UA76309C2 - Dpiv inhibitors based on glutaminyl - Google Patents

Description

Опис винаходу

Представлений винахід стосується інгібування дипептидил-пептидази ІМ, а більш конкретно, стосується 2 глутамініл-піролідину та глутамініл-тіазолідину, фармацевтичних композицій, що містять вказані сполуки, та застосування вказаних сполук при інгібуванні активності дипептидил-пептидази ІМ та ферментів типу дипептидил-пептидази ІМ.

Дипептидил-пептидаза ІМ (ОРІМ) є серин-протеазою, яка відщеплює М-термінальні дипептиди від пептидного ланцюга, що містить, переважно, проліновий залишок у передостанній позиції. Хоча біологічну роль ОРІМ у 710 системах ссавців не встановлено повністю, можна вважати, вона грає важливу роль у нейропептидному метаболізмі, активації Т-клітин, приєднанні ракових клітин до ендотелію та вході ВІЛ у лімфоїдні клітини.

Подібно, виявлено, що ЮОРІМ є відповідною для інактивування глюкагон-подібного пепти-ду-1 (СІ Р-1) та залежного від глюкози інсулінотропного пептиду, також відомого як шлунково-інгібіторний пептид (СР).

Оскільки СІ Р-1 є головним стимулятором панкреатичної секреції інсуліну та має прямий корисний вплив на 12 регуляцію глюкози, у УМО 97/40832 та 05 6303661 інгібування активності ОРІМ та ОРІМ-подібних ферментів показане як притягальний підхід, наприклад, для лікування незалежного від інсуліну цукрового діабету (МІОМ).

Згідно з аспектом представленого винаходу запропоновано нові інгібітори ОРІМ, які є ефективними, наприклад, у лікуванні станів, опосередкованих інгібуванням ОРІМ та ОРІМ-подібних ферментів, фармацевтичні композиції, наприклад, корисні при інгібуванні ОРІМ та ОРІМ-подібних ферментів, та спосіб інгібування вказаної активності ферментів. Згідно з другим аспектом винаходу запропоновано спосіб лікування, зокрема, спосіб лікування цукрового діабету, особливо незалежного від інсуліну діабету (МІООМ) або діабету типу 2 та станів, асоційованих з цукровим діабетом та композиції для застосування у такий спосіб.

Дипептидил-пептидаза ІМ (ОРІМ) є пост-проліновою (у меншому ступеню пост-аланіновою, пост-сериновою або пост-гліциновою) віддеплюючою серин протеазою, знайденою у різних тканинах тіла, включаючи нирки, с печінку та кишечник. Ге)

Відомо, що інгібітори ОРІМ можуть бути корисними для лікування порушеної толерантності до глюкози та цукрового діабету |Міжнародна патентна заявка, номер публікації МУО 99/61431, Редегзоп КА еї аї, Оіабегез. 1998 Аца; 47(8): 1253-8 та Рашу КР еї аї, Мейфароїїзт 1999 Маг; 48(3):385-9). Зокрема, МО 99/61431 розкриває інгібітори ОРІМ, що містять амінокислотний залишок та групу тіазолідину або піролідину, та їх солі, особливо о

ІЇ -трео-ізолейцил-тіазолідин, І -ало-ізолейцил-тіазолідин, І --трео-ізолейцил-піролідин, ав

І -алоіїзолейцил-тіазолідин, І -ало-ізолейцил-піролідин, та їх солі.

Наступними прикладами стосовно інгібіторів дипептидил-пептидази ІМ низької молекулярної маси є агенти, Ше як-то інгібітори похідних тетрагідроізохінолін-3-карбоксаміду, М-заміщених 2-ціанопіролів та -піролідинів, Ге)

М-(М'єзаміщений гліцил)-2-ціанопіролідинів, М-(заміщениійй гліцил)-тіазолідинів, М-(заміщений 3о гліцил)-4-ціанотіазолідинів, боронілу та конденсованих з циклопропілом піролідинів. Інгібітори в дипептидил-пептидази ІМ описано у 05 60111555 5 6107317; 05 6110949; Б 61243055 5 6172081; МО 99/61431, МО 99/67278, МО 99/67279, СЕ 19834591, МО 97/40832, СЕ 1961 486 С2, МО 98/19998, УМО 00/07617,

МО 99/38501, МО 99246272, МО 99/38501, МО 01/68603, УМО 01/40180, МО 01/81337, МО 01/81304, МО « 01/55105 та МО 02/02560, зміст яких уведено як посилання у їх повноті стосовно інгібіторів, їх отримання та З їх застосування. Представлений винахід стосується сполуки формули: с я ХМ се о /

Ф х Х о ня-СН о 50 ХХ те у ре 0и-он, о / з о 60 ш У . й де Х-СН» або 5, або її фармацевтично прийнятної, солі.

Такі сполуки та їх відповідні фармацевтично прийнятні адитивні солі, є корисними у лікуванні станів, опосередкованих ОРІМ або ОРІМ-подібними ферментами, як-то артрит, ожиріння, імунні та автоїмунні розлади, алотрансплантація, рак, неврональні розлади та хвороби шкіри. в5 Згідно з більш кращим втіленням сполуки представленого винаходу посилюють толерантність до глюкози зниженням підвищених рівнів глюкози у крові у реакції на пероральне стимулювання глюкозою, а відтак є корисними у лікуванні незалежного від інсуліну цукрового діабету.

Далі розуміти представлений винахід можна посиланням на графіки:

Фіг.1 показує активність ОРІМ у плазмі у сироватці щурів Умізіаг після перорального та внутрішньосудинного застосування 100 мг/кг маси тіла глутамініл-піролідину;

Фіг.2 показує активність ОРІМ у плазмі у сироватці щурів Умізіаг після перорального та внутрішньосудинного застосування 100 мг/кг маси тіла глутамініл-тіазолідину;

Фіг.З показує залежне від дози зниження рівнів глюкози у крові у діабетичних щурів 7исКег після перорального застосування 5мг/кг, 15мг/кг, 5Омг/кг маси тіла глутамініл-піролідин та плацебо, відповідно; 70 Фіг4 показує залежне від дози зниження рівнів глюкози у крові у діабетичних щурів 7исКег після перорального застосування 5мг/кг, 15мг/кг, 5Омг/кг маси тіла глутамініл-тіазолідину та плацебо, відповідно;

Фіг5 показує хімічну структуру піроглутамініл-тіазолідину, продукту розкладання, знайденого після перорального застосування глутамініл-тіазолідину до щурів М/ізіаг; а

Фігб показує хроматограму екстракту плазми щурів, отриману після перорального застосування 7/5 лутамініл-тіазолідину до жирних щурів 2исКег. Пік на 2,95 хвилину представляє глу-тамініл-тіазолідин, а пік на 6,57 хвилину представляє піроглутамініл-тіазолідин.

Представлений винахід стосується інгібування дипептидил-пептидази ІМ (ОРІМ), а більш конкретно, стосується глутамініл-піролідину та глутамініл-тіазолідину, фармацевтичних композицій, що містять вказані сполуки, та застосування вказаних сполук при інгібуванні ЮОРІМ та ОРІМ-подібної активності ферментів.

Представлений винахід стосується нових інгібіторів ОРІМ, які є ефективними, наприклад, у лікуванні станів, опосередкованих інгібування ОРІМ, фармацевтичних композицій, наприклад, корисних при інгібуванні ОРІМ та

ОРІМ-подібної активності ферментів та способу інгібування ОРІМ та ОРІМ-подібної активності ферментів.

Представлений винахід стосується сполуки формули: «о

К й Ше 5 о

В. в в в. і що й Б. ЕЕ. А. - Щі хх їй : я іа «жов дуття, ще. я їх Ку ТТ ' о і 7 тя - рив к ет. А й Й 7 дя й ' со ше. й Ш ян, Р

КА Я:

ЖЕ З

;» " а особливо сполуки формули (І) -і (о) (95) («в) іЧе) іме) 60 б5

"В І "олій ди 70 : х в. Я р, й и і; й й.

Е Я ї їі ве - КЕ т пе аа. зр дн ДЕ. і .

Е ай сЙ

Й ч вл с - У . й або фармацевтично її прийнятної солі. Го)

Наступною кращою сполукою представленого винаходу є сполука формули ІІ:

Е -. зако, Ще (о) до. Но СНІ Го зо . Ки Що . е ЗНУ ьо й шк З

Пи І Ще й Н Й (Се)

Ще я пре ВК

Зо - пончннни ЯИ р са ї-

Б. Ак.

НЯ ІЙ А н

ІЧ Е 7 з х -. Її. щ.

Щи -і ей (о) ге Ж її ї шо або її фармацевтично прийнятна сіль.

Ге Сполуки представленого винаходу можна перетворити у адитивні солі, особливо фармацевтично прийнятні кислотно-адитивні солі. Фармацевтично прийнятна сіль загалом має форму, в якій основний бічний ланцюг амінокислоти є протонованим неорганічною або органічною кислотою. Органічні або неорганічні кислоти ов Залучають гідрохлоридну, гідробромідну, перхлоратну, сульфатну, нітратну, фосфатну, оцтову, пропіонову, гліколеву, молочну, бурштинову, малеїнову, фумарову, яблучну, винну, лимонну, бензойну, мигдальну,

Ф) метансульфонову, гідроксіетгансульфонову, бензолсульфонову, щавлеву, памову, 2-нафталінсульфонову, ка п-толуолсульфонову, циклогексансульфамову, саліцилову, сахаринову або трифлуороцтову кислоту. Усі форми фармацевтично прийнятних адитивних солей сполук представленого винаходу включено у рамки цього бр винаходу.

