PT1480961E - Inibidores de dpiv à base de glutaminilo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "INIBIDORES DE DPIV À BASE DE GLUTAMINILO"

Campo da invenção A presente invenção refere-se à área da inibição de dipeptidil peptidase IV e, mais particularmente, refere-se a cloridrato de glutaminil tiazolidina, a composições farmacêuticas contendo o referido composto e à utilização do referido composto na inibição de dipeptidil peptidase IV e da actividade enzimática semelhante a dipeptidil peptidase IV.

Antecedentes da invenção A dipeptidil peptidase IV (DPIV) é uma serina protease que cliva dipéptidos N-terminais de uma cadeia peptídica contendo, de um modo preferido, um resíduo de prolina na penúltima posição. Embora o papel biológico da DPIV em sistemas de mamíferos não tenha sido ainda completamente determinado, crê-se que desempenha um papel importante no metabolismo dos neuropéptidos, activação de células T, fixação de células de cancro ao endotélio e penetração de VIH em células linfóides.

Analogamente, verificou-se que a DPIV é responsável pela inactivação de péptido 1 semelhante a glucagon (GLP-1) e péptido insulinotrópico dependente de glucose (GIP). Uma vez que o GLP-1 é um estimulador principal da secreção de insulina pancreática e tem efeitos benéficos directos sobre a eliminação de glucose, no documento WO 97/40832 e documento U.S. N.° 6303661 demonstrou-se 1 que a inibição de DPIV e da actividade enzimática semelhante a DPIV representava uma abordagem atraente e. g. para tratamento de diabetes mellitus não insulino dependente (NIDDM). É um aspecto da presente invenção proporcionar novos inibidores de DPIV que são eficazes e. g. no tratamento de patologias mediadas por inibição de DPIV e enzimas semelhantes a DPIV, composições farmacêuticas e. g. úteis na inibição de DPIV e enzimas semelhantes a DPIV e um método para a inibição da referida actividade enzimática.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método de tratamento, em particular a um método para o tratamento de diabetes mellitus, especialmente diabetes não insulino-dependente (NIDDM) ou diabetes de Tipo 2 e patologias associadas a diabetes mellitus e com composições para utilização nesse método. A dipeptidil peptidase IV (DPIV) é uma serina protease que cliva pós-prolina (em menor grau pós-alanina, pós-serina ou pós-glicina) encontrada em vários tecidos do corpo, incluindo rim, fígado e intestino.

Sabe-se que os inibidores de DPIV podem ser úteis para o tratamento de intolerância à glucose e diabetes mellitus (Pedido de Patente Internacional, Publicação número WO 99/61431, Pederson RA et ai., Diabetes. 1998 August; 47(8):1253-8 e Pauly RP et al., Metabolism 1999 March; 48(3):385-9). Em particular o to WO 99/61431 divulga inibidores de DPIV compreendendo um resíduo de aminoácido e um grupo tiazolidina ou pirrolidina, e os seus sais, especialmente L-treo-isoleucil tiazolidina, L-alo-isoleucil tiazolidina, L-treo-isoleucil pirrolidina, L-alo-isoleucil pirrolidina, e os seus sais. 2

Exemplos adicionais de inibidores de dipeptidil peptidase IV de baixo peso molecular são agentes, tais como derivados de tetra-hidroisoquinolino-3-carboxamida, 2-cianopirroles e -pirrolidinas N-substituídos, N-(N'-glicil substituído)-2-cianopirrolidinas, N-(glicil substituído)-tiazolidinas, N-(glicil substituído)-4-cianotiazolidinas, inibidores boronilo e pirrolidinas condensadas com ciclopropilo. Inibidores de dipeptidil peptidase IV estão descritos nos documentos U.S. N.°s 6011155/ 6107317; 6110949; 6124305; 6172081/ WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105 e WO 02/02560.

Sumário da invenção A presente invenção proporciona o sal do cloridrato do composto de fórmula: O. / h2n- -CH \ h2n \ ch2 c- / -ch2 // 0 útil no tratamento de patologias mediadas

Este composto é por DPIV ou enzimas obesidade, doenças homoenxertos, cancro, semelhantes a DPIV, tais como artrite, imunes e auto-imunes, transplante de doenças neuronais e doenças dérmicas. 3

Numa forma de realização mais preferida, o composto da presente invenção melhora a tolerância à glucose por abaixamento dos níveis elevados de glucose no sangue em resposta a um desafio com glucose oral e, portanto, é útil no tratamento de diabetes mellitus não insulino-dependente.

Breve descrição dos desenhos

Pode obter-se um melhor entendimento da presente invenção com referência às figuras anexas: A figura 1 mostra a actividade de DPIV no plasma em soro de ratos Wistar após administração oral e intravasal de 100 mg/kg b.w. corporal de glutaminil tiazolidina; A figura 2 mostra a diminuição dependente da dose dos níveis de glucose no sangue em ratos Zucker diabéticos após a administração oral de 5 mg/kg, 15 mg/kg, 50 mg/kg b.w. corporal de glutaminil tiazolidina e placebo, respectivamente; A figura 3 mostra a estrutura química de piroglutaminil tiazolidina, o produto de degradação encontrado após a administração oral de glutaminil tiazolidina a ratos Wistar; e A figura 4 mostra o cromatograma de um extracto de plasma de rato obtido após a administração oral de glutaminil tiazolidina a ratos Zucker gordos. O pico a 2,95 min representa glutaminil tiazolidina e o pico a 6,57 min representa piroglutaminil tiazolidina.

