 9, infra).
Exemplos de agonistas de GPR119 são divulgados, p.ex., no Pedido Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380) ; Pedido Internacional N°. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido
Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 05/007658); Pedido Internacional N°. PCT/US2005/019318 (publicado como WO 2005/121121); Pedido Internacional N°. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido
Internacional N°. PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208) ; Pedido Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional N°. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido
Internacional N°. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); e Pedido Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661).
Em certas concretizações, o método compreende o proporcionar o agonista de GPR119.
Em certas concretizações, o agonista de GPR119 é identificável através de um método de acordo com o primeiro aspecto.
Em certas concretizações, o método compreende a realização de um método de acordo com o primeiro aspecto para identificar o agonista de GPR119. 22 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, o método compreende ter identificado o agonista de GPR119 através de um método de acordo com o primeiro aspecto.
Num quarto aspecto, o invento apresenta a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto de um receptor acoplado a proteína G com um ligando conhecido para o receptor opcionalmente marcado na presença ou ausência de um composto de teste, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que seja amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar ao composto A. (b) detecção do complexo entre o referido ligando conhecido e o referido receptor; e (c) determinação de se é formado menos do referido complexo na presença do composto de teste que na ausência do composto de teste; 23 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ em que a referida determinação é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um alelo de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é recombinante.
Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando ou agonista de um receptor GPCR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um agonista conhecido de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando ou agonista de um receptor GPR119 endógeno humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é idêntico a um composto divulgado em, p.ex., Pedido Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 05/007658); Pedido Internacional N°. PCT/US2005/019318 (publicado como WO 2005/121121); Pedido Internacional N°. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido Internacional N°. PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido Internacional N°. 24 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); Pedido
Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional N°. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido internacional N°. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); ou Pedido Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661) . Em certas concretizações, o ligando conhecido é (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando endógeno de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamifero ou humano.
Em certas concretizações, o ligando conhecido opcionalmente marcado é um ligando conhecido marcado. Em certas concretizações, o ligando conhecido marcado é um ligando conhecido marcado radioactivamente. As técnicas para marcação radioactiva de um composto, tais como para marcação de um ligando conhecido de um receptor acoplado a proteína G do invento, são bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p.ex., Pedido Internacional WO 04/065380. Ver também, p.ex., Exemplo 11, infra.
As técnicas para detecção do complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um composto que se saiba ser um
ligando do receptor acoplado a proteína G são bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p.ex., Pedido internacional WO 04/065380. Ver também, p.ex., Exemplo 12, infra. O invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos (a) a (c) deste quarto aspecto, e compreendendo ainda: (d) opcionalmente a síntese de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c); (e) o contacto in vitro de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c) com uma célula 25 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP; e (f) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente a utilização de um GPCR num método in vitro para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de (a) a (c) deste quarto aspecto, e compreendendo ainda: (d) opcionalmente a síntese de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c); (e) a determinação de se um composto de teste aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição do nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c); em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas 26 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ concretizações, ο vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano. 0 invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de (a) a (c) deste quarto aspecto, e compreendendo ainda: (d) opcionalmente a síntese de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo de acordo com o passo (c); (e) proporcionar opcionalmente um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo de acordo com o passo (c); (f) o contacto in vitro de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo de acordo com o passo (c) com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP; e (g) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et ai., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compostos úteis para prevenção ou tratamento de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou compostos úteis para aumento da massa 27 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ óssea num indivíduo, compreendendo os passos de (a) a (c) deste quarto aspecto, e compreendendo ainda: (d) opcionalmente a síntese de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo de acordo com o passo (c); (e) proporcionar opcionalmente um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo de acordo com o passo (c); (f) a determinação de se um composto de teste aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c); em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano.
Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADN genómico humano.
Nalgumas concretizações, a reacção em cadeia da polimerase é transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). As técnicas de RT-PCR são bem conhecidas dos peritos na arte. Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADNc humano. Em certas concretizações, o ADNc é de um tecido humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhéus pancreáticos. Em certas concretizações, o ADNc é de um tipo celular humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma célula beta pancreática. Em certas concretizações, o ADNc é de uma linha celular pancreática.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um alelo de SEQ ID NO:2. 28 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2, 4] — oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, condições rigorosas de hibridação (p.ex., condições de elevado rigor) compreendem hibridação a 42°C numa solução compreendendo formamida a 50%, SSC 5x (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5χ, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado, seguido de lavagem a 65°C numa solução compreendendo SSC Ο,ΐχ. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos peritos na arte.
Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5- 29 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID N0:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. As técnicas para produção de uma construção de fusão GPCR:G são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Pedido Internacional WO 02/42461).
Em certas concretizações, a referida determinação é realizada utilizando uma célula hospedeira compreendendo o receptor acoplado a proteína G. Em certas concretizações, a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o GPCR. Nalgumas concretizações, o vector de expressão é pCMV. Este vector foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC) a 13 de Outubro de 1998 (10801 30 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins de Processos de Patentes. O ADN foi testado pela ATCC e determinado como sendo viável. A ATCC atribuiu o seguinte número de depósito a pCMV: ATCC #203351. Outros vectores de expressão adequados serão facilmente aparentes aos vulgares peritos na arte, e uma ampla variedade de vectores de expressão está comercialmente disponível (p.ex., em Clontech, Paio Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; e Invitrogen, Carlsbad, CA).
Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de vertebrado. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira de mamífero é seleccionada a partir do grupo que consiste numa célula 293, uma célula 293T, uma célula CHO, uma célula MCB3901, e uma célula COS-7. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula melanóforo. Outras células hospedeiras adequadas serão facilmente aparentes aos vulgares peritos na arte, e uma ampla variedade de linhas celulares está disponível na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 .
Em certas concretizações, a referida determinação é realizada utilizando membrana compreendendo o receptor acoplado a proteina G.
Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido nem um lipido. Nalgumas concretizações, o composto 31 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ de teste é um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido, com a condição de que o polipéptido não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de determinar opcionalmente a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de proporcionar opcionalmente o nome ou a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de produzir ou sintetizar opcionalmente o secretagogo de GIP, o composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou o composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo numa composição farmacêutica.
Noutro aspecto, o invento apresenta um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto de um composto que estimule a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G, em que o referido receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2; 32 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4;
(iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO: 1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar in vitro ao composto A, com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP, tendo o referido composto sido determinado ou identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; e (b) determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. 33 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um alelo de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é recombinante.
Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula pancreática. Ver, p.ex., Xie et al., Bone 2007 uma vez que se refere à expressão pancreática de GIP. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. O invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) determinação de se um composto aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G, em que o referido receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; 34 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO: 1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar ao composto A, tendo o referido composto sido determinado ou identificado através de um método de acordo com o primeiro aspecto; em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um alelo de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é recombinante. 35 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática ou sérica de GIP total. Em certas concretizações, o nível de GIP é a concentração sanguínea ou plasmática ou sérica de GIP bioactivo.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano.
Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADN genómico humano.
Nalgumas concretizações, a reacção em cadeia da polimerase é transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). As técnicas de RT-PCR são bem conhecidas dos peritos na arte. Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADNc humano. Em certas concretizações, o ADNc é de um tecido humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhéus pancreáticos. Em certas concretizações, o ADNc é de um tipo celular humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma célula beta pancreática. Em certas concretizações, o ADNc é de uma linha celular pancreática.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2- 36 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Fluorο-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, condições rigorosas de hibridação (p.ex., condições de elevado rigor) compreendem hibridação a 42°C numa solução compreendendo formamida a 50%, SSC 5x (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5χ, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado, seguido de lavagem a 65°C numa solução compreendendo SSC Ο,ΐχ. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos peritos na arte.
Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID N0:1 é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que hibrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que hibrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que hibrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um receptor para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que hibrida sob condições de elevado rigor com 37 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ ο complemento de SEQ ID N0:1 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID N0:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. As técnicas para produção de uma construção de fusão GPCR:G são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Pedido
Internacional WO 02/42461).
Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um lípido. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido nem um 38 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ lípido. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é um polipéptido, com a condição de que o polipéptido não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é um lípido. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto que estimula a funcionalidade de um receptor acoplado a proteína G é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de determinar opcionalmente a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de proporcionar opcionalmente o nome ou a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de produzir ou sintetizar opcionalmente o secretagogo de GIP, o composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou o composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo como produto farmacêutico.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formulação do secretagogo de GIP, do composto 39 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo numa composição farmacêutica.
Num quarto aspecto, o invento apresenta um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto de um composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de qualquer uma de (i) ou (ii), em que o fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar in vitro ao composto A com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou com uma célula capaz de segregar GIP, tendo o referido composto sido determinado ou identificado através de um método de acordo com o quarto aspecto; e 40 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (b) determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou a partir da célula capaz de segregar GIP é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um alelo de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um ortólogo de mamífero de SEQ ID NO:2.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é recombinante.
Em certas concretizações, a célula enteroendócrina de vertebrado é uma célula enteroendócrina de mamífero. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina é uma célula K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado do intestino delgado. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K. Em certas concretizações, a célula enteroendócrina compreende tecido do duodeno ou do jejuno (ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). Em certas
concretizações, a célula enteroendócrina é uma linha celular enteroendócrina. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP é uma célula pancreática. Ver, p.ex., Xie et al., Bone 2007 uma vez que se refere à expressão pancreática de GIP. Em certas concretizações, a célula capaz de segregar GIP 41 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ é uma célula recombinante concebida para ser capaz de segregar GIP. 0 invento apresenta adicionalmente um método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) determinação de se um composto aumenta um nivel de GIP num vertebrado através da medição de um nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto, em que na presença do referido composto se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID N0:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID N0:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar ao composto A; tendo o referido composto sido determinado ou identificado através de um método de acordo com o quarto aspecto; 42 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é ainda indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o vertebrado é um vertebrado não humano. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o mamífero é um mamífero não humano.
Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADN genómico humano.
Nalgumas concretizações, a reacção em cadeia da polimerase é transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). As técnicas de RT-PCR são bem conhecidas dos peritos na arte. Em certas concretizações, a amostra de ADN humano é ADNc humano. Em certas concretizações, o ADNc é de um tecido humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhéus pancreáticos. Em certas concretizações, o ADNc é de um tipo celular humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma célula beta pancreática. Em certas concretizações, o ADNc é de uma linha celular pancreática.
Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2, 4] — oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]— oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina 43 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ é um agonista. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, condições rigorosas de hibridação (p.ex., condições de elevado rigor) compreendem hibridação a 42°C numa solução compreendendo formamida a 50%, SSC 5x (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5χ, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado, seguido de lavagem a 65°C numa solução compreendendo SSC 0,lx. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos peritos na arte.
Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um receptor para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade 44 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína G. As técnicas para produção de uma construção de fusão GPCR:G são bem conhecidas dos peritos na arte (ver, p.ex., Pedido Internacional WO 02/42461).
Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é uma molécula pequena. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente 45 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ marcado que na ausência do composto é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é uma molécula pequena, com a condição de que a molécula pequena não seja um polipéptido nem um lipido. Nalgumas concretizações, o composto de teste é um polipéptido. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é um polipéptido, com a condição de que o polipéptido não seja um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é um lipido. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto não é um anticorpo nem um fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas concretizações, o composto na presença do qual se forma menos de um complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado que na ausência do composto é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste.
Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando ou agonista de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um agonista conhecido de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando ou agonista de um receptor GPR119 endógeno humano. Em certas concretizações, o ligando conhecido é idêntico a um composto divulgado em, p.ex., Pedido Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 04/065380); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/005555 (publicado como WO 04/076413); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 05/007647); Pedido Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 05/007658); Pedido Internacional N°. PCT/US2005/019318 (publicado como WO 2005/121121); Pedido Internacional N°. PCT/GB2004/050046 (publicado como WO 2005/061489); Pedido Internacional N°. 46 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ PCT/US06/00567 (publicado como WO 2006/083491); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050264 (publicado como WO 2006/067531); Pedido Internacional N°. PCT/GB2005/050265 (publicado como WO 2006/067532); Pedido Internacional N°, PCT/GB2005/050266 (publicado como WO 2006/070208); Pedido
Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661); Pedido Internacional N°. PCT/JP2005/018412 (publicado como WO 06/040966); Pedido Internacional N°. PCT/JP2005/019000 (publicado como WO 2006/043490); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2006/050176 (publicado como WO 2007/003960); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050177 (publicado como WO 2007/003961); Pedido Internacional N°. PCT/GB2006/050178 (publicado como WO 2007/003962); Pedido
Internacional N°. PCT/GB2006/050182 (publicado como WO 2007/003964); ou Pedido Internacional N°. PCT/JP02/09350 (publicado como WO 03/026661). Em certas concretizações, o ligando conhecido é (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o ligando conhecido é um ligando endógeno de um receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero ou humano.
Em certas concretizações, o ligando conhecido opcionalmente marcado é um ligando conhecido marcado. Em certas concretizações, o ligando conhecido marcado é um ligando conhecido marcado radioactivamente. As técnicas para marcação radioactiva de um composto, tais como para marcação de um ligando conhecido de um receptor acoplado a proteína G do invento, são bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p.ex., Pedido Internacional WO 04/065380. Ver também, p.ex., Exemplo 11, infra.
As técnicas para detecção do complexo entre um receptor acoplado a proteína G e um composto que se saiba ser um ligando do receptor acoplado a proteína G são bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p.ex., Pedido Internacional WO 04/065380. Ver também, p.ex., Exemplo 12, infra.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de determinar opcionalmente a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma 47 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o método compreende ainda o passo de proporcionar opcionalmente o nome ou a estrutura do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de produzir ou sintetizar opcionalmente o secretagogo de GIP, o composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou o composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo como produto farmacêutico.
Nalgumas concretizações, o referido método compreende ainda o passo de formulação do secretagogo de GIP, do composto útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, ou do composto útil para aumento da massa óssea num indivíduo numa composição farmacêutica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 0 invento é ilustrado em ligação com as figuras anexas aqui nas quais: A FIG. 1 mostra uma análise farmacodinâmica de um efeito da administração de agonista de GPR119 no nível sanguíneo de GIP em ratinhos de tipo selvagem. A. Uma análise temporal realizada utilizando o Composto 1 como agonista de GPR119. B. Uma análise temporal realizada utilizando o Composto 3 como agonista de GPR119. C. Uma análise de titulação da dose realizada utilizando o Composto 3 como agonista de GPR119. 48 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ A FIG. 2 mostra um efeito da administração de agonista de GPR119 no nivel sanguíneo de GIP em ratinhos deficientes em GPR119 (knock-out) em comparação com ratinhos de tipo selvagem. A. A comparação foi realizada utilizando o
Composto 1 como agonista de GPR119. B. A comparação foi realizada utilizando o Composto 2 como agonista de GPR119.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento apresenta métodos de utilização do receptor GPR119 para identificar secretagogos de GIP, que podem ser úteis para aumento da massa óssea num indivíduo. Os agonistas do receptor GPR119 são úteis como agentes terapêuticos para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e para aumento da massa óssea num indivíduo. 0 presente invento baseia-se, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta pelo Requerente de que a administração de um agonista de GPR119 a um indivíduo, tal como através de administração oral, pode actuar no receptor GPR119 para aumentar um nível de GIP no indivíduo. 0 termo "ligando", tal como aqui se utiliza, deverá significar uma molécula (p.ex., composto de teste) que se liga especificamente a um polipéptido, tal como GPR119. Um ligando pode ser, por exemplo, um polipéptido, um lípido, uma molécula pequena, um anticorpo. 0 Composto 1 é um ligando exemplar do polipéptido receptor GPR119 (ver, Tabela A, que expõe a estrutura química e o nome químico do Composto 1). 0
Composto 1 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina (ver, Tabela A) é um ligando exemplar do polipéptido receptor GPR119. O Composto 2 é um ligando exemplar do polipéptido receptor GPR119. O Composto 2 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente
Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658). O Composto 3 é um ligando exemplar do polipéptido receptor GPR119. O Composto 3 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647) . Um ligando 49 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ endógeno é um ligando que é um ligando endógeno e natural para um polipéptido nativo, tal como GPR119. Um ligando pode ser um "antagonista", "agonista", "agonista parcial", ou "agonista inverso", ou semelhante.
TABELA A
0 termo "agonista", tal como aqui se utiliza, deverá significar um agente (p.ex., ligando, composto de teste) que em virtude da ligação a um GPCR activa o GPCR de modo a desencadear uma resposta intracelular mediada pelo GPCR. 0 termo "agonista parcial", tal como aqui se utiliza, deverá significar um agente (p.ex., ligando, composto de teste) que em virtude da ligação a um GPCR activa o GPCR de modo a desencadear uma resposta intracelular mediada através do GPCR, apesar de numa menor extensão ou grau que o agonista inteiro. 0 termo "antagonista" deverá significar um agente (p.ex., ligando, composto de teste) que se liga, e de preferência se liga competitivamente, a um GPCR aproximadamente no mesmo local que um agonista ou agonista parcial mas que não activa uma resposta intracelular iniciada pela forma activa do GPCR, e pode deste modo inibir a resposta intracelular através do agonista ou agonista parcial. Um antagonista tipicamente não diminui a resposta intracelular limiar na ausência de um agonista ou agonista parcial. 50 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ Ο termo "agonista inverso" deverá significar um agente (p.ex., ligando, composto de teste) que se liga a um GPCR e que inibe a resposta intracelular limiar iniciada pela forma activa do receptor abaixo da actividade biológica de nivel basal normal que é observada na ausência de um agonista ou agonista parcial. O termo "agonista de GPR119," tal como aqui se utiliza, refere-se a um composto que se liga ao receptor GPR119 e actua como agonista. O Composto 1 é um agonista exemplar de GPR119 (ver, Tabela A, que expõe a estrutura quimica e o nome quimico do Composto 1). O Composto I é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2-Fluoro- 4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol- 5- il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista de GPR119 exemplar. O Composto 2 é um agonista de GPR119 exemplar. O Composto 2 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658). O Composto 3 é um agonista de GPR119 exemplar. O Composto 3 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647). O termo "agonista selectivo de GPR119", tal como aqui se utiliza, refere-se a um agonista de GPR119 possuindo selectividade para o receptor GPR119 em comparação com um ou mais receptores aparentados, tais como o receptor do factor de libertação da corticotrofina-1 (CRF-1). O Composto 1 é um agonista selectivo de GPR119 exemplar (ver, Tabela A, que expõe a estrutura quimica e o nome quimico do Composto 1) . O Composto 1 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista selectivo de GPR119 exemplar. O Composto 2 é um agonista selectivo de GPR119 exemplar. O Composto 2 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658) . O Composto 3 é um agonista selectivo de GPR119 exemplar. O Composto 3 é idêntico a um 51 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647). O termo "secretagogo de GIP" deverá significar um agente (p.ex., ligando, composto de teste) que promove a secreção de GIP numa célula, p.ex. uma célula enteroendócrina, ou que aumenta um nivel de GIP total, p.ex. um nivel de GIP total sanguíneo ou plasmático, após administração a um indivíduo tal como um vertebrado ou um mamífero. Em certas concretizações, um secretagogo de GIP é um composto adequado para aumento de um nível de GIP total num indivíduo, por exemplo um nível de GIP total sanguíneo ou plasmático. O termo "indivíduo", tal como aqui se utiliza, refere-se a um vertebrado, incluindo mas não se limitando a peixes (tal como peixes comerciais de viveiro, peixe de estimação, etc.), anfíbios (tais como rãs, sapos, anfíbios de estimação, etc.), répteis (tais como cobras, lagartos, tartarugas, répteis de estimação, etc.), aves (tais como galinhas, perus, aves de estimação, etc.) e mamíferos (tais como ratinhos, ratos, hamsters, coelhos, porcos, cães, gatos, cavalos, vacas, ovelhas, cabras, primatas não humanos, mamíferos não humanos, mamíferos não humanos de estimação, humanos, etc.). Em certas concretizações, 0 indivíduo é um peixe. Em certas concretizações, 0 indivíduo é um anfíbio. Em certas concretizações, 0 indivíduo é um réptil. Em certas concretizações, 0 indivíduo é uma ave. Em certas concretizações, o indivíduo é um peru. Ao longo dos últimos 25 anos, a pressão de selecção comercial para perus com maior massa muscular peitoral colocou exigências crescentes na integridade esquelética. A crescente massa muscular peitoral, no entanto, não foi acompanhada pelas alterações compensatórias no esqueleto, com o resultado de que a indústria de perus teve um aumento de problemas nas pernas. Foi relatada fractura dos ossos longos em perus machos jovens adultos. (Ver, p.ex., Crespo et al., Poult. Sei. (2000) 79: 602-608). Em certas concretizações, o indivíduo é um mamífero. Em certas concretizações, o indivíduo é um ratinho, um rato, um hamster, um coelho, um porco, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um primata não humano ou um humano (que pode ser incluído individualmente nas concretizações do invento ou em qualquer combinação). Em 52 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ certas concretizações, ο indivíduo é um cavalo. Cavalos de equitação, que são cavalos envolvidos em actividades tais como corridas, dressage e outros eventos competitivos, são susceptíveis a fracturas ósseas. Em certas concretizações, o indivíduo é um cão ou um gato. Em certas concretizações, o indivíduo é um animal de companhia dos humanos (tal como um cão, um gato, etc.), uma animal de quinta (tal como uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um porco, uma galinha, etc.), um animal de desporto (tal como um cavalo, um cão, etc.), uma besta de carga (tal como uma mula, um camelo, etc.) ou um animal exótico (tal como um animal que se encontre num zoológico, etc.), que pode ser incluído individualmente nas concretizações do invento ou em qualquer combinação. Em certas concretizações, o indivíduo é um mamífero não humano. Em certas concretizações, o indivíduo é um primata não humano (tal como um macaco rhesus, um chimpanzé, etc.). Em certas concretizações, o indivíduo é um humano. 0 termo "a necessitar de prevenção ou tratamento" tal como aqui se utiliza refere-se a uma avaliação feita por um prestador de cuidados médicos (p.ex. médico, enfermeiro, profissional de enfermagem no caso de humanos; veterinário no caso de vertebrados não humanos, e numa concretização particular mamíferos não humanos) de que um indivíduo requer ou beneficiará do tratamento. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz" tal como aqui se utiliza refere-se à quantidade de composto activo ou agente farmacêutico que desencadeia a resposta biológica ou medicinal num tecido, sistema, animal, indivíduo ou humano que esteja a ser considerado por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui um ou mais dos seguintes: (1) Prevenção da doença; por exemplo, prevenção de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que pode estar predisposto para a doença, condição ou distúrbio mas ainda não sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, (2) Inibição da doença; por exemplo, inibição de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (i.e., paragem do desenvolvimento da patologia e/ou sintomatologia), e 53 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (3) Melhoria da doença; por exemplo, melhoria de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (i.e., reversão da patologia e/ou sintomatologia). 0 termo "eficácia terapêutica" tal como aqui se utiliza refere-se a um desencadeamento da resposta biológica ou medicinal num tecido, sistema, animal, indivíduo ou humano que esteja a ser considerado por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui um ou mais dos seguintes: (1) Prevenção da doença; por exemplo, prevenção de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que pode estar predisposto à doença, condição ou distúrbio mas ainda não sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, (2) Inibição da doença; por exemplo, inibição de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (i.e., paragem do desenvolvimento da patologia e/ou sintomatologia), e (3) Melhoria da doença; por exemplo, melhoria de uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (i.e., reversão da patologia e/ou sintomatologia). 0 termo "quantidade que é eficaz para prevenir" refere-se à quantidade de fármaco que prevenirá ou reduzirá o risco de ocorrência do evento biológico ou médico que se está a considerar prevenir. Em muitos casos, a quantidade que é eficaz para prevenir é a mesma que a quantidade terapeuticamente eficaz. 0 termo "composição" deverá significar um material compreendendo pelo menos um componente. 0 termo "ingrediente activo" deverá significar qualquer componente que proporciona actividade farmacológica ou outro efeito directo no diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença. 0 termo "composição farmacêutica" deverá significar uma composição compreendendo pelo menos um ingrediente activo, 54 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ através do qual a composição é passível de investigação e tratamento num mamífero.
