JP2002526554A - 骨親和性ホルモンとして用いられるグルコース依存性インスリン親和性ペプチド - Google Patents
骨親和性ホルモンとして用いられるグルコース依存性インスリン親和性ペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
実験例から、ＧＩＰ受容体ｍＲＮＡおよびタンパク質が正常な骨と骨芽様細胞株に存在し、ＧＩＰに対する親和性の高い受容体が１２５Ｉ ＧＩＰ結合実験で実証し得ることが示されている。骨芽様細胞株（ＳａＯＳ２）に施した場合、ＧＩＰの刺激により細胞ｃＡＭＰ含有量と細胞内カルシウムが増加し、この双方の反応は投与量に依存した。さらに、ＧＩＰの投与によりＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現が上昇すると同時にアルカリホスファターゼ活性が増加する結果となる。この双方の効果は前骨芽細胞の同化作用に反映する。これらの結果は、ＧＩＰ受容体が骨と骨芽様細胞に存在し、ＧＩＰがこれらの細胞の作用を調節することを最初に実証するものである。ＧＩＰは再構築される骨に対して同化作用を有し、骨多孔症のラットモデルで脊椎骨密度を増加させる。ＧＩＰは１０ｎＭで胎児長骨分析におけるＰＴＨ誘発骨再吸収を阻害し、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡの合成を刺激する。ＧＩＰを過剰発現する遺伝子導入マウスでは、同じ年齢の対照動物と比較して骨密度が増加している。従って、ＧＩＰまたはその類似体を骨再吸収を阻止し、骨密度を維持または増加させる治療薬として使用することができる。ＧＩＰ受容体への結合を阻止する化合物であるＧＩＰ拮抗薬を、骨密度を減少させるために使用することができる。
Description
【０００１】 発明の背景 ＮＩＨ助成金ＤＫ−１９８１３およびＨＤ ３４１４９、および筋骨格疾患Ｙ
ａｌｅ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐ３０ ＡＲ４６０３２に基づき、米国政府
は本発明の権利を有する。
ａｌｅ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐ３０ ＡＲ４６０３２に基づき、米国政府
は本発明の権利を有する。
【０００２】 グルコース依存性インスリン親和性ペプチド（ＧＩＰ）は４２個のアミノ酸を
有するペプチドであり、小腸の内分泌細胞で合成され、分泌される。ＧＩＰの養
分摂取およびインスリン分泌の結び付けにおける役割、すなわち「インクレチン
（ｉｎｃｒｅｔｉｎ）効果」は良く知られている。副甲状腺ホルモンおよびビタ
ミンＤが骨形成のためのカルシウム摂取に関連することが知られているが、養分
摂取と骨形成を結び付けるホルモンは知られていない。
有するペプチドであり、小腸の内分泌細胞で合成され、分泌される。ＧＩＰの養
分摂取およびインスリン分泌の結び付けにおける役割、すなわち「インクレチン
（ｉｎｃｒｅｔｉｎ）効果」は良く知られている。副甲状腺ホルモンおよびビタ
ミンＤが骨形成のためのカルシウム摂取に関連することが知られているが、養分
摂取と骨形成を結び付けるホルモンは知られていない。
【０００３】 ＧＩＰは近位小腸内の腸内内分泌細胞から分泌されるが、他の主要「インクレ
チン」ホルモンであるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は末端小腸内の内
分泌細胞から分泌される。最近まで、グルコース依存性インスリン親和性ペプチ
ド（ＧＩＰ）は小腸内分泌系のパロキアル（ｐａｒｏｃｈｉａｌ）ホルモンであ
り、その主要な作用部位は内分泌膵臓のβ−細胞であると考えられていた［Ｒ．
Ａ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９９、７８０−７８５
（１９７６）］。しかしながら、ＧＩＰ受容体のクローニングにより、受容体は
外分泌膵臓およびいくつかの血管ベッドの遠位の小細胞を含む広範囲の組織や器
官で発現することが発見された［Ｔ． Ｂ． Ｕｓｄｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３３、２８６１−２８７０（１９９３）］。
チン」ホルモンであるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は末端小腸内の内
分泌細胞から分泌される。最近まで、グルコース依存性インスリン親和性ペプチ
ド（ＧＩＰ）は小腸内分泌系のパロキアル（ｐａｒｏｃｈｉａｌ）ホルモンであ
り、その主要な作用部位は内分泌膵臓のβ−細胞であると考えられていた［Ｒ．
Ａ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９９、７８０−７８５
（１９７６）］。しかしながら、ＧＩＰ受容体のクローニングにより、受容体は
外分泌膵臓およびいくつかの血管ベッドの遠位の小細胞を含む広範囲の組織や器
官で発現することが発見された［Ｔ． Ｂ． Ｕｓｄｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３３、２８６１−２８７０（１９９３）］。
【０００４】 この様に受容体が広く分布していることは、ＧＩＰのまだ分かっていない生理
作用を示唆している。ＧＩＰの作用を探求するための研究のほとんどは、インス
リン分泌を刺激するＧＩＰとグルコースの協同作業に集中している。ＧＩＰ注入
が肝臓に対するグルカゴンの効果を阻害するが、インスリンの効果を増大し、肝
血流に対し門脈流の増加と肝動脈流の阻害の二重の効果を有することも示されて
いる。皮肉なことに、そのためにＧＩＰが発見された効果、すなわち胃酸分泌の
阻害は生理学的な意味がほとんどない、重要でない医薬効果である様に思われる
。
作用を示唆している。ＧＩＰの作用を探求するための研究のほとんどは、インス
リン分泌を刺激するＧＩＰとグルコースの協同作業に集中している。ＧＩＰ注入
が肝臓に対するグルカゴンの効果を阻害するが、インスリンの効果を増大し、肝
血流に対し門脈流の増加と肝動脈流の阻害の二重の効果を有することも示されて
いる。皮肉なことに、そのためにＧＩＰが発見された効果、すなわち胃酸分泌の
阻害は生理学的な意味がほとんどない、重要でない医薬効果である様に思われる
。
【０００５】 現在のところ、骨代謝の主なモジュレーターはＰＴＨ−ビタミンＤ軸であると
考えられている。甲状腺ホルモンは養分吸収により負に制御され、カルシウムに
富んだ食事の後は減少し、断食中は上昇することが知られている［Ｗ． Ｊｕｂ
ｉｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ ５１、２０４０−２０４６（１９７
２）］。ＰＴＨに対する受容体は骨芽細胞に見出され、ＰＴＨは破骨細胞活性を
調節するサイトカイン発現を誘導する［Ｊ． Ｅ． Ｏｎｙｉａら、Ｊ． Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７、２６５−７４（１９９７）；Ｊ． Ｈ． Ｐｏ
ｌｌｏｃｋら、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ． １１、７５４−９（１
９９６）］。従って、ＰＴＨが誘発する骨回転率は一般に複合プロセスであり、
ビタミンＤと関連して、ＰＴＨが骨無機化に主要な役割を演じる。
考えられている。甲状腺ホルモンは養分吸収により負に制御され、カルシウムに
富んだ食事の後は減少し、断食中は上昇することが知られている［Ｗ． Ｊｕｂ
ｉｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ ５１、２０４０−２０４６（１９７
２）］。ＰＴＨに対する受容体は骨芽細胞に見出され、ＰＴＨは破骨細胞活性を
調節するサイトカイン発現を誘導する［Ｊ． Ｅ． Ｏｎｙｉａら、Ｊ． Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７、２６５−７４（１９９７）；Ｊ． Ｈ． Ｐｏ
ｌｌｏｃｋら、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ． １１、７５４−９（１
９９６）］。従って、ＰＴＨが誘発する骨回転率は一般に複合プロセスであり、
ビタミンＤと関連して、ＰＴＨが骨無機化に主要な役割を演じる。
【０００６】 しかしながら、骨の成長と再構築はカルシウム摂取の他に栄養摂取にも依存す
る。事実、卵巣摘出ラット等の骨回転率の高い状態でもラットの食餌を変えて特
定のタンパク質食を与えることにより骨の減少を阻止することが可能であり［Ｂ
． Ｈ． Ａｒｊｍａｎｄｉら、Ｊ． Ｎｕｔｒ． １２６、１６１−１６７（
１９９６）］、腸管誘発信号が骨回転率を調節し得ることを示唆している。現在
、骨格の成長と再構築を伴う栄養摂取に腸内内分泌系のホルモンが重要な役割を
果たすとは考えられていない。
る。事実、卵巣摘出ラット等の骨回転率の高い状態でもラットの食餌を変えて特
定のタンパク質食を与えることにより骨の減少を阻止することが可能であり［Ｂ
． Ｈ． Ａｒｊｍａｎｄｉら、Ｊ． Ｎｕｔｒ． １２６、１６１−１６７（
１９９６）］、腸管誘発信号が骨回転率を調節し得ることを示唆している。現在
、骨格の成長と再構築を伴う栄養摂取に腸内内分泌系のホルモンが重要な役割を
果たすとは考えられていない。
【０００７】 従って、骨格成長と再構築の制御手段を提供する事が、本発明の一つの目的で
ある。
ある。
【０００８】 本発明の別な目的は、骨多孔症等の疾患用の治療薬を提供することである。
【０００９】 発明の要旨 実験例から、ＧＩＰ受容体ｍＲＮＡおよびタンパク質が正常な骨と骨芽様細胞
株に存在し、ＧＩＰに対する親和性の高い受容体が１２５Ｉ ＧＩＰ結合実験で
実証し得ることが示されている。骨芽様細胞株（ＳａＯＳ２）に施した場合、Ｇ
ＩＰの刺激により細胞ｃＡＭＰ含有量と細胞内カルシウムが増加し、この双方の
反応は投与量に依存した。さらに、ＧＩＰの投与によりＩ型コラーゲンｍＲＮＡ
発現が上昇すると同時にアルカリホスファターゼ活性が増加する結果となる。こ
の双方の効果は前骨芽細胞の同化作用に反映する。これらの結果は、ＧＩＰ受容
体が骨と骨芽様細胞に存在し、ＧＩＰがこれらの細胞の作用を調節することを最
初に実証するものである。
株に存在し、ＧＩＰに対する親和性の高い受容体が１２５Ｉ ＧＩＰ結合実験で
実証し得ることが示されている。骨芽様細胞株（ＳａＯＳ２）に施した場合、Ｇ
ＩＰの刺激により細胞ｃＡＭＰ含有量と細胞内カルシウムが増加し、この双方の
反応は投与量に依存した。さらに、ＧＩＰの投与によりＩ型コラーゲンｍＲＮＡ
発現が上昇すると同時にアルカリホスファターゼ活性が増加する結果となる。こ
の双方の効果は前骨芽細胞の同化作用に反映する。これらの結果は、ＧＩＰ受容
体が骨と骨芽様細胞に存在し、ＧＩＰがこれらの細胞の作用を調節することを最
初に実証するものである。
【００１０】 ＧＩＰは再構築される骨に対して同化作用を有し、骨多孔症のラットモデルで
脊椎骨密度を増加させる。ＧＩＰは１０ｎＭで胎児長骨分析におけるＰＴＨ誘発
骨再吸収を阻害し、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡの合成を刺激する。ＧＩＰを過剰発
現する遺伝子導入マウスでは、同じ年齢の対照動物と比較して骨密度が増加して
いる。
脊椎骨密度を増加させる。ＧＩＰは１０ｎＭで胎児長骨分析におけるＰＴＨ誘発
骨再吸収を阻害し、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡの合成を刺激する。ＧＩＰを過剰発
現する遺伝子導入マウスでは、同じ年齢の対照動物と比較して骨密度が増加して
いる。
【００１１】 従って、ＧＩＰまたはその類似体を骨再吸収を阻止し、骨密度を維持または増
加させる治療薬として使用することができる。ＧＩＰ受容体への結合を阻止する
化合物であるＧＩＰ拮抗薬を、骨密度を減少させるために使用することができる
。
加させる治療薬として使用することができる。ＧＩＰ受容体への結合を阻止する
化合物であるＧＩＰ拮抗薬を、骨密度を減少させるために使用することができる
。
【００１２】 発明の詳細な記載 骨再構築におけるＧＩＰの役割に関する以下の実施例におけるデータに基づき
、ＰＴＨとＧＩＰは骨格に関する事象の制御に相補的な役割を演じると信じられ
る。ＰＴＨは単核細胞の新生を刺激し、一度形成すればこれらの破骨細胞が骨を
再吸収するように刺激する上で主要な役割を演じる。ＰＴＨはまた、破骨細胞の
寿命を増加させる。対照的にＧＩＰは破骨細胞に直接作用することにより、再構
築単位をその活性の破骨相から活性の骨芽相へ変化させる役割をする。再構築単
位の細胞が活性の破骨相にあると、ＰＴＨとＧＩＰの双方はこの骨形成相を調節
する上で独自の役割を果たす。この場合、ＰＴＨは骨芽細胞の増殖を刺激し、Ｇ
ＩＰはこれらの骨芽細胞の骨形成活性を刺激する。これらの２種のホルモンの作
用間の類似の関係が、骨端板における骨成長制御におけるその役割も決定する。
すなわち、ＰＴＨは軟骨細胞の増殖を刺激し、ＧＩＰはこれらの軟骨細胞のコラ
ーゲンマトリックス生成を刺激する。
、ＰＴＨとＧＩＰは骨格に関する事象の制御に相補的な役割を演じると信じられ
る。ＰＴＨは単核細胞の新生を刺激し、一度形成すればこれらの破骨細胞が骨を
再吸収するように刺激する上で主要な役割を演じる。ＰＴＨはまた、破骨細胞の
寿命を増加させる。対照的にＧＩＰは破骨細胞に直接作用することにより、再構
築単位をその活性の破骨相から活性の骨芽相へ変化させる役割をする。再構築単
位の細胞が活性の破骨相にあると、ＰＴＨとＧＩＰの双方はこの骨形成相を調節
する上で独自の役割を果たす。この場合、ＰＴＨは骨芽細胞の増殖を刺激し、Ｇ
ＩＰはこれらの骨芽細胞の骨形成活性を刺激する。これらの２種のホルモンの作
用間の類似の関係が、骨端板における骨成長制御におけるその役割も決定する。
すなわち、ＰＴＨは軟骨細胞の増殖を刺激し、ＧＩＰはこれらの軟骨細胞のコラ
ーゲンマトリックス生成を刺激する。
【００１３】 それらの類似性にもかかわらず、ＧＩＰとＰＴＨ受容体は明確な差も示す。ま
ず、骨芽細胞として作用し骨再吸収を刺激するのはＧＩＰでなくＰＴＨである。
第二に、両者のホルモンに対する受容体が骨端成長板中の細胞上に存在するが、
これらの受容体は異なった細胞タイプ、すなわちＰＴＨ受容体は増殖ゾーンと肥
大性ゾーンの間の軟骨細胞上［Ｋ． Ｌｃｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３７、５１０９−５１１８（１９９６）；Ｎ． Ａｍｉｚｕｋａら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７、５０５５−６７（１９９６）］、ＧＩＰ受容体は
肥大ゾーンの軟骨細胞上で発現する。この後者の差は骨生理学の他の特性に関連
する。正常な環境ではＰＴＨ分泌は日中は低く、血漿Ｃａ２＋が減少するため夜
間に増加する［Ｗ． Ｊｕｂｉｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５１
、２０４０−２０４６（１９７２）］。食物摂取の結果、ＧＩＰ分泌は日中を通
じて高く、終夜の絶食中は低下する［Ｊ． Ｍ． Ｋｎａｐｐｅｒら、Ｐｒｏｃ
． Ｎｕｔｒ． Ｓｏｃ．、２９１−３０５（１９９６）］。
ず、骨芽細胞として作用し骨再吸収を刺激するのはＧＩＰでなくＰＴＨである。
第二に、両者のホルモンに対する受容体が骨端成長板中の細胞上に存在するが、
これらの受容体は異なった細胞タイプ、すなわちＰＴＨ受容体は増殖ゾーンと肥
大性ゾーンの間の軟骨細胞上［Ｋ． Ｌｃｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３７、５１０９−５１１８（１９９６）；Ｎ． Ａｍｉｚｕｋａら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７、５０５５−６７（１９９６）］、ＧＩＰ受容体は
肥大ゾーンの軟骨細胞上で発現する。この後者の差は骨生理学の他の特性に関連
する。正常な環境ではＰＴＨ分泌は日中は低く、血漿Ｃａ２＋が減少するため夜
間に増加する［Ｗ． Ｊｕｂｉｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５１
、２０４０−２０４６（１９７２）］。食物摂取の結果、ＧＩＰ分泌は日中を通
じて高く、終夜の絶食中は低下する［Ｊ． Ｍ． Ｋｎａｐｐｅｒら、Ｐｒｏｃ
． Ｎｕｔｒ． Ｓｏｃ．、２９１−３０５（１９９６）］。
【００１４】 さらに、ＧＩＰは子供の骨格成長と成人の骨格再構築の双方に重要な役割を果
たす。ＧＩＰ受容体は骨由来細胞に存在し、これらの細胞との刺激は細胞内カル
シウム濃度の増加と細胞ｃＡＭＰ含有量の増加を導き、その結果、Ｉ型コラーゲ
ンの合成が増加しＰＴＨで刺激される骨再吸収が阻害される。実施例に示すデー
タは、「インクレチン」ホルモンが骨を「腸−骨性軸」に関連させるというＧＩ
Ｐの役割を支持する。その結果、受容体に結合するＧＩＰ、その類似体またはア
ンタゴニストを骨堆積の調節に用いることができる。
たす。ＧＩＰ受容体は骨由来細胞に存在し、これらの細胞との刺激は細胞内カル
シウム濃度の増加と細胞ｃＡＭＰ含有量の増加を導き、その結果、Ｉ型コラーゲ
ンの合成が増加しＰＴＨで刺激される骨再吸収が阻害される。実施例に示すデー
タは、「インクレチン」ホルモンが骨を「腸−骨性軸」に関連させるというＧＩ
Ｐの役割を支持する。その結果、受容体に結合するＧＩＰ、その類似体またはア
ンタゴニストを骨堆積の調節に用いることができる。
【００１５】 ＧＩＰ製剤 ＧＩＰ ＧＩＰを単離することは可能であるが、化学合成または組み替えＧＩＰの発現
により合成法で調製することがより好ましい。アミノ酸およびヌクレオチド配列
はＨｉｇａｓｈｉｍｏｔｏおよびＬｉｄｄｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９３（１）、１８２−１９０（１９９３
）に発表されている。特に断らないかぎり、本明細書では「ＧＩＰ」とはヒトの
配列、その縮退突然変異体、および他の生物種起源の等価体の他、ペプチドの機
能的活性を本質的には変えない、ヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかの附加、
欠失および置換部分を有する機能的に等価な突然変異体を言う。
により合成法で調製することがより好ましい。アミノ酸およびヌクレオチド配列
はＨｉｇａｓｈｉｍｏｔｏおよびＬｉｄｄｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９３（１）、１８２−１９０（１９９３
）に発表されている。特に断らないかぎり、本明細書では「ＧＩＰ」とはヒトの
配列、その縮退突然変異体、および他の生物種起源の等価体の他、ペプチドの機
能的活性を本質的には変えない、ヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかの附加、
欠失および置換部分を有する機能的に等価な突然変異体を言う。
【００１６】 他の実施態様では、ＧＩＰまたはその受容体の作用を真似る、またはそれと拮
抗する化合物を使用することができる。本明細書では、類似体とはＧＩＰ、ＧＩ
Ｐの断片または融合体、ＧＩＰ受容体に結合するＧＩＰまたはその断片に対する
抗イディオタイプ抗体、またはＧＩＰと等価の活性を有する合成構造類似体を言
う。特に断らない限り、本明細書ではこれらをまとめてＧＩＰと呼ぶ。アンタゴ
ニストとは典型的にはＧＩＰ受容体への結合を妨害する、または結合と競合する
類似のタイプの化合物である。これらの化合物は当業者に公知の方法を用いて得
られ、その内のいくつかは以下に記載され、実施例にある様なスクリーニング法
で同定される。
抗する化合物を使用することができる。本明細書では、類似体とはＧＩＰ、ＧＩ
Ｐの断片または融合体、ＧＩＰ受容体に結合するＧＩＰまたはその断片に対する
抗イディオタイプ抗体、またはＧＩＰと等価の活性を有する合成構造類似体を言
う。特に断らない限り、本明細書ではこれらをまとめてＧＩＰと呼ぶ。アンタゴ
ニストとは典型的にはＧＩＰ受容体への結合を妨害する、または結合と競合する
類似のタイプの化合物である。これらの化合物は当業者に公知の方法を用いて得
られ、その内のいくつかは以下に記載され、実施例にある様なスクリーニング法
で同定される。
【００１７】 受容体タンパク質はＧＩＰの機能を真似る、またはＧＩＰの機能と拮抗する、
ＧＩＰ受容体への結合をオン・オフ、または制御する化合物に対する標的として
有用である。以下に述べる分析法は、それによりある化合物のＧＩＰ受容体への
結合に対する阻害効果または刺激効果について試験し得る日常的な方法を、明確
に提供する。結合の選択性を変えると思われる化合物の生体外試験を、次に動物
試験で確認することができる。結合阻害に基づく研究は、例えば受容体結合の変
化等の間接効果を予見するものである。有用な活性に対する試験化合物の分析は
、細胞上、溶液中または不活性基質に固定化された受容体またはＧＩＰとの相互
作用のみに基づいて行うことができる。
ＧＩＰ受容体への結合をオン・オフ、または制御する化合物に対する標的として
有用である。以下に述べる分析法は、それによりある化合物のＧＩＰ受容体への
結合に対する阻害効果または刺激効果について試験し得る日常的な方法を、明確
に提供する。結合の選択性を変えると思われる化合物の生体外試験を、次に動物
試験で確認することができる。結合阻害に基づく研究は、例えば受容体結合の変
化等の間接効果を予見するものである。有用な活性に対する試験化合物の分析は
、細胞上、溶液中または不活性基質に固定化された受容体またはＧＩＰとの相互
作用のみに基づいて行うことができる。
【００１８】 また、分析はＧＩＰまたは受容体タンパク質をコードする遺伝子配列、好まし
くはＧＩＰまたは受容体タンパク質の発現を指向する制御配列との相互作用に基
づいて行うことができる。例えば、制御配列および／またはタンパク質をコード
する配列に結合するアンチセンスを標準のオリゴヌクレオチド合成法を用いて合
成することができる。標準の方法（リポソームまたはミクロスフェア中のカプセ
ル化、分解に対し耐性のある修飾ヌクレオチド、またはホスフォチオ化およびメ
チル化等のエンドヌクレアーゼ耐性を増加させる基の導入）を用いてアンチセン
スを医薬用に安定化し、最初に受容体結合またはＧＩＰ活性の変化をスクリーニ