Descrição pormenorizada da invenção 4 A presente invenção refere-se à área da inibição de dipeptidil peptidase IV (DPIV) e, mais particularmente, refere-se a cloridrato de glutaminil tiazolidina, com composições farmacêuticas que contêm o referido composto e à utilização do referido composto na inibição de DPIV e de actividade enzimática semelhante a DPIV. A presente invenção proporciona novos inibidores de DPIV, que são eficazes e. g. no tratamento de patologias mediadas por inibição de DPIV, composições farmacêuticas e. g. úteis na inibição de DPIV e de actividade enzimática semelhante a DPIV e um método de inibição de DPIV e de actividade enzimática semelhante a DPIV. A presente invenção proporciona o sal do cloridrato do composto de fórmula II:

N H2N-

CH \

A presente invenção inclui, ainda, no seu âmbito, os pró-fármacos do composto desta invenção. Em geral, esses pró-fármacos serão derivados funcionais do composto que pode ser prontamente convertido in vivo no composto terapeuticamente activo desejado. Assim, nestes casos, nos métodos de tratamento da presente invenção, o termo "administração" vai abranger o tratamento de vários distúrbios descritos com versões de 5 pró-fármacos do composto reivindicado, mas que converte o composto acima especificado in vivo após a administração ao indivíduo. Os processos convencionais para a selecção e preparação de derivados pró-fármacos adequados estão descritos, por exemplo, em "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985 e nos pedidos de patente DE 19828113, DE 19828114, WO 99/67228 e WO 99/67279 que aqui são dados como integralmente incorporados por referência. 0 composto, de acordo com esta invenção, tem um centro quiral e pode existir, em conformidade, como enantiómeros. Entender-se-á que todos esses isómeros e as suas misturas estão abrangidos pelo âmbito da presente invenção. Além disso, algumas das formas cristalinas do composto pode existir como polimorfos e, como tal, pretende-se que estejam incluídas na presente invenção. Além disso, o composto pode formar solvatos com água (i. e. hidratos) ou com solventes orgânicos correntes, e também se pretende que esses solvatos sejam abrangidos pelo âmbito desta invenção. 0 composto também pode ser obtido na forma do seu hidrato, ou incluir outros solventes utilizados para a sua cristalização.

Como indicado acima, o composto da presente invenção é útil na inibição de DPIV e de actividade enzimática semelhante a DPIV. A aptidão do composto da presente invenção para inibir DPIV e a actividade enzimática semelhante a DPIV pode ser demonstrada utilizando o ensaio de actividade de DPIV para determinação dos valores de Ki in vitro e em plasma humano, como descrito nos exemplos 2 e 3. Os valores de Ki do composto da presente invenção foi determinado para glutaminil tiazolidina como Ki = 3,12*10“^ M ± 5,11*10_10 M contra DPIV de fígado de porco. O valor de Ki do composto da presente invenção foi determinado para glutaminil 6 tiazolidina como Ki = 4,03*10 ^ M ± 2,19*10 10 M após 5 min e 5,13*10“^ M ± 1,26*10“0 M após 22 horas de pré-incubação em plasma humano. A aptidão do composto da presente invenção para inibir DPIV in vivo pode ser demonstrada por administração oral ou intravenosa a ratos Wistar, como descrito no exemplo 7. O composto da presente invenção inibe a actividade de DPIV in vivo após administração oral e intravenosa a ratos Wistar. A DPIV está presente numa grande variedade de orgãos e tecidos de mamíferos e. g. bordadura em escova do intestino (Gutschmidt S. et al., "In situ" - measurements of protein contents in the brush border region along rat jejunal villi and their correlations with four enzyme activities. Histochemistry 1981, 72(3), 467-79), epitélios exócrinos, hepatócitos, túbulos renais, endotélios, miofibroblastos (Feller A. C. et ai., A monoclonal antibody detecting dipeptidylpeptidase IV in human tissue. Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1986/ 409(2):263-73), células nervosas, membranas laterais de certos epitélios superficiais, e. g. trompa de Falópio, útero e glândula vesicular, no citoplasma luminal, e. g., do epitélio da glândula vesicular e em células da mucosa da glândula de Brunner (Hartel S. et ai., Dipeptidyl peptidase (DPP) IV in rat organs. Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry. Histochemistry 1988; 89(2): 151-61), órgãos reprodutores, e. g. cauda e ampola do epidídimo, vesículas seminais e as suas secreções (Agrawal & Vanha-Perttula, Dipeptidyl peptidases in bovine reproductive organs and secretions. Int. J. Androl. 1986, 9(6):435-52). No soro humano, estão presentes duas formas moleculares de dipeptidil peptidase (Krepela E. et ai., Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normal human serum. Physiol. Bohemoslov. 1983, 32(6):486-96). 7 A forma de peso molecular elevado de DPIV do soro é expressa na superfície de células T activadas (Duke-Cohan J. S. et al., Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV (CD26) is similar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells. J. Immunol. 1996, 156(5): 1714-21). 0 composto da presente invenção é capaz de inibir DPIV in vivo. Numa forma de realização da presente invenção, estão abrangidas pelo âmbito desta invenção todas as formas moleculares, homólogos e epitopos de DPIV de todos os tecidos e órgãos de mamíferos, bem como os que ainda não foram descobertos.

Entre o grupo raro de proteases específicas de prolina, acreditava-se inicialmente que a DPIV era a única enzima ligada à membrana específica de prolina como o penúltimo resíduo do terminal amino da cadeia polipeptídica. Contudo, foram identificadas recentemente outras moléculas, mesmo estruturalmente não homólogas de DPIV, mas possuindo actividade enzimática correspondente. As enzimas semelhantes a DPIV que foram identificadas até agora, são, e. g., proteína a de activação de fibroblastos, dipeptidil peptidase IV β, proteína semelhante a dipeptidil aminopeptidase, dipeptidase ácida α-ligada N-acetilada, prolina dipeptidase de células quiescentes, dipeptidil peptidase II, atractina e proteína relacionada com dipeptidil peptidase IV (DPP 8), e estão descritas no artigo de revisão por Sedo & Malik (Sedo & Malik, Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous proteins or homologous activities? Biochimica et Biophysica Acta 2001, 36506: 1-10).

