CN101421618B - 使用gpr119受体鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用GPR119受体鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法。GPR119受体的促效剂可用作用于治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)与用于增加个体骨质量的治疗剂。GPR119受体的促效剂促进个体骨形成。

Description

使用GPR119受体鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法
技术领域
本发明涉及使用GPR119受体鉴定可用于增加个体骨质量(bone mass)的化合物的方法。GPR119受体的促效剂可用作用于治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)与用于增加个体骨质量的治疗剂。GPR119受体的促效剂促进个体骨形成。
背景技术
以下论述旨在有利于理解本发明，但其并不意欲或被认可为本发明的先前技术。
A.骨质疏松症
骨质疏松症是特征为骨质量流失和骨架结构的微结构退化以致骨强度降低的致残疾病，其易使患者脆性骨折的风险增加。骨质疏松症在欧洲、日本和美国侵害超过75,000,000人，且致使仅欧洲和美国就有超过2,300,000例骨折。在美国，骨质疏松症侵害所有绝经后的白人女性中的至少25％，且在80岁以上的女性中比例升至70％。三分之一的50岁以上女性会患有骨质疏松性骨折，其在社会上造成相当大的社会和财政负担。所述疾病并不限于女性；年长男性也可能受到侵害。到2050年为止，预测男性髋部骨折的全球发生率增加310％，且女性增加240％。临床上呈现的髋部、前臂和脊椎骨折的组合寿命风险为约40％，相当于心血管疾病的风险。因此，骨质疏松性骨折引起相当大的死亡率、发病率和经济花费。除非研发有效预防策略，否则随着人口老龄化，骨质疏松性骨折的数量及其花费在下一个50年中将至少加倍。(参见例如阿替可(Atik)等人，临床矫形学及相关学科研究(Clin Orthop Relat Res)(2006)443：19-24；雷兹(Raisz)，临床检查杂志(J Clin Invest)(2005)115：3318-3325；和世界卫生组织技术报告丛书(WorldHealth Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis)。)
B.葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)
葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP，也称作抑胃多肽)是在摄取膳食后自十二指肠内分泌K细胞释放的42个氨基酸的肠肽激素(peptide incretin hormone)。所释放的GIP的量主要视所消耗的葡萄糖的量而定。已显示GIP刺激胰腺β细胞中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。GIP经由特异性G蛋白偶合受体(即GIPR)介导其作用。
由于GIP在2位处含有丙氨酸，因此其为二肽基肽酶-4(DPP-IV)(一种调节GIP降解的酶)的极佳底物。全长GIP(1-42)在自肠道K细胞分泌的数分钟内快速转化成生物非活性的GIP(3-42)。已显示抑制DPP-IV增强GIP生物活性。(参见例如德鲁克(Drucker)，细胞代谢(Cell Metab)(2006)3：153-165；麦金托虚(McIntosh)等人，正规肽(Regul Pept)(2005)128：159-165；迪肯(Deacon)，正规肽(Regul Pept)(2005)128：117-124；和阿伦斯(Ahren)等人，内分泌学(Endocrinology)(2005)146：2055-2059。)分析例如血液中的全长生物活性GIP可使用N末端特异性检验来进行(参见例如迪肯(Deacon)等人，临床内分泌学与新陈代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)(2000)85：3575-3581)。
最近，已显示GIP会促进骨形成。已显示GIP活化成骨细胞受体，使得与骨形成均相关的I型胶原蛋白合成及碱性磷酸酶活性增加。已显示GIP在活体外会抑制破骨细胞活性和分化。已显示投与GIP会预防因卵巢切除所引起的骨质流失。GIP受体(GIPR)基因剔除小鼠证明尤其在骨形成中骨尺寸减小，骨质量降低，骨微结构和生物化学特性改变，和骨转换的参数改变。(参见例如钟(Zhong)等人，美国生理学会杂志：内分泌学与新陈代谢(Am J Physiol Endocrinol Metab)(2007)292：E543-E548；波拉格(Bollag)等人，内分泌学(Endocrinology)(2000)141：1228-1235；波拉格(Bollag)等人，分子与细胞内分泌学(Mol Cell Endocrinol)(2001)177：35-41；谢(Xie)等人，骨(Bone)(2005)37：759-769；和筑山(Tsukiyama)等人，分子内分泌学(Mol Endocrinol)(2006)20：1644-1651。)
GIP用于维持或增加骨密度或骨形成的效用已由美国商标与专利局(United StateTrademark and Patent Office)通过颁布美国专利第6,410,508号而认可，所述专利是通过投与GIP肽来治疗骨矿化减少。然而，当前GIP肽促效剂遭受口服生物可用性的不足，其负面影响了患者顺应性。具吸引力的替代方法为开发用于增加GIP活性的内源性水平的口服活性组合物。
C.GPR119
GPR119是G蛋白偶合受体(GPR119；例如
Figure G2007800127142D00021
保存编号AAP72125的人类GPR119及其等位基因；例如保存编号AY288423的小鼠GPR119及其等位基因)。如由促效剂活化GPR119使细胞内cAMP含量升高，其与GPR119与Gs偶合一致。在专利文献中，GPR119已被称作RUP3(例如WO 00/31258)；GPR119也还被称作葡萄糖依赖性促胰岛素受体(GDIR)。
D.G蛋白偶合受体
尽管许多受体种类存在于人类中，但到目前为止，由G蛋白偶合受体(GPCR)种类表示最丰富且与治疗相关的种类。据估计在人类基因组内存在大约30,000-40,000个基因，且据估计在此等基因中约2％编码GPCR。
GPCR代表开发医药产品的重要领域。对GPCR有活性的药物在各种人类疾病中具有治疗效益，所述疾病如同疼痛、认知功能障碍、高血压、消化性溃疡、鼻炎和哮喘般多样化。在约500种临床上市药物中，30％以上为GPCR功能的调节剂。此等药物对约30种经充分鉴定的GPCR发挥其活性。(参见例如韦斯(Wise)等人，药理学与毒理学年评(Annu Rev Pharmacol Toxico1)(2004)44：43-66。)
GPCR共用一共同结构基元，所述结构基元具有七个形成七个α螺旋的介于22个至24个疏水性氨基酸之间的序列，所述序列中的每一者皆跨膜(每一跨越由数字鉴定，即跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。跨膜螺旋由细胞膜的外部或“细胞外”侧(此等分别被称作“细胞外”区域1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))的跨膜-2与跨膜-3、跨膜-4与跨膜-5和跨膜-6与跨膜-7之间的氨基酸股连接。跨膜螺旋也由细胞膜的内部或“细胞内”侧(此等分别被称作“细胞内”区域1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))的跨膜-1与跨膜-2、跨膜-3与跨膜-4和跨膜-5与跨膜-6之间的氨基酸股连接。受体的“羧基”(“C”)末端处于细胞内的细胞内空间中，且受体的“氨基”(“N”)末端处于细胞外的细胞外空间中。
一般来说，当配体与受体结合(通常称作受体的“活化”)时，在受体构形中存在有利于细胞内区域与细胞外“G蛋白”之间的偶合的变化。已报导GPCR对于G蛋白为“混杂的”，即GPCR可与一种以上G蛋白相互作用。参见肯内金(Kenakin)，生命科学(LifeSciences)(1988)43：1095-1101。尽管存在其他G蛋白，但目前Gq、Gs、Gi、Gz和Go为已经鉴定的G蛋白。与G蛋白偶合的经配体活化的GPCR引发信号级联过程(称作“信号转导”)。在正常条件下，信号转导最终导致细胞活化或细胞抑制。尽管并不希望受理论束缚，但应了解，IC-3环以及受体的羧基末端与G蛋白相互作用。
也存在表现为使若干种类的GPCR与磷脂酶C路径偶合的混杂G蛋白(诸如G15或G16)(奥弗曼斯(Offermanns)和西蒙(Simon)，生物化学杂志(J Biol Chem)(1995)270：15175-80)，或经设计以使大量不同GPCR与同一路径(例如磷脂酶C)偶合的嵌合G蛋白(米利甘(Milligan)和利斯(Rees)，药物科学进展(Trends in PharmaceuticalSciences)(1999)20：118-24)。
在生理条件下，GPCR以如下两种不同构形之间的平衡状态存在于细胞膜中：“非活性”状态及“活性”状态。处于非活性状态的受体不能与细胞内信号转导路径连接以引发产生生物回应的信号转导。受体构形变成活性状态使得(经由G蛋白)与转导路径连接且产生生物回应。
处于活性状态的受体可由配体或化合物(诸如药物)实现稳定。新近发现(包括(但不排外地限于)对受体的氨基酸序列的修饰)提供除配体或药物以外的方式以促进且稳定处于活性状态构形的受体。此等方式通过刺激与受体结合的配体的作用来有效稳定处于活性状态的受体。由所述配体非依赖性方式实现的稳定被称作“组成性受体活化”。
发明内容
本发明涉及申请者的意想不到的发现，所述发现是将GPR119促效剂投予个体(诸如通过经口投予)可对GPR119受体起作用以增加个体的GIP含量。本发明涉及与鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)的化合物及可用于增加个体骨质量的化合物的GPR119相关的方法。GPR119促效剂可用于促进(例如增加)个体骨形成。在某些实施例中，所述个体为人类。
编码人类GPR119多肽的核苷酸序列是以SEQ ID NO：1给出。所述经编码的人类GPR119多肽的氨基酸序列是以SEQ ID NO：2给出。
在第一方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使测试化合物与包含G蛋白偶合受体的宿主细胞或与宿主细胞的膜接触，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为G蛋白偶合受体不包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(v)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(vi)SEQ ID NO：2的变异体；
(vii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；和
(b)确定测试化合物刺激G蛋白偶合受体功能的能力；
其中测试化合物刺激G蛋白偶合受体功能的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因(ortholog)。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，方法为鉴定GIP促分泌素的方法。
在某些实施例中，方法包含鉴定受体的促效剂。
在某些实施例中，方法包含鉴定受体的部分促效剂。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物的方法。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)使在步骤(b)中刺激受体功能的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触；和
(e)确定化合物是否刺激自脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)将在步骤(b)中刺激受体功能的化合物投予给脊椎动物；和
(e)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)将在步骤(b)中刺激受体功能的化合物投予给脊椎动物；和
(e)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，所述确定包含测量脊椎动物的骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用双能X射线吸收测定法(DXA)测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量(T-score)。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World HealthOrganization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention andManagement of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)视情况提供在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(e)使在步骤(b)中刺激受体功能的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触；和
(f)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)视情况提供在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(e)将在步骤(b)中刺激受体功能的化合物投予给脊椎动物；和
(f)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第一方面的步骤(a)和(b)，且进一步包含以下步骤：
(c)视情况合成在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(d)视情况提供在步骤(b)中刺激受体功能的化合物；
(e)将在步骤(b)中刺激受体功能的化合物投予给脊椎动物；和
(f)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，所述确定包含测量个体骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用DXA测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis))。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在某些实施例中，经鉴定的GIP促分泌素或可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的经鉴定的化合物或可用于增加个体骨质量的经鉴定的化合物为受体的促效剂。在一些实施例中，所述促效剂为部分促效剂。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体与G蛋白偶合。在某些实施例中，活化G蛋白偶合受体增加细胞内cAMP的含量。在某些实施例中，G蛋白为Gs。
在某些实施例中，人类DNA样品为人类基因组DNA。
在一些实施例中，聚合酶链反应为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR技术为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中，人类DNA样品为人类cDNA。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类组织。在一些实施例中，表达GPR119的人类组织为胰腺或胰岛。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类细胞类型。在一些实施例中，cDNA来自胰腺β细胞。在一些实施例中，cDNA来自胰腺细胞株。
在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，严格杂交条件包含在42℃下在包含50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中杂交，接着在65℃下在包含0.l×SSC的溶液中洗涤。杂交技术为所属领域的技术人员所熟知。
在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，G蛋白偶合受体为包含G蛋白的融合蛋白的部分。用于制造GPCR:G融合构筑体的技术为所属领域的技术人员所熟知(参见例如国际申请案WO 02/42461)。
在某些实施例中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码G蛋白偶合受体的聚核苷酸。在一些实施例中，表达载体为pCMV。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure)的条款，此载体在1998年10月13日保存于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209USA)。由ATCC测试DNA且确定其具有活力。ATCC已向pCMV指定以下保存编号：ATCC#203351。其他合适的表达载体对所属领域的技术人员显而易见，且多种表达载体可购得(例如，来自Clontech，Palo Alto，CA；Stratagene，La Jolla，CA；和Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在一些实施例中，宿主细胞为脊椎动物细胞。在一些实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，哺乳动物宿主细胞是选自由293细胞、293T细胞、CHO细胞、MCB3901细胞和COS-7细胞组成的群组。在一些实施例中，宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，宿主细胞为黑色素细胞。其他合适的宿主细胞对所属领域的技术人员显而易见，且多种细胞株可购自美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)。
在某些实施例中，所述确定与G蛋白偶合受体为Gs偶合受体一致。
在一些实施例中，所述确定与G蛋白偶合受体经由混杂G蛋白(诸如Gα15或Gα16)与磷脂酶C路径偶合一致。混杂G蛋白为所属领域的技术人员所熟知(参见例如奥弗曼斯(Offermanns)等人，生物化学杂志(J Biol Chem)(1995)270：15175-15180)。在一些实施例中，所述确定与G蛋白偶合受体经由嵌合G蛋白(例如)与磷脂酶C路径偶合一致。嵌合G蛋白为所属领域的技术人员所熟知(参见例如米利甘(Milligan)等人，药物科学进展(Trends in Pharmaceutical Sciences Sciences)(1999)20：118-124；和WO02/42461)。
在一些实施例中，所述确定是经由测量第二信使的含量来进行。
在一些实施例中，所述确定是经由测量第二信使的含量来进行，所述第二信使是选自由环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)活性和Ca2+组成的群组。在一些优选实施例中，第二信使为cAMP。在某些实施例中，细胞内cAMP的含量增加。
在某些实施例中，所述确定是使用包含G蛋白偶合受体的膜来进行。
在某些实施例中，所述确定是经由使用黑色素细胞检验来进行。在某些实施例中，色素分散的程度增加。
在一些实施例中，所述确定是经由报道基因检验来进行。在一些实施例中，所述报道基因检验为CRE-Luc报道基因检验。
在一些实施例中，所述确定是经由测量通过增加细胞内cAMP含量所调节的活性来进行。
在一些实施例中，所述确定是经由CRE-Luc报道基因检验来进行。在某些实施例中，萤光素酶活性程度增加。
在一些实施例中，所述确定是经由测量与包含G蛋白偶合受体的膜结合的GTPγS来进行。在某些实施例中，以[35S]标记所述GTPγS。在某些实施例中，所述与包含GPCR的膜结合的GTPγS增加。
在一些实施例中，测试化合物为小分子。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为脂质。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽或脂质。在一些实施例中，测试化合物为多肽。在一些实施例中，测试化合物为多肽，其限制条件为所述多肽不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为脂质。在一些实施例中，测试化合物不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况确定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的结构的步骤。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况提供GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的名称或结构的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含视情况产生或合成GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物的步骤。
在第二方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触，所述化合物已由第一方面的方法鉴定；和
(b)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将化合物投予给脊椎动物，所述化合物已由第一方面的方法鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将化合物投予给脊椎动物，所述化合物已由第一方面的方法鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力进一步指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
在某些实施例中，所述确定包含测量脊椎动物的骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用双能X射线吸收测定法(DXA)测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World HealthOrganization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention andManagement of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在一些实施例中，测试化合物为小分子。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为脂质。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽或脂质。在一些实施例中，测试化合物为多肽。在一些实施例中，测试化合物为多肽，其限制条件为所述多肽不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为脂质。在一些实施例中，测试化合物不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为抗体或其抗原结合片段。
在第三方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使GPR119促效剂活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触；和
(b)确定GPR119促效剂是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中GPR119促效剂刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示GPR119促效剂为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将GPR119促效剂投予给脊椎动物；和
(b)确定GPR119促效剂是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中GPR119促效剂增加脊椎动物的GIP含量的能力指示GPR119促效剂为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将GPR119促效剂投予给脊椎动物；和