З огляду на близьку спорідненість між вільними сполуками та сполуками у формі їх солей, коли ж сполуку згадано у цьому контексті, відповідну сіль також мають на увазі, за умови, що це можливе або прийнятне у цих обставинах.

Представлений винахід стосується також проліків сполук цього винаходу. Взагалі, такі проліки повинні бути 65 функціональними похідними сполук, які легко перетворюються іп мімо у бажану терапевтично активну сполуку.

Відтак, у цих випадках, способах лікування представленого винаходу, термін "застосування" стосується лікування різних описаних розладів пролікувальними варіантами одної або більше із заявлених сполук, але які перетворюються у вищезазначені конкретні сполуки іп мімо після застосування до суб'єкта. Звичайні способи селекції та отримання придатних похідних проліків описано, наприклад, у |Оевідп ої Ргодгодв", ей. Н.

Випаддаагам ЕІземісег, 1985 та патентні заявки ОЕ 19828113, ОЕ 19828114, МО 99/67228 та МО 99/67279 як є повністю наведено тут як посилання).

Коли сполуки згідно з цим винаходом мають принаймні один хіральний центр, вони можуть відповідно існувати як енантіомери. Коли сполуки мають два або більше хіральних центрів, вони можуть також існувати як діастереомери. Треба розуміти, що усі так ізомери та суміші їх охоплено рамками представленого винаходу. 7/0 Далі, деякі з кристалічних форм сполук можуть існувати як поліморфи та як такі охоплені представленим винаходом. На додаток, деякі сполуки можуть утворювати сольвати з водою (тобто гідрати) або звичайними органічними розчинниками, і такі сольвати також охоплено рамками цього винаходу.

Сполуки, включаючи їх солі, можна також отримувати у формі їх гідратів, або залучають інші розчинники, використані для їх кристалізації.

Як вище зазначено, сполуки представленого винаходу, а особливо сполуки формул І! та ІІ, та відповідні форми їх фармацевтично прийнятних адитивних солей, є корисними при інгібуванні активності ОРІМ та

ОРІМ-подібного ферменту. Здатність сполук представленого винаходу та відповідних форм їх фармацевтично прийнятних адитивних солей до інгібування активності ОРІМ та ОРІМ-подібного ферменту можна показати аналізом активності ОРІМ для визначення величин Кі іп міго та у плазмі людини, як описано у прикладах 4 та 95. Величини Кі сполук представленого винаходу визначають для глутамініл-тіазолідину як

Кі-3,12.10-7М.5,11.1079М та для глутамініл-піролідину як Кі-1,30.Кі-7М.--8,49.109М проти ОРІМ свинячих нирок.

Величини Кі сполук представленого винаходу визначають для глутамініл-тіазолідину як

Кі-4,03.10-7М42,19.1079М після 5 хвилин 5,13.10-7М-1,26.109М після 22 годин попереднього інкубування, та сч ов для глутамініл-піролідину як Кі-1,30 -10-8М--4,89.108М після 5 хвилин та 1,36.109М.-3,21.108М після 22 годин попереднього інкубування у плазмі людини. о

Здатність сполук представленого винаходу та відповідних форм їх фармацевтично прийнятних адитивних солей до інгібування ОРІМ іп мімо можна показати пероральним або внутрішньосудинним застосуванням до щурів

МУуіївіаг, як описано у прикладі 9. Сполуки представленого винаходу інгібують активність ОРІМ іп мімо після Ге»! зо перорального та внутрішньосудинного застосування до щурів УМівіаг.

ОРІМ наявна у багатьох органах та тканинах ссавців, наприклад, кишковій щітковій каймі (ицї8сптіаї 5. еї о а, "повйи" - теазигетепів ої ргоївеіп сопіепіз іп (Пе бгизй рогдег гедіоп апо гає )е)опа! мій апа се

Іпеїг соггеїайопе ом/йй бог о еплуте асімйевз ("п о ейи" - виміри вмісту білку у регіоні щіткової кайми вздовж єюнальних ворсинок щура та їх кореляції з активностями чотирьох ферментів). Нізвіоспетівігу 1981, 72 ке, (3), 467-79), зовнішньосекреторному епітеліальних тканинах, гепатоцитах, ниркових канальцях, ендотеліальних че тканинах, міофібробластах (Рейег А.С. ей а), А топосіопа! апіїроду аегйесііпд аіреріідуІрерідазе ІМ іп

Ппитап (їззце (Визначення дипептидилпептидази ІМ моноклональних антитіл тканині у людини) Мігспомуз Агспй. А.

Раїпої. Апаї. Нізіораїйної. 1986; 409 (2):263-73), нервових клітинах, латеральних мембранах деяких поверхневих епітеліальних тканин, наприклад, фаллопієвих труб, матки та везикулярної залози, у порожнинній цитоплазмі, « наприклад, епітеліальній тканині везикулярної залози, та у клітинах слизової дуоденальної залози (Напе! з. шщ с ег аїЇ.,, Оіреріїду! рерідазе (ОРР) ІМ іп гаї огдапз. Сотрагізоп ої ігптипойівіоспетівігу апа асіїмну й пПівіоспетівігу (Дипептидил-пептидаза (ОРР) ІМ в органах щурів. Порівняння імуногістохімії та гістохімічної «» активності. Нівіоспетівігу 1988; 89 (2): 151-61), репродуктивних органах, наприклад, хвості придатку яєчка та ампулі, сім'яних везикулах та їх секреції (Адгажа! 85 Маппа-Регіша, ОБіреріїду! реріідазев іп Боміпе Тергодисіїме огдапз апа зесгейопе (Дипептидил-пептидази у коров'ячих репродуктивних органах та секреції. -І Іпї. 9. Апагої. 1986,9 (6): 435-52). У сироватці людини наявні дві молекулярні форми дипептидил-пептидази (Кгтереїа Е. еї аїІ., ЮОетопвзігайоп ої йо тоіесціаг їогтз ої аіреріїду! реріїдазе ІМ іп погта! питап вегит

Ме (Демонстрація двох молекулярних форм дипептидил-пептидази М у сироватці нормальної людини. РпПузіо|. г) Вопетозвіому. 1983, 32 (6): 486-96). Сироваточна форма ОРІМ високої молекулярної маси експресується на 5р поверхні активованих Т-клітин (биКе-Сопап .).5. еї аї., Зегит Підп тоїесціаг меді аірернау! реріїдаве ІМ ші (СО026) із вітіаг ю а помеї! апідеп ОРРТ-Ї. геІсазей їтот асіїмаЇей Т сеїЇїв (Сироваточна дипептидил-пептидаза (Че) ЇМ високої молекулярної маси (СО26) є подібною новому антигену ОРРТ-Ї, вивільненому з активованих Т-клітин.

У. Іттипої. 1996,156(5): 1714-21).

Сполуки представленого винаходу та відповідні форми їх фармацевтично прийнятних адитивних солей

Здатні інгібувати ОРІМ іп мімо. Згідно з одним втіленням представленого винаходу усі молекулярні форми, гомологи та епітопи ОРІМ від усіх тканин та органів ссавців, а також досі невиявлених, охоплено рамками цього іФ) винаходу. ко Серед рідкісної групи пролін-специфічних протеаз тільки ОРІМ, як спочатку вважали, є мембрано-зв'язаним ферментом, специфічним стосовно проліну як передостаннього залишку на аміно-закінченні поліпептидного бо ланцюга. Однак, інші молекули, навіть структурно негомологічні з ОРІМ, але виявляючі відповідну ферментну активність, зараз ідентифіковано. ОРІМ-подібні ферменти, які ідентифіковано, представляють, наприклад, білок" активації фібробласту, дипептидил-пептидазу Ме, дипептидил-амінопептидазо-подібний білок, М-ацетиловану екс-зчеплену кислотну дипептидазу, пролін-дипептидазу статичних клітин, дипептидил-пептидазу ІЇ, атрактин та споріднений з дипептидил-пептидазою ІМ білок (ОРР 8), їх описано в огляді Зедо 8 МаїїкК (Зедо 85 Маїк, 65 Віреріїйу! реріїдазе ІМ-йКе тоіесціев: Потоіодоиз ргоїеіпй5 ого Ппотоіодоиз асіїмцез? (Подібні дипептидил-пептидазі ІМ молекули: гомологічні білки або гомологічні активності?) Віоспітіса еї Віорпузіса

Асіа 2001, 36506:1-10).