Mais enzimas semelhantes a DPIV estão divulgados nos documentos WO 01/19866, WO 02/04610, WO 02/34900 e WO 02/31134. O documento WO 01/19866 divulga uma nova dipeptidil aminopeptidase humana (DPP8) com semelhanças estruturais e funcionais a DPIV e proteina de activação de fibroblastos (FAP). 0 documento WO 02/04610 proporciona reagentes que regulam a enzima semelhante a dipeptidil peptidase IV humana e reagentes que se ligam ao produto génico enzima semelhante a dipeptidil peptidase IV humana. Estes reagentes podem desempenhar um papel na prevenção, melhoramento ou correcção de disfunções ou doenças incluindo, mas não limitadas a tumores e doenças do sistema nervoso periférico e central, incluindo dor e distúrbios neurodegenerativos. A enzima semelhante a dipeptidil peptidase IV do documento WO 02/04610 é bem conhecida na técnica. Na base de dados Gene Bank, esta enzima está registada como KIAA1492 (registo em Fevereiro de 2001, apresentado em 4 de Abril de 2000, AB040925). O documento WO 02/34900 divulga uma dipeptidil peptidase 9 (DPP9) com homologia significativa com as sequências de aminoácidos de DPIV e DPP8. O documento WO 02/31134 divulga três enzimas semelhantes a DPIV, DPRP1, DPRP2 e DPRP3. A análise das sequências mostrou que a DPRP1 é idêntica a DPP8, como divulgado no documento WO 01/19866, que a DPRP2 é idêntica à DPP9 e que a DPRP3 é idêntica a KIAA1492 como divulgado no WO 02/04610.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, pretende-se que estejam abrangidas pelo âmbito desta invenção todas as formas moleculares, homólogos e epitopos de proteinas, compreendendo actividade enzimática semelhante a DPIV, de todos os tecidos e órgãos de mamiferos, bem como as que ainda não foram descobertas. A aptidão do composto da presente invenção, para inibir enzimas semelhantes a DPIV pode ser demonstrada utilizando um ensaio de actividade enzimática para determinação dos valores de Ki in vitro como descrito no exemplo 4. Os valores de Kf do composto da presente invenção contra dipeptidil peptidase II porcina foi determinado como Ki = 1,07*10“^ M ± 3,81*10“^ M para 9 glutaminil tiazolidina.

Noutra forma de realização da presente invenção, o composto da presente invenção só tem baixa ou nenhuma actividade inibidora contra enzimas especificas de prolina não DPIV e não semelhantes a DPIV. Como descrito no exemplo 5, com glutaminil tiazolidina não se observou inibição de dipeptidil peptidase I e prolil oligopeptidase. Contra prolidase, o composto apresentou uma eficácia inferior comparada com DPIV. Os valores da IC50 contra prolidase foram determinados como IC50 > 3 mM para glutaminil tiazolidina.

Devido à sua aptidão para inibir DPIV e enzimas semelhantes a DPIV, o composto da presente invenção é útil no tratamento de patologias mediadas pelas referidas actividades enzimáticas. Assim, o composto aqui divulgado é útil no tratamento de patologias, tais como diabetes mellitus não insulino dependente, artrite, obesidade, doenças imunes e auto-imunes, transplante de homoenxertos, cancro, doenças neuronais como esclerose múltipla e doenças dérmicas.

Numa forma de realização mais preferida desta invenção, o composto da presente invenção melhora a tolerância à glucose por abaixamentos dos niveis aumentados de glucose no sangue em resposta a um desafio com glucose por via oral e, portanto, são úteis no tratamento de diabetes mellitus não insulino dependente. A aptidão dos compostos da presente invenção, e das suas correspondentes formas de sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, para melhorar a tolerância à glucose em resposta a um desafio com glucose por via oral pode ser determinada em ratos Zucker diabéticos. O método está descrito nos exemplo 8. A administração oral de 5 mg/kg de peso, 15 mg/kg e 50 mg/kg de peso de glutaminil tiazolidina ou de resultou numa 10 diminuição dependente da dose dos niveis elevados de glucose no sangue e, portanto, num melhoramento da tolerância à glucose em ratos Zucker diabéticos. 0 composto da presente invenção é, de acordo com o exemplo 6, estável em plasma humano. Surpreendentemente, e como uma forma de realização preferida adicional da presente invenção, o composto da presente invenção pode ser degradado in vivo após administração a um mamífero. A aptidão do composto da presente invenção para ser degradado in vivo pode ser determinada utilizando o modelo de rato Wistar e análise subsequente por LC/MS. Verificou-se que a glutaminil tiazolidina era degradada após administração oral a ratos Wistar, à respectiva piroglutaminil tiazolidina. A presente invenção proporciona, portanto, um método de tratamento de uma patologia mediada por modulação de DPIV ou da actividade enzimática semelhante a DPIV num indivíduo dele necessitado que compreende a administração do composto da presente invenção ou das suas composições farmacêuticas numa quantidade e regime de dosagem terapeuticamente eficazes para tratar a patologia. Adicionalmente, a presente invenção inclui a utilização do composto da presente invenção para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma patologia mediada por modulação da actividade de DPIV num indivíduo. 0 composto pode ser administrado a um doente por qualquer via de administração convencional, incluindo, mas não limitada a intravenosa, oral, subcutânea, intramuscular, intradérmica e parentérica.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona formulações do composto da presente invenção em 11 composições farmacêuticas. 0 termo "indivíduo", tal como aqui utilizado, refere-se a um animal, de um modo preferido, um mamífero, de um modo mais preferido, um ser humano, que foi objecto de tratamento, observação ou experimentação. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, significa a quantidade de composto activo, ou de agente farmacêutico que produz uma resposta biológica ou medicinal num sistema de tecidos, animal ou humano, que é procurada por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui o alívio dos sintomas da doença ou distúrbio a ser tratado.

Tal como aqui utilizado, o termo "composição" pretende abranger um produto compreendendo os compostos reivindicados nas quantidades terapeuticamente eficazes, bem como qualquer produto que resulta, directamente ou indirectamente, das associações dos compostos reivindicados.

Para preparar as composições farmacêuticas desta invenção, mistura-se intimamente o composto da presente invenção, especialmente como o ingrediente activo, com um veículo farmacêutico, de acordo com as técnicas convencionais de preparação de composições farmacêuticas, veículo esse que pode tomar uma variedade de formas, dependendo da forma da preparação desejada para administração, e. g., oral ou parentérica tal como intramuscular. Na preparação de composições em forma de dosagem oral, pode utilizar-se qualquer dos meios farmacêuticos habituais. Assim, para preparações líquidas orais, tais como por exemplo, suspensões, elixires e soluções, os veículos e aditivos adequados podem com vantagem incluir água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e 12 outros semelhantes; para preparações sólidas orais, tais como, por exemplo, pós, cápsulas, cápsulas de gelatina e comprimidos, os veículos e aditivos adequados incluem amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes desintegrantes e outros semelhantes. Devido à facilidade na sua administração, os comprimidos e as cápsulas representam a forma de dosagem unitária oral mais vantajosa, caso em que se utiliza veículos farmacêuticos sólidos. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com açúcar ou com revestimento entérico por técnicas correntes. Para parentéricos, o veículo normalmente compreenderá água estéril, embora possam ser incluídos outros componentes, por exemplo, para objectivos tais como auxiliar a solubilização ou para conservação.

