JP4334480B2 - α−ヘリックス安定化剤を用いる高次構造的に制約された副甲状腺ホルモン - Google Patents

α−ヘリックス安定化剤を用いる高次構造的に制約された副甲状腺ホルモン Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、高次構造的に制約された副甲状腺ホルモン(PTH)アナログ、ならびにPTHアナログの調製方法および使用方法に関する。
連邦政府によって資金援助された研究開発に関する言及
米国特許審査便覧310の下での言及。米国政府は、本発明における一括払いライセンス、および米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号DK-11794の規約によって提供されるような道理にかなった規約に基づいて他者にライセンスを与えるよう特許権者に要求するために限定された状況における権利を有する。
背景技術
副甲状腺ホルモン
副甲状腺ホルモン(PTH)(84アミノ酸ペプチド)は、ヒト体内のイオン化血液カルシウムの主要なレギュレーターである(Kronenberg, H.M., et al.、Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G.R. and Martin, T.J. (編)、pp.185-201、Springer-Verlag, Heidelberg (1993))。カルシウム濃度の調節は、胃腸、骨格、神経、神経筋、および心臓血管の系の通常の機能のために必要である。PTHの合成および放出は主に血清カルシウムレベルによって制御され;低レベルはホルモンの合成と放出の両方を刺激し、高レベルはそれらを抑制する。PTHは、次に、カルシウム交換の3つの部位:腸、骨、および腎臓において、血液へのカルシウムの流入を直接的または間接的に促進することによって、血清カルシウムレベルを維持する。PTHは、活性型ビタミンDの腎臓合成を促進することによって、正味の胃腸のカルシウム吸収に寄与する。PTHは、骨再吸収細胞である破骨細胞の分化を刺激することによって間接的にカルシウム再吸収を促進する。これはまた、腎臓に対する少なくとも3つの主要な効果:尿細管カルシウム再吸収の刺激、リン酸クリアランスの増強、および活性型ビタミンDの合成を完成する酵素の増加の促進を媒介する。PTHは、主としてアデニル酸シクラーゼおよび/またはホスホリパーゼCのレセプター媒介活性化を通してこれらの効果を発揮すると考えられている。
カルシウムホメオスタシスの破壊は、多くの臨床的障害(例えば、重篤な骨疾患、貧血、腎臓機能障害、潰瘍、筋障害、および神経障害)を生じる可能性があり、通常、副甲状腺ホルモンのレベルの変化を生じる状態から生じる。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの上昇によって特徴付けられる状態である。これはしばしば、過度のPTH産生が副甲状腺の損傷(例えば、腺腫、過形成、または癌腫)の結果として起こる原発性副甲状腺機能亢進症と関連する。別の型の高カルシウム血症である悪性体液性高カルシウム血症(HHM)は、最も一般的な新生物随伴症候群である。これは、大部分の場合において、PTHとアミノ酸相同性を共有するタンパク質ホルモンの1つのクラスの腫瘍(例えば、扁平上皮癌、腎臓癌、卵巣癌、または膀胱癌)による産生から生じると考えられる。これらのPTH関連タンパク質(PTHrP)は、PTHの腎臓および骨格の特定の作用を模倣するようであり、これらの組織におけるPTHレセプターと相互作用すると考えられている。
骨粗鬆症
骨粗鬆症は、高齢の成人集団の実質的部分、妊娠している女性、および年少者においてでさえ観察される潜在的に大きな損害を与える骨格疾患である。骨粗鬆症という用語は、異種の障害の群をいう。臨床的には、骨粗鬆症はI型およびII型に分けられる。I型骨粗鬆症は、中年女性において主に起こり、閉経期におけるエストロゲンの喪失と関連するのに対して、II型骨粗鬆症は加齢と関連する。骨粗鬆症を有する患者は、骨折修復を促進するように設計された新規の治療、またはこの疾患に関連した骨折を予防または軽減するように設計された治療からの利益を受ける。
この疾患は、骨質量の減少、骨ミネラル密度(BMD)の減少、骨強度の減少、および骨折のリスクの増大によって特徴付けられる。現在のところ、骨粗鬆症のための効果的な治療は存在しないが、エストロゲン、カルシトニンおよびビスホスホネート、エチドロン酸、およびアレンドロン酸が、様々なレベルの成功を伴って疾患を治療するために使用される。これらの薬剤は、骨再吸収を減少させるように作用する。副甲状腺ホルモンは、動物において血液カルシウムおよびリン酸レベルを調節し、かつ骨格に対して強力なタンパク質同化性(骨形成)効果を有するため
Figure 0004334480
、断続的に投与された場合、PTHまたはPTH誘導体は、骨粗鬆症のための新規かつ有効な治療の第1の候補である。
PTH誘導体
PTH誘導体は、アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むか、または全長分子と比較して短縮される。PTHの14アミノ酸と34アミノ酸の両方のアミノ末端短縮型、ならびにC末端短縮型が研究された。さらに、短縮型ポリペプチド中のアミノ酸置換もまた研究された。