Наступні ОРІМ-подібні ферменти розкрито у УУО 01/19866, УУО 02/04610, МО 02/34900 та МО 02/31134. МО 01/19866 розкриває нову дипептидил-амінопептидаз людини (ОРР8) зі структурною та функціональною подібністю з ОРІМ та активаційним білком фібробласту (ГАР). УМО 02/04610 розкриває реагенти, які регулюють подібний до дипептидил-пептидази ІМ фермент людини та реагенти, які приєднуються до подібного до дипептидил-пептидази ІМ ферменту генного продукту людини. Ці реагенти можуть грати роль у попередженні, поліпшенні, або корекції дисфункцій або хвороб, включаючи, але без обмеження, пухлини та розлади периферійної та центральної нервової системи, включаючи біль та нейродегенеративні розлади. Подібний 70 дипептидил-пептидазі ІМ фермент з МУО 02/04610 добре відомий у рівні техніки. У базі даних Сепе Вапк цей фермент зареєстровано як КІАА1492 (зареєстровано у лютому 2001, представлено на розгляд 04.04.2000,

АВО40925). МО 02/34900 розкриває дипептидил-пептидазу9 (ОРРОУ) зі значною гомологією з амінокислотними послідовностями ОРІМ та ОРР8. УМО 02/31134 розкриває три ОРІМ-подібні ферменти, ОРКРІ1, ОРКРІ2 та ОРКРЗ.

Аналіз послідовності виявив, що ОРКРІ є ідентичним ОРРВ, як розкрито у МО 01/19866, що ОРКРА є ідентичним 7/5 РР, та що ОРКРЗ є ідентичним КІМ1492, як розкрито у УУО 02/04610.

Згідно з другим кращим втіленням представленого винаходу, усі молекулярні форми, гомологи та епітопи білків, що містять ферменти з подібною до ОРІМ активністю, від усіх тканин та органів ссавців, також тих, які є досі невиявленими, охоплено рамками цього винаходу.

Здатність сполук представленого винаходу та відповідних форм їх фармацевтично прийнятних адитивних солей до інгібування ОРІМ-подібних ферментів можна показати аналізом активності ферментів для визначення величин Кі іп мійго, як описано у прикладі б. Величини Кі сполук представленого винаходу для свинячої дипептидил-пептидази І визначають як Кі-8,52 .105М-6,33.109М для глутамініл-піролідину і Кіт ,507.10-5М3,81.10-7М для глутамініл-тіазолідину. Усі сполуки інгібують свинячу дипептидил-пептидазу ІІ.

Згідно з другим втіленням представленого винаходу, сполуки представленого винаходу, та відповідні форми се їх фармацевтично прийнятних адитивних солей мають тільки низьку, або не мають інгібіторної активності о стосовно не-ОРІМ та Не-ОРІМ-подібних пролін-специфічних ферментів. Як описано у прикладі 7, з глутамініл-тіазолідином та глутамініл-піролідином не виявлено інгібування дипептидил-пептидази ! та проліл-олігопептидази. Стосовно пролідази обидві сполуки показали помітно нижчу ефективність порівняно з

ОРІМ. Величини ІКео проти пролідази визначають як ІК 5023ММ для глутамініл-тіазолідину та як Ме.

ІКео-3,4.1077М5,63.109 для глутамініл-піролідину. о

З огляду на їх здатність до інгібування активності ОРІМ та ОРІМ-подібного ферменту, сполуки с представленого винаходу, особливо сполуки формул І та ІІ, та відповідні форми їх фармацевтично прийнятних адитивних солей корисні у лікуванні станів, опосередкованих вказаною активністю ферментів. Відтак, сполуки, (0 розкриті тут, є корисними у лікуванні станів, як-то незалежного від інсуліну цукрового діабету, артриту, М ожиріння, імунних та автоїмунних розладів, алотрансплантації, раку, неврональних розладів типу розсіяного склерозу та хвороб шкіри.

Згідно з більш кращим втіленням цього винаходу, сполуки представленого винаходу та відповідні форми їх фармацевтично прийнятних адитивних солей, посилюють толерантність до глюкози зниженням підвищених « 20 рівнів глюкози у крові у реакції на пероральне стимулювання глюкозою, а відтак є корисними у лікуванні -о незалежного від інсуліну цукрового діабету. Здатність сполук представленого винаходу та відповідних форм їх с фармацевтично прийнятних адитивних солей до посилення толерантності до глюкози у реакції на пероральне :з» стимулювання глюкозою, можна вимірювати у діабетичних щурів 7исКег. Спосіб описано у прикладах 10 та 11.

Пероральне застосування Ббмг/кг маси тіла, 15мг/кг та БОмг/кг маси тіла глутамініл-тіазолідину або 415 глутамініл-піролідину призводить до залежного від дози зниження підвищених рівнів глюкози у крові, а відтак -1 до поліпшення толерантності до глюкози у діабетичних щурів 7искКег.

Сполуки представленого винаходу, згідно з прикладом 5, стабільні у плазмі людини. Несподівано, та як (о) наступне краще втілення представленого винаходу, сполуки представленого винаходу та відповідні форми їх сю фармацевтично прийнятних адитивних солей, можуть розкладатися іп мімо після застосування до ссавця.

Здатність сполук представленого винаходу та їх відповідних фармацевтично прийнятних адитивних солей («в») розкладатися іп омімо можна визначити на моделі щурів МУіївіаг та наступним аналізом РХ/МС. с Глутамініл-тіазолідин, як виявлено, розкладається після перорального застосування до щурів УМівіаг, до відповідного піроглутамініл-тіазолідину.

Представлений винахід відтак стосується способу лікування стану, опосередкованого модуляцією активності

ОРІМ та ОРІМ-подібного ферменту у суб'єкту, що цього потребує, спосіб полягає у застосуванні будь-якої сполуки представленого винаходу або її фармацевтичної композиції у кількості та режимі дозування (Ф) терапевтично ефективних для лікування стан. Крім того, представлений винахід стосується застосування сполук

Ге представленого винаходу та їх відповідних фармацевтично прийнятних адитивних солей для отримання медикаменту для попередження або лікування стану, опосередкованого модуляцією активності ОРІМ у суб'єкту. во Сполуку можна застосовувати до пацієнта будь-яким звичайним шляхом застосування, включаючи, але без обмеження, внутрішньовенний, пероральний, підшкірний, внутрішньом'язовий, інтрадермальний та парентеральний.

Згідно з другим втіленням представлений винахід стосується рецептур сполук представленого винаходу та їх відповідних фармацевтично прийнятних адитивних солей у фармацевтичних композиціях. ве Термін "суб'єкт", що використано тут, стосується тварини, переважно ссавця, найпе-реважніше людини, що є об'єктом лікування, спостереження або експерименту.

Термін "терапевтично ефективна кількість", що використано тут, стосується кількості активної сполуки або фармацевтичного агенту, що виявляє біологічну або медичну реакцію у тканинній системі, тварині або людині, яку вивчає дослідник, ветеринар, лікар або інший клініцист, яка залучає полегшення симптомів хвороби або розладу, що лікують.

Як використано тут, термін "композиція" стосується продукту, що містить заявлені сполуки у терапевтично ефективній кількості, а також будь-якого продукту, який походить, безпосередньо або небезпосередньо, від комбінації заявлених сполук.

Для отримання фармацевтичної композиції цього винаходу одну або більше сполук представленого 7/0 винаходу, особливо сполук формул І або ІІ та відповідних форм їх фармацевтично прийнятних адитивних солей як активний інгредієнт перемішують до однорідності з фармацевтичним носієм звичайними фармацевтичними способами сполучення, носій може мати багато форм залежно від форми бажаного для застосування препарату, наприклад, перорального або парентерального, як-то внутрішньом'язового. В отриманій композиції у пероральній формі дозування може бути застосованим будь-яке зі звичайних фармацевтичних середовищ.

Відтак, для рідких пероральних препаратів, як-то, наприклад, суспензії, еліксири та розчини, придатні носії та адитиви можуть переважно залучають воду, гліколі, олії, спирти, ароматизатори, консерванти, барвники тощо; для твердих пероральних препаратів, як-то, наприклад, порошки, капсули, желатинові капсули та таблетки, придатні носії та адитиви залучають крохмалі, цукри, розріджувачі, гранулювальні засоби, лубриканти, зв'язувальні засоби, дезинтегратори тощо, внаслідок легкості їх застосування таблетки та капсули 2о представляють найпереважніше пероральні одиничні форми дозування, в яких застосовують тверді фармацевтичні носії. За бажанням таблетки можна покривати цукром або ентеросолюбільним покриттям стандартними способами. Для парентеральних засобів носій звичайно містить стерильну воду, хоча можуть бути залученими інші інгредієнти, наприклад, для поліпшення розчинності або для консервування.

Придатні для ін'єкцій суспензії можна також отримати, в них можна застосовувати прийнятні рідкі носії, сч ов суспендувальні засоби тощо. Фармацевтичні композиції міститимуть, на одиницю дозування, наприклад, таблетку, капсулу, порошок, ін'єкцію, повну чайну ложку тощо, кількість активного інгредієнту, необхідну для і) постачання вищезазначеної ефективної дози. Фармацевтичні композиції міститимуть на одиницю дозування, наприклад, таблетку, капсулу, порошок, ін'єкцію, повну чайну ложку, супозиторій, тощо, приблизно від 0,01мг до 100Омг (переважно приблизно від 5 до 500Омг) та можуть застосовуватися при дозуванні приблизно від 0,1 до Ге! зо ЗООмг/кг маси тіла на добу (переважно 1-50мг/кг на добу). Дозування однак, може змінюватися залежно від потреб пацієнтів, суворості стану, що лікують та сполуки, що застосовують. Можна застосовувати добове о застосування або пост-періодичне дозування. Звичайно дозування регулюватиме лікар залежно від со особливостей пацієнта, його стану та бажаної терапевтичної дії.

