ES2278944T3 - Inhibidores de dpiv basados en glutaminilo. - Google Patents

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ES2278944T3 ES02758280T ES02758280T ES2278944T3 ES 2278944 T3 ES2278944 T3 ES 2278944T3 ES 02758280 T ES02758280 T ES 02758280T ES 02758280 T ES02758280 T ES 02758280T ES 2278944 T3 ES2278944 T3 ES 2278944T3
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Abstract

Hidrocloruro de glutaminil-tiazolidina.

Description

Inhibidores de DPIV basados en glutaminilo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al área de la inhibición de la dipeptidil-peptidasa IV y, más particularmente, se refiere a hidrocloruro de glutaminil-tiazolidina, composiciones farmacéuticas que contienen dicho compuesto, y el uso de dicho compuesto en la inhibición de la actividad de la enzima dipeptidil-peptidasa IV y enzimas análogas a la dipeptidil-peptidasa IV.
Antecedentes de la técnica
La dipeptidil-peptidasa IV (DPIV) es una serina-proteasa que escinde los dipéptidos N-terminales de una cadena peptídica que contiene, preferiblemente, un residuo prolina en la penúltima posición. Aunque la función biológica de DPIV en los sistemas de mamíferos no se ha establecido por concepto, se cree que juega un papel importante en el metabolismo de los neuropéptidos, la activación de las células T, la fijación de las células del cáncer al endotelio y la entrada de HIV en las células linfoides.
Análogamente, se ha descubierto que la DPIV es responsable de la desactivación del péptido-1 afín al glucagón (GLP-1) y el péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa conocido también como péptido inhibidor gástrico (GIP). Dado que GLP-1 es un estimulador principal de la secreción pancreática de insulina y tiene efectos beneficiosos directos sobre la eliminación de la glucosa, en los documentos WO 97/40832 y US 6.303.661, se demostró que la inhibición de la actividad de DPIV y enzimas semejantes a DPIV representa un enfoque atractivo v.g. para el tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDD M).
Es un aspecto de la presente invención proporcionar nuevos inhibidores de DPIV que son eficaces v.g. en el tratamiento de afecciones mediadas por la inhibición de DPIV y enzimas semejantes a DPIV, composiciones farmacéuticas v.g. útiles en la inhibición de DPIV y enzimas afines a DPIV y un método de inhibir la actividad de dichas
enzimas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento, en particular a un método para el tratamiento de diabetes mellitus, especialmente diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDD M) o diabetes Tipo 2 y condiciones asociadas con diabetes mellitus y a composiciones para uso en dicho método.
La dipeptidil-peptidasa IV (DPIV) es una serina-proteasa de escisión post-prolina (en menor grado post-alanina, post-serina o post-glicina), encontrada en diversos tejidos del cuerpo que incluyen riñón, hígado, e intestino.
Es sabido que los inhibidores de DPIV pueden ser útiles para el tratamiento de la tolerancia deteriorada a la glucosa y la diabetes mellitus (Solicitud de Patente Internacional, Publicación Número WO 99/61431, Pederson RA et al, Diabetes, agosto 1998; 47(8): 1253-8 y Pauly RP et al, Metabolism, marzo 1999, 48(3): 385-9). En particular, el documento WO 99/61431 da a conocer inhibidores de la DPIV que comprenden un residuo de aminoácido y un grupo tiazolidina o pirrolidina, y sales de los mismos, especialmente L-treo-isoleucil-tiazolidina, L-alo-isoleucil-tiazolidina, L-treo-isoleucil-pirrolidina, L-alo-isoleucil-pirrolidina, y sales de los mismos.
Ejemplos adicionales de inhibidores de peso molecular bajo de la dipeptidil-peptidasa IV son agentes tales como derivados de tetrahidroisoquinolin-3-carboxamida, 2-cianopirroles y -pirrolidinas sustituidos en N, N-(glicil N'-sustituido)-2-cianapirrolidinas, N-(glicil sustituido)-tiazolidinas, N-(glicil sustituido)-4-cianotiazolidinas, inhibidores de boronilo y pirrolidinas condensadas con ciclopropilo. Inhibidores de la dipeptidil-peptidasa IV se describen en los documentos US 6,011,155; US 6,107,317; US 6,110,949; US 6,124,305; US 6,172,081; WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105 y WO 02/02560.
\newpage
Sumario de la invención
La presente invención proporciona la sal hidrocloruro del compuesto de la fórmula:
100
Este compuesto es útil en el tratamiento de afecciones mediadas por DPIV o enzimas afines a DPIV, tales como artritis, obesidad, trastornos inmunes y autoinmunes, trasplante de aloinjertos, cáncer, trastornos neuronales y enfermedades dérmicas.
En una realización más preferida, el compuesto de la presente invención mejora la tolerancia a la glucosa por disminución de los niveles elevados de glucosa en sangre en respuesta a una exposición oral a glucosa y, por consiguiente, es útil en el tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de insulina.
Breve descripción de los dibujos
Puede obtenerse una comprensión adicional de la presente invención por referencia a las figuras, en las cuales:
La figura 1 muestra la actividad de DPIV en plasma en el suero de ratas Wistar después de administración oral e intra-vasal de 100 mg/kg peso corporal de glutaminil-tiazolidina;
la figura 2 muestra la disminución dependiente de la dosis de los niveles de glucosa en sangre en ratas Zucker diabéticas después de la administración oral de 5 mg/kg, 15 mg/kg, 50 mg/kg peso corporal de glutaminil-tiazolidina y placebo, respectivamente;
la figura 3 muestra la estructura química de la piroglutaminil-tiazolidina, el producto de degradación, encontrada después de la administración oral de glutaminil-tiazolidina a ratas Wistar; y
la Figura 4 muestra el cromatograma de un extracto de plasma de rata obtenido después de administración oral de glutaminil-tiazolidina a ratas Zucker obesas. El pico a 2,95 min representa glutaminil-tiazolidina y el pico a 6,57 min representa piroglutaminil-tiazolidina.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al área de la inhibición de la dipeptidil-peptidasa IV (DPIV), y, más particularmente, se refiere a hidrocloruro de glutaminil-tiazolidina, composiciones farmacéuticas que contienen dicho compuesto, y al uso de dicho compuesto en la inhibición de la actividad de DPIV y enzimas afines a DPIV.