合成PTH(1-34)は、大部分の細胞に基づくアッセイ系において完全な生物活性を示し、動物における骨質量に対してタンパク質同化性効果を有し、かつ閉経後の骨粗鬆症の女性における骨折のリスクを減少させることが示された(Neer, R.M., et al., N.E.J.M. 344: 1434-1441 (2001); Dempster, D.W., et al., Endocr Rev 14:690-709 (1993))。PTHは、アデニリルシクラーゼ/cAMPおよびホスホリパーゼC/イノシトールリン酸(IP)シグナル伝達経路と共役する、クラスIIGタンパク質結合ヘプタヘリックスレセプターであるPTH/PTHrPレセプター(P1R)に対して作用する(Rippner, H., et al., Science 254: 1024-1026 (1991))。欠失分析研究は、PTHのアミノ末端残基が、P1Rを刺激してcAMPおよびIPシグナル伝達経路を活性化する際に決定的な役割を果たすことを示した(Tregear, G.W., et al., Endocrinology 93: 1349-1353 (1973); Takasu, H., et al., Biochemistry 38: 13453-13460 (1999))。架橋およびレセプター変異誘発研究は、PTHのアミノ末端部分の残基が、レセプターの膜近傍領域中に存在する7つの膜貫通ヘリックスの細胞外ループおよび細胞外末端と相互作用することを示した。
Figure 0004334480
α-ヘリックス安定化剤
PTHおよびPTHrPの最初の34アミノ酸は、高親和性P1R結合およびP1R媒介シグナル伝達応答の強力な誘導のために必要な情報を含む(Nerr, RM, et al., N.E.J.M. 344: 1434-1441 (2001))。PTHの短いN末端フラグメント、例えば、PTH(1-14)およびPTH(1-11)は極度に弱い結合親和性を示すが(Kd>>100μM)、それにも関わらず、PTH(1-34)の効力(EC50〜2nM)よりも実質的に弱い効力(EC50s≧100μM)であるが、cAMPシグナル伝達応答を誘発することが可能である(Luck, MD et al., Molecular Endocrinology 13: 670-680 (1999))。一連の修飾されたPTH(1-14)およびPTH(1-11)アナログが、PTH(1-34)の効力に近いか、または完全に等しい程のシグナル伝達効力を示すことが報告されている(Shimizu, M. et al., Endocrinology 142: 3068-3074 (2001); Shimizu, M. et al., J. Biol. Chem. 276: 490003-49012 (2001); Shimizu, M. et al., J. Biol. Chem. 275: 21836-21843 (2000))。
最近、1位および/または3位におけるα,α-二置換アミノ酸、α-アミノイソ酪酸(Aib)を含むPTH(1-14)アナログが、これらの位置にアラニンを含むそれらの対応物ペプチドよりも、10から100倍高い親和性およびcAMPシグナル伝達強度を有することもまた報告された(Shimizu, N. et al., J. Biol. Chem. 276: 49003-49012 (2001))。
発明の要旨
本発明は、ポリペプチドにおける選択された位置にアミノ酸置換を含む新規PTHポリペプチド誘導体を提供する。この誘導体は、PTH-1レセプターの完全な、またはほぼ完全なアゴニストとして機能する。これらの独特の特性のために、これらのポリペプチドは、骨粗鬆症などのヒトの骨格の疾患を治療するための薬物としての有用性を有する。
本発明は、ポリペプチドPTH(1-14)、PTH(1-13)、PTH(1-12)、PTH(1-11)、PTH(1-10)、およびPTH(1-9)の誘導体を提供し、ここで、各ポリペプチドにおける少なくとも1つの残基がα,α-ジ-置換アミノ酸である。これらのポリペプチドはまた、ヘリックス(好ましくはα-ヘリックス)安定化残基である残基を含む。これらのα-ヘリックス安定化残基には、構造的に様々な側鎖を有するα，α-ジ-アルキルアミノ酸:例えば、α-アミノイソ酪酸(Aib)、α,α-ジエチル-グリシン(Deg)、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(Ac3c)、1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸(Ac5c)、アミノ-シクロブタン-1-カルボン酸(Ac4c)、および1-アミノ-シクロヘキサン-1-カルボン酸(Ac6c)が含まれるがこれらに限定されない。本発明はまた、このようなペプチドを作製する方法を提供する。さらに、本発明は、例えば、骨折または軟骨障害を治療する際、および必要であると見なされる細胞においてcAMPレベルを上昇させるため、といった、望ましくない骨損失または骨成長の必要によって特徴付けられる状態を治療する際に、望ましくない骨損失のリスクがある脊椎動物におけるこのような骨損失を制限するときの使用のための組成物および方法を含む。
1つの局面において、本発明は、本質的に