Переважно ці композиції мають форми одиниць дозування, як-то таблетки, пілюлі, капсули, порошки, ісе) зв Гранули, стерильні парентеральні розчини або суспензії, дозовані аерозольні або рідкі спреї, краплі, ампули, ї- автоін'єкційні пристрої або супозиторії; для перорального, парентерального, інтраназального, сублінгвального або ректального застосування, або для застосування інгаляцією або вдуванням. Альтернативно, композиція може мати форму, придатну для застосування раз на тиждень або раз на місяць; наприклад, нерозчинну сіль активної сполуки, як-то деканоат, можна пристосувати для забезпечення отримання депо для «

Внутрішньом'язових ін'єкцій. Для отримання твердої композиції, як-то таблетки, головний активний інгредієнт з с перемішують до однорідності з фармацевтичним носієм, наприклад, звичайними таблетувальними інгредієнтами, як-то кукурудзяний крохмаль, лактоза, сахароза, сорбіт, тальк, стеаринова кислота, магній ;» стеарат, дикальцій фосфат або камеді, та інші фармацевтичні розріджувачі, наприклад, вода, для утворення твердої попередньої композиції рецептури, що містить гомогенну суміш сполуки представленого винаходу, або її фармацевтично прийнятної солі. Стосовно цієї попередньої композиції рецептури як гомогенної, мають на увазі, -І що активний інгредієнт ідеально диспергований рівномірно по композиції так, щоб композицію можна було легко поділити на рівні ефективні форми дозування, як-то таблетки, пілюлі та капсули. Цю тверду попередню

Ме. композицію рецептури можна тоді поділити на вищеописані типи форми одиниць дозування, що містять 2) приблизно від 0,1 до 100Омг, переважно приблизно від 5 до 500мг активного інгредієнту представленого винаходу. о Таблетки або пілюлі нової композиції можуть переважно бути покритими або інакше сполученими для

Ге) забезпечення форми дозування, що надає переваги пролонгованої дії, наприклад, таблетка або пілюля можуть містити внутрішній компонент дозування та зовнішній компонент дозування, останній є у формі оболонки поверх попередньої. Два компоненти можуть бути розділені шаром ентеросолюбільного покриття, яке перешкоджає Ддезинтеграції у шлунку та дозволяє внутрішнньому компоненту пройти у дванадцятипалу кишку мати затримане вивільнення. Різні матеріали можна використовувати для таких шарів ентеросолюбільного покриття, такі (Ф, матеріали залучають ряд полімерних кислот з такими матеріалами як шелак, цетиловий спирт та ацетат ка целюлози.

Рідкі форми, в яких нові композиції представленого винаходу можуть переважно бути комбінованими для бо застосування перорально або ін'єкціями залучають водні розчини, належно ароматизовані сиропи, водні або олійні суспензії, та ароматизовані емульсії з їстівними оліями, як-то бавовняна олія, кунжутна олія, кокосова олія або арахісова олія, а також еліксири та подібні фармацевтичні наповнювачі. Придатні диспергувальні або суспендувальні засоби для водних суспензій залучають синтетичні та природні камеді, як-то трагаканту, акації, алгінат, декстран, натрій карбоксиметилцелюлозу, метилцелюлозу, полівінілпіролідон або желатин. 65 Коли способи отримання сполук згідно з винаходом дають суміш стереоізомерів, ці ізомери можна розділяти звичайними способами, як-то препаративною хроматографією. Сполуки можна отримати у рацемічній формі, або індивідуальні енантіомери можна отримати енантіоспецифічним синтезом або розділенням. Сполуки можна, наприклад, розділяти на їх компонентні енантіомери стандартними способами, як-то утворення діастереомерних пар утворенням солі з оптично активною кислотою, як-то (-)-ді-п-толусіл-/-винною кислотою та/або (т)-ді-п-толуоїл-Ї-винною кислотою, з наступною фракційною кристалізацією та регенерацією вільної основи.

Сполуки можна також розділяти утворенням діастереомерних естерів або амідів з наступним хроматографічним розділенням та видалення хірального допоміжнику. Альтернативно, сполуки можна розділяти застосуванням хіральної колонки ВЕРХ.

Протягом будь-якого зі способів отримання сполук представленого винаходу, може бути необхідним та/або 7/0 бажаним захищати чутливі або реакційні групи на будь-якій з потрібних молекул. Цього можна досягти звичайними захисними групами, як-то описаними у ІРгоїесіїме Сгоцрз у Огдапіс Спетізігу, ед. У.Е. МсОтіев,

Ріепит Ргезз, 1973; та Т.МУ. Сгеепе 5 Р.С.М. МУців, Ргоїесіме Сгоцрз у Огдапіс Зупіпевзів. дойп МУйеу 5 Бопв, 1991, що наведено тут як посилання). Захисні групи можна видалити на зручному наступному етапі відомими у рівні техніки способами.

Спосіб лікування станів, модульованих дипептидил-пептидазою ІМ та ОРІМ-подібними ферментами, описаний у представленому винаході, можна також провадити застосуванням фармацевтичної композиції, що містить одну або більше вищезазначених сполук та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція може містити приблизно між 0,01їмг та 1000мг, переважно приблизно 5-500мг сполуки, та може бути складеною у будь-яку форму, придатну для вибраного режиму застосування. Носії залучають необхідні та інертні фармацевтичні ексципієнти, включаючи, але без обмеження, зв'язувальні засоби, суспендувальні засоби, лубриканти, ароматизатори, підсолоджувачі, консерванти, барвники та покриття. Композиції, придатні для перорального застосування, залучають тверді форми, як-то пілюлі, таблетки, капсули (включаючи рецептури негайного вивільнення, хронованого вивільнення та безперервного вивільнення), гранули, та порошки, та рідкі форми, як-то розчини, сиропи, еліксири, емульсії, та суспензії. Форми, корисні для парентерального сч ов Застосування, залучають стерильні розчини, емульсії та суспензії. Переважно, сполуки представленого винаходу можна застосовувати одиничною добовою дозою, або загальне добове дозування можна застосовувати і) роздільними дозами два, три або чотири рази на добу. Далі, сполуки представленого винаходу можна застосовувати у інтраназальній формі шляхом місцевого застосування придатного інтраназального наповнювачу, або трансдермальним шляхом з пластирами, що добре відомо фахівцям. Для застосування у б зо формі трансдермальної системи постачання дозування буде скоріше безперервним, а не переривчастим дозуванням і інтенсивність дозування треба відповідно модифікувати для отримання бажаної терапевтичної дії. о

Краще для перорального застосування у формі таблеток або капсул, щоб активний компонент ліків був со скомбінований з пероральним, нетоксичним фармацевтично прийнятним інертним носієм, як-то етанол, гліцерин, вода тощо. Більш того, коли бажано або необхідно, можна також додавати у суміш придатні зв'язувальні засоби; ре) з5 лубриканти, дезинтегратори та барвники. Придатні зв'язувальні засоби залучають, без обмеження, крохмаль, ча желатин, природні цукри, як-то глюкоза або беталактоза, кукурудзяні підсолоджувачі, природні та синтетичні камеді, як-то акації, трагаканту, або натрій олеат, натрій стеарат, магній стеарат, натрій бензоат, натрій ацетат, натрій хлорид тощо. Дезинтегратори залучають, без обмеження, крохмаль, метилцелюлозу, агар, бентоніт, ксантанову камедь тощо. «

Рідкі форми придатні у ароматизованих суспендувальних чи диспергувальних засобах, як-то синтетичні та пт») с природні камеді, наприклад, трагаканту, акації, метил-делюлози тощо. Для парентерального застосування бажаними є стерильні суспензії та розчини. Ізотонічні препарати, які загалом містять придатні консерванти, ;» застосовують, коли бажаним є внутрішньовенне застосування.

Сполуку представленого винаходу можна також застосовувати у формі ліпосомних систем постачання, як-то невеликих одношарових пухирців, великих одношарових пухирців та багатошарових пухирців. Ліпосоми можна -І створювати з різних фосфоліпідів, як-то холестерин, стеариламін або фосфатидилхоліни добре відомими у рівні техніки способами.

Ме, Сполуки представленого винаходу можна також сполучати з розчинними полімерами як націлювані носії ліків. 2) Такі полімери можуть залучати полівінілпіролідон, кополімер пірану, полігідроксипропілметакриламідофенол, полігідроксіетиласпартамідофенол, або поліетиленоксидполілізин, заміщений палмітоїльним залишком. Далі, о сполуки представленого винаходу можна сполучати з біорозкладними полімерами, корисними у досягненні

Ге регульованого вивільнення ліків, наприклад, поліоцтовою кислотою, поліепсилонкапролактоном, полігідроксимасляною кислотою, поліортоестерами, поліацеталями, полідигідропіранами, поліціаноакрилатами та перехресно-зчепленими або амфіпатичними блоккополімерами гідрогелей. 5Б Сполуки цього винаходу можна застосовувати у будь-якій з вищезазначених композицій та згідно з режимами дозування, встановленими у рівні техніки, коли потрібне лікування певних розладів. (Ф) Добове дозування продуктів може змінюватися в межах від 0,01 до 1,000мг для дорослої людини на добу. ка Для перорального застосування композиції переважно запропоновані у формі таблеток, що містять, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250, 500 та 100Омг активного інгредієнту для бо симптоматичного дозування для пацієнта, якого лікують. Ефективна кількість ліків звичайно є на рівні дозування приблизно від 0,1мг/кг до З0Омг/кг маси тіла на добу. Кращими межами є приблизно від 1 до 5Омг/кг маси тіла на добу. Сполуки можна застосовувати у режимі 1-4 рази на добу.