Também podem ser preparadas suspensões injectáveis, caso em que se pode utilizar veículos líquidos apropriados, agentes de suspensão e outros semelhantes. As composições farmacêuticas aqui descritas conterão, por unidade de dosagem, e. g., comprimido, cápsula, pó, injecção, colher de chá e outros semelhantes, uma quantidade do ingrediente activo necessário para administrar uma dose eficaz, tal como descrito acima. As composições farmacêuticas aqui descritas conterão, por unidade de dosagem, e. g., comprimido, cápsula, pó, injecção, supositório, colher de chá e outros semelhantes, de cerca de 0,01 mg a cerca de 1000 mg (de um modo preferido cerca de 5 a cerca de 500 mg) e podem ser administradas numa dosagem desde cerca de 0,1 a cerca de 300 mg/kg de peso corporal por dia (de um modo preferido 1 a 50 mg/kg por dia). As dosagens, contudo, podem ser variadas dependendo dos requisitos dos doentes e da gravidade da patologia a ser tratada. Pode utilizar-se administração diária ou dosagem pós-periódica. Tipicamente a dosagem será regulada pelo médico, com base nas caracteristicas do doente, do seu estado e do efeito terapêutico desej ado. 13

De um modo preferido, estas composições estão em formas de dosagem unitárias, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parentésicas estéreis, produtos para pulverização calibrada de aerossoles ou líquidos, gotas, ampolas, dispositivos auto-injectores ou supositórios; para administração oral, parentérica, intranasal, sublingual ou rectal, ou para administração por inalação ou insuflação. Alternativamente, a composição pode ser apresentada numa forma adequada para administração uma vez por semana ou uma vez por mês. Para a preparação de composições sólidas, tais como comprimidos, o ingrediente activo principal é idealmente misturado com um veículo farmacêutico, e. g. componentes convencionais para produção de comprimidos, tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, e. g. água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogénea do composto da presente. Quando se refere a estas composições de pré-formulação como homogéneas, significa-se que o ingrediente activo está disperso idealmente regularmente através da composição, de tal modo que a composição pode ser prontamente subdividida em formas de dosagem igualmente eficazes, tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta composição de pré-formulação sólida pode então ser subdividida em formas de dosagem unitárias do tipo descrito acima contendo desde cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg, de um modo preferido, desde cerca de 5 a cerca de 500 mg do ingrediente activo da presente invenção.

Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem, com vantagem, ser revestidos ou formulados de outro modo para produzir uma forma de dosagem que proporciona a vantagem da acção prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e de dosagem externa, estando o 14 último na forma de um envelope do primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente interior passe intacto para o duodeno ou seja atrasado na libertação. Pode utilizar-se uma variedade de materiais para essas camadas ou revestimentos entéricos, incluindo esses materiais diversos ácidos poliméricos com como materiais, tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

As formas liquidas em que as novas composições da presente invenção podem ser incorporadas com vantagem, para administração, oral ou por injecção, incluem soluções aquosas, xaropes adequadamente aromatizados, suspensões aquosas ou oleosas e emulsões aromatizadas com óleos alimentares, tais como óleo de sementes de algodoeiro, óleo de sésamo, óleo de coco ou óleo de amendoim, bem como elixires e veículos farmacêuticos semelhantes. Os agentes de dispersão ou de suspensão adequados para suspensões aquosas incluem gomas sintéticas e naturais, tais como tragacanta, acácia, alginato, dextrano, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, polivinilpirrolidona ou gelatina.

Quando os processos para a preparação do composto, de acordo com a invenção, dão origem a uma mistura de estereoisómeros, estes isómeros podem ser separados por técnicas convencionais, tais como cromatografia preparativa. 0 composto pode ser preparado em forma racémica, ou os enantiómeros individuais podem ser preparados por síntese enantioespecífica ou por resolução. 0 composto pode, por exemplo, ser resolvido nos enantiómeros seu constituinte por técnicas correntes, tais como a formação de pares diastereoméricas por formação de sais com um ácido opticamente activo, tal como ácido (-)-di-p-toluoil-d-tartárico e/ou ácido (+)-di-p-toluoil-l-tartárico seguida por cristalização fraccionada e pela regeneração da base livre. 0 composto também pode ser resolvido por formação de ésteres ou 15 amidas diastereoméricas, seguida por separação cromatográfica e remoção do auxiliar quiral. Alternativamente, o composto pode ser resolvido utilizando uma coluna de HPLC quiral.

Durante qualquer dos processos para a preparação do composto da presente invenção, pode ser necessário e/ou desejável proteger grupos sensíveis ou reactivos em qualquer das moléculas em causa. Isto pode se feito por meio de grupos protectores convencionais, tais como os descritos em Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J. F. W. McOmie, Plenum Press, 1973/ e T.W. Greene & P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991, aqui dados como integralmente incorporados por referência. Os grupos protectores podem ser removidos num estádio subsequente conveniente utilizando métodos conhecidos na técnica. 0 método de tratamento de patologias moduladas por dipeptidil peptidase IV e enzimas semelhantes a DPIV descritas na presente invenção também pode ser realizado utilizando uma composição farmacêutica compreendendo o composto tal como aqui definidos e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode conter entre cerca de 0,01 mg e 1000 mg, de um modo preferido, cerca de 5 a cerca de 500 mg, do composto, e pode ser constituída em qualquer forma adequada para o modo de administração seleccionado. Os veículos incluem excipientes farmacêuticos necessários e inertes, incluindo, mas não limitados a aglutinantes, agentes de suspensão, lubrificantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, corantes e revestimentos. As composições adequadas para administração oral incluem formas sólidas, tais como pílulas, comprimidos, caplets, cápsulas (incluindo cada uma delas formulações de libertação imediata, libertação temporizada e libertação controlada), grânulos e pós, e formas líquidas, tais como soluções, xaropes, 16 elixires, emulsões e suspensões. As formas úteis para administração parentérica incluem soluções, emulsões e suspensões estéreis.

Com vantagem, o composto da presente invenção pode ser administrados numa dose diária única, ou a dosagem diária total pode ser administrada em doses divididas por duas, três ou quatro vezes por dia. Além disso, o composto da presente invenção pode ser administrado em forma intranasal por meio de uso tópico de veículos intranasais adequados, ou através de pensos transdérmicos, bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Para ser administrada na forma de sistema de administração transdérmica, a administração da dosagem será, é claro, contínua e não intermitente ao longo do regime de dosagem e a concentração da dosagem terá de ser modificada em conformidade para se obter os efeitos terapêuticos desejados.