Figure 0004334480
からなる生物学的に活性なペプチドに向けられ、ここで、X01はα-ヘリックス安定化残基、Gly、Ser、またはAlaであり; X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerであり;X03はAla、Gln、またはAsnであり; X04はArg、Har、またはLeuであり; X05はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはGlyであり; X06はα-ヘリックス安定化残基またはLysであり; X07はα-ヘリックス安定化残基、TrpまたはHisであり、X01、X02、X03、X04、X05、X06、またはX07の少なくとも1つがα-ヘリックス安定化残基であり、かつα-ヘリックス安定化残基の少なくとも1つがAib(α-アミノイソ酪酸)、Ac3c(1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸)、Ac4c(1-アミノ-シクロブタン-1-カルボン酸)、Ac5c(1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸)、Ac6c(1-アミノ-シクロヘキサン-1-カルボン酸)またはDeg(α,α-ジエチルグリシン)である。
本発明はさらに、SEQ.ID.NO.1の配列、特に、
Figure 0004334480
を有するペプチドのフラグメントに及ぶ。本発明はさらに、上記のペプチド、および上記のペプチドのN末端またはC末端誘導体の薬学的に許容される塩を含み、ここで、X01、X02、X03、X04、X05、またはX06の少なくとも1つがα-ヘリックス安定化残基である。α-ヘリックス安定化残基の少なくとも1つは、Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cまたはDegからなる群より選択され得る。
さらに、本発明は、本質的に
Figure 0004334480
からなる生物学的に活性なポリペプチド、およびアミノ酸1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、または1〜9を含むペプチドに及ぶ。本発明はさらに、上記のペプチド、および上記のペプチドのN末端またはC末端誘導体の薬学的に許容される塩を含み、ここで、X01はα-ヘリックス安定化残基、Gly、Ser、またはAlaであり; X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerである。α-ヘリックス安定化残基には、上記に定義したようなAib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cおよびDegからなる群が含まれるがこれらに限定されない。
生物学的に活性なペプチドの好ましい態様には、
Figure 0004334480
が含まれる。アミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、または1〜13を含む上述のペプチドのフラグメントもまた、本発明の態様であることが意図される。本発明はさらに、上記のペプチドの薬学的に許容される塩、およびこのペプチドのN末端またはC末端誘導体を含む。
別の局面において、本発明は、本質的に
Figure 0004334480
からなる生物学的に活性なペプチドに向けられ、ここで、X01はα-ヘリックス安定化残基、Gly、Ser、またはAlaであり; X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerであり;X03はAla、Gln、またはAsnであり; X04はAla、Gln、またはAsnであり; X05はα-ヘリックス安定化残基、Ala、Gly、Har、またはArgであり; X06はα-ヘリックス安定化残基またはLysであり; X07はα-ヘリックス安定化残基、TrpまたはHisであり、ここで、X01、X02、X03、X04、X05、X06、またはX07の少なくとも1つがα-ヘリックス安定化残基であり、かつここでα-ヘリックス安定化残基の少なくとも１つがAib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cまたはDegである。
本発明はさらに、SEQ.ID.NO.5の配列、特に、
Figure 0004334480
を有するペプチドのフラグメントに及び、ここで、X01はα-ヘリックス安定化残基、Gly、Ser、またはAlaであり; X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerであり;X03はAla、Gln、またはAsnであり; X04はAla、Gln、またはAsnであり; X05はα-ヘリックス安定化残基、Ala、Gly、Har、またはArgであり; X06はα-ヘリックス安定化残基またはLysであり; X07はα-ヘリックス安定化残基、TrpまたはHisであり、ここで、X01、X02、X03、X04、X05、X06、またはX07の少なくとも1つがα-ヘリックス安定化残基であり、かつここでα-ヘリックス安定化残基の少なくとも1つがAib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cまたはDegである。本発明はさらに、上記のペプチドの薬学的に許容される塩、およびこのペプチドのN末端またはC末端誘導体を含む。