ングすることができる。
くはＧＩＰまたは受容体タンパク質の発現を指向する制御配列との相互作用に基
づいて行うことができる。例えば、制御配列および／またはタンパク質をコード
する配列に結合するアンチセンスを標準のオリゴヌクレオチド合成法を用いて合
成することができる。標準の方法（リポソームまたはミクロスフェア中のカプセ
ル化、分解に対し耐性のある修飾ヌクレオチド、またはホスフォチオ化およびメ
チル化等のエンドヌクレアーゼ耐性を増加させる基の導入）を用いてアンチセン
スを医薬用に安定化し、最初に受容体結合またはＧＩＰ活性の変化をスクリーニ
ングすることができる。
【００１９】 受容体または受容体コード配列結合分子の無秩序生成 ある機能、例えば触媒またはリガンド結合機能を有する分子を、「生体外遺伝
学」と呼ばれる方法で無秩序分子の複雑な混合物から選択することができる［Ｓ
ｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ １９：８９、１９９２］。無秩序および一定の配列を
有する巨大な分子のプールを合成した場合、その複雑な混合系、例えば１００μ
ｇの１００個のヌクレオチドＲＮＡ中の約１０１５個の個々の配列をある選択お
よび濃縮プロセスに供することができる。例えば、カラム上のリガンドに結合し
た分子のアフィニティークロマトグラフィーおよび／またはＰＣＲ増幅サイクル
を繰り返すことにより、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は１
０１０個のＲＮＡ分子中の１個を、あるリガンドに結合させる方法で確保できる
と見積っている。この様なリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子が単離されてい
る（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０：Ｂｏｃｋら、１９９
２）。
学」と呼ばれる方法で無秩序分子の複雑な混合物から選択することができる［Ｓ
ｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ １９：８９、１９９２］。無秩序および一定の配列を
有する巨大な分子のプールを合成した場合、その複雑な混合系、例えば１００μ
ｇの１００個のヌクレオチドＲＮＡ中の約１０１５個の個々の配列をある選択お
よび濃縮プロセスに供することができる。例えば、カラム上のリガンドに結合し
た分子のアフィニティークロマトグラフィーおよび／またはＰＣＲ増幅サイクル
を繰り返すことにより、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は１
０１０個のＲＮＡ分子中の１個を、あるリガンドに結合させる方法で確保できる
と見積っている。この様なリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子が単離されてい
る（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０：Ｂｏｃｋら、１９９
２）。
【００２０】 コンピュータ支援医薬設計 コンピューターモデリング技術により選択した３次元分子構造を可視化し、そ
の分子と相互作用すると思われる新しい化合物を合理的に設計することが可能で
ある。３次元構造は典型的には特定の分子のＸ−線結晶学解析またはＮＭＲイメ
ージングによるデータに基づく。分子動力学には力の場のデータが必要である。
コンピューターグラフィックスシステムにより、新しい分子が標的分子にどの様
に結合するかの予測を可能にし、その化合物と標的分子の構造を完全な結合特異
性を得るために実験的に操作することができる。一方または双方に小さな変化が
生じた場合、分子−化合物間相互作用が何であるかという予測には、分子動力学
ソフトウェアと、通常はユーザーに分かりやすい分子設計プログラムと、ユーザ
ー間のメニュー起動インターフェースを組み合せた強力な演算を有するコンピュ
ーターが必要である。
の分子と相互作用すると思われる新しい化合物を合理的に設計することが可能で
ある。３次元構造は典型的には特定の分子のＸ−線結晶学解析またはＮＭＲイメ
ージングによるデータに基づく。分子動力学には力の場のデータが必要である。
コンピューターグラフィックスシステムにより、新しい分子が標的分子にどの様
に結合するかの予測を可能にし、その化合物と標的分子の構造を完全な結合特異
性を得るために実験的に操作することができる。一方または双方に小さな変化が
生じた場合、分子−化合物間相互作用が何であるかという予測には、分子動力学
ソフトウェアと、通常はユーザーに分かりやすい分子設計プログラムと、ユーザ
ー間のメニュー起動インターフェースを組み合せた強力な演算を有するコンピュ
ーターが必要である。
【００２１】 分子モデリングシステムの例はＰｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗ
ａｌｔｈａｎ、ＭＡ）のＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムである。Ｃ
ＨＡＲＭｍはエネルギー最小化と分子動力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構
造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行う。ＡＵＡＮＴＡでは分子相
互の挙動の相互作用の構築、変更、可視化、および解析が可能である。
ａｌｔｈａｎ、ＭＡ）のＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムである。Ｃ
ＨＡＲＭｍはエネルギー最小化と分子動力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構
造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行う。ＡＵＡＮＴＡでは分子相
互の挙動の相互作用の構築、変更、可視化、および解析が可能である。
【００２２】 多数の論文に特定のタンパク質と相互作用する薬剤のコンピューターモデリン
グがレビューされている。例えばＲｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８、Ａｃｔａ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７、１５９−１６６；Ｒｉｐ
ｋａ、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７（Ｊｕｎｅ １６、１９８８）
；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９、１１１−１２２；Ｐｅｒｒ
ｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｓｉｇｎ、ｐｐ１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ． １９８
９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌ
ｏｎｄ．、２３６、１２５−１４０および１４１−１６２など。核酸成分に対す
るモデル受容体に関してはＡｓｋｅｗら、１９８９、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ． １１１、１０８２−１０９０。化合物をスクリーニングしグラフィ
ック表示する他のコンピュータープログラムがＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．（
Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇ
ａ、Ｏｎｔａｉｏ、Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．（Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手できる。これらは主として特定の
タンパク質に特異的な医薬への応用のために設計されているが、一度その領域が
同定されればＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な医薬の設計に用いることがで
きる。結合を変更し得る化合物の設計と生成に関して上に説明したが、天然物ま
たは合成化合物、およびタンパク質を含む生物活性物質の既知の化合物のライブ
ラリーを、阻害剤または活性化剤である化合物についてスクリーニングすること
ができる。
グがレビューされている。例えばＲｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８、Ａｃｔａ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７、１５９−１６６；Ｒｉｐ
ｋａ、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７（Ｊｕｎｅ １６、１９８８）
；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９、１１１−１２２；Ｐｅｒｒ
ｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｓｉｇｎ、ｐｐ１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ． １９８
９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌ
ｏｎｄ．、２３６、１２５−１４０および１４１−１６２など。核酸成分に対す
るモデル受容体に関してはＡｓｋｅｗら、１９８９、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ． １１１、１０８２−１０９０。化合物をスクリーニングしグラフィ
ック表示する他のコンピュータープログラムがＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．（
Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇ
ａ、Ｏｎｔａｉｏ、Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．（Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手できる。これらは主として特定の
タンパク質に特異的な医薬への応用のために設計されているが、一度その領域が
同定されればＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な医薬の設計に用いることがで
きる。結合を変更し得る化合物の設計と生成に関して上に説明したが、天然物ま
たは合成化合物、およびタンパク質を含む生物活性物質の既知の化合物のライブ
ラリーを、阻害剤または活性化剤である化合物についてスクリーニングすること
ができる。
【００２３】 核酸制御物質の生成 受容体遺伝子の５’制御配列を含む核酸分子を、生体内遺伝子発現を制御また
は阻害するために用いることができる。
は阻害するために用いることができる。
【００２４】 プラスミドおよび真核ウイルスベクターを含むベクターを特定の組み替え５’
フランク領域遺伝子構築物を、経験のある実験者の好みと判断に応じて細胞内で
発現するために用いることができる［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、第１６章参照
］。さらに、生体内で核酸配列を導入することのできるウイルスおよび非ウイル
スベクターが数多くある［例えば本明細書に参考資料として含まれるＭｕｌｌｉ
ｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０、９２６−９３２；米国特許第４，
９８０，２８６号；米国特許第４，８６８，１１６号参照］。核酸が陽イオンリ
ポソーム中にカプセル化され、哺乳動物に静脈注射できる配送システムが数多く
開発されている。このシステムはＤＮＡを内種皮や骨髄を含むマウス成獣の様々
な組織の細胞中に導入するために用いられてきた［例えばＺｈｕら、１９９３、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１、２０９−２１１；本明細書中に参考資料として含まれ
る］。受容体遺伝子の５’−フランク配列も受容体またはＧＩＰの発現を変化さ
せるために用いられる。細胞内に通常見出される受容体タンパク質遺伝子のｍＲ
ＮＡ転写物に相補成である配列も作製される。この挿入ＤＮＡのアンチセンスＲ
ＮＡ転写物は次いで細胞中に見出される正常ｍＲＮＡ転写物と塩基対を生成し、
それによりｍＲＮＡの翻訳を阻止する。もちろん、アンチセンスＲＮＡがｍＲＮ
Ａ上に存在する相補配列を含むことを確認するため、受容体タンパク質遺伝子に
対する転写開始部位の下流にある５’−フランク領域の配列を選択することは必
要である。
フランク領域遺伝子構築物を、経験のある実験者の好みと判断に応じて細胞内で
発現するために用いることができる［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、第１６章参照
］。さらに、生体内で核酸配列を導入することのできるウイルスおよび非ウイル
スベクターが数多くある［例えば本明細書に参考資料として含まれるＭｕｌｌｉ
ｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０、９２６−９３２；米国特許第４，
９８０，２８６号；米国特許第４，８６８，１１６号参照］。核酸が陽イオンリ
ポソーム中にカプセル化され、哺乳動物に静脈注射できる配送システムが数多く
開発されている。このシステムはＤＮＡを内種皮や骨髄を含むマウス成獣の様々
な組織の細胞中に導入するために用いられてきた［例えばＺｈｕら、１９９３、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１、２０９−２１１；本明細書中に参考資料として含まれ
る］。受容体遺伝子の５’−フランク配列も受容体またはＧＩＰの発現を変化さ
せるために用いられる。細胞内に通常見出される受容体タンパク質遺伝子のｍＲ
ＮＡ転写物に相補成である配列も作製される。この挿入ＤＮＡのアンチセンスＲ
ＮＡ転写物は次いで細胞中に見出される正常ｍＲＮＡ転写物と塩基対を生成し、
それによりｍＲＮＡの翻訳を阻止する。もちろん、アンチセンスＲＮＡがｍＲＮ
Ａ上に存在する相補配列を含むことを確認するため、受容体タンパク質遺伝子に
対する転写開始部位の下流にある５’−フランク領域の配列を選択することは必
要である。
【００２５】 アンチセンスＲＮＡを生体外で生成し、次いで細胞内に挿入することも可能で
ある。オリゴヌクレオチドは自動合成装置で合成できる［例えばＭｉｌｌｉｇｅ
ｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）モデル８７００または
ＡＢＩモデル３８０Ｂ自動合成装置］。さらに、アンチセンスデオキシオリゴヌ
クレオチドが遺伝子転写およびウイルス複製を阻害するのに有効であることも示
されている［例えばＺａｍｅｃｎｉｋら、１９７８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７５、２８０−２８４；Ｚａｍｅｃｎｉｋら、
１９８６、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８３、４１４３−
４１４６；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、１９８８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５、１０２８−１０３２；Ｃｒｏｏｋｅ、１９９３
、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、７、５３３−５３９参照］。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが修飾ヌクレオチドを含む場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発
現阻害が可能である［例えばＯｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９３、ＥＭＢＯ
Ｊ．、１２、１２５７−１２６２（アンチセンスホスフォロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチドによるアヒルＢ型肝炎ウイルス複製および遺伝子発現の生
体内阻害）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＰＣＴ ＷＯ ９３／０１２８６（スルフ
チオエートオリゴヌクレオチドの合成）；Ａｇｒａｗａｌら、１９８８、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５、７０７９−７０８３
（ヒト免疫欠陥ウイルス−１の複製を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレ
オシドホスフォロアミドおよびホスフォロチオエートの合成）；Ｓａｒｉｎら、
１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．、８５、
７４４８−７７９４（アンチセンスメチルホスフォネートオリゴヌクレオチドの
合成）；Ｓｈａｗら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９
、７４７−７５０（３’−末端ホスフォロアミド修飾を含む３’−エキソヌクレ
アーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成）参照、これらの文献は全て本明細書に参
考資料として含まれる］。
ある。オリゴヌクレオチドは自動合成装置で合成できる［例えばＭｉｌｌｉｇｅ
ｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）モデル８７００または
ＡＢＩモデル３８０Ｂ自動合成装置］。さらに、アンチセンスデオキシオリゴヌ
クレオチドが遺伝子転写およびウイルス複製を阻害するのに有効であることも示
されている［例えばＺａｍｅｃｎｉｋら、１９７８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７５、２８０−２８４；Ｚａｍｅｃｎｉｋら、
１９８６、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８３、４１４３−
４１４６；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、１９８８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５、１０２８−１０３２；Ｃｒｏｏｋｅ、１９９３
、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、７、５３３−５３９参照］。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが修飾ヌクレオチドを含む場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発
現阻害が可能である［例えばＯｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９３、ＥＭＢＯ
Ｊ．、１２、１２５７−１２６２（アンチセンスホスフォロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチドによるアヒルＢ型肝炎ウイルス複製および遺伝子発現の生
体内阻害）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＰＣＴ ＷＯ ９３／０１２８６（スルフ
チオエートオリゴヌクレオチドの合成）；Ａｇｒａｗａｌら、１９８８、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５、７０７９−７０８３
（ヒト免疫欠陥ウイルス−１の複製を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレ
オシドホスフォロアミドおよびホスフォロチオエートの合成）；Ｓａｒｉｎら、
１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．、８５、
７４４８−７７９４（アンチセンスメチルホスフォネートオリゴヌクレオチドの
合成）；Ｓｈａｗら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９
、７４７−７５０（３’−末端ホスフォロアミド修飾を含む３’−エキソヌクレ
アーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成）参照、これらの文献は全て本明細書に参
考資料として含まれる］。
【００２６】 受容体タンパク質遺伝子の５’−フランク領域の配列も３重鎖（トリプレック
ス）遺伝子治療に用いることができる。ＤＮＡ鎖の一方の鎖上の遺伝子プロモー
ター配列に相補的なオリゴヌクレオチドがプロモーターおよび制御配列に結合し
、遺伝子転写を妨害する局所３重鎖ヘリックスを生成することが示されている［
例えばＭａｈｅｒら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５、７２５−７３０；Ｏ
ｒｓｏｎら、１９９１、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、３４３５−
３４４１；Ｐｏｓｔａｌら、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８、８２２７−８２３１；Ｃｏｏｎｅｙら、１９８８、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２４１、４５６−４５９；Ｙｏｕｎｇら、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８、１００２３−１００２６
；Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９、５０４−５０８；Ｂｌｕｍｅら、１９９２、
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２０、１７７７−１７８４；Ｇｒｉｇｏｒｉ
ｅｖら、１９９２、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７、３３８９−３３９
５］。
ス）遺伝子治療に用いることができる。ＤＮＡ鎖の一方の鎖上の遺伝子プロモー
ター配列に相補的なオリゴヌクレオチドがプロモーターおよび制御配列に結合し
、遺伝子転写を妨害する局所３重鎖ヘリックスを生成することが示されている［
例えばＭａｈｅｒら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５、７２５−７３０；Ｏ
ｒｓｏｎら、１９９１、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、３４３５−
３４４１；Ｐｏｓｔａｌら、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８、８２２７−８２３１；Ｃｏｏｎｅｙら、１９８８、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２４１、４５６−４５９；Ｙｏｕｎｇら、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８、１００２３−１００２６
；Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９、５０４−５０８；Ｂｌｕｍｅら、１９９２、
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２０、１７７７−１７８４；Ｇｒｉｇｏｒｉ
ｅｖら、１９９２、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７、３３８９−３３９
５］。
【００２７】 オリゴヌクレオチドを生産または合成する方法は公知である。この様な方法に
は標準の酵素消化後にヌクレオチド断片を単離する方法［例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋら、第５、６章］から純合成法、例えばＭｉｌｌｉｇａｎまたはＢｅｃｋｍａ
ｎシステム１Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成装置を用いるシアノエチルホスフォルアミダ
イト法［Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、５
３、３２３−３５６（ホスフォトリエステルおよびホスファイトトリエステル法
）；Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５、６１０−６２
０、１９８０（ホスフォトリエステル法）］まである。
は標準の酵素消化後にヌクレオチド断片を単離する方法［例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋら、第５、６章］から純合成法、例えばＭｉｌｌｉｇａｎまたはＢｅｃｋｍａ
ｎシステム１Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成装置を用いるシアノエチルホスフォルアミダ
イト法［Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、５
３、３２３−３５６（ホスフォトリエステルおよびホスファイトトリエステル法
）；Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５、６１０−６２
０、１９８０（ホスフォトリエステル法）］まである。
【００２８】 ＧＩＰまたはＧＩＰ受容体タンパク質断片の調製 受容体へのＧＩＰによる結合を変える、または真似るために有効な化合物には
、組み替えで発現し酵素消化で開裂する、または完全な長さの受容体タンパク質
またはＧＩＰより短いペプチドをコードする配列で発現する受容体タンパク質ま
たはＧＩＰの断片も含まれる。適当なタンパク質断片を製作し、結合試験を行っ
た後に利用することは日常の問題である。潜在的な免疫反応を最小にするために
、好ましい断片はヒト起源のものである。そのペプチドの長さはわずか５〜８個
の短さでも良く、標準的な技術で容易に調製できる。それらを生体内の半減期を
増加させるため、アミノ酸の化学修飾、またはキャリア分子または不活性基質に
附加することにより修飾することもできる。合成アミノ酸ペプチドをＪ． Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５、２
１４９に記載され、米国特許第４，７９２，５２５号で用いられる方法、および
米国特許第４，２４４，９４６号に記載される固相法で調製することが可能であ
るが、その方法ではペプチドのＣ−末端から出発してペプチド合成を開始するた
め、保護αアミノ酸を適当な樹脂に結合する。他の合成法は米国特許第４，３０
５，８７２号および第４，３１６，８９１号に記載される。ペプチドを塩酸、臭
素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸および燐酸等の無機酸、およびギ酸
、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コ
ハク酸、マレイン酸およびフマル酸等の有機酸との反応、または水酸化ナトリウ
ム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、およびモノ−、ジ−、
トリアルキルおよびアリルアミンおよび置換エタノールアミン等の有機塩基との
反応で生成する、薬学的に許容し得る酸または塩基の附加塩として投与すること
もできる。
、組み替えで発現し酵素消化で開裂する、または完全な長さの受容体タンパク質
またはＧＩＰより短いペプチドをコードする配列で発現する受容体タンパク質ま
たはＧＩＰの断片も含まれる。適当なタンパク質断片を製作し、結合試験を行っ
た後に利用することは日常の問題である。潜在的な免疫反応を最小にするために
、好ましい断片はヒト起源のものである。そのペプチドの長さはわずか５〜８個
の短さでも良く、標準的な技術で容易に調製できる。それらを生体内の半減期を
増加させるため、アミノ酸の化学修飾、またはキャリア分子または不活性基質に
附加することにより修飾することもできる。合成アミノ酸ペプチドをＪ． Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５、２
１４９に記載され、米国特許第４，７９２，５２５号で用いられる方法、および
米国特許第４，２４４，９４６号に記載される固相法で調製することが可能であ
るが、その方法ではペプチドのＣ−末端から出発してペプチド合成を開始するた
め、保護αアミノ酸を適当な樹脂に結合する。他の合成法は米国特許第４，３０
５，８７２号および第４，３１６，８９１号に記載される。ペプチドを塩酸、臭
素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸および燐酸等の無機酸、およびギ酸
、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コ
ハク酸、マレイン酸およびフマル酸等の有機酸との反応、または水酸化ナトリウ
ム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、およびモノ−、ジ−、
トリアルキルおよびアリルアミンおよび置換エタノールアミン等の有機塩基との
反応で生成する、薬学的に許容し得る酸または塩基の附加塩として投与すること
もできる。
【００２９】 シクロプロピルアミノ酸、または同様な方法で誘導体化したアミノ酸を含むペ
プチドを使用することもできる。これらのペプチドはその初期の活性を維持する
が、生体内の半減期は増加している。アミノ酸の修飾方法、およびその使用は当
業者に公知であり、例えばＳｔａｍｍｅｒ、米国特許第４，６２９，７８４号に
記載されている。
プチドを使用することもできる。これらのペプチドはその初期の活性を維持する
が、生体内の半減期は増加している。アミノ酸の修飾方法、およびその使用は当
業者に公知であり、例えばＳｔａｍｍｅｒ、米国特許第４，６２９，７８４号に
記載されている。
【００３０】 妨害抗体の調製 ＧＩＰ受容体に対する抗体をＧＩＰのその受容体に対する結合を変更または調
節するために用いることができ、抗イディオタイプ抗体をペプチドを真似るため
に使用することができる。図６で円で示した、ＧＩＰ受容体のＮ−末端領域に対
し作製した妨害抗体は、ＧＩＰ受容体活性化の阻害剤として有用である。抗体は
ポリクローン性、モノクローン性、その結合特異性を維持する断片、および組み
替え断片であり得る。ヒト型抗体を当業者に公知の標準法で調製することができ
る。
節するために用いることができ、抗イディオタイプ抗体をペプチドを真似るため
に使用することができる。図６で円で示した、ＧＩＰ受容体のＮ−末端領域に対
し作製した妨害抗体は、ＧＩＰ受容体活性化の阻害剤として有用である。抗体は
ポリクローン性、モノクローン性、その結合特異性を維持する断片、および組み
替え断片であり得る。ヒト型抗体を当業者に公知の標準法で調製することができ
る。
【００３１】 抗体はヒトまたは動物受容体タンパク質を用いる標準技術で生成することがで
きる。典型的にはフロインドのアジュバント等のアジュバンドを用いて動物を免
疫化することで抗体を生成することができるが、アジュバントを免疫原量のタン
パク質と組み合せ、２、３週間の間隔で数週間投与し、血清から単離するか、培
養体中で抗体を発現するハイブリドーマを作製するために使用される。動物を免
疫化する方法はヒト起源でない抗体を産出するので、ヒトに投与した場合、副作
用を誘発する可能性がある。「ヒト型」抗体法、または非ヒト抗体の免疫原性断
片を殆ど生産しない方法は公知である。ヒト型抗体は、抗原認識部位、または相
補的抗原決定超可変領域（ＣＤＲ）のみが非ヒト起源であるが、可変ドメインの
骨格領域（ＦＲ）はすべてヒト遺伝子のものである。ヒト受給者に導入した場合
、これらの「ヒト型抗体」は異種移植拒絶刺激の発現ががより少ない。
きる。典型的にはフロインドのアジュバント等のアジュバンドを用いて動物を免
疫化することで抗体を生成することができるが、アジュバントを免疫原量のタン
パク質と組み合せ、２、３週間の間隔で数週間投与し、血清から単離するか、培
養体中で抗体を発現するハイブリドーマを作製するために使用される。動物を免
疫化する方法はヒト起源でない抗体を産出するので、ヒトに投与した場合、副作
用を誘発する可能性がある。「ヒト型」抗体法、または非ヒト抗体の免疫原性断
片を殆ど生産しない方法は公知である。ヒト型抗体は、抗原認識部位、または相
補的抗原決定超可変領域（ＣＤＲ）のみが非ヒト起源であるが、可変ドメインの
骨格領域（ＦＲ）はすべてヒト遺伝子のものである。ヒト受給者に導入した場合
、これらの「ヒト型抗体」は異種移植拒絶刺激の発現ががより少ない。
【００３２】 Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９１、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９
：２４７１−２４７６に記載され、本明細書に参考資料として取り入れられるＣ
ＤＲ移植法を選択したマウスモノクローン性抗体をヒト型にするために用いられ
る。簡単に言えば、選ばれた動物の組み替え抗イディオタイプＳｃＦｖの可変領
域ＤＮＡは、Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６
２４−６８８に記載され、本明細書に参考資料として採用される方法により配列
決定される。この配列を用い、動物可変遺伝子の既知の配列中のＣＤＲの位置に
基づき、動物ＣＤＲが動物骨格領域（ＦＲ）から識別される［Ｋａｂａｔら、Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７）］。動
物ＣＤＲとＦＲが一度同定されると、合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）組み替えを用いてＣＤＲがヒト重鎖可変領域骨格に移植さ
れる。動物重鎖ＣＤＲに対するコドンと、入手できるヒト重鎖可変領域骨格が４
個のオリゴヌクレオチド（それぞれ１００塩基長）に組み込まれる。ＰＣＲを用
い、４００塩基の移植ＤＮＡ配列が作製され、組み替え動物ＣＤＲ／ヒト重鎖Ｆ
Ｒ保護をコードする。
：２４７１−２４７６に記載され、本明細書に参考資料として取り入れられるＣ
ＤＲ移植法を選択したマウスモノクローン性抗体をヒト型にするために用いられ
る。簡単に言えば、選ばれた動物の組み替え抗イディオタイプＳｃＦｖの可変領
域ＤＮＡは、Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６
２４−６８８に記載され、本明細書に参考資料として採用される方法により配列
決定される。この配列を用い、動物可変遺伝子の既知の配列中のＣＤＲの位置に
基づき、動物ＣＤＲが動物骨格領域（ＦＲ）から識別される［Ｋａｂａｔら、Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７）］。動
物ＣＤＲとＦＲが一度同定されると、合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）組み替えを用いてＣＤＲがヒト重鎖可変領域骨格に移植さ
れる。動物重鎖ＣＤＲに対するコドンと、入手できるヒト重鎖可変領域骨格が４
個のオリゴヌクレオチド（それぞれ１００塩基長）に組み込まれる。ＰＣＲを用
い、４００塩基の移植ＤＮＡ配列が作製され、組み替え動物ＣＤＲ／ヒト重鎖Ｆ
Ｒ保護をコードする。
【００３３】 この様にして製作されたモノクローン性抗体により発現する免疫原性刺激は、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）の「組み替えファージ抗体システム（ＲＰＡＳ）」を用いる
ことにより、さらに減少させることができ、それにより抗体の完全な抗原結合ド
メインを含む単一鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）が生成する。ＲＰＡＳでは、抗体の可
変重鎖および軽鎖遺伝子がハイブリドーマｍＲＮＡから別々に増幅され、発現ベ
クター中にクローン化される。柔軟性ペプチドをコードする短いリンカーＤＮＡ
に結び付けることにより、重鎖および軽鎖ドメインは同一ポリペプチド鎖中に同
時発現する。この組み合わせは、抗体の完全な抗原結合ドメインを含む単一鎖Ｆ
ｖ断片（ＳｃＦｖ）を生成する。無傷のモノクローン性抗体と比較して、組み替
えＳｃＦｖはかなり少ない数のエピトープを含み、従ってヒトに注射した場合、
より弱い免疫原性刺激を示す。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）の「組み替えファージ抗体システム（ＲＰＡＳ）」を用いる
ことにより、さらに減少させることができ、それにより抗体の完全な抗原結合ド
メインを含む単一鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）が生成する。ＲＰＡＳでは、抗体の可
変重鎖および軽鎖遺伝子がハイブリドーマｍＲＮＡから別々に増幅され、発現ベ
クター中にクローン化される。柔軟性ペプチドをコードする短いリンカーＤＮＡ
に結び付けることにより、重鎖および軽鎖ドメインは同一ポリペプチド鎖中に同
時発現する。この組み合わせは、抗体の完全な抗原結合ドメインを含む単一鎖Ｆ
ｖ断片（ＳｃＦｖ）を生成する。無傷のモノクローン性抗体と比較して、組み替
えＳｃＦｖはかなり少ない数のエピトープを含み、従ってヒトに注射した場合、
より弱い免疫原性刺激を示す。
【００３４】 調合 静脈内、筋肉内または皮下注射による治療用組成物を、ＧＩＰを燐酸緩衝生理
食塩水等の適当なキャリア中に調合、またはＧＩＰを一定時間放出する制御放出
調合物、例えばマイクロカプセルまたはゲルとして製造することができる。経口
投与用の好ましい調合物では、ペプチドまたはペプチド類似体をカプセル、錠剤
または薬剤を放出する場所である腸へ配送するためのその他の腸用被覆製剤で投
与される。多くの放出制御調合物が公知であるが、その場合、薬剤は噴霧乾燥、
溶剤揮発、または乳化等の公知の技術を用いて、セルロース、ポリ酪酸−ポリグ
リコール酸等のポリヒドロキシ酸、またはエチレン−酢酸ビニルまたはシリコー
ン等の非生物分解性材料等のポリマー材料中にカプセル化される。リポソームを
製造する方法のレビューはＧ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、第１４章「リポソー
ム」、Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、ｐｐ． ２８７−３４１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７９
に記載されている。ポリマーまたはタンパク質でつくられるミクロスフェアは当
業者に公知であり、胃腸管を通って血流中へ直接通過するように設計することが
できる。または、化合物を包み込み、ミクロスフェアまたはミクロスフェア組成
物を数日から数ヶ月にわたり一定期間、徐々に放出するように移植することもで
きる。例えば米国特許第４，９０６，４７４号、第４，９２５，６７３号および
第３，６２５，２１４号参照。ＧＩＰを吸入、または粘膜表面への投与（経鼻、
経直腸または経膣）、または経皮パッチにより、局所的に投与することもできる
。
食塩水等の適当なキャリア中に調合、またはＧＩＰを一定時間放出する制御放出
調合物、例えばマイクロカプセルまたはゲルとして製造することができる。経口
投与用の好ましい調合物では、ペプチドまたはペプチド類似体をカプセル、錠剤
または薬剤を放出する場所である腸へ配送するためのその他の腸用被覆製剤で投
与される。多くの放出制御調合物が公知であるが、その場合、薬剤は噴霧乾燥、
溶剤揮発、または乳化等の公知の技術を用いて、セルロース、ポリ酪酸−ポリグ
リコール酸等のポリヒドロキシ酸、またはエチレン−酢酸ビニルまたはシリコー
ン等の非生物分解性材料等のポリマー材料中にカプセル化される。リポソームを
製造する方法のレビューはＧ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、第１４章「リポソー
ム」、Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、ｐｐ． ２８７−３４１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７９
に記載されている。ポリマーまたはタンパク質でつくられるミクロスフェアは当
業者に公知であり、胃腸管を通って血流中へ直接通過するように設計することが
できる。または、化合物を包み込み、ミクロスフェアまたはミクロスフェア組成
物を数日から数ヶ月にわたり一定期間、徐々に放出するように移植することもで
きる。例えば米国特許第４，９０６，４７４号、第４，９２５，６７３号および
第３，６２５，２１４号参照。ＧＩＰを吸入、または粘膜表面への投与（経鼻、
経直腸または経膣）、または経皮パッチにより、局所的に投与することもできる
。
【００３５】 治療への応用 実施例は、ＧＩＰ受容体が骨芽細胞および骨細胞を含む正常骨の骨細胞の他、
骨芽様骨肉腫細胞株にも存在することを示している。これらの細胞株は、分化骨
細胞−コラーゲン合成およびアルカリホスファターゼ活性で示される代謝反応を
伴う生理学的レベルでＧＩＰに反応する。その結果は、骨を含む様々な末梢組織
における養分処理により、ＧＩＰを腸内の養分摂取を制御するために使用し得る
ことを示している。ＧＩＰの生体外での骨細胞に対する同化効果の最も簡単な説
明では、ＧＩＰがｃＡＭＰを増加させ（ＰＴＨやＰＧＥ２と同様に）、これがＩ
ＧＦ−１放出を刺激し、次いで骨形成を刺激すると考えられる。生体内効果はＧ
ＩＰ刺激インスリンおよびアミリン分泌と関連し、それが次に骨形成を刺激する
。抗再吸収効果の最も簡単な説明では、ＰＴＨまたは性機能低下状態で増加した
Ｉｌ−６分泌をＧＩＰが阻害されると考えられる。
骨芽様骨肉腫細胞株にも存在することを示している。これらの細胞株は、分化骨
細胞−コラーゲン合成およびアルカリホスファターゼ活性で示される代謝反応を
伴う生理学的レベルでＧＩＰに反応する。その結果は、骨を含む様々な末梢組織
における養分処理により、ＧＩＰを腸内の養分摂取を制御するために使用し得る
ことを示している。ＧＩＰの生体外での骨細胞に対する同化効果の最も簡単な説
明では、ＧＩＰがｃＡＭＰを増加させ（ＰＴＨやＰＧＥ２と同様に）、これがＩ
ＧＦ−１放出を刺激し、次いで骨形成を刺激すると考えられる。生体内効果はＧ
ＩＰ刺激インスリンおよびアミリン分泌と関連し、それが次に骨形成を刺激する
。抗再吸収効果の最も簡単な説明では、ＰＴＨまたは性機能低下状態で増加した
Ｉｌ−６分泌をＧＩＰが阻害されると考えられる。
【００３６】 疑いもなく、インスリンとアミリンは骨に対するＧＩＰの作用に寄与している
が、骨細胞中のＧＩＰ受容体は、膵臓等の他の組織中に存在する骨細胞中より親
和性が高く、その量も多いという事実は、骨に対してＧＩＰ作用の特異性が高い
ことを示唆している。ＧＩＰが前骨芽細胞株中でアルカリホスファターゼ活性を
増加させるという事実（予備的事実の節参照）は、ＧＩＰが骨芽前駆体細胞の分
化にある役割を担っていることを示唆している。上記の通り、骨芽前駆体細胞（
線維芽細胞ＣＦＵ）は筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞または脂肪細胞へ発育する
ことができる。これら後者３タイプの細胞はすべてＧＩＰ受容体を発現する。従
って、ＧＩＰが骨芽細胞分化、成熟および機能にある役割を担い、骨マトリック