De um modo mais preferido, para administração oral na forma de um comprimido ou cápsula, o componente fármaco activo pode ser associado a um veículo inerte não tóxico farmaceuticamente aceitável tal como etanol, glicerol, água e outros semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, também podem ser incorporados na mistura aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes adequados. Os aglutinantes adequados incluem, sem limitação, amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glucose ou beta-lactose, edulcorantes do milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanta ou oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e outros semelhantes. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, agar, bentonite, goma xantana e outros semelhantes.

As formas líquidas são adequadas em agentes de suspensão ou 17 de dispersão aromatizados, tais como as gomas sintéticas e naturais, por exemplo, tragacanta, acácia, metil celulose e outros semelhantes. Para administração parentérica, são desejadas suspensões e soluções estéreis. As preparações isotónicas, que geralmente, contêm conservantes adequados são utilizadas quando é desejada administração intravenosa. 0 composto da presente invenção também pode ser administrado na forma de sistemas de administração lipossomais, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, tais como colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas utilizando processos bem descritos na técnica. 0 composto da presente invenção também pode ser acoplado com polímeros solúveis como veículos para direccionamento de fármacos. Esses polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poli-hidroxipropil-metacrilamido-fenol, poli-hidroxietilaspartamido-fenol ou polietil eneoxidespolilisina substituída com resíduo de palmitoílo. Além disso, o composto da presente invenção pode ser acoplado a uma classe de polímeros biodegradáveis, úteis para conseguir a libertação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, poli ε-caprolactona, ácido poli-hidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, poli-dihidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de blocos reticulados ou anfipáticos de hidrogeles. 0 composto desta invenção pode ser administrado em qualquer das composições anteriores e de acordo com regimes de dosagem estabelecidos na técnica, sempre que é necessário o tratamento das doenças anteriormente referidas. 18 A dosagem diária dos produtos pode ser variada numa ampla gama desde 0,01 a 1,000 mg por ser humano adulto por dia. Para administração oral, as composições são preferencialmente proporcionadas na forma de comprimidos contendo 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250, 500 e 1000 miligramas do ingrediente activo para o ajustamento sintomático da dosagem ao doente a ser tratado. Uma quantidade eficaz do fármaco é geralmente administrada a um nivel de dosagem desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 300 mg/kg de peso corporal por dia. De um modo preferido, a gama é desde cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal por dia. Os compostos podem ser administrados num regime de 1 a 4 vezes por dia.

As dosagens óptimas a ser administradas podem ser prontamente determinadas pelos especialistas na técnica, e variarão com o modo de administração, a concentração da preparação, a biodisponibilidade devida ao modo de administração e ao avanço da patologia da doença. Além disso, devem ser genericamente considerados no ajustamento das dosagens factores associados ao doente especifico a ser tratado, incluindo idade do doente, peso, dieta e momento da administração. O composto ou composições da presente invenção pode ser tomado antes de uma refeição, com a refeição ou depois de uma refeição.

Quando tomados antes de uma refeição o composto ou composições da presente invenção podem ser tomados 1 hora, de um modo preferido 30 ou até 15 ou 5 minutos antes de comer.

Quando tomados à refeição, o composto ou composições da presente invenção podem ser misturados com a refeição ou tomados numa forma de dosagem separada como descrito acima. 19

Quando tomados após uma refeição, o composto ou composições da presente invenção podem ser tomados 5, 15 ou 30 minutos ou até 1 hora depois de terminada a refeição.

Exemplos

Exemplo 1: Síntese de cloridrato de glutaminil tiazolidina

Acilação:

Dissolveu-se N-t-butil-oxicarbonilglutamina (2,0 g, 8,12 mmol) em 5 mL de THF e levou-se a -15 °C. A essa mistura adicionou-se CAIBE (cloroformato de isobutilo) (1,06 mL, 8,12 mmol) e 4-metilmorfolina (0,895 mL, 8,12 mmol) e a solução foi agitada durante 15 min. A formação do anidrido misto foi verificada por TLC (eluente: CHCl3/MeOH: 9/1). Após aquecimento a -10 °C, adicionou-se outro equivalente de 4-metilmorfolina (0,895 mL, 8,12 mmol) e cloridrato de tiazolidina (1,02 g, 8,12 mmol). A mistura foi levada à temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro.

Processamento: O sedimento formado foi separado por filtração e o solvente foi evaporado. O óleo resultante foi retomado em clorofórmio (20 mL) e lavado com uma solução saturada de hidrogenossulfato de sódio seguida por uma solução saturada de bicarbonato de sódio, água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi separada, seca e evaporada. O produto resultante foi 20 verificado quanto à pureza por TLC (eluente: CHCl3/MeOH: 9/1). Rendimento: 1,64 g, sólido

Clivagem:

Dissolveu-se 640 mg do composto Boc-protegido sólido resultante em 3,1 mL de HC1 gelado em dioxano (12,98 M, 20 equivalentes) e deixado em gelo. A evolução da reacção foi monitorizada por TLC (eluente: CHCl3/MeOH: 9/1). Depois de completada a reacção o solvente foi removido e o óleo resultante foi retomado em metanol e evaporado de novo. Depois disso o óleo resultante foi seco sobre pentóxido de fósforo e triturado duas vezes com éter dietilico. A pureza foi verificada por HPLC. Rendimento: 0,265 g A pureza foi verificada por HPLC. A identidade do produto da reacção foi verificada por análise por RMN.

Exemplo 2: Determinação de K±

Para a determinação do Ki de glutaminil pirrolidina utilizou-se dipeptidil peptidase IV de rim de porco com uma actividade especifica contra glicilprolil-4-nitroanilina de 37,5 U/mg e uma concentração de enzima de 1,41 mg/mL na solução mãe. 21

Mistura de Ensaio: 100 pL de glutaminil tiazolidina numa gama de concentrações de l*10-6 m _ i*io-8 m (glutaminil tiazolidina), respectivamente, foi misturado com 50 pL de glicilprolil-4-nitroanilina em diferentes concentrações (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) e 100 pL de HEPES (40 mM, pH 7,6; força iónica = 0,125). A mistura de ensaio foi pré-incubada a 30 °C durante 30 min. Após a pré-incubação, adicionou-se 20 pL de DPIV (diluído 1:600) e a medição do desenvolvimento da cor amarela devida à libertação de 4-nitroanilina foi realizada a 30 °C e λ = 405 nm durante 10 min utilizando um leitor de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). O valor de Ki foi calculado utilizando o Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd, UK) baseados numa inibição competitiva de DPIV por glutaminil tiazolidina. Foi determinado para glutaminil tiazolidina como Ki = 3,12*10“^ M ± 5,11*10“-*-^ M.