La presente invención proporciona nuevos inhibidores de DPIV, que son eficaces v.g. en el tratamiento de afecciones mediadas por la inhibición de DPIV, composiciones farmacéuticas v.g. útiles en la inhibición de la actividad de DPIV y enzimas afines a DPIV, y un método de inhibición de la actividad de DPIV y enzimas afines a
DPIV.
\newpage
La presente invención proporciona la sal hidrocloruro del compuesto de fórmula:
101
La presente invención incluye adicionalmente dentro de su alcance profármacos del compuesto de esta invención. En general, tales profármacos serán derivados funcionales del compuesto que pueden convertirse fácilmente in vivo en el compuesto terapéuticamente activo deseado. Así, en estos casos, en los métodos de tratamiento de la presente invención, el término "administración" comprenderá el tratamiento de los diversos trastornos descritos con versiones de profármaco del compuesto reivindicado, pero que se convierten in vivo en el compuesto arriba especificado después de administración al individuo. Procedimientos convencionales para la selección y preparación de derivados profármaco adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985 y en las solicitudes de patente DE 198 28 113, DE 198 28 114, WO 99/67228 y WO 99/67279 que se incorporan totalmente en esta memoria por referencia.
El compuesto de acuerdo con esta invención tiene un centro quiral y puede, de acuerdo con ello, existir como enantiómeros. Debe entenderse que la totalidad de tales isómeros y mezclas de los mismos están abarcados dentro del alcance de la presente invención. Adicionalmente, algunas de las formas cristalinas del compuesto pueden existir como polimorfos y como tales deben considerarse incluidas en la presente invención. Adicionalmente, el compuesto puede formar solvatos con agua (es decir hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y tales solvatos deben considerarse también abarcados dentro del alcance de esta invención.
El compuesto puede obtenerse también en la forma de un hidrato, o incluir otros disolventes utilizados para su cristalización.
Como se ha indicado arriba, el compuesto de la presente invención es útil en la inhibición de la actividad de DPIV y enzimas afines a DPIV. La capacidad del compuesto de la presente invención para inhibir la actividad de DPIV y enzimas afines a DPIV puede demostrarse empleando el ensayo de actividad de DPIV para la determinación de los valores K_{i} in vitro y en plasma humano, como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Los valores K_{i} del compuesto de la presente invención se determinaron para glutaminil-tiazolidina como K_{i} = 3,12*10^{-7} M \pm 5,11*10^{-10} M contra DPIV de riñón de porcino. Los valores K_{i} del compuesto de la presente invención se determinaron para glutaminil-tiazolidina como K_{i} = 4,03*10^{-7} M \pm 2,19*10^{-10} M después de 5 min y 5,13*10^{-7} M \pm 1,26*10^{-8} M después de 22 horas de pre-incubación en plasma humano.
La capacidad del compuesto de la presente invención para inhibir DPIV in vivo puede demostrarse por administración oral o intravasal a ratas Wistar, como se describe en el Ejemplo 7. El compuesto de la presente invención inhibe la actividad de DPIV in vivo después de ambas administraciones, oral e intravasal, a ratas Wistar.
La DPIV está presente en una gran diversidad de órganos y tejidos de mamífero, v.g. el borde de los cepillos intestinales (Gulfschmidt S. et al., medidas "in situ" de los contenidos de proteínas en la región del borde de los cepillos a lo largo de los vellos del yeyuno de la rata y sus correlaciones con las actividades de cuatro enzimas. Histochemistry 1981, 72(3), 467-79), epitelios exocrinos, hepatocitos, túbulos renales, endotelios, miofibroblastos (Feller A.C. et al., Un anticuerpo monoclonal que detecta dipeptidil-peptidasa IV en tejido humano. Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopatol. 1986; 409 (2): 263-73), células nerviosas, membranas laterales de ciertos epitelios superficiales, v.g. tubo de Falopio, útero y glándula vesicular, en el citoplasma luminal de, v.g., el epitelio de las glándulas vesiculares, y en las células mucosas de la glándula de Brunner (Hartel S. et al., dipeptidil-peptidasa (DPP) IV en órganos de rata. Comparación de inmunohistoquímica e histoquímica de la actividad. Histochemistry 1988; 89(2): 151-61), órganos reproductores, v.g. epidídimo caudal y ampolla, vesículas seminales y sus secreciones (Agrawal & Vanha-Perttula y dipeptidil-peptidasas en órganos reproductores y secreciones de bovino. Int. J. Androl. 1988, 9(6): 435-52. En el suero humano, están presentes dos formas moleculares de dipeptidil-peptidasa (Krepela E. et al., Demostración de dos formas moleculares de dipeptidil-peptidasa IV en suero humano normal. Physiol. Bohemoslov. 1983, 32(6): 486-96). La forma de peso molecular alto en suero de DPIV se expresa en la superficie de las células T activadas (Duke-Cohan J.S. et al., La dipeptidil-peptidasa IV de peso molecular alto del suero (CD26) es similar a un nuevo antígeno DPPT-L liberado por las células T activadas. J. Immunol. 1996, 156(5): 1714-21).
El compuesto de la presente invención es capaz de inhibir la DPIV in vivo. En una realización de la presente invención, todas las formas moleculares, homólogos y epítopes de DPIV procedentes de todos los tejidos y órganos de mamífero, también de aquéllos que no han sido descubiertos todavía, deben considerarse abarcadas por el alcance de esta invención.
Entre el grupo raro de proteasas específicas de prolina, se creía originalmente que DPIV era la única enzima fijada a la membrana específica para prolina como el penúltimo residuo en el término amino de la cadena del polipéptido. Sin embargo, otras moléculas, incluso estructuralmente no homólogas a DPIV pero que contienen la actividad de la enzima correspondiente, han sido identificadas recientemente. Enzimas afines a DPIV, que han sido identificadas hasta ahora, son p.ej. la proteína \alpha de activación de los fibroblastos, la dipeptidil-peptidasa IV \beta, la proteína afín a la dipeptidil-aminopeptidasa, la dipeptidasa ácida acetilada en N y enlazada en \alpha, la prolina-dipeptidasa de las células en reposo, la dipeptidil-peptidasa II, la atractina y la proteína afín a la dipeptidil-peptidasa IV (DPP 8), y han sido descritas en el artículo de revisión por Sedo & Malik (Sedo & Malik, moléculas afines de la dipeptidil-peptidasa IV: ¿proteínas homólogas o actividades homólogas? Biochemica et Biophysica Acta 2001, 36506:1-10).