ス合成の制御にＰＴＨと協調してＧＩＰが作用すると仮定される。
が、骨細胞中のＧＩＰ受容体は、膵臓等の他の組織中に存在する骨細胞中より親
和性が高く、その量も多いという事実は、骨に対してＧＩＰ作用の特異性が高い
ことを示唆している。ＧＩＰが前骨芽細胞株中でアルカリホスファターゼ活性を
増加させるという事実（予備的事実の節参照）は、ＧＩＰが骨芽前駆体細胞の分
化にある役割を担っていることを示唆している。上記の通り、骨芽前駆体細胞（
線維芽細胞ＣＦＵ）は筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞または脂肪細胞へ発育する
ことができる。これら後者３タイプの細胞はすべてＧＩＰ受容体を発現する。従
って、ＧＩＰが骨芽細胞分化、成熟および機能にある役割を担い、骨マトリック
ス合成の制御にＰＴＨと協調してＧＩＰが作用すると仮定される。
【００３７】 本明細書記載の組成物は骨多孔症の治療または予防に使用することができる。
骨多孔症は、骨形成と破壊の間の不釣り合いが特徴で、骨量が減少する結果とな
る。老化は主として骨の損失よりも骨形成の減少と関連し、その結果である正味
の骨損失は骨折の危険性の増加と関連している。Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒにおける患者の多くは特に骨多孔症の危険にある。骨多孔症
は閉経後の女性により多くみられるので、男性におけるこの疾病は余り注目され
ていない。しかしながら、喫煙や飲酒等の生活習慣因子を有する老齢の男性、閉
塞性肺疾患、腎臓移植後およびリュウマチ様関節炎（コルチコステロイド投与）
等の関連疾患を有する男性は骨多孔症を発症する危険性が特に高い。骨多孔症に
関連して生じる骨折は病的状態の主な原因であり、生活の質が低下し医療センタ
ーに対する出費が多くなる結果となる。骨多孔症に対する現在の治療は、主とし
て抗再吸収治療、すなわちそれ以上の骨の破壊を阻止することであり、新しい骨
を形成するための薬剤治療（即効性のパラチロイドホルモン注射、多分、女性用
のエストロゲンおよびフッ化物を除いて）は殆ど不可能である。
骨多孔症は、骨形成と破壊の間の不釣り合いが特徴で、骨量が減少する結果とな
る。老化は主として骨の損失よりも骨形成の減少と関連し、その結果である正味
の骨損失は骨折の危険性の増加と関連している。Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒにおける患者の多くは特に骨多孔症の危険にある。骨多孔症
は閉経後の女性により多くみられるので、男性におけるこの疾病は余り注目され
ていない。しかしながら、喫煙や飲酒等の生活習慣因子を有する老齢の男性、閉
塞性肺疾患、腎臓移植後およびリュウマチ様関節炎（コルチコステロイド投与）
等の関連疾患を有する男性は骨多孔症を発症する危険性が特に高い。骨多孔症に
関連して生じる骨折は病的状態の主な原因であり、生活の質が低下し医療センタ
ーに対する出費が多くなる結果となる。骨多孔症に対する現在の治療は、主とし
て抗再吸収治療、すなわちそれ以上の骨の破壊を阻止することであり、新しい骨
を形成するための薬剤治療（即効性のパラチロイドホルモン注射、多分、女性用
のエストロゲンおよびフッ化物を除いて）は殆ど不可能である。
【００３８】 骨の形成と成長は、骨の直径と形の変化でなる複雑なプロセスである。このプ
ロセスは２種の細胞タイプ、破骨細胞と骨芽細胞が順番に活性化されることによ
り生じる。骨芽細胞は、軟骨細胞、筋肉細胞および脂肪細胞としての線維芽細胞
コロニー形成ユニット由来の間充組織起源である。骨芽細胞は破骨細胞の成長に
影響し得るいくつかの因子（インターロイキン−６および／または１１、ＭＣＳ
−ＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）を分泌することができる。破骨細胞は顆粒球−マクロ
ファージコロニー形成ユニットから発育し、この発育はインターロイキン１、３
、６および１１を含む様々な因子で調節される。最近、インターロイキン−６が
かなり注目されているが、その理由はその骨芽細胞からの生産がＰＴＨおよびビ
タミンＤで刺激されるからであり、一次上皮小体機能亢進、多発性骨髄腫、リュ
ウマチ性関節炎、ぺージェットおよび性機能低下骨多孔症を含むいくつかの疾病
に罹り易くなるからである。骨芽細胞からのインターロイキン−６の生産は、Ｉ
ｌ−６プロモーターに作用する性ホルモン（アンドロゲンおよびエストロゲン）
で制御される。正常な破骨細胞におけるＩｌ−６の役割（Ｉｌ−１１に比較し）
ははっきりしないが、ある種の病的状態ではＩｌ−６受容体が過剰制御され、Ｉ
ｌ−６がその効果を発揮する。性機能低下マウス由来の骨細胞では、正常細胞と
比較してｇｐ８０、ｇｐ１３０およびＩｌ−６ ｍＲＮＡがすべて増加する。従
って、Ｉｌ−６が閉経後骨多孔症に関連する骨損失の加速に重要な役割を果たす
ことはあり得る。
ロセスは２種の細胞タイプ、破骨細胞と骨芽細胞が順番に活性化されることによ
り生じる。骨芽細胞は、軟骨細胞、筋肉細胞および脂肪細胞としての線維芽細胞
コロニー形成ユニット由来の間充組織起源である。骨芽細胞は破骨細胞の成長に
影響し得るいくつかの因子（インターロイキン−６および／または１１、ＭＣＳ
−ＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）を分泌することができる。破骨細胞は顆粒球−マクロ
ファージコロニー形成ユニットから発育し、この発育はインターロイキン１、３
、６および１１を含む様々な因子で調節される。最近、インターロイキン−６が
かなり注目されているが、その理由はその骨芽細胞からの生産がＰＴＨおよびビ
タミンＤで刺激されるからであり、一次上皮小体機能亢進、多発性骨髄腫、リュ
ウマチ性関節炎、ぺージェットおよび性機能低下骨多孔症を含むいくつかの疾病
に罹り易くなるからである。骨芽細胞からのインターロイキン−６の生産は、Ｉ
ｌ−６プロモーターに作用する性ホルモン（アンドロゲンおよびエストロゲン）
で制御される。正常な破骨細胞におけるＩｌ−６の役割（Ｉｌ−１１に比較し）
ははっきりしないが、ある種の病的状態ではＩｌ−６受容体が過剰制御され、Ｉ
ｌ−６がその効果を発揮する。性機能低下マウス由来の骨細胞では、正常細胞と
比較してｇｐ８０、ｇｐ１３０およびＩｌ−６ ｍＲＮＡがすべて増加する。従
って、Ｉｌ−６が閉経後骨多孔症に関連する骨損失の加速に重要な役割を果たす
ことはあり得る。
【００３９】 ＧＩＰは骨芽細胞および破骨細胞の双方に対する受容体を有する点で独特のペ
プチドホルモンである（破骨細胞のみに対する受容体を有するＰＴＨとは対称的
に）。従って、ＧＩＰは骨多孔症に対する別な治療法を提供する。
プチドホルモンである（破骨細胞のみに対する受容体を有するＰＴＨとは対称的
に）。従って、ＧＩＰは骨多孔症に対する別な治療法を提供する。
【００４０】 実施例で示される様に、ＧＩＰ調合物は当業者に公知の分析法を用いて測定し
得る治療反応を誘発する量で投与される。好ましい実施態様では、ＧＩＰまたは
その類似体、または内因性ＧＩＰの量を増加させる化合物を、骨多孔症の危険に
当面する、またはその徴候が顕著な男性又は女性に、Ｉ型コラーゲン合成および
／または骨密度を増加させるに有効な量で投与する。または、ＧＩＰ阻害剤を骨
再吸収を促進するために用いることもできる。
得る治療反応を誘発する量で投与される。好ましい実施態様では、ＧＩＰまたは
その類似体、または内因性ＧＩＰの量を増加させる化合物を、骨多孔症の危険に
当面する、またはその徴候が顕著な男性又は女性に、Ｉ型コラーゲン合成および
／または骨密度を増加させるに有効な量で投与する。または、ＧＩＰ阻害剤を骨
再吸収を促進するために用いることもできる。
【００４１】 実施例 本発明は以下の非限定的実施例を参照してより理解し得るものと思われる。正
常な骨代謝におけるＧＩＰの生理学的役割を定義するため、４つのタイプの実験
を行った。１） ＧＩＰ受容体の研究：多くの１次および形質移入骨芽細胞様細
胞についてＧＩＰ受容体の存在を調べ、ＧＩＰ受容体の細胞外ドメインに対する
ウサギポリクローン性抗体を作成し、最初の研究で抗体と、ラットの骨と骨芽細
胞様細胞におけるＧＩＰＲの位置の双方を特徴付けた。２） ＧＩＰ信号伝達経
路の生体外研究：細胞質ゾルカルシウムおよび細胞中のｃＡＭＰに対するＧＩＰ
の効果を測定した。３） ＧＩＰの作用の研究：骨芽細胞Ｉ型コラーゲン合成と
アルカリホスファターゼ活性に対するＧＩＰの効果を測定した。４） 生体内動
物モデルにおけるＧＩＰの作用の特徴付け：ＧＩＰの生体内における生理学的役
割が何であるかの問題を明確にするため、実験を行った。骨多孔症を発症する卵
巣摘出マウス、およびＧＩＰを過剰発現する遺伝子形質位移入マウスの二つのモ
デルを使用した。双方のモデルでＧＩＰが増加するか、または骨密度が維持され
た。
常な骨代謝におけるＧＩＰの生理学的役割を定義するため、４つのタイプの実験
を行った。１） ＧＩＰ受容体の研究：多くの１次および形質移入骨芽細胞様細
胞についてＧＩＰ受容体の存在を調べ、ＧＩＰ受容体の細胞外ドメインに対する
ウサギポリクローン性抗体を作成し、最初の研究で抗体と、ラットの骨と骨芽細
胞様細胞におけるＧＩＰＲの位置の双方を特徴付けた。２） ＧＩＰ信号伝達経
路の生体外研究：細胞質ゾルカルシウムおよび細胞中のｃＡＭＰに対するＧＩＰ
の効果を測定した。３） ＧＩＰの作用の研究：骨芽細胞Ｉ型コラーゲン合成と
アルカリホスファターゼ活性に対するＧＩＰの効果を測定した。４） 生体内動
物モデルにおけるＧＩＰの作用の特徴付け：ＧＩＰの生体内における生理学的役
割が何であるかの問題を明確にするため、実験を行った。骨多孔症を発症する卵
巣摘出マウス、およびＧＩＰを過剰発現する遺伝子形質位移入マウスの二つのモ
デルを使用した。双方のモデルでＧＩＰが増加するか、または骨密度が維持され
た。
【００４２】 データはＧＩＰ受容体が骨および／または骨由来の細胞で多数発現し、ＧＩＰ
がこれらの細胞で信号伝達を調節していることを示している。実施例はＧＩＰ受
容体が正常ラットの骨、骨芽細胞および破骨細胞、および確立された骨芽様細胞
株に存在していることを示している。骨および骨芽細胞由来の細胞におけるこれ
らの受容体の存在は二つの方法で示された：（１）ＧＩＰ受容体に対するｍＲＮ
Ａが細胞株で、骨芽細胞および骨細胞におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションにより検出された（データは示されない）、および（２）そのタンパク質
がウエスターンブロット分析および間接免疫蛍光法で骨および細胞株中で観察さ
れた。さらに、その他のインクレチンホルモン、すなわちグルカゴン様ペプチド
−１（ＧＬＰ−１）に対する関連受容体が見出されなかったので、骨細胞中のＧ
ＩＰ受容体の存在は特異的である。さらに、ＧＩＰに対する受容体は、それらが
膵臓β細胞において以前測定された価（細胞系およびＧＩＰ源（ヒトとブタ）に
より０．３〜３０ｎＭ）に匹敵する約０．５ｎＭの親和性でホルモンを結合する
機能を有する様に思われる。さらに、この結合親和性は食後に血清中で到達する
ＧＩＰ濃度の生理学的範囲内である。
がこれらの細胞で信号伝達を調節していることを示している。実施例はＧＩＰ受
容体が正常ラットの骨、骨芽細胞および破骨細胞、および確立された骨芽様細胞
株に存在していることを示している。骨および骨芽細胞由来の細胞におけるこれ
らの受容体の存在は二つの方法で示された：（１）ＧＩＰ受容体に対するｍＲＮ
Ａが細胞株で、骨芽細胞および骨細胞におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションにより検出された（データは示されない）、および（２）そのタンパク質
がウエスターンブロット分析および間接免疫蛍光法で骨および細胞株中で観察さ
れた。さらに、その他のインクレチンホルモン、すなわちグルカゴン様ペプチド
−１（ＧＬＰ−１）に対する関連受容体が見出されなかったので、骨細胞中のＧ
ＩＰ受容体の存在は特異的である。さらに、ＧＩＰに対する受容体は、それらが
膵臓β細胞において以前測定された価（細胞系およびＧＩＰ源（ヒトとブタ）に
より０．３〜３０ｎＭ）に匹敵する約０．５ｎＭの親和性でホルモンを結合する
機能を有する様に思われる。さらに、この結合親和性は食後に血清中で到達する
ＧＩＰ濃度の生理学的範囲内である。
【００４３】 骨芽細胞由来の細胞中のＧＩＰ受容体の機能は、その信号伝達経路との結合能
でも示される。他の類似の７個の膜横断受容体と同様、骨芽様細胞中のＧＩＰ受
容体はｃＡＭＰとホスフォイノシチド信号経路の双方と結合する様に思われる。
事実、ホスフォイノシチド反応は、ｃＡＭＰ含有量の変化に対する１ｎＭに比べ
、有為の効果が０．１ｎＭで観測された点で、より大きい潜在能力を示した。骨
芽様細胞中のＧＩＰのより低い投与量で見られた、細胞内カルシウム濃度の大き
な増加は、膵臓β細胞株による以前の研究に基づくと予想外であった。ＧＩＰは
細胞外カルシウム流入を増加させ、膵臓小島および細胞株内の細胞内貯蔵カルシ
ウムからのカルシウム移動を誘発すると報告されているが、ｃＡＭＰ含有量の上
昇はグルコース誘導インスリン分泌に対するインクレチン効果で主として媒介さ
れると考えられる。
でも示される。他の類似の７個の膜横断受容体と同様、骨芽様細胞中のＧＩＰ受
容体はｃＡＭＰとホスフォイノシチド信号経路の双方と結合する様に思われる。
事実、ホスフォイノシチド反応は、ｃＡＭＰ含有量の変化に対する１ｎＭに比べ
、有為の効果が０．１ｎＭで観測された点で、より大きい潜在能力を示した。骨
芽様細胞中のＧＩＰのより低い投与量で見られた、細胞内カルシウム濃度の大き
な増加は、膵臓β細胞株による以前の研究に基づくと予想外であった。ＧＩＰは
細胞外カルシウム流入を増加させ、膵臓小島および細胞株内の細胞内貯蔵カルシ
ウムからのカルシウム移動を誘発すると報告されているが、ｃＡＭＰ含有量の上
昇はグルコース誘導インスリン分泌に対するインクレチン効果で主として媒介さ
れると考えられる。
【００４４】 ＧＩＰ受容体は、その存在により細胞反応を誘発する機能も有する。従って、
ＧＩＰ処理により、十分に生理学的範囲である０．１ｎＭの低いＧＩＰ濃度でＩ
型コラーゲンｍＲＮＡの発現とアルカリホスファターゼ活性が増加する結果とな
った。Ｉ型コラーゲンの発現の変化には、正常な生理学的範囲より若干高い、よ
り高いＧＩＰ濃度（１ｎＭ以上）が必要であった。
ＧＩＰ処理により、十分に生理学的範囲である０．１ｎＭの低いＧＩＰ濃度でＩ
型コラーゲンｍＲＮＡの発現とアルカリホスファターゼ活性が増加する結果とな
った。Ｉ型コラーゲンの発現の変化には、正常な生理学的範囲より若干高い、よ
り高いＧＩＰ濃度（１ｎＭ以上）が必要であった。
【００４５】 まとめると、生体外研究でＧＩＰ受容体が骨と骨由来の細胞に存在することが
示され、生体外および生体内研究の双方からこれらの細胞のＧＩＰによる刺激が
細胞内カルシウムレベル、細胞ｃＡＭＰ含有量、Ｉ型コラーゲンの発現、および
アルカリホスファターゼ活性が増加する結果になることが示された。
示され、生体外および生体内研究の双方からこれらの細胞のＧＩＰによる刺激が
細胞内カルシウムレベル、細胞ｃＡＭＰ含有量、Ｉ型コラーゲンの発現、および
アルカリホスファターゼ活性が増加する結果になることが示された。
【００４６】 （１） ＧＩＰの作用とその受容体の研究 これらの研究は、ＧＩＰ受容体が様々な骨芽様細胞に存在することを示してい
る。
る。
【００４７】 実施例１： 骨細胞中のＨＩＰ受容体の発現 ラット立方骨およびラット膵臓の切片におけるＧＩＰ受容体ｍＲＮＡの発現を
、細胞内ハイブリダイゼーションを成獣Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット由
来の立方骨切片上のアンチセンスジゴキシゲニン標識ＧＩＰ受容体プローブに使
用するためにスクリーニングした。バックグラウンドレベルを立方骨細胞および
成長ゾーンにおけるアンチセンスジゴキシゲニン標識ＧＩＰ受容体転写体へのハ
イブリダイゼーションとして測定した。マウスＧＩＰ受容体ｃＤＮＡから転写し
た４００個のヌクレオチドのジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブをハイブリダイ
ゼーションに用いた。
、細胞内ハイブリダイゼーションを成獣Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット由
来の立方骨切片上のアンチセンスジゴキシゲニン標識ＧＩＰ受容体プローブに使
用するためにスクリーニングした。バックグラウンドレベルを立方骨細胞および
成長ゾーンにおけるアンチセンスジゴキシゲニン標識ＧＩＰ受容体転写体へのハ
イブリダイゼーションとして測定した。マウスＧＩＰ受容体ｃＤＮＡから転写し
た４００個のヌクレオチドのジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブをハイブリダイ
ゼーションに用いた。
【００４８】 方法と材料 簡単に言えば、ラットを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドと０．２％グルタ
ルアルデヒドで心臓経由で潅流した。立方骨を採集し、４％パラホルムアルデヒ
ド中、４℃で終夜固定した。骨を１０％ＥＤＴＡ中で４〜６日間脱カルシウムし
、エタノールおよびキシレン中で脱水しパラフィン中に埋め込んだ。厚さ７ｍｍ
の切片を切り出し、脱パラフィンし再水和した。切片をプロテアーゼＫで処理し
４％パラホルムアルデヒドで後固定した。５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、１
％ＳＤＳ、５ ｍｇ／ｍｌヘパリンおよび５０ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む
溶液中でハイブリダイゼーションを７０℃で終夜行った。ハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄は２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中７０℃で１時間、１ＸＳＳＣ、１％ＳＤ
Ｓ中で１時間、０，５ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１時間行った。切片をアルカリ
ホスファターゼ結合抗体と２時間インキュベーションし、ＰＢＳ中で終夜洗浄し
た。発色反応をＮＢＴおよびＸ−ホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）中で行った。正染色により青色になった。
ルアルデヒドで心臓経由で潅流した。立方骨を採集し、４％パラホルムアルデヒ
ド中、４℃で終夜固定した。骨を１０％ＥＤＴＡ中で４〜６日間脱カルシウムし
、エタノールおよびキシレン中で脱水しパラフィン中に埋め込んだ。厚さ７ｍｍ
の切片を切り出し、脱パラフィンし再水和した。切片をプロテアーゼＫで処理し
４％パラホルムアルデヒドで後固定した。５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、１
％ＳＤＳ、５ ｍｇ／ｍｌヘパリンおよび５０ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む
溶液中でハイブリダイゼーションを７０℃で終夜行った。ハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄は２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中７０℃で１時間、１ＸＳＳＣ、１％ＳＤ
Ｓ中で１時間、０，５ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１時間行った。切片をアルカリ
ホスファターゼ結合抗体と２時間インキュベーションし、ＰＢＳ中で終夜洗浄し
た。発色反応をＮＢＴおよびＸ−ホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）中で行った。正染色により青色になった。
【００４９】 結果 ＧＩＰ受容体メッセージおよびタンパク質が骨芽細胞により発現する 受容体ｍＲＮＡが２種のヒト培養骨芽細胞株（ＳａＯＳ２およびＭＧ６３）中
で検出された。ｍＲＮＡの発現が必ずしもタンパク質の発現と相関しないので、
ＧＩＰ受容体タンパク質の分布を評価した。ヒトＧＩＰ受容体のＮ−末端細胞外
ドメインの一部でなるアフィニティーで精製したペプチドに対するポリクローン
性抗体を生成し、様々な細胞および／または組織中でのタンパク質発現をウエス
ターンブロット分析で探索するために使用した。正の対照として、ＧＳＴに融合
したＧＩＰ受容体のアミノ酸末端に対応する組み替えバクテリア発現タンパク質
を発現した。
で検出された。ｍＲＮＡの発現が必ずしもタンパク質の発現と相関しないので、
ＧＩＰ受容体タンパク質の分布を評価した。ヒトＧＩＰ受容体のＮ−末端細胞外
ドメインの一部でなるアフィニティーで精製したペプチドに対するポリクローン
性抗体を生成し、様々な細胞および／または組織中でのタンパク質発現をウエス
ターンブロット分析で探索するために使用した。正の対照として、ＧＳＴに融合
したＧＩＰ受容体のアミノ酸末端に対応する組み替えバクテリア発現タンパク質
を発現した。
【００５０】 ３種の骨芽細胞様細胞株（ＳａＯＳ２、ＲＯＳ１７／２．８およびＭＧ６３）
はＧＩＰ受容体の予想されるサイズに対応する単一の免疫活性バンドを含む。対
照的に、ＧＩＰ受容体を含まないことが分かっている２種の細胞株（Ｈｅｌａお
よびＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞）はこの免疫活性バンドを含まない。正常なＳｐ
ｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット由来のタンパク質抽出物を調製し、ウエスター
ンブロットによりＧＩＰ受容体抗体で標識した。正常ラットの骨では同じ５０ｋ
Ｄの免疫活性バンドが観測された。さらに、膵臓、脳および心臓およびすでにＧ
ＩＰを含むと報告されている組織も陽性であり、一方、ＧＩＰ受容体を含まない
と報告されていた脾臓は免疫活性バンドを含まず、抗体の特性を示唆している。
はＧＩＰ受容体の予想されるサイズに対応する単一の免疫活性バンドを含む。対