Por "farmaceuticamente aceitável" entenda-se que o transportador, veículo, diluente, excipientes, e/ou sal têm de ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação, e não prejudiciais para o receptor destes. 0 termo "forma de dosagem" deverá significar a forma física na qual é produzido e dispensado um fármaco, tal como um comprimido, uma cápsula ou um injectável.
Por "osso" designa-se o tecido conjuntivo denso, semi-rígido, poroso, calcificado que forma a maior parte do esqueleto da maioria dos vertebrados, compreendendo uma matriz orgânica densa e um componente mineral inorgânico. 0 osso é qualquer uma das numerosas estruturas anatomicamente distintas constituindo o esqueleto de um vertebrado.
Os termos "massa óssea" e "densidade mineral óssea (DMO)" são aqui utilizados alternadamente. A DMO em humanos é habitualmente medida através de uma técnica radiográfica padrão, absorciometria de raios X de dupla energia (DXA). Das muitas técnicas desenvolvidas para avaliar a DMO, a DXA é a mais altamente desenvolvida tecnicamente e a mais cuidadosamente validada biologicamente. A tecnologia de DXA, com suporte lógico adequadamente adaptado, pode também ser utilizada para avaliar com confiança a DMO em estudos animais. A DXA é utilizada no diagnóstico de osteoporose, prognóstico (previsão de fracturas), monitorização da história natural do distúrbio e avaliação da resposta ao tratamento. 0 termo "baixa massa óssea" tal como aqui se utiliza refere-se a uma qualquer diminuição ou redução na densidade mineral óssea (DMO) num indivíduo, e inclui tanto osteoporose como osteopenia tal como definido em propostas da Organização Mundial de Saúde (OMS) . A OMS definiu o normal como um valor de DMO dentro de um desvio padrão da média de referência do adulto jovem (registo T á -1). A OMS definiu osteopenia como um valor de DMO mais de 1 desvio padrão abaixo da média do adulto jovem, mas menos de 2,5 desvios padrão abaixo deste valor (registo de T < -1 e > -2,5). A OMS caracterizou a 55 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ osteoporose como uma forma mais grave de osteopenia, e definiu-a através de um valor de DMO de 2,5 desvios padrão ou mais abaixo da média do adulto jovem (registo de T d -2,5). (Ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis", cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Mais vulgarmente, a osteopenia é definida como um registo de T de menos de -1 e mais de -2, e a osteoporose é definida como um registo de τ de menos de ou igual a -2. Em certas concretizações do presente invento, o registo de T é medido na anca com DXA. 0 termo "osteoporose" tal como aqui se utiliza é definido através de um valor de DMO 2 desvios padrão ou mais abaixo da média de referência do adulto jovem (registo de T < -2) ou refere-se a um diagnóstico feito por um prestador de cuidados médicos (p.ex. médico, enfermeiro, profissional de enfermagem no caso de humanos; veterinário no caso de vertebrados não humanos). A osteoporose pode ser classificada como primária ou secundária. (Ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis") . Tal como aqui se utiliza, o termo "osteoporose" engloba osteoporose primária e osteoporose secundária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária. A "osteoporose primária" tal como aqui se utiliza está associada a menopausa (natural, prematura ou cirúrgica), envelhecimento ou ambos. Deverá entender-se que no presente invento, a osteoporose primária associada a menopausa (natural, prematura ou cirúrgica), a osteoporose primária associada a envelhecimento e a osteoporose primária associada a menopausa e envelhecimento podem ser incluídas individualmente nas concretizações ou em qualquer combinação. A "osteoporose secundária" tal como aqui se utiliza refere-se a uma osteoporose que está associada não a menopausa ou ao envelhecimento mas antes a condições médicas ou à utilização de medicamentos ou drogas. Um maior risco de 56 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ osteoporose está associado a um hospedeiro de condições médicas, incluindo mas não se limitando a distúrbios endócrinos e metabólicos, e doença maligna, e à utilização de certas medicações e fármacos, cujos exemplos são bem conhecidos dos peritos na arte (ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis"; Williams Textbook of Endocrinology, 10a Edição; cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade). A osteoporose secundária pode também estar associada a imobilização. Um diagnóstico de osteoporose secundária a uma condição médica, à utilização de um medicamento ou fármaco, ou à imobilização pode ser feito por um prestador de cuidados médicos (p.ex. médico, enfermeiro, profissional de enfermagem no caso de humanos; veterinário no caso de vertebrados não humanos).
Por "fractura óssea" entenda-se uma quebra, ruptura ou fissura completa ou incompleta de um osso. O diagnóstico de fracturas depende normalmente do exame clínico e das descobertas radiológicas. No invento, fracturas ósseas incluem, mas não se limitam a, fracturas traumáticas, fracturas de longo prazo, e fracturas patológicas. "Fractura traumática" tal como aqui se utiliza deverá referir-se a uma fractura imediata que envolve um traumatismo supraliminal com um grau de violência local que excede a elasticidade natural do osso. Pode ser acompanhada de lesão simultânea nos tecidos moles e muito frequentemente da pele. Uma fractura traumática pode ser fechada (o tecido mole adjacente pode estar lesionado mas as partes moles a cobrir estão grandemente preservadas). Uma fractura traumática pode ser exposta (as extremidades quebradas do osso ficam frequentemente libertas por lesão extensiva do tecido molde de modo que os patogénios de fora podem entrar directamente na ferida). A "fractura de longo prazo" tal como aqui se utiliza deverá referir-se a uma fractura crónica, fractura de fadiga, fractura de esforço ou fractura espontânea de tipo I. A "fractura patológica" tal como aqui se utiliza deverá referir-se a uma fractura espontânea de tipo II. Uma fractura 57 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ patológica surge espontaneamente, sem haver traumatismo adequado responsável por tal. 0 osso pode ter sido previamente danificado, por uma doença sistémica (p.ex., osteoporose, osteodistrofia ou osteite deformante de Paget) ou por uma lesão local do osso (p.ex., metástase, rádio-osteonecrose ou tumor ósseo). Ver, Adler, Claus-Peter, Bone Diseases, pág. 114 (Springer-Verlag, Alemanha 2000) .
As fracturas também incluem, mas não se limitam a, fractura de torção obliqua, fractura transversa, fractura cominutiva, fractura de compressão, fracturas das costelas, fractura de deformação, e colo do fémur fracturado (Adler, Claus-Peter, Bone diseases, Springer-Verlag, Alemanha (2000)).
Tal como aqui se utiliza, o termo "condição caracterizada por baixa massa óssea" inclui mas não se limita a osteopenia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática infantil, curvatura da coluna vertebral e perda de peso. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada a uma condição médica. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada à utilização de um medicamento ou droga. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada a imobilização. Condições caracterizadas por baixa massa óssea incluem também, mas não se limitam a, doença de Paget, perda óssea devido a cancro metastático e lesões osteoliticas tais como as causadas por doença neoplásica, radioterapia ou quimioterapia. Condições caracterizadas por baixa massa óssea incluem também, mas não se limitam a, complicações de longo prazo da osteoporose tal como curvatura da coluna vertebral, perda de peso e cirurgia prostética. Será entendido que no presente invento, condições caracterizadas por baixa massa óssea podem ser incluídas individualmente nas concretizações ou em qualquer combinação. (Ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis"; Williams Textbook of Endocrinology, 10a Edição, Larsen et al., Eds. (2002), W.B. Saunders Company; e Endocrinology and Metabolism, 4a Edição, Felig et ai., Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; cuja 58 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ divulgação de cada é aqui incorporada por referência na sua totalidade).
Tal como aqui se utiliza, "doença óssea" refere-se a um distúrbio ou condição relacionado com anomalia do osso. Doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com o invento, através de aumento da massa óssea ou crescimento de osso, incluem mas não se limitam a osteopenia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática infantil, curvatura da coluna vertebral, e perda de peso. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada a uma condição médica. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada à utilização de um medicamento ou droga. Em certas concretizações, a osteoporose secundária está associada a imobilização. Doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com o invento, através de aumento da massa óssea ou de crescimento de osso, incluem também, mas não se limitam a, doença de Paget e perda óssea devido a cancro metastático. Distúrbios destrutivos do osso que podem ser tratados de acordo com o invento, através de aumento da massa óssea ou crescimento, incluem mas não se limitam a osteoporose, osteoartrite, e lesões osteoliticas tais como as causadas por doença neoplásica, radioterapia, ou quimioterapia. Será entendido que no presente invento, doenças ósseas que podem ser tratadas de acordo com o invento, através de aumento da massa óssea ou crescimento, podem ser incluídas individualmente nas concretizações ou em qualquer combinação. (Ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of
Osteoporosis"; Williams Textbook of Endocrinology, 10a Edição, Larsen et ai., Eds. (2002), W.B. Saunders Company; e "Endocrinology and Metabolism", 4a Edição, Felig et ai., Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; cuja divulgação de cada é aqui incorporada por referência na sua totalidade). O presente invento refere-se também a outras condições que beneficiam de tratamento de acordo com o invento, através do aumento da massa óssea ou do crescimento ósseo, incluindo 59 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ mas não se limitando a maior cicatrização óssea após reconstrução facial, reconstrução maxilar, reconstrução mandibular, doença periodontal ou extracção dentária, maior extensão dos ossos longos, maior crescimento interno prostético e maior sinostose óssea. 0 termo "endógeno" deverá significar um material que um indivíduo (por exemplo, e não como limitação, um humano) produz naturalmente. Em contraste, "não endógeno" deverá significar que não é produzido naturalmente por um indivíduo (por exemplo, e não como limitação, um humano). 0 termo "fragmento biologicamente activo" de um receptor acoplado a proteína G deverá significar um fragmento do GPCR possuindo funções estruturais e bioquímicas de um GPCR de ocorrência natural. Em certas concretizações, o fragmento biologicamente activo acopla-se a uma proteína G. Em certas concretizações, o fragmento biologicamente activo liga-se a um ligando conhecido do GPCR. 0 termo "iniciador" é aqui utilizado para significar uma sequência nucleotídica específica que é complementar a uma sequência nucleotídica alvo e utilizada para hibridar com a sequência nucleotídica alvo. Um iniciador serve como ponto de iniciação para a polimerização nucleotídica catalisada pela ADN-polimerase, ARN-polimerase ou transcritase reversa. 0 termo "vector de expressão" deverá significar uma sequência de ADN que é necessária para a transcrição de ADN clonado e tradução do ARNm transcrito numa célula hospedeira apropriada para o vector de expressão. Um vector de expressão apropriadamente construído deverá conter uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras, marcadores seleccionáveis, um número limitado de locais de enzimas de restrição úteis, um potencial para elevado número de cópias, e promotores activos. 0 ADN clonado a transcrever está operativamente ligado a um promotor constitutivamente ou condicionalmente activo no vector de expressão. 0 termo "célula hospedeira" deverá significar uma célula capaz de possuir um vector nela incorporado. No presente contexto, o vector conterá tipicamente ácido nucleico 60 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ codificando um GPCR ou uma proteína de fusão de GPCR em ligação operativa com uma sequência promotora adequada para permitir que ocorra a expressão do GPCR ou da proteína de fusão de GPCR. Numa concretização particular, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica. Em certas concretizações, a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira de mamífero. Em certas concretizações, a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira de levedura. Em certas concretizações, a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira melanóforo. O termo "contacto" ou "contactar" deverá significar colocar pelo menos duas porções juntas. O termo "modular" ou "modificar" deverá ser tido como referindo-se a um aumento ou uma diminuição na quantidade, qualidade, ou efeito de uma determinada actividade, função ou molécula. Para fins de ilustração e não como limitação, agonistas, agonistas parciais, agonistas inversos, e antagonistas de um receptor acoplado a proteína G são moduladores do receptor. O termo "molécula pequena" deverá ser tido como significando um composto possuindo um peso molecular de menos de cerca de 10000 gramas por mole, incluindo um péptido, peptidomimético, aminoácido, análogo de aminoácido, polinucleótido, análogo de polinucleótido, nucleótido, análogo de nucleótido, composto orgânico ou composto inorgânico (i.e. incluindo um composto heterorgânico ou composto organometálico), e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis deste. Em certas concretizações, moléculas pequenas são compostos orgânicos ou inorgânicos possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole. Em certas concretizações, moléculas pequenas são compostos orgânicos ou inorgânicos possuindo um peso molecular de menos de cerca de 1000 gramas por mole. Em certas concretizações, moléculas pequenas são compostos orgânicos ou inorgânicos possuindo um peso molecular de menos de cerca de 800 gramas por mole. Em certas concretizações, moléculas pequenas são compostos orgânicos ou inorgânicos possuindo um peso molecular de menos de cerca de 600 gramas por mole. Em certas concretizações, moléculas pequenas são compostos 61 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ orgânicos ou inorgânicos possuindo um peso molecular de menos de cerca de 500 gramas por mole.
As abreviaturas dos aminoácidos aqui utilizadas são expostas na Tabela B:
TABELA B
ALANINA ALA A ARGININA ARG R ASPARAGINA ASN N ÁCIDO ASPÁRTICO ASP D CISTEÍNA CYS C ÁCIDO GLUTÂMICO GLU E GLUTAMINA GLN Q GLICINA GLY G HISTIDINA HIS H ISOLEUCINA ILE I LEUCINA LEU L LISINA LYS K METIONINA MET M FENILALANINA PHE F PROLINA PRO P SERINA SER S TREONINA THR T TRIPTOFANO TRP w TIROSINA TYR Y VALINA VAL V O termo "polipéptido" deverá referir-se a um polimero de aminoácidos independentemente do comprimento do polimero. Assim, são incluídos péptidos, oligopéptidos e proteínas na definição de polipéptido. Este termo também não especifica ou exclui modificações pós-expressão de polipéptidos. Por exemplo, polipéptidos que incluam a ligação covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos e semelhantes são expressamente englobados pelo termo polipéptido. O termo "polinucleótido" deverá referir-se a uma sequência de ARN, ADN ou híbrida de ARN/ADN de mais de um nucleótido na forma de cadeia simples ou duplex. Os polinucleótidos do invento podem ser preparados através de 62 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ qualquer método conhecido, incluindo geração sintética, recombinante, ex vivo ou uma combinação destas, bem como utilizando quaisquer métodos de purificação conhecidos na arte.
Pretende-se aqui que o termo "anticorpo" englobe anticorpo monoclonal e anticorpo policlonal. 0 termo "mensageiro secundário" deverá significar uma resposta intracelular produzida em resultado da activação de um receptor. Um mensageiro secundário pode incluir, por exemplo, inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), actividade de MAP-cinase, actividade de MAPK/ERK-cinase-cinase-1 (MEKKl), e Ca2+. A resposta do mensageiro secundário pode ser medida para uma determinação da activação do receptor. 0 termo "funcionalidade do receptor" deverá referir a operação normal de um receptor para receber um estímulo e moderar um efeito na célula, incluindo mas não se limitando à regulação da transcrição génica, regulação do influxo ou efluxo de iões, realização de uma reacção catalítica e/ou actividade de modulação através de proteínas G, tal como o desencadeamento de uma resposta de mensageiro secundário. 0 termo "estimular" ou "estimulação", em relação ao termo "resposta" ou "funcionalidade do receptor" deverá significar que uma resposta ou uma funcionalidade do receptor é aumentada na presença de um composto em oposição à ausência do composto. 0 termo "inibir" ou "inibição", em relação ao termo "resposta" ou "funcionalidade do receptor" deverá significar que uma resposta ou funcionalidade do receptor é diminuída ou prevenida na presença de um composto em oposição à ausência do composto. 0 termo "eficácia do composto" deverá significar uma medição da capacidade de um composto para inibir ou estimular a funcionalidade do receptor, em oposição à afinidade de ligação do receptor. 0 termo "composto de teste", aqui utilizado alternadamente com "composto candidato", deverá significar uma molécula (por exemplo, e não como limitação, um composto 63 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ químico) que é passível de ser sujeito a uma técnica de pesquisa. 0 termo "constitutivamente activo" em relação a um receptor acoplado a proteína G deverá significar que o receptor acoplado a proteína G exibe actividade independente de agonista. 0 termo "identificação directa" ou "identificado directamente", em relação à frase "composto de teste", deverá significar a pesquisa de um composto contra um receptor acoplado a proteína G na ausência de um ligando conhecido (p.ex., um agonista conhecido) ao receptor acoplado a proteína G.
Quando é proporcionado um intervalo de valores, entende-se que cada valor interveniente, até ao décimo do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor afirmado ou interveniente nesse intervalo afirmado, está englobado pelo invento. 0 limite superior e inferior destes intervalos menores podem estar independentemente incluídos nos intervalos menores, e estão também englobados no invento, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo afirmado. Quando o intervalo afirmado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos esses limites incluídos estão também incluídos no invento. A. Introdução A ordem das seguintes secções é exposta para eficiência de apresentação e não se pretende, nem deve ser entendida, como uma limitação da divulgação ou das reivindicações que se seguem. B. Expressão do Receptor 1. Polipéptidos GPCR de interesse
Um GPCR do invento pode compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 1-335 de SEQ ID N0:2; 64 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (b) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; (c) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a
proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 4; (d) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l; (e) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; (f) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (g) um fragmento biologicamente activo de qualquer uma de (a) ou (b), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar ao composto A.