(b)确定GPR119促效剂是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中GPR119促效剂增加脊椎动物的骨质量水平的能力指示GPR119促效剂为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
在某些实施例中，所述确定包含测量脊椎动物的骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用双能X射线吸收测定法(DXA)测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World HealthOrganization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention andManagement of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在某些实施例中，GPR119促效剂为内源性GPR119的促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为人类GPR119的促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为GPR119部分促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为选择性GPR119促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为小分子。在一些实施例中，小分子不为多肽。在一些实施例中，小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，小分子不为脂质。在一些实施例中，小分子不为多肽或脂质。
在某些实施例中，GPR119促效剂可口服使用。
在某些实施例中，GPR119促效剂具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，在腺苷酸环化酶检验中(例示性腺苷酸环化酶检验提供于下文实例7和实例8中)，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，在黑色素细胞检验中(例示性黑色素细胞检验提供于下文实例9中)，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。
例示性GPR119促效剂揭示于以下文献中：例如国际申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 04/065380公开)；国际申请案第PCT/US2004/005555号(以WO 04/076413公开)；国际申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 05/007647公开)；国际申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 05/007658公开)；国际申请案第PCT/US2005/019318号(以WO 2005/121121公开)；国际申请案第PCT/GB2004/050046号(以WO 2005/061489公开)；国际申请案第PCT/US06/00567号(以WO 2006/083491公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050264号(以WO 2006/067531公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050265号(以WO 2006/067532公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050266号(以WO 2006/070208公开)；国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)；国际申请案第PCT/JP2005/018412号(以WO 06/040966公开)；国际申请案第PCT/JP2005/019000号(以WO 2006/043490公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050176号(以WO2007/003960公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050177号(以WO 2007/003961公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050178号(以WO 2007/003962公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050182号(以WO 2007/003964公开)；和国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)。
在某些实施例中，方法包含提供GPR119促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂可由第一方面的方法鉴定。
在某些实施例中，方法包含进行第一方面的方法以鉴定GPR119促效剂。
在某些实施例中，方法包含由第一方面的方法鉴定GPR119促效剂。
在第四方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在测试化合物存在或不存在的情况下，使G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体接触，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为受体不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(v)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(vi)SEQ ID NO：2的变异体；
(vii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；和
(b)侦测所述已知配体与所述受体之间的复合物；和
(c)确定在测试化合物存在的情况下是否比在测试化合物不存在的情况下形成较少所述复合物；
其中所述确定指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，方法为鉴定GIP促分泌素的方法。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物的方法。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法。
在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的配体或促效剂。在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的已知促效剂。在某些实施例中，已知配体为内源性人类GPR119受体的配体或促效剂。在某些实施例中，已知配体与以下文献中所揭示的化合物相同：例如国际申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 04/065380公开)；国际申请案第PCT/US2004/005555号(以WO 04/076413公开)；国际申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 05/007647公开)；国际申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 05/007658公开)；国际申请案第PCT/US2005/019318号(以WO 2005/121121公开)；国际申请案第PCT/GB2004/050046号(以WO 2005/061489公开)；国际申请案第PCT/US06/00567号(以WO 2006/083491公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050264号(以WO 2006/067531公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050265号(以WO 2006/067532公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050266号(以WO 2006/070208公开)；国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)；国际申请案第PCT/JP2005/018412号(以WO 06/040966公开)；国际申请案第PCT/JP2005/019000号(以WO 2006/043490公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050176号(以WO 2007/003960公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050177号(以WO 2007/003961公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050178号(以WO 2007/003962公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050182号(以WO 2007/003964公开)；或国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)。在某些实施例中，已知配体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的内源性配体。
在某些实施例中，视情况经标记的已知配体为经标记的已知配体。在某些实施例中，经标记的已知配体为经放射性标记的已知配体。用于放射性标记化合物，诸如用于标记本发明的G蛋白偶合受体的已知配体的技术为所属领域的技术人员所熟知。参见例如国际申请案WO 04/065380。亦参见例如下文实例11。
用于侦测G蛋白偶合受体与已知为所述G蛋白偶合受体的配体的化合物之间的复合物的技术为所属领域的技术人员所熟知。参见例如国际申请案WO 04/065380。亦参见例如下文实例12。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物；
(e)使在其存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触；和
(f)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物；
(e)将在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物投予给脊椎动物；和
(f)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物；
(e)将在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物投予给脊椎动物；和
(f)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，所述确定包含测量个体骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用DXA测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(e)视情况提供在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(f)使在其存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触；和
(g)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(e)视情况提供在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(f)将在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物投予给脊椎动物；和
(g)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含此第四方面的步骤(a)至(c)，且进一步包含以下步骤：
(d)视情况合成在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(e)视情况提供在化合物存在下根据步骤(c)形成较少所述复合物的化合物；
(f)将在化合物存在下在步骤(c)中形成较少所述复合物的化合物投予给脊椎动物；和
(g)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，所述确定包含测量个体骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用DXA测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在某些实施例中，人类DNA样品为人类基因组DNA。
在一些实施例中，聚合酶链反应为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR技术为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中，人类DNA样品为人类cDNA。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类组织。在一些实施例中，表达GPR119的人类组织为胰腺或胰岛。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类细胞类型。在一些实施例中，cDNA来自胰腺β细胞。在某些实施例中，cDNA来自胰腺细胞株。
在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，严格杂交条件(例如高度严格条件)包含在42℃下在包含50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中杂交，接着在65℃下在包含0.1×SSC的溶液中洗涤。杂交技术为所属领域的技术人员所熟知。
在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，G蛋白偶合受体为包含G蛋白的融合蛋白的部分。用于制造GPCR:G融合构筑体的技术为所属领域的技术人员所熟知(参见例如国际申请案WO02/42461)。
在某些实施例中，所述确定是使用包含G蛋白偶合受体的宿主细胞来进行。在某些实施例中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码GPCR的聚核苷酸。在一些实施例中，表达载体为pCMV。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款，此载体在1998年10月13日保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209USA)。由ATCC测试DNA且确定其具有活力。ATCC已向pCMV指定以下保存编号：ATCC#203351。其他合适的表达载体对所属领域的技术人员显而易见，且多种表达载体可购得(例如，来自Clontech，Palo Alto，CA；Stratagene，La Jolla，CA；和Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在一些实施例中，宿主细胞为脊椎动物细胞。在一些实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，哺乳动物宿主细胞是选自由293细胞、293T细胞、CHO细胞、MCB3901细胞和COS-7细胞组成的群组。在一些实施例中，宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，宿主细胞为黑色素细胞。其他合适的宿主细胞对所属领域的技术人员显而易见，且多种细胞株可购自美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)。
在某些实施例中，所述确定是使用包含G蛋白偶合受体的膜来进行。
在一些实施例中，测试化合物为小分子。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为脂质。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽或脂质。在一些实施例中，测试化合物为多肽。在一些实施例中，测试化合物为多肽，其限制条件为所述多肽不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为脂质。在一些实施例中，测试化合物不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，测试化合物为抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况确定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的结构的步骤。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况提供GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的名称或结构的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含视情况产生或合成GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物的步骤。
在第五方面，本发明涉及一种筛选测试化合物以鉴定GIP促分泌素、用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法的特征在于使用包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列的G蛋白偶合受体：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(e)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(f)SEQ ID NO：2的变异体；
(g)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(f)的氨基酸序列：
(i)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(ii)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(h)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(i)(a)至(h)中的任一者的生物学活性片段。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，方法包含鉴定受体的促效剂。
在某些实施例中，方法包含鉴定受体的部分促效剂。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物的步骤。
在第六方面，本发明涉及一种方法，其包含根据第一方面、第二方面、第三方面、第四方面或第五方面鉴定GIP促分泌素、用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或用于增加个体骨质量的化合物，将所述GIP促分泌素、所述用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或所述用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物。
在第七方面，本发明涉及G蛋白偶合受体筛选作为GIP促分泌素、用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或用于增加个体骨质量的化合物的测试化合物的用途，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(e)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(f)SEQ ID NO：2的变异体；
(g)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(f)的氨基酸序列：
(i)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(ii)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(h)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(i)(a)至(h)中的任一者的生物学活性片段。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，受体为重组体。
在某些实施例中，测试化合物为小分子。
在某些实施例中，测试化合物为GPR119促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为内源性GPR119的促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为人类GPR119的促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为GPR119部分促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为选择性GPR119促效剂。
在某些实施例中，GPR119促效剂为小分子。
在某些实施例中，GPR119促效剂可口服使用。
在某些实施例中，GPR119促效剂具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，在腺苷酸环化酶检验中(例示性腺苷酸环化酶检验提供于下文实例7和实例8中)，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在某些实施例中，在黑色素细胞检验中(例示性黑色素细胞检验提供于下文实例9中)，GPR119促效剂对具有SEQ ID NO：2的人类GPR119具有以下EC50值：小于约10μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。
例示性GPR119促效剂揭示于以下文献中：例如国际申请案第PCT/US2004/001267号(以WO04/065380公开)；国际申请案第PCT/US2004/005555号(以WO 04/076413公开)；国际申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 05/007647公开)；国际申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 05/007658公开)；国际申请案第PCT/US2005/019318号(以WO 2005/121121公开)；国际申请案第PCT/GB2004/050046号(以WO 2005/061489公开)；国际申请案第PCT/US06/00567号(以WO 2006/083491公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050264号(以WO 2006/067531公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050265号(以WO 2006/067532公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050266号(以WO 2006/070208公开)；国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)；国际申请案第PCT/JP2005/018412号(以WO 06/040966公开)；国际申请案第PCT/JP2005/019000号(以WO 2006/043490公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050176号(以WO2007/003960公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050177号(以WO 2007/003961公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050178号(以WO 2007/003962公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050182号(以WO 2007/003964公开)；和国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)。