さらに、本発明は、本質的に
Figure 0004334480
からなる生物学的に活性なポリペプチド、およびアミノ酸1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、または1〜9を含むフラグメントに及ぶ。本発明はさらに、上記のペプチドの薬学的に許容される塩、およびこのペプチドのN末端またはC末端誘導体を含み、ここで、X01はα-ヘリックス安定化残基、Gly、Ser、またはAlaであり; X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerであり、ここでα-ヘリックス安定化残基の少なくとも1つは、Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cまたはDegである。
生物学的に活性なペプチドの好ましい態様には、
Figure 0004334480
が含まれる。アミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、または1〜13を含む上述のペプチドのフラグメントもまた本発明の態様であることが意図される。本発明はさらに、上記のペプチドの薬学的に許容される塩、およびこのペプチドのN末端またはC末端誘導体を含む。
本発明はまた、本明細書に記載されるPTHのいずれかを含む薬学的組成物および薬学的に許容される塩、および/または、生理食塩水などの薬学的に許容される溶液もしくは生理学的に緩衝化される溶液を含む薬学的組成物を提供する。
1つの局面において、本発明は、SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.5、または上記のペプチドのいずれかの配列を有する生物学的に活性なペプチド、および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物に向けられる。
別の局面において、本発明は、SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.5、または上記のペプチドを作製する方法に向けられ、ここで、このペプチドは、固相合成、液相合成、または溶液相合成によって合成される。
別の局面において、本発明は、SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.5、または上記のペプチドを作製する方法に向けられ、ここで、このペプチドはFMOCによって保護される。
本発明はまた、骨質量の減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を治療するための方法を提供し、この方法は、生物学的に活性なPTHポリペプチド誘導体の骨質量増加有効量を、その必要がある対象に投与する工程を含む。本発明の好ましい態様は、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、および高カルシウム血症などの状態に及ぶ。骨粗鬆症の型には、老年期骨粗鬆症および閉経後骨粗鬆症が含まれるがこれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、骨質量の減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を治療するための方法に向けられ、この方法は、SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.5、または上記のペプチドのいずれかの配列を有する、生物学的に活性なペプチドの骨質量増加有効量および薬学的に許容されるキャリアを、その必要がある対象に投与する工程を含む。さらなる好ましい態様には、約0.01μg/kg/日〜約1.0μg/kg/日のポリペプチドの有効量を使用する工程が含まれ、ここで、このポリペプチドは、非経口的に、皮下的に、または経鼻吸入法によって投与される。
本発明はまた、骨再編成、骨再吸収、および/または骨再構築の速度を決定するための方法を提供し、この方法は、有効量の標識されたPTHポリペプチド(例えば、SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.5、またはそれらの誘導体の配列を有するペプチドなど)を患者に投与する工程、およびそのペプチドのその患者への取り込みを決定する工程を含む。このペプチドは、放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識からなる群より選択される標識で標識してもよい。好ましい態様において、放射性標識は125Iまたは99mTcである。
発明の詳細な説明
定義