照的に、ＧＩＰ受容体を含まないことが分かっている２種の細胞株（Ｈｅｌａお
よびＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞）はこの免疫活性バンドを含まない。正常なＳｐ
ｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット由来のタンパク質抽出物を調製し、ウエスター
ンブロットによりＧＩＰ受容体抗体で標識した。正常ラットの骨では同じ５０ｋ
Ｄの免疫活性バンドが観測された。さらに、膵臓、脳および心臓およびすでにＧ
ＩＰを含むと報告されている組織も陽性であり、一方、ＧＩＰ受容体を含まない
と報告されていた脾臓は免疫活性バンドを含まず、抗体の特性を示唆している。
【００５１】 ４種の骨細胞−骨端成長板の肥大ゾーン中の骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞およ
び軟骨細胞−が細胞内ハイブリダイゼーションでＧＩＰ受容体転写物を発現する
ことが見出された。受容体ｍＲＮＡは２種の骨芽細胞株、一つはヒト（ＳａＯＳ
２）、もう一つはラット（ＲＯＳ１７／２）と同時に単離されたラット破骨細胞
中で発現する。対照的に、もう一つの主要「インクレチン」ホルモンであるグル
カゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に対する受容体のメッセージはこの細胞株
中では観測されず、その発現も骨で他の研究者により報告されていない［Ｒ．
Ｖ． Ｃａｍｐｏｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４、２１５６−２１
６４（１９９４）］。このホルモンはＧＩＰと同様、小腸内の内分泌細胞で分泌
され、β細胞に作用し、その受容体は副甲状腺ホルモン、カルシトニン、コルチ
コトロピン放出因子、グルカゴン、下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ポリ
ペプチド、血管活性腸ペプチド、セクレチンおよび成長ホルモン放出ホルモンも
含む７個の膜横断ドメイン受容体のサブクラスの構成員である。
び軟骨細胞−が細胞内ハイブリダイゼーションでＧＩＰ受容体転写物を発現する
ことが見出された。受容体ｍＲＮＡは２種の骨芽細胞株、一つはヒト（ＳａＯＳ
２）、もう一つはラット（ＲＯＳ１７／２）と同時に単離されたラット破骨細胞
中で発現する。対照的に、もう一つの主要「インクレチン」ホルモンであるグル
カゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に対する受容体のメッセージはこの細胞株
中では観測されず、その発現も骨で他の研究者により報告されていない［Ｒ．
Ｖ． Ｃａｍｐｏｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４、２１５６−２１
６４（１９９４）］。このホルモンはＧＩＰと同様、小腸内の内分泌細胞で分泌
され、β細胞に作用し、その受容体は副甲状腺ホルモン、カルシトニン、コルチ
コトロピン放出因子、グルカゴン、下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ポリ
ペプチド、血管活性腸ペプチド、セクレチンおよび成長ホルモン放出ホルモンも
含む７個の膜横断ドメイン受容体のサブクラスの構成員である。
【００５２】 ＧＩＰＲに対するメッセージレベルはＭＧ６３細胞ではＳａＯＳ２細胞より４
．８倍高く、結語データと一致している。
．８倍高く、結語データと一致している。
【００５３】 実施例２： 骨細胞および骨様細胞におけるＧＩＰ受容体発現の免疫蛍光研究 細胞内ハイブリダイゼーションで同定されたｍＲＮＡの発現は必ずしもタンパ
ク質発現と相関しないので、直接免疫蛍光法を用いる研究をＧＩＰ受容体の細胞
外ドメインを指向する抗体を用いてさらに行った。
ク質発現と相関しないので、直接免疫蛍光法を用いる研究をＧＩＰ受容体の細胞
外ドメインを指向する抗体を用いてさらに行った。
【００５４】 正常ラット頚骨の切片とＳａＯｓ２細胞中のＧＩＰ受容体免疫蛍光の分布を、
ウサギ中で生成したＧＩＰ受容体配列の細胞外領域に相当する合成オリゴペプチ
ドに対するポリクローン性抗体［Ａｎｉｍａｌ Ｐｈａｒｍ． Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅａｌｄｓｂｕｒｇ、ＣＡ］を用いて測定した。抗体をアフィ
ニティーで精製し、抗体の特異性を発現ＧＩＰ受容体タンパク質と反応させて評
価した。バックグラウンドレベルをＣＹ３標識２次抗体のみを用いてラット頚骨
中の免疫蛍光として測定した。１次抗体の特異性も、ＳａＯｓ２細胞中で結合す
るＧＩＰ受容体１次抗体を、過剰（１４０μｇ）の１次抗体を生成するための抗
体として用いられるＧＩＰＲペプチド抗原の存在で１次抗体と競合的に置換する
ことにより試験した。ラット頚椎の切片を切り出し、固定し１次抗体としてのＧ
ＩＰＲ抗体で印を付け、次いでペルオキシダーゼで標識した。ラット頚骨で同様
なパターンの発現が見出された。培養中に生育したＳａＯＳ２細胞もＧＩＰＲ抗
体で標識した。ＳａＯＳ２細胞を抗体を製造するための抗原として用いた過剰（
１４０μｇ）のＧＩＰＲペプチド抗原の存在下で１次抗体と共にインキュベーシ
ョンした。ＭＧ６３細胞も、ＳａＯＳ２細胞のパターンに類似の標識パターンを
有する強い陽性であった。正常ヒト骨芽細胞についてもＧＩＰＲを試験した。
ウサギ中で生成したＧＩＰ受容体配列の細胞外領域に相当する合成オリゴペプチ
ドに対するポリクローン性抗体［Ａｎｉｍａｌ Ｐｈａｒｍ． Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅａｌｄｓｂｕｒｇ、ＣＡ］を用いて測定した。抗体をアフィ
ニティーで精製し、抗体の特異性を発現ＧＩＰ受容体タンパク質と反応させて評
価した。バックグラウンドレベルをＣＹ３標識２次抗体のみを用いてラット頚骨
中の免疫蛍光として測定した。１次抗体の特異性も、ＳａＯｓ２細胞中で結合す
るＧＩＰ受容体１次抗体を、過剰（１４０μｇ）の１次抗体を生成するための抗
体として用いられるＧＩＰＲペプチド抗原の存在で１次抗体と競合的に置換する
ことにより試験した。ラット頚椎の切片を切り出し、固定し１次抗体としてのＧ
ＩＰＲ抗体で印を付け、次いでペルオキシダーゼで標識した。ラット頚骨で同様
なパターンの発現が見出された。培養中に生育したＳａＯＳ２細胞もＧＩＰＲ抗
体で標識した。ＳａＯＳ２細胞を抗体を製造するための抗原として用いた過剰（
１４０μｇ）のＧＩＰＲペプチド抗原の存在下で１次抗体と共にインキュベーシ
ョンした。ＭＧ６３細胞も、ＳａＯＳ２細胞のパターンに類似の標識パターンを
有する強い陽性であった。正常ヒト骨芽細胞についてもＧＩＰＲを試験した。
【００５５】 材料と方法 細胞培養 本報告で調べた細胞株にはＳａＯＳ２、ＭＧ６３、ＲＯＳ１７／２．８、Ｈｅ
ｌａおよびＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞が含まれる。正常１次ヒト骨芽細胞（Ｃｌ
ｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）も使用した。細胞を１０％（ｖ／
ｖ）胎児ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｌ
ｏｇａｎ、ＵＴ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０
０ｍｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（３ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭＥＭ、Ｒ
ＰＭＩまたはＤＭＥＭ中（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒ
ｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で密集状態に生育させ、３〜７日間の後期密集培養を行っ
た。我々はグルタミンが構造コラーゲンの発現レベルを増加させることを発見し
たので、Ｉ型コラーゲンの発現研究ではＳａＯＳ２細胞をグルタミンを含まない
培地中で生育した。
ｌａおよびＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞が含まれる。正常１次ヒト骨芽細胞（Ｃｌ
ｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）も使用した。細胞を１０％（ｖ／
ｖ）胎児ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｌ
ｏｇａｎ、ＵＴ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０
０ｍｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（３ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭＥＭ、Ｒ
ＰＭＩまたはＤＭＥＭ中（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒ
ｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で密集状態に生育させ、３〜７日間の後期密集培養を行っ
た。我々はグルタミンが構造コラーゲンの発現レベルを増加させることを発見し
たので、Ｉ型コラーゲンの発現研究ではＳａＯＳ２細胞をグルタミンを含まない
培地中で生育した。
【００５６】 免疫ブロット分析 図６に示すヒトＧＩＰ受容体タンパク質配列の細胞外領域に対応する合成オリ
ゴペプチド、ＳＫＧＱＴＡＧＥＬＹＱＲＷＥＲＹＲＲＥＣ、に対するポリクロー
ン性抗体をウサギ中に製造した。オリゴペプチドをＩｍｊｅｃｔマレイミド活性
化免疫原コンジュゲートキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＲｏｃｋＦｏｒｄ、ＩＬ）を用
いてＫＬＨに組み込み、ウサギ（Ａｎｉｍａｌ Ｆａｒｍ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、
Ｉｎｃ．、Ｈｅａｌｄｓｂｕｒｇ、ＣＡ）に注射した。血清をＣＮＢｒセファロ
ースに架橋したオリゴペプチド−ＢＳＡ上でアフィニティー精製し、抗体をウエ
スターンブロット分析でバクテリアで発現したＧＩＰ受容体タンパク質に対し評
価した。１次抗体の製造に用いた過剰の（１４０μｇ）ＧＩＰＲペプチド抗原の
存在下、１次抗体の特異性をＳａＯＳ２中のＧＩＰ受容体１次抗体結合を１次抗
体で競合的に置換して試験した。
ゴペプチド、ＳＫＧＱＴＡＧＥＬＹＱＲＷＥＲＹＲＲＥＣ、に対するポリクロー
ン性抗体をウサギ中に製造した。オリゴペプチドをＩｍｊｅｃｔマレイミド活性
化免疫原コンジュゲートキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＲｏｃｋＦｏｒｄ、ＩＬ）を用
いてＫＬＨに組み込み、ウサギ（Ａｎｉｍａｌ Ｆａｒｍ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、
Ｉｎｃ．、Ｈｅａｌｄｓｂｕｒｇ、ＣＡ）に注射した。血清をＣＮＢｒセファロ
ースに架橋したオリゴペプチド−ＢＳＡ上でアフィニティー精製し、抗体をウエ
スターンブロット分析でバクテリアで発現したＧＩＰ受容体タンパク質に対し評
価した。１次抗体の製造に用いた過剰の（１４０μｇ）ＧＩＰＲペプチド抗原の
存在下、１次抗体の特異性をＳａＯＳ２中のＧＩＰ受容体１次抗体結合を１次抗
体で競合的に置換して試験した。
【００５７】 間接免疫蛍光法 実験動物として３ヶ月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅ
ｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を
犠牲にし、組織を取り除いた。このプロトコールはＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ動物保護委員会（ＣＡＵＲＥ）に承認された。ラッ
トを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドと０．２％グルタルアルデヒドで心臓経
由で潅流した。頚骨と脊椎を集め、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で終夜固
定した。骨を１０％ＥＤＴＡ中、４〜６日間で脱カルシウムし、エタノールとキ
シレン中で脱水しパラフィン中に埋め込んだ、厚さ７μｍの切片を切り出し、脱
パラフィンし再水和した。
ｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を
犠牲にし、組織を取り除いた。このプロトコールはＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ動物保護委員会（ＣＡＵＲＥ）に承認された。ラッ
トを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドと０．２％グルタルアルデヒドで心臓経
由で潅流した。頚骨と脊椎を集め、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で終夜固
定した。骨を１０％ＥＤＴＡ中、４〜６日間で脱カルシウムし、エタノールとキ
シレン中で脱水しパラフィン中に埋め込んだ、厚さ７μｍの切片を切り出し、脱
パラフィンし再水和した。
【００５８】 ＳａＯＳ２とＭＧ６３細胞をカバーガラス上に置き、１０％胎児ウシ血清を補
充したＤＭＥＭ中で４８時間生育し、氷冷４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（
ＰＢＳ：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ ｍＭ ＫＣｌ、８．１ ｍＭ Ｎａ２ ＰＯ４、１．１５ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）
中、３０分で固定した。次いで細胞をＰＢＳ中で３×５分間濯ぎ洗いし、ＰＢＳ
＋ＮＨ４Ｃｌ（５０ｍＭ）中に１５分間移した。濯ぎ洗い後、表面をＰＢＳ＋Ｂ
ＳＡ（１００ｍｇ／１０ｍｌ）で１５分間覆った（「ブロッキングバッファー」
）。次いで細胞を５００μｌ ＰＢＳ＋ＢＳＡ中でＧＩＰ抗体と４５分間インキ
ュベーションした。次いで細胞を濯ぎ洗いし、２次抗体，Ｃｙ３ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ、（５μｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で覆い、エピフルオレセ
ンスにより可視化した（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡、Ｃａｒｌｓ Ｚ
ｅｉｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）。
充したＤＭＥＭ中で４８時間生育し、氷冷４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（
ＰＢＳ：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ ｍＭ ＫＣｌ、８．１ ｍＭ Ｎａ２ ＰＯ４、１．１５ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）
中、３０分で固定した。次いで細胞をＰＢＳ中で３×５分間濯ぎ洗いし、ＰＢＳ
＋ＮＨ４Ｃｌ（５０ｍＭ）中に１５分間移した。濯ぎ洗い後、表面をＰＢＳ＋Ｂ
ＳＡ（１００ｍｇ／１０ｍｌ）で１５分間覆った（「ブロッキングバッファー」
）。次いで細胞を５００μｌ ＰＢＳ＋ＢＳＡ中でＧＩＰ抗体と４５分間インキ
ュベーションした。次いで細胞を濯ぎ洗いし、２次抗体，Ｃｙ３ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ、（５μｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で覆い、エピフルオレセ
ンスにより可視化した（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡、Ｃａｒｌｓ Ｚ
ｅｉｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）。
【００５９】 免疫組織化学による位置決めのため、３，３’−ジアミノベンジジン・ペルオ
キシダーゼ基質としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼシステム
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を
用いて解析した。現像したスライドをエタノール中で脱水し、キシレン中で洗浄
し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中で反対染色した。
キシダーゼ基質としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼシステム
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を
用いて解析した。現像したスライドをエタノール中で脱水し、キシレン中で洗浄
し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中で反対染色した。
【００６０】 密集状態の骨細胞（５００、０００個／レーン対）を氷冷ホスフェート緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に掻きとり、氷冷ホモジェネーション緩衝液
（６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ
ＥＧＴＡ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭβ−メルカプトエタノール、およ
びプロテアーゼ阻害剤）中で６０秒間超音波処理した。タンパク質を試料緩衝液
（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．１
％ブロモフェノールブルー）中に入れ、煮沸した。
理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に掻きとり、氷冷ホモジェネーション緩衝液
（６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ
ＥＧＴＡ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭβ−メルカプトエタノール、およ
びプロテアーゼ阻害剤）中で６０秒間超音波処理した。タンパク質を試料緩衝液
（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．１
％ブロモフェノールブルー）中に入れ、煮沸した。
【００６１】 変性タンパク質をドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）で分離し、１：２５０希釈でアフィニティー精製したＧＩＰ受容体抗体
とインキュベーションした。免疫反応性バンドをセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ結合２次ヤギ抗ラビット血清で可視化し、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ、ＩＬ）で現像した。
ＡＧＥ）で分離し、１：２５０希釈でアフィニティー精製したＧＩＰ受容体抗体
とインキュベーションした。免疫反応性バンドをセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ結合２次ヤギ抗ラビット血清で可視化し、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ、ＩＬ）で現像した。
【００６２】 結果 正常ラット骨では骨細胞と骨芽細胞の両者が強い蛍光を示した。対照的に、Ｃ
Ｙ−３標識抗体のみとインキュベーションした場合、ラットの骨は細胞標識を示
さなかった。ＳａＯＳ２細胞も強い非核蛍光を示したが、過剰に存在する抗体製
造に用いた抗原でブロックすることができた。この結果は、抗体がＧＩＰ受容体
に特異的に結合することを示す。ＭＧ６３細胞も、ＳａＯＳ２細胞の蛍光と類似
したパターンで強い蛍光を示した。別な対照として、ＭＧ６３細胞を２次抗体の
みで標識したが、１次抗体の特異性が示された。
Ｙ−３標識抗体のみとインキュベーションした場合、ラットの骨は細胞標識を示
さなかった。ＳａＯＳ２細胞も強い非核蛍光を示したが、過剰に存在する抗体製
造に用いた抗原でブロックすることができた。この結果は、抗体がＧＩＰ受容体
に特異的に結合することを示す。ＭＧ６３細胞も、ＳａＯＳ２細胞の蛍光と類似
したパターンで強い蛍光を示した。別な対照として、ＭＧ６３細胞を２次抗体の
みで標識したが、１次抗体の特異性が示された。
【００６３】 受容体ｍＲＮＡを発現する同じ骨細胞型の全てで受容体タンパク質の発現が観
察された。これらの研究は、骨再吸収破骨細胞と骨形成骨芽細胞双方の上に受容
体が存在するという意味で、骨中のＧＩＰ受容体の分布が独特であることを示す
。対照的に、骨の上で作用することが知られている２種の特性がよく分かったペ
プチドホルモンに対する受容体は、これらの骨細胞型の一方のみに存在する。す
なわち、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）受容体は骨芽細胞上のみに［
Ａ． Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ、８９、２７３２−６（１９９２）］、カルシトニン（ＣＴ）受容体
は破骨細胞上のみに存在する［Ｓ． Ｒ． Ｇｏｌｄｒｉｎｇら、Ｈｏｒｍ Ｍ
ｅｔａｂ． Ｒｅｓ．、２５、４７７−８０（１９９３）］。従って、ＧＩＰは