Exemplo 3: Determinação do K± em Plasma Humano O plasma humano contém actividade libertadora de Xaa-Pro N-terminal.

Misturou-se 70 pL de glutaminil tiazolidina numa gama de concentração de 1*10“^ M - 1*10“^ M (glutaminil tiazolidina) respectivamente com 50 pL de glicilprolil-4-nitroanilina em diferentes concentrações (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) e 100 22 yL de HEPES (40 mM, pH 7,6). A mistura de ensaio foi pré-incubada a 30 °C durante 5 min e 22 horas respectivamente. Depois da pré-incubação, adicionou-se 50 yL de plasma humano e a medição do desenvolvimento da cor amarela devida à libertação de 4-nitroanilina foi realizada a 30 °C e λ = 405 nm durante 10 min utilizando um leitor de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). O valor de Ki foi calculado utilizando Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd, UK) baseado numa inibição competitiva de DPIV por glutaminil tiazolidina. Foi determinado para glutaminil tiazolidina como Ki = 4,03*10“^ Μ ± 2,19*10“10 M após 5 min e 5,13*10“^ M ± 1,26*10“^ M após 22 horas de pré-incubação.

Exemplo 4: Inibição de enzimas semelhantes a DPIV dipeptidil peptidase II A DP II (3.4.14.2) liberta dipéptidos N-terminais de oligopéptidos se a extremidade N não estiver protonada (McDonald, J. K., Ellis, S. & Reilly, T. J., 1966, J. Biol. Chem., 241, 1494-1501) . Pro e Ala em posição Pi são residuos preferidos. A actividade enzimática é descrita como actividade semelhante a DPIV, mas a DP II tem um pH óptimo ácido. A enzima utilizada foi purificada de rim de porco.

Ensaio:

Misturou-se 100 yL de glutaminil tiazolidina numa gama de concentração de 1*10-4 M - 5*10“^ m COm 100 yL de solução tampão (HEPES 40 mM, pH 7,6, 0,015% Brij, DTT a 1 mM), 50 yL de solução de lisilalanilaminometilcumarina (5 mM) e 20 yL de DP II porcina 23 (diluída 250 vezes em solução tampão). A determinação da fluorescência foi realizada a 30 °C e λ = 380 nm, λ . , = excitaçao ’ emissão 465 nm durante 25 min utilizando um leitor de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). O valor de Kf foi calculado utilizando o Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK) e foi determinado como Kf = 1,07* 10-5 m + 3,81*10“^ M para glutaminil tiazolidina.

Exemplo 5: Enzimas com reacção cruzada A glutaminil tiazolidina foi testada quanto à sua potência para reacção cruzada contra dipeptidil peptidase I, prolil oligopeptidase e prolidase.

Dipeptidil peptidase I (DP I, catepsina C) : A DP I ou catepsina C é uma cisteína protease lisossomal que separa dipéptidos por clivagem a partir da extremidade N dos seus substratos (Gutman, H. R. & Fruton, J. S., 1948, J. Biol. Chem., 174, 851-858). É classificada como uma cisteína protease. A enzima utilizada foi adquirida a Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Para se obter uma enzima totalmente activa, a enzima foi diluída 1000 vezes em tampão MES pH 5, 6 (MES 40 mM, DTT a 4 mM, KC1 a 4 mM, EDTA a 2 mM, 0,015% Brij) e pré-incubada durante 30 min a 30 °C.

Ensaio:

Misturou-se 50 yL de glutaminil tiazolidina numa gama de 24 concentração de l*10-5 M - 1*10-^ M com 110 pL de mistura tampão-enzima. A mistura de ensaio foi pré-incubada a 30 °C durante 15 min. Após a pré-incubação, adicionou-se 100 pL de histidilseril-β-ηίtroanilina (2 x 10-5 M) e a medição do desenvolvimento da cor amarela devida à libertação de β-nitroanilina foi realizada a 30 °C e λ _ = 380 nm, λ „ = ~ excitaçao ' emissão 465 nm durante 10 min, utilizando um leitor de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). O valor da IC50 foi calculado utilizando o Graphit 4,0,15 (Erithacus Software, Ltd., UK) . Não se observou inibição da actividade enzimática de DP I por glutaminil tiazolidina.

Prolil oligopeptidase (POP) A prolil oligopeptidase (EC 3.4.21.26) é uma endoprotease do tipo serina que separa por clivagem os péptidos na parte N-terminal da ligação Xaa-Pro (Walter, R., Shlank, H., Glass, J. D., Schwartz, I. L. & Kerenyi, T. D., 1971, Science, 173, 827-829) . Os substratos são péptidos com um peso molecular até 3000 Da. A enzima utilizada foi uma prolil oligopeptidase humana recombinante. A expressão recombinante foi realizada em E. coli em condições correntes como descrito no estado da técnica.

Ensaio:

Misturou-se 100 pL de glutaminil tiazolidina na gama de concentrações de 1*10“^ m - 5*10“^ m com 100 pL de solução tampão (HEPES 40 mM, pH 7,6, 0,015% Brij, DDT a 1 mM) e 20 pL de solução 25 de POP. A mistura de ensaio foi pré-incubada a 30 °C durante 15 min. Depois da pré-incubação, adicionou-se 50 pL de solução de glicilprolilprolil-4-nitroanilina (0,29 mM) e a medição do desenvolvimento da cor amarela devida à libertação de 4-nitroanilina foi realizada a 30 °C e λ = 405 nm durante 10 min, utilizando um leitor de placas (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). O valor de Ki foi calculado utilizando o Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd, UK). Não se observou inibição da actividade de POP por glutaminil tiazolidina.

Prolidase (X-Pro dipeptidase) A prolidase (EC 3.4.13.9) foi pela primeira vez descrita por Bergmann & Fruton (Bergmann, M. & Fruton, J. S., 1937, J.