Em certas concretizações, um GPCR do invento compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor acoplado a proteína G endógeno. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase e que é um receptor acoplado a proteína G endógeno é um receptor acoplado a proteína G de mamífero. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase e que é um receptor acoplado a proteína G endógeno é um receptor GPR119 de mamífero. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção 65 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ em cadeia da polimerase liga-se especificamente ao Composto 1 (ver Tabela A, que expõe a estrutura quimica e o nome quimico do Composto 1). Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteina G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o
Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteina G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-l-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o
Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2-fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 66 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G codificado pelo polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, o ADN humano é ADN genómico.
Nalgumas concretizações, a reacção em cadeia da polimerase é transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). As técnicas de RT-PCR são bem conhecidas dos peritos na arte. Nalgumas concretizações, o ADN humano é ADNc humano derivado de um tecido ou tipo celular que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o tecido humano que expressa GPR119 é pâncreas ou ilhéus pancreáticos. Em certas concretizações, o ADNc é de um tipo celular humano que expressa GPR119. Nalgumas concretizações, o ADNc é de uma linha celular beta pancreática. Nalgumas concretizações, o GPCR do invento é recombinante. Nalgumas concretizações, o GPCR recombinante é GPR119 humano recombinante.
Em certas concretizações, o GPCR que pode ser utilizado nos métodos sujeitos exibe um nível detectável de actividade constitutiva.
Nalgumas concretizações, o GPCR do invento é endógeno. Nalgumas concretizações, o GPCR do invento é um GPR119 de mamífero. Nalgumas concretizações, o GPCR do invento que é endógeno é um GPR119 de mamífero.
Para fins de ilustração e não como limitação, é considerada a deleção de um resíduo de metionina N-terminal para proporcionar um fragmento biologicamente activo que possa ser utilizado no presente invento. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento 67 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA (da hemaglutinina do vírus da gripe) que se liga especif icamente ao Composto 1. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA (da hemaglutinina do vírus da gripe) que se liga especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA que se liga especif icamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]— oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI5o no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA que se liga especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com o referido péptido no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo 68 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ com ο Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com o referido péptido no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Nalgumas concretizações, um fragmento biologicamente activo do invento é um fragmento opcionalmente fundido no seu terminal N com um péptido compreendendo um resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA que exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento. Em certas concretizações, o fragmento é fundido no seu terminal N com um péptido consistindo essencialmente num resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA. As técnicas para fusão de um péptido compreendendo ou consistindo essencialmente num resíduo de metionina N-terminal e uma etiqueta de epitopo HA ao terminal N de um fragmento polipeptídico são bem conhecidas na arte e podem ser obtidas comercialmente (p.ex., Clontech, Mountain View, CA).
Uma variante alélica do GPR119 humano de SEQ ID NO:2 é considerada como estando dentro do âmbito do invento. O GPR119 humano é considerado como estando dentro do âmbito do invento.
Uma variante que é um ortólogo de vertebrado do GPR119 humano de SEQ ID NO:2 é considerada como estando dentro do âmbito do invento. Uma variante que é um ortólogo de mamífero do GPR119 humano de SEQ ID NO:2 é considerada como estando 69 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ dentro do âmbito do invento. Para fins de ilustração e não como limitação, o GPR119 de ratinho (p.ex., N°. de Entrada em GenBank® AY288423), GPR119 de rato (N°. de Entrada em GenBank® AAN95195), GPR119 de hamster, GPR119 de cão, e GPR119 de primata não humano são considerados como estando dentro do âmbito do invento.
Uma variante de SEQ ID NO:2 possuindo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com SEQ ID NO:2 é considerada como estando dentro do âmbito do invento. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 possuindo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com SEQ ID NO:2 é um GPCR. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um GPCR endógeno. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 é um GPCR não endógeno. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 que é um GPCR endógeno é um GPCR de mamifero. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente ao Composto 1. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o
Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 70 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 100 ηΜ, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ED NO: 2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 exibe um nivel detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nivel de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento. A percentagem de identidade pode ser determinada convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos.
Em certas concretizações, um GPCR variante que pode ser utilizado nos presentes métodos tem uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com SEQ ID NO:2. Por GPCR variante possuindo, por exemplo, 95% de "identidade" com SEQ ID NO:2 entenda-se que a sequência de aminoácidos da variante é idêntica aos aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2 excepto que pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de SEQ ID NO:2. Assim, para obter por exemplo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácidos na sequência podem ser inseridos, suprimidos ou substituídos por 71 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ outros aminoácidos em comparação com os aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2. Estas alterações podem ocorrer nos terminais amino ou carboxilo ou em qualquer parte entre essas posições terminais, dispersas provavelmente entre resíduos na sequência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência.
Em certas concretizações, um receptor acoplado a proteína G variante que pode ser utilizado nos presentes métodos é um receptor acoplado a proteína G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 através de deleção, substituição e/ou adição de um ou vários aminoácidos. Em certas concretizações, um receptor acoplado a proteína G variante que pode ser utilizado nos presentes métodos é um receptor acoplado a proteína G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 através de não mais de 10 substituições de aminoácidos conservativas e/ou não mais de 3 substituições de aminoácidos não conservativas na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, arginina, lisina e histidina podem substituir-se conservativamente umas às outras; ácido glutâmico e ácido aspártico podem substituir-se conservativamente um ao outro; glutamina e asparagina podem substituir-se conservativamente uma à outra; leucina, isoleucina e valina podem substituir-se conservativamente umas às outras; fenilalanina, triptofano e tirosina podem substituir-se conservativamente uns aos outros; e glicina, alanina, serina, treonina e metionina podem substituir-se conservativamente umas às outras. As substituições de aminoácidos, deleções de aminoácidos e adições de aminoácidos podem ser em qualquer posição (p.ex., posições no terminal C ou N, ou internas). Nalgumas concretizações, a variante é um receptor acoplado a proteína G endógeno. Nalgumas concretizações, a variante é um receptor acoplado a proteína G de vertebrado endógeno. Nalgumas concretizações, a variante é um receptor acoplado a proteína G de mamífero endógeno. Nalgumas concretizações, a variante é um receptor acoplado a proteína G humano endógeno. Nalgumas concretizações, a variante é um receptor acoplado a proteína G não endógeno. Nalgumas concretizações, a variante exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento do AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão 72 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ do pigmento. Em certas concretizações, o referido receptor acoplado a proteína G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 é um receptor acoplado a proteina G para o qual o Composto 1 é um ligando. Em certas concretizações, o referido receptor acoplado a proteina G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 é um receptor acoplado a proteina G para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um ligando possuindo um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, o referido receptor acoplado a proteina G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 é um receptor acoplado a proteina G para o qual o Composto 1 é um agonista. Em certas concretizações, o referido receptor acoplado a proteina G possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:2 é um receptor acoplado a proteina G para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM.
Uma variante de SEQ ID NO:2 que é um receptor acoplado a proteina G compreendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, ou pelo menos 100 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:2 é considerada como estando dentro do âmbito do invento. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 compreendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, ou pelo menos 100 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:2 é um GPCR. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um GPCR endógeno. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um GPCR não endógeno. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 que é um GPCR endógeno é um GPCR de mamífero. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 liga-se 73 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ especificamente ao Composto 1. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2, 4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, a variante de SEQ ID NO:2 é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Nalgumas concretizações, a variante de SEQ ID NO: 2 exibe um nivel detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nivel de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células 74 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ melanóforos sofram dispersão do pigmento. Nalgumas concretizações, o receptor acoplado a proteína G compreendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, ou pelo menos 100 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:2 exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Nalgumas concretizações, um GPCR variante que pode ser utilizado nos presentes métodos é um GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um GPCR endógeno. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um GPCR não endógeno. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l e que é um GPCR endógeno é um GPCR endógeno de mamífero. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é SEQ ID NO:2 ou um alelo desta. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um alelo de SEQ ID NO:2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um ortólogo de SEQ ID NO: 2. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente ao Composto 1. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanesulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente a (2-Fluoro-4- 75 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o
Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 50 μΜ, menos de cerca de 25 μΜ, menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l liga-se especificamente a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina com um valor de CI50 no ensaio de ligação ao receptor de acordo com o
Exemplo 12, infra, de menos de cerca de 10 μΜ, menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 500 nM, menos de cerca de 100 nM, ou menos de cerca de 50 nM. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l é um receptor para o qual (2-Fluoro-4- metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com o Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 5 μΜ, menos de cerca de 1 μΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Em certas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com 0 complemento de SEQ ID NO:l é um receptor para o qual (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina é um agonista possuindo um valor de CE50 no referido receptor no ensaio de adenilil-ciclase de células inteiras de acordo com 0 Exemplo 8, infra, de menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, ou menos de cerca de 1 nM. Nalgumas concretizações, o GPCR codificado por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:l exibe um nível detectável de actividade constitutiva. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a 76 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos peritos na arte. Nalgumas concretizações, condições rigorosas de hibridação (p.ex., condições de elevado rigor) incluem incubação de um dia para o outro a 42°C numa solução compreendendo: formamida a 50%, SSC 5χ (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de adn de esperma de salmão fragmentado, desnaturado; seguido de lavagem do filtro em SSC 0,lx a cerca de 65°C. Nalgumas concretizações, condições rigorosas de hibridação (p.ex., condições de elevado rigor) incluem incubação de um dia para o outro a 42°C numa solução compreendendo: formamida a 50%, SSC 5χ (SSC lx = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5χ, sulfato de dextrano a 10%, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado; seguido de uma lavagem em SSC Ο,ΐχ/SDS a 0,1% (dodecilsulfato de sódio) ou em SSC 0,2x/SDS a 0,1% a cerca de 50°C, a cerca de 55°C, a cerca de 60°C ou a cerca de 65°C. Nalgumas concretizações, as referidas condições de elevado rigor compreendem lavagem a 65°C com SSC 0,1χ. Nalgumas concretizações, as referidas condições de elevado rigor compreendem lavagem a cerca de 50°C, a cerca de 55°C, a cerca de 60°C, ou a cerca de 65° com SSC Ο,ΐχ/SDS a 0,1% ou com SSC 0,2x/SDS a 0,1%.
Nalgumas concretizações, um GPCR que pode ser utilizado nos presentes métodos é um receptor não endógeno, constitutivamente activado compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, em que a leucina na posição de aminoácido 224 de SEQ ID NO:2 é substituída por um aminoácido diferente de leucina. Nalgumas concretizações, o aminoácido diferente de leucina é lisina. Nalgumas concretizações, o aminoácido diferente de leucina é alanina. Nalgumas concretizações, o aminoácido diferente de leucina é arginina. Nalgumas concretizações, o aminoácido diferente de leucina é histidina. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nivel de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento. 77 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, um GPCR do invento compreende uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID N0:2. Nalgumas concretizações, a versão constitutivamente activa do receptor é uma versão constitutivamente activa endógena possuindo SEQ ID NO:2. Nalgumas concretizações, a versão constitutivamente activa do receptor é uma versão constitutivamente activa não endógena possuindo uma mutação posicionada na posição de aminoácido 224 de SEQ ID N0:2. Nalgumas concretizações, o resíduo mutado foi mutado para um resíduo diferente de leucina. Nalgumas concretizações, o resíduo mutado foi mutado para um resíduo de lisina. Nalgumas concretizações, o resíduo mutado foi mutado para um resíduo de alanina. Nalgumas concretizações, o resíduo mutado foi mutado para um resíduo de arginina. Nalgumas concretizações, o resíduo mutado foi mutado para um resíduo de histidina. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para aumento de um nível de AMPc intracelular. Nalgumas concretizações, a actividade constitutiva é para que células melanóforos sofram dispersão do pigmento.
Em certas concretizações, um GPCR do invento faz parte de uma proteína de fusão com uma proteína G. a. Identidade da sequência
Em certas concretizações, a percentagem de identidade é avaliada utilizando a Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), que é bem conhecida na arte (Ver, p.ex., Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1990) 87: 2264-2268;
Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410; Altschul et al., Nature Genetícs (1993) 3: 266-272; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402; cuja divulgação de cada uma é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Os programas BLAST podem ser utilizados com os parâmetros por defeito ou com parâmetros modificados proporcionados pelo utilizador. De preferência, os parâmetros são os parâmetros por defeito.
Em certas concretizações, um método preferido para determinação da melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (p.ex., a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2) e uma sequência a pesquisar, também referida como alinhamento global de sequências, pode ser determinado 78 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ utilizando ο programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-245; cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Num alinhamento de sequências as sequências de consulta e a pesquisada são ambas sequências de aminoácidos. Os resultados do referido alinhamento global de sequências estão em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento de aminoácidos FASTDB são: Matriz (Matrix)=PAM 0, k-tupte=2, Penalidade de Não Correspondência (Mismatch Penalty)=1, Penalidade de Junção (Joining Penalty)=20, Grupo de Aleatorização (Randomization Group)=25, Comprimento (Length)=0, Registo Limiar (Cutoff Score)=1, Tamanho da Janela (Window Size)=comprimento da janela (sequence length), Penalidade do Intervalo (Gap Penalty)=5, Penalidade do Tamanho do Intervalo (Gap Size Penalty)=0,05, Tamanho da Janela (Window Size)=247 ou o comprimento da sequência de aminoácidos pesquisada, conforme o que for menor. Se a sequência pesquisada for mais curta que a sequência de consulta devido a deleções N ou C-terminais, não por causa de deleções internas, os resultados, em percentagem de identidade, têm de ser manualmente corrigidos porque o programa FASTDB não tem em conta truncagens N e C-terminais da sequência pesquisada quando se calcula a percentagem de identidade global. Para sequências pesquisadas truncadas nos terminais N e C, relativamente à sequência de consulta, a percentagem de identidade é corrigida através do cálculo do número de residuos da sequência de consulta que são N e C-terminais em relação à sequência pesquisada, que não correspondem/alinham com um residuo correspondente da sequência pesquisada, como uma percentagem das bases totais da sequência de consulta. Se um residuo corresponde/alinha é determinado pelos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esta percentagem é estão subtraída da percentagem de identidade, calculada através do programa FASTDB de cima utilizando os parâmetros especificados, para se chegar a um registo final da percentagem de identidade. Este registo final de percentagem de identidade é o que é utilizado para os fins do presente invento. Apenas os residuos nos terminais N e C da sequência pesquisada, que não correspondem/alinham com a sequência de consulta, são considerados para fins de ajuste manual do registo da percentagem de identidade. Isto é, apenas 79 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ os resíduos de aminoácidos da consulta fora dos resíduos N e C-terminais mais afastados da sequência pesquisada.
Por exemplo, uma sequência pesquisada de 90 resíduos de aminoácidos é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no terminal N da sequência pesquisada e, portanto, o alinhamento FASTDB não coincide/alinha com os primeiros resíduos no terminal N. Os 10 resíduos desemparelhados representam 10% da sequência (o número de resíduos nos terminais N e C não correspondentes/número total de resíduos na sequência de consulta) por isso são subtraídos 10% ao registo da percentagem de identidade calculado através do programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes coincidirem perfeitamente, a percentagem de identidade final será de 90%. Noutro exemplo, uma sequência pesquisada de 90 resíduos é comparada com uma sequência de consulta de 100 resíduos. Desta vez as deleções são internas e assim não existem resíduos nos terminais N ou C da sequência pesquisada, que não correspondam/alinhem com a consulta. Neste caso, a percentagem de identidade calculada através de FASTDB não é corrigida manualmente. Novamente, apenas posições de resíduos fora das extremidades dos terminais N e C da sequência sujeita, tal como apresentado no alinhamento FASTDB, que não correspondam/alinhem com a sequência de consulta são manualmente corrigidas. Não são feitas outras correcções para fins do presente invento. b. Proteínas de fusão
Em certas concretizações, um polipéptido de interesse é uma proteína de fusão, e pode conter, por exemplo, um domínio etiqueta de afinidade ou um domínio repórter. Etiquetas de afinidade adequadas incluem qualquer sequência de aminoácidos que possa ser especificamente ligada a outra porção, habitualmente outro polipéptido, mais habitualmente um anticorpo. Etiquetas de afinidade adequadas incluem etiquetas de epitopo, por exemplo, a etiqueta V5, a etiqueta FLAG, a etiqueta HA (da hemaglutinina do vírus da gripe), a etiqueta myc, e semelhantes, tal como é conhecido na arte. Etiquetas de afinidade adequadas incluem também domínios para os quais são conhecidos substratos de ligação, p.ex., etiquetas HIS, GST e 80 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ ΜΒΡ, tal como é conhecido na arte, e domínios de outras proteínas para os quais estão disponíveis parceiros de ligação específica, p.ex., anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais. Etiquetas de afinidade adequadas incluem também qualquer domínio de interacção proteína-proteína, tal como uma região Fc de igG, que pode ser especif icamente ligada e detectada utilizando um parceiro de ligação adequado, p.ex. o receptor de Fc de IgG. Está expressamente contemplado que uma tal proteína de fusão pode conter um domínio heterólogo N-terminal (p.ex., uma etiqueta de epitopo) fundido enquadrado com um GPCR com o seu resíduo de metionina N-terminal suprimido ou substituído por um aminoácido alternativo.
Domínios repórter adequados incluem qualquer domínio que possa reportar a presença de um polipéptido. Embora se reconheça que uma etiqueta de afinidade pode ser utilizada para reportar a presença de um polipéptido utilizando, p.ex., um anticorpo marcado que se ligue especificamente à etiqueta, domínios repórter emissores de luz são mais habitualmente utilizados. Domínios repórter emissores de luz adequados incluem luciferase (de, p.ex., pirilampo, Vargula, Renilla reniformis ou Renilla muelleri), ou variantes emissoras de luz destes. Outros domínios repórter adequados incluem proteínas fluorescentes (de, p.ex., medusa, corais e outros celenterados tais como os de espécies de Aequoria, Renilla, Ptilosarcus, Stylatula), ou variantes emissoras de luz destes. Variantes emissoras de luz destas proteínas repórter são muito bem conhecidas na arte e podem ser mais brilhantes, menos brilhantes ou terem espectros de excitação e/ou emissão diferentes, em comparação com uma proteína repórter nativa. Por exemplo, algumas variantes são alteradas para deixarem de surgir verdes, e poderem surgir azuis, ciano, amarelas, amarelo melhorado, vermelhado (designadas BFP, CFP, YFP, eYFP e RFP, respectivamente) ou terem outros espectros de emissão, tal como é conhecido na arte. Outros domínios repórter adequados incluem domínios que podem reportar a presença de um polipéptido através da uma mudança bioquímica ou de cor, tal como β-galactosidase, β-glucuronidase, cloranfenicol-acetiltransferase, e fosfatase alcalina embrionária segregada.
Também tal como é conhecido na arte, uma etiqueta de afinidade ou um domínio repórter pode estar presente em 81 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ qualquer posição num polipéptido de interesse. No entanto, na maioria das concretizações, estão presentes na extremidade C ou N-terminal de um polipéptido de interesse. 2. Ácidos nucleicos codificando polipéptidos GPCR de interesse
Desde que o código genético e as técnicas recombinantes para manipulação de ácido nucleico são conhecidos, e as sequências de aminoácidos dos polipéptidos GPCR de interesse descritas tal como acima, o desenho e a produção de ácidos nucleicos codificando um polipéptido GPCR de interesse está bem dentro da perícia na arte. Em certas concretizações, são utilizados métodos de tecnologia de ADN recombinante padrão (Ausubel, et al., "Short Protocols in Molecular Biology", 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Por exemplo, as sequências de codificação de GPCR podem ser isoladas a partir de uma biblioteca de sequências de codificação de GPCR utilizando qualquer uma ou uma combinação de uma variedade de métodos recombinantes que não é necessário descrever aqui. A subsequente substituição, deleção e/ou adição de nucleótidos à sequência de ácido nucleico codificando uma proteína pode também ser feita utilizando técnicas de ADN recombinante padrão. Por exemplo, mutagénese dirigida ao local e subclonagem podem ser utilizadas para introduzir/suprimir/substituir resíduos de ácido nucleico num polinucleótido codificando um polipéptido de interesse. Noutras concretizações, pode ser utilizada PCR. Ácidos nucleicos codificando um polipéptido de interesse podem também ser feitos através de síntese química inteiramente a partir de oligonucleótidos (p.ex., Cello et al., Science (2002) 297: 1016-8). Nalgumas concretizações, os codões dos ácidos nucleicos codificando polipéptidos de interesse são optimizados para expressão em células de uma determinada espécie, particularmente um mamífero, p.ex., espécies de ratinho, rato, hamster, primatas não humanos ou humano. Nalgumas concretizações, os codões dos ácidos nucleicos codificando polipéptidos de interesse são optimizados para expressão em células de uma determinada espécie, particularmente uma espécie de anfíbio. 82 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ a. vectores Ο pedido descreve ainda vectores (também referidos como "construções") compreendendo um ácido nucleico sujeito. Em muitas concretizações do invento, as sequências de ácido nucleico sujeitas serão expressas num hospedeiro após as sequências serem operativamente liqadas a uma sequência de controlo da expressão, incluindo, p.ex. um promotor. Os ácidos nucleicos sujeitos são também tipicamente colocados num vector de expressão que se pode replicar numa célula hospedeira como um epissoma ou como parte integral do ADN cromossómico hospedeiro. Vulgarmente, os vectores de expressão conterão marcadores de selecção, p.ex., tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de ADN desejadas (ver, p.ex., Pat. U.S. N°. 4704362, que é aqui incorporada por referência). Os vectores, incluindo vectores de cassete de expressão simples e dupla, são bem conhecidos na arte (Ausubel, et al., "Short Protocols in Molecular Biology", 3a ed., wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Vectores adequados incluem vectores virais, plasmideos, cosmideos, cromossomas artificiais (cromossomas artificiais humanos, cromossomas artificiais bacterianos, cromossomas artificiais de levedura, etc.), mini-cromossomas, e semelhantes. Podem ser utilizados vectores retrovirais, adenovirais e virais adeno-associados.