Оптимальне дозування для застосування може легко визначити фахівець, воно залежатиме від конкретної використаної сполуки, режиму застосування, інтенсивності отримання, біо-засвоюваності внаслідок режиму 65 Застосування, та перебігу стану хвороби. На додаток, фактори, асоційовані з конкретним пацієнтом, якого лікують, включаючи вік, масу, харчування пацієнта та час застосування, слід загалом враховувати при коректуванні дозування.

Сполуки або композиції представленого винаходу можна брати перед помелом, при помелі або після помелу.

Коли сполуки або композиції представленого винаходу відповідають узяттю до помелу, їх приймають за 1 годину, переважно ЗО або навіть 15 або 5 хвилин перед їжею.

Коли сполуки або композиції представленого винаходу відповідають узяттю під час помелу, їх можна вмішувати у порошок або приймати в окремій формі дозування, як вище описано.

Коли сполуки або композиції представленого винаходу відповідають узяттю після помелу їх можна приймати через 5, 15 або 30 хвилин або навіть 1 годину після кінцевого помелу. 70 Приклади

Приклад 1: Синтез вільної основи глутамініл-піролідину

Ацилування:

М-Бензил-оксикарбонілглутамін (2,02г, 7,21ммоль) розчиняють у З5мл ТГФ та доводять до -1520. У цю суміш

САЇВЕ (ізобутилхлорформіат) (0,937мл, 7,21ммоль) та 4-метилморфолін (0,795мл, 7,21ммоль) додають та 75 розчин перемішують протягом 15 хвилин Утворення змішаного ангідриду перевіряють ТШХ (елюент:

СНСІЗ/Меон: 9/1). Після нагрівання до -10 «С додають піролідин (0,59бмл, 7,21ммоль). Суміш доводять до кімнатної температури та перемішують протягом ночі.

Обробка:

Утворений осад відфільтровують та розчинник випарюють. Утворене масло переносять у етилацетат (20мл) 2о та промивають насиченим розчином натрій гідросульфату, а потім насиченим розчином натрій гідрокарбонату, водою та розсолом. Органічний шар відділяють, сушать та випарюють. Утворений продукт перевіряють на чистоту ТШХ (елюент: СНСІзЗ/мМеон: 9/1). Вихід: 1,18г, твердий воскоподібний продукт.

Розщеплення: 1,18г утвореної твердої 7-захищеної сполуки розчиняють у 40мл абсолютного етанолу. У розчин додають Га приблизно 20Омг Ра на активованому вугіллі (1095, Р ОКА) та суспензію струшують в атмосфері водню протягом З годин. Перебіг реакції контролюють ТШХ (елюент: СНСІЗ/Меон: 9/1). Після завершення реакції розчинник і) видаляють для забезпечення вільної основи. Вихід: 9995 Перевіряють чистоту за допомогою ТШХ: н-бутанол/АсОН/вода/етилацетат: 1/1/1/1, К, - 0,4. Ідентичність продукту реакції перевіряють ЯМР-аналізом.

Приклад 2: Синтез глутамініл-тіазолідину гідрохлориду Ге»)

Ацилування:

М-т-Бутил-оксикарбонілглутамін (2,0г, 8,12ммоль) розчиняють у 5мл ТГФ та доводять до -1592С. У цю суміш о додають САЇВЕ (ізобутилхлорформіат) (1,0бмл, 8,12ммоль) та 4-метилморфолін (0,895мл, 8,12ммоль) та розчин «о перемішують протягом 15 хвилин. Утворення змішаного ангідриду перевіряють ТШХ (елюент: СНСІ З/мМеон: 9/1). Після нагрівання до -10 9С додають ще еквівалент 4-метилморфоліну (0,895мл, 8,12ммоль) та ї-о тіазолідингідрохлориду (1,02г, 8,12ммоль). Суміш доводять до кімнатної температури та перемішують протягом - ночі.

Обробка:

Утворений осад відфільтровують та розчинник випарюють. Утворене масло переносять у хлороформ (20мл) « та промивають насиченим розчином натрій гідросульфату, а потім насиченим розчином натрій гідрокарбонату, водою та розсолом. Органічний шар відділяють, сушать та випарюють. Утворений продукт перевіряють на - с чистоту ТШХ (елюент: СНСІзЗ/меон: 9/1). Вихід: 1,64г, твердий продукт. и Розщеплення: є» б4Омг утвореної твердої Вос-захищеної сполуки розчиняють у З,їмл охолодженої льодом НСІ у діоксані (12,98М, 20 еквіваленти) та залишають на льоді. Перебіг реакції контролюють ТШХ (елюент: СНСІЗ/Меон: 9/1).

Після завершення реакції розчинник видаляють та утворене масло переносять у метанол та випарюють знов. -і Після цього утворене масло сушать фосфор-У-оксидом та розтирають два рази з діетилетером. Перевіряють бу чистоту шляхом ВЕРХ. Вихід: 0,265г Перевіряють чистоту шляхом ВЕРХ. Ідентичність продукту реакції перевіряють ЯМР-аналізом. (95) Приклад 3: Синтез глутамініл-піролідину гідрохлориду о 50 Ацилування:

М-т-Бутил-оксикарбонілглутамін (3,0г, 12,18ммоль) розчиняють у 7мл ТГФ та доводять до -1592С. У цю суміш

Ме) додають САЇВЕ (ізобутилхлорформіат) (1,бмл, 12,1в8ммоль) та 4-метилморфолін (1,Змл, 12,18ммоль) та розчин перемішують протягом 15 хвилин Утворення змішаного ангідриду перевіряють ТШХ (елюент: СНСІ з/Меон: 9/1).

Після нагрівання до -10 2 додають 1 еквівалент піролідину (1,О0мл, 12,18ммоль). Суміш доводять до кімнатної 22 температури та перемішують протягом ночі.

Ге) Обробка:

Утворений осад відфільтровують та розчинник випарюють. Утворене масло переносять у хлороформ (20мл) о та промивають насиченим розчином натрій гідросульфату, а потім насиченим розчином натрій гідрокарбонату, водою та розсолом. Органічний шар відділяють, сушать та випарюють. Утворений продукт перевіряють на 60 чистоту ТШХ (елюент: СНСІз/МеОнН: 9/1). Вихід: 2,7г твердий продукт.

Розщеплення: 2,7г утвореного твердого продукту розчиняють у 13,0мл охолодженої льодом НСЇІ у діоксані (12,98М, 20 еквіваленти) та залишають на льоді. Перебіг реакції контролюють ТШХ (елюент: СНСІЗ/Меон: 9/1). Після завершення реакції розчинник видаляють та утворене масло переносять у метанол та випарюють знов. Після бо цього утворене масло сушать фосфор-М-оксидом та розтирають два рази з діетилетером. Вихід: 98Омг

Перевіряють чистоту шляхом ВЕРХ. Ідентичність продукту реакції перевіряють ЯМР-аналізом.

Приклад 4: Визначення Кі

Для визначення Кі глутамініл-піролідину та глутамініл-тіазолідину застосовують дипептидил-пептидазу ІМ зі свинячих нирок зі специфічною активністю проти гліцилпроліл-4-нітроаніліну 37,50/мг та концентрацію фермент 500 ЛаАмг/мл у стандартному розчині.

Аналіз суміші: 100мкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину при концентраціях 100 109М-1.10-7М (глутамініл-піролідин)та 1.10-6М-1.109М (глутамініл-тіазолідин) відповідно перемішують з 5Омкл гліцилпроліл-4-нітроаніліну у різних концентраціях (0,4мММ, 0,2мМ, 0,1мММ, 0,05мММ) та 100мкл ГЕПЕС (40мМ, рН 70 7,6; іонна сила - 0,125). Аналізовану суміш попередньо інкубують при 302С протягом 30 хвилин Після попереднього інкубування додають 20мкл ОРІМ (розбавлено 1:600) та вимір розвитку жовтого кольору внаслідок вивільнення 4-нітроаніліну провадять при 30 «С та 26-405нм протягом 10 хвилин, застосовуючи планшетний зчитувач (НТ5З7000 ріиз, Арріїеа Віозузіетв, У/ейегвіаді, Сепгтапу).

Величини Кі розраховують, застосовуючи (згарпй4,0,15 (Епійпасиз Зоїймаге, ЦЯ, ОК), що базується на 75 конкурентному інгібуванні ОРІМ глутамініл-піролідином або глутамініл-тіазолідином. їх визначають для глутамініл-тіазолідину як Кі-3,12.10-7М5,11.10719М та для глутамініл-піролідину як Кі-1 "30мМО 9МА8,49.109М.