骨形成を刺激して骨再吸収を阻害するよう同時に作用することが予想される。
察された。これらの研究は、骨再吸収破骨細胞と骨形成骨芽細胞双方の上に受容
体が存在するという意味で、骨中のＧＩＰ受容体の分布が独特であることを示す
。対照的に、骨の上で作用することが知られている２種の特性がよく分かったペ
プチドホルモンに対する受容体は、これらの骨細胞型の一方のみに存在する。す
なわち、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）受容体は骨芽細胞上のみに［
Ａ． Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ、８９、２７３２−６（１９９２）］、カルシトニン（ＣＴ）受容体
は破骨細胞上のみに存在する［Ｓ． Ｒ． Ｇｏｌｄｒｉｎｇら、Ｈｏｒｍ Ｍ
ｅｔａｂ． Ｒｅｓ．、２５、４７７−８０（１９９３）］。従って、ＧＩＰは
骨形成を刺激して骨再吸収を阻害するよう同時に作用することが予想される。
【００６４】 ２） ＧＩＰシグナル伝達経路の生体外研究 実施例３： 細胞質ゾルカルシウムとｃＡＭＰに対するＧＩＰの効果 ＧＩＰ受容体が存在することが知られている膵臓β細胞では、電圧感受性カル
シウムチャネルを通るカルシウム流入の増加と、内部貯蔵からの移動によりＧＩ
Ｐが細胞内カルシウムを増加させると報告されている。さらに、ＧＩＰは細胞ｃ
ＡＭＰを増加させる。従って、ＰＴＨとＧＩＰの両者が類似の信号伝達経路を活
性化すると報告されているが、ＰＴＨは抗同化性であり、ＧＩＰは生体内で骨に
対し同化性であると考えられる。ＧＩＰで活性化される信号伝達経路が膵臓小島
細胞と骨細胞の間で異なっているかどうかを決定するため、カルシウムおよびｃ
ＡＭＰ反応の双方を検討した。
シウムチャネルを通るカルシウム流入の増加と、内部貯蔵からの移動によりＧＩ
Ｐが細胞内カルシウムを増加させると報告されている。さらに、ＧＩＰは細胞ｃ
ＡＭＰを増加させる。従って、ＰＴＨとＧＩＰの両者が類似の信号伝達経路を活
性化すると報告されているが、ＰＴＨは抗同化性であり、ＧＩＰは生体内で骨に
対し同化性であると考えられる。ＧＩＰで活性化される信号伝達経路が膵臓小島
細胞と骨細胞の間で異なっているかどうかを決定するため、カルシウムおよびｃ
ＡＭＰ反応の双方を検討した。
【００６５】 材料と方法 ｆｕｒａ−２による細胞内カルシウムの測定 Ｇａｓａｌｌａ−Ｈｅｒｒａｉｚらの報告［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２１４：３７３−８８（１９９５）］の通り
細胞内カルシウムの測定を行った。簡単に言えば、ＳａＯＳ２細胞を７５ｃｍ２ フラスコ中で生育し、ＰＢＳ／ＥＧＴＡ中でインキュベーションして取り出した
。細胞にＫＲＢ中のカルシウム感受性染料ｆｕｒａ−２ＡＭを室温で４５分間負
荷した。次いで細胞を遠心分離し、ＫＲＢ中に再懸濁した。ｆｕｒａ−２ＡＭを
ｆｕｒａ−２にエステラーゼ分解するため室温で約３０分後、細胞を再度遠心分
離し、２重波長分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ）中のキュベットに入れた。励起波長３４０および３８０ｎｍ、発光波長５１
０ｎｍを用いて蛍光を測定した。無負荷細胞の自発蛍光を測定し、この価を全て
の測定値から差し引いた。
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２１４：３７３−８８（１９９５）］の通り
細胞内カルシウムの測定を行った。簡単に言えば、ＳａＯＳ２細胞を７５ｃｍ２ フラスコ中で生育し、ＰＢＳ／ＥＧＴＡ中でインキュベーションして取り出した
。細胞にＫＲＢ中のカルシウム感受性染料ｆｕｒａ−２ＡＭを室温で４５分間負
荷した。次いで細胞を遠心分離し、ＫＲＢ中に再懸濁した。ｆｕｒａ−２ＡＭを
ｆｕｒａ−２にエステラーゼ分解するため室温で約３０分後、細胞を再度遠心分
離し、２重波長分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ）中のキュベットに入れた。励起波長３４０および３８０ｎｍ、発光波長５１
０ｎｍを用いて蛍光を測定した。無負荷細胞の自発蛍光を測定し、この価を全て
の測定値から差し引いた。
【００６６】 サイクリックＡＭＰの測定： ｃＡＭＰ測定をＩｓａｌｅｓらの報告［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９
：４８９−９５（１９９１）］通り行った。簡単に言えば、ＳａＯＳ２細胞を６
０ｍｍ２皿中で密集生育し、使用前にＫＲＢ中に２４時間置いた。ｃＡＭＰ凄惨
の測定をし易くするため、１ｍＭイソメチルブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）をア
ゴニスト添加１０分前に加え、次いでアゴニストと共に１０分間インキュベーシ
ョンした。５％ＴＣＡを加えてインキュベーションを停止し、氷の上に１５分間
放置し細胞抽出物を集めた。氷冷フレオン／トリ−Ｎ−オクチルアミン（４：１
、ｖ／ｖ）１：１溶液を加え抽出物を中和した。適度の攪拌を確認するため、各
試料を少なくとも３０秒間ボルテックス攪拌した。混合物を２，５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離した（４℃）。ｃＡＭＰを含む上相水溶液を集めた。上相のｐ
Ｈをチェックし、中和が適当であるか確認した。分析まで試料を−７０℃で保存
した。ｃＡＭＰを市販の放射線免疫分析装置（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）で測定した。インキュベーショ
ンはすべて３重に行い、異なった細胞調製物を用い各実験を３回繰り返した。
：４８９−９５（１９９１）］通り行った。簡単に言えば、ＳａＯＳ２細胞を６
０ｍｍ２皿中で密集生育し、使用前にＫＲＢ中に２４時間置いた。ｃＡＭＰ凄惨
の測定をし易くするため、１ｍＭイソメチルブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）をア
ゴニスト添加１０分前に加え、次いでアゴニストと共に１０分間インキュベーシ
ョンした。５％ＴＣＡを加えてインキュベーションを停止し、氷の上に１５分間
放置し細胞抽出物を集めた。氷冷フレオン／トリ−Ｎ−オクチルアミン（４：１
、ｖ／ｖ）１：１溶液を加え抽出物を中和した。適度の攪拌を確認するため、各
試料を少なくとも３０秒間ボルテックス攪拌した。混合物を２，５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離した（４℃）。ｃＡＭＰを含む上相水溶液を集めた。上相のｐ
Ｈをチェックし、中和が適当であるか確認した。分析まで試料を−７０℃で保存
した。ｃＡＭＰを市販の放射線免疫分析装置（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）で測定した。インキュベーショ
ンはすべて３重に行い、異なった細胞調製物を用い各実験を３回繰り返した。
【００６７】 結果 ＧＩＰはｃＡＭＰおよびＣａ２＋依存性信号伝達経路を活性化する 信号伝達におけるこれらのＧＩＰ受容体の機能を決定するため、通常ＧＩＰ受
容体が関与する信号伝達経路をまず調べた。ＰＴＨと同様、ＧＩＰの受容体はア
デニリルサイクラーゼとホスフォイノシチド特異性ホスフォリパーゼＣ（ＰＩ−
ＰＬＣ）信号伝達経路の双方と同時に作用する７種の膜横断ドメイン架橋受容体
サブクラスの構成員である。
容体が関与する信号伝達経路をまず調べた。ＰＴＨと同様、ＧＩＰの受容体はア
デニリルサイクラーゼとホスフォイノシチド特異性ホスフォリパーゼＣ（ＰＩ−
ＰＬＣ）信号伝達経路の双方と同時に作用する７種の膜横断ドメイン架橋受容体
サブクラスの構成員である。
【００６８】 ＧＩＰは細胞質ゾルカルシウム濃度とＳａＯＳ２細胞中の細胞ｃＡＭＰ含有量
の双方を増加させたが、カルシウム反応は［Ｃａ２＋］ｉで投与量に依存する増
加を示し、０．１ ｎＭ ＧＩＰで有為の増加であった（図１Ａ）。１ ｎＭ以
上のＧＩＰ濃度で細胞ｃＡＭＰ含有量の上昇を刺激することができた（図１Ｂ）
。これらの上昇はＧＩＰ濃度１μＭで対照の７１０％以上に達した。
の双方を増加させたが、カルシウム反応は［Ｃａ２＋］ｉで投与量に依存する増
加を示し、０．１ ｎＭ ＧＩＰで有為の増加であった（図１Ａ）。１ ｎＭ以
上のＧＩＰ濃度で細胞ｃＡＭＰ含有量の上昇を刺激することができた（図１Ｂ）
。これらの上昇はＧＩＰ濃度１μＭで対照の７１０％以上に達した。
【００６９】 まず細胞質ゾルカルシウム濃度に対するＧＩＰの効果を測定した。ＧＩＰは［
Ｃａ２＋］ｉを投与量に依存して増加させ、図１Ａに示す様に有為の増加は１ｐ
Ｍ ＧＩＰで生じた。図１Ｂに示す様に、１ｎＭ以上のＧＩＰ濃度で細胞ｃＡＭ
Ｐ含有量の上昇を有意に刺激することが可能であった。これらの上昇はＧＩＰ濃
度１μＭで対照の７１０％以上に達した。これらのＧＩＰのより高い濃度は明ら
かに医薬および明らかではないが生理学意義を有するものである。しかしながら
、ＧＩＰに応答して観測される細胞反応により、これらの受容体が機能性であり
、特定の信号伝達経路と結びつき、これらの骨芽様細胞中で特定の反応を誘発す
ることが可能であることを明らかにすることができる。
Ｃａ２＋］ｉを投与量に依存して増加させ、図１Ａに示す様に有為の増加は１ｐ
Ｍ ＧＩＰで生じた。図１Ｂに示す様に、１ｎＭ以上のＧＩＰ濃度で細胞ｃＡＭ
Ｐ含有量の上昇を有意に刺激することが可能であった。これらの上昇はＧＩＰ濃
度１μＭで対照の７１０％以上に達した。これらのＧＩＰのより高い濃度は明ら
かに医薬および明らかではないが生理学意義を有するものである。しかしながら
、ＧＩＰに応答して観測される細胞反応により、これらの受容体が機能性であり
、特定の信号伝達経路と結びつき、これらの骨芽様細胞中で特定の反応を誘発す
ることが可能であることを明らかにすることができる。
【００７０】 実施例４： 受容体結合の研究 ＧＩＰ受容体をさらに特徴付けるため、様々な骨芽細胞株に対する放射線標識 １２５ Ｉ−ＧＩＰの結合を調べた。受容体結合の研究はＯｒｌｏｆｆらの報告通
り行われた［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：５３７６−８５（１９９６
）］。簡単に言えば、ＳａＯＳ２、ＭＧ６３またはＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を
６孔プレート上で生育し、過剰の非標識ＧＩＰ（１μＭ）の存在下または非存在
下で室温で２時間、［１２５Ｉ］−ＧＩＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の濃度を
増加させてインキュベーションした。次いで細胞を１ｍｌの冷ＰＢＳ（＋０．０
５％ＢＳＡ）で３回洗浄し、０．３Ｍ ＮａＯＨで可溶化した。抽出液をγ線計
数器で計数し、バックグラウンド計数を差し引いた。実験は３重に行われた。
り行われた［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：５３７６−８５（１９９６
）］。簡単に言えば、ＳａＯＳ２、ＭＧ６３またはＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を
６孔プレート上で生育し、過剰の非標識ＧＩＰ（１μＭ）の存在下または非存在
下で室温で２時間、［１２５Ｉ］−ＧＩＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の濃度を
増加させてインキュベーションした。次いで細胞を１ｍｌの冷ＰＢＳ（＋０．０
５％ＢＳＡ）で３回洗浄し、０．３Ｍ ＮａＯＨで可溶化した。抽出液をγ線計
数器で計数し、バックグラウンド計数を差し引いた。実験は３重に行われた。
【００７１】 骨芽細胞様細胞株ＳａＯＳ２およびＭＧ６３は親和性の高い結合部位を示した
が、３Ｔ３線維芽細胞は最小限のバックグラウンド結合効果を示した。ＭＧ６３
とＳａＯＳ２細胞の両者は類似のＫｄ値、約０．３ｎＭを有するが、ＭＧ６３の
ＢｍａｘはＳａＯＳ２のものより高い。
が、３Ｔ３線維芽細胞は最小限のバックグラウンド結合効果を示した。ＭＧ６３
とＳａＯＳ２細胞の両者は類似のＫｄ値、約０．３ｎＭを有するが、ＭＧ６３の
ＢｍａｘはＳａＯＳ２のものより高い。
【００７２】 ３） ＧＩＰの作用の研究 ＧＩＰが骨量に対し同化効果を有するならば、骨マトリックス合成を増加させ
ると考えられる。骨マトリックスの主なタンパク質成分はＩ型コラーゲンである
。従って、ＧＩＰがＩ型コラーゲン合成を増加させるかどうかを決定するため、
ＳａＯＳ２に付いて生体外実験を行った。
ると考えられる。骨マトリックスの主なタンパク質成分はＩ型コラーゲンである
。従って、ＧＩＰがＩ型コラーゲン合成を増加させるかどうかを決定するため、
ＳａＯＳ２に付いて生体外実験を行った。
【００７３】 実施例５： コラーゲン合成に対するＧＩＰの効果の研究 材料と方法 ＳａＯＳ２を７５ｃｍ２フラスコ中で生育し、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ
または１００ｎＭの投与量で２４時間、ＧＩＰで刺激した（培地を新鮮なＧＩＰ
を含む培地で８時間毎に置換した）。２４時間後、Ｔｒｉｚｏｌを用い全ＲＮＡ
を細胞から抽出した。ＲＮＡ（２０μｇ）を１．２％アガロース−ホルムアルデ
ヒドゲル上で電気泳動し、ナイロンフィルター上へ移した。ブロットを３２Ｐ標
識プローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）と６５℃で終夜ハイブリダイゼーションし、
ランダムプライム法で標識し、最新の注意を払って洗浄した。ブロットをコダッ
クＸＡＲ５フィルムに露光し、光学濃度計で解析し、Ｂｉｏｉｍａｇｅソフトウ
ェアを用いてＳｕｎ Ｓｐａｒｃステーション上で定量した（ｎ＝４、＊＝ｐ＜
０．００１）。ＧＩＰへの応答が変化しないことが分かっている構成遺伝子であ
るＧＡＰＤＨに対しコラーゲン光学濃度を正規化した。
または１００ｎＭの投与量で２４時間、ＧＩＰで刺激した（培地を新鮮なＧＩＰ
を含む培地で８時間毎に置換した）。２４時間後、Ｔｒｉｚｏｌを用い全ＲＮＡ
を細胞から抽出した。ＲＮＡ（２０μｇ）を１．２％アガロース−ホルムアルデ
ヒドゲル上で電気泳動し、ナイロンフィルター上へ移した。ブロットを３２Ｐ標
識プローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）と６５℃で終夜ハイブリダイゼーションし、
ランダムプライム法で標識し、最新の注意を払って洗浄した。ブロットをコダッ
クＸＡＲ５フィルムに露光し、光学濃度計で解析し、Ｂｉｏｉｍａｇｅソフトウ
ェアを用いてＳｕｎ Ｓｐａｒｃステーション上で定量した（ｎ＝４、＊＝ｐ＜
０．００１）。ＧＩＰへの応答が変化しないことが分かっている構成遺伝子であ
るＧＡＰＤＨに対しコラーゲン光学濃度を正規化した。
【００７４】 結果 培養骨芽細胞に対するＧＩＰの効果の研究から、１０ｎＭ以上の濃度でＧＩＰ
が骨形成のマーカーであるＩ型コラーゲンの合成を刺激することが示される。Ｉ
型コラーゲンに対するＧＩＰの効果は投与量依存性ではない。むしろ、低いＧＩ
Ｐ投与量（０．１および１ｎＭ）はコラーゲン合成に効果がなく。高い投与量（
１０および１００ｎＭ）は最大の効果を示した。コラーゲンは骨マトリックスの
１次構成成分であるので、コラーゲン合成に影響する能力は骨の同化効果と一致
する。
が骨形成のマーカーであるＩ型コラーゲンの合成を刺激することが示される。Ｉ
型コラーゲンに対するＧＩＰの効果は投与量依存性ではない。むしろ、低いＧＩ
Ｐ投与量（０．１および１ｎＭ）はコラーゲン合成に効果がなく。高い投与量（
１０および１００ｎＭ）は最大の効果を示した。コラーゲンは骨マトリックスの
１次構成成分であるので、コラーゲン合成に影響する能力は骨の同化効果と一致
する。
【００７５】 ＧＩＰはＩ型コラーゲン遺伝子発現を刺激し、骨芽様細胞株でアルカリホスファ
ターゼ活性を活性化する ＧＩＰが骨細胞中でシグナル伝達と関連することを示してきたが、まだ回答さ
れない問題は、正常な骨細胞の生物学におけるＧＩＰの可能な役割であり、生体
内で細胞反応を誘発するその能力も不明であった。この問題を解決するため、骨
生成における二つの同化指数、新規マトリックス合成と骨芽様細胞でのアルカリ
ホスファターゼ活性、に対するＧＩＰの効果を調べた。
ターゼ活性を活性化する ＧＩＰが骨細胞中でシグナル伝達と関連することを示してきたが、まだ回答さ
れない問題は、正常な骨細胞の生物学におけるＧＩＰの可能な役割であり、生体
内で細胞反応を誘発するその能力も不明であった。この問題を解決するため、骨
生成における二つの同化指数、新規マトリックス合成と骨芽様細胞でのアルカリ
ホスファターゼ活性、に対するＧＩＰの効果を調べた。
【００７６】 ＧＩＰがＳａＯＳ２細胞中でＩ型コラーゲンの発現を刺激するかどうかを最初
に測定した。ＳａＯＳ２細胞はＧＩＰ濃度を増加すると刺激され、Ｉ型コラーゲ
ンの発現をノーザンブロットで評価し光学濃度法で定量した。図２Ａに示す様に
、１ｎＭ以上の濃度でＧＩＰは骨形成のマーカーであるＩ型コラーゲンの発現を
刺激した。より高いＧＩＰ濃度でそれ以上のＩ型コラーゲンの発現は見られなか
ったので、このＧＩＰの効果は閾値効果を示すように思われる。コラーゲンは骨
マトリックスの１次構成成分であるので、コラーゲン合成に影響する能力はＧＩ
Ｐの骨に対する同化効果と一致する。この問題をさらに調べるため、以前の実験
で最大の効果があることが分かった投与量（１ｎＭ）を用いてコラーゲン合成に
対するＧＩＰ効果の時間変化を評価した。その結果を図２Ｂに示す。コラーゲン
ｍＲＮＡに対するＡＧＩＰ効果は６時間の刺激で観測され、その後の時点ではそ
れ以上の増加は観測されなかった。
に測定した。ＳａＯＳ２細胞はＧＩＰ濃度を増加すると刺激され、Ｉ型コラーゲ
ンの発現をノーザンブロットで評価し光学濃度法で定量した。図２Ａに示す様に
、１ｎＭ以上の濃度でＧＩＰは骨形成のマーカーであるＩ型コラーゲンの発現を
刺激した。より高いＧＩＰ濃度でそれ以上のＩ型コラーゲンの発現は見られなか
ったので、このＧＩＰの効果は閾値効果を示すように思われる。コラーゲンは骨
マトリックスの１次構成成分であるので、コラーゲン合成に影響する能力はＧＩ
Ｐの骨に対する同化効果と一致する。この問題をさらに調べるため、以前の実験
で最大の効果があることが分かった投与量（１ｎＭ）を用いてコラーゲン合成に
対するＧＩＰ効果の時間変化を評価した。その結果を図２Ｂに示す。コラーゲン
ｍＲＮＡに対するＡＧＩＰ効果は６時間の刺激で観測され、その後の時点ではそ
れ以上の増加は観測されなかった。
【００７７】 実施例６： アルカリホスファターゼ活性の測定 骨芽細胞は順序正しいパターンに従うが、それは初期増殖相（ｃ−ｍｙｃ、ｃ
−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ヒストンおよびＩ型コラーゲンの発現増加）とその後の
分化相（アルカリホスファターゼの発現増加）、および最後の無機化相（骨シア
ロタンパク質、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現増加）が特徴で
ある。従って、アルカリホスファターゼ活性は骨芽細胞分化の印であると考えら
れる。
−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ヒストンおよびＩ型コラーゲンの発現増加）とその後の
分化相（アルカリホスファターゼの発現増加）、および最後の無機化相（骨シア
ロタンパク質、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現増加）が特徴で
ある。従って、アルカリホスファターゼ活性は骨芽細胞分化の印であると考えら
れる。
【００７８】 方法と材料 ＲＮＡの調製とノーザンブロット解析： 全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて細胞か
ら抽出した。使用するまでＲＮＡを−７０℃で保存した。ＲＮＡ（２０μｇ）を
１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ナイロンフィルタ
ー上へ移した。ブロットを３２Ｐ標識プローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）と共に６
５℃で終夜ハイブリダイゼーションし、ランダム・プライミング法で標識し最新
の注意を払って洗浄した。ハイブリダイゼーションを７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４の溶液中で行った。ハイブリダ
イゼーションフィルターを２ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳで室温で５分間、４回、
０．１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間、２回洗浄した。次いでブ
ロットをコダックＸＡＲ５フィルムに露光した。使用したプローブはＧＡＰＤＨ
（ＡＴＣＣクローン５７０９０）、Ｉ型コラーゲン（ｉ．ｍ．ａ．ｇ．ｅ．クロ
ーン＃３０８９１９）および膜横断ドメイン２〜７に対応するＰＣＲ由来のヒト
ＧＩＰＲ断片であった。
ら抽出した。使用するまでＲＮＡを−７０℃で保存した。ＲＮＡ（２０μｇ）を
１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ナイロンフィルタ
ー上へ移した。ブロットを３２Ｐ標識プローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）と共に６
５℃で終夜ハイブリダイゼーションし、ランダム・プライミング法で標識し最新
の注意を払って洗浄した。ハイブリダイゼーションを７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４の溶液中で行った。ハイブリダ
イゼーションフィルターを２ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳで室温で５分間、４回、
０．１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間、２回洗浄した。次いでブ