Uma variedade de vectores de expressão está disponível aos peritos na arte para fins de produção de um polipéptido de interesse numa célula e incluem vectores de expressão que estão comercialmente disponíveis (p.ex., em Invitrogen, Carlsbad, CA; Clontech, Mountain View, CA; Stratagene, La Jolla, CA) . Vectores de expressão comercialmente disponíveis incluem, como exemplo não limitante, vectores baseados no promotor de CMV. Um vector de expressão adequado é pCMV. O vector de expressão pode ser adenoviral. Um vector adenoviral exemplar pode ser adquirido em AdEasyTM de Qbiogene (Carlsbad, CA) (He TC et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1998) 95: 2509-2514; e Patente U.S. N°. 5922576; cuja divulgação de cada é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Outros vectores de expressão adequados serão facilmente aparentes aos vulgares peritos na arte. Os ácidos nucleicos sujeitos 83 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ compreendem habitualmente um enquadramento de leitura aberto simples codificando um polipéptido de interesse sujeito, no entanto, em certas concretizações, uma vez que a célula hospedeira para expressão do polipéptido de interesse pode ser uma célula eucariótica, p.ex., uma célula de mamífero, tal como uma célula humana, o enquadramento de leitura aberto pode ser interrompido por intrões. Os ácidos nucleicos sujeitos fazem tipicamente parte de uma unidade de transcrição que pode conter, para além do ácido nucleico sujeito, regiões não traduzidas (UTRs) 3' e 5' que podem dirigir a estabilidade do ARN, a eficiência da tradução, etc. 0 ácido nucleico sujeito pode também fazer parte de uma cassete de expressão que contém, para além do ácido nucleico sujeito, um promotor que dirige a transcrição e expressão de um polipéptido de interesse, e um terminador da transcrição.
Os promotores eucarióticos podem ser qualquer promotor que seja funcional numa célula hospedeira eucariótica, incluindo promotores virais e promotores derivados de genes eucarióticos. Promotores eucarióticos exemplares incluem, mas não se limitam aos seguintes: o promotor da sequência do gene da metalotioneína I de ratinho (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982); o promotor da TK do vírus Herpes (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982); o promotor inicial de SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290: 304-310, 1981); o promotor da sequência do gene gall de levedura (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79: 6971-6975, 1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81: 5951-59SS, 1984), o promotor de CMV, o promotor de EF-1, o promotor ou promotores que respondem a Ecdysone, o promotor que responde a tetraciclina e semelhantes. Os promotores virais podem ser de particular interesse uma vez que são geralmente promotores particularmente fortes. Em certas concretizações, é utilizado um promotor que seja um promotor do patogénio alvo. Os promotores para utilizar no presente invento são seleccionados para serem funcionais no tipo celular (e/ou animal) no qual se pretende introduzir. Em certas concretizações, o promotor é um promotor de CMV.
Em certas concretizações, um vector sujeito pode também proporcionar expressão de um marcador seleccionável. Vectores e marcadores seleccionáveis adequados são bem conhecidos na 84 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ arte e discutidos em Ausubel, et al., ("Short Protocols in Molecular Biology", 3a ed., Wiley & Sons, 1995) e Sambrook, et al., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Terceira Edição, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.). Foi empregue uma variedade de genes diferentes como marcadores seleccionáveis, e o gene particular empregue nos vectores sujeitos como marcador seleccionável é escolhido primariamente por conveniência. Genes marcadores seleccionáveis conhecidos incluem: o gene da timidina-cinase, o gene da di-hidrofolato-redutase, o gene da xantina-guanina-fosforribosil-transferase, CAD, o gene da adenosina-desaminase, o gene da asparagina-sintetase, genes de resistência a antibióticos, p.ex. tetr, ampr, Cmr ou cat, kanr ou neor (genes da aminoglicósido-fosfotransferase), o gene da higromicina B-fosfotransferase, e semelhantes. Tal como mencionado acima, os polipéptidos de interesse podem ser proteínas de fusão que contenham um domínio de afinidade e/ou um domínio repórter. Os métodos para produção de fusões entre um repórter ou uma etiqueta e um GPCR, por exemplo, no terminal C ou N do GPCR, estão bem dentro da perícia na arte (p.ex. McLean et al., Mol. Pharma. Mol. Pharmacol. (1999) 56: 1182-91; Ramsay et al., Br. J. Pharmacology, (2001) 315-323) e não serão mais descritos. Está expressamente contemplado que uma tal proteína de fusão possa conter um domínio heterólogo N-terminal (p.ex., uma etiqueta de epitopo) fundido enquadrado com um GPCR tenha tido o seu resíduo de metionina N-terminal suprimido ou substituído por um aminoácido alternativo. É apreciado que um polipéptido de interesse possa primeiro ser produzido a partir de um polipéptido nativo e depois ligado operativamente a um repórter/etiqueta adequado tal como descrito acima.
Os ácidos nucleicos sujeitos podem também conter locais de restrição, locais de clonagem múltipla, locais de ligação a iniciadores, extremidades ligáveis, locais de recombinação, etc., habitualmente para facilitar a construção de um ácido nucleico codificando um polipéptido de interesse. b. Células hospedeiras O pedido descreve ainda células hospedeiras compreendendo um vector compreendendo um ácido nucleico sujeito. Células hospedeiras adequadas incluem células procarióticas, p.ex., 85 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ bacterianas (por exemplo E. coli), bem como células eucarióticas p.ex. uma célula animal (por exemplo uma célula de insecto, mamífero, peixe, anfíbio, ave ou réptil), uma célula vegetal (por exemplo uma célula de milho ou Arabidopsis), ou uma célula fúngica (por exemplo uma célula de S. cerevisiae). Em certas concretizações, qualquer célula adequada para expressão de um ácido nucleico codificando um polipéptido de interesse pode ser utilizada como célula hospedeira. Habitualmente, é utilizada uma linha celular hospedeira animal, da qual se seguem exemplos: células de rim de macaco (células COS), células de rim de macaco CVI transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de rim embrionário humano (HEK-293 ("293"), Graham et al. J. Gen. Virol. (1977) 36: 59); células HEK-293T ("293T"); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77: 4216); células de hamster Syrian dourado MCB3901 (ATCC CRL-9595); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. (1980) 23: 243-251); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sei (1982) 383: 44-68); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); e células L de ratinho (ATCC CCL-1). Em certas concretizações, são utilizados melanóforos. Os melanóforos são células da pele verificadas nos vertebrados inferiores. Os materiais e métodos relevantes serão seguidos de acordo com a divulgação de Patente U.S. N°. 5462856 e Patente U.S. N°. 6051386.
Linhas celulares adicionais tornar-se-ão aparentes aos vulgares peritos na arte e uma ampla variedade de linhas celulares está disponível na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209. 86 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ C. Pesquisa de Compostos Candidatos
1. Técnicas genéricas de ensaio de pesquisa de CPCR
Quando um receptor de proteína G se torna activo, liga-se a uma proteína G (p.ex., Gq, Gs, Gi, Gz, Go) e estimula a ligação de GTP à proteína G. A proteína G actua então como uma GTPase e hidrolisa lentamente o GTP em GDP, pelo que o receptor, sob condições normais, se torna desactivado. No entanto, receptores activados continuam a trocar GDP por GTP. Um análogo não hidrolisável de GTP, [35S]GTPyS, pode ser utilizado para monitorizar uma maior ligação a membranas que expressam receptores activados. Está relatado que [35S]GTPyS pode ser utilizado para monitorizar a ligação da proteína G a membranas na ausência e na presença de ligando. Um exemplo desta monitorização, entre outros exemplos bem conhecidos e disponíveis na arte, foi relatado por Traynor e Nahorski em 1995. Uma utilização preferida deste sistema de ensaio é para pesquisa inicial de compostos candidatos porque o sistema é genericamente aplicável a todos os receptores acoplados à proteína G independentemente da proteína G particular que interage com o domínio intracelular do receptor.
2. Técnicas específicas de ensaio de pesquisa de GPCR
Uma vez identificados compostos candidatos utilizando o ensaio "genérico" de receptor acoplado a proteína G (i.e., um ensaio para seleccionar compostos que são agonistas ou agonistas inversos), nalgumas concretizações é preferido pesquisar mais para confirmar que os compostos interagiram no local do receptor. Por exemplo, um composto identificado através do ensaio "genérico" pode não se ligar ao receptor, mas pode em vez disso meramente "desacopular" a proteína G do domínio intracelular. a. Gs, Gz e Gi
Gs estimula a enzima adenilil-ciclase. Gi (e Gz e Go), por outro lado, inibem a adenilil-ciclase. A adenilil-ciclase catalisa a conversão de ATP em AMPc; assim, GPCRs activados que se acoplam à proteína Gs estão associados a maiores níveis celulares de AMPc. Por outro lado, GPCRs activados que se acoplam à proteína Gi (ou Gz, Go) estão associados a menores níveis celulares de AMPc. Ver, geralmente, "Indirect 87 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Mechanisms of Synaptic Transmission", Capt. 8, "From Neuron To Brain" (3a ed.) Nichols, J.G. et al. eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Assim, ensaios que detectem AMPc podem ser utilizados para determinar se um composto candidato é, p.ex., um agonista inverso do receptor (i.e., um composto tal diminuiria os niveis de AMPc). Pode ser utilizada uma variedade de abordagens conhecidas na arte para medição do AMPc; nalgumas concretizações uma abordagem preferida assenta na utilização de anticorpos anti-AMPc num formato baseado em ELISA. Outro tipo de ensaio que pode ser utilizado é um ensaio de sistema repórter de mensageiro secundário em células inteiras. Os promotores nos genes dirigem a expressão das proteínas que um determinado gene codifica. 0 AMP cíclico dirige a expressão génica através da promoção da ligação de uma proteína de ligação ao ADN ou factor de transcrição (CREB) que responde a AMPc que então se liga ao promotor em locais específicos designados elementos de resposta a AMPc e dirige a expressão do gene. Podem ser construídos sistemas repórter que possuam um promotor contendo múltiplos elementos de resposta a AMPc antes do gene repórter, p.ex., β-galactosidase ou luciferase. Assim, um receptor ligado a Gs activado causa a acumulação de AMPc que activa então o gene e a expressão da proteína repórter. A proteína repórter tal como β-galactosidase ou luciferase pode então ser detectada utilizando ensaios bioquímicos padrão (Chen et al. 1995). b. Go e Gq
Gq e Go estão associadas a activação da enzima fosfolipase C, que por sua vez hidrolisa o fosfolípido PIP2, libertando dois mensageiros intracelulares: diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) . Maior acumulação de IP3 está associada a activação de receptores associados a Gq e Go. Ver, geralmente, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission", Capt. 8, "From Neuron To Brain" (3a ed.) Nichols, J.G. et al. eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Os ensaios que detectam acumulação de IP3 podem ser utilizados para determinar se um composto candidato é, p.ex., um agonista inverso de um receptor associado a Gq ou Go (i.e., um composto tal diminuiria os níveis de IP3) . Os receptores associados a Gq podem também ser examinados utilizando um ensaio repórter API por a fosfolipase C dependente de Gq causar activação de genes contendo elementos API; assim, receptores associados a 88 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Gq activados evidenciarão um aumento na expressão de tais genes, pelo que agonistas inversos destes evidenciarão uma diminuição em tal expressão e agonista evidenciarão um aumento em tal expressão. Estão disponíveis ensaios comercialmente disponíveis para tal detecção.
3. Proteína de Fusão de GPCR A utilização de um GPCR endógeno, constitutivamente activo ou um GPCR não endógeno, constitutivamente activado, para utilização em pesquisa de compostos candidatos para a identificação directa de agonistas inversos ou agonistas proporciona um desafio de pesquisa interessante porque, por definição, o receptor é activo mesmo na ausência de um ligando endógeno ligado a este. Assim, para diferenciar entre, p.ex., o receptor não endógeno na presença de um composto candidato e o receptor não endógeno na ausência desse composto, com o objectivo de uma tal diferenciação permitir uma compreensão de se tal composto pode ser um agonista inverso ou agonista ou não ter efeito num tal receptor, nalgumas concretizações é preferido que seja utilizada uma abordagem que possa aumentar tal diferenciação. Nalgumas concretizações, uma abordagem preferida é a utilização de uma Proteína de Fusão de GPCR.
Geralmente, uma vez determinado que um GPCR não endógeno foi constitutivamente activado utilizando as técnicas de ensaio expostas acima (bem como outras conhecidas dos peritos na arte), é possível determinar a proteína G predominante que se acopla ao GPCR endógeno. A ligação da proteína G ao GPCR proporciona uma via de sinalização que pode ser avaliada. Nalgumas concretizações é preferido que a pesquisa ocorra utilizando um sistema de expressão de mamífero ou de melanóforos, uma vez que esperar-se-á que um tal sistema tenha uma proteína G endógena nele. Assim, por definição, num tal sistema, o GPCR não endógeno, constitutivamente activado sinalizará continuamente. Nalgumas concretizações é preferido que este sinal seja aumentado para que na presença de, p.ex., um agonista inverso para o receptor, seja mais provável que seja capaz de diferenciar mais facilmente, particularmente no contexto de pesquisa, entre os receptores quando é colocado em contacto com o agonista inverso. 89 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Pretende-se que a Proteína de Fusão de GPCR aumente a eficácia da ligação da proteína G ao GPCR. A Proteína de Fusão de GPCR pode ser preferida para pesquisa com um GPCR endógeno, constitutivamente activo ou um GPCR não endógeno, constitutivamente activado porque uma tal abordagem aumenta o sinal que é gerado em tais técnicas de pesquisa. Isto é importante ao facilitar uma significativa razão "sinal para ruído"; uma tal razão significativa é preferida para a pesquisa de compostos candidatos tal como aqui divulgado. A construção de uma construção útil para expressão de uma Proteína de Fusão de GPCR está dentro da vulgar perícia na arte. Vectores e sistemas de expressão comercialmente disponíveis oferecem uma variedade de abordagens que se ajustam às necessidades particulares de um investigador. Critérios importantes na construção de uma tal construção de Proteína de Fusão de GPCR incluem, mas não se limitam a, que a sequência de GPCR e a sequência da proteína G estejam ambas enquadradas (de preferência, a sequência para o GPCR endógeno está a montante da sequência da proteína G), e que o codão de "terminação" do GPCR possa ser suprimido ou substituído para que após expressão do GPCR, a proteína G possa também ser expressa. 0 GPCR pode ser ligado directamente à proteína G ou pode haver resíduos espaçadores entre os dois (de preferência, não mais de cerca de 12, embora este número possa ser facilmente apurado por um vulgar perito na arte). Com base na conveniência, é preferido utilizar um espaçador. Nalgumas concretizações, é preferido que a proteína G que se liga ao GPCR não endógeno tenha sido identificada antes da criação da construção da Proteína de Fusão de GPCR. Tal como observado acima, espera-se que os GPCRs activados que se acoplam a Gi, Gz e Go inibam a formação de AMPc fazendo ensaios com base nestes tipos de confronto de GPCRs (i.e., o sinal do AMPc diminui após activação, fazendo assim a identificação directa, p.ex., de confronto com agonistas (que diminuiriam mais este sinal)) . Tal como será aqui divulgado, foi apurado que para estes tipos de receptores, é possível criar uma Proteína de Fusão de GPCR que não se baseia na proteína G do GPCR endógeno, num esforço para estabelecer um ensaio viável baseado em ciclase. Assim, por exemplo, um receptor endógeno acoplado a Gi pode ser fundido com uma proteína Gs - tal construção de fusão, após expressão, "dirige" ou "força" o 90 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ GPCR endógeno a acoplar-se a, p.ex., Gs em vez da proteína Gi "natural", de tal forma que possa ser estabelecido um ensaio baseado em ciclase. Assim, para receptores acoplados a Gi, Gz e Go, nalgumas concretizações é preferido que quando uma Proteína de Fusão de GPCR é utilizada e o ensaio se baseia na detecção da actividade da adenilil-ciclase, a construção de fusão seja estabelecida com Gs (ou uma proteína G equivalente que estimule a formação da enzima adenilil-ciclase).
TABELA C
Proteína G Efeito da produção de AMPc após Activação de GPCR (i.e., activação constitutiva ou ligação de um agonista) Efeito da Acumulação de IP3 após Activação de GPCR (i.e., activação constitutiva ou ligação de um agonista) Efeito da Produção de AMPc após contacto com um Agonista Inverso Efeito na Acumulação de ip3 após contacto com um Agonista Inverso Gs Aumenta N/A Diminui N/A Gi Diminui N/A Aumenta N/A Gz Diminui N/A Aumenta N/A Go Diminui Aumenta Aumenta Diminui Gq N/A Aumenta N/A Diminui
Igualmente eficaz é uma construção de Fusão de Proteína G que utilize uma Proteína Gq fundida com uma Proteína Gs, Gi, Gz ou Go. Nalgumas concretizações uma construção de fusão preferida pode ser alcançada com uma Proteína Gq em que os primeiros seis (6) aminoácidos da subunidade α da proteína G ("Gaq") são suprimidos e os últimos cinco (5) aminoácidos na extremidade C-terminal de Gaq são substituídos pelos aminoácidos correspondentes da Ga da proteína G de interesse. Por exemplo, uma construção de fusão pode ter uma Gq (deleção de 6 aminoácidos) fundida com uma Proteína Gi, resultando numa "Construção de Fusão Gq/Gi". Esta construção de fusão forçará o receptor endógeno acoplado a Gi a ligar-se à sua proteína G não endógena, Gq, tal que o mensageiro secundário, por exemplo, inositol-trifosfato ou diacilgicerol, possa ser medido em vez da produção de AMPc. 91 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 4. Co-transfecção de um 6PCR Alvo Acoplado a 61 com um GPCR Acoplado a Gs Ampliador do Sinal (Ensaios Baseados em AMPc)
Sabe-se que um receptor acoplado a Gi inibe a adenilil-ciclase, e, portanto, diminui o nivel de produção de AMPc, o que pode tornar um desafio a avaliação dos níveis de AMPc. Em certas concretizações, uma técnica eficaz na medição da diminuição da produção de AMPc como indicação da activação de um receptor que predominantemente se acopla a Gi após activação pode ser alcançada através de co-transfecção de um ampliador do sinal, p.ex., um receptor não endógeno, constitutivamente activado que se acopla predominantemente a Gs após activação (p.ex., TSHR-A623I; ver infra), com o GPCR acoplado a Gi. Tal como é aparente, a activação de um receptor acoplado a Gs pode ser determinada com base num aumento na produção de AMPc. A activação de um receptor acoplado a Gi conduz a uma diminuição na produção de AMPc. Assim, pretende-se que a abordagem de co-transfecção explore vantajosamente estes efeitos "opostos". Por exemplo, a co-transfecção de um receptor não endógeno acoplado a Gs, constitutivamente activado (o "ampliador de sinal") com o vector de expressão sozinho proporciona um sinal de AMPc limiar (i.e., embora o receptor acoplado a Gi diminua os níveis de AMPc, esta "diminuição" será relativa ao substancial aumento nos niveis de AMPc estabelecidos pelo ampliador de sinal acoplado a Gs constitutivamente activado). Co-transfectando então o ampliador de sinal com o "receptor alvo", um agonista inverso do receptor alvo acoplado a Gi aumentará o sinal de AMPc medido, ao mesmo tempo que um agonista do receptor alvo acoplado a Gi diminuirá este sinal.
Os compostos candidatos que são directamente identificados utilizando esta abordagem devem ser avaliados independentemente para assegurar que estes não se dirigem ao receptor ampliador do sinal (isto pode ser feito antes ou após a pesquisa contra os receptores co-transfectados).