在第八方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使刺激G蛋白偶合受体功能的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为G蛋白偶合受体不包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(v)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(vi)SEQ ID NO：2的变异体；
(vii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第一方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为胰腺细胞。参见例如谢(Xie)等人，骨(Bone)2007，与GIP的胰腺表达相关(as relates to pancreatic expression of GIP)。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将刺激G蛋白偶合受体功能的化合物投予给脊椎动物，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为G蛋白偶合受体不包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(viii)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(ix)SEQ ID NO：2的变异体；
(x)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第一方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，GIP含量为总GIP的血液或血浆或血清浓度。在某些实施例中，GIP含量为生物活性GIP的血液或血浆或血清浓度。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将刺激G蛋白偶合受体功能的化合物投予给脊椎动物，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为G蛋白偶合受体不包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(xi)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(xii)SEQ ID NO：2的变异体；
(xiii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第一方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力进一步指示测试化合物为可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在某些实施例中，所述确定包含测量脊椎动物的骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用双能X射线吸收测定法(DXA)测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World HealthOrganization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention andManagement of Osteoporosis))。
在某些实施例中，人类DNA样品为人类基因组DNA。
在一些实施例中，聚合酶链反应为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR技术为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中，人类DNA样品为人类cDNA。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类组织。在一些实施例中，表达GPR119的人类组织为胰腺或胰岛。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类细胞类型。在一些实施例中，cDNA来自胰腺β细胞。在某些实施例中，cDNA来自胰腺细胞株。
在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，严格杂交条件(例如高度严格条件)包含在42℃下在包含50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中杂交，接着在65℃下在包含0.1×SSC的溶液中洗涤。杂交技术为所属领域的技术人员所熟知。
在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，G蛋白偶合受体为包含G蛋白的融合蛋白的部分。用于制造GPCR:G融合构筑体的技术为所属领域的技术人员所熟知(参见例如国际申请案WO02/42461)。
在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为小分子。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为脂质。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽或脂质。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为多肽。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为多肽，其限制条件为所述多肽不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为脂质。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，刺激G蛋白偶合受体功能的化合物为抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况确定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的结构的步骤。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况提供GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的名称或结构的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含视情况产生或合成GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成药物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物的步骤。
在第九方面，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使在化合物存在的情况下比在所述化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或与能分泌GIP的细胞接触，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为受体不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(v)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(vi)SEQ ID NO：2的变异体；
(vii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第四方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中测试化合物刺激脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的等位基因。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为SEQ ID NO：2的哺乳动物直系同源基因。
在某些实施例中，G蛋白偶合受体为重组体。
在某些实施例中，脊椎动物肠内分泌细胞为哺乳动物肠内分泌细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞为K细胞。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含来源于小肠的K细胞富集区域的组织。在某些实施例中，肠内分泌细胞包含十二指肠或空肠组织(参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140)。在某些实施例中，肠内分泌细胞为肠内分泌细胞株。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为胰腺细胞。参见例如谢(Xie)等人，骨(Bone Bone)2007，与GIP的胰腺表达相关(as relates to pancreatic expressionof GIP)。在某些实施例中，能分泌GIP的细胞为经工程化为能分泌GIP的重组细胞。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将化合物投予给脊椎动物，其中在所述化合物存在的情况下比在所述化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为受体不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(viii)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(ix)SEQ ID NO：2的变异体；
(x)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第四方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的GIP含量；
其中测试化合物增加脊椎动物的GIP含量的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
另外，本发明涉及一种鉴定GIP促分泌素、可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将化合物投予给脊椎动物，其中在所述化合物存在的情况下比在所述化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物，其中所述G蛋白偶合受体包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其限制条件为受体不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(iv)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(xi)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(xii)SEQ ID NO：2的变异体；
(xiii)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(vi)的氨基酸序列：
(a′)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(b′)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(viii)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(ix)(i)至(viii)中的任一者的生物学活性片段；
所述化合物已由第四方面的方法确定或鉴定；和
(b)确定化合物是否增加脊椎动物的骨质量水平；
其中测试化合物增加脊椎动物的骨质量水平的能力进一步指示测试化合物为GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物。
在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物或哺乳动物为卵巢切除的大鼠或卵巢切除的小鼠。
在某些实施例中，所述确定包含测量脊椎动物的骨质量水平。在某些实施例中，所述测量骨质量水平包含使用DXA测量骨质量水平。在某些实施例中，所述使用DXA测量骨质量水平包含使用DXA测量T分数。在某些实施例中，所述使用DXA测量T分数包含使用DXA在髋部测量T分数。应明确预期，所述测量骨质量水平可包含使用除DXA以外的技术(诸如单X射线吸收测定法(SXA))测量骨质量水平(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis))。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为非人类哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为非人类哺乳动物。
在某些实施例中，人类DNA样品为人类基因组DNA。
在一些实施例中，聚合酶链反应为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR技术为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中，人类DNA样品为人类cDNA。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类组织。在一些实施例中，表达GPR119的人类组织为胰腺或胰岛。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类细胞类型。在一些实施例中，cDNA来自胰腺β细胞。在某些实施例中，cDNA来自胰腺细胞株。
在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，严格杂交条件(例如高度严格条件)包含在42℃下在包含50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中杂交，接着在65℃下在包含0.1×SSC的溶液中洗涤。杂交技术为所属领域的技术人员所熟知。
在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，G蛋白偶合受体为包含G蛋白的融合蛋白的部分。用于制造GPCR：G融合构筑体的技术为所属领域的技术人员所熟知(参见例如国际申请案WO02/42461)。
在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为小分子。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为脂质。在一些实施例中，测试化合物为小分子，其限制条件为所述小分子不为多肽或脂质。在一些实施例中，测试化合物为多肽。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为多肽，其限制条件为所述多肽不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为脂质。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物不为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，在化合物存在的情况下比在化合物不存在的情况下形成较少的G蛋白偶合受体与所述受体的视情况经标记的已知配体之间的复合物的化合物为抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，方法为鉴定GIP促分泌素的方法。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于预防或治疗特征为低骨质量的病状的化合物的方法。
在某些实施例中，方法为鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法。
在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的配体或促效剂。在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的已知促效剂。在某些实施例中，已知配体为内源性人类GPR119受体的配体或促效剂。在某些实施例中，已知配体与以下文献中所揭示的化合物相同：例如国际申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 04/065380公开)；国际申请案第PCT/US2004/005555号(以WO 04/076413公开)；国际申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 05/007647公开)；国际申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 05/007658公开)；国际申请案第PCT/US2005/019318号(以WO 2005/121121公开)；国际申请案第PCT/GB2004/050046号(以WO 2005/061489公开)；国际申请案第PCT/US06/00567号(以WO 2006/083491公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050264号(以WO 2006/067531公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050265号(以WO 2006/067532公开)；国际申请案第PCT/GB2005/050266号(以WO 2006/070208公开)；国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)；国际申请案第PCT/JP2005/018412号(以WO 06/040966公开)；国际申请案第PCT/JP2005/019000号(以WO 2006/043490公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050176号(以WO 2007/003960公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050177号(以WO 2007/003961公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050178号(以WO 2007/003962公开)；国际申请案第PCT/GB2006/050182号(以WO 2007/003964公开)；或国际申请案第PCT/JP02/09350号(以WO 03/026661公开)。在某些实施例中，已知配体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，已知配体为内源性脊椎动物、哺乳动物或人类GPR119受体的内源性配体。
在某些实施例中，视情况经标记的已知配体为经标记的已知配体。在某些实施例中，经标记的已知配体为经放射性标记的已知配体。用于放射性标记化合物，诸如用于标记本发明的G蛋白偶合受体的已知配体的技术为所属领域的技术人员所熟知。参见例如国际申请案WO 04/065380。亦参见例如下文实例11。
用于侦测G蛋白偶合受体与已知为所述G蛋白偶合受体的配体的化合物之间的复合物的技术为所属领域的技术人员所熟知。参见例如国际申请案WO 04/065380。亦参见例如下文实例12。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况确定GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的结构的步骤。
在一些实施例中，方法进一步包含视情况提供GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的名称或结构的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含视情况产生或合成GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成药物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包含将GIP促分泌素、可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状的化合物或可用于增加个体骨质量的化合物调配成医药组合物的步骤。
附图说明
结合随附图式说明本发明。图1展示投与GPR119促效剂对野生型小鼠的血液GIP含量的影响的药效分析。A.使用化合物1作为GPR119促效剂进行时程分析。B.使用化合物3作为GPR119促效剂进行时程分析。C.使用化合物3作为GPR119促效剂进行剂量滴定分析。
图2展示与野生型小鼠相比，投与GPR119促效剂对GPR119缺失(基因剔除)的小鼠的血液GIP含量的影响。A.使用化合物1作为GPR119促效剂进行比较。B.使用化合物2作为GPR119促效剂进行比较。
具体实施方式
本发明涉及使用GPR119受体鉴定可用于增加个体骨质量的化合物的方法。GPR119受体的促效剂可用作用于治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)及用于增加个体骨质量的治疗剂。本发明至少部分是基于申请者的意想不到的发现，所述发现是将GPR119促效剂投予个体(诸如通过经口投予)可对GPR119受体起作用以增加个体的GIP含量。
如本文中所使用，术语“配体”应意谓特异性结合多肽(诸如GPR119)的分子(例如测试化合物)。配体可为(例如)多肽、脂质、小分子、抗体。化合物1为GPR119受体多肽的例示性配体(参见表A，其陈述化合物1的化学结构和化学名称)。化合物1与国际专利申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 2004/065380公开)所揭示的化合物相同。(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺(参见表A)为GPR119受体多肽的例示性配体。化合物2为GPR119受体多肽的例示性配体。化合物2与国际专利申请案第PCT/US2004/022417号(以WO2005/007658公开)所揭示的化合物相同。化合物3为GPR119受体多肽的例示性配体。化合物3与国际专利申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 2005/007647公开)所揭示的化合物相同。内源性配体为作为原生多肽(诸如GPR119)的内源性、天然配体的配体。配体可为“拮抗剂”、“促效剂”、“部分促效剂”或“反向促效剂”，或其类似物。
表A
Figure G2007800127142D00421
如本文中所使用，术语“促效剂”应意谓借助于结合GPCR而活化所述GPCR以引起由GPCR介导的细胞内回应的试剂(例如配体、测试化合物)。
如本文中所使用，术语“部分促效剂”应意谓借助于结合GPCR而活化所述GPCR以引起由GPCR介导的细胞内回应(尽管低于完全促效剂所达到的程度)的试剂(例如配体、测试化合物)。
术语“拮抗剂”应意谓在与促效剂或部分促效剂大致相同的位点处结合且优选竞争性结合GPCR但并不活化由GPCR的活性形式所引发的细胞内回应，且可进而抑制由促效剂或部分促效剂所产生的细胞内回应的试剂(例如配体、测试化合物)。在促效剂或部分促效剂不存在的情况下，拮抗剂通常并不减少基线细胞内回应。
术语“反向促效剂”应意谓结合GPCR且抑制在促效剂或部分促效剂不存在的情况下所观测到的由在正常基准活性以下的受体的活性形式所引发的基线细胞内回应的试剂(例如配体、测试化合物)。
如本文中所使用，术语“GPR119促效剂”是指结合GPR119受体且充当促效剂的化合物。化合物1为例示性GPR119促效剂(参见表A，其陈述化合物1的化学结构和化学名称)。化合物1与国际专利申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 2004/065380公开)所揭示的化合物相同。(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为例示性GPR119促效剂。化合物2为例示性GPR119促效剂。化合物2与国际专利申请案第PCT/US2004/022417号(以WO2005/007658公开)所揭示的化合物相同。化合物3为例示性GPR119促效剂。化合物3与国际专利申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 2005/007647公开)所揭示的化合物相同。