ロットをコダックＸＡＲ５フィルムに露光した。使用したプローブはＧＡＰＤＨ
（ＡＴＣＣクローン５７０９０）、Ｉ型コラーゲン（ｉ．ｍ．ａ．ｇ．ｅ．クロ
ーン＃３０８９１９）および膜横断ドメイン２〜７に対応するＰＣＲ由来のヒト
ＧＩＰＲ断片であった。
【００７９】 アルカリホスファターゼ活性： アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を市販の分析キット（ＡＬＰ ＥＣ３
．１．１．１比色テスト；Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ． Ｌｏ
ｕｉｓ、ＭＯ）を用いて測定した。このキットはｐ−ニトロフェニルホスフェー
トのｐ−ニトロフェノールと無機燐酸への変換を測定する。４０５ｎｍでの吸光
度変化がＡＬＰ活性と正比例する。ＭＧ６３細胞を６穴プレート中で生育させ、
指定されたアゴニストと共に指定された時間インキュベーションし（培地を新鮮
なアゴニストを再添加して毎日交換した）、試料を集めた。キット試薬を３０℃
で分光光度計中の試料キュベットに添加し、４０５ｎｍの吸光度を１、２および
３分に測定した。ＡＬＰ活性（Ｕ／Ｌ）を吸光度の時間変化と１８．４５．の４
０５ｎｍでのｐ−ニトロフェノールのミリモル吸光度を用いて測定した。
．１．１．１比色テスト；Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ． Ｌｏ
ｕｉｓ、ＭＯ）を用いて測定した。このキットはｐ−ニトロフェニルホスフェー
トのｐ−ニトロフェノールと無機燐酸への変換を測定する。４０５ｎｍでの吸光
度変化がＡＬＰ活性と正比例する。ＭＧ６３細胞を６穴プレート中で生育させ、
指定されたアゴニストと共に指定された時間インキュベーションし（培地を新鮮
なアゴニストを再添加して毎日交換した）、試料を集めた。キット試薬を３０℃
で分光光度計中の試料キュベットに添加し、４０５ｎｍの吸光度を１、２および
３分に測定した。ＡＬＰ活性（Ｕ／Ｌ）を吸光度の時間変化と１８．４５．の４
０５ｎｍでのｐ−ニトロフェノールのミリモル吸光度を用いて測定した。
【００８０】 統計： 結果を平均値±ＳＥＭで表す。データをＡＮＯＶＡまたは対応のないｔ−試験
のいずれかを用いて解析したが、適当な場合は市販の統計パッケージ（Ｉｎｓｔ
ａｔ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）を用いた。
のいずれかを用いて解析したが、適当な場合は市販の統計パッケージ（Ｉｎｓｔ
ａｔ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）を用いた。
【００８１】 結果 Ｉ型コラーゲン合成に加え、骨の同化活性の他のインデックスはアルカリホス
ファターゼ（ＡＬＰ）活性である。この可能性をＭＧ６３細胞株におけるＧＩＰ
のアルカリホスファターゼ活性に対する効果を測定して評価した。受容体結合の
実験から、細胞株はＧＩＰ受容体が豊富であることを示す。図３に示す様に、０
．１ｎＭ濃度のＧＩＰは刺激後早くも２日でＡＬＰ活性をかなり増加させ、ＧＩ
Ｐ暴露の６日後もＡＬＰ活性が増加し続けた。より高いＧＩＰ投与量（１〜１０
ｎＭ）でも、０．１ｎＭ ＧＩＰで見出された以上にＡＬＰ活性を増加させなか
った。ＡＬＰに対するＧＩＰの効果は、正の対照として用いられた１，２５ビタ
ミンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）で観測された値よ
り大きかった。従って、ＧＩＰはアルカリホスファターゼ活性の強力なインデュ
ーサーである。
ファターゼ（ＡＬＰ）活性である。この可能性をＭＧ６３細胞株におけるＧＩＰ
のアルカリホスファターゼ活性に対する効果を測定して評価した。受容体結合の
実験から、細胞株はＧＩＰ受容体が豊富であることを示す。図３に示す様に、０
．１ｎＭ濃度のＧＩＰは刺激後早くも２日でＡＬＰ活性をかなり増加させ、ＧＩ
Ｐ暴露の６日後もＡＬＰ活性が増加し続けた。より高いＧＩＰ投与量（１〜１０
ｎＭ）でも、０．１ｎＭ ＧＩＰで見出された以上にＡＬＰ活性を増加させなか
った。ＡＬＰに対するＧＩＰの効果は、正の対照として用いられた１，２５ビタ
ミンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）で観測された値よ
り大きかった。従って、ＧＩＰはアルカリホスファターゼ活性の強力なインデュ
ーサーである。
【００８２】 実施例７： 骨再吸収に対するＧＩＰの効果 方法と材料 妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）に２００μＣｉ４５Ｃａを
妊娠１８日に注入し、１日後に殺して標識胎児ぎょう骨と尺骨を取り出した。骨
外植片をＢＧＪｂ培地中で２４時間前培養し、次いで試験物質（１０ｎＭ ＧＩ
Ｐ；１０ｎＭ ＰＴＨ；および５、１０または５０ｎＭいずれかのＧＩＰとＰＴ
Ｈ）の存在下、または非存在下でＢＧＪｂ中で６日間培養した。培地を３日毎に
交換し、各培養期間後に４５Ｃａを測定した。再吸収を処理骨と対照骨からの４ ５ Ｃａ放出比で表した。
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）に２００μＣｉ４５Ｃａを
妊娠１８日に注入し、１日後に殺して標識胎児ぎょう骨と尺骨を取り出した。骨
外植片をＢＧＪｂ培地中で２４時間前培養し、次いで試験物質（１０ｎＭ ＧＩ
Ｐ；１０ｎＭ ＰＴＨ；および５、１０または５０ｎＭいずれかのＧＩＰとＰＴ
Ｈ）の存在下、または非存在下でＢＧＪｂ中で６日間培養した。培地を３日毎に
交換し、各培養期間後に４５Ｃａを測定した。再吸収を処理骨と対照骨からの４ ５ Ｃａ放出比で表した。
【００８３】 結果 結果を図４に示す。胎児長骨分析システムで測定してＧＩＰはＰＴＨ−誘導骨
再吸収を阻害する。ＰＴＨ−誘導骨再吸収の正確な機序は不明であるが、少なく
とも異化効果が部分的に働いている。
再吸収を阻害する。ＰＴＨ−誘導骨再吸収の正確な機序は不明であるが、少なく
とも異化効果が部分的に働いている。
【００８４】 ４） 生体内動物モデルにおけるＧＩＰ作用の特徴付け 上記に示したデータは、ＧＩＰが生体外で細胞機能を調節し得る事を示すが、
ＧＩＰの生体内での生理学的役割を示していない。この問題を解決するため、２
つの動物モデル（尾血管によるＧＩＰ注入を毎日受けたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ
ＬｅｙラットとＧＩＰを過剰発現する遺伝子形質移入マウス）を用いた。
ＧＩＰの生体内での生理学的役割を示していない。この問題を解決するため、２
つの動物モデル（尾血管によるＧＩＰ注入を毎日受けたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ
ＬｅｙラットとＧＩＰを過剰発現する遺伝子形質移入マウス）を用いた。
【００８５】 実施例８： 幼獣卵巣摘出ラットにおける脊柱骨に対するＧＩＰの効果 閉経後骨多孔症の動物モデルとして卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットを広範囲に使用
してきたが、このモデルを骨形成に関するＧＩＰの生体内の効果を調べるために
用いた。
してきたが、このモデルを骨形成に関するＧＩＰの生体内の効果を調べるために
用いた。
【００８６】 方法と材料 ８週齢の１３匹の処女雌ＯＶＸと１１匹の処女非ＯＶＸ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄ
ａｗｌｅｙラット（１５０〜１７４ｇ）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａ
ｗｌｅｙ、Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＧｅｏｒｇｉａのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅｒｃ
ｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育した。プロトコールはＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ ＧｅｏｒｇｉａのＣＡＵＲＥ委員会に承認された。動物を２１℃に
保った室内の別々の釣り下げケージに入れ、０６００／１８００Ｅ．Ｓ．Ｔで１
２時間の照明／暗黒サイクルとした。動物を通常の市販餌ペレット（Ｔｅｋｌａ
ｂ Ｒｏｄｅｎｔ餌；１．４６％カルシウム）で不断給餌し、水を自由に飲ませ
た。
ａｗｌｅｙラット（１５０〜１７４ｇ）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａ
ｗｌｅｙ、Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＧｅｏｒｇｉａのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅｒｃ
ｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育した。プロトコールはＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ ＧｅｏｒｇｉａのＣＡＵＲＥ委員会に承認された。動物を２１℃に
保った室内の別々の釣り下げケージに入れ、０６００／１８００Ｅ．Ｓ．Ｔで１
２時間の照明／暗黒サイクルとした。動物を通常の市販餌ペレット（Ｔｅｋｌａ
ｂ Ｒｏｄｅｎｔ餌；１．４６％カルシウム）で不断給餌し、水を自由に飲ませ
た。
【００８７】 ラットを無作為に体重を合わせた４つの実験グループに分け、尾の血管に生理
食塩水またはヒトＧＩＰ（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）
の注射を毎朝受ける様に選択した。ラットを以下の様な４つの研究グループに分
けた：
食塩水またはヒトＧＩＰ（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）
の注射を毎朝受ける様に選択した。ラットを以下の様な４つの研究グループに分
けた：
【００８８】 １． 対照： ５匹の非ＯＶＸラットに毎朝（９：００）、尾の血管に生理
食塩水を６週間注射した。
食塩水を６週間注射した。
【００８９】 ２． 対照＋ＧＩＰ： ６匹の非ＯＶＸラットに毎日、ＧＩＰ（０．０５ｍ
ｇ／ｋｇ）を上記の様に尾の血管から６週間注射した。
ｇ／ｋｇ）を上記の様に尾の血管から６週間注射した。
【００９０】 ３． ＯＶＸ： ６匹のＯＶＸラットに毎日、生理食塩水を６週間注射した
。
。
【００９１】 ４． ＯＶＸ＋ＧＩＰ： ７匹のＯＶＸラットに毎日、ＧＩＰ（０．０５ｍ
ｇ／ｋｇ）を尾の血管に６週間注射した。
ｇ／ｋｇ）を尾の血管に６週間注射した。
【００９２】 選ばれたＧＩＰの投与量は約１０ｎＭであり、生体外でコラーゲン合成刺激に
ほぼ最大の効果を与える量である。ラットの体重を毎日計量し、身長をベースラ
インに測定し、第６週間に再度測定した。Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ １０００／
Ｗ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いる二重エネルギーＸ−線吸収法（ＤＸＡ）を
、第６週に処置を開始する前に全ての動物について行い、データをＲａｔ Ｗｈ
ｏｌｅ Ｂｏｄｙソフトウェアバージョン５．５３を用いて解析した。研究の最
後に実験対照を犠牲にし、骨試料を組織形態学解析と免疫細胞化学のために採取
した。
ほぼ最大の効果を与える量である。ラットの体重を毎日計量し、身長をベースラ
インに測定し、第６週間に再度測定した。Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ １０００／
Ｗ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いる二重エネルギーＸ−線吸収法（ＤＸＡ）を
、第６週に処置を開始する前に全ての動物について行い、データをＲａｔ Ｗｈ
ｏｌｅ Ｂｏｄｙソフトウェアバージョン５．５３を用いて解析した。研究の最
後に実験対照を犠牲にし、骨試料を組織形態学解析と免疫細胞化学のために採取
した。
【００９３】 結果 図５に示す骨デンシトメトリーは、ＯＶＸグループに対し対照グループおよび
対照＋ＧＩＰグループの脊椎における骨の無機物密度（ＢＭＤ）の変化に有為の
差を示した。
対照＋ＧＩＰグループの脊椎における骨の無機物密度（ＢＭＤ）の変化に有為の
差を示した。
【００９４】 ＯＶＸグループは全グループの中で最低の密度を有した。ＧＩＰは脊椎骨密度
に対する卵巣摘出の負の効果を減少させた。ＯＶＸ＋ＧＩＰラットの平均６週間
脊椎ＢＭＤはＯＶＸラットより高かった（０．１４３４ ＝／−０．００１０
ｇｍｓ／ｃｍ２対０．１３８８＋／−０．００４５ ｇｍｓ／ｃｍ２、Ｐ ＝
０．０３８５）。ＧＩＰ処理対照動物は未処理動物より低い骨密度を有したが、
この差は統計的に有意ではなかった。ＧＩＰ処理対照グループでなぜ骨密度の増
加が観察されなかったかは明らかでない。それは不適切なＧＩＰ投与量、注射の
タイミング（一回と多数回）、ラットの年齢（若年と老年）、実験の継続期間（
６週間と８〜１２週間）またはホルモン環境の差（例えばＰＴＨ感受性）と関係
しているかも知れない。
に対する卵巣摘出の負の効果を減少させた。ＯＶＸ＋ＧＩＰラットの平均６週間
脊椎ＢＭＤはＯＶＸラットより高かった（０．１４３４ ＝／−０．００１０
ｇｍｓ／ｃｍ２対０．１３８８＋／−０．００４５ ｇｍｓ／ｃｍ２、Ｐ ＝
０．０３８５）。ＧＩＰ処理対照動物は未処理動物より低い骨密度を有したが、
この差は統計的に有意ではなかった。ＧＩＰ処理対照グループでなぜ骨密度の増
加が観察されなかったかは明らかでない。それは不適切なＧＩＰ投与量、注射の
タイミング（一回と多数回）、ラットの年齢（若年と老年）、実験の継続期間（
６週間と８〜１２週間）またはホルモン環境の差（例えばＰＴＨ感受性）と関係
しているかも知れない。
【００９５】 ＧＩＰは「インクレチン」ホルモンであるので、動物を低血糖にする可能性も
ある。血糖を研究中にチェックしたが、ＧＩＰを投与したラットと生理食塩水を
投与したラットの間の血糖値の有意な差は見出されなかった。
ある。血糖を研究中にチェックしたが、ＧＩＰを投与したラットと生理食塩水を
投与したラットの間の血糖値の有意な差は見出されなかった。
【００９６】 さらに、これらの動物がＧＩＰ処理によってインスリン過剰になった場合、体
重が異常に増加し、体重増加そのものが骨密度増加の原因になるということも関
係している。ラットＯＶＸモデルを用いて他の研究者らが報告している様に、こ
れらの動物は体重が増加する傾向にあるが、ＧＩＰ自身は体重に影響しない。ベ
ースライン体重は対照：１７７．８±３．３；対照＋ＧＩＰ：１８０．８±２．
５；ＯＶＸ：１７８．７±４；ＯＶＸ＋ＧＩＰ：１８６．０±２．７（全てグラ
ムで表した体重±ｓｅｍ）。６週間後の実験後の体重は対照：２３７．８±４．
４；対照＋ＧＩＰ：２３４．５±５．５；ＯＶＸ：２９４．７±６．２；ＯＶＸ
＋ＧＩＰ：３０５．１±５．２（全てグラムで表した体重±ｓｅｍ）。
重が異常に増加し、体重増加そのものが骨密度増加の原因になるということも関
係している。ラットＯＶＸモデルを用いて他の研究者らが報告している様に、こ
れらの動物は体重が増加する傾向にあるが、ＧＩＰ自身は体重に影響しない。ベ
ースライン体重は対照：１７７．８±３．３；対照＋ＧＩＰ：１８０．８±２．
５；ＯＶＸ：１７８．７±４；ＯＶＸ＋ＧＩＰ：１８６．０±２．７（全てグラ
ムで表した体重±ｓｅｍ）。６週間後の実験後の体重は対照：２３７．８±４．
４；対照＋ＧＩＰ：２３４．５±５．５；ＯＶＸ：２９４．７±６．２；ＯＶＸ
＋ＧＩＰ：３０５．１±５．２（全てグラムで表した体重±ｓｅｍ）。
【００９７】 図に示すデンシトメトリーの結果は柱骨に対するものである。研究に用いたソ
フトウェアパッケージは末端部の特定の切片の解析を行うことができない（例え
ば近位大腿骨に対する中央大腿骨）。末端部全体のデンシトメトリーは様々な実
験グループ間で差がなかった。
フトウェアパッケージは末端部の特定の切片の解析を行うことができない（例え
ば近位大腿骨に対する中央大腿骨）。末端部全体のデンシトメトリーは様々な実
験グループ間で差がなかった。
【００９８】 ＰＴＨと同様に、ＧＩＰはアデニリルサイクラーゼとホスフォイノシチド特異
性ホスフォリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）信号伝達経路と同時に結合する７個の膜
横断ドメイン受容体のサブクラスである。先の実施例で示された様に、ＧＩＰは
ＳａＯＳ２細胞で細胞質ゾルカルシウム濃度と細胞ｃＡＭＰ含有量の双方を増加
させる。ＧＩＰは投与量に依存して［Ｃａ２＋］ｉの増加を刺激し、有為の増加
は０．１ｎＭ ＧＩＰで生じる。また、１ｎＭ以上の濃度のＧＩＰは細胞ｃＡＭ
Ｐ含有量上昇を有意に刺激することができる。これらの上昇はＧＩＰ濃度１μＭ
で対照の７１０％に達した。これらの生体外の発見に基づき、ＧＩＰが生体内で
も骨に対し同化作用を有すると予想することができる。事実、卵巣摘出ラットで
の研究により、ＧＩＰ投与がこれらの動物で通常見られる骨量の減少を防止する
ことが示されている。成長しつつある若年のラットで期待される様に、全てのラ
ットは骨密度を増加させた。しかしながら、ＯＶＸグループでは骨増加が対照グ
ループよりはるかに少なかった（ｐ ＜ ０．０１）。対照的に、ＧＩＰで処理
したＯＶＸ動物は骨量を維持し、骨密度も統計的に対照と異ならなかった。この
ことから、ＧＩＰを骨多孔症の治療または予防に使用し得ることが明らかである
。
性ホスフォリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）信号伝達経路と同時に結合する７個の膜
横断ドメイン受容体のサブクラスである。先の実施例で示された様に、ＧＩＰは
ＳａＯＳ２細胞で細胞質ゾルカルシウム濃度と細胞ｃＡＭＰ含有量の双方を増加
させる。ＧＩＰは投与量に依存して［Ｃａ２＋］ｉの増加を刺激し、有為の増加
は０．１ｎＭ ＧＩＰで生じる。また、１ｎＭ以上の濃度のＧＩＰは細胞ｃＡＭ
Ｐ含有量上昇を有意に刺激することができる。これらの上昇はＧＩＰ濃度１μＭ
で対照の７１０％に達した。これらの生体外の発見に基づき、ＧＩＰが生体内で
も骨に対し同化作用を有すると予想することができる。事実、卵巣摘出ラットで
の研究により、ＧＩＰ投与がこれらの動物で通常見られる骨量の減少を防止する
ことが示されている。成長しつつある若年のラットで期待される様に、全てのラ
ットは骨密度を増加させた。しかしながら、ＯＶＸグループでは骨増加が対照グ
ループよりはるかに少なかった（ｐ ＜ ０．０１）。対照的に、ＧＩＰで処理
したＯＶＸ動物は骨量を維持し、骨密度も統計的に対照と異ならなかった。この
ことから、ＧＩＰを骨多孔症の治療または予防に使用し得ることが明らかである
。
【００９９】 実施例８： 遺伝子形質移入マウス ＧＩＰ発現構成体 ＧＩＰ受容体を高投与量のペプチドホルモンで下方制御できるというデータに
基づき、制御可能なプロモーターを含む構成体が設計された。マウスメタロチオ
ネンプロモーターに関連した制御エレメントはＤｒ． Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐａｌ
ｍｉｔｅｒの研究室で十分に特徴付けされた。ＧＩＰペプチドそのものは厳密な
制御下にあり、分泌は十二指腸Ｋ細胞と唾液腺のみで生じると報告され、また十
分に加工されないプロペプチドは内因性ＧＩＰの正常な機能と拮抗し得る循環ペ
プチドを生じる可能性があるので、２つの発現構成体を設計した。最初のものは
完全長プレプロペプチドを含み、第二のものは加工を必要としない成熟ペプチド
を分泌する。従って、前者の構成体は完全腸ＧＩＰ ｃＤＮＡ（ｐｒｅｐｒｏＧ
ＩＰ）を構成する様に設計され、後者は成熟ＧＩＰペプチド（ｐｒｅＭＧＩＰ）
に付加えられたＧＩＰ信号配列をコードする様に遺伝子操作された。これらの構
成体が確立された細胞株中で生物学的に活性なＧＩＰを生産する能力を有するこ
とを試験するため、サイトメガロウイルスプロモータおよびウシ成長ホルモンポ
リアデニル化部位を含むｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３中に導入した。
基づき、制御可能なプロモーターを含む構成体が設計された。マウスメタロチオ
ネンプロモーターに関連した制御エレメントはＤｒ． Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐａｌ
ｍｉｔｅｒの研究室で十分に特徴付けされた。ＧＩＰペプチドそのものは厳密な
制御下にあり、分泌は十二指腸Ｋ細胞と唾液腺のみで生じると報告され、また十
分に加工されないプロペプチドは内因性ＧＩＰの正常な機能と拮抗し得る循環ペ
プチドを生じる可能性があるので、２つの発現構成体を設計した。最初のものは
完全長プレプロペプチドを含み、第二のものは加工を必要としない成熟ペプチド
を分泌する。従って、前者の構成体は完全腸ＧＩＰ ｃＤＮＡ（ｐｒｅｐｒｏＧ
ＩＰ）を構成する様に設計され、後者は成熟ＧＩＰペプチド（ｐｒｅＭＧＩＰ）
に付加えられたＧＩＰ信号配列をコードする様に遺伝子操作された。これらの構
成体が確立された細胞株中で生物学的に活性なＧＩＰを生産する能力を有するこ
とを試験するため、サイトメガロウイルスプロモータおよびウシ成長ホルモンポ
リアデニル化部位を含むｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３中に導入した。
【０１００】 これらの構成体の概要を図７に示す。図に示す様に、両者のＧＩＰ ｃＤＮＡ
がベクターｐｃＤＮＡ３中の転写制御エレメントを経由して発現している。ｐｒ
ｅｐｒｏＧＩＰは内因性マウスＧＩＰ ｍＲＮＡの全コード配列を含むが、ｐｒ
ｅＭＧＩＰはＮ−およびＣ−末端プロペプチド配列が欠失する様に遺伝子操作さ
れている。
がベクターｐｃＤＮＡ３中の転写制御エレメントを経由して発現している。ｐｒ
ｅｐｒｏＧＩＰは内因性マウスＧＩＰ ｍＲＮＡの全コード配列を含むが、ｐｒ
ｅＭＧＩＰはＮ−およびＣ−末端プロペプチド配列が欠失する様に遺伝子操作さ
れている。