Otras enzimas afines a DPIV se describen en los documentos WO 01/19866, WO 02/04610, WO 02/34900 y WO 02/31134. WO 01/19866 da a conocer una nueva dipeptidil-aminopeptidasa humana (DPP8) con similitudes estructurales y funcionales a DPIV y la proteína de activación de los fibroblastos (FAP). WO 02/04610 proporciona reactivos, que regulan la enzima afín a la dipeptidil-peptidasa IV humana y reactivos que se fijan al producto del gen de la enzima afín a la dipeptidil-peptidasa IV humana. Estos reactivos pueden jugar un papel en la prevención, la mejora, o la corrección de disfunciones o enfermedades que incluyen, pero sin carácter limitante, tumores y trastornos del sistema nervioso central y periférico que incluyen dolor y trastornos neurodegenerativos. La enzima afín a la dipeptidil-peptidasa IV del documento WO 02/04610 es bien conocida en la técnica. En la base de datos de GeneBank, esta enzima está registrada como KIAA1492 (registro en Febrero de 2001, presentado en fecha 4 de Abril, 2000, AB040925). El documento WO 02/34900 describe una dipeptidil-peptidasa 9 (DPP9) con homología significativa con las secuencias de aminoácidos de DPIV y DPP8. El documento WO 02/31134 da a conocer 3 enzimas afines a DPIV, DPRP1, DPRP2 y DPRP3. El análisis de secuencia reveló que DPRP1 es idéntica a DPP8, como se describe en el documento WO 01/19866, que DPRP2 es idéntica a DPP9 y que DPRP3 es idéntica a KIAA1492 como se describe en el documento WO 02/04610.
En otra realización preferida de la presente invención, todas las formas moleculares, homólogos y epítopes de proteínas que comprenden actividad enzimática afín a DPIV, de todos los tejidos y órganos de mamífero, así como de aquéllas que no han sido descubiertas todavía, deben considerarse abarcadas por el alcance de esta invención.
La capacidad del compuesto de la presente invención para inhibir las enzimas afines a DPIV puede demostrarse empleando un ensayo de actividad enzimática para determinación de los valores K_{i} in vitro como se describe en el Ejemplo 4. El valor K_{i} del compuesto de la presente invención contra la dipeptidil-peptidasa II de porcino se determinó como K_{i} = 1,07*10^{-5} M \pm 3,81*10^{-7} M para glutaminil-tiazolidina.
En otra realización de la presente invención, el compuesto de la presente invención tiene solamente una actividad baja, si no inhibidora contra enzimas específicas de prolina distintas de DPIV y no afines a DPIV. Como se describe en el Ejemplo 5, con glutaminil-tiazolidina no se encontró inhibición alguna de la dipeptidil-peptidasa I y prolil-oligopeptidasa. Contra prolidasa, el compuesto exhibía una eficacia marcadamente inferior en comparación con DPIV. El valor CI_{50} contra prolidasa se determinó como CI_{50} > 3 mM para glutaminil-tiazolidina.
Teniendo en cuenta su capacidad para inhibir la actividad de DPIV y enzimas afines a DPIV, el compuesto de la presente invención es útil en el tratamiento de afecciones mediadas por las actividades de dichas enzimas. Así, el compuesto descrito en esta memoria es útil en el tratamiento de afecciones tales como diabetes mellitus no dependiente de insulina, artritis, obesidad, trastornos inmunes y autoinmunes, trasplante de aloinjertos, cáncer, trastornos neuronales tales como esclerosis múltiple y enfermedades dérmicas.
En una realización más preferida de esta invención, el compuesto de la presente invención mejora la tolerancia a la glucosa por reducción de los niveles elevados de glucosa en sangre en respuesta a un enfrentamiento oral a glucosa y, por esta razón, es útil en el tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de insulina. La capacidad del compuesto de la presente invención para mejorar la tolerancia a la glucosa en respuesta a un enfrentamiento oral a la glucosa, puede medirse en ratas Zucker diabéticas. El método se describe en el Ejemplo 8. La administración oral de 5 mg/kg peso corporal, 15 mg/kg y 50 mg/kg peso corporal de glutaminil-tiazolidina dio como resultado una disminución dependiente de la dosis de los niveles elevados de glucosa en sangre y por consiguiente una mejora de la tolerancia a la glucosa en las ratas Zucker diabéticas.
El compuesto de la presente invención es, de acuerdo con el Ejemplo 6, estable en plasma humano. Sorprendentemente, y como una realización preferida adicional de la presente invención, el compuesto de la presente invención puede degradarse in vivo después de administración a un mamífero. La capacidad del compuesto de la presente invención para degradarse in vivo puede determinarse empleando el modelo de rata Wistar y análisis de LC/ MS subsiguiente. Se encontró que la glutaminil-tiazolidina se degrada después de la administración oral a ratas Wistar, para dar la piroglutaminil-toazolidina respectiva.
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La presente invención proporciona por tanto un método de tratamiento de una afección mediada por la modulación de la actividad de DPIV o enzimas afines a DPIV en un individuo que se encuentra en necesidad de ello, que comprende administrar el compuesto de la presente invención o composiciones farmacéuticas del mismo en una cantidad y un régimen de dosificación terapéuticamente eficaces para tratar la afección. Adicionalmente, la presente invención incluye el uso del compuesto de la presente invención para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una afección mediada por la modulación de la actividad de DPIV en un individuo. El compuesto puede administrarse a un paciente por cualquier ruta de administración convencional, con inclusión, pero sin carácter limitante, de la administración intravenosa, oral, subcutánea, intramuscular, intradérmica y parenteral.
En una realización adicional, la presente invención proporciona formulaciones para el compuesto de la presente invención en composiciones farmacéuticas.
El término "individuo", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un animal, preferiblemente un mamífero, muy preferiblemente un humano, que ha sido el objeto de tratamiento, observación o experimento.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en esta memoria, significa aquella cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que suscita la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, que es buscada por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro técnico clínico, que incluye alivio de los síntomas de la enfermedad o el trastorno que se está tratando.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "composición" tiene por objeto abarcar un producto que comprende el compuesto reivindicado en las cantidades terapéuticamente eficaces, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones del compuesto reivindicado.
Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, el compuesto de la presente invención como el ingrediente activo, se mezcla íntimamente con un vehículo farmacéutico de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales, vehículo que puede tomar una gran diversidad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, v.g., oral o parenteral tal como intramuscular. En la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales. Así, para preparaciones orales líquidas, tales como por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, vehículos y aditivos adecuados pueden incluir ventajosamente agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y análogos; para preparaciones orales sólidas tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas, cápsulas de gel y tabletas, vehículos y aditivos adecuados incluyen almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglomerantes, agentes de desintegración y análogos. Debido a su facilidad de administración, tabletas y cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Si se desea, las tabletas pueden estar recubiertas con azúcar o estar dotadas de un recubrimiento entérico por técnicas estándar. Para la administración parenteral, el vehículo comprenderá usualmente agua estéril, aunque pueden incluirse otros ingredientes, por ejemplo, para propósitos tales como favorecer la solubilidad o para conservación.
Pueden prepararse también suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden emplearse vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y análogos. Las composiciones farmacéuticas de esta invención contendrán, por unidad de dosificación, v.g., tableta, cápsula, polvo, inyección, cucharadita de té y análogas, una cantidad del ingrediente activo necesaria para suministrar una dosis eficaz como se ha descrito arriba. Las composiciones farmacéuticas de esta invención contendrán, por unidad de dosificación, v.g., tableta, cápsulas, polvo, inyección, supositorio, cucharadita de té y análogas, desde aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg (con preferencia aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg) y pueden administrarse a una dosis que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal por día (preferiblemente, 1 a 50 mg/kg por día). Las dosis, sin embargo, pueden modificarse dependiendo del requerimiento de los pacientes y de la gravedad de la afección que se esté tratando. El uso de administración diaria o dosificación post-periódica puede emplearse. Típicamente, la dosificación será regulada por el médico basándose en las características del paciente, su estado general y el efecto terapéutico deseado.
Preferiblemente, estas composiciones se encuentran en formas de dosificación unitarias tales como tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, aerosol medido o pulverizaciones líquidas, gotas, ampollas, dispositivos autoinyectores o supositorios; para administración oral, parenteral, intranasal, sublingual o rectal, o para administración por inhalación o insuflación. Alternativamente, la composición puede presentarse en una forma adecuada para administración una vez a la semana o una vez al mes. Para la preparación de composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla idealmente con un vehículo farmacéutico, v.g. ingredientes convencionales de preparación de tabletas tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, v.g., agua, para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea del compuesto de la presente invención. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, debe entenderse que el ingrediente activo está dispersado idealmente de modo uniforme en toda la composición de tal modo que la composición puede subdividirse fácilmente en formas de dosificación igualmente eficaces tales como tabletas, píldoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida puede subdividirse luego en formas de dosificación unitarias del tipo descrito arriba que contienen desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 mg, con preferencia desde aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención.
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Las tabletas o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse ventajosamente o prepararse en forma de composiciones de cualquier otro modo para proporcionar una forma de dosificación que aporta la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o la píldora pueden comprender un componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, encontrándose el último en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes están separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o se demore en la liberación. Una diversidad de materiales pueden utilizarse para tales capas o recubrimientos entéricos, incluyendo tales materiales cierto número de ácidos polímeros con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Las formas líquidas en las cuales pueden incorporarse ventajosamente las nuevas composiciones de la presente invención para administración por vías oral o por inyección incluyen soluciones acuosas, jarabes saborizados convenientemente, suspensiones acuosas o aceitosas, y emulsiones saborizadas con aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares. Agentes dispersantes o de suspensión adecuados para suspensiones acuosas incluyen gomas sintéticas y naturales tales como tragacanto, goma arábiga, alginato, dextrano, sodio-carboximetilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o gelatina.
En los casos en que los procesos para la preparación del compuesto de acuerdo con la invención dan lugar a una mezcla de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse por técnicas convencionales tales como cromatografía preparativa. El compuesto puede prepararse en forma racémica, o pueden prepararse enantiómeros individuales sea por síntesis enantioespecífica o por resolución. El compuesto puede, por ejemplo, resolverse en sus enantiómeros componentes por técnicas estándar, tales como la formación de pares de diastereoisómeros por formación de sales con un ácido ópticamente activo, tal como ácido (-)-di-p-toluoil-d-tartárico y/o ácido (+)-di-p-toluoil-l-tartárico, seguido por cristalización fraccionada y regeneración de la base libre. El compuesto puede resolverse también por formación de ésteres o amidas diastereoisómeros, seguido por separación cromatográfica y eliminación del adyuvante quiral. Alternativamente, el compuesto puede resolverse utilizando una columna HPLC quiral.
Durante cualquiera de los procesos para preparación del compuesto de la presente invención, puede ser necesario y/o deseable proteger los grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas implicadas. Esto puede lograrse por medio de grupos protectores convencionales, tales como los descritos en Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; y T.W. Greene & P.G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991, que se incorpora por completo en esta memoria por referencia. Los grupos protectores pueden eliminarse en una etapa posterior conveniente utilizando métodos conocidos por la técnica.
El método de tratamiento de las afecciones moduladas por la dipeptidil-peptidasa IV y enzimas afines a DPIV descrito en la presente invención puede llevarse a cabo también utilizando una composición farmacéutica que comprende el compuesto que se define en esta memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener entre aproximadamente 0,01 mg y 1000 mg, con preferencia aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg del compuesto, y puede estar constituida en cualquier forma adecuada para el modo de administración seleccionado. Los vehículos incluyen excipientes farmacéuticos necesarios e inertes, con inclusión, pero sin carácter limitante, de aglomerantes, agentes de suspensión, lubricantes, saborizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, y recubrimientos. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, tabletas, microcápsulas, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación inmediata, liberación controlada y liberación sostenida), gránulos, y polvos, así como formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, emulsiones, y suspensiones. Formas útiles para administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.
Ventajosamente, el compuesto de la presente invención puede administrarse en una dosis diaria simple, o la dosis diaria total puede administrase en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Adicionalmente, el compuesto de la presente invención puede administrarse en forma intranasal por uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o por medio de parches transdérmicos en la piel bien conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en dicha técnica. Para ser administrados en la forma de sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosis será, por supuesto, continua más bien que intermitente durante todo el régimen de dosificación y la concentración de dosificación precisará modificarse de acuerdo con ello para obtener los efectos terapéuticos deseados.