如本文中所使用，术语“选择性GPR119促效剂”是指对GPR119受体的选择性高于对一或多种相关受体的选择性的GPR119促效剂，所述相关受体诸如促肾上腺皮质激素释放因子-1(CRF-1)受体。化合物1为例示性选择性GPR119促效剂(参见表A，其陈述化合物1的化学结构和化学名称)。化合物1与国际专利申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 2004/065380公开)所揭示的化合物相同。(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为例示性选择性GPR119促效剂。化合物2为例示性选择性GPR119促效剂。化合物2与国际专利申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 2005/007658公开)所揭示的化合物相同。化合物3为例示性选择性GPR119促效剂。化合物3与国际专利申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 2005/007647公开)所揭示的化合物相同。
术语“GIP促分泌素”应意谓促进细胞(例如肠内分泌细胞)中的GIP分泌或在投予个体(诸如脊椎动物或哺乳动物)后增加总GIP含量(例如血液或血浆总GIP含量)的试剂(例如配体、测试化合物)。在某些实施例中，GIP促分泌素为适于增加个体的总GIP含量(例如血液或血浆总GIP含量)的化合物。
如本文中所使用，术语“个体”是指脊椎动物，其包括(但不限于)：鱼(诸如市售养殖鱼、观赏鱼等)、两栖动物(诸如青蛙、蟾蜍、宠物型两栖动物等)、爬行动物(诸如蛇、蜥蜴、海龟、宠物型爬行动物等)、鸟(诸如家鸡、火鸡、宠物鸟等)和哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、狗、猫、马、母牛、绵羊、山羊、非人类灵长类动物、非人类哺乳动物、宠物型非人类哺乳动物、人类等)。在某些实施例中，个体为鱼。在某些实施例中，个体为两栖动物。在某些实施例中，个体为爬行动物。在某些实施例中，个体为鸟。在某些实施例中，个体为火鸡。在过去25年中，对于具有较大胸肌质量的火鸡的商业选择压力带来了对骨架完整性的渐增需求。然而，胸肌质量增加尚未伴随有骨骼的补偿性变化，从而使火鸡行业已经历腿部问题的增加。已报导年轻成年雄性火鸡的长骨骨折。(参见例如克雷斯波(Crespo)等人，家禽科学(Poult Sci)(2000)79：602-608。)在某些实施例中，个体为哺乳动物。在某些实施例中，个体为小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、狗、猫、马、母牛、绵羊、山羊、非人类灵长类动物或人类(其可单独或以任何组合包括在本发明的实施例中)。在某些实施例中，个体为马。表演型马为在诸如赛马、溜蹄和其他竞赛事件的活动中所涉及的马，其易于骨折。在某些实施例中，个体为狗或猫。在某些实施例中，个体为人类伴侣动物(诸如狗、猫等)、家畜(诸如母牛、绵羊、山羊、猪、家鸡等)、运动型动物(诸如马、狗等)、驮畜(诸如骡、骆驼等)或外来动物(诸如动物园中所见的动物等)，所述动物可单独或以任何组合包括在本发明的实施例中。在某些实施例中，个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，个体为非人类灵长类动物(诸如猕猴、黑猩猩等)。在某些实施例中，个体为人类。
如本文中所使用，术语“需要预防或治疗”是指由护理者(例如，在人类状况下为医师、护士、从业护士；在非人类脊椎动物状况下及在非人类哺乳动物的特定实施例中为兽医)所作出的个体需要或将受益于治疗的判断。
如本文中所使用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指引起研究者、兽医、医学博士或其他临床医师所寻求的组织、系统、动物、个体或人类的生物回应或药物回应的活性化合物或医药剂的量，所述生物回应或药物回应包含以下回应中的一或多者：
(1)预防疾病；例如，预防易患疾病、病状或病症而尚未经历或显示疾病的病理或症状的个体的疾病、病状或病症，
(2)抑制疾病；例如，抑制经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体的疾病、病状或病症(即遏止病理和/或症状的进一步发展)，和
(3)改善疾病；例如，改善经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体的疾病、病状或病症(即逆转病理和/或症状)。
如本文中所使用，术语“治疗功效”是指引起研究者、兽医、医学博士或其他临床医师所寻求的组织、系统、动物、个体或人类的生物回应或药物回应，所述生物回应或药物回应包含以下回应中的一或多者：
(1)预防疾病；例如，预防易患疾病、病状或病症而尚未经历或显示疾病的病理或症状的个体的疾病、病状或病症，
(2)抑制疾病；例如，抑制经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体的疾病、病状或病症(即遏止病理和/或症状的进一步发展)，和
(3)改善疾病；例如，改善经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体的疾病、病状或病症(即逆转病理和/或症状)。
术语“预防有效量”是指将预防或降低设法预防的生物事件或医疗事件的发生风险的药物量。在许多情况下，预防有效量与治疗有效量相同。
术语“组合物”应意谓包含至少一种组份的物质。
术语“活性成份”应意谓在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理学活性或其他直接作用的任何组份。
术语“医药组合物”应意谓包含至少一种活性成份的组合物，由此所述组合物可经受哺乳动物中的研究和治疗。
“医药学上可接受”意谓载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐必须与调配物的其他成份相容，且对其接受者无害。
术语“剂型”应意谓药物产生和分配的实体形态，诸如片剂、胶囊或注射剂。
“骨”意谓形成大多数脊椎动物的骨架的主要部分的致密、半硬质、多孔、钙化结缔组织，其包含致密有机基质和无机矿物组份。骨为构成脊椎动物骨架的众多解剖学独特结构中的一者。
术语“骨质量”和“骨密度(BMD)”在本文中可互换使用。人类BMD通常由标准射线照相技术(双能量X射线吸收测定法(DXA))来测量。在为分析BMD而发展的许多技术中，DXA在技术上发展最高且在生物学上最充分有效。DXA技术连同适当修改的软件也可用于在动物研究中可靠地分析BMD。DXA用于诊断骨质疏松症、预后(骨折预测)、监控病症的自然史和分析对治疗的回应。
如本文中所使用，术语“低骨质量”是指个体的骨密度(BMD)的任何减少或降低，且包括如世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的提案中所定义的骨质疏松症与骨质减少(osteopenia)。WHO已将正常值定义为在年轻成年人参考平均值的一个标准差内的BMD值(T分数≥-1)。WHO已将骨质减少定义为在年轻成年人平均值以下超过1个标准差、但在此值以下不足2.5个标准差的BMD值(T分数<-1且>-2.5)。WHO已将骨质疏松症描绘为骨质减少的较严重形式，且已将其定义为在年轻成年人平均值以下2.5个标准差或更高标准差的BMD值(T分数≤-2.5)。(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis)，其揭示内容是以引用的方式全部并入本文中)。更为通常地，将骨质减少定义为T分数小于-1且大于-2，且将骨质疏松症定义为T分数小于或等于-2。在本发明的某些实施例中，T分数是用DXA在髋部进行测量。
如本文中所使用，术语“骨质疏松症”是由在年轻成年参考平均值以下2个标准差或更低标准差的BMD值(T分数≤-2)来定义，或是指由护理者(例如在人类状况下为医师、护士、从业护士；在非人类脊椎动物状况下为兽医)所作出的诊断。
骨质疏松症可分为原发性或继发性的。(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis)。)如本文中所使用，术语“骨质疏松症”涵盖原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。
如本文中所使用，“原发性骨质疏松症”与绝经(自然、提前或手术)、变老或两者相关。应了解，在本发明中，与绝经(自然、提前或手术)相关的原发性骨质疏松症、与变老相关的原发性骨质疏松症和与绝经及变老相关的原发性骨质疏松症可单独或以任何组合包括在实施例中。
如本文中所使用，“继发性骨质疏松症”是指并不与绝经或变老相关而与医学病况或与药剂或药物的使用相关的骨质疏松症。骨质疏松症的风险增加是与包括(但不限于)内分泌及代谢失调和恶性病的许多医学病况相关，且与某些药剂及药物的使用相关，所述药剂及药物的实例为所属领域的技术人员所熟知(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis)；Williams Textbook of Endocrinology，第10版；其揭示内容是以引用的方式全部并入本文中)。继发性骨质疏松症也可与不动性相关。对由医学病况、由使用药剂或药物或由不动性所继发的骨质疏松症的诊断可由护理者(例如在人类状况下为医师、护士、从业护士；在非人类脊椎动物状况下为兽医)作出。
“骨折”意谓骨的完全或不完全破裂、断裂或裂开。骨折的诊断通常视临床检查和放射学测定而定。在本发明中，骨折包括(但不限于)：创伤性骨折、长期骨折和病理性骨折。
如本文中所使用，“创伤性骨折”应指涉及具有超过骨天然弹性的局部暴力程度的阈上创伤的即刻性骨折(immediate fracture)。其可伴随有同时软组织损伤和时常皮肤损伤。创伤性骨折可为闭合性的(相邻软组织可受损，但其覆盖性软组织在很大程度上受到保护)。创伤性骨折也可为开放性的(由于大范围软组织损伤而使骨的断端游离，使得来自外部的病原体可直接进入伤口)。
如本文中所使用，“长期骨折”应指慢性骨折、疲劳性骨折、应力骨折或I型自发性骨折。
如本文中所使用，“病理性骨折”应指II型自发性骨折。病理性骨折在并无造成所述骨折的足够创伤的情况下自发性出现。骨可能先前已由于全身性疾病(例如骨质疏松症、骨营养不良或佩吉特氏畸形性骨炎(Paget′s osteitis deformans))或由于局部骨损害(例如癌转移、放射性骨坏死或骨肿瘤)而受损。参见阿德勒(Adler)、克劳斯·彼得(Claus-Peter)，骨病(BONE DISEASES)，第114页(施普林格(Springer-Verlag)，德国(Germany)2000)。
骨折还包括(但不限于)：倾斜性扭转骨折、横断骨折、粉碎性骨折、压缩性骨折、肋骨骨折、蔓延性骨折和股骨颈骨折(阿德勒(Adler)、克劳斯·彼得(Claus-Peter)，骨病(BONE DISEASES)，施普林格(Springer-Verlag)，德国(Germany)(2000))。
如本文中所使用，术语“特征为低骨质量的病状”包括(但不限于)：骨质减少、骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨关节炎、牙周病、牙槽骨质流失、截骨术骨质流失、儿童特发性骨质流失、脊柱弯曲和身高缩短。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与医学病况相关。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与药剂或药物的使用相关。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与不动性相关。特征为低骨质量的病状还包括(但不限于)：佩吉特氏病(Paget′s disease)、由转移性癌症所引起的骨质流失和溶骨性破坏(诸如由赘生性疾病、放射线疗法或化学疗法所引起的溶骨性破坏)。特征为低骨质量的病状还包括(但不限于)：骨质疏松症的长期并发症，诸如脊柱弯曲、身高缩短和修复手术。应了解，在本发明中，特征为低骨质量的病状可单独或以任何组合包括在实施例中。(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health OrganizationTechnical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Managementof Osteoporosis)；威廉姆斯内分泌学(Williams Textbook of Endocrinology)，第10版，拉森(Larsen)等人编(2002)，W.B.桑德斯出版公司(W.B.Saunders Company)；和内分泌学与代谢(Endocrinology and Metabolism)，第4版，费利格(Felig)等人编(2001)，麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill Book Company)；其各自的揭示内容以引用的方式全部并入本文中。)
如本文中所使用，“骨病”是指与骨异常相关的病症或病状。可根据本发明通过增加骨质量或骨生长来治疗的骨病包括(但不限于)：骨质减少、骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨关节炎、牙周病、牙槽骨质流失、截骨术骨质流失、儿童特发性骨质流失、脊柱弯曲和身高缩短。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与医学病况相关。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与药剂或药物的使用相关。在某些实施例中，继发性骨质疏松症与不动性相关。可根据本发明通过增加骨质量或骨生长来治疗的骨病还包括(但不限于)：佩吉特氏病和由转移性癌症所引起的骨质流失。可根据本发明通过增加骨质量或生长来治疗的破坏性骨病包括(但不限于)：骨质疏松症、骨关节炎和溶骨性破坏(诸如由赘生性疾病、放射线疗法或化学疗法所引起的溶骨性破坏)。应了解，在本发明中，可根据本发明通过增加骨质量或生长来治疗的骨病可单独或以任何组合包括在实施例中。(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World HealthOrganization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention andManagement of Osteoporosis)；威廉姆斯内分泌学(Williams Textbook of Endocrinology)，第10版，拉森(Larsen)等人编(2002)，W.B.桑德斯出版公司(W.B.Saunders Company)；和内分泌学与代谢(Endocrinology and Metabolism)，第4版，费利格(Felig)等人编(2001)，麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill Book Company)；其各自的揭示内容以引用的方式全部并入本文中。)
本发明还涉及得益于根据本发明通过增加骨质量或骨生长所进行的治疗的其他病状，所述治疗包括(但不限于)：增强面部修复、上颌骨修复、下颌骨修复、牙周病或拔牙后的骨愈合，增强长骨伸长，增强修复性向内生长和增加骨结合。
术语“内源性”应意谓个体(例如且并不限于人类)天然产生的物质。相反，“非内源性”应意谓并非由个体(例如且并不限于人类)天然产生的物质。
术语G蛋白偶合受体的“生物学活性片段”应意谓具有天然产生的GPCR的结构和生物化学功能的GPCR的片段。在某些实施例中，生物学活性片段与G蛋白偶合。在某些实施例中，生物学活性片段与GPCR的已知配体结合。
术语“引物”在本文中用于表示与靶核苷酸序列互补且用于与靶核苷酸序列杂交的特异性核苷酸序列。引物充当由DNA聚合酶、RNA聚合酶或反转录酶所催化的核苷酸聚合的引发点。
术语“表达载体”应意谓在表达载体的适当宿主细胞重组体中转录所克隆的DNA且转译所转录的mRNA所需的DNA序列。适当构筑的表达载体应含有宿主细胞中用于自主复制的复制起始点、可选择标记、有限数目的适用限制酶位点、高复本数的潜能和活性启动子。在表达载体内，待转录的所克隆的DNA可操作地连接组成性或条件性活性启动子。
术语“宿主细胞”应意谓能具有并入其中的载体的细胞。在本发明的内容中，载体将通常含有编码与合适的启动子序列可操作地连接的GPCR或GPCR融合蛋白的核酸以使GPCR或GPCR融合蛋白的表达发生。在特定实施例中，宿主细胞为真核宿主细胞。在某些实施例中，真核宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，真核宿主细胞为酵母宿主细胞。在某些实施例中，真核宿主细胞为黑色素宿主细胞。
术语“接触”应意谓使至少两个部分合在一起。
术语“调节”或“修饰”应用来指增加或减少特定活性、功能或分子的量、品质或作用。作为说明且并无限制，G蛋白偶合受体的促效剂、部分促效剂、反向促效剂和拮抗剂为受体的调节剂。
术语“小分子”应用以意谓具有小于约10,000克/摩尔的分子量的化合物，包括肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、聚核苷酸、聚核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、有机化合物或无机化合物(即，包括杂合有机化合物或有机金属化合物)，及其盐、酯或其他医药学上可接受的形式。在某些实施例中，小分子为具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物。在某些实施例中，小分子为具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物。在某些实施例中，小分子为具有小于约800克/摩尔的分子量的有机或无机化合物。在某些实施例中，小分子为具有小于约600克/摩尔的分子量的有机或无机化合物。在某些实施例中，小分子为具有小于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物。
本文中所使用的氨基酸缩写在表B中列出：
表B
 
丙氨酸 ALA A
精氨酸 ARG R
天冬酰胺 ASN N
天冬氨酸 ASP D
半胱氨酸 CYS C
谷氨酸 GLU E
谷酰胺 GLN Q
甘氨酸 GLY G
组氨酸 HIS H
异白氨酸 ILE I
白氨酸 LEU L
赖氨酸 LYS K
甲硫氨酸 MET M
苯丙氨酸 PHE F
脯氨酸 PRO P
丝氨酸 SER S
苏氨酸 THR T
 
色氨酸 TRP W
酪氨酸 TYR Y
缬氨酸 VAL V
术语“多肽”应指氨基酸的聚合物，而无需考虑聚合物的长度。因此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义内。此术语也并未指定或排除多肽的表达后修饰。举例来说，包括共价连接的糖基、乙酰基、磷酸根、脂质基团及其类似基团的多肽显然由术语多肽所涵盖。
术语“聚核苷酸”应指一种以上呈单链或双链形式的核苷酸的RNA、DNA或RNA/DNA杂交序列。本发明的聚核苷酸可由包括合成、重组、体外产生或其组合的任何已知方法以及利用此项技术中已知的任何纯化方法来制备。
术语“抗体”在本文中意欲涵盖单克隆抗体和多克隆抗体。
术语“第二信使”应意谓由于受体活化而产生的细胞内回应。第二信使可包括(例如)1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)活性和Ca2+。可测量第二信使回应来确定受体活化。
术语“受体功能”应指受体接受刺激且缓和细胞内作用的正常操作，其包括(但不限于)：调节基因转录、调节离子流入或流出、实现催化反应和/或经由G蛋白调节活性(诸如引起第二信使回应)。
与术语“回应”或“受体功能”相关的术语“刺激”应意谓与化合物不存在的情况下相反，在化合物存在的情况下回应或受体功能增加。
与术语“回应”或“受体功能”相关的术语“抑制”应意谓与化合物不存在的情况下相反，在化合物存在的情况下回应或受体功能减少或受阻。
术语“化合物功效”应意谓与受体结合亲和性相反，化合物抑制或刺激受体功能的能力的测量。
在本文中可与“候选化合物”互换使用的术语“测试化合物”应意谓可经受筛选技术的分子(例如但并不限于化合物)。
与G蛋白偶合受体相关的术语“组成性活性”应意谓G蛋白偶合受体显示促效剂非依赖性活性。
与短语“测试化合物”相关的术语“直接鉴定”或“经直接鉴定”应意谓在G蛋白偶合受体的已知配体(例如已知促效剂)不存在的情况下筛选针对G蛋白偶合受体的化合物。
当提供值的范围时，应了解，除非内容清楚指出，否则在所述范围的上限与下限之间的每一居中值(至下限的十分之一)和在所述规定范围内的任何其他规定值或居中值都涵盖于本发明中。此等较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，且也涵盖于本发明中，以规定范围内的任何经特定排除的界限为条件。当规定范围包括界限的一或两者时，排除所包括的界限的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
A.引言
以下部分的顺序是为达成说明效果而进行陈述，且并不意欲(也不应视作)限制本揭示案或以下权利要求。
B.受体表达
1.所关注的GPCR多肽
本发明的GPCR可包含选自由以下各氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1-335；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-335，其中GPCR不包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸可用人类DNA样品，使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4通过聚合酶链反应(PCR)来扩增；
(e)由聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述聚核苷酸在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交；
(f)SEQ ID NO：2的变异体；
(g)当选自由以下各氨基酸序列组成的群组时，(f)的氨基酸序列：
(i)与SEQ ID NO：2具有至少约80％一致性的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；和
(ii)包含SEQ ID NO：2的至少20个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的氨基酸序列；
(h)具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式的氨基酸序列；和
(i)(a)至(h)中的任一者的生物学活性片段。
在某些实施例中，本发明的GPCR包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为内源性G蛋白偶合受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码且为内源性G蛋白偶合受体的G蛋白偶合受体为哺乳动物G蛋白偶合受体。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码且为内源性G蛋白偶合受体的G蛋白偶合受体为哺乳动物GPR119受体。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合化合物1(参见表A，其陈述化合物1的化学结构和化学名称)。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在某些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在一些实施例中，由可由聚合酶链反应扩增的聚核苷酸编码的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，人类DNA为基因组DNA。
在一些实施例中，聚合酶链反应为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR技术为所属领域的技术人员所熟知。在一些实施例中，人类DNA为来源于表达GPR119的组织或细胞类型的人类cDNA。在一些实施例中，表达GPR119的人类组织为胰腺或胰岛。在某些实施例中，cDNA来自表达GPR119的人类细胞类型。在一些实施例中，cDNA来自胰腺β细胞株。
在一些实施例中，本发明的GPCR为重组体。在一些实施例中，重组性GPCR为重组性人类GPR119。
在一些实施例中，可在本发明方法中使用的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。
在一些实施例中，本发明的GPCR为内源性的。在一些实施例中，本发明的GPCR为哺乳动物GPR119。在一些实施例中，内源性的本发明的GPCR为哺乳动物GPR119。