アミノ酸配列:本願におけるアミノ酸配列は、アミノ酸についての1文字または3文字のいずれかの記号表示を使用する。これらの記号表示は当業者に周知であり、例えば、Cooper, G.M., The Cell 1997, ASM Press, Washington, D.C. またはAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994などの多数の容易に入手可能な参考文献において見出され得る。例えば、Ser-3-->Alaまたは[Ala3]ペプチドのように配列における置換が言及される場合、これは、ポリペプチドのN末端からの3番目のセリンが、別のアミノ酸、この例においてはアラニンで置換されていることを意味する。
骨格ペプチド[M]PTH(1-14)は、[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)アミド(SEQ.ID.NO.13)と定義される。[M]PTH(1-11)は、[Ala1,3,Gln10,Har11]PTH(1-11)NH2(SEQ.ID.NO.16)と定義される。[Aib1,3,M]PTH(1-14)は[Aib1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.3)と定義される。
α,α-ジアルキルアミノ酸:「Aib」とはα-アミノイソブチル酪酸をいう;「Har」とはホモアルギニンをいう;「Nle」とはノルロイシンをいう;Ac3cとは1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸をいう;Ac4cとは1-アミノ-シクロブタン-カルボン酸をいう;Ac5cとは1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸をいう;Ac6cとは1-アミノ-シクロヘキサン-カルボン酸をいう;Degとはα,α-ジエチルグリシンをいう;IBMXとは3-イソブチル-1-メチルキサンチンをいう;および他のアミノ酸は慣用的な1文字コードまたは3文字コードのいずれかで示される。
タンパク質の生物学的活性:この表現はポリペプチドの任意の生物学的活性をいう。これらの活性の例には、SEQ.ID.NO.1の配列を有するペプチドの化合物、またはその誘導体の代謝的または生理学的機能(類似の活性または改善された活性、または望ましくない副作用の減少を伴う活性を含む)が含まれるがこれらに限定されない。上記の化合物の抗原性活性および免疫原性活性もまた含まれる。
誘導体または機能的誘導体:用語「誘導体」または「機能的誘導体」は、PTH分子の「変異体」、「誘導体」、または「化学的誘導体」を含むことが意図される。分子の「変異体」、例えば、SEQ.ID.NO.1の配列を有するペプチドまたはその誘導体の化合物などは、完全な分子またはそのフラグメントのいずれかに対して実質的に類似する分子をいう。分子の「アナログ」、例えば、SEQ.ID.NO.1の配列を有する化合物またはその誘導体などは、SEQ.ID.NO.1の分子の配列を有するペプチドまたはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然分子を意味する。
PTH誘導体は、同じサイズのネイティブなPTHポリペプチドと比較してポリペプチドにおける変化を含む。ネイティブなヒト(「hPTH」)PTH(1-14)ポリペプチドの配列は
Figure 0004334480
であり、またはネイティブなラット(「rPTH」)PTH(1-14)は
Figure 0004334480
である。分子は、両方の分子におけるアミノ酸の配列が実質的に同一である場合、および両方の分子が同様の生物学的活性を有する場合に、別の分子に対して「実質的に同様である」といわれる。従って、この用語は、1つの分子が他方において見出されないさらなるアミノ酸残基を含むか、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合においてでさえ、この用語は本明細書において使用されるように、同様の活性を有する2つの分子が、変異体、誘導体、またはアナログと見なされることが可能である。しかし、PTH誘導体は、ネイティブな分子と実質的に同様の生物学的活性を有する必要はない。ある場合において、PTH誘導体は、ネイティブなPTHとは実質的に異なる活性を有する。例えば、誘導体は、PTHレセプターのアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかであり得る。
本明細書中で使用される場合、分子は、これが通常その分子の一部ではないさらなる化学的部分を含む場合、別の分子の「化学的誘導体」であるといわれる。このような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することが可能である。この部分は、代替的に、その分子の任意の望ましくない副作用を除去または減弱するなど、その分子の毒性を減少させる。このような副作用を媒介することが可能である部分の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)に開示されており、当業者には明らかである。
フラグメント:分子の「フラグメント」、例えば、
Figure 0004334480
またはその誘導体などは、これらの分子の任意のポリペプチドサブセット(N末端またはC末端誘導体を含む)をいう。