Más preferiblemente, para administración oral en la forma de una tableta o cápsula, el componente del fármaco activo puede combinarse con un vehículo oral inerte, no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y análogos. Además, en caso deseado o necesario, pueden incorporarse también en la mezcla aglomerantes adecuados, lubricantes, agentes de desintegración y agentes colorantes. Aglomerantes adecuados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto u oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y análogos. Los agentes de desintegración incluyen, sin limitación, almidón, metil-celulosa, agar, bentonita, goma de xantano y análogos.
Las formas líquidas son adecuadas en agentes de suspensión o dispersión saborizados tales como las gomas sintéticas y naturales, por ejemplo, tragacanto, goma arábiga, metilcelulosa y análogas. Para administración parenteral, se desean suspensiones y soluciones estériles. Las preparaciones isotónicas que contienen generalmente conservantes adecuados se emplean cuando se desea administración intravenosa.
El compuesto de la presente invención puede administrarse también en forma de sistemas de suministro de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes, y vesículas multilaminares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas utilizando procesos bien descritos en la técnica.
El compuesto de la presente invención puede acoplarse también con polímeros solubles como vehículos diana direccionables. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamidafenol, polihidroxietilaspartamida-fenol, o polietileno-oxidopolilisina sustituida con residuo palmitoílo. Adicionalmente, el compuesto de la presente invención puede acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsilon-caprolactona, ácido polihidroxi-butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloques reticulados o anfipáticos de hidrogeles.
El compuesto de esta invención puede administrarse en cualquiera de las composiciones que anteceden y de acuerdo con regímenes de dosificación establecidos en la técnica siempre que se requiera el tratamiento de los trastornos abordados.
La dosis diaria de los productos puede modificarse dentro de un intervalo amplio que va desde 0,01 a 1,000 mg por adulto humano y por día. Para administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en la forma de tabletas que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250, 500 y 1000 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra ordinariamente a un nivel de dosificación que va desde aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal por día. Con preferencia, el intervalo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día. Los compuestos pueden administrarse en un régimen de 1 a 4 veces al día.
Las dosis óptimas a administrar pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica, y variarán con el modo de administración, la concentración de la preparación, la biodisponibilidad debida al modo de administración, y el progreso del estado de enfermedad. Adicionalmente, factores asociados con el paciente particular que se esté tratando, que incluyen la edad del paciente, el peso, la dieta y el tiempo de administración, deben ser considerados generalmente en el ajuste de las dosis.
El compuesto o las composiciones de la presente invención pueden tomarse antes de una comida, al tiempo que se toma una comida, o después de una comida.
Cuando se toman antes de una comida, el compuesto o la composición de la presente invención puede tomarse 1 hora, preferiblemente 30 o incluso 15 ó 5 minutos antes de la comida.
Cuando se toman al mismo tiempo de la comida, el compuesto o las composiciones de la presente invención pueden mezclarse en la comida o tomarse en una forma de dosificación separada como se ha descrito arriba.
Cuando se toman después de una comida, el compuesto o las composiciones de la presente invención pueden tomarse 5, 15 ó 30 minutos o incluso 1 hora después de la terminación de una comida.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis del hidrocloruro de glutaminil-tiazolidina Acilación
Se disolvió N-t-butil-oxicarbanilglutamina (2,0 g, 8,12 mmol) en 5 ml de THF y se llevó a -15ºC. Se añadieron a dicha mixtura CAIBE (cloroformiato de isobutilo) (1,06 ml, 8,12 mmol) y 4-metilmorfolina (0,895 ml, 8,12 mmol) y la solución se agitó durante 15 min. La formación del anhídrido mixto se comprobó por TLC (eluyente: CHCl_{3}/ MeOH: 9/1). Después de calentar a -10ºC, se añadió otro equivalente de 4-metilmorfolina (0,895 ml, 8,12 mmol) e hidrocloruro de tiazolidina (1,02 g, 8,12 mmol). La mezcla se llevó a la temperatura ambiente y se agitó durante una noche.
Acabado
El sedimento formado se separó por filtración y se evaporó el disolvente. El aceite resultante se recogió en cloroformo (20 ml) y se lavó con una solución saturada de hidrogenosulfato de sodio seguida por una solución saturada de bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Se separó la capa orgánica, se secó y se evaporó. El producto resultante se comprobó en cuanto a pureza por TLC (eluyente: CHCl_{3}/ MeOH: 9/1).
Rendimiento: 1,64 g, sólido.
Desdoblamiento
Se disolvieron 640 mg del compuesto sólido resultante protegido con Boc en 3-1 ml de HCl enfriado en hielo en dioxano (12,98 M, 20 equivalentes) y se dejaron en hielo. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (eluyente: CHCl_{3}/ MeOH: 9/1). Una vez completada la reacción, se retiró el disolvente y el aceite resultante se recogió en metanol y se evaporó de nuevo. Después de ello, el aceite resultante se secó sobre óxido de fósforo-V y se trituró dos veces con dietil-éter. La pureza se comprobó por HPLC. Rendimiento: 0,265 g
La pureza se comprobó por HPLC.
La identidad del producto de reacción se comprobó por análisis N MR.
Ejemplo 2 Determinación de K_{i}
Para la determinación del valor K_{i} de glutaminil-tiazolidina, se utilizó dipeptidil-peptidasa IV de riñón de porcino con una actividad específica contra glicilprolil-4-nitroanilina de 37,5 U/mg y una concentración de enzima de 1,41 mg/ml en la solución stock.
Mezcla de ensayo
Se mezclaron 100 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 1*10^{-6} M - 1*10^{-8} M (glutaminil-tiazolidina) con 50 \mul de glicilprolil-4-nitroanilina en concentraciones diferentes (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) y 100 \mul de HEPES (40 mM, pH 7,6; concentración iónica = 0,125). La mezcla de ensayo se pre-incubó a 30ºC durante 30 min. Después de la pre-incubación, se añadieron 20 \mul de DPIV (diluido en relación 1:600) y se realizó la medida del desarrollo del color amarillo debido a la liberación de 4-nitroanilina a 30ºC y \lambda = 405 nm durante 10 min utilizando un lector de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).