Composição/Formulação e Métodos de Tratamento
Um agonista de GPR119 pode ser formulado em composições farmacêuticas e medicamentos utilizando técnicas bem conhecidas na arte. A formulação correcta é dependente da via 92 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ de administração escolhida. Em certas concretizações, a referida administração é a um vertebrado não humano ou a um mamífero não humano.
No que respeita a terapias os compostos podem ser administrados de qualquer modo adequado. Vias adequadas de administração incluem administração oral, nasal, rectal, transmucosa, transdérmica ou intestinal, distribuição parentérica, incluindo intramuscular, subcutânea, injecções intramedulares, bem como intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intrapulmonar (inalada) ou injecções intraoculares utilizando métodos conhecidos na arte. Outras vias de administração adequadas são a formulação em aerossol e de depósito. As formulações de libertação sustida, particularmente de depósito, dos medicamentos inventados estão expressamente contempladas. Em certas concretizações preferidas, os compostos são administrados oralmente. Os compostos podem ser feitos na forma sólida ou líquida, tais como comprimidos, cápsulas, pós, xaropes, elixires e semelhantes, aerossóis, soluções, suspensões ou emulsões estéreis e semelhantes. Em certas concretizações, o agonista de GPR119 é administrado oralmente.
As formulações para administração oral podem estar na forma de soluções aquosas e suspensões, além das formulações sólidas em comprimidos e cápsulas. As soluções e suspensões aquosas podem ser preparadas a partir de pós ou grânulos estéreis. Os compostos podem ser dissolvidos em água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de sésamo, álcool benzílico, cloreto de sódio e/ou vários tampões. Outros adjuvantes são bem e amplamente conhecidos na arte.
As composições farmacêuticas do agonista de GPR119 podem ser preparadas através de métodos bem conhecidos na arte, p.ex., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drageias, pulverização, emulsionação, encapsulamento, aprisionamento, liofilização ou de secagem por vaporização.
As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional utilizando um ou mais transportadores 93 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que possam ser utilizadas farmaceuticamente. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados estão disponíveis aos peritos na arte (ver, p.ex., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", (Gennaro et al., eds.), 20a Edição, 2000, Lippincott Williams & Wilkins; e "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (Rowe et al., eds), 4a Edição, 2003, Pharmaceutical Press; cuja divulgação de cada uma é aqui incorporada por referência na sua totalidade). A formulação apropriada está dependente da via de administração escolhida. O termo material "transportador" ou material "excipiente" aqui significa qualquer substância, ela própria não um agente terapêutico, utilizada como transportador e/ou diluente e/ou adjuvante, ou veículo para distribuição de um agente terapêutico a um sujeito ou adicionado a uma composição farmacêutica para melhorar as suas propriedades de manuseamento ou armazenamento ou para permitir ou facilitar a formação de uma unidade de dosagem da composição num artigo discreto tal como uma cápsula ou um comprimido adequado para administração oral. Os excipientes podem incluir, para ilustração e não como limitação, diluentes, desintegrantes, agentes aglomerantes, adesivos, agentes humidificantes, polímeros, lubrificantes, anti-aderente, substâncias adicionadas para mascarar ou contrariar um sabor ou odor desagradável, aromas, corantes, fragrâncias e substâncias adicionadas para melhorar a aparência da composição. Excipientes aceitáveis incluem ácido esteárico, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio dos ácidos fosfórico e sulfúrico, carbonato de magnésio, talco, gelatina, goma arábica, alginato de sódio, pectina, dextrina, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, amidos, gelatina, materiais celulósicos, tais como ésteres de celulose de ácidos alcanóicos e ésteres alquílicos de celulose, cera de baixo ponto de fusão, manteiga ou pó de cacau, polímeros, tais como polivinil-pirrolidona, álcool polivinílico, e polietilenoglicóis, e outros materiais farmaceuticamente aceitáveis. Os componentes da composição farmacêutica podem ser encapsulados ou comprimidos para uma administração conveniente. 94 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Farmaceuticamente aceitável refere-se às propriedades e/ou substâncias que são aceitáveis para o paciente de um ponto de vista farmacológico/toxicológico e para o quimico farmacêutico fabricante de um ponto de vista fisico/quimico em relação à composição, formulação, estabilidade, aceitação do paciente e biodisponibilidade.
As cores das drageias são proporcionadas com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Tintas ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageias para identificação ou para caracterização de diferentes combinações de doses de composto activo.
Composições farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas moles, seladas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os ingredientes activos em mistura com um enchimento tal como lactose, um ligante tal como amido, e/ou um lubrificante tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida, polietilenoglicóis líquidos, Cremophor, Capmul, mono, di ou triglicéridos de cadeia média ou longa. Podem também ser adicionados nestas formulações estabilizadores.
Adicionalmente, um agonista de GPR119 pode ser distribuído utilizando um sistema de libertação sustida. Vários materiais de libertação sustida foram estabelecidos e são bem conhecidos dos peritos na arte. Comprimidos ou cápsulas de libertação sustida são particularmente preferidos. Por exemplo, um material de retardamento tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo pode ser empregue. A forma de dosagem pode também ser revestida através das técnicas descritas nas Pat. U.S. Nos. 4256108, 95 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 4166452, θ 4265874 para formar comprimidos terapêuticos osmóticos para libertação controlada.
Está expressamente contemplado que as terapias podem ser administradas ou proporcionadas sozinhas ou em combinação com um ou mais outros compostos farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Opcionalmente, o outro composto farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável não é um agonista de GPR119. Opcionalmente, o outro composto farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável é um agente farmacêutico seleccionado a partir do grupo que consiste em cálcio, vitamina D, estrogénio, tibolona, modulador selectivo do receptor de estrogénio (SERM; p.ex., raloxifeno, tamoxifeno), bifosfonato (p.ex., etidronato, alendronato, risedronato), calcitonina, metabolito Ια-hidroxilado da vitamina D, fluoreto, tiazida, esteróide anabólico, ipriflavona, vitamina K, hormona da paratiróide (HPT), estrôncio, estatina, osteoprotererina, agonista selectivo do receptor EP4, agonista selectivo do receptor de canabinóides de tipo 2 (CB2), e inibidor da MAP-cinase p38. (Ver, p.ex., "World Health Organization Technical Report Series 921" (2003), "Prevention and Management of Osteoporosis"). O presente pedido descreve uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente numa quantidade de um agonista de GPR119. O presente pedido descreve uma composição farmacêutica compreendendo ou consistindo essencialmente numa quantidade de um agonista de GPR119 e pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente pedido refere-se também a uma forma de dosagem da composição ou da composição farmacêutica em que o agonista de GPR119 está numa quantidade suficiente para ter um efeito no tratamento ou na prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e/ou no aumento da massa óssea num indivíduo. O presente pedido refere-se também a uma forma de dosagem da composição ou da composição farmacêutica em que o agonista de GPR119 está numa quantidade suficiente para ter um efeito no aumento de um nível de GIP num indivíduo. 96 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Composições farmacêuticas adequadas para utilizar de acordo com o presente pedido incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade para alcançar o seu fim pretendido. Nalgumas concretizações, entenda-se que uma composição farmacêutica é útil para tratamento ou prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, ou para aumento da massa óssea num indivíduo. Nalgumas concretizações, entenda-se que a composição farmacêutica é útil para aumento de um nível de GIP num indivíduo. A determinação da quantidade de um agonista de GPR119 suficiente para alcançar um fim pretendido está bem dentro da capacidade dos peritos na arte, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada.
Os dados obtidos de estudos animais, incluindo mas não se limitando a estudos utilizando ratinhos, ratos, coelhos, porcos, e primatas não humanos, podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilizar em humanos. Em geral, um perito na arte percebe como extrapolar dados in vivo obtidos num sistema modelo animal para outro, tal como um humano. Nalgumas circunstâncias, estas extrapolações podem ser meramente baseadas no peso do modelo animal em comparação com outro, tal como um humano; noutras circunstâncias, estas extrapolações não são simplesmente baseadas nos pesos mas incorporam em vez disso uma variedade de factores. Factores representativos incluem o tipo, a idade, o peso, o sexo, a dieta e a condição médica do paciente, a gravidade da doença, a via de administração, considerações farmacológicas tais como a actividade, eficácia, perfis farmacocinéticos e de toxicologia do composto particular empregue, se utilizado um sistema de distribuição de fármacos, ou se estiver a ser tratado um estado de doença aguda ou crónica ou a ser conduzida profilaxia ou se estiverem a ser administrados mais compostos activos para além dos compostos do presente invento e como parte de uma combinação de fármacos. 0 regime de dosagem para tratamento de uma condição de doença com os compostos e/ou composições aqui descritos é seleccionado de acordo com uma variedade de factores tal como citado acima. Assim, o regime de dosagem real empregue pode variar amplamente e pode portanto desviar-se de um regime de dosagem preferido e um perito na arte reconhecerá que essa 97 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ dosagem e regime de dosagem fora destes intervalos típicos podem ser testados e, quando apropriado, podem ser utilizados nos métodos deste invento.
Um sistema modelo animal exemplar é o modelo de perda óssea por ovariectomia de rato (OVX). 0 rato ovariectomizado é um excelente modelo animal pré-clínico que rivaliza correctamente com a característica clínica importante do esqueleto humano sem estrogénio e da resposta dos agentes terapêuticos. Neste modelo, uma eficácia terapêutica é alcançada quando a perda óssea associada a ovariectomia é parcialmente ou completamente prevenida. (Ver, p.ex., Bollag et al., Mol. Cell. Endocrinol. (2001) 177: 35-41; e Jee et al.f J. Musculoskel. Neuron Interact. (2001) 1: 193-207). Em certas concretizações, a eficácia terapêutica é alcançada quando a perda óssea associada a ovariectomia é prevenida a pelo menos cerca de 10%, prevenida a pelo menos cerca de 20%, prevenida a pelo menos cerca de 30%, prevenida a pelo menos cerca de 40%, prevenida a pelo menos cerca de 50%, prevenida a pelo menos cerca de 60%, prevenida a pelo menos cerca de 70%, prevenida a pelo menos cerca de 75%, prevenida a pelo menos cerca de 80%, prevenida a pelo menos cerca de 85%, prevenida a pelo menos cerca de 90%, prevenida a pelo menos cerca de 95%, ou prevenida a 100%.
Um sistema modelo animal exemplar adicional é o aumento de um nível sanguíneo de GIP após confronto de glicose em ratinhos. Em certas concretizações, o nível sanguíneo de GIP é um nível plasmático de GIP. Em certas concretizações, o nível de GIP é um nível de GIP independente de glicose. Em certas concretizações, o nível de GIP é um nível de GIP dependente de glicose. Em certas concretizações, o GIP é GIP total. Em certas concretizações, o GIP total é medido utilizando um ensaio dirigido centralmente ou ao terminal C. Em certas concretizações, o GIP é GIP bioactivo. Em certas concretizações, o GIP bioactivo é medido utilizando um ensaio específico do terminal N. Em certas concretizações, o GIP bioactivo tem actividade para promoção da formação de osso. Em certas concretizações, a eficácia terapêutica é alcançada quando o nível sanguíneo de GIP é aumentado em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo 98 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400%, ou pelo menos cerca de 500%. A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados para proporcionar um efeito terapêutico pretendido. Será apreciado que a exacta dosagem de um agonista de GPR119 variará dependendo do agonista de GPR119, da sua potência, do modo de administração, da idade e do peso do paciente e da gravidade da condição a tratar. A formulação exacta, via de administração e dosagem podem ser escolhidas por cada médico tendo em vista a condição do paciente. Para fins de ilustração e não como limitação, uma quantidade de um agonista de GPR119 pode ser menos de cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,005 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 1 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 5 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 10 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 50 mg/kg de peso corporal, ou menos de cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Em certas concretizações, uma quantidade de um agonista de GPR119 pode ser de menos de cerca de 0,001-100 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-50 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-10 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-5 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-1 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001 a 0,5 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-0,1 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-0,05 mg/kg de peso corporal, menos de cerca de 0,001-0,01 mg/kg de peso corporal, ou menos de cerca de 0,001-0,005 mg/kg de peso corporal.
Um intervalo de dosagem preferido para a quantidade de um modulador (p.ex. um agonista de GPR119), que pode ser administrado numa base diária ou regular para alcançar os resultados desejados é de 0,1-100 mg/kg de massa corporal. Outro intervalo de dosagem preferido é 0,1-30 mg/kg de massa corporal. Outro intervalo de dosagem preferido é 0,1-10 mg/kg de massa corporal. Outro intervalo de dosagem preferido é de 0,1-3,0 mg/kg de massa corporal. Claro que, estas dosagem diárias podem ser distribuídas ou administradas em pequenas quantidades periodicamente durante o decurso de um dia. 99 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Observa-se que estes intervalos de dosagem são apenas intervalos preferidos e não se pretende que sejam limitantes do invento. A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar niveis plasmáticos de um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento que alcança um efeito terapêutico pretendido. Os intervalos de dosagem podem também ser determinados utilizando o valor para um intervalo seleccionado de concentração de agonista de GPR119 de modo a alcançar o efeito terapêutico pretendido. Um agonista de GPR119 deve ser administrado utilizando um regime que mantém os niveis plasmáticos dentro do intervalo seleccionado de concentração de agonista de GPR119 durante 10-90% do tempo, de preferência entre 30-99% do tempo, e de maior preferência entre 50-90% do tempo. Em casos de administração local ou tomada selectiva, o intervalo de concentração do agonista de GPR119 proporcionando o efeito terapêutico pretendido pode não estar relacionado com a concentração plasmática. A quantidade de composição administrada será, claro, dependente do indivíduo a tratar, do peso do indivíduo, da gravidade da aflição, do modo de administração e da avaliação do médico prescritor.
Condições caracterizadas por baixa massa óssea incluem mas não se limitam a osteopenia, osteoporose, arterite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática infantil, doença de Paget, perda óssea devido a cancro metastático, lesões osteolíticas, curvatura da coluna vertebral e perda de peso. Em certas concretizações, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose. Em certas concretizações, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária. Condições caracterizadas por baixa massa óssea incluem também, mas não se limitam a, complicações de longo prazo de osteoporose tais como curvatura da coluna vertebral, perda de peso e cirurgia prostética. Entende-se que as condições caracterizadas por 100 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ baixa massa óssea podem ser incluídas individualmente nas concretizações ou em qualquer combinação. Em certas concretizações, a condição caracterizada por baixa massa óssea é osteoporose primária.
Em certas concretizações, o indivíduo necessitado de maior massa óssea tem uma densidade mineral óssea (DMO) de mais de 1 (Registo T < -1), superior ou igual a 1,5 (Registo T < -1,5), superior ou igual a 2 (Registo τ < -2) ou superior ou igual a 2,5 (Registo T ^ -2,5), desvios padrão abaixo da média de referência para o adulto jovem. Em certas concretizações, o indivíduo necessitado de maior massa óssea está a necessitar de tratamento de fractura óssea. Em certas concretizações, o indivíduo a necessitar de tratamento de uma fractura óssea tem um fractura óssea traumática, uma fractura óssea de longo prazo, ou uma fractura óssea osteoporótica. Em certas concretizações, o indivíduo está a necessitar de tratamento para uma doença óssea. Em certas concretizações, o indivíduo a necessitar de tratamento para uma doença óssea tem osteopenia, osteoporose, artrite reumatóide, osteoartrite, doença periodontal, perda óssea alveolar, perda óssea por osteotomia, perda óssea idiopática infantil, doença de Paget, perda óssea devido a cancro metastático, lesões osteolíticas, curvatura da coluna vertebral, ou perda de peso. Em certas concretizações, o indivíduo a necessitar de tratamento para uma doença óssea tem osteoporose. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária. Distúrbios destrutivos do osso que podem ser tratados de acordo com o invento incluem, mas não se limitam a, osteoporose, osteoartrite e lesões osteolíticas tais como as causadas por doença neoplásica, radioterapia, ou quimioterapia. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose primária. Em certas concretizações, a osteoporose é osteoporose secundária.
As terapias referentes a um agonista de GPR119 são adicionalmente úteis no aumento da cicatrização óssea após reconstrução facial, reconstrução maxilar, reconstrução mandibular, doença periodontal ou extracção dentária, aumento da extensão dos ossos longos, aumento do crescimento interno prostético ou aumento da sinostose óssea num indivíduo. 101 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Em certas concretizações, o indivíduo é um vertebrado. Em certas concretizações, o indivíduo que é um vertebrado é um peixe, um anfíbio, um réptil, uma ave ou um mamífero. Em certas concretizações, o indivíduo ou vertebrado é um mamífero. Em certas concretizações, o indivíduo ou vertebrado que é um mamífero é um ratinho, um rato, um hamster, um coelho, um porco, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um mamífero não humano, um primata não humano ou um humano. Em certas concretizações, o indivíduo é um humano. Em certas concretizações, o humano é uma mulher pós-menopausa ou um homem com mais de 50 anos.
Sem mais desenvolvimento, crê-se que um perito na arte pode, utilizando a descrição anterior, praticar o presente invento na íntegra. A descrição detalhada precedente é dada apenas para clareza de compreensão e não deve ser entendida desta qualquer limitação desnecessária, uma vez que modificações no âmbito do invento podem tornar-se aparentes aos peritos na arte.
Este pedido reivindica o benefício de prioridade a partir do seguinte pedido de patente provisório, apresentado via U.S. Express Mail no United States Patent and Trademark Office na data indicada: Pedido de Patente Provisório U.S. Número 60/791,550, apresentado a 11 de Abril de 2006.
Ao longo deste pedido, são citadas várias publicações, patentes e pedidos de patente. A citação aqui pelo Requerente de uma publicação, patente ou pedido de patente não é a admissão pelo Requerente da referida publicação, patente ou pedido de patente como arte anterior.
EXEMPLOS
Sem mais desenvolvimento, crê-se que um perito na arte possa, utilizando a descrição anterior, praticar o presente invento na íntegra. Os seguintes exemplos detalhados devem ser entendidos como meramente ilustrativos, e não como limitações da divulgação precedente seja de que modo for. Os peritos na arte reconhecerão prontamente variações apropriadas dos procedimentos. 102 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
EXEMPLO 1: ANÁLISE FARMACODINÂMICA DE DM EFEITO DA
ADMINISTRAÇÃO DE DM AGONISTA DE GPR119 NO NÍVEL SANGDÍNEO DE GIP EM RATINHOS DE TIPO SELVAGEM A. Ratinhos C57blk/6 machos foram colocados em jejum durante 18 horas, e atribuídos aleatoriamente a catorze grupos com n=6 para cada grupo. Foi administrado oralmente aos ratinhos veiculo (PET; PEG400 a 80%, etanol a 10%, Tween 80 a 10%) ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento (Composto 1; (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina) a 20 mg/kg, tal como indicado na Figura IA. Trinta minutos após o tratamento, foi distribuído oralmente um bolo de glicose a 3 g/kg, e foi colhido plasma a 0 (sem bolo de glicose), 2, 5, 10, 20, 40 e 60 minutos após o bolo de glicose. Os níveis plasmáticos de GIP foram determinados através da utilização de um estojo de ELISA de GIP de roedor adquirido em Linco Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA, N° de Catálogo EZRMGIP-55K), seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor. A partir dos resultados mostrados na Figura IA, é aparente que a administração do agonista de GPR119 aumentou um nível de GIP tanto dependente de glicose como independente de glicose no sangue dos ratinhos. O Composto 1 estimulou o GIP plasmático total nos ratinhos. O Composto 1 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380) . B. Ratinhos C57blk/6 machos foram colocados em jejum durante 18 horas, e atribuídos aleatoriamente a catorze grupos com n=6 para cada grupo. Foi administrado oralmente aos ratinhos veículo (hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPCD) a 20%) ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento (Composto 3) a 10 mg/kg, tal como indicado na Figura 1B. Trinta minutos após o tratamento, foi distribuído oralmente um bolo de glicose a 3 g/kg, e foi colhido plasma a 0 (sem bolo de glicose), 5, 10, 20, 60 e 120 minutos após o bolo de glicose. Os níveis plasmáticos de GIP foram determinados através da utilização de um estojo de ELISA de GIP de roedor adquirido em Linco Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA, N° de Catálogo EZRMGIP- 103 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 55Κ), seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor. A análise estatística foi efectuada utilizando o programa Excel. Os valores médios da concentração de GIP foram calculados com base nos resultados de seis ratinhos em cada grupo e mostrados como a média ± EPM. A partir dos resultados mostrados na Figura 1B, é aparente que a administração do agonista de GPR119 aumentou um nível de GIP tanto dependente de glicose como independente de glicose no sangue dos ratinhos. O Composto 3 estimulou o GIP plasmático total nos ratinhos. O Composto 3 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647). C. Ratinhos C57blk/6 machos foram colocados em jejum durante 18 horas, e atribuídos aleatoriamente a catorze grupos com n=6 para cada grupo. Foi administrado oralmente aos ratinhos veículo (hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPCD) a 20%) ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento (Composto 3) a 1, 3 ou 10 mg/kg. Trinta minutos após o tratamento, foi distribuído oralmente um bolo de glicose a 3 g/kg, e foi colhido plasma a 0 (sem bolo de glicose) ou 5 minutos após o bolo de glicose. Os níveis plasmáticos de GIP foram determinados através da utilização de um estojo de ELISA de GIP de roedor adquirido em Linco Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA, N° de Catálogo EZRMGIP-55K), seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor. A análise estatística foi efectuada utilizando o programa Excel. Os valores médios da concentração de GIP foram calculados com base nos resultados de seis ratinhos em cada grupo e são mostrados na Figura 1C. A partir da Figura 1C é aparente que o agonista de GPR119 (Composto 3) estimulou o GIP plasmático total nos ratinhos de um modo dependente da dose. O Composto 3 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022327 (publicado como WO 2005/007647).