融合タンパク質:本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、例えば、次にさらなるアミノ酸リーダーポリペプチド配列が連結される、そのN末端に連結された「選択的切断部位」を伴うかまたは伴わない、
Figure 0004334480
またはその誘導体などの化合物を含むタンパク質である。
ポリペプチド:ポリペプチドおよびペプチドは交換可能に使用される。ポリペプチドという用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いに結合された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」とは、短い鎖(一般的にはペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマー)と、長い鎖(一般的には、タンパク質)の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる20個のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよく、天然のプロセス(例えば、翻訳後プロセシング)によって、または当技術分野において周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書およびより詳細な研究論文、ならびに研究文献に十分に記載されている。修飾はポリペプチドのどこで行われることも可能であり、これには、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端およびカルボキシル末端が含まれる。同じ型の修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位において同じかまたは異なる程度で存在してもよいことが認識される。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含んでもよい。
ポリペプチドは分枝していてもよく、およびこれらは、分枝を伴ってまたは伴わずに環状であってもよい。環状、分枝、および環状分枝のポリペプチドは翻訳後修飾から生じてもよく、または合成方法によって作製してもよい。修飾には、以下が含まれる:アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、およびユビキチン化。例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties, 第2版, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspective and Prospests, 1〜12頁, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983; Seifter et al.,「Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors」, Methods in Enzymol. 182:626-646 (1990)およびRattan et al.,「Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging」, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)を参照されたい。
PTHレセプター:PTH-1レセプター(P1R)はクラスIIGタンパク質共役レセプターであり、そのアミノ末端細胞外(N)ドメインはPTHのC末端タンパク質に結合すると考えられている。
PTHアナログ-構造的特性および機能的特性
α-アミノイソ酪酸(Aib)およびAibと区別できるα,α-二置換アミノ酸は、短いN末端PTHペプチドアナログに導入された。種々の極性溶媒または非極性溶媒の中で実行されたPTH(1-34)アナログの多数のNMR研究は、一般的に、2つのドメインの二次構造:ほぼSer-17からVal-31までに拡がる安定なC末端ヘリックス、およびSer-3からLys-13まで変動的に拡がるより短くかつより安定でないアミノ末端ヘリックスを示した。これらの2つのドメインはベンドまたはターン領域によって接続されている。
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最近のPTH(1-34)の結晶学的研究は、Ser-3からHis-32までに拡がり、かつ中央部分にわずかな15°のベンドのみを含む連続的なα-ヘリックスを示した。しかし、NMRデータは、N末端ヘリックスが比較的弱いことを示す。ヘリックス安定化修飾(Aib残基の導入など)は、ペプチド強度に関して顕著な利点を提供し、PTH(1-34)と比較し得る活性を有する短いペプチド(≦14アミノ酸)を生じる。
単純な非注入法によって送達可能であるために十分に小さい、新規のPTHの「最小化」変異体が本明細書で記載される。本発明の変異体は、ポリペプチドの最初の14アミノ酸に置換を含む。新規ポリペプチドは、他に注記されない限り、成熟PTHポリペプチドのアミノ酸配列1〜14、1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、および1〜9に対応する。より短い変異体(≦PTH1-14)は、2,000ダルトン未満の分子量を有する。