Приклад 5: Визначення Кі у плазмі людини

Плазма людини має активність стосовно вивільнення М-термінального Хаа-Рго. 7Омкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину у концентраціях 1.10 5М-1.10-7М (глутамініл-піролідин) та 1.109М-1ІМО М /(глутамініл-тіазолідин) відповідно перемішують з БОмкл гліцилпроліл-4-нітроаніліну у різних концентраціях (0,4мММ, 0,2мМ, 0,1мММ, 0,05мММ) та 100мкл ГЕПЕС (40мМ, рН 7,6). Аналізовану суміш попередньо інкубують при 302С протягом 5 хвилин та 22 годин відповідно. Після попереднього інкубування додають 5Омкл плазми людини та вимір розвитку жовтого кольору внаслідок Га вивільнення 4-нітроаніліну провадять при 30 «С та 2-405нм протягом 10 хвилин, застосовуючи планшетний зчитувач (НТ5З7000 ріиз, Арріїеа Віозузіетв, У/ейегвіаді, Сепгтапу). о

Величини Кі розраховують, застосовуючи програмне забезпечення (згарпії 4,0,15 (Егйпасиз Зоймаге, Ца,

ОК), що базується на конкурентному інгібуванні ОРІМ глутамініл-піролідином або глутамініл-тіазолідином. їх визначають для глутамініл-тіазолідину як Кі-4,03.1077М--2,19.10779М після 5 хвилин, 5,13.1077М--1,26.109М після (о) 22 годин попереднього інкубування, та для глутамініл-піролідину як Кі-1,30 -10-9М-4,89.108М після 5 хвилин та о 1,36.10-6М-3,21.103М після 22 годин попереднього інкубування.

Приклад 6: Інгібування ОРІМ-подібних ферментів - дипептидил-пептидази ЇЇ

ОР І (3,4,14,2) вивільняє М-термінальні дипептиди з олігопептидів, якщо М-закінчення не протоноване (се)

ІМебопаїа, 9У.К., ЕПів, 5. 5 Кейу, Т.9У., 1966, 9. Віої. Спет., 241,1494-1501). Рго та Аа у Р.-позиції є кращими | : ! ! М і - залишками. Активність ферментів описано як ОРІМ-подібну активність, але ОР ІЇ має кислотний рН-оптимум.

Фермент, що використано, очищають зі свинячих нирок.

Аналіз: 100мкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину у концентраціях! .1077М-5.109М перемішують з « 420 ООмкл буферного розчину (40мМ ГЕПЕС, рН 7,6, 001595 Ві), їмМ ОТ), бОмкл розчину 9 с лізилаланіламінометилкумарину (5ММ) та 20мкл свинячої ОР ІІ (розбавлено у 250 разів у буферному розчині). . Флуоресценцію вимірюють при 309С при о збудження -З8ОНМ, емісії іб5нм протягом 25 хвилин, застосовуючи "» планшетний зчитувач (НТЗ7О0ООріиз, Арріїей Віозузіетв, УУейегвіаді, Септапу). Величини Кі розраховують, застосовуючи програмне забезпечення (згарпії 4,0,15 (Егпійпасиз Зоймаге, (4. ОК) та визначають як

Кі-8,52.109М.6,33.105М для глутамініл-піролідину та Кі-1,07.1079М.3,81.10-7М для глутамініл-тіазолідину. - Приклад 7: Перехресно реагуючі ферменти б Глутамініл-піролідин або глутамініл-тіазолідин тестують на їх здатність стосовно перехресного реагування відносно дипептидил-пептидази І, проліл-олігопептидази та пролідази. (65) Дипептидил-пептидаза І (ОР І, катепсин С): о 20 ОР І або катепсин С є лізосомальною цистеїн-протеазою, яка відщеплює дипептиди від М-закінчення її субстратів (зцітап, Н.К. 5 ЕРгиоп, 9.5., 1948, У. Віо!: Спет., 174,851-858). Ії класифікують як цистеїн-протеазу.

Ме) Фермент, що використано отримано від Оіадеп (Оіадеп отрнН, Ніїдеп, Септапу). Для отримання повністю активного ферменту, фермент розбавлено у 1000 разів у буфері МЕ5 рН 5,6 (4А0ММ МЕ5, 4мМ ОТТ, 4ММ КСІ, 2ММ ЕОТА, 0,01595 Вгі)) та попередньо інкубують протягом 30 хвилин при 3020. 99 Аналіз: (ФІ БОмкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину при концентраціях 1 .109М-1.10-7М перемішують з юю 110О0мкл суміші буфер-фермент. Аналізовану суміш попередньо інкубують при 302С протягом 15 хвилин Після попереднього інкубування 100мкл гістидилсерил-п-нітроаніліну (2 .102М) додають та вимір розвитку жовтого бр Кольору внаслідок вивільнення 4-нітроаніліну провадять при 309С та збудження У8ОНМ, оемісї ї6б5нм протягом 10 хвилин, застосовуючи планшетний зчитувач (НТЗ7000 різ, Арріїеа Віозузіетв, УУейегвзіаді, Септапу).

Величини ІКео розраховують, застосовуючи програмне забезпечення Сгарпії 4,0,15 (Егпійпасиз Зоїмаге, Ца,,

ОК). Жодного інгібування активності ферменту ЮР І глутамініл-піролідином або глутамініл-тіазолідином не знайдено. в5 Проліл-олігопептидаза (РОР)

Проліл-оліопептидаза (ЕС 3,4,21,26) є ендопротеазою серинового типу, яка відщеплює пептиди на

М-термінальній частині зв'язку Хаа-Рго (МуаМег, К., ЗпІапК, Н., СіІазв, 9У.О., Зспмагіг).|Ї. 8 Кегепуїі, Т.0., 1971,

Зсіепсе, 173,827-829). Субстратами є пептиди з молекулярною масою до З000Да.

Фермент, що використано, є рекомбінантною проліл-олігопептидазою людини. Рекомбінантну експресію провадять у Е. соїї у стандартних умовах, які описано у рівні техніки.

Аналіз: 100мкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину у концентраціях 1 .107М-5.109М перемішують з 100мкл буферного розчину (40МмМ ГЕПЕС, рН 7,6, 0,015905 Вгі), мМ ОТ) та 20мкл розчину РОР. Аналізовану суміш попередньо інкубують при 302 протягом 15 хвилин. Після попереднього інкубування 5Омкл розчину 70 гліцилпролілпроліл-4-нітроаніліну (О0,29мММ) додають та вимір розвитку жовтого кольору внаслідок вивільнення 4-нітроаніліну провадять при 302С та Х-405нм протягом 10 хвилин, застосовуючи планшетний зчитувач (Зипгізе,

Тесап, СтаїйвНеїт, Септапу).

Величини ІКео розраховують, застосовуючи програмне забезпечення Сгарпії 4,0,15 (Егпійпасиз Зоїмаге, Ца,,

ОК). Жодного інгібування активності РОР глутамініл-піролідином або глутамініл-тіазолідином не знайдено.

Пролідаза (Х-Рго-дипептидаза)

Пролідаза (ЕС 3,4,13,9) спершу описана Вегдтапп 5 Егшоп (Вегатапп, М. 5 ЕРгшоп, 95, 1937, 9. Віої.

Спет. 189-202). Пролідаза вивільняє М-термінальну амінокислоту від дипептидів Хаа-Рго та має оптимум рН між б та 9.

Пролідазу від свинячих нирок (ІСМ Віотевдісв, Езспул"еде, Сегтапу), розчиняють (мг/мл) у буфері для аналізу (20мМ МНАСНзСОО)», ЗММ Маисі», рН 7,6). Для отримання повністю активного ферменту розчин інкубують протягом 60 хвилин при кімнатній температурі.

Аналіз: 450мкл глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину у концентраціях 5 .103М-5.10-7М перемішують з 5ООмкл буферного розчину (20мММ МНАСНьУСОО)», рН 7,6) та 25О0мкл Пе-Рго-ОН (0,5ММ в аналізованій с 29 суміші). Аналізовану суміш попередньо інкубують при 302С протягом 5 хвилин. Після попереднього інкубування ге) 75мкл. Пролідази (розбавлено 1:10 у буфері для аналізу) додають та вимір провадять при 309С та Х-220нм протягом 20 хвилин, застосовуючи ОМЛ/із фотометр, ОМ1 (Тпегто Зресігопіс, Сатргідде, ОК).

Величини ІКео розраховують, застосовуючи програмне забезпечення Сгарпії 4,0,15 (Егпійпасиз Зоїмаге, Ца,, Ф 20 цк). Їх визначають як ІК БО»ЗММ для глутамініл-тіазолідину та як ІК 5о-3,4.107М5,63.1079 для глутамініл-піролідину. о

Приклад 8: Стабільність у плазмі со

Для дослідження стабільності глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину у плазмі людини, активність у плазмі визначають у визначений час. Середню активність ОРІМ у плазмі людини визначають як 43,690/мл. У. СО робочому розчині плазму розбавляють 0,995 Масі до фіксованого рівня активності ОРІМ 25 О/мл. їм

Плазму та глутамініл-піролідин або глутамініл-тіазолідин у різних концентраціях (5.10, 2,5.107, 1,25.1079М у плазмі) інкубують при 3720. У визначений час зразки збирають, застосовуючи піпеточний автомат (сіївоп 215,

Пацій о папаег, Сійвоп) та переносять у мікротитрувальний планшет, що містить 5 -109М « гліцилпроліламінометилкумарину у 0,995 МасСі - 015905 Вгі) на комірку. Після б хвилин реакцію зупиняють додаванням ізолейцилтіазолідину (5.10 М у 0,995 розчині масі). о) с Флуоресценцію вимірюють відносно 0,995 Масі у плазмі (внутрішній стандарт), застосовуючи планшетний "» зчитувач (НТЗ7ОООріиз, Арріїей Віозузіетве, МУУейегеїаді, Сегтапу). Напівперіод інгібіторної потужності " глутамініл-піролідину або глутамініл-тіазолідину розраховують за залежністю активності ферменту від часу реакції.