El valor K_{i} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido) basado en una inhibición competitiva de DPIV por la glutaminil-tiazolidina. Dicho valor se determinó para la glutaminil-tiazolidina como K_{i} = 3,12*10^{-7} M \pm 5,11*10^{-10} M.
Ejemplo 3 Determinación de K_{i} en plasma humano
El plasma humano contiene actividad liberadora de Xaa-Pro N-terminal.
70 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 1*10^{-6} M - 1*10^{-8} M (glutaminil-tiazolidina) se mezclaron con 50 \mul de glicilprolil-4-nitroanilina en concentraciones diferentes (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) y 100 \mul de HEPES (40 mM, pH 7,6). La mezcla de ensayo se pre-incubó a 30ºC durante 5 min y 22 horas respectivamente. Después de la pre-incubación, se añadieron 50 \mul de plasma humano y se realizó la medida del desarrollo de color amarillo debido a la liberación de 4-nitroanilina a 30ºC y \lambda = 405 nm durante 10 min utilizando un lector de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).
El valor K_{i} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido) basado en una inhibición competitiva de DPIV por la glutaminil-tiazolidina. Se determinó el mismo para la glutaminil-tiazolidina como K_{i} = 4,03*10^{-7} M \pm 2,19*10^{-10} M después de 5 min y 5,13*10^{-7} M \pm 1,26*10^{-8} M después de 22 horas de pre-incubación.
Ejemplo 4 Inhibición de enzimas afines de DPIV - dipeptidil-peptidasa II
DPII (3.4.14.2) libera dipéptidos N-terminales de los oligopéptidos si el término N no está protonizado (McDonald, J.K., Ellis, S. & Reilly, T.J., 1966, J. Biol. Chem., 241, 1494-1501). Pro y Ala en posición P_{1} son residuos preferidos. La actividad enzimática se describe como la actividad afín a DPIV, pero DPII tiene un pH ácido óptimo. La enzima utilizada se purificó a partir de riñón de porcino.
Ensayo
Se mezclaron 100 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 1*10^{-4} M - 5*10^{-8} M con 100 \mul de solución tampón (HEPES 40 mM, pH 7,6, 0,015% Brij, DTT 1 mM), 50 \mul de solución de lisilalanilaminometilcumarina (5 mM) y 20 \mul de DPII de porcino (diluida 250 veces en solución tampón). La medida de la fluorescencia se realizó a 30ºC y \lambda_{excitación}= 380 nm, \lambda_{emisión} = 465 nm durante 25 min utilizando un lector de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).
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El valor K_{i} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido) y se determinó como K_{i} = 1,07*10^{-5} M \pm 381*10^{-7} M para la glutaminil-tiazolidina.
Ejemplo 5 Enzimas de reacción cruzada
Se ensayó la glutaminil-tiazolidina en cuanto a su potencia de reacción cruzada contra dipeptidil-peptidasa I, prolil-oligopeptidasa y prolidasa.
Dipeptidil-peptidasa I (DP1, catepsina C)
La DPI o catepsina C es una cisteína-proteasa lisosómica que escinde los dipéptidos a partir del término N de sus sustratos (Gutman, H.R. & Fruton, J.S., 1948, J. Biol. Chem., 174, 851-858). Se clasifica como una cisteína-proteasa.
La enzima utilizada se adquirió de Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Con objeto de obtener una enzima totalmente activa, la enzima se diluyó 1000 veces en tampón MES de pH 5,6 ( MES 40 mM, DTT 4 mM, KCl 4 mM, EDTA 2 mM, 0,015% Brij) y se preincubó durante 30 min a 30ºC.
Ensayo
Se mezclaron 50 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 1*10^{-5} M - 1*10^{-7} M con 110 \mul de mezcla tampón-enzima. La mezcla de ensayo se pre-incubó a 30ºC durante 15 min. Después de la pre-incubación, se añadieron 100 \mul de histidilseril-\beta-nitroanilina (2*10^{-5}) M y se realizó la medida del desarrollo de color amarillo debido a la liberación de \beta-nitroanilina a 30ºC y \lambda_{excitación}= 380 nm, \lambda_{emisión} = 465 nm durante 10 min, utilizando un lector de placas ((HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).
El valor CI_{50} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido). No se encontró inhibición alguna de la actividad de la enzima DPI por la glutaminil-tiazolidina.
Prolil-oligopeptidasa (POP)
La prolil-olipeptidasa (EC 3.4.21.26) es una endoproteasa de tipo serina que escinde los péptidos en la parte N-terminal del enlace Xaa-Pro (Walter, R., Shlank, H., Glass, J.D., Schwartz, I.L. & Kerenyi, T.D., 1971, Science, 173, 827-829). Los sustratos son péptidos con un peso molecular hasta 3000 Da.
La enzima utilizada era una prolil-oligopeptidasa recombinante humana. La expresión recombinante se realizó en E. coli en condiciones estándar como se describe en otro lugar de la técnica anterior.
Ensayo
Se mezclaron 100 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 1*10^{-4} M - 5*10^{-8} M con 100 \mul de solución tampón (HEPES 40 mM, pH 7,6, 0,015% Brij, DTT 1 mM) y 20 \mul de solución de POP. La mezcla de ensayo se preincubó a 30ºC durante 15 min. Después de la pre-incubación, se añadieron 50 \mul de solución de glicilprolilprolil-4-nitroaniliina (0,29 mM) y se realizó la medida del desarrollo de color amarillo debido a la liberación de 4-nitroanilina a 30ºC y \lambda = 405 nm durante 10 min utilizando un lector de placas (Sunrise, Tecan, Crailsheim, Alemania).
El valor CI_{50} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido). No se encontró inhibición alguna de la actividad de POP por la glutaminil-tiazolidina.
Prolidasa (dipeptidasa X-Pro)
La prolidasa (EC 3.4.13.9) fue descrita por primera vez por Bergmann & Fruton (Bergmann, M. & Fruton, JS, 1937, J. Biol. Chem. 189-202). La prolidasa libera el aminoácido N-terminal de los dipéptidos Xaa-Pro y tiene un pH óptimo entre 6 y 9.
Se disolvió prolidasa de riñón de porcino (ICN Biomedicals, Eschwege, Alemania) (1 mg/ml) en tampón de ensayo (NH_{4}(CH_{3}COO)_{2} 20 mM, MnCl_{2} 3 mM, pH 7,6). A fin de obtener una enzima plenamente activa, la solución se incubó durante 60 min a la temperatura ambiente.