Biol. Chem. 189-202). A prolidase liberta o aminoácido N-terminal de dipéptidos Xaa-Pro e tem um pH óptimo entre 6 e 9.

Solubilizou-se prolidase de rim de porco (ICN Biomedicals, Eschwege, Alemanha) (1 mg/mL) em tampão de ensaio (NH4(CH3COO)2 20 mM, MnCl2 a 3 mM, pH 7,6) . Para se obter uma enzima completamente activa a solução foi incubada durante 60 min à temperatura ambiente.

Ensaio:

Misturou-se 450 pL de glutaminil tiazolidina na gama de concentrações de 5*10-3 μ - 5*10-^ M com 500 pL de solução tampão (NH4 (CH3COO) 2 20 mM, pH 7,6) e 250 pL de Ile-Pro-OH (0,5 mM na mistura de ensaio) . A mistura de ensaio foi pré-incubada a 30 °C 26 durante 5 min. Depois da pré-incubação, adicionou-se 75 yL de prolidase (diluída 1:10 em tampão de ensaio) e a determinação foi realizada a 30 °C e λ = 220 nm durante 20 min utilizando um fotómetro de UV/Vis, UV1 (Thermo Spectronic, Cambridge, UK). O valore de IC50 foi calculado utilizando o Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd, UK) . Foi determinado IC50 >3 mM para glutaminil tiazolidina.

Exemplo 6: Estabilidade no plasma

Para investigar a estabilidade de glutaminil tiazolidina em plasma humano, a actividade de DPIV em plasma foi determinada num período de tempo definido. A actividade média de DPIV em plasma humano foi determinada como 43,69 U/mL. Na solução de trabalho, o plasma foi diluído em NaCl a 0,9% para fixar o nível de actividade de DPIV em 25 U/mL.

Incubou-se plasma e glutaminil tiazolidina em diferentes concentrações (5*10“^, 2,5*10“^, 1,25*10“^ M in plasma) a 37 °C.

Em pontos de tempo definidos retirou-se amostras utilizando uma pipeta robotizada (Gilson 215, Liquid handler, Gilson) e transferiu-se para uma placa de microtitulação contendo 5*10“^ M de glicilprolilaminometilcumarina em NaCl a 0,9% + 0,15% de Brij por poço. Após 6 min a reacção foi parada por adição de isoleuciltiazolidina (5*10“^ M em solução de NaCl a 0,9%). A determinação da fluorescência foi realizada contra NaCl a 0,9% em plasma (padrão de referência) utilizando um leitor de placas (HTS7000plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). A semi-vida da potência inibidora de glutaminil tiazolidina foi calculada a partir do gráfico da actividade enzimática em função 27 do tempo de reacção.

Para o composto, não foi possível determinar a semi-vida. A substância é considerada como sendo estável em plasma humano durante 22 horas.

Exemplo 7: Determinação da actividade inibidora de DPIV de glutaminil tiazolidina após administração intravasal e oral a ratos Wistar

Animais

Ratos Wistar machos (Shoe: Wist(Sho)) com um peso corporal entre 250 e 350 g foram adquiridos a Tierzucht Schonwalde (Schõnwalde, Alemanha).

Condições de alojamento

Os animais foram alojados em gaiolas individuais em condições convencionais, com temperatura controlada (22 ± 2 °C) , num ciclo de 12/12 horas de claro/escuro (luz acesa às 06:00 h) .

Ração granulada corrente (ssniff® Soest, Alemanha) e água da torneira acidificada com HC1 foram permitidos ad libitum.

Inserção de cateter na artéria carótida

Após h uma semana de adaptação às condições de alojamento, implantou-se cateteres na artéria carótida dos ratos Wistar com anestesia geral (injecção i.p. de 0,25 mL/kg de peso de Rompun® 28 [2%] , BayerVital, Alemanha e 0,5 mL/kg de peso de Ketamin 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Alemanha). Deixou-se que os animais recuperassem durante uma semana. Os cateteres foram lavados com soro fisiológico heparinizado (100 UI/mL) três vezes por semana. No caso de disfunção do cateter, foi inserido um segundo cateter na artéria carótida contra-lateral do respectivo rato. Após uma semana de recuperação da cirurgia, este animal foi reintegrado no estudo. No caso de disfunção do segundo cateter, o animal foi retirado do estudo. Foi recrutado um novo animal e as experiências prosseguiram na sequência planeada, começando, pelo menos, 7 dias após a implantação do cateter.

Concepção experimental A ratos com cateter com funcionamento intacto foram administrados placebo (1 mL de soro fisiológico, 0,154 mol/L) ou 100 mg/kg de peso de glutaminil tiazolidina pela via oral e intravasal (intra-arterial).

Após jejum de um dia para o outro, colheu-se uma amostra de

100 yL de sangue arterial heparinizado aos -30, -5 e 0 min. A substância de teste foi dissolvida de fresco em 1,0 mL de soro fisiológico (0,154 mol/L) e foi administrada aos 0 min oralmente através de uma sonda (75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha) ou pela via intravasal. No caso da administração oral, injectou-se um volume adicional de 1 mL de soro fisiológico na cateter arterial. No caso da administração intra-arterial, o cateter foi imediatamente lavado com 30 yL de soro fisiológico e administrou-se mais 1 mL de soro fisiológico por via oral através da sonda. Após a aplicação do placebo ou das substâncias de teste, colheu-se amostras de sangue arterial aos 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 e 120 min do cateter da carótida dos ratos conscientes não restringidos. Todas as amostras de sangue foram 29 colhidas para tubos Eppendorf gelados (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburgo, Alemanha) contendo 10 pL de tampão de citrato de sódio 1 M (pH 3,0) para determinação da actividade de DPIV no plasma. Os tubos Eppendorf foram imediatamente centrifugados (12000 rpm durante 2 min, Hettich Zentrifuge EBA 12, Tuttlingen; Alemanha): As fracções de plasma foram armazenadas em gelo até à análise ou foram congeladas a -20 °C até à análise. Todas as amostras de plasma foram rotuladas com os seguintes dados: • Número de código • Número do Animal • Data de recolha da amostra • Hora de recolha da amostra Métodos analíticos A mistura de ensaio para a determinação da actividade de DPIV no plasma consistia em 80 pL de reagente e 20 pL de amostra de plasma. A determinação cinética da formação do produto amarelo 4-nitroanilina a partir do substrato glicilprolil-4-nitroanilina foi realizada a 390 nm durante 1 min a 30 °C após 2 min de pré-incubação à mesma temperatura. A actividade de DPIV foi expressa em mU/mL. Métodos estatísticos

As avaliações estatísticas e gráficos foram realizados com o PRISM® 3.02 (GraphPad Software, Inc.). Todos os parâmetros foram analisados de modo descritivo incluindo média e SD.