作为说明且并无限制，预期N末端甲硫氨酸残基的缺失提供可在本发明中使用的生物学活性片段。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和特异性结合化合物1的HA抗原决定基标记(来自血球凝集素流感病毒)的肽融合的片段。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记(来自血球凝集素流感病毒)的肽融合的片段，所述HA抗原决定基标记特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记的肽融合的片段，所述HA抗原决定基标记特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记的肽融合的片段，所述HA抗原决定基标记特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记的肽融合的片段，(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为所述HA抗原决定基标记的促效剂，其在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在视情况在N末端与所述肽融合的所述片段处具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在某些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记的肽融合的片段，(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为所述HA抗原决定基标记的促效剂，其在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在视情况在N末端与所述肽融合的所述片段处具有以下EC50值：小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在一些实施例中，本发明的生物学活性片段为视情况在N末端与包含N末端甲硫氨酸残基和显示可侦测水平的组成性活性的HA抗原决定基标记的肽融合的片段。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。在某些实施例中，所述片段在其N末端与基本上由N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记组成的肽融合。使包含N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记或基本上由N末端甲硫氨酸残基和HA抗原决定基标记组成的肽与多肽片段的N末端融合的技术在此项技术中已为熟知的且可购得(例如Clontech，Mountain View，CA)。
预期SEQ ID NO：2的人类GPR119的等位基因变异体在本发明的范畴内。预期人类GPR119在本发明的范畴内。
预期作为SEQ ID NO：2的人类GPR119的脊椎动物直系同源基因的变异体在本发明的范畴内。预期作为SEQ ID NO：2的人类GPR119的哺乳动物直系同源基因的变异体在本发明的范畴内。作为说明且并无限制，预期小鼠GPR119(例如
Figure G2007800127142D00541
保存编号AY288423)、大鼠GPR119(
Figure G2007800127142D00542
保存编号AAN95195)、仓鼠GPR119、狗GPR119和非人类灵长类动物GPR119在本发明的范畴内。
在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。
预期与SEQ ID NO：2具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的SEQ ID NO：2的变异体在本发明的范畴内。在某些实施例中，与SEQ ID NO：2具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为内源性GPCR。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为非内源性GPCR。在一些实施例中，为内源性GPCR的SEQ ID NO：2的变异体为哺乳动物GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合化合物1。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。通常，可使用已知计算机程序来确定一致性百分数。
在某些实施例中，可在本发明方法中使用的变异GPCR具有与SEQ ID NO：2具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的氨基酸序列。与SEQ ID NO：2具有(例如)95％“一致性”的变异GPCR意谓变异体的氨基酸序列除可包括SEQ ID NO：2的每100个氨基酸至多五个氨基酸变更以外与SEQ ID NO：2的氨基酸1-335相同。因此，为获得(例如)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸1-335相比，序列中至多5％(100个中的5个)的氨基酸残基可插入、缺失或经另一氨基酸取代。此等变更可在氨基或羧基末端或在末端位置之间的任何地方发生，所述变更从属地散布于序列中的残基之间或散布于序列内的一或多个相邻基团中。
在某些实施例中，可在本发明方法中使用的变异G蛋白偶合受体为具有来源于SEQID NO：2的由一或多个氨基酸的缺失、取代和/或添加而产生的氨基酸序列的G蛋白偶合受体。在某些实施例中，可在本发明方法中使用的变异G蛋白偶合受体为具有来源于SEQ ID NO：2的由SEQ ID NO：2的氨基酸序列中不多于10个保守性氨基酸取代和/或不多于3个非保守性氨基酸取代所产生的氨基酸序列的G蛋白偶合受体。在某些实施例中，精氨酸、赖氨酸与组氨酸可保守性地互相取代；谷氨酸与天冬氨酸可保守性地互相取代；谷酰胺与天冬酰胺可保守性地互相取代；白氨酸、异白氨酸与缬氨酸可保守性地互相取代；苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸可保守性地互相取代；且甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸与甲硫氨酸可保守性地互相取代。氨基酸取代、氨基酸缺失和氨基酸添加可在任何位置处(例如C末端或N末端，或在内部位置处)。在一些实施例中，变异体为内源性G蛋白偶合受体。在一些实施例中，变异体为内源性脊椎动物G蛋白偶合受体。在一些实施例中，变异体为内源性哺乳动物G蛋白偶合受体。在一些实施例中，变异体为内源性人类G蛋白偶合受体。在一些实施例中，变异体为非内源性G蛋白偶合受体。在一些实施例中，变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。在某些实施例中，所述具有来源于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的G蛋白偶合受体为化合物1为配体的G蛋白偶合受体。在某些实施例中，所述具有来源于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为配体的G蛋白偶合受体，所述配体在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，所述具有来源于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的G蛋白偶合受体为化合物1为促效剂的G蛋白偶合受体。在某些实施例中，所述具有来源于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的G蛋白偶合受体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的G蛋白偶合受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。
预期为包含SEQ ID NO：2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个或至少100个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体的SEQ ID NO：2的变异体在本发明的范畴内。在某些实施例中，包含SEQ ID NO：2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个或至少100个相邻氨基酸的SEQ ID NO：2的变异体为GPCR。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为内源性GPCR。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为非内源性GPCR。在一些实施例中，为内源性GPCR的SEQ ID NO：2的变异体为哺乳动物GPCR。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合化合物1。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，SEQ IDNO：2的变异体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的变异体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。在一些实施例中，包含SEQ ID NO：2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个或至少100个相邻氨基酸的G蛋白偶合受体显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在一些实施例中，可在本发明方法中使用的变异GPCR为由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为内源性GPCR。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为非内源性GPCR。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码且为内源性GPCR的GPCR为哺乳动物内源性GPCR。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2或其等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的等位基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为SEQ ID NO：2的直系同源基因。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合化合物1。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约50μM、小于约25μM、小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR特异性结合在根据下文实例12的受体结合检验中具有以下IC50值的(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺：小于约10μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约5μM、小于约1μM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在某些实施例中，由在高度严格条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR为(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺为促效剂的受体，所述促效剂在根据下文实例8的全细胞腺苷酸环化酶检验中在所述受体处具有以下EC50值：小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM。在一些实施例中，由在高度严格条件下与SEQID NO：1的互补序列杂交的聚核苷酸编码的GPCR显示可侦测水平的组成性活性。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。杂交技术为所属领域的技术人员所熟知。在一些实施例中，严格杂交条件(例如高度严格条件)包括在42℃下在包含以下各物的溶液中培养整夜：50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA；接着在约65℃下在0.1×SSC中洗涤过滤器。在一些实施例中，严格杂交条件(例如高度严格条件)包括在42℃下在包含以下各物的溶液中培养整夜：50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA；接着在约50℃下、在约55℃下、在约60℃下或在约65℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中或在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。在一些实施例中，所述高度严格条件包含在65℃下用0.1×SSC洗涤。在一些实施例中，所述高度严格条件包含在约50℃下、在约55℃下、在约60℃下或在约65℃下用0.1×SSC/0.1％SDS或用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤。
在一些实施例中，可在本发明方法中使用的GPCR为包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非内源性、组成性活化受体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置224处的白氨酸经除白氨酸外的氨基酸取代。在一些实施例中，除白氨酸外的氨基酸为赖氨酸。在一些实施例中，除白氨酸外的氨基酸为丙氨酸。在一些实施例中，除白氨酸外的氨基酸为精氨酸。在一些实施例中，除白氨酸外的氨基酸为组氨酸。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，本发明的GPCR包含具有SEQ ID NO：2的G蛋白偶合受体的组成性活性型式。在一些实施例中，受体的组成性活性型式为具有SEQ ID NO：2的内源性组成性活性型式。在一些实施例中，受体的组成性活性型式为具有位于SEQ ID NO：2的氨基酸位置224处的突变的非内源性组成性活性型式。在一些实施例中，突变的残基已突变成除白氨酸外的残基。在一些实施例中，突变的残基已突变成赖氨酸残基。在一些实施例中，突变的残基已突变成丙氨酸残基。在一些实施例中，突变的残基已突变成精氨酸残基。在一些实施例中，突变的残基已突变成组氨酸残基。在一些实施例中，组成性活性是用于增加细胞内cAMP的含量。在一些实施例中，组成性活性是用于使黑色素细胞经受色素分散。
在某些实施例中，本发明的GPCR与G蛋白形成融合蛋白的部分。
a.序列一致性
在某些实施例中，一致性百分数是使用基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool，“BLAST”)来评估，所述工具在此项技术中已为熟知的[参见例如卡林(Karlin)和欧裘尔(Altschul)，美国国家科学院汇刊(Proc Natl Acad Sci USA)(1990)87：2264-2268；欧裘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J Mol Biol)(1990)215：403-410；欧裘尔(Altschul)等人，自然遗传学(Nature Genetics)(1993)3：266-272；和欧裘尔(Altschul)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1997)25：3389-3402；其各自的揭示内容以引用的方式全部并入本文中]。BLAST程序可以默认参数或以使用者提供的经修改的参数使用。优选地，所述参数为默认参数。
在某些实施例中，用于确定查询序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸序列)与待询问序列之间的最优选全面匹配(也称作全域序列比对)的优选方法可使用基于不拉特赖哥(Brutlag)等人的演算法(应用生物科学计算(Comp App Biosci)(1990)6：237-245，其揭示内容是以引用的方式全部并入本文中)的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列与询问序列都为氨基酸序列。所述全域序列比对的结果为一致性百分数。在FASTDB氨基酸比对中所使用的优选参数为：矩阵＝PAM0，k元组(k-tuple)＝2，错配处罚＝1，连接处罚(joining penalty)＝20，随机化组＝25，长度＝0，截止分数＝1，窗口尺寸＝序列长度，空隙处罚＝5，空隙尺寸处罚＝0.05，窗口尺寸＝247或询问氨基酸序列的长度(取较短长度)。如果询问序列是由于N末端或C末端缺失，而非由于内部缺失而比查询序列短时，那么一致性百分数的结果必须手动校正，这是由于FASTDB程序在计算全域一致性百分数时并不说明询问序列的N末端与C末端截断。对于相对于查询序列在N末端和C末端处截断的询问序列，通过以查询序列的总碱基百分数形式计算并不与相应的询问序列残基匹配/对准、为询问序列的N末端和C末端的查询序列的残基数来校正一致性百分数。残基是否匹配/对准是由FASTDB序列比对的结果来确定。接着，自一致性百分数减去此百分数，由上述FASTDB程序使用指定参数来计算以得出最终一致性百分数计分。此最终一致性百分数计分为用于达成本发明目的的计分。为达成手动调整一致性百分数计分的目的，仅考虑并不与查询序列匹配/对准的询问序列的N末端和C末端的残基。即，仅查询询问序列的最远N末端和C末端残基以外的氨基酸残基。
举例来说，将90个氨基酸残基的询问序列与100个残基的查询序列对准以确定一致性百分数。缺失发生在询问序列的N末端处，且由此，FASTDB比对并不与N末端处的第一残基匹配/对准。10个不成对残基表示序列的10％(在N末端和C末端处不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因此自由FASTDB程序计算的一致性百分数计分减去10％。如果剩余90个残基完全匹配，那么最终一致性百分数将为90％。
在另一实例中，将90个残基的询问序列与100个残基的查询序列比较。此时缺失处于内部，因此在询问序列的N末端或C末端不存在与查询序列不匹配/不对准的残基。在此状况下，并不手动校正由FASTDB计算的一致性百分数。再次，手动校正如FASTDB比对所显示与查询序列不匹配/不对准、仅在本发明序列的N末端和C末端外部的残基位置。不需进行其他校正来达成本发明的目的。
b.融合蛋白
在某些实施例中，所关注的多肽为融合蛋白，且可含有(例如)亲和标记域或报道基因域。合适的亲和标记包括可特异性结合另一部分(通常为另一多肽，最通常为抗体)的任何氨基酸序列。合适的亲和标记包括抗原决定基标记，例如此项技术中已知的V5标记、FLAG标记、HA标记(来自血球凝集素流感病毒)、myc标记及其类似标记。合适的亲和标记还包括已知结合底物的域，例如此项技术中已知的HIS、GST和MBP标记；和可利用特异性结合搭配物(例如抗体，尤其单克隆抗体)的来自其他蛋白的域。合适的亲和标记还包括任何蛋白-蛋白相互作用域，诸如IgG Fc区，其可特异性结合合适的结合搭配物(例如IgG Fc受体)且可使用所述结合搭配物来侦测。明确预期所述融合蛋白可含有与GPCR同框融合的异源性N末端域(例如抗原决定基标记)，所述GPCR的N末端甲硫氨酸残基已缺失或经替代性氨基酸取代。
合适的报道基因域包括可报导多肽存在的任何域。尽管了解亲和标记可用于使用(例如)特异性结合标记的经标记的抗体来报导多肽的存在，但更常使用发光报道基因域。合适的发光报道基因域包括萤光素酶(来自(例如)萤火虫、弯喉萤(Vargula)、海三色堇(Renilla reniformis)或海洋微藻(Renilla muelleri))或其发光变异体。其他合适的报道基因域包括萤光蛋白(来自(例如)水母、珊瑚和其他腔肠动物，如来自多管水母属(Aequoria)、海肾属(Renilla)、海笔属(Ptilosarcus)、海鳃属(Stylatula)种的萤光蛋白)或其发光变异体。此等报道基因蛋白的发光变异体在此项技术中极为熟知且与原生报道基因蛋白相比可更亮、更暗或具有不同激发和/或发射光谱。举例来说，一些变异体已改变，使得其不再呈现绿色，且可呈现蓝色、青色、黄色、增强型黄色、红色(分别称作BFP、CFP、YFP、eYFP和RFP)或具有如此项技术中已知的其他发射光谱。其他合适的报道基因域包括可经由生物化学或颜色变化报导多肽存在的域，诸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰基转移酶和分泌型胚胎碱性磷酸酶。
另外，如此项技术中已知，亲和标记或报道基因域可存在于所关注的多肽中的任何位置处。然而，在多数实施例中，其存在于所关注的多肽的C末端或N末端处。
2.编码所关注的GPCR多肽的核酸
由于用于操纵核酸的遗传密码和重组技术为已知的且所关注的GPCR多肽的氨基酸序列如上所述，因此编码所关注的GPCR多肽的核酸的设计和产生完全处于技工的技术范围内。在某些实施例中，使用标准重组DNA技术(奥苏贝尔(Ausubel)等人，精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版，约翰威立国际出版公司(Wiley&Sons)，1995；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第2版，(1989)，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.))方法。举例来说，可使用无须在本文中描述的多种重组方法中的任一者或其组合，自GPCR编码序列的库分离GPCR编码序列。编码蛋白的核酸序列中的核苷酸的随后取代、缺失和/或添加也可使用标准重组DNA技术来完成。
举例来说，定位突变和亚克隆可用于在编码所关注的多肽的聚核苷酸中引入/删去/取代核酸残基。在其他实施例中，可使用PCR。编码所关注的多肽的核酸也可由化学合成完全自寡核苷酸制得(例如赛罗(Cello)等人，科学(Science)(2002)297：1016-8)。
在一些实施例中，使编码所关注的多肽的核酸的密码子最优化以在特定物种(尤其哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人类灵长类动物或人类物种)的细胞中表达。在一些实施例中，使编码所关注的多肽的核酸的密码子最优化以在特定物种(尤其两栖动物物种)的细胞中表达。
a.载体
本发明进一步提供包含本发明核酸的载体(也被称作“构筑体”)。在本发明的许多实施例中，在本发明核酸序列已可操作地连接表达控制序列(包括(例如)启动子)后，所述序列将在宿主中表达。本发明核酸还通常位于表达载体中，所述表达载体可以游离体形式或以宿主染色体DNA的主要部分的形式在宿主细胞中复制。通常，表达载体将含有选择标记(例如四环素或新霉素)以允许侦测用所要DNA序列转型的细胞(参见例如美国专利第4,704,362号，其是以引用的方式并入本文中)。载体(包括单表达盒载体和双表达盒载体)在此项技术中已为熟知的(奥苏贝尔(Ausubel)等人，精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版，约翰威立国际出版公司(Wiley&Sons)，1995；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第2版，(1989)，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.))。合适的载体包括病毒载体、质体、黏质体、人工染色体(人类人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等)、微型染色体及其类似物。可使用反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。
为达成在细胞中产生所关注的多肽的目的，多种表达载体可为所属领域的技术人员所用且包括市售表达载体(例如，来自Invitrogen，Carlsbad，CA；Clontech，Mountain View，CA；Stratagene，La Jolla，CA)。以非限制性实例说明，市售表达载体包括基于CMV启动子的载体。一种合适的表达载体为pCMV。表达载体可为腺病毒。例示性腺病毒载体可以AdEasyTM购自Qbiogene(Carlsbad，CA)(何(He)TC等人，美国国家科学院汇刊(Proc Natl Acad Sci USA)(1998)95：2509-2514；和美国专利第5,922,576号，其各自的揭示内容以引用的方式全部并入本文中)。其他合适的表达载体对所属领域的技术人员为显而易见的。
本发明核酸通常包含编码所关注的本发明多肽的单一开放阅读框架，然而，在某些实施例中，由于用于表达所关注的多肽的宿主细胞可为真核细胞(例如哺乳动物细胞，诸如人类细胞)，因此开放阅读框架可由内含子中断。本发明核酸通常为转录单位的部分，所述转录单位除本发明核酸以外还可含有3′和5′未转译区(UTR)，所述未转译区可引导RNA稳定性、转译效率等。本发明核酸也可为表达盒的部分，所述表达盒除本发明核酸以外还含有引导所关注的多肽的转录和表达的启动子和转录终止子。