Ensayo
Se mezclaron 450 \mul de glutaminil-tiazolidina en un intervalo de concentración de 5*10^{-3} M - 5*10^{-7} M con 500 \mul de solución tampón (NH_{4}(CH_{3}COO)_{2} 20 mM, pH 7,6) y 250 \mul de Ile-Pro-OH (0,5 mM en la mezcla de ensayo). La mezcla de ensayo se pre-incubó a 30ºC durante 5 min. Después de la pre-incubación, se añadieron 75 \mul de Prolidasa (diluida en relación 1:10 en tampón de ensayo) y se realizó la medida a 30ºC y \lambda = 220 nm durante 20 min utilizando un fotómetro UV/Vis, UV1 (Thermo Spectronic Cambridge, Reino Unido).
El valor CI_{50} se calculó utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., Reino Unido). Se determinó el mismo como CI50 > 3 mM para la glutaminil-tiazolidina.
Ejemplo 6 Estabilidad en plasma
Con objeto de investigar la estabilidad de la glutaminil-tiazolidina en plasma humano, se determinó la actividad de DPIV en plasma en un tiempo definido. La actividad media de DPIV en plasma humano se determinó como 43,69 U/ml. En la solución de trabajo, el plasma se diluyó en NaCl al 0,9% para fijar el nivel de actividad de DPIV en 25 U/ml.
Se incubaron plasma y glutaminil-tiazolidina en concentraciones diferentes (5*10^{-5}, 2,5*10^{-5}, 1,25*10^{-5} M en plasma) a 37ºC. En momentos puntuales definidos se tomaron muestras utilizando un pipeteador automático (Gilson 215, Manipulador de Líquidos, Gilson) y se transfirieron a una placa de microtitulación que contenía glicilprolilaminometilcumarina 5*10^{-5} M en NaCl al 0,9% + 0,15% Brij por pocillo. Después de 6 min, la reacción se paró por adición de isoleuciltiazolidina (5*10^{-5} M en solución de NaCl al 0,9%).
Se analizó la medida de la fluorescencia contra NaCl al 0,9% en plasma (patrón de referencia) utilizando un lector de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania). La semi-vida de la potencia inhibidora de la glutaminil-tiazolidina se calculó represen-tando gráficamente la actividad de la enzima en función del tiempo de reacción.
No pudo determinarse tiempo medio alguno para el compuesto. Se considera que la sustancia es estable en plasma humano durante más de 22 horas.
Ejemplo 7 Determinación de la actividad inhibidora de DPIV de la glutaminil-tiazolidina después de administración intravasal y oral a ratas Wistar Animales
Se adquirieron ratas Wistar macho (Shoe: Wist(Sho)) con un peso corporal comprendido entre 250 y 350 g de Tierzucht Schönwalde (Schönwalde, Alemania).
Condiciones de alojamiento
Los animales se alojaron en jaulas individuales en condiciones convencionales con temperatura controlada (22 \pm 2ºC) en un ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas (con encendido a las 06:00 AM). Se permitieron ad libitum comida estándar en pellets para animales (ssniff® Soest, Alemania) y agua del grifo acidificada con HCl.
Inserción de catéteres en la arteria carótida
Después de una semana al menos de adaptación a las condiciones de alojamiento, se implantaron catéteres en la arteria carótida de las ratas Wistar bajo anestesia general (inyección i.p. de 0,25 ml/kg de peso corporal de Rompun® [2%], BayerVital, Alemania y 0,5 ml/kg de peso corporal de Ketamin 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Alemania). Se dejó que los animales se recuperaran durante una semana. Los catéteres se lavaron con heparina-solución salina (100 UI/ml) tres veces por semana. En caso de disfunción del catéter, se insertó un segundo catéter en la arteria carótida contralateral de la rata respectiva. Después de una semana se recuperación de la cirugía, este animal se reintegró al estudio. En caso de disfunción del segundo catéter, el animal se eliminó del estudio. Se reclutó un nuevo animal y se continuaron los experimentos en la secuencia planificada, comenzando al menos 7 días después de la implantación del catéter.
Diseño experimental
Se administró a ratas con función del catéter intacta placebo (1 ml de solución salina, 0,54 mol/l) o 100 mg/kg de peso corporal de glutaminil-tiazolidina por la vía oral y la intravasal (intra-arterial).
Después de ayuno durante una noche, se recogieron muestras de 100 \mul de sangre arterial heparinizada a -30, -5, y 0 min. Se disolvió inmediatamente la sustancia de ensayo en 1,0 ml de solución salina (0,154 mol/l) y se administró en el minuto 0 por vía oral a través de un tubo de alimentación (75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania) o por la ruta intra-vasal. En el caso de la administración oral, se inyectó un volumen adicional de 1 ml de solución salina en el catéter arterial. En el caso de la administración intra-arterial, el catéter se lavó inmediatamente con 30 \mul de solución salina y se administró 1 ml de solución salina por vía oral a través del tubo de alimentación.
Después de la aplicación de placebo o de la sustancia de ensayo, se tomaron muestras de sangre arterial a los 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 y 120 min del catéter carotídeo de las ratas conscientes incontroladas. Todas las muestras de sangre se recogieron en tubos Eppendorf enfriados en hielo (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburgo, Alemania) llenos con 10 \mul de tampón de citrato de sodio 1 M (pH 3,0) para medida de la actividad plasmática de DPIV. Los tubos Eppendorf se centrifugaron inmediatamente (12000 rpm durante 2 min, Centrífuga Hettich EBA 12, Tuttlingen; Alemania): las fracciones de plasma se guardaron en hielo hasta su análisis o se congelaron a -20ºC hasta su análisis. Todas las muestras de plasma se marcaron con los datos siguientes:
\bullet
Número de código
\bullet
Número de animal
\bullet
Fecha de la toma de muestra
\bullet
Hora de la toma de muestra.
Métodos analíticos
La mezcla de ensayo para la determinación de la actividad plasmática de DPIV estaba constituida por 80 \mul de reactivo y 20 \mul de muestra de plasma. La medida cinética de la formación del producto amarillo 4-nitroanilina a partir del sustrato glicilprolil-4-nitroanilina se realizó a 390 nm durante 1 min a 30ºC después de 2 min de preincubación a la misma temperatura. La actividad de DPIV se expresó en mU/ml.