タンパク質が産生されるとき、本明細書中に記載される化合物は、溶液相-または固相のペプチド合成の技術による産生に対して受容可能である。特に、固相ペプチド合成技術は、ヒトPTHの産生において首尾よく適用され、かつこれらの化合物の産生のために使用されることが可能である(手引きとしては、Kimura et al., 前記、およびFairwell et al., Biochem. 22:2691 (1983)を参照されたい)。比較的大スケールでのヒトPTHの産生における成功は、Goud et al., J. Bone Min. Res. 6(8):781 (1991)によって報告されている。合成的ペプチド合成アプローチは、一般的に、自動合成装置および固相としての適切な樹脂の使用を伴い、この固相に、SEQ.ID.NO.1またはその誘導体の配列を有するペプチドの、所望の化合物のC末端アミノ酸が結合される。次いで、N末端方向でのペプチドの伸長が、FMOCまたはBOCのいずれかに基づく化学的プロトコールを使用して、代表的には、合成が完了するまで、適切に保護された型の次の所望のアミノ酸を首尾よくカップリングすることによって達成される。次いで、保護基が、通常は樹脂からのペプチドの切断と同時にペプチドから切断され、次いで、ペプチドが、従来的な技術、例えば、溶媒としてアセトニトリルを使用し、イオン対剤としてトリフルオロ酢酸を使用する逆相HPLCを使用して、単離および精製される。このような手順は、一般的には、多数の刊行物に記載されており、例えば、Stewart and Young,「Solid Phase Peptide Synthesis」第2版, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984)が参照され得る。ペプチド合成アプローチは、例えば、遺伝子によってコードされていないアミノ酸(例えば、Aibなど)を取り込む、SEQ.ID.NO.1およびその誘導体の配列を有するペプチドなどの産生のために必要であることが理解される。
置換基は、当技術分野において公知である標準的な方法によって、本発明の化合物のN末端アミノ酸の遊離のアミンに結合されることが可能である。例えば、アルキル基(例えば、C1-12アルキル)は還元的アルキル化を使用して結合される。ヒドロキシアルキル基(例えば、C1-12ヒドロキシアルキル)はまた、還元的アルキル化を使用して結合され、ここで、遊離のヒドロキシ基はt-ブチルエステルで保護される。アシル基(例えば、COE1)は、遊離の酸(例えば、E1COOH)をN末端アミノ酸の遊離のアミノにカップリングすることによって結合される。さらに、ポリペプチドのC末端の可能な化学修飾は本発明の範囲内に含まれる。これらの修飾は、レセプターへの結合親和性を改変することが可能である。
例えば、なお生物学的な活性を保持している、変化した二次構造もしくは三次構造、および/または変化した安定性を有する、SEQ.ID.NO.1ならびにその誘導体の配列を有するペプチドなどの化合物が、本発明の範囲内にあることもまた意図される。このような誘導体はラクタム環形成、ジスルフィド結合、または当業者に公知である他の手段を通して達成されることが可能である。本発明の好ましい態様は上記に列挙されるポリペプチドのいずれかに及び、ここで、このポリペプチドはC末端アミドを含む。
本発明の化合物の有用性および投与
本発明の化合物またはその誘導体は多数の用途を有する。これらには、とりわけ、PTHレセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、骨質量の損失によって明示される種々の哺乳動物の状態の予防および治療、診断用プローブ、診断用プローブおよび分子量マーカーとしてさえ使用される抗体を調製するための抗原が含まれる。PTHポリペプチドにおいて、1つまたはそれ以上のアミノ酸を特異的に置換し得ることは、特定の分子量のポリペプチドの構築を可能にする。
特に、本発明の化合物は、ヒトにおける骨粗鬆症および骨減少症の予防および治療的処置のために示される。さらに、本発明の化合物は、他の骨疾患の予防および治療的処置のために示される。本発明の化合物はまた、副甲状腺機能低下症の予防および治療的処置のために示される。最後に、本発明の化合物は、骨修復のためのアゴニストとして、および高カルシウム血症のためのアンタゴニストとしての使用のために示される。
一般的に、本発明の化合物、またはその塩は、1日あたり約0.01から1μg/kg体重の間、好ましくは1日あたり約0.07〜約0.2μg/kg体重の量で投与される。50kgの対象ヒト女性については、生物学的に活性な化合物の1日用量は、約0.5〜約50μg、好ましくは約3.5〜約10μgである。他の哺乳動物(例えば、ウマ、イヌ、およびウシ)においては、より高い用量が必要とされる可能性がある。この投薬量は、最も効果的な結果を達成するために必要とされるように、単回用量によって、複数回適用によって、または制御放出を介して、好ましくは注射によって毎日1回またはそれ以上、従来的な薬学的組成物中で送達されることが可能である。例えば、この投薬量は、経鼻吸入法によって、または経口的に活性な手段によって従来的な薬学的組成物中で送達されることが可能である。別の投与の方法には、骨格に対する潜在的なタンパク質同化性効果のために、少なくとも1日1回の皮下注射が含まれる。