Resultados O composto glutaminil tiazolidina numa dose de 100 mg/kg em peso vs. placebo inibiram a actividade de DPIV no plasma após 30 administração oral e intravasal (ver figura 1).

Exemplo 8: Estudo do aumento da dose em ratos Zucker obesos após administração oral de glutaminil tiazolidina

Animais N=30 ratos Zucker machos (fa/fa), com idade média de 11 semanas (5-12 semanas), peso corporal médio de 350 g (150-400 g) foram adquiridos a Charles River (Sulzfeld, Alemanha). Após a entrega foram mantidos durante > 12 semanas até praticamente todos os ratos Zucker obesos terem as caracteristicas de diabetes mellitus manifesta. Foi recrutado um grupo de N=8 animais para teste de três doses crescentes de glutaminil tiazolidina vs. placebo (soro fisiológico).

Condições de alojamento

Os animais foram alojados em gaiolas individuais em condições convencionais com temperatura controlada (22 ± 2 °C) num ciclo de 12/12 horas de ciclo claro/escuro (luz acesa às 06:00 h) . Ração granulada corrente estéril (ssniff® Soest, Alemanha) e água da torneira acidificada com HC1 foram permitidos ad libitum.

Cateterização da artéria carótida 31

Ratos Zucker obesos com idade de 24-31 semanas (média: 25 semanas), adaptados às condições de alojamento, foram bem preparados para o estudo. Implantou-se cateteres na artéria carótida dos ratos Zucker obesos com anestesia geral (injecção i.p. de 0,25 mL/kg de peso de Rompun® [2%] , BayerVital, Alemanha e 0,5 mL/kg de peso de Ketamin 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Alemanha). Deixou-se que os animais recuperassem durante uma semana. Os cateteres foram lavados com soro fisiológico heparinizado (100 UI/mL) três vezes por semana.

Concepção experimental

Administrou-se placebo (1 mL soro fisiológico, 0,154 mol/L) ou doses crescentes de glutaminil tiazolidina (5, 15 e 50 mg/kg de peso) a grupos de N=8 ratos Zucker obesos. As respectivas quantidades de glutaminil tiazolidina foram dissolvidas em 1000 yL de soro fisiológico. Após jejum de um dia para o outro, administrou-se placebo ou substância de teste aos ratos Zucker obesos por sonda oral (15 G, 75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha) aos -10 min. Administrou-se um teste de tolerância à glucose oral (OGTT) com 2 g/kg de peso de glucose (solução a 40%, B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemanha) aos ±0 min através de uma segunda sonda. Colheu-se amostras de sangue venoso das veias da cauda aos -30 min, -15 min, ±0 min e aos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min para tubos capilares de 20 pL, que foram colocados em tubos correntes contendo 1 mL de solução para determinação da glucose no sangue.

Todas as amostras de sangue foram rotuladas com os seguintes dados: 32 • Número de código • Número do Animal • Data de recolha da amostra • Hora de recolha da amostra Métodos analíticos

Os niveis de glucose foram determinados utilizando o procedimento da glucose oxidase (analisador de glucose Super G; Dr. Muller Gerátebau, Freital, Alemanha). Métodos estatísticos

As avaliações estatísticas e gráficos foram realizados com o PRISM® 3.02 (GraphPad Software, Inc.). Todos os parâmetros foram analisados de modo descritivo incluindo média e DP.

Efeito da Medicação Sobre a Tolerância à Glucose

Os ratos Zucker diabéticos tratados com placebo apresentaram um perfil de glucose no sangue fortemente elevado indicando intolerância à glucose de diabetes mellitus manifesta. A administração de 5 mg/kg de peso, 15 mg/kg e 50 mg/kg de peso de glutaminil tiazolidina resultou num abaixamento dependente da dose dos níveis elevados de glucose no sangue e melhoramento da tolerância à glucose em ratos Zucker diabéticos (ver figura 2). 33

Exemplο 9:

Inactivação in vivo de glutaminil tiazolidina após administração oral a ratos Wistar

Animais/Concepção experimental

Administrou-se glutaminil tiazolidina a ratos Wistar oralmente como descrito no exemplo 7. Métodos analíticos

Após a aplicação de placebo ou de glutaminil tiazolidina, recolheu-se amostras de sangue arterial aos 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 e 120 min do cateter da carótida de ratos conscientes não restringidos para determinar a formação de produtos de degradação de glutaminil tiazolidina.

Para análise, utilizou-se um processo de extracção simples em fase sólida em cartuchos C18 para isolar do plasma os compostos de interesse. Os extractos foram analisados utilizando cromatografia liquida em fase inversa numa coluna Lichrospher 60 RP Select B, hifenada com espectrometria de massa operando em APCI no modo positivo. Para quantificação utilizou-se um método do padrão interno.

Resultados

Após a administração oral de glutaminil tiazolidina a ratos Wistar, observou-se a degradação do composto. Utilizando LC/MS, o produto de degradação foi definido como piroglutaminil tiazolidina. Ver figuras 3 e 4. 34

Lisboa , 24 de Janeiro de 2007 35

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Cloridrato de glutaminil tiazolidina.
2. 2. Composição farmacêutica compreendendo um veiculo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável e um composto de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Utilização de um composto ou de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de um medicamento para inibição de dipeptidil peptidase IV ou actividade enzimática semelhante a dipeptidil peptidase IV para a prevenção ou tratamento de doenças ou patologias relacionadas com dipeptidil peptidase IV ou enzimas semelhantes a dipeptidil peptidase IV.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3 para diminuição de niveis elevados de glucose no sangue em mamíferos que resultam da ingestão de alimentos.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3 para a prevenção ou tratamento de diabetes mellitus não insulino-dependente.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 3 para a prevenção ou tratamento de artrite, obesidade, doenças imunes e auto-imunes, transplante de homoenxertos, cancro, doenças neuronais e doenças dérmicas. Lisboa, 24 de Janeiro de 2007 1