【０１０１】 培養細胞へのＧＩＰ構成体の形質移入 これらの２つの構成体の有効性を評価するため、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を
リポソーム仲介形質移入法（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
で形質転換した。培地に分泌された免疫活性ＧＩＰを放射線免疫分析法で形質移
入後１日および／または２日に測定した。分泌効率を評価するため、２日めに細
胞の内容物を凍結−溶解細胞溶解法で放出し、続いて上澄みを取り出し、ＧＩＰ
の免疫反応性を評価した。ウエル当りのＧＩＰレベルが図８に示される。
リポソーム仲介形質移入法（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
で形質転換した。培地に分泌された免疫活性ＧＩＰを放射線免疫分析法で形質移
入後１日および／または２日に測定した。分泌効率を評価するため、２日めに細
胞の内容物を凍結−溶解細胞溶解法で放出し、続いて上澄みを取り出し、ＧＩＰ
の免疫反応性を評価した。ウエル当りのＧＩＰレベルが図８に示される。
【０１０２】 これらの構成体は免疫的に検出し得るＧＩＰを明らかに生産していた。生物活
性を評価するため、馴化培地をＳａＯＳ２細胞に加え、ＧＩＰにより刺激される
ことが分かっている２つのセカンドメッセンジャー：カルシウムおよびｃＡＭＰ
の上昇に対する効果を測定した。結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。
性を評価するため、馴化培地をＳａＯＳ２細胞に加え、ＧＩＰにより刺激される
ことが分かっている２つのセカンドメッセンジャー：カルシウムおよびｃＡＭＰ
の上昇に対する効果を測定した。結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。
【０１０３】 ＧＩＰを過剰発現する形質移入マウスの生産 上記の形質移入実験に基づき、完全長ｃＤＮＡ（ｐｒｅｐｒｏＧＩＰ）を用い
てＧＩＰ過剰発現形質移入マウスを製造するためのベクターを設計した。５００
ｂｐマウスＧＩＰ ｃＤＮＡをベクター２９９９の固有ＮｒｕＩ部位中に挿入し
た。ベクター２９９９は導入ｃＤＮＡの近位マウスメタロチオネンＩプロモータ
ー上流とヒト成長ホルモンポリアデニル化信号下流を含む。転写が確実に制御さ
れていることを確認するため、このミニ遺伝子はゲノムメタロチオネン遺伝子座
由来の５’および３’制御配列の１７ｋｂで隔離されている。遺伝子形質導入構
成体をフランクＳａｌＩ部位でプラスミドベクターから切除することができる。
ＤＮＡを胚芽前核中へミクロインジェクションし、続いて偽妊娠雌経移植する標
準法を用いてマウスを製造した。
てＧＩＰ過剰発現形質移入マウスを製造するためのベクターを設計した。５００
ｂｐマウスＧＩＰ ｃＤＮＡをベクター２９９９の固有ＮｒｕＩ部位中に挿入し
た。ベクター２９９９は導入ｃＤＮＡの近位マウスメタロチオネンＩプロモータ
ー上流とヒト成長ホルモンポリアデニル化信号下流を含む。転写が確実に制御さ
れていることを確認するため、このミニ遺伝子はゲノムメタロチオネン遺伝子座
由来の５’および３’制御配列の１７ｋｂで隔離されている。遺伝子形質導入構
成体をフランクＳａｌＩ部位でプラスミドベクターから切除することができる。
ＤＮＡを胚芽前核中へミクロインジェクションし、続いて偽妊娠雌経移植する標
準法を用いてマウスを製造した。
【０１０４】 遺伝子形質移入マウスのコロニーを確立した。コピー数が１０倍に増加した遺
伝子形質移入マウスを選び、ＧＩＰレベルを測定した（図１０）。これらの遺伝
子形質移入マウスに関わる主な問題は、高ＧＩＰレベルがインスリン放出を刺激
し、これらの動物を低血糖症にし体重を増加させるかかどうかということである
。しかしながら、これらの動物では体重に差はなかった（図１１Ｂ）。それにも
かかわらず、重金属で刺激する前でも遺伝子形質移入マウスは脊椎骨の無機物含
有量が有意に増加していた（図１１Ａ）。これらの結果は、ＧＩＰを骨密度を増
加または維持するために使用し得ることを明らかに示すものである。
伝子形質移入マウスを選び、ＧＩＰレベルを測定した（図１０）。これらの遺伝
子形質移入マウスに関わる主な問題は、高ＧＩＰレベルがインスリン放出を刺激
し、これらの動物を低血糖症にし体重を増加させるかかどうかということである
。しかしながら、これらの動物では体重に差はなかった（図１１Ｂ）。それにも
かかわらず、重金属で刺激する前でも遺伝子形質移入マウスは脊椎骨の無機物含
有量が有意に増加していた（図１１Ａ）。これらの結果は、ＧＩＰを骨密度を増
加または維持するために使用し得ることを明らかに示すものである。
【０１０５】 本明細書に記載された方法と材料の変更は当業者に自明であり、クレームに含
まれるものである。本明細書に引用した参考文献の内容は、特に本明細書にも採
用される。
まれるものである。本明細書に引用した参考文献の内容は、特に本明細書にも採
用される。
【図１】 図１Ａおよび１ＢはＧＩＰ（０．１ｎＭ〜１マイクロモルＧＩＰ）の細胞質カ
ルシウム濃度（ｎＭ；図１Ａ）および細胞ｃＡＭＰ濃度（ｐｇ／ｍｌ；図１Ｂ）
に対する効果のグラフである。図１Ａは、ＧＩＰがＳａＯｓ２細胞中で投与量に
依存して［Ｃａ２＋］ｉとｃＡＭＰを増加させることを示している。ＳａＯＳ２
細胞をカバーガラス上で生育させ、蛍光カルシウム感受性プローブｆｕｒａ−２
で負荷をかけ、ＧＩＰ投与量を増加させつつ刺激した。４回の異なった実験から
細胞内カルシウムのピークの増加を計算した。データは平均値±ＳＥＭ（＊＝ｐ
＜０．０１；＊＊＝ｐ＜０．００１）で表される。図１ＢはＳａＯＳ２細胞を６
穴プレート上で生育し、ホスフォジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸと予備インキュ
ベーション（０．５ｍＭ、１０分間）し、ＧＩＰの投与量を増加させて刺激（１
０分間）した場合の結果を示す。細胞ｃＡＭＰを市販の放射線免疫分析（Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）で測
定した。データは平均値±ＳＥＭ（＊＊＝ｐ＜０．００１）で表した。
ルシウム濃度（ｎＭ；図１Ａ）および細胞ｃＡＭＰ濃度（ｐｇ／ｍｌ；図１Ｂ）
に対する効果のグラフである。図１Ａは、ＧＩＰがＳａＯｓ２細胞中で投与量に
依存して［Ｃａ２＋］ｉとｃＡＭＰを増加させることを示している。ＳａＯＳ２
細胞をカバーガラス上で生育させ、蛍光カルシウム感受性プローブｆｕｒａ−２
で負荷をかけ、ＧＩＰ投与量を増加させつつ刺激した。４回の異なった実験から
細胞内カルシウムのピークの増加を計算した。データは平均値±ＳＥＭ（＊＝ｐ
＜０．０１；＊＊＝ｐ＜０．００１）で表される。図１ＢはＳａＯＳ２細胞を６
穴プレート上で生育し、ホスフォジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸと予備インキュ
ベーション（０．５ｍＭ、１０分間）し、ＧＩＰの投与量を増加させて刺激（１
０分間）した場合の結果を示す。細胞ｃＡＭＰを市販の放射線免疫分析（Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）で測
定した。データは平均値±ＳＥＭ（＊＊＝ｐ＜０．００１）で表した。
【図２】 図２Ａおよび２ＢはＧＩＰ（０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ
）の、培養骨芽様細胞におけるコラーゲン合成に対する効果のグラフである。Ｓ
ａＯｓ２細胞をＴ７５フラスコ中で生育し、示された投与量のＧＩＰで２４時間
刺激した（培地を８時間ごとにＧＩＰを含む新鮮な培地で置換した）。２４時間
後、全ＲＮＡを抽出し、Ｉ型コラーゲン特異性プローブで標識した。次いでオー
トラジオグラフを走査し、Ｂｉｏｉｍａｇｅソフトウェアを用いてＳｕｎ Ｓｐ
ａｒｃステーション上で光学濃度を定量した（ｎ＝４、＊＝ｐ＜ ０．００１）
。コラーゲンの光学濃度をＧＡＰＤＨに対して正規化し、図２ＡにＧＩＰ濃度の
関数として示される。図２ＢはＳａＯＳ２細胞をＴ７５中で上記の通り生育し、
１ｎＭ ＧＩＰで図示した様々な時点（０、３、６、９および１２時間）で刺激
し、ノーザーン分析を行った結果を示すグラフである。４回の異なった実験の光
学濃度測定をまとめ、時間の関数として図２Ａに対照に対する棒グラフ（＊ ＝
ｐ ＜ ０．００１）で表す。
）の、培養骨芽様細胞におけるコラーゲン合成に対する効果のグラフである。Ｓ
ａＯｓ２細胞をＴ７５フラスコ中で生育し、示された投与量のＧＩＰで２４時間
刺激した（培地を８時間ごとにＧＩＰを含む新鮮な培地で置換した）。２４時間
後、全ＲＮＡを抽出し、Ｉ型コラーゲン特異性プローブで標識した。次いでオー
トラジオグラフを走査し、Ｂｉｏｉｍａｇｅソフトウェアを用いてＳｕｎ Ｓｐ
ａｒｃステーション上で光学濃度を定量した（ｎ＝４、＊＝ｐ＜ ０．００１）
。コラーゲンの光学濃度をＧＡＰＤＨに対して正規化し、図２ＡにＧＩＰ濃度の
関数として示される。図２ＢはＳａＯＳ２細胞をＴ７５中で上記の通り生育し、
１ｎＭ ＧＩＰで図示した様々な時点（０、３、６、９および１２時間）で刺激
し、ノーザーン分析を行った結果を示すグラフである。４回の異なった実験の光
学濃度測定をまとめ、時間の関数として図２Ａに対照に対する棒グラフ（＊ ＝
ｐ ＜ ０．００１）で表す。
【図３】 ＭＧ−６３細胞アルカリホスファターゼ活性に対するＧＩＰの効果のグラフで
ある。細胞を６穴プレート上で密集生育し、０．１ｎＭ ＧＩＰで図示された時
間（１、２、３または６日間）刺激し、反応を停止しアルカリホスファターゼ活
性を市販のキットで測定した。ＡＬＰに対するＧＩＰの効果は、陽性の対照とし
て用いた１，２５ビタミンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ
）で観測された効果より大きかった。４回の異なった実験それぞれの３回の平均
値±ＳＥＭ（＊＝ｐ＜０．０５；＋＝ｐ＜０．００１）を示す。
ある。細胞を６穴プレート上で密集生育し、０．１ｎＭ ＧＩＰで図示された時
間（１、２、３または６日間）刺激し、反応を停止しアルカリホスファターゼ活
性を市販のキットで測定した。ＡＬＰに対するＧＩＰの効果は、陽性の対照とし
て用いた１，２５ビタミンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ
）で観測された効果より大きかった。４回の異なった実験それぞれの３回の平均
値±ＳＥＭ（＊＝ｐ＜０．０５；＋＝ｐ＜０．００１）を示す。
【図４】 １０ｎＭ ＧＩＰ、１０ｎＭ ＰＴＨおよび３種の濃度（５ｎＭ、１０ｎＭお
よび５０ｎＭ）のＰＴＨとＧＩＰの組み合せに暴露した培養骨細胞における、骨
再吸収（放出４５Ｃａ２＋、対照に対する倍数）のグラフである。
よび５０ｎＭ）のＰＴＨとＧＩＰの組み合せに暴露した培養骨細胞における、骨
再吸収（放出４５Ｃａ２＋、対照に対する倍数）のグラフである。
【図５】 卵巣摘出処女ラットにおける６週間のＧＩＰ処理後の骨髄骨密度の割合の変化
のグラフである。
のグラフである。
【図６】 ＧＩＰ受容体の概念図であり、ＧＩＰ受容体活性をブロックする抗体を産生す
る領域を円で囲っている。
る領域を円で囲っている。
【図７】 ＧＩＰ発現構成体の概念図である。二つのＧＩＰ ｃＤＮＡがベクターｐｃＤ
ＮＡ３中の転写制御要素を経由して発現する。ｐｒｅｐｒｏＧＩＰには内因性マ
ウスＧＩＰ ｍＲＮＡの全コード配列が含まれるが、ｐｒｅＭＧＩＰには遺伝子
操作によりＮ−およびＣ−末端ペプチド配列が欠失している。
ＮＡ３中の転写制御要素を経由して発現する。ｐｒｅｐｒｏＧＩＰには内因性マ
ウスＧＩＰ ｍＲＮＡの全コード配列が含まれるが、ｐｒｅＭＧＩＰには遺伝子
操作によりＮ−およびＣ−末端ペプチド配列が欠失している。
【図８】 形質移入線維芽細胞におけるＧＩＰ分泌（ｎｇ／穴）のグラフである。ＮＩＨ
−３Ｔ３線維芽細胞を、リポフェクタミンを用いて図７に示す構成体で形質移入
し、対照としてｐＥＧＦＰで形質移入した。細胞を密集生育し、馴化培地を集め
、市販の放射線免疫分析を用いてＧＩＰを測定した。ＧＩＰが分泌されない場合
もあるので、採集し溶菌した細胞内の細胞内容物も測定した。３回の異なった測
定の平均値±ＳＥＭを示す。
−３Ｔ３線維芽細胞を、リポフェクタミンを用いて図７に示す構成体で形質移入
し、対照としてｐＥＧＦＰで形質移入した。細胞を密集生育し、馴化培地を集め
、市販の放射線免疫分析を用いてＧＩＰを測定した。ＧＩＰが分泌されない場合
もあるので、採集し溶菌した細胞内の細胞内容物も測定した。３回の異なった測
定の平均値±ＳＥＭを示す。
【図９】 図９Ａと９Ｂは、ＧＩＰ構成体の形質移入により生物活性ＧＩＰが産生される
ことを示すグラフである。線維芽細胞馴化培地は、ＳａＯｓ２細胞で細胞内カル
シウム（図９Ａ、細胞質ゾルカルシウム増加率％／基準量）および細胞ｃＡＭＰ
含有量（図９Ｂ、細胞ｃＡＭＰ含有量、増加率％／基準量）の双方を増加させる
。１００μｌの線維芽細胞馴化培地をＳａＯｓ２細胞に加え、Ｆｕｒａ−２を用
いて細胞内カルシウムを測定した。細胞質ゾルカルシウムに対する負の対照とし
てＥＦＧＰを用いた。ｃＡＭＰに対する陽性の対照として１０μＭのフォルスコ
リンを用いた。各条件に対し、３回の測定の平均値±ＳＥＭを示す。
ことを示すグラフである。線維芽細胞馴化培地は、ＳａＯｓ２細胞で細胞内カル
シウム（図９Ａ、細胞質ゾルカルシウム増加率％／基準量）および細胞ｃＡＭＰ
含有量（図９Ｂ、細胞ｃＡＭＰ含有量、増加率％／基準量）の双方を増加させる
。１００μｌの線維芽細胞馴化培地をＳａＯｓ２細胞に加え、Ｆｕｒａ−２を用
いて細胞内カルシウムを測定した。細胞質ゾルカルシウムに対する負の対照とし
てＥＦＧＰを用いた。ｃＡＭＰに対する陽性の対照として１０μＭのフォルスコ
リンを用いた。各条件に対し、３回の測定の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１０】 遺伝子導入マウスと非遺伝子導入マウスにおける血清ＧＩＰレベルのグラフで
ある。約５０μｌの血液を眼球採血で遺伝子導入マウス（Ｔｇ）と非遺伝子導入
マウス（ＮｏｎＴＧ）それぞれの同腹仔から採集した。ＧＩＰを市販放射性免疫
分析試薬（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ ＣＡ）を用いて測定した。遺伝子導入マウスの基礎ＧＩＰレベルは、重金属
を与える前は非遺伝子導入マウスより約２倍高い。
ある。約５０μｌの血液を眼球採血で遺伝子導入マウス（Ｔｇ）と非遺伝子導入
マウス（ＮｏｎＴＧ）それぞれの同腹仔から採集した。ＧＩＰを市販放射性免疫
分析試薬（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ ＣＡ）を用いて測定した。遺伝子導入マウスの基礎ＧＩＰレベルは、重金属
を与える前は非遺伝子導入マウスより約２倍高い。
【図１１】 図１１Ａおよび１１Ｂは遺伝子導入ＧＩＰ過剰発現マウスの体重（図１１Ｂ、
グラム）と骨無機質密度（図１１Ａ、面積ｃｍ２）のグラフである。
グラム）と骨無機質密度（図１１Ａ、面積ｃｍ２）のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 ＺＮＡ 16/18 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/26 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (71)出願人 1120 Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ Ｓｔｒｅｅ ｔ，Ａｕｇｕｓｔａ，ＧＡ 30912−4810 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 イサレス，カルロス，エム． アメリカ合衆国 ジョージア州 30909 オーガスタ ウッドストーン プレイス 3413 (72)発明者 ボラッグ，ロニ， ジェイ． アメリカ合衆国 ジョージア州 30907 マーティンツ ウォーターヴェイル ロー ド 231 (72)発明者 ラスムッセン，ハワード アメリカ合衆国 ジョージア州 30909 オーガスタ バセット レーン 820 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 GA11 4C084 AA02 BA19 MA52 NA12 NA14 ZA96 ZA97 4C085 AA13 AA14 GG08 4H045 AA11 AA30 BA10 DA38 EA28 FA74
Claims (19)
- 【請求項１】 その必要のある患者に有効量のＧＩＰまたは機能的に等価な
その類似体を薬学的に許容し得るキャリア中で投与することを特徴とする、骨密
度または骨生成を維持または増加させる方法。 - 【請求項２】 ＧＩＰまたはその断片が投与されることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 経口投与のためＧＩＰまたはその類似体が薬学的に許容し得
るキャリア中に含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ＧＩＰまたはその類似体が制御放出または持続放出調合物中
に含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ受容体に結合するＧＩＰに対する抗イ
ディオタイプ抗体またはその断片であることを特徴とする請求項１に記載の方法
。 - 【請求項６】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ受容体に結合して細胞信号伝達経路を
活性化する抗体、またはその断片であることを特徴とする請求項１に記載の方法
。 - 【請求項７】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ発現を促進することを特徴とする請求
項１に記載の方法。 - 【請求項８】 ＧＩＰまたはその類似体を骨多孔症に罹患した、又はその危
険のある患者に投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 遺伝形質が移入されたヒト以外の哺乳動物の過剰発現ＧＩＰ
。 - 【請求項１０】 患者にその必要によりＧＩＰ受容体に対する有効量のＧＩ
Ｐ結合阻害剤を投与することを特徴とする骨密度を減少させる方法。 - 【請求項１１】 薬学的に許容し得るキャリア中の、有効投与量のＧＩＰま
たは機能的に等価なその類似体でなり、骨形成を促進することを特徴とする骨密
度または骨形成を維持または増加させる組成物。 - 【請求項１２】 ＧＩＰを包含することを特徴とする請求項１１に記載の組
成物。 - 【請求項１３】 ＧＩＰの断片を包含することを特徴とする請求項１１に記
載の組成物。 - 【請求項１４】 ＧＩＰ断片が修飾されて投与後の半減期が増加することを
特徴とする請求項１２に記載の組成物。 - 【請求項１５】 経口投与のため、ＧＩＰまたはその類似体が薬学的に許容
し得るキャリア中に含まれることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。 - 【請求項１６】 ＧＩＰまたはその類似体が制御または持続放出調合物中に
含まれることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。 - 【請求項１７】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ受容体に結合する、ＧＩＰに対する
抗イディオタイプ抗体またはその断片であることを特徴とする請求項１１に記載
の組成物。 - 【請求項１８】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ受容体に結合し細胞信号伝達経路を
活性化する、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項１１に記載の組
成物。 - 【請求項１９】 ＧＩＰ類似体がＧＩＰ発現を促進することを特徴とする請
求項１１に記載の組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10333398P | 1998-10-07 | 1998-10-07 | |
| US60/103,333 | 1998-10-07 | ||
| US10349598P | 1998-10-08 | 1998-10-08 | |
| US60/103,495 | 1998-10-08 | ||
| PCT/US1999/023365 WO2000020592A1 (en) | 1998-10-07 | 1999-10-07 | Glucose-dependent insulinotropic peptide for use as an osteotropic hormone |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002526554A true JP2002526554A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=26800341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000574687A Pending JP2002526554A (ja) | 1998-10-07 | 1999-10-07 | 骨親和性ホルモンとして用いられるグルコース依存性インスリン親和性ペプチド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6410508B1 (ja) |
| EP (1) | EP1119625B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002526554A (ja) |
| AU (1) | AU6294899A (ja) |
| DE (1) | DE69926007T2 (ja) |
| WO (1) | WO2000020592A1 (ja) |
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