Для обох сполуки, не можна було визначити напівперіод. Субстанцію вважають стабільною у плазмі людини - більше 22 годин.

Ф Приклад 9: Визначення інгібувальної активності стосовно ОРІМ глутамініл-піролідину та глутамініл-тіазолідину після перорального та внутрішньосудинного застосування до щурів УУівіаг. о Тварини о 50 Самці щурів УУізіаг (Муів(ЗПпо)) з масою тіла між 250 та З350г отримано від Тіеггиспї 5спепмаіде (Зспопуаїде,

Сегптапу).

Ме) Умови утримання

Тварин тримають у клітках поодинці у звичайних умовах з регульованою температурою (22-22) при циклі світло/темрява 12/12 годин (світло на 06:00 ранку). Стандартну гранульовану їжу (ззпіїй бБоеві, Сегтапу) та 99 воду з крану, підкислену НОСІ, дають досхочу.

Ф! Вставка катетера у сонну артерію

Після більше одного тижня адаптації в умовах тримання катетери імплантують у сонну артерію щурів Умізіаг де під загальною анестезією (інтраперитональною ін'єкцією 0,25мл/кг Котрип'" (295), Вауегуйа!І, Сегпгтапу та

О,5мл/кг кетаміну 10, Агагові сОтрН 5 Со., Гмівігіпдеп, Септапу). Тваринам дають одужати протягом тижня. 60 Катетери промивають гепарином-фізіологічним розчином (10010/мл) три рази на тиждень. У випадку дисфункції катетера, другий катетер вставляють у контра-латеральну сонну артерію відповідного щура. Після одного тижня одужання від хірургії цю тварину залучають у дослідження. У випадку дисфункції другого катетера, тварину видаляють з дослідження. Уводять нову тварину та експерименти продовжують у запланованій послідовності, починаючи принаймні через 7 діб після імплантування катетера. бо Мета експерименту

До щурів зі збереженою функцією катетера застосовують плацебо (мл фізіологічного розчин, 0,154моль/л) або 10Омг/кг маси тіла глутамініл-піролідину або 1ООмг/кг маси тіла глутамініл-тіазолідину пероральним та внутрішньосудинним (інтраартеріально) шляхом.

Після голодування протягом ночі зразки по 100мкл гепаринізованої артеріальної крові збирають на хвилину -30, -5 та 0. Тест-субстанцію розчиняють безпосередньо перед цим у 1,О0мл фізіологічного розчину (0,154моль/л) та застосовують на хвилину 0 перорально через зонд (75мм; Ріпе Зсіепсе Тооі5, НеїдеІрегд, Септапу) або внутрішньосудинним шляхом. У випадку перорального застосування додатковий об'єм мл фізіологічного розчину ін'єктують у артеріальний катетер, у випадку інтраартеріального застосування, катетер негайно 7/0 промивають ЗОмкл фізіологічного розчину та додатково Тмл фізіологічного розчину уводять перорально через зонд.

Після застосування плацебо або тест-субстанції зразки артеріальної крові відбирають на хвилину 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 та 120 з катетера сонної артерії притомних вільних щурів. Усі зразки крові збирають в охолоджені льодом туби Еппендорфа (Еррепадоп-МеїПеїег-Ніпг, Натбриго, Септапу), заповнені 1Омкл натрій 7/5 цитратного буферу (рН 3,0) для виміру активності ОРІМ у плазмі. Туби Еппендорфа центрифугують негайно (12000об/хил протягом 2 хвилин, Нейісп 7епігїде ЕВА 12, Тиціпдеп; Септапу): Фракції плазми зберігають на льоді до аналізу або заморожують при -202С до аналізу. Усі зразки плазми помічають таким чином: - Номер коду - Число тварин - Дата відбору зразку - Час відбору зразку

Аналітичні способи

Аналізована суміш для визначення активності ОРІМ у плазмі складається з ВОмкл реагенту та 20мкл зразку плазми. Кінетичний вимір утворення жовтого продукту 4-нітроаніліну з субстрату гліцилпроліл-4-нітроанілін с провадять при З9Онм протягом 1 хвилини при 30 С після 2 хвилин попереднього інкубування при тій же температурі. Активність ОРІМ виражено у міліодиницях/мл. і)

Статистичні способи

Статистичні оцінки та графіки виконують за допомогою програмного забезпечення РКІЗМ 3,02 (сгарпРай зЗоїмаге, Іпс.). Усі параметри аналізують наочно, включаючи значення та стандартне відхилення. Ге»)

Результати

Сполуки глутамініл-піролідин та глутамініл-тіазолідин у дозі 1ООмг/кг маси тіла відносно плацебо о інгібують активність ОРІМ у плазмі після перорального та внутрішньосудинного застосування (дивись графіки 1 со та 2)

Приклад 10: Дослідження підвищення дози у жирних щурів 2исКег після перорального застосування і-й глутамініл-піролідину ч-

Тварини

М-30 самців щурів 7ицисКег (Тала), середній вік 171 тижнів (5-12 тижнів), середня маса тіла З50г (150-400г), отримано від СНагієз Кімег (Зці2теїЇд, Септапу). Після постачання їх тримають 212 тижнів, доки майже « усі жирні щури 7исКег не мали характеристик вираженого цукрового діабету. Групу з М-8 тварини застосовували для тестування трьох підвищуючихся доз глутамініл-піролідину відносно плацебо (фізіологічний розчин). - с Умови утримання ц Тварин тримають у клітках поодинці у стандартизованих умовах з регульованою температурою (22222) при "» циклі світло/темрява 12/12 годин (світло на 06:00 ранку). Стерильну стандартну гранульовану їжу (звпії

Зоеві, Сегтапу) та підкислену НОСІ воду з крана дають досхочу.

Катетеризація сонної артерії -і Жирних щурів 7исКег віком 24-31 тижнів (у середньому: 25 тижнів), адаптованих до умов утримання, добре б» готують для дослідження.

Катетери імплантують у сонну артерію жирних щурів 2исКег під загальною анестезією (ін-траперитональною (95) ін'єкцією 0,25мл/кг Котрип (29051, Вауегуйа!, Сегтапу та О,5мл/кг кетаміну 10, Агагові ОтЬН к Со., Тмівігіпдеп, о 50 Септапу). Тваринам дають одужати протягом одного тижня. Катетери промивають гепарином-фізіологічним розчином (10010/мл) три рази на тиждень. іЧе) Експериментальна схема

Плацебо (мл фізіологічного розчину, 0,154моль/л) або підвищуючиїся дози глутамініл-піролідину (5, 15 та 5Омг/кг маси тіла) застосовують до групи з М-8 жирних щурів 2исКег. 375мг глутамініл-піролідину розчиняють у 1О000мкл ДМСО (Е. Мегск, Юагтвіаді Сеппапу |Диметилсульфоксиді), ТОмл фізіологічного розчину додають та о аліквоти по мл, кожна містить 34,09мг глутамініл-піролідину, зберігають при -202С. Для отримання тест-субстанції залежні від дози аліквоти розбавлено фізіологічним розчином. їмо) Після голодування протягом ночі плацебо або тест-субстанцію застосовують до жирних щурів 7исКег через зонд перорально (1505, 75мм; Ріпе Зсіепсе Тооів, НеїдеІрего, Септапу) на - 10 хвилину. Пероральний тест 60 толерантності до глюкози (ОСТ) з 2г/кг глюкози (4095 розчин, В. Вгашп Меїзипдеп, МеїЇзипдеп, Сегтапу) застосовують на 40 хвилину через другий зонд. Зразки венозної крові з хвостових вен збирають на - 30 хвилину, - 15 хвилину, 40 хвилину та на хвилини 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90 та 120 у скляні капіляри на 2Омкл, які поміщають у стандартні туби, заповнені їмл розчином для виміру глюкози у крові.

Усі зразки крові помічають таким чином: бо - Номер коду - Число тварин

- Дата відбору зразку - Час відбору зразку

Аналітичні способи

Рівні глюкози вимірюють, застосовуючи спосіб глюкоза-оксидази (Зирег (з Сісозе апаїулег; Ог. Мійег

Сегаігераи, Егейа!ї, Сегтапу).

Статистичні способи

Статистичні оцінки та графіки виконують за допомогою програмного забезпечення РКІЗМ 3,02 (сгарпРай зЗоїмаге, Іпс.). Усі параметри аналізують наочно, включаючи значення та стандартне відхилення. 70 Дія лікування на толерантність до глюкози

Ліковані плацебо діабетичні щури 7исКег показали сильно підвищене відхилення глюкози у крові, що вказує на нетолерантність до глюкози як вияв цукрового діабету. Застосування 5мг/кг маси тіла глутамініл-піролідину дає обмежене поліпшення толерантності до глюкози у діабетичних щурів 7исКег. Значне зниження підвищених рівнів глюкози у крові та поліпшення толерантності до глюкози досягають після застосування 15мг/кг та 5Омг/кг /5 маси тіла глутамініл-піролідину (дивись Фіг.3).