EXEMPLO 2: EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 NO NÍVEL SANGUÍNEO DE GIP EM RATINHOS DEFICIENTES EM GPR119 (KNOCK-OUT) EM COMPARAÇÃO COM RATINHOS DE TIPO SELVAGEM A. Ratinhos machos deficientes em GPR119 e de tipo selvagem da mesma ninhada foram colocados em jejum durante 18 104 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ horas. Foi administrado oralmente aos ratinhos veiculo (PET; PEG400 a 80%, etanol a 10%, Tween 80 a 10%) ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento (Composto 1; (2-
Fluoro-4-metanossulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina) a 20 mg/kg, tal como indicado (n=5). Trinta minutos após o tratamento, foi colhido sangue (100 microlitros) através da veia retro-orbital do olho (tempo 0) seguido de um bolo de glicose a 3 g/kg (oralmente) . Cinco minutos após a distribuição da glicose, foi colhida outra amostra de sangue (100 microlitros) (tempo 5 minutos). Foi colhido o plasma após centrifugação e os niveis de GIP foram determinados através da utilização de um estojo de ELISA de GIP de roedor adquirido em Linco Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA N° de Catálogo EZRMGIP-55K), seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor. A partir dos resultados mostrados na Figura 2Ά, é aparente que o receptor GPR119 funcional era necessário para que o agonista de GPR119 administrado aumentasse um nivel de GIP independente de glicose e dependente de glicose no sangue dos ratinhos. O Composto 1 estimulou o GIP plasmático total nos ratinhos de tipo selvagem. O Composto 1 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/001267 (publicado como WO 2004/065380). B. Ratinhos machos deficientes em GPR119 e de tipo selvagem da mesma ninhada foram colocados em jejum durante 18 horas. Foi administrado oralmente aos ratinhos veiculo (hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPCD) a 40%) ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento (Composto 2) a 30 mg/kg, tal como indicado (n=5). Trinta minutos após o tratamento, foi colhido sangue (100 microlitros) através da veia retro-orbital do olho (tempo 0) seguido de um bolo de glicose a 3 g/kg (oralmente). Cinco minutos após a distribuição de glicose, foi colhida outra amostra de sangue (100 microlitros) (tempo 5 minutos). Foi colhido o plasma após centrifugação e os niveis de GIP foram determinados através da utilização de um estojo de ELISA de GIP de roedor adquirido em Linco Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA N° de Catálogo EZRMGIP-55K), seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor. Os valores médios da concentração de GIP foram calculados com 105 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ base nos resultados de cinco ratinhos em cada grupo. A partir dos resultados mostrados na Figura 2B, é aparente que o receptor GPR119 funcional era necessário para que o agonista de GPR119 administrado aumentasse um nivel de GIP independente de glicose e dependente de glicose no sangue dos ratinhos. O Composto 2 estimulou o GIP plasmático total nos ratinhos de tipo selvagem. O Composto 2 é idêntico a um composto divulgado no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2004/022417 (publicado como WO 2005/007658).
EXEMPLO 3: EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 NA MASSA ÓSSEA EM RATOS OVARIECTOMIZADOS
Pode-se mostrar que um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento é eficaz no tratamento ou na prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e/ou em aumento da massa óssea num indivíduo utilizando o modelo in vivo de rato ovariectomizado (OVX) descrito abaixo (ver, p.ex., Bollag et al.r Mol. Cell. Endocrinol. (2001) 177: 35-41).
Vinte ratos Sprague-Dawley fêmeas virgens OVX e 20 virgens não OVX (150-175 g), com 8 semanas de idade, são adquiridos em Harlan Sprague-Dawley, Inc. (Indianapolis, IN). Os animais são alimentados ad libitum com uma dieta comercial de granulado normal, dieta Teklab Rodent (1,46% de cálcio), com livre acesso a água. Os ratos são divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais com o mesmo peso e seleccionados para receberem oralmente veículo ou um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento. O tratamento é continuado numa base diária durante 6 semanas. 1. Controlo. É administrado oralmente veículo a dez ratos não OVX. 2. Controlo + Tratamento. É administrado oralmente agonista de GPR119 a dez ratos não OVX. 3. OVX. É administrado oralmente veículo a dez ratos OVX. 4. OVX + Tratamento. É administrado oralmente agonista de GPR119 a dez ratos OVX. 106 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Os ratos são pesados diariamente e o comprimento é medido no limiar e novamente às 6 semanas. É efectuada absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) utilizando um Hologic QDR 1000/w (Waltham, MA) em todos os animais antes do inicio do tratamento e às 6 semanas, e os dados são analisados utilizando o suporte lógico Rat Whole Body versão 5.53. A densidade mineral óssea (DMO) é determinada na coluna vertebral. A alteração percentual na densidade óssea vertebral após 6 semanas de tratamento é determinada. É mostrado que a administração de um agonista de GPR119 atenua os efeitos
negativos da ovariectomia na densidade óssea vertebral. A atenuação dos efeitos negativos da ovariectomia na densidade óssea vertebral é indicativa do tratamento ter eficácia no tratamento ou na prevenção de uma condição caracterizada por baixa massa óssea, tal como osteoporose, e/ou no aumento da massa óssea num individuo.
EXEMPLO 4: EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE AGONISTA DE GPR119 NA CICATRIZAÇÃO DE FRACTURA ÓSSEA
Pode-se mostrar que um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento é eficaz no tratamento de fractura óssea utilizando o ensaio in vivo descrito abaixo. Técnica de Fractura
Ratos Sprague-Dawley aos 3 meses de idade são anestesiados com Cetamina. É feita uma incisão de 1 cm no aspecto anteromedial da parte proximal da tíbia ou do fémur direito. O seguinte descreve a técnica cirúrgica da tíbia. A incisão é realizada até ao osso, e é feito um furo de 1 mm 4 mm proximal do aspecto distai da tuberosidade da tíbia 2 mm medial à cristã anterior. É efectuada a cravação medular com um tubo de aço inoxidável de 0,8 mm (carga máxima de 36,3 N, rigidez máxima de 61,8 N/mm, testado sob as mesmas condições que os ossos). Não é efectuada brocagem do canal medular. É produzida uma fractura fechada padrão 2 mm acima da junção tibio-peronial através de inclinação de três pontos utilizando fórceps ajustáveis especialmente desenhados com pinças rombas. Para minimizar danos nos tecidos moles, é tido cuidado para 107 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ não deslocar a fractura. A pele é fechada com suturas de monofilamento de nylon. A operação é efectuada sob condições estéreis. São tomadas radiografias de todas as fracturas imediatamente após a cravação, e os ratos com fracturas fora da área diafisária especificada ou com cavilhas deslocadas são excluídos. Os restantes animais são divididos aleatoriamente pelos seguintes grupos com 10-12 animais por cada subgrupo por ponto temporal para testes da cicatrização das fracturas. É administrado oralmente aos ratos numa base diária veículo ou um agonista de GPR119. O agonista de GPR119 é utilizado numa quantidade entre 0,00 mg/kg de peso corporal e 100 mg/kg de peso corporal. O tratamento é continuado durante 10, 20, 40 e 80 dias.
Aos 10, 20, 40 e 80 dias, 10-12 ratos de cada grupo são anestesiados com Cetamina e sacrificados através de exsanguinação. Ambos os ossos tibio-peroniais são removidos através de dissecção e são removidos todos os tecidos moles. Os ossos de 5-6 ratos para cada grupo são armazenados em etanol a 70% para análise histológica, e os ossos de outros 5-6 ratos para cada grupo são armazenados numa solução de Ringer tamponada (+4°C, pH 7,4) para radiografias e testes biomecânicos que são efectuados.
Análise Histológica
Os métodos para análise histológica do osso fracturado foram anteriormente publicados por Mosekilde e Bak (Bone (1993) 14: 19-27). Resumidamente, o local da fractura é serrado a 8 mm de cada lado da linha da fractura, embebido sem descalcificação em metimetacrilato, e são cortadas secções frontais num micrótomo Polycut Reichert-Jung com 8 pm de espessura. São utilizadas secções médio-frontais coradas com Masson-Trichome (incluindo tanto tíbia como perónio) para visualização da resposta celular e tecidular à cicatrização da fractura com e sem tratamento. Secções coradas de vermelho sírio são utilizadas para demonstrar as características da estrutura de calo e para diferenciar entre osso fibroso e osso lamelar no local da fractura. São efectuadas as seguintes medições: (1) medida do espaço da fractura como a menor distância entre as extremidades corticais do osso na fractura, (2) comprimento do calo e diâmetro do calo, (3) área total do 108 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ volume ósseo do calo, (4) tecido ósseo por área de tecido dentro da área do calo, (5) tecido fibroso no calo e (6) área de cartilagem no calo.
Análise biomecânica
Os métodos para a análise biomecânica foram anteriormente publicados por Bak e Andreassen (Calcif. Tissue Int. (1989) 45: 292-297). Resumidamente, são tiradas radiografias de todas as fracturas antes dos testes biomecânicos. As propriedades mecânicas das fracturas a cicatrizar são analisadas através de um procedimento destrutivo de inclinação de três ou quatro pontos. É determinada a carga máxima, rigidez, energia na carga máxima, deflexão na carga máxima, e esforço máximo. EXEMPLO 5
CLONAGEM INTEIRA DO GPR119 ENDÓGENO HUMANO O polinucleótido codificando GPR119 endógeno humano foi clonado por PCR utilizando os iniciadores específicos de GPR119 5'-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3' (SEQ ID NO:3; com sentido, ATG como codão de iniciação) 5'-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3' (SEQ ID NO:4; anti-sentido, 3' do codão de terminação) e ADN genómico humano como molde. Foi utilizada ADN-polimerase
TM
TaqPlus Precision (Stratagene) para amplificação através do seguinte ciclo com o passo 2 ao passo 4 repetido 35 vezes: 94°C, 3 minutos; 94°C, 1 minuto; 58°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos; 72°C, 10 minutos. Um fragmento de PCR de 1,0 Kb do tamanho previsto foi isolado e clonado no vector pCRII-TOPO™ (Invitrogen) e completamente sequenciado utilizando o estojo T7 DNA sequenase de (Amersham) . Ver, SEQ ID NO:l para a sequência de ácido nucleico e SEQ ID NO:2 para a sequência de aminoácidos deduzida. EXEMPLO 6
EXPRESSÃO DO RECEPTOR
Embora esteja disponível na arte uma variedade de células para a expressão de receptores acoplados à proteína G, é preferido que sejam utilizadas células eucarióticas. Em certas concretizações, são utilizadas células de mamífero ou 109 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ melanóforos. Os seguintes são ilustrativos; os vulgares peritos na arte são creditados com a capacidade para determinar as técnicas que são preferencialmente benéficas para as necessidades do perito. Ver, p.ex., Exemplo 9, infra, uma vez que se refere a melanóforo. a. Transfecção Transiente
No dia um, são plaqueadas βχΙΟ6 células 293/caixa de 10 cm. No dia dois são preparados dois tubos reaccionais (as proporções a seguir para cada tubo são por placa): o tubo A é preparado através da mistura de 4 pg de ADN (p.ex., vector pCMV; vector pCMV com ADNc do receptor, etc.) em 0,5 ml de DME sem soro (Gibco BRL); o tubo B é preparado através da mistura de 24 μΐ de lipofectamina (Gibco BRL) em 0,5 ml de DMEM sem soro. Os tubos A e B são misturados através de inversões (várias vezes), seguidas de incubação à temperatura ambiente durante 30-45 min. A mistura é referida como "mistura de transfecção". As células 293 plaqueadas são lavadas com PBS lx, seguido de adição de 5 ml de DMEM sem soro. É adicionado 1 ml da mistura de transfecção às células, seguido de incubação durante 4 h a 37°C/C02 a 5%. A mistura de transfecção é removida através de aspiração, seguido da adição de 10 ml de DMEM/Soro Fetal Bovino a 10%. As células são incubadas a 37°C/C02 a 5%. Após incubação de 48 h, as células são colhidas e utilizadas para análise. b. Linhas Celulares Estáveis
Aproximadamente 12xl06 células 293 são plaqueadas numa placa de cultura de tecidos de 15 cm. São criadas em Meio DME Rico em Glicose contendo Soro Fetal Bovino a dez porcento e piruvato de sódio a um porcento, L-glutamina e antibióticos. Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células 293 (ou até «80% de confluência), as células são transfectadas utilizando 12 pg de ADN (p.ex., vector pCMV-neor com ADNc do receptor) . Os 12 pg de ADN são combinados com 60 pl de lipof ectamina e 2 ml de Meio DME Rico em Glicose sem soro. O meio é aspirado das placas e as células são lavadas uma vez com meio sem soro. A mistura de ADN, lipof ectamina, e meio é adicionada à placa juntamente com 10 ml de meio sem soro. Após incubação a 37°C durante quatro a cinco horas, o meio é 110 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ aspirado e são adicionados 25 ml de meio contendo soro. Vinte e quatro horas após a transfecção, o meio é aspirado novamente, e é adicionado meio com soro fresco. Quarenta e oito horas após a transfecção, o meio é aspirado e é adicionado meio fresco com soro contendo geneticina (fármaco G418) a uma concentração final de 500 pg/ml. As células transfectadas sofrem agora selecção de células positivamente transfectadas contendo o gene de resistência a G418. O meio é substituído a cada quatro a cinco dias à medida que a selecção ocorre. Durante a selecção, as células são criadas para obter bancos estáveis ou divididas para selecção clonal estável. EXEMPLO 7 ENSAIOS PARA PESQUISA DE COMPOSTOS CANDIDATOS COMO, P.EX., AGONISTAS DE GPR119
Está disponível uma variedade de abordagens para pesquisa de compostos candidatos como, p.ex., agonistas de GPR119. Os seguintes são ilustrativos; os peritos na arte são creditados com a capacidade para determinar as técnicas que são preferencialmente benéficas para as necessidades do perito. Os ensaios para pesquisa de compostos como agonistas de um receptor acoplado a proteína G são bem conhecidos dos peritos na arte (ver, p.ex., Pedido Internacional WO 02/42461).
1. Ensaios de Ligação à Membrana: Ensaio de [35S]GTPyS
Quando um receptor acoplado a proteína G está no seu estado activo, em resultado de ligação do ligando ou de activação constitutiva, o receptor acopla-se a uma proteína G e estimula a libertação de GDP e a subsequente ligação de GTP à proteína G. A subunidade alfa do complexo proteína G-receptor actua como GTPase e hidrolisa lentamente o GTP em GDP, ponto ao qual o receptor é normalmente desactivado. Os receptores activados continuam a permutar GDP por GTP. O análogo de GTP não hidrolisável, [35S]GTPyS, pode ser utilizado para demonstrar maior ligação de [35S]GTPyS às membranas expressando receptores activados. A vantagem de utilizar a ligação de [35S]GTPyS para medir a activação é que: (a) é genericamente aplicável a todos os receptores acoplados à proteína G; (b) está próximo à superfície da membrana 111 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ tornando-o menos provável de apanhar moléculas que afectem a cascata intracelular. O ensaio utiliza a capacidade dos receptores acoplados à proteína G para estimularem a ligação de [35S]GTPyS a membranas expressando os receptores relevantes. 0 ensaio é genérico e tem aplicação na descoberta de fármacos em todos os receptores acoplados à proteina G.
Preparação da Membrana
Nalgumas concretizações, as membranas compreendendo um receptor acoplado a proteina G do invento e para utilização na identificação de compostos candidatos como, p.ex., agonistas do receptor, são de preferência preparadas como se segue: a. Materiais 0 "Tampão de Extracção da Membrana" é constituído por HEPES 20 mM e EDTA 10 mM, pH 7,4; o "Tampão de Lavagem da Membrana" é constituído por HEPES 20 mM e EDTA 0,1 mM, pH 7,4; o "Tampão de Ligação" é constituído por HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, e MgCl2 10 mM, pH 7,4. b. Procedimento
Todos os materiais serão mantidos em gelo ao longo do procedimento. Primeiramente, o meio será aspirado de uma monocamada confluente de células, seguido de lavagem com 10 ml de PBS frio, seguido de aspiração. A partir daí, 5 ml de Tampão de Extracção da Membrana serão adicionados para raspagem das células; isto será seguido de transferência do extracto celular para tubos de centrífuga de 50 ml (centrifugados a 20000 rpm durante 17 minutos a 4°C). A partir daí, o sobrenadante será aspirado e o sedimento será ressuspenso em 30 ml de Tampão de Lavagem da Membrana seguido de centrifugação a 20000 rpm durante 17 minutos a 4°C. O sobrenadante será então aspirado e o sedimento ressuspenso em Tampão de Ligação. Isto será então homogeneizado utilizando um homogeneizador Brinkman Polytron™ (rajadas de 15-20 segundos até todo o material estar em suspensão). Isto é aqui referido como "Proteína Membranar". 112 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Ensaio Proteico de Bradford
Após a homogeneização, a concentração proteica das membranas será determinada utilizando o Ensaio Proteico de Bradford (a proteína pode ser diluida até cerca de 1,5 mg/ml, aliquotada e congelada (-80°C) para posterior utilização; quando congelada, o protocolo para utilização será como se segue: no dia do ensaio, a Proteína Membranar congelada é descongelada à temperatura ambiente, seguida de vórtice e depois homogeneizada com um Polytron a cerca de 12x 1000 rpm durante cerca de 5-10 segundos; observa-se que para múltiplas preparações, o homogeneizador deverá ser cuidadosamente limpo entre as homogeneizações das diferentes preparações). a. Materiais
Serão utilizados Tampão de Ligação (tal como acima); Reagente Corante de Bradford; Padrão Proteico de Bradford, seguindo as instruções do fabricante (Biorad, n°. cat. 500- 0006) . b. Procedimento
Serão preparados tubos em duplicado, um incluindo a membrana, e um como controlo "branco". Cada um continha 800 μΐ de Tampão de Ligação. A partir daí, 10 μΐ de Padrão Proteico de Bradford (1 mg/ml) será adicionado a cada tubo, e 10 μΐ de Proteína membranar serão então adicionados a apenas um tubo (não o branco) . A partir daí, 200 μΐ de Reagente Corante de Bradford serão adicionados a cada tubo, seguido de vórtice de cada um. Após cinco (5) minutos, os tubos serão novamente sujeitos a vórtice e o material nestes será transferido para cuvetes. As cuvetes serão então lidas utilizando um espectrofotómetro CECIL 3041, a um comprimento de onda de 595.