真核启动子可为在真核宿主细胞中具功能性的任何启动子，包括病毒启动子和来源于真核基因的启动子。例示性真核启动子包括(但不限于)以下启动子：小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(哈默(Hamer)等人，分子应用期刊(J.Mol.Appl.Gen.)1：273-288，1982)；疱疹病毒的TK启动子(麦肯奈特(McKnight)，细胞(Cell)31：355-365，1982)；SV40早期启动子(贝诺亚(Benoist)等人，自然(Nature)(伦敦(London))290：304-310，1981)；酵母gall基因序列启动子(强森(Johnston)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79：6971-6975，1982；西佛(Silver)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))81：5951-59SS，1984)；CMV启动子；EF-1启动子；蜕皮激素反应性启动子；四环素反应性启动子；及其类似启动子。由于病毒启动子一般为尤其强的启动子，因此其特别受关注。在某些实施例中，所使用的启动子为靶病原体的启动子。选择用于本发明的启动子，使得其在所引入的细胞类型(和/或动物)中具功能性。在某些实施例中，启动子为CMV启动子。
在某些实施例中，本发明载体也可用于表达可选择标记。合适的载体和可选择标记在此项技术中已为熟知的且论述于奥苏贝尔(Ausubel)等人(精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版，约翰威立国际出版公司(Wiley&Sons)，1995)和萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆实验指南(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第3版(2001)，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.))中。多种不同基因已用作可选择标记，且为方便起见，首先选择在本发明载体中用作可选择标记的特定基因。已知的可选择标记基因包括：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因、CAD、腺苷脱氨酶基因、天冬酰胺合成酶基因、抗生素抗性基因(例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷磷酸转移酶基因))、潮霉素B磷酸转移酶基因及其类似基因。如上文所提及，所关注的多肽可为含有亲和域和/或报道基因域的融合蛋白。用于(例如)在GPCR的C末端或N末端处产生报道基因或标记与GPCR之间的融合的方法完全处于所属领域的技术人员的技术范围内(例如马克林(McLean)等人，分子药物与分子药理学(Mol.Pharma.Mol Pharmacol.)199956：1182-91；拉姆塞(Ramsay)等人，英国临床药理学杂志(Br.J.Pharmacology)2001，315-323)且将不再进一步描述。明确预期所述融合蛋白可含有与GPCR同框融合的异源性N末端域(例如抗原决定基标记)，所述GPCR的N末端甲硫氨酸残基已缺失或经替代性氨基酸取代。应了解，所关注的多肽可首先自原生多肽制得且接着可操作地连接如上所述的合适的报道基因/标记。
本发明核酸也可含有限制性位点、多克隆位点、引物结合位点、可连接端、重组位点等，通常为了有利于构筑编码所关注的多肽的核酸。
b.宿主细胞
本发明进一步提供包含载体的宿主细胞，所述载体包含本发明核酸。合适的宿主细胞包括原核细胞，例如细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))；以及真核细胞，例如动物细胞(例如昆虫、哺乳动物、鱼、两栖动物、鸟或爬行动物细胞)、植物细胞(例如玉米或芥菜(Arabidopsis)细胞)或真菌细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)。在某些实施例中，适于表达编码所关注的多肽的核酸的任何细胞都可用作宿主细胞。通常使用动物宿主细胞株，其实例如下：猴肾细胞(COS细胞)、由SV40转型的猴肾CVI细胞(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚胎肾细胞(HEK-293[＂293＂]，葛翰(Graham)等人，普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)36：59(1977))；HEK-293T[＂293T＂]细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))77：4216，(1980))；叙利亚(Syrian)金仓鼠细胞MCB3901(ATCC CRL-9595)；小鼠塞特利氏细胞(mouse sertoli cell)(TM4，马撒(Mather)，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人类肝细胞(hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马撒(Mather)等人，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)；和小鼠L细胞(ATCC CCL-1)。在某些实施例中，使用黑色素细胞。黑色素细胞为低等脊椎动物中所见的皮肤细胞。相关物质和方法将遵循美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号的揭示内容。此等专利揭示内容是以引用的方式全部并入本文中。
其他细胞株对所属领域的技术人员来说将变得显而易见，且多种细胞株可购自美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)。
C.筛选候选化合物
1.通用GPCR筛选检验技术
当G蛋白受体变得有活性时，其结合G蛋白(例如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)且刺激GTP与G蛋白的结合。接着，G蛋白充当GTPase且将GTP缓慢水解成GDP，由此在正常条件下受体变得失活。然而，活化受体继续使GDP变成GTP。GTP的不可水解类似物([35S]GTPγS)可用于监控与表达活化受体的膜的增强的结合。据报导，[35S]GTPγS可用于监控在配体存在与不存在的情况下与膜偶合的G蛋白。除众所熟知且可为所属领域的技术人员所用的实例以外，由Traynor和Nahorski在1995年报导此监控的实例。此检验系统的优选用途为用于初始筛选候选化合物，这是由于所述系统一般适用于所有G蛋白偶合受体，而不考虑与受体的细胞内域相互作用的特定G蛋白。
2.特异性GPCR筛选检验技术
在使用“通用”G蛋白偶合受体检验(即选择为促效剂或反向促效剂的化合物的检验)鉴定候选化合物后，在一些实施例中进一步筛选以确认在受体位点处已相互作用的化合物为优选的。举例来说，由“通用”检验所鉴定的化合物可能不结合受体，但可替代地仅使G蛋白自细胞内域“去偶合”。
a.Gs、Gz和Gi
Gs刺激酶腺苷酸环化酶。另一方面，Gi(和Gz和Go)抑制腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶催化ATP转化成cAMP；由此，与Gs蛋白偶合的经活化的GPCR与cAMP的细胞含量增加相关。另一方面，偶合Gi(或Gz、Go)蛋白的经活化的GPCR与cAMP的细胞含量下降相关。一般参见“突触传递的间接机理(Indirect Mechanisms of SynapticTransmission)”第8章，从神经元到脑(From Neuron To Brain)(第3版)，尼克尔斯(Nichols，J.G)等人编，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，侦测cAMP的检验可用于确定候选化合物是否为(例如)受体的反向促效剂(即，所述化合物会降低cAMP含量)。可利用用于测量cAMP的此项技术中已知的多种方法；在一些实施例中，优选方法依赖于使用呈基于ELISA的格式的抗-cAMP抗体。可利用的另一类型的检验为全细胞第二信使报道基因系统检验。基因上的启动子驱动特定基因编码的蛋白表达。环状AMP通过促进cAMP反应性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合来驱动基因表达，所述结合蛋白或转录因子接着在称作cAMP反应元件的特定位点处结合启动子且驱动基因表达。可构筑报道基因系统，其在报道基因基因(例如β-半乳糖苷酶或萤光素酶)之前具有含有多个cAMP反应元件的启动子。因此，经活化的Gs连接的受体使cAMP积聚，其接着活化基因和报道基因蛋白表达。接着，可使用标准生物化学检验(陈(chen)等人，1995)来侦测诸如β-半乳糖苷酶或萤光素酶的报道基因蛋白。
b.Go和Gq
Gq和Go与酶磷脂酶C的活化相关，其继而使磷脂PIP2水解，从而释放两种细胞内信使：二酰基甘油(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3积聚增加与Gq和Go相关的受体的活化相关。一般参见“突触传递的间接机理(Indirect Mechanisms of SynapticTransmission)”，第8章，从神经元到脑(From Neuron To Brain)(第3版)，尼克尔斯(Nichols，J.G.)等人编，Sinauer Associates，Inc.(1992)。侦测IP3积聚的检验可用于确定候选化合物是否为Gq或Go相关的受体的反向促效剂(即，所述化合物会降低IP3含量)。Gq相关的受体也可使用AP1报道基因检验来检测，其中Gq依赖性磷脂酶C使含有AP1元件的基因活化；因此，经活化的Gq相关的受体将显示所述基因的表达增加，由此其反向促效剂将显示所述表达下降，且促效剂将显示所述表达增加。用于所述侦测的市售检验为可用的。
3.GPCR融合蛋白
内源性、组成性活性GPCR或非内源性、组成性活性GPCR用于筛选候选化合物以直接鉴定反向促效剂或促效剂的用途提供令人关注的筛选前景，其中根据定义，受体甚至在与其结合的内源性配体不存在的情况下也具有活性。因此，为区分(例如)候选化合物存在的情况下的非内源性受体与所述化合物不存在的情况下的非内源性受体，其中所述区分的目的在于了解所述化合物是否可为反向促效剂或促效剂或对所述受体无影响，在一些实施例中优选利用可增强所述区分的方法。在一些实施例中，优选方法为使用GPCR融合蛋白。
一般来说，一旦使用上述检验技术(以及所属领域的技术人员已知的其他技术)确定非内源性GPCR已组成性活化，即可能确定与内源性GPCR偶合的主要G蛋白。G蛋白与GPCR的偶合提供可分析的信号转导路径。在一些实施例中，优选使用哺乳动物或黑色素细胞表达系统来进行筛选，这是由于将预期所述系统中具有内源性G蛋白。因此，根据定义，在所述系统中，非内源性、组成性活化的GPCR将连续发信号。在一些实施例中，优选为增强此信号，使得在(例如)受体的反向促效剂存在下，更有可能将能够(尤其)在筛选的情形下当受体与反向促效剂接触时更易于区分受体。
GPCR融合蛋白意欲增强与GPCR偶合的G蛋白的功效。GPCR融合蛋白对于使用内源性、组成性活性GPCR或非内源性、组成性活化的GPCR的筛选来说可为优选的，这是由于所述方法使在所述筛选技术中产生的信号增加。此在促进显著“信杂”比方面为重要的；所述显著比率对于如本文中所揭示的候选化合物的筛选来说为优选的。
构筑可用于表达GPCR融合蛋白的构筑体是在所属领域的技术人员的范围内。市售表达载体和系统提供可符合研究者的特定需要的多种方法。构筑所述GPCR融合蛋白构筑体的重要准则包括(但不限于)GPCR序列与G蛋白序列同框(优选地，内源性GPCR的序列在G蛋白序列的上游)，且GPCE的“终止”密码子缺失或经置换，使得在GPCR表达后也可表达G蛋白。GPCR可直接连接G蛋白，或在两者之间可存在间隔残基(尽管此数目可易于由所属领域的技术人员确定，但优选不大于约12个)。为方便起见，优选使用间隔基。在一些实施例中，优选为将在产生GPCR融合蛋白构筑体之前已鉴定与非内源性GPCR偶合的G蛋白。
如上所述，预期与Gi、Gz和Go偶合的经活化的GPCR抑制cAMP形成，使基于此等类型的GPCR的检验有前景(即，活化后cAMP信号减少，由此使直接鉴定促效剂(其会进一步减少此信号)有前景)。如将在本文中所揭示，已确定对于此等类型的受体来说，在致力于建立基于环化酶的可行检验中，可能产生并不基于GPCR的内源性G蛋白的GPCR融合蛋白。因此，举例来说，内源性Gi偶合受体可与Gs蛋白融合-所述融合构筑体在表达后“驱动”或“促使”内源性GPCR与(例如)Gs而非“天然”Gi蛋白偶合，使得可建立基于环化酶的检验。因此，对于Gi、Gz和Go偶合的受体来说，在一些实施例中优选为当使用GPCR融合蛋白且检验是基于侦测腺苷酸环化酶活性时，用Gs(或刺激酶腺苷酸环化酶形成的等效G蛋白)来建立融合构筑体。
表C
 
G蛋白 在GPCR活化(即组成性活化或促效剂结合)后对cAMP产生的影响 在GPCR活化(即组成性活化或促效剂结合)后对IP3积聚的影响       在与反向促效剂接触后对cAMP产生的影响     在与反向促效剂接触后对IP3积聚的影响
Gs 增加 N/A 减少 N/A
Gi 减少 N/A 增加 N/A
Gz 减少 N/A 增加 N/A
Go 减少 增加 增加 减少
Gq N/A 增加 N/A 减少
利用与Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合构筑体同样有效。在一些实施例中，优选融合构筑体可用Gq蛋白来达成，其中G蛋白α-亚单位(“Gαq”)的开始六(6)个氨基酸缺失且在Gαq的C末端处的最后五(5)个氨基酸经所关注的G蛋白的Gα的相应氨基酸置换。举例来说，融合构筑体可具有与Gi蛋白融合的Gq(6个氨基酸缺失)，从而产生“Gq/Gi融合构筑体”。此融合构筑体将促使内源性Gi偶合受体与其非内源性G蛋白(Gq)偶合，使得可替代cAMP产生来测量第二信使，例如三磷酸肌醇或二酰基甘油。
4.靶Gi偶合的GPCR与信号强化子Gs偶合的GPCR的共转染(基于cAMP的检验)
已知Gi偶合受体抑制腺苷酸环化酶且由此减少cAMP产生量，其可使cAMP含量的分析有前景。在某些实施例中，测量cAMP产生的减少作为主要偶合活化后Gi的受体活化的指示的有效技术可通过使例如主要偶合活化后Gs(例如TSHR-A623I，见下文)的非内源性、组成性活化的受体的信号强化子与Gi连接的GPCR共转染来达成。显而易见，可基于cAMP产生的增加来确定Gs偶合受体活化。Gi偶合受体活化使cAMP产生减少。因此，共转染方法意欲有利地利用此等“相反”影响。举例来说，非内源性、组成性活化的Gs偶合受体(“信号强化子”)与单独表达载体共转染提供基线cAMP信号(即，尽管Gi偶合受体将减少cAMP含量，此“减少”将与由组成性活化的Gs偶合信号强化子所建立的cAMP含量的实质增加相当)。通过接着使信号强化子与“靶受体”共转染，Gi偶合靶受体的反向促效剂将增加所测量的cAMP信号，而Gi偶合靶受体的促效剂将减少此信号。
使用此方法直接鉴定的候选化合物应独立地加以分析以确保此等候选化合物并不靶向信号强化受体(此可在针对经共转染的受体进行筛选之前或之后进行)。
组合物/调配物和治疗方法
GPR119促效剂可调配成使用此项技术中熟知的技术根据本发明来使用的医药组合物和药剂。适当的调配物视所选择的投药途径而定。在某些实施例中，所述投药是针对非人类脊椎动物或针对非人类哺乳动物。
与本发明的疗法有关，即与GPR119促效剂的疗法有关，本发明的组合物可以任何合适的方式来投与。合适的投药途径包括使用此项技术中已知的方法经口、经鼻、经直肠、经黏膜、经皮或肠内投药；非经肠传递，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、肺内(吸入式)或眼内注射。其他合适的投药途径为气溶胶和储槽式调配物。显然涵盖本发明的药剂的持续释放调配物、尤其储槽式调配物。在某些优选实施例中，经口投与本发明的化合物。本发明的化合物可以固体或液体形式制成，诸如片剂、胶囊、散剂、糖浆、酏剂及其类似物、气溶胶、无菌溶液、悬浮液或乳液，及其类似物。在某些实施例中，经口投与GPR119促效剂。
用于经口投与的调配物除固体片剂和胶囊调配物以外还可呈水性溶液和悬浮液的形式。水性溶液和悬浮液可自无菌散剂或颗粒来制备。可将化合物溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠和/或各种缓冲液中。其他佐剂在此项技术中熟知且广泛已知。
GPR119促效剂的医药组合物可由此项技术中熟知的方法来制备，例如借助于习知混合、溶解、粒化、制成糖衣药丸、水磨、乳化、囊封、陷入、冻干法或喷雾干燥来制备。
根据本发明使用的医药组合物可以习知方式使用一或多种包含赋形剂和助剂的生理学上可接受的载剂来调配，所述赋形剂和助剂有利于使活性化合物加工成可在医药学上使用的制剂。合适的医药学上可接受的载剂可为所属领域的技术人员所用(参见例如雷明顿：药物科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，(加纳索(Gennaro)等人编)，第20版，2000，Lippincott Williams&Wilkins；和药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(劳(Rowe)等人编)，第4版，2003，英国医药出版社(Pharmaceutical Press)；其各自的揭示内容以引用的方式全部并入本文中)。适当的调配物视所选择的投药途径而定。术语“载剂”物质或“赋形剂”物质在本文中意谓本身并非治疗剂的任何物质，其用作载剂和/或稀释剂和/或佐剂或媒剂以将治疗剂传递至受检者或添加到医药组合物中以改良其处理或储存特性或允许或有利于组合物的剂量单位形成适于经口投与的离散物品(诸如胶囊或片剂)。作为说明且并无限制，赋形剂可包括：稀释剂、崩解剂、黏合剂、黏着剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、助流剂、为遮蔽或中和不合意的口味或气味而添加的物质、香料、染料、芳香剂和为改良组合物外观而添加的物质。可接受的赋形剂包括：硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、阿拉伯胶(acacia gum)、海藻酸钠、果胶、糊精、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素物质(诸如烷酸的纤维素酯和纤维素烷酯)、低熔点蜡、可可脂或散剂、聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇和聚乙二醇)和其他医药学上可接受的物质。医药组合物的组份可经囊封或压片以便于投药。
医药学上可接受是指就药理学/毒物学观点来说可为患者所接受且就关于组合物、调配物、稳定性、患者接受性和生物可用性的物理/化学观点来说可为制造医药化学品所接受的特性和/或物质。
糖衣药丸核心具备合适的涂层。为达成此目的，可使用经浓缩的糖溶液，其可视情况含有阿拉伯胶(gum Arabic)、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯酸凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加到片剂或糖衣药丸涂层中以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可经口使用的医药组合物包括由明胶制成的配合插入胶囊，以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软密封明胶。配合插入胶囊可含有与填充剂(诸如乳糖)、黏合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)和视情况稳定剂混杂的活性成份。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于诸如脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇、十六醇聚氧乙烯醚、蒙克汀(capmul)、介质或长链甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的合适的液体中。也可将稳定剂添加到此等调配物中。
另外，可使用持续释放系统来传递GPR119促效剂。各种持续释放物质已经确立且为所属领域的技术人员所熟知。持续释放片剂或胶囊为尤其优选的。举例来说，可使用诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的延时物质。也可由美国专利第4,256,108号、第4,166,452号和第4,265,874号所述的技术来涂布剂型以形成用于受控释放的渗透性治疗片剂。
明确预期本发明的治疗剂，即与GPR19促效剂有关的治疗剂可单独或以与其他医药学上或生理学上可接受的化合物组合的形式来投与或提供。在本发明的一方面，其他医药学上或生理学上可接受的化合物不为GPR119促效剂。在本发明的一方面，其他医药学上或生理学上可接受的化合物是选自由以下各物组成的群组的医药剂：钙、维生素D、雌激素、替勃龙(tibolone)、选择性雌激素受体调节剂(SERM，例如雷诺昔酚(raloxifene)、他莫西芬(tamoxifen))、双膦酸盐(例如依替膦酸盐(etidronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、利塞膦酸盐(risedronate))、降血钙素、维生素D的1α-羟基化代谢物、氟化物、噻嗪、同化类固醇、依普黄酮(ipriflavone)、维生素K、甲状旁腺激素(PTH)、锶、士他汀(statin)、骨保护素、EP4受体选择性促效剂、大麻素受体2型(CB2)选择性促效剂和p38MAP激酶抑制剂。(参见例如世界卫生组织技术报告丛书(World Health Organization Technical Report Series)921(2003)，预防和管理骨质疏松症(Prevention and Management of Osteoporosis)。)
一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂或基本上由其组成的组合物。一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂和至少一种医药学上可接受的载剂或基本上由其组成的医药组合物。
一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂或基本上由其组成的组合物。一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂和至少一种医药学上可接受的载剂或基本上由其组成的医药组合物。本发明还涉及组合物的剂型或医药组合物的剂型，其中GPR119促效剂的量足以提供治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)和/或增加个体骨质量的作用。
一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂或基本上由其组成的组合物。一方面，本发明涉及一种包含一定量的本发明的GPR119促效剂和至少一种医药学上可接受的载剂或基本上由其组成的医药组合物。本发明还涉及组合物的剂型或医药组合物的剂型，其中GPR119促效剂的量足以提供增加个体GIP含量的作用。
适于在本发明中使用的医药组合物包括其中含有达成其所欲目的的量的活性成份的组合物。在一些实施例中，应了解，本发明的医药组合物可用于治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)或可用于增加个体骨质量。特征为低骨质量的病状是根据本发明。在一些实施例中，应了解，本发明的医药组合物可用于增加个体GIP含量。如与本发明有关，足以达成本发明的所欲目的的GPR119促效剂的量的确定(尤其)根据本文中所提供的详细揭示内容而完全在所属领域的技术人员的能力范围内。
自包括(但不限于)使用小鼠、大鼠、兔、猪和非人类灵长类动物的研究的动物研究所获得的资料可用于调配用于人类的剂量范围。一般来说，所属领域的技术人员应了解如何将动物模型系统中所获得的活体内资料外推至另一者(诸如人类)。在一些情况下，此等外推可仅基于动物模型与另一者(诸如人类)相比的重量；在其他情况下，此等外推并不简单基于重量而是将多种因素合并。代表性因素包括患者的类型、年龄、重量、性别、饮食和医学病况；疾病严重性；投药途径；药理学研究，诸如所使用的特定化合物的活性、功效、药物动力学和毒物学概况；是否利用药物传递系统；是否治疗急性或慢性疾病病况或进行预防；或是否除本发明的化合物以外还作为药物组合的部分投与其他活性化合物。用本发明的化合物和/或组合物治疗疾病病状的给药方案是根据如上所列的多种因素来选择。因此，所使用的实际给药方案可广泛变化且由此可能偏离优选给药方案，且所属领域的技术人员应了解，此等典型范围以外的剂量和给药方案可经测试且适当时可用于本发明的方法中。