Métodos estadísticos
Las evaluaciones estadísticas y los gráficos se realizaron con PRIS M® 3.02 (GraphPad Software, Inc.). Todos los parámetros se analizaron de una manera descriptiva con inclusión del valor medio y la desviación estándar.
Resultados
El compuesto glutaminil-tiazolidina en una dosis de 100 mg/kg de peso corporal frente a placebo inhibía la actividad de DPIV en plasma después de administración oral e intra-vasal (véase Figura 1).
Ejemplo 8 Estudio en escala creciente de la dosis en ratas Zucker obesas después de administración oral de glutaminil-tiazolidina Animales
Se adquirieron N = 30 ratas Zucker macho (fa/fa), de una edad media de 11 semanas (5-12 semanas), peso corporal medio 350 g (150-400 g), de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Después de la entrega, los animales se mantuvieron durante más de 12 semanas hasta que prácticamente todas las ratas Zucker obesas presentaban las características de diabetes mellitus manifiesta. Se reclutó un grupo de N = 8 animales para ensayar tres dosis en escala creciente de glutaminil-tiazolidina frente a placebo (solución salina).
Condiciones de alojamiento
Los animales se alojaron en jaulas individuales en condiciones estandarizadas con temperatura controlada (22 \pm 2ºC) en un ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas (con encendido a las 06:00 AM). Se permitieron ad libitum comida estándar estéril en pellets para animales (ssniff® Soest, Alemania) y agua del grifo acidificada con HCl.
Cateterización de la arteria carótida
Las ratas Zucker obesas de 24-31 semanas (valor medio: 25 semanas) de edad, adaptadas a las condiciones de alojamiento, estaban bien preparadas para el estudio.
Se implantaron catéteres en la arteria carótida de las ratas Zucker obesas bajo anestesia general (inyección i.p. de 0,25 ml/kg de peso corporal de Rompun® [2%], BayerVital, Alemania) y 0,5 ml/kg de peso corporal de Ketamin 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Alemania). Se dejó que los animales se recuperaran durante 1 semana. Los catéteres se lavaron con heparina-solución salina (100 UI/ml) tres veces por semana.
Diseño experimental
Se administró placebo (1 ml de solución salina, 0,154 mol/l) o dosis en escala creciente de glutaminil-tiazolidina (5, 15 y 50 ml/kg de peso corporal) a grupos de N = 8 ratas Zucker obesas. Las cantidades respectivas de glutaminil-tiazolidina se disolvieron en 1000 \mul de solución salina.
Después de mantenerse en ayunas durante una noche, se administró placebo o la sustancia de ensayo a las ratas Zucker obesas por la vía del tubo de alimentación oral (15 G, 75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania) a los -10 min. Se administró un ensayo oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) con 2 g/kg de peso corporal de glucosa (solución al 40%, B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemania) a \pm0 min por la vía de un segundo tubo de alimentación. Se recogieron muestras de sangre venosa de las venas de la cola a -30 min, -15 min, \pm0 min y a los 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90, y 120 min en tubos capilares de vidrio de 20 \mul, que se introdujeron en tubos estándar llenos con 1 ml de solución para medida de glucosa en sangre.
Todas las muestras de sangre se marcaron con los datos siguientes:
\bullet
Número de código
\bullet
Número de animal
\bullet
Fecha de la toma de muestra
\bullet
Hora de la toma de muestra.
Métodos analíticos
Se midieron los niveles de glucosa utilizando el procedimiento de glucosa-oxidasa (analizador de glucosa Super G: Dr. Müller Gerätebau, Freital, Alemania).
Métodos estadísticos
Las evaluaciones estadísticas y los gráficos se realizaron con PRISM® 3.02 (GraphPad Software, Inc.). Todos los parámetros se analizaron de una manera descriptiva con inclusión del valor medio y la desviación estándar.
Efecto de la medicación sobre la tolerancia a la glucosa
Las ratas Zucker diabéticas tratadas con placebo exhibían una excursión muy elevada de la glucosa en sangre, indicativa de la intolerancia a la glucosa de la diabetes mellitus manifiesta. La administración de 5 mg/kg de peso corporal, 15 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal de glutaminil-tiazolidina dio como resultado una disminución dependiente de la dosis de los niveles elevados de glucosa en sangre y una mejora de la tolerancia a la glucosa en las ratas Zucker diabéticas (véase la Figura 2).
Ejemplo 9 Desactivación in vivo de la glutaminil-tiazolidina después de administración oral a ratas Wistar Animales/Diseño experimental
Se administró glutaminil-tiazolidina a ratas Wistar por vía oral como se describe en el Ejemplo 7.
Métodos analíticos
Después de aplicación de placebo o glutaminil-tiazolidina, se tomaron muestras de sangre arterial a los 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 y 120 min del catéter carotídeo de las ratas conscientes incontroladas para determinar la formación de productos de degradación de la glutaminil-tiazolidina. Para el análisis, se utilizó un procedimiento de extracción simple en fase sólida con cartuchos C-18 a fin de aislar los compuestos de interés del plasma. Los extractos se analizaron utilizando cromatografía líquida en fase inversa en una columna Lichrospher 60 RP Select B unida a espectrometría de masas en tándem que operaba en el modo APCI positivo. Se utilizó un método de patrón interno para la cuantificación.
Resultados
Después de la administración oral de glutaminil-tiazolidina a ratas Wistar, se encontró una degradación del compuesto. Utilizando LC/ MS, el producto de degradación pudo definirse como piroglutaminil-tiazolidina. Véanse las Figuras 3 y 4.

Claims (6)

1. Hidrocloruro de glutaminil-tiazolidina.
2. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o diluyente y un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Uso de un compuesto o composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento para inhibición de la actividad de la enzima dipeptidil-peptidasa IV o enzima afín a dipeptidil-peptidasa IV para la prevención o el tratamiento de enfermedades o afecciones relacionadas con la dipeptidil-peptidasa IV o enzimas afines a la dipeptidil-peptidasa IV.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 para disminuir los niveles elevados de glucosa en sangre en los mamíferos resultantes de la ingesta alimentaria.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de insulina.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 para la prevención o el tratamiento de artritis, obesidad, trastornos inmunes y autoinmunes, transplante de aloinjertos, cáncer, trastornos neuronales o enfermedades dérmicas.
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