Ensaio de identificação a. Materiais O Tampão de GDP consiste em 37,5 ml de Tampão de Ligação e 2 mg de GDP (Sigma, n°. cat. G-7127), seguido de uma série 113 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ de diluições em Tampão de Ligação para obter GDP 0,2 μΜ (a concentração final de GDP em cada poço foi de GDP 0,1 μΜ) ; cada poço compreendendo um composto candidato, tem um volume final de 200 μΐ consistindo em 100 μΐ Tampão de GDP (concentração final, GDP 0,1 μΜ) , 50 μΐ de Proteína Membranar em Tampão de Ligação, e 50 μΐ de [35S]GTPyS (0,6 nM) em Tampão de Ligação (2,5 μΐ de [35S]GTPyS por 10 ml de Tampão de Ligação). b. Procedimento
Os compostos candidatos serão de preferência pesquisados utilizando um formato de placa de 96 poços (estes podem ser congelados a -80°C). A Proteína Membranar (ou as membranas com vector de expressão excluindo o GPCR Alvo, como controlo), será homogeneizada rapidamente enquanto em suspensão. A concentração proteica será então determinada utilizando o Ensaio Proteico de Bradford exposto acima. A Proteína Membranar (e o controlo) será então diluída até 0,25 mg/ml em Tampão de Ligação (concentração final do ensaio, 12,5 pg/poço). A partir daí, foram adicionados 100 μΐ de Tampão de GDP a cada poço de um Wallac Scintistrip™ (Wallac) . Uma ferramenta de pontas (pin-tool) de 5 μΐ será então utilizada para transferir 5 μΐ de um composto candidato para tal poço (i.e., 5 μΐ no volume total do ensaio de 200 μΐ é uma razão 1:40 para que a concentração final de pesquisa do composto candidato seja 10 μΜ). Novamente, para evitar contaminação, após cada passo de transferência a ferramenta de pontas deve ser lavada em três reservatórios compreendendo água (lx), etanol (lx) e água (2χ) - o líquido em excesso deve ser sacudido da ferramenta após cada lavagem e seco com papel e lenços de papel. A partir daí, 50 μΐ de Proteína Membranar serão adicionados a cada poço (foi também utilizado um poço de controlo compreendendo membranas sem o GPCR Alvo), e pré-incubados durante 5-10 minutos à temperatura ambiente. A partir daí, serão adicionados a cada poço 50 μΐ de [35S]GTPyS (0,6 nM) em Tampão de Ligação, seguido de incubação num agitador durante 60 minutos à temperatura ambiente (novamente, neste exemplo, as placas foram cobertas com folha de alumínio) . O ensaio será então parado fazendo girar as placas a 4000 RPM durante 15 minutos a 22°C. As placas serão então aspiradas com um colector de 8 canais e seladas com tampas de 114 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ placas. As placas serão então lidas num Wallac 1450 utilizando a regulação "Prot. #37" (segundo as instruções do fabricante). 2. Ensaio de Adenilil-Ciclase
Um estojo de Adenilil-Ciclase Flash Plate™ (New England Nuclear; N°. Cat. SMP004A) desenhado para ensaios baseados em células pode ser modificado para utilização com membranas plasmáticas brutas. Os poços das Placas Flash podem conter um revestimento cintilante que também contém um anticorpo especifico reconhecendo AMPc. O AMPc gerado nos poços pode ser quantificado através de uma competição directa pela ligação do indicador AMPc radioactivo ao anticorpo de AMPc. O seguinte serve como um breve protocolo para a medição das alterações nos niveis de AMPc em células que expressam os receptores.
Em certas concretizações, um estojo de Adenilil-Ciclase Flash Plate™ (New England Nuclear; N°. Cat. SMP004A) modificado é utilizado para identificação de compostos candidatos como, p.ex., agonistas de GPR119 de acordo com o seguinte protocolo. Células transfectadas com um receptor acoplado a proteína G do invento são colhidas aproximadamente três dias após a transfecção. As membranas são preparadas através de homogeneização das células suspensas em tampão contendo HEPES 20 mM, pH 7,4 e MgCl2 10 mM. A homogeneização é efectuada em gelo utilizando um Brinkman Polytron™ durante aproximadamente 10 segundos. O homogenato resultante é centrifugado a 49000 xg durante 15 minutos a 4°C. O sedimento resultante é então
ressuspenso em tampão contendo HEPES 20 mM, pH 7,4 e EDTA 0,1 mM, homogeneizado durante 10 segundos, seguido de centrifugação a 49000 xg durante 15 minutos a 4°C. O sedimento resultante é então armazenado a -80°C até ser utilizado. No dia da pesquisa directa de identificação, o sedimento de membranas é descongelado lentamente à temperatura ambiente, ressuspenso em tampão contendo HEPES 20 mM, pH 7,4 e MgCl2 10 mM, para produzir uma concentração proteica final de 0,60 mg/ml (as membranas ressuspensas são colocadas em gelo até à utilização). 115 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Os padrões de AMPc e o Tampão de Detecção (compreendendo 2 μΟί de indicador ([125I]AMPc (100 μΐ) para 11 ml de Tampão de Detecção)) são preparados e mantidos de acordo com as instruções do fabricante. O Tampão de Ensaio foi preparado de fresco para a pesquisa e continha HEPES 20 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, fosfocreatina 20 mM (Sigma), 0,1 unidades/ml de creatina-fosfocinase (Sigma), GTP 50 μΜ (Sigma), e ATP 0,2 mM (Sigma); o Tampão de Ensaio foi então armazenado em gelo até ser utilizado.
Os compostos candidatos são adicionados, de preferência, a p.ex. placas de 96 poços (3 μΐ/poço; concentração final de ensaio de 12 μΜ), juntamente com 40 μΐ de Proteína Membranar (30 pg/poço) e 50 μΐ de Tampão de Ensaio. Esta mistura foi então incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, com agitação suave.
Após a incubação, são adicionados 100 μΐ de Tampão de Detecção a cada poço, seguido de incubação durante 2-24 horas. As placas são então contadas num leitor de placas Wallac MicroBeta™ utilizando "Prot. #31" (de acordo com as instruções do fabricante). 3. Ensaio do Repórter CRE-Luc Células 293 e 293T são plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2xl04 células por poço e são transfectadas utilizando Reagente Lipofectamina (BRL) no dia seguinte de acordo com as instruções do fabricante. É preparada uma mistura de ADN/lípido para cada transfecção de 6 poços como se segue: 260 ng de ADN plasmídico em 100 μΐ de DMEM são suavemente misturados com 2 μΐ de lípido em 100 μΐ de DMEM (os 260 ng de ADN plasmídico consistem em 200 ng de um plasmídeo repórter 8xCRE-Luc, 50 ng de pCMV compreendendo um receptor acoplado a proteína G do invento ou apenas pCMV, e 10 ng de um plasmídeo de expressão de GPRS (GPRS em pcDNA3 (Invitrogen)). O plasmídeo repórter 8XCRE-Luc foi preparado como se segue: o vector SRIF-p-gal foi obtido através de clonagem do promotor da somatostatina de rato (-71/+51) no local BglV-HindlII no Vector Básico ppgal (Clontech). Oito (8) cópias de elemento de resposta de AMPc foram obtidas por PCR a partir de um molde de adenovírus AdpCFl26CCRE8 (ver, Suzuki et al., Hum. Gene Ther. 116 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ (1996) 7: 1883-1893; cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade) e clonadas no vector SRlF-3-gal no local Kpn-BglV, resultando no vector repórter 8xCRE-p-gal. 0 plasmideo repórter 8xCRE-Luc foi gerado através da substituição do gene da beta-galactosidase no vector repórter 8xCRE-p-gal pelo gene da luciferase obtido a partir do vector básico pGL3 (Promega) no local HindlII-Bamhl. Após uma incubação de 30 min. à temperatura ambiente, a mistura de ADN/lipido é diluida com 400 μΐ de dmem e 100 μΐ da mistura diluída são adicionados a cada poço. 100 μΐ de DMEM com FCS a 10% são adicionados a cada poço após uma incubação de 4 h numa incubadora de culturas celulares. No dia seguinte as células transfectadas são mudadas com 200 μΐ/poço de DMEM com FCS a 10%. Oito (8) horas depois, os poços são mudados para 100 μΐ/poço de DMEM sem vermelho fenólico, após uma lavagem com PBS. A actividade da luciferase é medida no dia seguinte utilizando o estojo de ensaio do gene repórter LucLite™ (Packard) seguindo as instruções do fabricante e lida num contador de cintilações e luminescência 1450 MicroBeta™ (Wallac). EXEMPLO 8: ENSAIO DE ADENILIL-CICLASE DE CÉLULAS INTEIRAS PARA, P.EX., ACTIVIDADE AGONISTA DE GPR119
As medições de AMP cíclico são feitas com um estojo de Adenilil-Ciclase Flash Plate™ (New England Nuclear) de acordo com o protocolo do fornecedor. Células HEK293 são plaqueadas em caixas de cultura de tecidos de 15 cm a 12xl06 células por caixa em meio de crescimento normal (DMEM/FBS a 10%) . No dia seguinte, 10 pg de ADN do vector vazio ou de ADN do plasmideo de expressão são transfectados para as células com lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas em cultura, as células transfectadas são colhidas para tampão de dissociação de células de GIBCO (Cat #13151-014), sedimentadas através de centrifugação durante 5 minutos a 1100 rpm, e cuidadosamente ressuspensas num volume apropriado de Tampão de Ensaio (50% de PBS lx e 50% de Tampão de Estimulação) para dar uma contagem celular final a 2xl06 células/ml. Os compostos de teste são preparados em 50 μΐ de Tampão de Ensaio à concentração de ensaio desejada quando indicado, e pipetados para os poços da Placa Flash de 96 poços. A suspensão celular preparada acima 117 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ foi então adicionada (50 μΐ por poço) . Após um tempo de incubação de 60 minutos à temperatura ambiente, 100 μΐ da Mistura de Detecçao contendo o indicador [ I]-AMPc são então adicionados aos poços. As placas são incubadas durante mais 2 horas seguidas de contagem num contador de cintilações Wallac MicroBeta. Os valores de AMPc/poço são extrapolados a partir de uma curva padrão do AMPc que é incluída em cada placa de ensaio.
Um aumento no nível de AMPc em células HEK293 transfectadas com GPR119 em relação ao de células HEK293 transfectadas com vector vazio é indicativo de um composto de teste ser um composto que estimula a funcionalidade do receptor GPR119. EXEMPLO 9: ENSAIO DE MELANÓFOROS PARA, P.EX., ACTIVIDADE AGONISTA DE GPR119
Os melanóforos são mantidos em cultura tal como relatado por Potenza et al. (Pigment Cell Research (1992) 5: 372-378) e transfectados com um vector de expressão codificando um receptor GPR119 (GPR119; p.ex., GPR119 humano, N°. de Entrada em GenBank® AAP72125 e alelos deste) utilizando electroporação. Após electroporação, as células transfectadas são plaqueadas em placas de 96 poços para o ensaio. As células são então deixadas crescer durante 48 horas para recuperar do procedimento de electroporação e alcançar níveis máximos de expressão do receptor.
No dia do ensaio, o meio de crescimento das células é substituído por tampão sem soro contendo melatonina 10 nM. A melatonina actua através de um GPCR acoplado a Gi endógeno nos melanóforos para baixar os níveis intracelulares de AMPc. Em resposta a níveis reduzidos de AMPc, os melanóforos translocam o seu pigmento para o centro da célula. O efeito líquido disto é uma significativa diminuição na leitura da absorvância da monocamada celular no poço, medida a 600-650 nM.
Após uma incubação de 1 hora em melatonina, as células tornam-se completamente de pigmento agregado. Neste momento é colhida uma leitura da absorvância limiar. São então adicionadas à placa diluições em série de compostos de teste, 118 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ e os compostos possuindo actividade agonista de GPR119 produzem aumentos nos níveis intracelulares de AMPc. Em resposta a estes níveis aumentados de AMPc, os melanóforos translocam o seu pigmento de novo para a periferia da célula. Após uma hora, as células estimuladas são completamente de pigmento disperso. A monocamada celular no estado disperso absorve muito mais luz no intervalo de 600-650 nM. O aumento medido na absorvância em comparação com a leitura do limiar permite quantificar o grau de estimulação do receptor e representar graficamente uma curva de resposta à dose.
Os materiais e métodos referentes ao ensaio de melanóforos é verificado nas Pat. U.S. Nos. 5462856 e 6051386, cuja divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
Um aumento na dispersão do pigmento em melanóforos transfectados com GPR119 acima daquele em melanóforos transfectados com vector vazio é indicativo de um composto de teste ser um composto que estimula a funcionalidade do receptor GPR119.
Outros ensaios para identificação de um composto como agonista de GPR119 serão facilmente aparentes aos peritos (ver, p.ex., Exemplo 7, supra). EXEMPLO 10: ENSAIO REPÓRTER DE LEVEDURA PARA, P.EX., ACTIVIDADE AGONISTA DE GPR119
Os ensaios repórter baseados em células de levedura foram previamente descritos na literatura (p.ex., ver Miret et al., J. Biol. Chem. (2002) 277: 6881-6887; Campbell et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9: 2413-2418; King et al., Science (1990) 250: 121-123; WO 99/14344; WO 00/12704; e US 6100042). Resumidamente, células de levedura foram modificadas para que o G-alfa de levedura endógeno (GPA 1) fosse suprimido e substituído por quimeras de proteína G construídas utilizando múltiplas técnicas. Adicionalmente, o GPCR endógeno de células alfa de levedura, Ste3 foi suprimido para permitir uma expressão homóloga de um GPCR de mamífero à escolha. Na levedura, os elementos da via de transdução de sinal da ferormona, que são conservados em células eucarióticas (por 119 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ exemplo, a via da proteína cinase activada por mitogénio), dirigem a expressão de Fus 1. Através da colocação da β-galactosidase (LacZ) sob o controlo do promotor de Fusl (Fus lp), foi desenvolvido um sistema através do qual a activação do receptor conduz a uma leitura enzimática.
As células de levedura são transformadas através de uma adaptação do método de acetato de lítio descrito por Agatep et al. (Agatep et al., 1998, "Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol". Technical Tips Online, Trends Journals, Elsevier). Resumidamente, células de levedura são criadas de um dia para o outro em placas de triptona de levedura (YT). ADN de cadeia simples transportador (10 pg), 2 pg de cada um dos dois plasmídeos repórter Fuslp-LacZ (um com marcador de selecção URA e um com TRP), 2 pg de GPR119 (p.ex., receptor humano) em vector de expressão de levedura (2 pg de origem de replicação) e um tampão acetato de lítio/polietilenoglicol/TE são pipetados para um tubo Eppendorf. O plasmideo de expressão de levedura contendo o receptor/controlo sem receptor tem um marcador LEU. As células de levedura são inoculadas nesta mistura e a reacção prossegue a 30°C durante 60 min. As células de levedura são então sujeitas a choque térmico a 42°C durante 15 min. As células são então lavadas e espalhadas em placas de selecção. As placas de selecção são meio de levedura definido sintético menos LEU, URA e TRP (SD-LUT). Após incubação a 30°C durante 2-3 dias, as colónias que crescem nas placas de selecção são então testadas no ensaio de LacZ.
Para efectuar ensaios enzimáticos fluorimétricos para β-galactosidase, células de levedura possuindo o receptor GPR119 sujeito são criadas de um dia para o outro em meio líquido SD-LUT até uma concentração não saturada (i.e. as células estão ainda em divisão e não alcançaram ainda a fase estacionária). Elas são diluídas em meio fresco até uma concentração óptima de ensaio e são adicionados 90 pl de células de levedura a placas de 96 poços de poliestireno pretas (Costar). Os compostos de teste, dissolvidos em DMSO e diluídos numa solução de DMSO a 10% até uma concentração de 10x, são adicionados às placas e as placas são colocadas a 30°C durante 4h. Após 4h, o substrato para a β-galactosidase é 120 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ adicionado a cada poço. Nestas experiências, é utilizado di(p-D-galactopiranósido) de Fluoresceína (FDG), um substrato para a enzima que liberta fluoresceína, permitindo uma leitura fluorimétrica. São adicionados 20 μΐ por poço de FDG 500 μΜ/Triton X 100 a 2,5% (o detergente é necessário para tornar as células permeáveis). Após incubação das células com o substrato durante 60 min, são adicionados 20 μΐ por poço de carbonato de sódio 1 M para terminar a reacção e aumentar o sinal fluorescente. As placas são então lidas num fluorímetro a 485/535 nM.
Um aumento no sinal fluorescente em células de levedura transformadas com GPR119 em relação às células de levedura transformadas com vector vazio é indicativo de um composto de teste ser um composto que estimula a funcionalidade do receptor GPR119 (p.ex., um composto que é um agonista ou agonista parcial de GPR119). Em certas concretizações, os compostos do invento dão um aumento no sinal fluorescente acima do sinal de fundo (o sinal obtido na presença de apenas veículo).
EXEMPLO 11: COMPOSTO MARCADO RADIOACTIVAMENTE 125 T 131-1- -L t -1- t 75Br, 76Br, 150,
Em certas concretizações, um composto que se saiba ser um ligando de um receptor acoplado a proteína G do invento é marcado radioactivamente. Um composto marcado radioactivamente tal como aqui descrito pode ser utilizado num ensaio de pesquisa para identificar/avaliar os compostos. Em termos gerais, um composto recentemente sintetizado ou identificado (i.e., composto de teste) pode ser avaliado quanto à sua capacidade para reduzir a ligação ao receptor do ligando conhecido marcado radioactivamente, através da sua capacidade para reduzir a formação do complexo entre o ligando conhecido marcado radioactivamente e o receptor. Radionuclídeos adequados que podem ser incorporados em compostos do presente invento incluem, mas não se limitam a, 3H (também escrito como T), nC, 14C, 18F, 125I, 82Br, 123I, 124I, 13N, 35S e 77Br. Os compostos que incorporam 3H, 14C, 125I, 131I, q c Q o S ou Br serão geralmente mais uteis.
Entenda-se que um composto "marcado radioactivamente" é um composto que incorporou pelo menos um radionuclídeo. 121 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ
Nalgumas concretizações, ο radionuclídeo é seleccionado a partir do grupo que consiste em H, C, I, Se Br. Nalgumas concretizações, o radionuclídeo é 3H ou 14C. Além disso, deve entender-se que todos os átomos representados nos compostos que se sabe serem ligandos de um receptor acoplado a proteína G do invento podem ser os isótopos de tais átomos de ocorrência mais frequente ou o radioisótopo mais raro ou o isótopo não radioactivo. Métodos sintéticos para incorporação de radioisótopos em compostos orgânicos incluindo os aplicáveis a estes compostos que se sabe serem ligandos de um receptor acoplado a proteína G do invento são bem conhecidos na arte e incluem a incorporação de níveis de actividade de trítio em moléculas alvo, incluem: A. Redução Catalítica com Trítio Gasoso - Este procedimento produz normalmente produtos de elevada actividade específica e requer precursores halogenados ou insaturados. B. Redução com Boro-hidreto de Sódio [3H] - Este procedimento é pouco dispendioso e requer precursores contendo grupos funcionais redutíveis tais como aldeídos, cetonas, lactonas, ésteres e semelhantes. C. Redução com Hidreto de Alumínio e Lítio [3H] - Este procedimento oferece produtos quase às actividades específicas teóricas. Requer também precursores contendo grupos funcionais redutíveis tais como aldeídos, cetonas, lactonas, ésteres e semelhantes. D. Marcação de Exposição a Trítio Gasoso - Este procedimento envolve a exposição de precursores contendo protões permutáveis a trítio gasoso na presença de um catalisador adequado. E. N-Metilação utilizando Iodeto de Metilo [3H] - Este procedimento é habitualmente empregue para preparar produtos O-metilo ou N-metilo (3H) através de tratamento de precursores apropriados com iodeto de metilo (3H) de elevada actividade específica. Este método permite em geral uma elevada actividade específica, tal como de cerca de 80-87 Ci/mmol. Métodos sintéticos para incorporação de níveis de actividade de 125i em moléculas alvo incluem: A. Reacção de Sandmeyer e semelhantes - Este procedimento transforma uma aril- ou heteroaril-amina num sal de diazónio, tal como um sal tetrafluoroborato, e subsequentemente em composto marcado com 125I utilizando Na125I. Um procedimento representado foi relatado por Zhu, D.-G. e colegas em J. Org. Chem. (2002) 67: 122 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 1 ρ c 943-948. Β. Orto- Iodaçao de fenóis - Este procedimento 125 permite a incorporação de I na posição orto de um fenol tal como relatado por Collier, T.L. e colegas em J. Labelled Compd. Radiopharm. (1999) 42: S264-S266. C. Permuta de brometo de arilo e heteroarilo com 115I - Este método é geralmente um processo de dois passos. 0 primeiro passo é a conversão do brometo de arilo ou heteroarilo no intermediário trialquiltin correspondente utilizando, por exemplo, uma reacção catalisada com Pd (i.e. Pd(Ph3P)4) ou através de um lítio de arilo ou heteroarilo, na presença de um tri-alquiltin-halogeneto ou hexa-alquilditin [p.ex., (CH3)3SnSn(CH3)3) . Um procedimento representado foi relatado por Bas, M.-D. e colegas em J. Labelled Compd. Radiopharm. (2001) 44: S280-S282.
Pretende-se que as técnicas anteriores sejam ilustrativas e não limitantes. Outras técnicas para marcação radioactiva de um composto que se saiba ser um ligando de um receptor acoplado a proteina G do invento são bem conhecidas dos peritos na arte.
EXEMPLO 12: ENSAIO DE LIGAÇÃO AO RECEPTOR
Um composto de teste pode ser avaliado quanto à sua capacidade para reduzir a formação do complexo entre um composto que se saiba ser um ligando de um receptor acoplado a proteina G do invento e o receptor. Em certas concretizações, o ligando conhecido é marcado radioactivamente. O ligando marcado radioactivamente conhecido pode ser utilizado num ensaio de pesquisa para identificar/avaliar compostos. Em termos gerais, um composto recentemente sintetizado ou identificado (i.e., composto de teste) pode ser avaliado quanto à sua capacidade para reduzir a ligação ao receptor do ligando conhecido marcado radioactivamente, através da sua capacidade par reduzir a formação do complexo entre o ligando conhecido marcado radioactivamente e o receptor.