Приклад 11: Дослідження підвищення дози у жирних щурів 2исКег після перорального застосування глутамініл-тіазолідину

Тварини

М-30 самців щурів 7ицисКег (Тала), середній вік 171 тижнів (5-12 тижнів), середня маса тіла З50г (150-400г), отримано від Спагіез Кімег (Зці2еїд, Сегтапу). Після постачання їх тримають 212 тижнів, доки майже усі жирні щури 7исКег не мали характеристик вираженого цукрового діабету. Групу з М-8 тварини застосовували для тестування трьох підвищуючихся доз глутамініл-тіазолідину відносно плацебо (фізіологічний розчин).

Умови утримання

Тварин тримають у клітках поодинці у стандартизованих умовах з регульованою температурою (225222) при сч циклі світло/темрява 12/12 годин (світло на при 06:00 ранку). Стерильну стандартну гранульовану їжу (ззпії

Зоеві, Сегтапу) та воду з крану, підкислену НСІ, дають досхочу. і)

Катетеризація сонної артерії

Жирних щурів 2!исКег віком 24-31 тижнів (у середньому: 25 тижнів), адаптованих до умов утримання, добре готують для дослідження. Ф

Катетери імплантують у сонну артерію жирних щурів 7исКег під загальною анестезією (інтраперитональною ін'єкцією 0,25мл/кг Котрип (290), Вауегуйа), Сепгтапу та 0,5мл/кг кета-міну 10, Агагові СтТЬН Я Со. Тмівігіпдеп, -

Септапу). Тваринам дають одужати протягом одного тижня. Катетери промивають гепарином-фізіологічним со розчином (1001Ш/мл) три рази на тиждень.

Експериментальна схема ее,

Плацебо (мл фізіологічного розчину, 0,154моль/л) або підвищуючиїся дози глутамініл-тіазолідину (5, 15 та ї- 5Омг/кг маси тіла) застосовують до групи з М-8 жирних щурів 2исКег. Відповідну кількість глутамініл-тіазолідину розчиняють у 100Омкл фізіологічного розчину. Після голодування протягом ночі плацебо або тест-субстанцію застосовують до жирних щурів 7исКег через зонд перорально (1505, 75мм; Ріпе Зсіепсе

Тоо!ів, Неїдеірего, Сегтапу) на - 10 хвилину. Пероральний тест толерантності до глюкози (ОСТ) з 2г/кг глюкоз « (4095 розчин, В. Вгашп МеіІвипдеп, Меівипдеп, Сегтапу) застосовують на 40 хвилину через другий зонд. Зразки у с венозної крові з хвостових вен збирають на - 30 хвилину, - 15 хвилину, 40 хвилину та на хвилини 5, 10, 15, 20, "з ЗО, 40, 60, 90 та 120 у скляні капіляри по 2Омкл, які поміщають у стандартні туби, заповнені 1 мл розчину для " виміру глюкози у крові.

Усі зразки крові помічають таким чином: - Номер коду -і - Число тварин б» - Дата відбору зразку - Час відбору зразку (95) Аналітичні способи о 50 Рівні глюкози вимірюють, застосовуючи спосіб глюкоза-оксидази (Зирег З Сісозе апаїулег; Ог. МОНег

Сегаігераи, Егейа!ї, Сегтапу). іЧе) Статистичні способи

Статистичні оцінки та графіки провадять за допомогою програмного забезпечення РКІЗМ 3,02 (сгарпРай зЗоїмаге, Іпс.). Усі параметри аналізують наочно, включаючи значення та стандартне відхилення.

Дія лікування на толерантність до глюкози

Ліковані плацебо діабетичні щури 7исКег показали сильно підвищене відхилення глюкози у крові, що вказує о на нетолерантність до глюкози як вияв цукрового діабету. Застосування 5мг/кг маси тіла, 15мг/кг та 5Омг/кг іме) глутамініл-ті(іазолідину дає залежне від дози зниження підвищених рівнів глюкози у крові та поліпшення толерантності до глюкози у діабетичних щурів 7искКег (дивись Фіг.4). 60 Приклад 12: Іп мімо інактивація глутамініл-тіазолідину після перорального застосування до щурів УМізіаг

Тварини/Експериментальна схема

Глутамініл-тіазолідин застосовують до щурів УМівіаг перорально, як описано у прикладі 9

Аналітичні способи

Після застосування плацебо або глутамініл-тіазолідину, зразки артеріальної крові відбирають на хвилини 65 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 та 120 з катетера сонної артерії притомних вільних щурів для визначення утворення продуктів розкладання глутамініл-тіазолідину.

Для аналізу спосіб простої твердо-фазної екстракції на патронах С18 використовують для виділення потрібної сполуки з плазми. Екстракти аналізують, застосовуючи обернено-фазову рідинну хроматографію на колонці Гіспгозрпег 60 КР Зеїесі В з тандемною мас-спектрометрією у позитивному режимі ХІАТ. Спосіб з внутрішнім стандартом використовують для кількісного аналізу.

Результати

Після перорального застосування глутамініл-тіазолідину до щурів М/ізвіаг виявлено розкладання сполук.

Застосовуючи РХ/МС, продукт розкладання можна визначити як піроглутамініл-тіазолідин. Дивись графіки 5 та 6.

Claims (16)

Формула винаходу

1. Сполука формули: о , іч ; в--М і ная-ен - нон, сн, й о де ХСН» або 5, або її сіль приєднання.

2. Сполука за п. 71, де адитивну сіль вибирають з групи, в яку залучено солі гідрохлоридної, гідробромідної, перхлоратної, сульфатної, нітратної, фосфатної, оцтової, пропіонової, гліколевої, молочної, с 29 бурштинової, малеїнової, фумарової, яблучної, винної, лимонної, бензойної, мигдалевої, метансульфонової, Го) гідроксіетансульфонової, бензолсульфонової, щавлевої, памової, 2-нафталінсульфонової, п-толуолсульфонової, циклогексансульфамової, саліцилової, сахаринової та трифлуороцтової кислот.

3. Сполука за п. 1 або п. 2, яка є адитивною сіллю сполуки формули: б о , 30 Х Як о М х со ная-ен нм "сн, (Се) 35 "с-св, М. Й о де ХА:СН»е» або 5; а адитивну сіль вибирають з групи, в яку залучено солі гідрохлоридної, гідробромідної, « перхлоратної, нітратної, пропіонової, гліколевої, молочної, малеїнової, яблучної, лимонної, бензойної, З 50 мигдалевої, метансульфонової, гідроксіетансульфонової, бензолсульфонової, щавлевої, памової, с 2-нафталінсульфонової, п-толуолсульфонової, циклогексансульфамової, саліцилової, сахаринової та "з трифлуороцтової кислот.

4. Сполука за п. 3, вибрана з глутамінілтіазолідину гідрохлориду та глутамінілпіролідину гідрохлориду.

5. Сполука за п. 4, яка є глутамінілтіазолідину гідрохлоридом. 45

6. Сполука за п. 4, яка є глутамінілпіролідину гідрохлоридом.

-

7. Сполука за будь-яким одним з попередніх пунктів, яку застосовують для отримання медикаменту для Ге») інгібування активності дипептидилпептидази ІМ або подібних до дипептидилпептидази ІМ ферментів для попередження або лікування хвороб або станів, асоційованих з дипептидилпептидазою ІМ або подібними до о дипептидилпептидази ІМ ферментами. ав) 20

8. Сполука за п. 7 для зниження підвищених рівнів глюкози у крові у ссавців, які є результатом вживання їжі.

9. Сполука за пп. 7 або 8 для попередження або лікування незалежного від інсуліну цукрового діабету, со артриту, ожиріння, імунних та автоіїмунних розладів, алотрансплантації, раку, неврональних розладів та хвороб шкіри.

10. Сполука за п. 9У для попередження або лікування незалежного від інсуліну цукрового діабету.

11. Фармацевтична композиція, що містить фармацевтично прийнятний носій та/або розріджувач і сполуку за ГФ) будь-яким одним з попередніх пунктів. юю

12. Спосіб інгібування активності дипептидилпептидази ІМ або подібних до дипептидилпептидази ІМ ферментів для попередження або лікування хвороб або станів, асоційованих з дипептидилпептидазою ІМ або подібними до дипептидилпептидази ІМ ферментами, спосіб полягає у застосуванні до ссавця, що потребує 60 такого лікування, терапевтично ефективної кількості сполуки або фармацевтичної композиції за одним з пп. 1-11.

13. Спосіб за п. 12 для застосування при зниженні рівнів глюкози у крові у ссавців, які є результатом вживання їжі.

14. Спосіб за пп. 12 або 13 для застосування при попередженні або лікуванні хвороб або станів, вибраних з групи, що складається з незалежного від інсуліну діабету, цукрового діабету, артриту, ожиріння, імунних та бо автоіїмунних розладів, алотрансплантації, раку, неврональних розладів та хвороб шкіри.

15. Спосіб за п. 14 для застосування при попередженні або лікуванні незалежного від інсуліну цукрового діабету.

16. Продукт розкладання сполуки за пп. 1, З або 5, що має формулу Ї ' Н Мк - З с (8) (22) о со (Се)

м. « ші с ;» -І (22) (95) о 50 3е) Ф) іме) 60 б5