例示性动物模型系统为大鼠卵巢切除(OVX)骨质流失模型。卵巢切除的大鼠为正确模拟雌激素缺乏的人类骨骼的重要临床特征和治疗剂的反应的极佳临床前动物模型。在此模型中，当部分或完全预防与卵巢切除相关的骨质流失时，达成治疗功效。(参见例如波拉格(Bollag)等人，分子与细胞内分泌学(Mol Cell Endocrinol)(2001)177：35-41；和杰(Jee)等人，J Musculoskel Neuron Interact(2001)1：193-207。)在某些实施例中，当至少约10％预防、至少约20％预防、至少约30％预防、至少约40％预防、至少约50％预防、至少约60％预防、至少约70％预防、至少约75％预防、至少约80％预防、至少约85％预防、至少约90％预防、至少约95％预防或100％预防与卵巢切除相关的骨质流失时，达成治疗功效。
另一例示性动物模型系统为在小鼠中葡萄糖筛查后血液GIP含量的增加。在某些实施例中，血液GIP含量为血浆GIP含量。在某些实施例中，GIP含量为葡萄糖非依赖性GIP含量。在某些实施例中，GIP含量为葡萄糖依赖性GIP含量。在某些实施例中，GIP为总GIP。在某些实施例中，使用中心或C末端定点检验来测量总GIP。在某些实施例中，GIP为生物活性GIP。在某些实施例中，使用N末端特异性检验来测量生物活性GIP。在某些实施例中，生物活性GIP对促进骨形成具有活性。在某些实施例中，当血液GIP含量增加至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或至少约500％时达成治疗功效。
可调整剂量和时间间隔以提供所欲的治疗作用。应了解，本发明的GPR119促效剂的精确剂量将视GPR119、其效能、投药模式、患者年龄和重量以及待治疗病状的严重性而改变。精确调配物、投药途径和剂量可由个别医师鉴于患者病状来选择。作为说明且并无限制，本发明的GPR119促效剂的量为小于约0.001mg/kg体重、小于约0.005mg/kg体重、小于约0.01mg/kg体重、小于约0.05mg/kg体重、小于约0.1mg/kg体重、小于约0.5mg/kg体重、小于约1mg/kg体重、小于约5mg/kg体重、小于约10mg/kg体重、小于约50mg/kg体重或小于约100mg/kg体重。在某些实施例中，本发明的GPR119促效剂的量为小于约0.001-100mg/kg体重、小于约0.001-50mg/kg体重、小于约0.001-10mg/kg体重、小于约0.001-5mg/kg体重、小于约0.001-1mg/kg体重、小于约0.001至0.5mg/kg体重、小于约0.001-0.1mg/kg体重、小于约0.001-0.05mg/kg体重、小于约0.001-0.01mg/kg体重或小于约0.001-0.005mg/kg体重。
可以每日或定期为基础来投与以达成所要结果的本发明的调节剂(例如GPR119促效剂)的量的优选剂量范围为0.1-100mg/kg体重。其他优选剂量范围为0.1-30mg/kg体重。其他优选剂量范围为0.1-10mg/kg体重。其他优选剂量范围为0.1-3.0mg/kg体重。当然，此等日剂量可在一日的过程中周期性地以少量传递或投与。应注意，此等剂量范围仅为优选范围且并不意欲限制本发明。
可个别调整剂量和时间间隔以提供达成所欲的治疗作用的本发明的GPR119促效剂的血浆水平。也可使用GPR119促效剂浓度的选定范围内的值来确定给药时间间隔以达成所欲的治疗作用。应使用对于10-90％的时间、优选30-99％之间的时间和最优选50-90％之间的时间使血浆水平维持在GPR119促效剂浓度的选定范围内的方案来投与GPR119促效剂。在局部投药或选择性吸收的状况下，提供所欲的治疗作用的GPR119促效剂浓度的范围可与血浆浓度无关。
当然，所投与的组合物的量将视所治疗的个体、个体重量、病痛严重性、投药方式和处方医师的判断而定。
一方面，因此本发明涉及一种治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)或增加骨质量的方法，所述方法包含将包含一定量的本发明的GPR119促效剂或基本上由其组成的治疗有效量的组合物投予有需要的个体。在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。
一方面，本发明涉及一种治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)或增加骨质量的方法，所述方法包含将包含一定量的本发明的GPR119促效剂或基本上由其组成的治疗有效量的组合物投予有需要的个体。在一相关方面，本发明涉及所述方法，其中GPR119促效剂是以足以提供增加个体GIP含量的作用的量来投与。在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。
本发明的疗法，即与GPR119促效剂有关的疗法可用于治疗或预防个体的特征为低骨质量的病状和增加个体骨质量。
特征为低骨质量的病状包括(但不限于)：骨质减少、骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨关节炎、牙周病、牙槽骨质流失、截骨术骨质流失、儿童特发性骨质流失、佩吉特氏病、由转移性癌症所引起的骨质流失、溶骨性破坏、脊柱弯曲和身高缩短。在某些实施例中，特征为低骨质量的病状为骨质疏松症。在某些实施例中，特征为低骨质量的病状为骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。特征为低骨质量的病状还包括(但不限于)：骨质疏松症的长期并发症，诸如脊柱弯曲、身高缩短和修复手术。应了解，特征为低骨质量的病状可个别或以任何组合包括在实施例中。在某些实施例中，特征为低骨质量的病状为原发性骨质疏松症。
在某些实施例中，需要增加骨质量的个体具有在年轻成年参考平均值以下大于1(T分数<-1)、大于或等于1.5(T分数≤-1.5)、大于或等于2(T分数≤-2)或大于或等于2.5(T分数≤-2.5)个标准差的骨密度(BMD)。在某些实施例中，需要增加骨量的个体有治疗骨折的需要。在某些实施例中，需要治疗骨折的个体患有创伤性骨折、长期骨折或骨质疏松性骨折。在某些实施例中，个体有治疗骨病的需要。在某些实施例中，需要治疗骨病的个体患有骨质减少、骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨关节炎、牙周病、牙槽骨质流失、截骨术骨质流失、儿童特发性骨质流失、佩吉特氏病、由转移性癌症所引起的骨质流失、溶骨性破坏、脊柱弯曲或身高缩短。在某些实施例中，需要治疗骨病的个体患有骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。可根据本发明来治疗的破坏性骨病包括(但不限于)：骨质疏松症、骨关节炎和溶骨性破坏(诸如由赘生性疾病、放射线疗法或化学疗法所引起的溶骨性破坏)。在某些实施例中，骨质疏松症为原发性骨质疏松症。在某些实施例中，骨质疏松症为继发性骨质疏松症。
本发明的疗法，即与GPR119促效剂有关的疗法另外可用于增强个体的面部修复、上颌骨修复、下颌骨修复、牙周病或拔牙后的骨愈合，增强个体长骨伸长，增强个体修复性向内生长和增加个体骨结合。
在某些实施例中，个体为脊椎动物。在某些实施例中，为脊椎动物的个体为鱼、两栖动物、爬行动物、鸟或哺乳动物。在某些实施例中，个体或脊椎动物为哺乳动物。在某些实施例中，为哺乳动物的个体或脊椎动物为小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、狗、猫、马、母牛、绵羊、山羊、非人类哺乳动物、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，人类为绝经后女性或50岁以上的男性。
在未进一步详述的情况下，咸信所属领域的技术人员可使用上述描述充分实施本发明。由于在本发明的范畴内的修改对所属领域的技术人员来说可变得显而易见，因此上述详细描述仅出于清楚理解而给出，且自其应了解无不必要的限制。
本申请案要求经由美国快递(U.S.Express Mail)由美国专利与商标局(United StatesPatent and Trademark Office)在指定日期提交的以下临时专利申请案的优先权：美国临时专利申请案第60/791,550号，在2006年4月11日提交。上述临时专利申请案的揭示内容是以引用的方式全部并入本文中。
贯穿本申请案，引用各种公开案、专利和专利申请案。本申请案中所参考的此等公开案、专利和专利申请案的揭示内容是以引用的方式全部并入本揭示案中。申请者在本文中引用公开案、专利或专利申请案并非申请者承认所述公开案、专利或专利申请案为先前技术。
实例
在未进一步详述的情况下，咸信所属领域的技术人员可利用上述描述充分实施本发明。以下详细实例仅被视作说明性的，且决不以任何方式限制上述揭示内容。所属领域的技术人员应即时了解所述程序的适当变更。
实例1：投与GPR119促效剂对野生型小鼠的血液GIP含量的影响的药效分析
A.使C57blk/6雄性小鼠禁食18小时，且随机分配成十四组，每组n＝6。如图1A所指示，将20mg/kg的媒剂(PET；80％ PEG400，10％乙醇，10％ Tween80)或20mg/kg的本发明的GPR119促效剂(化合物1；(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺)经口投予小鼠。处理后三十分钟，经口传递3g/kg的葡萄糖大丸剂，且在葡萄糖大丸剂传递后0(无葡萄糖大丸剂)、2、5、10、20、40和60分钟时收集血浆。通过使用购自Linco Research Laboratory的啮齿动物GIPELISA试剂盒[大鼠/小鼠抑胃多肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定血浆GIP含量。由图1A所示的结果可知，显然投与GPR119促效剂增加小鼠血液中的葡萄糖依赖性GIP含量与葡萄糖非依赖性GIP含量。化合物1刺激小鼠的血浆总GIP。化合物1与国际专利申请案第PCT/US2004/001267号(以WO2004/065380公开)所揭示的化合物相同。
B.使C57b1k/6雄性小鼠禁食18小时，且随机分配成十四组，每组n＝6。如图1B所指示，将10mg/kg的媒剂(20％羟丙基-β-环糊精(HPCD))或10mg/kg的本发明的GPR119促效剂(化合物3)经口投予小鼠。处理后三十分钟，经口传递3g/kg的葡萄糖大丸剂，且在葡萄糖大丸剂传递后0(无葡萄糖大丸剂)、5、10、20、60和120分钟时收集血浆。通过使用购自Linco Research Laboratory的啮齿动物GIP ELISA试剂盒[大鼠/小鼠抑胃多肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定血浆GIP含量。使用Excel程序进行统计分析。基于每组六只小鼠的结果计算GIP浓度的平均值且展示为平均值±SEM。由图1B所示的结果可知，显然投与GPR119促效剂增加小鼠血液中的葡萄糖依赖性GIP含量与葡萄糖非依赖性GIP含量。化合物3刺激小鼠的血浆总GIP。化合物3与国际专利申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 2005/007647公开)所揭示的化合物相同。
C.使C57b1k/6雄性小鼠禁食18小时，且随机分配成十四组，每组n＝6。将1、3或10mg/kg的媒剂(20％羟丙基-β-环糊精(HPCD))或1、3或10mg/kg的本发明的GPR119促效剂(化合物3)经口投予小鼠。处理后三十分钟，经口传递3g/kg的葡萄糖大丸剂，且在葡萄糖大丸剂传递后0(无葡萄糖大丸剂)或5分钟时收集血浆。通过使用购自LincoResearch Laboratory的啮齿动物GIP ELISA试剂盒[大鼠/小鼠抑胃肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定血浆GIP含量。使用Excel程序进行统计分析。基于每组六只小鼠的结果计算GIP浓度的平均值且展示于图1C中。由图1C可知，显然GPR119促效剂(化合物3)以剂量依赖性方式刺激小鼠的血浆总GIP。化合物3与国际专利申请案第PCT/US2004/022327号(以WO 2005/007647公开)所揭示的化合物相同。
实例2：与野生型小鼠相比，投与GPR119促效剂对GPR119缺失(基因剔除)小鼠的血液GIP含量的影响
A.使GPR119缺失的雄性小鼠和野生型同窝出生仔禁食18小时。如所指示(n＝5)，将20mg/kg的媒剂(PET；80％ PEG400，10％乙醇，10％ Tween80)或20mg/kg的本发明的GPR119促效剂(化合物1；(2-氟-4-甲烷磺酰基-苯基)-{6-[4-(3-异丙基-[1，2，4]恶二唑-5-基)-哌啶-1-基]-5-硝基-嘧啶-4-基}-胺)经口投予小鼠。处理后三十分钟，(时间：0)经由眼睛的后眼眶静脉收集血液(100微升)，接着投与3g/kg的葡萄糖大丸剂(经口)。传递葡萄糖后五分钟，(时间：5分钟)收集另一血样(100微升)。离心后收集血浆且通过使用购自Linco Research Laboratory的啮齿动物GIP ELISA试剂盒[大鼠/小鼠抑胃多肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定GIP含量。由图2A所示的结果可知，显然由于所投与的GPR119促效剂增加小鼠血液中的葡萄糖非依赖性GIP含量和葡萄糖依赖性GIP含量，因此功能性GPR119受体为必需的。化合物1刺激野生型小鼠的血浆总GIP。化合物1与国际专利申请案第PCT/US2004/001267号(以WO 2004/065380公开)所揭示的化合物相同。
B.使GPR119缺失的雄性小鼠和野生型同窝出生仔禁食18小时。如所指示(n＝5)，将30mg/kg的媒剂(40％羟丙基-β-环糊精(HPCD))或30mg/kg的本发明的GPR119促效剂(化合物2)经口投予小鼠。处理后三十分钟，(时间：0)经眼睛的后眼眶静脉收集血液(100微升)，接着投与3g/kg的葡萄糖大丸剂(经口)。传递葡萄糖后五分钟，(时间：5分钟)收集另一血样(100微升)。离心后收集血浆且通过使用购自Linco ResearchLaboratory的啮齿动物GIP ELISA试剂盒[大鼠/小鼠抑胃多肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定GIP含量。基于每组五只小鼠的结果来计算GIP浓度的平均值。由图2B所示的结果可知，显然由于所投与的GPR119促效剂增加小鼠血液中的葡萄糖非依赖性GIP含量和葡萄糖依赖性GIP含量，因此功能性GPR119受体为必需的。化合物2刺激野生型小鼠的血浆总GIP。化合物2与国际专利申请案第PCT/US2004/022417号(以WO 2005/007658公开)所揭示的化合物相同。
实例3：投与GPR119促效剂对卵巢切除的大鼠的骨质量的影响
使用下述活体内卵巢切除(OVX)的大鼠模型，可显示本发明的GPR119促效剂有效治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)和/或增加个体骨质量(参见例如波拉格(Bollag)等人，分子与细胞内分泌学(Mol Cell Endocrinol)(2001)177：35-41)。
20只未交配雌性OVX和20只未交配非OVX Sprague-Dawley大鼠(150-175g)(年龄8周)是购自Harlan Sprague-Dawley，Inc.(Indianapolis，IN)。随意喂给动物正常的市售小球状膳食，Teklab啮齿动物膳食(1.46％钙)，自由进水。将大鼠随机分成四个重量匹配型实验组且经选择以经口接受媒剂或本发明的GPR119促效剂。以每日为基础持续处理6周。
1.对照.将媒剂经口投予十只非OVX大鼠。
2.对照+处理.将GPR119经口投予十只非OVX大鼠。
3.OVX.将媒剂经口投予十只OVX大鼠。
4.OVX+处理.将GPR119经口投予十只OVX大鼠。
在基线时对大鼠每日称重且测量长度，且在6周时再次如此。在治疗开始之前和在6周时，对所有动物进行使用Hologic QDR 1000/W(Waltham，MA)的双能X射线吸收测定法(DXA)，且使用软件大鼠整体(Rat Whole Body)版本5.53来分析资料。在脊柱处测定骨密度(BMD)。
确定处理6周后脊椎骨密度的变化百分数。显示投与GPR119促效剂削弱卵巢切除对脊椎骨密度的负面影响。卵巢切除对脊椎骨密度的负面影响的削弱指示所述处理有效治疗或预防特征为低骨质量的病状(诸如骨质疏松症)和/或增加个体骨质量。
实例4：投与GPR119促效剂对骨折愈合的影响
使用下述活体内检验，可显示本发明的GPR119促效剂有效治疗骨折。
骨折技术
用氯胺酮(Ketamine)使3月龄的Sprague-Dawley大鼠麻醉。在右胫骨或股骨的近端部分的前内侧上产生1cm切口。以下描述胫骨手术技术。完成切口直到骨骼，且钻出1mm孔，使胫骨粗隆的近侧到远侧为4mm，内侧到前脊2mm。用0.8mm不锈钢管(在与骨相同的条件下测试，最大负荷36.3N，最大硬度61.8N/mm)进行骨髓腔内插钉术(intramedullary nailing)。不进行髓管铰孔。使用具有钝钳口的经特别设计的可调节钳子，由三点弯曲在胫腓接合处上方2mm产生标准闭合性骨折。为使软组织损伤最小，应小心不使骨折移位。用单丝尼龙缝合线使皮肤闭合。在无菌条件下进行手术。插钉术后立即获取所有骨折的放射线照片，且排除在指定骨干区域外部患有骨折或具有移位的钉的大鼠。将剩余动物随机分成以下各组，对每个小组10-12只动物在每个时间点测试骨折愈合。以每日为基础，用媒剂或用GPR119促效剂经口投予大鼠。GPR119促效剂是以0.001mg/kg体重与100mg/kg体重之间的量使用。持续处理10、20、40和80天。
在10、20、40和80天时，用氯胺酮使来自每组的10-12只大鼠麻醉且通过放血使其死亡。通过解剖移除胫腓骨且剥去所有软组织。将来自每组5-6只大鼠的骨骼储存于70％乙醇中以用于组织学分析，且将来自每组另外5-6只大鼠的骨骼储存于缓冲林格氏溶液(buffered Ringer′s solution)(+4℃，pH7.4)中以用于放射线照相和所进行的生物机械学测试。
组织学分析
用于骨折骨骼的组织学分析的方法先前已由Mosekilde和Bak(Bone(1993)14：19-27)公开。简单来说，将骨折部位锯开8mm直到骨折线的每一侧，未脱钙包埋于甲基丙烯酸甲酯中，且在8μm厚的Reichert-Jung Polycut切片机上切割额状切片(frontals section)。使用经Masson-Trichome染色的正中额状切片(mid-frontal section)(包括胫骨与腓骨)来观测在有或无处理的情况下对骨折愈合的细胞和组织回应。使用经天狼星红(Sirius red)染色的切片来证明骨痂结构的特征且区分骨折部位处的织网骨与板层骨。进行以下测量：(1)骨折间隙-测量为骨折的皮层骨端之间的最短距离，(2)骨痂长度和骨痂直径，(3)骨痂的全骨大面积，(4)骨痂区域内部单位组织面积的骨组织，(5)骨痂中的纤维组织，和(6)骨痂中的软骨面积。
生物机械学分析
用于生物机械学分析的方法先前已由巴克(Bak)和安德烈森(Andreassen)(CalcifTissue Int(1989)45：292-297)公开。简单来说，在生物机械学测试之前获取所有骨折的放射线照片。由破坏性三点或四点弯曲程序来分析愈合骨折的机械特性。测定最大负荷、硬度、最大负荷下的能量、最大负荷下的挠曲和最大应力。
实例5
内源性人类GPR119的全长克隆
编码内源性人类GPR119的聚核苷酸是通过PCR使用以下GPR119特异性引物：
5′-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3′(SEQ ID NO：3；有义股，ATG作为起始密码子)
5′-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3′(SEQ ID NO：4；反义股，3′为终止密码子)
和人类基因组DNA作为模板来克隆。使用TaqPlus PrecisionTM DNA聚合酶(Stratagene)，由以下循环将步骤2至步骤4重复35次来进行扩增：
94℃，3分钟；94℃，1分钟；58℃，1分钟；72℃，2分钟；72℃，10分钟。
将预测尺寸的1.0Kb PCR片段分离且克隆到pCRII-TOPOTM载体(Invitrogen)中且使用T7DNA定序酶试剂盒(Amersham)来完全定序。参见核酸序列的SEQ ID NO：1和经推导的氨基酸序列的SEQ ID NO：2。
实例6
受体表达
尽管G蛋白偶合受体的表达技术可使用多种细胞，但最优选为利用真核细胞。在某些实施例中，利用哺乳动物细胞或黑色素细胞。以下为说明性的；咸信所属领域的技术人员能确定对技工的需要来说优先有利的技术。参见例如以下实例9，其涉及黑色素细胞。
a.瞬时转染
第1天，涂布6×106个293细胞/10cm培养皿。第2天，制备两个反应管(每一管所遵循的比例是根据涂布)：管A是通过在0.5ml无血清DMEM(Gibco BRL)中混合4μg DNA(例如pCMV载体，具有受体cDNA的pCMV载体，等)来制备；管B是通过在0.5ml无血清DMEM中混合24μl脂质转染剂(lipofectamine)(Gibco BRL)来制备。通过倒置(数次)来混杂管A和B，接着在室温下培养30-45min。混杂物是指“转染混合物”。将经涂布的293细胞用1×PBS洗涤，接着添加5ml无血清DMEM。将1ml转染混合物添加到细胞中，接着在37℃/5％CO2下培养4小时。通过吸出移除转染混合物，接着添加10ml DMEM/10％胎牛血清。在37℃/5％CO2下培养细胞。培养48小时后，将细胞收集且用于分析。
b.稳定细胞株
将约12×106个293细胞涂布于15cm组织培养盘上。在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培养基中生长。涂布293细胞后24小时(或达约80％融合)，使用12μgDNA(例如具有受体cDNA的pCMV-neor载体)转染细胞。将12μgDNA与60μl脂质转染剂和2ml无血清DME高葡萄糖培养基组合。自培养盘吸出培养基且将细胞用无血清培养基洗涤一次。将DNA、脂质转染剂和培养基混合物连同10ml无血清培养基一起添加到培养盘中。在37℃下培养四至五小时后，吸出培养基且添加25ml含血清培养基。转染后24小时，再次吸出培养基，且添加新鲜含血清培养基。转染后48小时，吸出培养基且添加含有遗传霉素(G418药物)的含血清培养基，将最终浓度的约12×106个293细胞涂布于15cm组织培养盘上。在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培养基中生长。涂布293细胞后24小时(或达到约80％融合)，使用12μgDNA(例如具有受体cDNA的pCMV载体)转染细胞。将12μgDNA与60μl脂质转染剂和2ml无血清DME高葡萄糖培养基组合。自培养盘吸出培养基且将细胞用无血清培养基洗涤一次。将DNA、脂质转染剂和培养基混合物连同10ml无血清培养基一起添加到培养盘中。在37℃下培养四至五小时后，吸出培养基且添加25ml含血清培养基。转染后24小时，再次吸出培养基，且添加新鲜含血清培养基。转染后48小时，吸出培养基且以500μg/ml的最终浓度添加含有遗传霉素(G418药物)的含血清培养基。现在，经转染的细胞经受对含有G418抗性基因的经阳性转染的细胞的选择。每隔四至五天，当选择发生时更换培养基。选择期间，使细胞生长以产生稳定汇集，或使其分裂以用于稳定克隆选择。
实例7
用于筛选作为(例如)GPR119促效剂的候选化合物的检验
多种方法可用于筛选作为(例如)GPR119促效剂的候选化合物。以下为说明性的；咸信所属领域的技术人员能确定对技工的需要来说优先有利的技术。用于筛选作为G蛋白偶合受体的促效剂的化合物的检验为所属领域的技术人员所熟知(参见例如国际申请案WO 02/42461)。
1.膜结合检验：[35S]GTPγS检验
当由于配体结合或组成性活化使得G蛋白偶合受体处于其活性状态时，受体与G蛋白偶合且刺激释放GDP及随后使GTP与G蛋白结合。G蛋白受体复合物的α亚单位充当GTPase且使GTP缓慢水解成GDP，此时通常使受体失活。经活化的受体继续使GDP变成GTP。不可水解GTP类似物([35S]GTPγS)可用于证明[35S]GTPγS与表达经活化受体的膜的结合增强。使用[35S]GTPγS结合测量活化的优势在于：(a)其一般适用于G蛋白偶合受体；(b)其最接近膜表面，使得极少可能采集影响细胞内级联的分子。
所述检验利用G蛋白偶合受体刺激[35S]GTPγS与表达相关受体的膜结合的能力。检验为通用的且适用于所有G蛋白偶合受体的药物传递。
膜制备
在一些实施例中，包含本发明的G蛋白偶合受体且用于鉴定作为(例如)受体促效剂的候选化合物的膜优选如下制备：
a.物质
“刮膜缓冲液”包含20mM HEPES和10mM EDTA，pH7.4；“膜洗涤缓冲液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA，pH7.4；“结合缓冲液”包含20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl2，pH7.4。
b.程序
在整个程序中，将所有物质保持于冰上。首先，自细胞的汇合单层吸出培养基，接着用10ml冷PBS冲洗，接着吸出。其后，添加5ml刮膜缓冲液以刮细胞；接着将细胞提取物转移到50ml离心管中(在4℃下以20,000rpm离心17分钟)。其后，吸出上清液且将小球再悬浮于30ml膜洗涤缓冲液中，接着在4℃下以20,000rpm离心17分钟。接着吸出上清液且将小球再悬浮于结合缓冲液中。接着使用Brinkman PolytronTM均化器使其均化(15-20秒脉冲直到所有物质处于悬浮状态)。此在本文中是指“膜蛋白”。
Bradford蛋白检验