Um nivel de ligação específica do ligando conhecido marcado radioactivamente na presença do composto de teste inferior a um nivel de ligação especifica do ligando conhecido marcado radioactivamente na ausência do composto de teste é indicativa de ser formado menos complexo entre o referido ligando conhecido marcado radioactivamente e o referido 123 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ receptor na presença do composto de teste que na ausência do composto de teste.
Protocolo de Ensaio para Detecção do Complexo Entre um Composto que se Saiba ser um Ligando de um Receptor Acoplado a Proteína G do Invento e o Receptor A. Preparação do Receptor
As células 293 são transfectadas transientemente com 10 pg de vector de expressão compreendendo um polinucleótido codificando um receptor acoplado a proteína G do invento utilizando 60 μΐ de Lipofectamina (por caixa de 15 cm) . As células transientemente transfectadas são criadas na caixa durante 24 horas (75% de confluência) com uma mudança de meio e removidas com 10 ml/caixa de tampão Hepes-EDTA (HEPES 20 mM + EDTA 10 mM, pH 7,4). As células são então centrifugadas numa centrífuga Beckman Coulter durante 20 minutos, 17000 rpm (rotor ja-25.50). Subsequentemente, o sedimento é ressuspenso em HEPES 20 mM + EDTA 1 mM, pH 7,4 e homogeneizadas com um homogeneizador Dounce de 50 ml e novamente centrifugadas. Após remoção do sobrenadante, os sedimentos são armazenados a -80°C, até serem utilizados no ensaio de ligação. Quando utilizadas no ensaio, as membranas são descongeladas em gelo durante 20 minutos e depois são adicionados 10 ml de tampão de incubação (Hepes 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4). As membranas são então sujeitas a vórtice para ressuspender o sedimento de membranas bruto e homogeneizado com um homogeneizador Brinkmann PT-3100 Polytron durante 15 segundos na regulação 6. A concentração de proteína membranar é determinada utilizando o ensaio proteico de Bradford de BRL. B. Ensaio de Ligação
Para ligação total, é adicionado um volume total de 50 μΐ de membranas apropriadamente diluídas (diluídas em tampão de ensaio contendo Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, e EDTA 1 mM; 5-50 pg de proteína) a placas de microtitulação de polipropileno de 96 poços seguido da adição de 100 μΐ de tampão de ensaio e 50 μΐ de um ligando conhecido marcado radioactivamente. Para ligação não específica, são adicionados 50 μΐ de tampão de ensaio em vez de 100 μΐ e são adicionados 124 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ mais 50 μΐ de 10 μΜ do referido ligando conhecido que não é marcado radioactivamente antes de serem adicionados 50 μΐ do referido ligando conhecido marcado radioactivamente. As placas são então incubadas à temperatura ambiente durante 60-120 minutos. A reacção de ligação é terminada através da filtração das placas de ensaio através de uma placa de filtração Microplate Devices GF/C Unifilter com um dispositivo de colheita de placas de 96 poços Brandell seguido de lavagem com Tris-HCl 50 mM frio, pH 7,4 contendo NaCl a 0,9%. Depois, o fundo da placa de filtração é selado, são adicionados 50 μΐ de Optiphase Supermix a cada poço, o topo das placas é selado, e as placas são contadas num contador de cintilações Trilux MicroBeta. Para determinação de se é formado menos do complexo entre o referido ligando conhecido marcado radioactivamente e o referido receptor na presença de um composto de teste, em vez da adição de 100 μΐ de tampão de ensaio, são adicionados 100 μΐ do referido composto de teste apropriadamente diluído aos poços apropriados seguido da adição de 50 μΐ do referido ligando conhecido marcado radioactivamente. C. Cálculos
Os compostos de teste são inicialmente avaliados a 10, 1 e 0,1 μΜ e depois a um intervalo de concentrações escolhido para que a dose do meio cause cerca de 50% de inibição da ligação do ligando conhecido marcado radioactivamente (i.e., CI50) · A ligação específica na ausência de composto de teste (B0) é a diferença da ligação total (BT) menos a ligação não específica (NSB) e semelhantemente a ligação específica (na presença de composto de teste) (B) é a diferença da ligação de deslocamento (BD) menos a ligação não específica (NSB). A CI50 é determinada a partir de uma curva de resposta de inibição, gráfico logit-log da % de B/B0 vs concentração do composto de teste.
Ki é calculada através da transformação de Cheng e Prustoff: Κ!=ΙΟΜ\(! +(r]\JCD) onde [L] é a concentração do ligando conhecido marcado radioactivamente no ensaio e KD é a constante de dissociação 125 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ do ligando conhecido marcado radioactivamente determinada independentemente sob as mesmas condições de ligação. EXEMPLO 13
EFEITO DO AGONISTA DE GPR119 NA SECREÇÃO DE GIP NA LINHA CELULAR ENTEROENDÓCRINA OU EM CÉLULAS EM TECIDO DE UMA REGIÃO RICA EM CÉLULAS K DO INTESTINO DELGADO
Pode mostrar-se que um agonista de GPR119 de acordo com o presente invento estimula a secreção de GIP num linha celular enteroendócrina ou em células em tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K (p.ex., tecido do duodeno ou do jejuno; ver, p.ex., Sondhi et al., Pharmacogenetics J. (2006) 6: 131-140) utilizando o ensaio in vitro aqui descrito. As células enteroendócrinas ou células em tecido derivado de uma região do intestino delgado rica em células K são plaqueadas em placas de 24 poços no dia um em meio de cultura completo (DMEM/FBS a 10%). No dia dois o meio de cultura é substituído por um meio pobre em glicose (DMEM/Glicose 3 mM/FBS a 10%). No dia três as células são lavadas duas vezes com PBS lx. As células lavadas são estimuladas com veículo ou com agonista de GPR119 a várias concentrações (p.ex., no intervalo de 1 nM a 20 μΜ) ou com forscolina (1 μΜ) como controlo positivo em DMEM sem soro com glicose 15 mM durante uma hora a 37°C e CO2 a 5% numa incubadora de cultura de tecidos. Os sobrenadantes são então colhidos e clarificados através de centrifugação a 500 g e 4°C durante 5 minutos. O GIP libertado para o sobrenadante é determinado através de ELISA utilizando reagentes adquiridos em LINCO Research Laboratory (Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) elisa Catálogo # ezrmgip-55K) , seguindo as instruções proporcionadas pelo fornecedor.
LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Arena Pharmaceuticals, Inc. Chu, Zhi-Liang Leonard, James 126 ΕΡ 1 971 862/ΡΤ < 12 Ο > MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DO RECEPTOR GPR119 PARA IDENTIFICAR COMPOSTOS ÚTEIS PARA AUMENTO DA MASSA ÓSSEA NUM INDIVÍDUO <130> 122.WOl <150> 60/791,550 <151> 2006-04-11 <160> 4 <170> Patentln versão 3.2
<210> 1 <211> 1008 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 atggaatcat ctttctcatt tggagtgaxc cttgctgtcc tggcctctct catcatcgct 60 actaacacac tagxggcxgx ggctgtgctg ctgttgatcc acaagaatga xggtgtcagt 120 ctctgcttca ccttgaatct ggctgtgget gacaeettga ttggxgtggc catctctggc 1*0 ctactcacag accagctctc cagcccttct cggcccacac agaagaccct gtgcagcctg 240 cggatggcat ttgtcacxtc ctccgcagct gcctctgxcc tcacggtcat gctgatcacc 300 cttgaeaggt accttgccat caagcagccc ttccgctact tgaagatcat gagtgggttc 360 gtggccggge cctgcattgc cgggctgtgg ttagtgtctt acctcattgg cttcctccca 420 cxcggaatce ccatgrtcca gcagactgcc tacaaagggc agtgcagttt ctttgctgta 460 tttcaeeetc acttcgtgct gaeectitee tgcgttggct tctccccagc catgctcctc 540 tttgtcttct tctactgcga catgctcaag attgcetcca tgeaeageca geagattxga 600 aagatggaac axgcaggagc catggctgga ggttatcgat ccccacggac tcccagcgac 660 ttcaaagctc tccgtactgt gtctgttctc attgggagct ttgctctatc ctggaccccc 720 ttccttatca ctggcattgt gcaggtggce tgceagg&gt gccacctcta cctagtgcte 710 gaacggtacc tgtggctgct cggcgtgggc aacxccctgc tcaacccact eatctatgce 840 tattggcaga aggaggtgcg actgcagcte taccacatgg ccctaggagt gaagaaggtg 900 ctcacctcac tcctcctctt tctctcggcc aggaattgtg geccagagag gcccagggaa 960 agttcctgtc acatcgtcac tatctccagc tcagagtttg atggctaa 1008
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Lisboa, 2011-02-07

Claims (69)

  1. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 1/14 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um receptor acoplado a proteina G para identificação de secretagogos de GIP, num método in vitro compreendendo os passos de: (a) contacto de um composto de teste com uma célula hospedeira ou com membrana de uma célula hospedeira compreendendo o referido receptor acoplado a proteina G, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; e (b) determinação da capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 2/14
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, e compreendendo ainda: (c) o contacto in vitro de um composto que estimula a funcionalidade do receptor no passo (b) com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de segregar GIP; e (d) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, e compreendendo ainda: (c) a determinação de se o composto aumenta um nível de GIP num vertebrado, através da medição do nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto que estimula a funcionalidade do receptor no passo (b); em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o vertebrado é um vertebrado não humano.
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o receptor é recombinante.
  6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o receptor acoplado a proteína G.
  7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida determinação é através da medição do nível de um mensageiro secundário. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 3/14
  8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o mensageiro secundário é seleccionado a partir do grupo que consiste em AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), actividade de MAP-cinase, actividade de MAPK/ERK-cinase-cinase-1 (MEKK1), e Ca2+.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que um nível de AMPc está aumentado.
  10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida determinação é através da utilização de um ensaio de Melanóforos, através da medição da ligação de GTPyS a uma membrana compreendendo o referido GPCR, ou através de um ensaio repórter.
  11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero.
  12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura.
  13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira melanóforo.
  14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o composto de teste é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ id NO:2 .
  16. 16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ id NO:2. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 4/14
  17. 17. Método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo os passos de: (a) contacto in vitro de um agonista de GPR119 com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de segregar GIP; e (b) determinação de se o agonista de GPR119 estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do agonista de GPR119 para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou célula capaz de segregar GIP é indicativa do agonista de GPR119 ser um secretagogo de GIP.
  18. 18. Método para identificação de secretagogos de GIP, compreendendo o passo de: (a) determinação de se um agonista de GPR119 aumenta um nivel de GIP num vertebrado, através da medição do nível de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado o agonista de GPR119 ; em que a capacidade do agonista de GPR119 para aumentar um nível de GIP no vertebrado é indicativa do agonista de GPR119 ser um secretagogo de GIP.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o vertebrado é um humano.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o vertebrado é um vertebrado não humano.
  21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em que o agonista de GPR119 é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21 em que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 5/14
  23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, em que o agonista de GPR119 é um agonista selectivo de GPR119.
  24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, em que o agonista de GPR119 tem uma CE50 de menos de 10 μΜ.
  25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, em que o agonista de GPR119 tem uma CE50 de menos de 1 μΜ.
  26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, em que o agonista de GPR119 tem um EC50 de menos de 100 nM.
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo antes do passo (a) os passos adicionais in vitro de: (x) contacto de um composto de teste com uma célula hospedeira ou com membrana de uma célula hospedeira compreendendo um receptor acoplado a proteína G, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID N0:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID N0:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID NO:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 6/14 (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il] -5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; e (y) determinação da capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP, e em que o agonista de GPR119 do passo (a) é um composto de teste identificado como estimulando a funcionalidade do receptor no passo (y).
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 18, compreendendo antes do passo (a) os passos adicionais in vitro de: (x) contacto de um composto de teste com uma célula hospedeira ou com membrana de uma célula hospedeira compreendendo um receptor acoplado a proteína G, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID N0:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID N0:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 7/14 (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; e (y) determinação da capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor; em que a capacidade do composto de teste para estimular a funcionalidade do receptor é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP, e em que o agonista de GPR119 do passo (a) é um composto de teste identificado como estimulando a funcionalidade do receptor no passo y.
  29. 29. Método da reivindicação 28, em que o vertebrado é um humano.
  30. 30. Método da reivindicação 28, em que o vertebrado é um vertebrado não humano.
  31. 31. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 30, em que o receptor é recombinante.
  32. 32. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 31, em que a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o receptor acoplado a proteína G.
  33. 33. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 32, em que a referida determinação é através da medição do nível de um mensageiro secundário.
  34. 34. Método da reivindicação 33, em que o mensageiro secundário é seleccionado a partir do grupo que consiste em AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), actividade de MAP-cinase, actividade de MAPK/ERK-cinase-cinase-1 (MEKKl), e Ca2+. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 8/14
  35. 35. Método da reivindicação 34, em que um nível de AMPc está aumentado.
  36. 36. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 32, em que a referida determinação é através da utilização de um ensaio de Melanóforos, através da medição da ligação de ΘΤΡγΞ a uma membrana compreendendo o referido GPCR, ou através de um ensaio repórter.
  37. 37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero.
  38. 38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura.
  39. 39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira melanóforo.
  40. 40. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 39, em que o composto de teste é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  41. 41. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 40, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
  42. 42. Método de qualquer uma das reivindicações 27 a 41, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
  43. 43. Utilização de um receptor acoplado a proteína G para identificação de secretagogos de GIP, num método in vitro compreendendo os passos de: (a) contacto de um receptor acoplado a proteína G com um ligando conhecido opcionalmente marcado com o receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 9/14 (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID N0:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; e (b) detecção do complexo entre o referido ligando conhecido e o referido receptor; e (c) determinação de se é formado menos do referido complexo na presença do composto de teste que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
  44. 44. Utilização de acordo com a reivindicação 43 em que o referido método compreende ainda: (d) o contacto in vitro de um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c) com uma célula enteroendócrina de vertebrado ou uma célula capaz de segregar GIP; e ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 10/14 (e) a determinação de se o composto estimula a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de segregar GIP; em que a capacidade do composto de teste para estimular a secreção de GIP a partir da célula enteroendócrina de vertebrado ou da célula capaz de segregar GIP é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
  45. 45. Utilização de acordo com a reivindicação 43 em que o referido método compreende ainda (d) a determinação de se o composto aumenta um nivel de GIP num vertebrado, através da medição do nivel de GIP numa amostra obtida a partir de um vertebrado ao qual foi previamente administrado um composto na presença do qual se forma menos do referido complexo no passo (c); em que a capacidade do composto de teste para aumentar um nivel de GIP no vertebrado é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP.
  46. 46. Utilização de acordo com a reivindicação 45 em que o vertebrado é um vertebrado não humano.
  47. 47. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, em que o receptor é recombinante.
  48. 48. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, em que a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o receptor acoplado a proteina G.
  49. 49. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, em que o ligando conhecido é um agonista de GPR119.
  50. 50. Utilização de acordo com a reivindicação 49, em que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
  51. 51. Utilização de acordo com a reivindicação 49 ou reivindicação 50 em que o referido agonista de GPR119 é um agonista selectivo de GPR119. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 11/14
  52. 52. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, em que o agonista de GPR119 tem uma CE50 de menos de um valor seleccionado a partir do grupo que consiste em 10 μΜ, 1 μΜ e 100 nM.
  53. 53. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 52, em que o agonista de GPR119 é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  54. 54. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 53, em que o composto de teste é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  55. 55. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 54, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2 .
  56. 56. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 55, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
  57. 57. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo antes do passo (a) os passos adicionais in vitro de: (x) contacto de um receptor acoplado a proteina G com um ligando conhecido do receptor opcionalmente marcado na presença ou ausência de um composto de teste, em que o receptor acoplado a proteina G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO: 2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4; ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 12/14 (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO:1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO: 2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il] -5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; (y) detecção do complexo entre o referido ligando conhecido e o referido receptor; e (z) determinação de se é formado menos do referido complexo na presença do composto de teste que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP, e em que o agonista de GPR119 do passo (a) é um composto de teste determinado no passo (z) como sendo um composto na presença do qual é formado menos do referido complexo.
  58. 58. Método de acordo com a reivindicação 18, compreendendo antes do passo (a) os passos adicionais in vitro de: (x) contacto de um receptor acoplado a proteína G com um ligando conhecido opcionalmente marcado do receptor na presença ou ausência de um composto de teste, em que o receptor acoplado a proteína G compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ ID NO:2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ ID NO:2; (iii) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G codificada por um polinucleótido que é amplificável por reacção em cadeia da polimerase (PCR) ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 13/14 numa amostra de ADN humano utilizando os iniciadores específicos SEQ ID N0:3 e SEQ ID NO:4; (iv) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteina G codificada por um polinucleótido que híbrida sob condições de elevado rigor com o complemento de SEQ ID NO: 1; (v) a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2; (vi) a sequência de aminoácidos de uma versão constitutivamente activa de um receptor acoplado a proteína G possuindo SEQ ID NO:2; e (vii) um fragmento biologicamente activo de (i) ou (ii), em que o referido fragmento biologicamente activo é capaz de se ligar a (2-Fluoro-4-metanossulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-l-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; (y) detecção do complexo entre o referido ligando conhecido e o referido receptor; e (z) determinação de se é formado menos do referido complexo na presença do composto de teste que na ausência do composto de teste; em que a referida determinação é indicativa do composto de teste ser um secretagogo de GIP e em que o agonista de GPR119 do passo (a) é um composto de teste determinado no passo (z) como sendo um composto na presença do qual é formado menos do referido complexo.
  59. 59. Método de acordo com a reivindicação 58, em que o vertebrado é um vertebrado não humano.
  60. 60. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 59, em que o receptor é recombinante.
  61. 61. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 60, em que a célula hospedeira compreende um vector de expressão, compreendendo o referido vector de expressão um polinucleótido codificando o receptor acoplado a proteína G. ΕΡ 1 971 862/ΡΤ 14/14
  62. 62. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 61, em que o ligando conhecido é um agonista de GPR119.
  63. 63. Método da reivindicação 62, em que o agonista de GPR119 é um agonista de GPR119 humano.
  64. 64. Método da reivindicação 62 ou reivindicação 63 em que o referido agonista de GPR119 é um agonista selectivo.
  65. 65. Método de qualquer uma das reivindicações 62 a 64, em que o agonista de GPR119 tem uma CE50 de menos de um valor seleccionado a partir do grupo que consiste em 10 μΜ, 1 μΜ e 100 nM.
  66. 66. Método de qualquer uma das reivindicações 62 a 65, em que o agonista de GPR119 é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  67. 67. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 66, em que o composto de teste é uma molécula pequena possuindo um peso molecular de menos de cerca de 5000 gramas por mole.
  68. 68. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 67, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de um receptor acoplado a proteína G possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade com SEQ ID NO:2.
  69. 69. Método de qualquer uma das reivindicações 57 a 68, em que o receptor compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Lisboa, 2011-02-07 Figura ΙΑ. Análise Farmacodinâmica de GIP em Ratinhos Tratados com Agonista de GPR119 versus Não Tratados Veículo I Id/398 ΙΔ 6 T <33 700 Agonista de GPR119
    0 2 5 10 20 40 μ \ Ui Tempo (min.) Figura 1B. Análise Famacodinâmica de 6IP em Ratinhos Tratados com Agonista de GPR119 versus Não Tratados v] μ 8 6 2 /PT
    Tempo (min.) M Figura 1C, Estimulação Dependente da Dose do 6IP Plasmático Total pelo Agonista de GPR119 em Ratinhos μ μ μ 8 6 2 (tw/£>c3.) oox^uisexa <310 350* 300' Μ> q Veículo | Agonista de GPR119 (1 mpk) 0 Agonista de GPR119 (3 mpk) 1 Agonista de GPR119 (10 mpk) m 150
    ω \ Ui Tempo (min.) 5 Figura 2A, Perda de Estimulação da Libertação de 6IP Dependente de Glicose e Independente de Glicose pelo Agonista de GPR119 em Ratinhos Deficientes em GPR119 (knock-out) Ratinhos Deficientes em GPR119 Tipo Selvagem da Mesma Ninhada M/U 600- 500- PVeículo | Agonista de GPR119
    •100'
    0 5 0 Tempo (min.) 5 Figura 2B. Ferda de Estimulação do GIF Flasmático Total pelo Agonista de GFR119 em Ratinhos Deficientes em GPR119 (Jcnod-out) Tipo Selvagem Deficientes em GPR119 (Xui/BcJ) xeq.oji oo-çq.BuiSBx<J aiO
    500' □ I Veículo Agonista de GPR119
    Tempo (min.) Relativamente ao Bolo de Glicose
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