均化后，膜的蛋白浓度将使用Bradford蛋白检验来测定(可将蛋白稀释到约1.5mg/ml，等分且冷冻(-80℃)以用于稍后使用；冷冻时，使用方案如下：检验当天，在室温下使经冷冻的膜蛋白解冻，接着涡旋，且接着用Polytron以约12×1,000rpm均化约5-10秒；应注意对于多种制剂来说，在均化不同制剂之间应彻底清洁均化器)。
a.物质
按照制造商说明书(Biorad，目录号500-0006)，将利用结合缓冲液(如上)、Bradford染料试剂、Bradford蛋白标准品。
b.程序
制备两个管，一个管包括膜，且一个管作为对照“空白”。每一管含有800μl结合缓冲液。其后，将10μl Bradford蛋白标准品(1mg/ml)添加到每一管中，且接着将10μl膜蛋白添加到仅一个管(非空白)中。其后，将200μl Bradford染料试剂添加到每一管中，接着使每一管涡旋。五(5)分钟后，使所述管反涡旋且将其中的物质转移到比色管中。接着使用CECIL3041分光光度计在波长595处读取比色管。
鉴定检验
a.物质
GDP缓冲液由37.5ml结合缓冲液和2mg GDP(Sigma，目录号G-7127)组成，接着在结合缓冲液中进行一系列稀释以获得0.2μM GDP(每一孔中GDP的最终浓度为0.1μM GDP)；包含候选化合物的每一孔具有200μl的最终体积，其由100μl GDP缓冲液(最终浓度为0.1μM GDP)、在结合缓冲液中的50μl膜蛋白和在结合缓冲液中的50μl[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml结合缓冲液2.5μl[35S]GTPγS)组成。
b.程序
优选将使用96孔培养盘格式来筛选候选化合物(此等候选化合物可在-80℃下冷冻)。将膜蛋白(或具有表达载体而不包括靶GPCR的膜，作为对照物)简单均化直到处于悬浮状态。接着将使用上文所陈述的Bradford蛋白检验来测定蛋白浓度。接着，将膜蛋白(和对照物)在结合缓冲液(最终检验浓度为12.5微克/孔)中稀释到0.25mg/ml。其后，将100μl GDP缓冲液添加到Wallac ScintistripTM(Wallac)的每一孔中。接着使用5μl针具将5μl候选化合物转移到所述孔中(即，200μl总检验体积中的5μl为1:40的比率，使得候选化合物的最终筛选浓度为10μM)。此外，为避免污染，在每个转移步骤后，应将针具在包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×)的三个储集器中冲洗-应将过量液体自工具震落且用纸和擦拭纸(kimwipe)干燥。其后，将50μl膜蛋白添加到每一孔中(亦利用包含膜而无靶GPCR的对照孔)，且在室温下预培养5-10分钟。其后，将结合缓冲液中的50μl[35S]GTPγS(0.6nM)添加到每一孔中，接着在室温下在震荡器上培养60分钟(此外，在此实例中，用箔覆盖培养盘)。接着，在22℃下通过使培养盘以4000RPM旋转15分钟来终止检验。接着在Wallac1450上使用设定“第37号方案”读取培养盘(按照制造商说明书)。
2.腺苷酸环化酶检验
经设计用于基于细胞的检验的Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New EnglandNuclear，目录号SMP004A)可经修改以与粗质膜一起使用。Flash Plate孔可含有闪烁体涂层，所述闪烁体涂层还含有识别cAMP的特异性抗体。所述孔中所产生的cAMP可由放射性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合的直接竞争来定量。以下充当用于测量表达受体的细胞中cAMP含量变化的简要方案。
在某些实施例中，经修改的Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New EnglandNuclear，目录号SMP004A)是用于根据以下方案鉴定作为(例如)GPR119促效剂的候选化合物。
转染后约三日，收集经本发明的G蛋白偶合受体转染的细胞。通过在含有20mMHEPES(pH7.4)和10mM MgCl2的缓冲液中均化经悬浮的细胞来制备膜。使用BrinkmanPolytronTM在冰上进行均化历时约10秒。在4℃下使所得均浆以49,000×g离心15分钟。接着将所得小球再悬浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和0.1mM EDTA的缓冲液中，均化10秒，接着在4℃下以49,000×g离心15分钟。接着将所得小球储存于-80℃下直到利用。直接鉴定筛选当天，将膜小球在室温下缓慢解冻，再悬浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mM MgCl2的缓冲液中，以得到0.60mg/ml的最终蛋白浓度(将再悬浮的膜放置到冰上直到使用)。
根据制造商说明书，制备且维持cAMP标准品及侦测缓冲液(包含2μCi示踪剂([125I]cAMP(100μl)至11ml侦测缓冲液))。新鲜制备检验缓冲液以用于筛选且其含有20mM HEPES(pH7.4)、10mM MgCl2、20mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1单位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；接着，将检验缓冲液储存于冰上直到利用。
优选将候选化合物连同40μl膜蛋白(30微克/孔)和50μl检验缓冲液一起添加到(例如)96孔培养盘孔中(3微升/孔，12μM最终检验浓度)。接着，在温和震荡下将此混杂物在室温下培养30分钟。
培养后，将100μl侦测缓冲液添加到每一孔中，接着培养2-24小时。接着使用“第31号方案”在Wallac MicroBetaTM培养盘读取器中对培养盘计数(按照制造商说明书)。
3.CRE-Luc报道基因检验
将293和293T细胞以2×104个细胞/孔的密度涂布于96孔培养盘上且次日，根据制造商说明书使用脂质转染剂试剂(BRL)转染。对于每6孔转染，如下制备DNA/脂质混合物：将100μl DMEM中的260ng质体DNA与100μl DMEM中的2μl脂质缓慢混合(260ng质体DNA由200ng 8×CRE-Luc报道基因质体、包含本发明的G蛋白偶合受体的50ng pCMV或单独pCMV和10ng GPRS表达质体(于pcDNA3中的GPRS(Invitrogen))组成)。如下制备8×CRE-Luc报道基因质体：通过在pβgal-Basic载体(Clontech)中在BglV-HindIII位点处克隆大鼠生长抑素启动子(-71/+51)来获得载体SRIF-β-gal。由来自腺病毒模板AdpCF126CCRE8的PCR获得cAMP反应元件的八(8)个复本[参见铃木(Suzuki)等人，人类基因治疗(Hum Gene Ther)(1996)7：1883-1893，其揭示内容是以引用的方式全部并入本文中]，且在Kpn-BglV位点处克隆到SRIF-β-gal载体中，从而产生8×CRE-β-gal报道基因载体。通过用在HindIII-BamHI位点处自pGL3-basic载体(Promega)获得的萤光素酶基因置换8×CRE-β-gal报道基因载体中的β-半乳糖苷酶基因来产生8×CRE-Luc报道基因质体。在室温下培养30min后，用400μlDMEM稀释DNA/脂质混合物且将100μl经稀释的混合物添加到每一孔中。在细胞培养恒温箱中培养4小时后，将具有10％FCS的100μl DMEM添加到每一孔中。次日，将经转染的细胞与具有10％FCS的200微升/孔的DMEM交换。八(8)小时后，在用PBS洗涤一次后，将孔换成100微升/孔的无酚红DMEM。次日，使用LucLiteTM报道基因基因检验试剂盒(Packard)，按照制造商说明书测量萤光素酶活性且在1450MicroBetaTM闪烁和发光计数器(Wallac)上读取。
实例8：对于(例如)GPR119促效剂活性的全细胞腺苷酸环化酶检验
环状AMP测量是根据供应商方案用Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(NewEngland Nuclear)来完成。将HEK293细胞以12×106个细胞/培养皿涂布于规则生长培养基(DMEM/10％ FBS)中的15-cm组织培养皿中。次日，根据制造商方案用脂质转染剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)将10μg空载体DNA或表达质体DNA转染到细胞中。培养24小时后，将经转染的细胞收集于GIBCO细胞解离缓冲液(目录号13151-014)中，通过以1,100rpm离心5分钟来粒化，且小心地再悬浮于适当体积的检验缓冲液(50％1×PBS和50％萤光放射增强缓冲液)中以得到2×106个细胞/毫升的最终细胞计数。如指示，在所要检验浓度的50μl检验缓冲液中制备测试化合物，且用移液管移到96孔FlashPlate的孔中。接着添加上文所制备的细胞悬浮液(50微升/孔)。在室温下60分钟的培养时间后，接着将含有示踪剂[125I]-cAMP的100μl侦测混合物添加到孔中。将培养盘再培养2小时，接着在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。cAMP/孔的值自每一检验培养盘所包括的标准cAMP曲线外推而得。
经GPR119转染的HEK293细胞中cAMP含量的增加高于经空载体转染的HEK293细胞中cAMP含量的增加指示测试化合物为刺激GPR119受体功能性的化合物。
实例9：对于(例如)GPR119促效剂活性的黑色素细胞检验
如由普腾查(Potenza)等人[色素细胞研究(Pigment Cell Research)(1992)5：372-378]报导，将黑色素细胞维持于培养物中，且使用电穿孔以编码GPR119受体(GPR119；例如
Figure G2007800127142D00841
保存编号AAP72125的人类GPR119及其等位基因)的表达载体转染。电穿孔后，将经转染的细胞涂布于96孔培养盘中以用于检验。接着使细胞生长48小时以自电穿孔程序回收并达到最大受体表达量。
检验当天，用含有10nM褪黑激素的无血清缓冲液更换细胞的生长培养基。褪黑激素经由黑色素细胞中的内源性Gi偶合GPCR起作用以降低细胞内cAMP含量。回应cAMP含量降低，黑色素细胞将其颜料移到细胞中心。其净效应为在600-650nM处所测量的孔中细胞单层的吸光度读数显著降低。
在褪黑激素中培养1小时后，细胞变成完全颜料聚集的。此时，收集基线吸光度读数。接着，将连续稀释的测试化合物添加到培养盘中，且具有GPR119促效剂活性的化合物引起细胞内cAMP含量增加。回应此等cAMP含量增加，黑色素细胞将其颜料移回细胞周边。1小时后，经刺激的细胞为完全颜料分散的。处于分散状态的细胞单层在600-650nm范围内吸收更多光。与基线读数相比，所测量的吸光度增加使得定量受体刺激的程度且绘制剂量回应曲线。
关于黑色素细胞检验的物质和方法见于美国专利第5,462,856号和第6，051,386号中，其各自的揭示内容是以引用的方式全部并入本文中。
经GPR119转染的黑色素细胞中颜料分散的增加高于经空载体转染的黑色素细胞中颜料分散的增加指示测试化合物为刺激GPR119受体功能性的化合物。
用于鉴定作为GPR119促效剂的化合物的其他检验将对所属领域的技术人员显而易见(参见例如上文实例7)。
实例10：对于(例如)GPR119促效剂活性的酵母报道基因检验
基于酵母细胞的报道基因检验先前已描述于文献中(例如，参见米瑞特(Miret)等人，生物化学杂志(J Biol Chem)(2002)277：6881-6887；卡姆拜(Campbell)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Lett)(1999)9：2413-2418；金(King)等人，科学(Science)(1990)250：121-123；WO 99/14344；WO 00/12704；和US6,100,042)。简单来说，酵母细胞已经工程化使得内源性酵母G-α(GPA1)已缺失且经使用多种技术构筑的G蛋白嵌合体置换。另外，内源性酵母α细胞GPCR(Ste3)已缺失以使得同源表达所选择的哺乳动物GPCR。在酵母中，保存于真核细胞中的信息素信号转导路径(例如经有丝分裂原活化的蛋白激酶路径)的元件驱动Fusl的表达。通过将β-半乳糖苷酶(LacZ)放置于Fusl启动子(Fuslp)控制下，已使系统发展，由此受体活化产生酶读数。
通过修改由Agatep等人(Agatep等人，1998，Transformation of Saccharomycescerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol(LiAc/ss-DNA/PEG)protocol.Technical Tips Online，Trends Journals，Elsevier)所述的乙酸锂方法使酵母细胞转型。简单来说，使酵母细胞在酵母胰蛋白胨培养盘(YT)上生长整夜。将酵母表达载体(2μg复制源)和乙酸锂/聚乙二醇/TE缓冲液中的载体单股DNA(10μg)、各2μg的两种Fuslp-LacZ报道基因质体(一者具有URA选择标记且一者具有TRP)、2μgGPR119(例如人类受体)用移液管移到Eppendorf管中。含有受体的酵母表达质体/无受体对照具有LEU标记。将酵母细胞接种到此混合物中且反应在30℃下进行60min。接着使酵母细胞在42℃下热休克15min。接着将细胞洗涤且展布于选择培养盘上。选择培养盘为不含LEU、URA和TRP(SD-LUT)的合成界定的酵母培养基。在30℃下培养2-3天后，接着在LacZ检验中测试在选择培养盘上生长的群落。
为进行对β-半乳糖苷酶的萤光酶检验，使载运本发明GPR119受体的酵母细胞在液体SD-LUT培养基中生长整夜直到不饱和浓度(即，细胞仍分开且尚未到达生长停滞期)。将其在新鲜培养基中稀释到最优选检验浓度且将90μl酵母细胞添加到96孔黑聚苯乙烯培养盘(Costar)中。将溶解于DMSO中且在10％DMSO溶液中稀释到10×浓度的测试化合物添加到培养盘中，且将培养盘在30℃下放置4h。4h后，将β-半乳糖苷酶的底物添加到每一孔中。在此等实验中，使用萤光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)(FDG)，释放萤光素的酶的底物，产生萤光读数。添加20微升/孔的500μM FDG/2.5％Triton X100(清洁剂对使细胞可渗透为必需的)。在细胞与底物一起培养60min后，添加20微升/孔的1M碳酸钠以终止反应且增强萤光信号。接着在485/535nm处在萤光计中读取培养盘。
经GPR119转型的酵母细胞中萤光信号的增加高于经空载体转型的酵母细胞中萤光信号的增加指示测试化合物为刺激GPR119受体功能性的化合物(例如为GPR119的促效剂或部分促效剂的化合物)。在某些实施例中，本发明的化合物产生高于背景信号(在单独媒剂存在下所获得的信号)增加的萤光信号的增加。
实例11：经放射性标记的化合物
在某些实施例中，已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物经放射性标记。如本文中所述的经放射性标记的化合物可用于筛选检验中以鉴定/评估化合物。大体来说，可通过新合成或鉴定的化合物(即测试化合物)减少形成经放射性标记的已知配体与受体之间的复合物的能力来评估其减少经放射性标记的已知配体与受体的结合的能力。可并入本发明的化合物中的合适的放射性核种包括(但不限于)：3H(也写作T)、11C、14C、18F、125I、82Br、123I、124I、125I、131I、75Br、76Br、15O、13N、35S和77Br。合并有3H、14C、125I、131I、35S或82Br的化合物一般最适用。
应了解，“经放射性标记的化合物”为已合并有至少一种放射性核种的化合物。在一些实施例中，放射性核种是选自由3H、14C、125I、35S和82Br组成的群组。在一些实施例中，放射性核种为3H或14C。此外，也应了解，在已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物中所呈现的所有原子都可为所述原子的最常产生的同位素或更稀有的放射性同位素或非放射性同位素。
用于将放射性同位素并入有机化合物中的合成方法(包括适用于已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物的方法)在此项技术中已为熟知的且包括将活性程度的氚并入靶分子中，所述方法包括：A.用氚气催化还原-此程序通常得到比活性产物且需要经卤化或不饱和前驱物。B.用硼氢化钠[3H]还原-此程序相当便宜且需要含有可还原官能基的前驱物，诸如醛、酮、内酯、酯及其类似物。C.用氢化铝锂[3H]还原-此程序得到最接近理论比活性的产物。其还需要含有可还原官能基的前驱物，诸如醛、酮、内酯、酯及其类似物。D.氚气暴露标记-此程序包括在合适的催化剂存在下将含有可交换质子的前驱物暴露于氚气中。E.使用碘代甲烷[3H]的N-甲基化-此程序通常用于通过用高比活性碘代甲烷(3H)处理适当前驱物来制备O-甲基或N-甲基(3H)产物。此方法一般产生高比活性，诸如约80-87Ci/mmol。
用于将活性程度的125I并入靶分子中的合成方法包括：A.Sandmeyer及其类似反应-此程序使芳基或杂芳基胺转化成重氮盐，诸如四氟硼酸盐，且随后使用Na125I转化成经125I标记的化合物。代表性程序由Zhu，D.-G.和共同工作者报导于有机化学期刊(J.Org.Chem.)2002，67，943-948中。B.酚的邻125碘化-如由考列而(Collier，T.L)和共同工作者报导于标记化合物与放射药物杂志(J.Labelled Compd Radiopharm.)1999，42，S264-S266中，此程序使得在酚的邻位处并入125I。C.芳基或杂芳基溴与125I交换-此方法一般为两步法。第一步为在三烷基卤化锡或六烷基二锡[例如(CH3)3SnSn(CH3)3]存在下使用(例如)Pd催化反应[即Pd(Ph3P)4]或通过芳基或杂芳基锂使芳基或杂芳基溴转化成相应三烷基锡中间物。代表性程序由Bas，M.-D.和共同工作者报导于标记化合物与放射药物杂志(J.Labelled Compd Radiopharm.)2001，44，S280-S282中。
上述技术旨在说明且并非限制。用于放射性标记已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物的其他技术为所属领域的技术人员所熟知。
实例12：受体结合检验
可评估测试化合物减少形成已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物与受体之间的复合物的能力。在某些实施例中，已知配体经放射性标记。经放射性标记的已知配体可用于筛选检验中以鉴定/评估化合物。大体来说，可通过新合成或鉴定的化合物(即测试化合物)减少形成经放射性标记的已知配体与受体之间的复合物的能力来评估其减少经放射性标记的已知配体与受体的结合的能力。
在测试化合物存在的情况下经放射性标记的已知配体的特异性结合程度小于在所述测试化合物不存在的情况下经放射性标记的已知配体的特异性结合程度，指示在测试化合物存在的情况下比在测试化合物不存在的情况下形成较少的所述经放射性标记的已知配体与所述受体之间的复合物。
用于侦测已知为本发明的G蛋白偶合受体的配体的化合物与受体之间的复合物的检验方案
A.制备受体
使用60μl脂质转染剂(每15-cm培养皿)，以包含编码本发明的G蛋白偶合受体的聚核苷酸的10μg表达载体瞬时转染293细胞。使经瞬时转染的细胞在培养皿中生长24小时(75％融合)同时改变培养基，且用10毫升/培养皿的Hepes-EDTA缓冲液(20mMHepes+10mM EDTA，pH7.4)来进行移除。接着，将细胞在Beckman Coulter离心机中以17,000rpm(JA-25.50转子)离心20分钟。随后，将小球再悬浮于20mM Hepes+1mM EDTA(pH7.4)中且用50-ml Dounce均化器均化且再次离心。移除上清液后，将小球储存于-80℃下直到用于结合检验。当用于检验时，将膜在冰上解冻20分钟且接着添加培养缓冲液(20mM Hepes，1mM MgCl2，100mM NaCl，pH7.4)。接着，使膜涡旋以使粗膜小球再悬浮且在设定6下用Brinkmann PT-3100 Polytron均化器均化15秒。使用BRL Bradford蛋白检验测定膜蛋白浓度。
B.结合检验
对于总结合来说，将总体积50μl的经适当稀释的膜(在含有50mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl2和1mM EDTA的检验缓冲液中稀释；5-50μg蛋白)添加到96孔聚丙烯微量滴定培养盘中，接着添加100μl检验缓冲液和50μl经放射性标记的已知配体。对于非特异性结合来说，添加50μl检验缓冲液而非100μl，且再添加50μl未经放射性标记的10μM所述已知配体，随后添加50μl所述经放射性标记的已知配体。接着将培养盘在室温下培养60-120分钟。通过经具有Brandell96孔培养盘收集器的微定量盘装置GF/C Unifilter滤板过滤检验培养盘，接着用含有0.9％ NaCl的冷50mM Tris HCl(pH7.4)洗涤来终止结合反应。接着，密封滤板底部，将50μl Optiphase Supermix添加到每一孔中，密封培养盘顶部，且在Trilux MicroBeta闪烁计数器中对培养盘计数。为确定是否在测试化合物存在下形成较少所述经放射性标记的已知配体与所述受体之间的复合物，将100μl经适当稀释的所述测试化合物添加到适当孔中，以替代添加100μl检验缓冲液，接着添加50μl所述经放射性标记的已知配体。
C.计算
最初在10、1和0.1μM下且接着在所选择的浓度范围下检验测试化合物以使中间剂量会引起约50％抑制经放射性标记的已知配体的结合(即IC50)。在测试化合物不存在的情况下，特异性结合(BO)为总结合减去非特异性结合(NSB)的差，且类似地，特异性结合(在测试化合物存在的情况下)(B)为置换结合(BD)减去非特异性结合(NSB)的差。根据抑制回应曲线，％B/BO对测试化合物浓度的双对数(logit-log)曲线来确定IC50。
由程(Cheng)和普鲁索夫(Prustoff)转换计算Ki：
Ki＝IC50/(1+[L]/KD)，
其中[L]为检验中所使用的经放射性标记的已知配体的浓度且KD为在相同结合条件下独立地测定的经放射性标记的已知配体的解离常数。
实例13
GPR119促效剂对肠内分泌细胞株中或来源于小肠的K细胞富集区域的组织中的细胞中GIP分泌的影响
使用在此所述的活体外检验，可显示本发明的GPR119促效剂刺激肠内分泌细胞株中或来源于小肠[例如，十二指肠或空肠组织；参见例如松迪(Sondhi)等人，药物基因组学杂志(Pharmacogenomics J)(2006)6：131-140]的K细胞富含区域的组织中的细胞中的GIP分泌。第1天，将肠内分泌细胞或来源于小肠的K细富集区域的组织中的细胞涂布于24孔培养盘中的完全培养基(DMEM/10％FBS)中。第2天，用低葡萄糖培养基(DMEM/3mM葡萄糖/10％FBS)更换培养基。第3天，将细胞用1×PBS洗涤两次。在37℃和5％CO2下，在组织培养恒温箱中在具有15mM葡萄糖的无血清DMEM中用媒剂或用GPR119促效剂以不同浓度(例如，在1nM至20μM范围内)或用弗斯可林(forskolin)(1μM)作为阳性对照来刺激经洗涤的细胞，历时1小时。接着收集上清液且通过以500g且在4℃下离心来净化5分钟。由使用购自Linco Research Laboratory的试剂的ELISA[大鼠/小鼠抑胃多肽(总)ELISA，目录号EZRMGIP-55K]，按照供应商提供的说明书来测定释放于上清液中的GIP。
尽管上述说明以为达成说明的目的所提供的实例教示本发明的原则，但应了解，本发明的实施涵盖处于所附申请专利范围的范畴内的所有常见变更、修改或修正及其等效物。

Claims (7)

1.一种鉴定GIP促分泌素的方法，其包含以下步骤：
(a)使GPR119促效剂在活体外与脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞接触；和
(b)确定所述GPR119促效剂是否刺激所述脊椎动物肠内分泌细胞或所述能分泌GIP的细胞分泌GIP；
其中所述GPR119促效剂刺激所述脊椎动物肠内分泌细胞或能分泌GIP的细胞分泌GIP的能力指示所述GPR119促效剂为GIP促分泌素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂为具有小于5,000克/摩尔的分子量的小分子。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂为人类GPR119的促效剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂为选择性GPR119促效剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂具有小于10μM的值的EC50。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂具有小于1μM的值的EC50。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR119促效剂具有小于100nM的值的EC50。
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