正確な用量および組成物ならびに最も適切な送達治療プログラムの選択は、とりわけ、本発明の選択された化合物の薬理学的特性、治療される状態の性質および重篤度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神的鋭敏さによって影響される。
代表的な好ましい送達治療プログラムには、非限定的に、経口、非経口、皮下、経皮(transcutaneous)、筋肉内および静脈内、直腸、口腔(舌下を含む)、経皮(transdermal)、および鼻内吸入が含まれる。
薬学的に許容される塩は、毒性の副作用を伴うことなく、本発明の化合物の望ましい生物学的活性を保持する。このような塩の例は、(a)無機酸、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、リン酸、硝酸などとともに形成された酸付加塩;および有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとともに形成された酸付加塩;(b)多価金属カチオン、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとともに形成された塩基付加塩;またはN,N'-ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成された有機カチオンとともに形成された塩基付加塩;あるいは(c)(a)および(b)の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩などである。薬学的に許容される緩衝液には、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水が含まれるがこれらに限定されない。当業者に公知である許容される保存剤もまた、これらの溶液に含まれる。
本発明のさらなる局面は、本発明の活性成分化合物または本発明のその誘導体、またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される非毒性キャリアと混合して含む薬学的組成物に関する。上述のように、このような組成物は、非経口(皮下、経皮(transcutaneous)、筋肉内、または静脈内)投与のために、特に液体溶液または懸濁物の形態で;経口または口腔投与のために、特に錠剤またはカプセルの形態で;直腸、経皮(transdermal)投与のために;および鼻内投与のために、特に粉末、鼻滴下剤、またはエアロゾルの形態で調製することが可能である。
本発明の組成物は、単位投薬量形態で便利に投与することが可能であり、かつ薬学分野において周知の方法のいずれかによって、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985)(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるように調製することが可能である。非経口投与のための処方物は、賦形剤として、滅菌水または生理食塩水、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来のオイル、水素化ナフタレンなどを含んでもよい。経口投与のために、処方物は、胆汁酸塩またはアシルカルニチンの付加によって増強されることが可能である。鼻投与のための処方物は固体であってもよく、賦形剤、例えば、ラクトースまたはデキストランを含んでもよく、または鼻滴下剤もしくは定量スプレーの形態での使用のための水性もしくは油性溶液であってもよい。口腔投与のために、代表的な賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化でんぷんなどが含まれる。
1つの好ましい投与の経路、鼻投与のために製剤化された場合、鼻粘膜を横切る吸収は、例えば、約0.2〜15重量パーセントの間の範囲、好ましくは約0.5〜4重量パーセントの間の範囲、最も好ましくは約2重量パーセントの量の、グリコール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコデオキシコール酸、シクロデキストリンなどの界面活性剤である酸によって増強することが可能である。
長期間の間、例えば、1週間から1年間の期間の間にわたっての、対象への本発明の化合物の送達は、所望の放出期間、十分に活性な成分を含む制御放出系の単回投与によって達成することが可能である。種々の制御放出系、例えば、モノリシックまたはリザーバー型マイクロカプセル、デポー移植物、浸透圧ポンプ、ベシクル、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン泳動装置、および代替的な注射可能投薬形態をこの目的のために利用することが可能である。活性成分の送達が所望される部位への局在化は、いくつかの制御放出装置のさらなる特徴であり、これは特定の障害の治療において有益性を証明し得る。
制御放出処方物の1つの形態は、Kent, Lewis, Sanders, and Tice, 米国特許第4,675,189号の先駆的な研究において記載されたようなコポリ(乳酸/グリコール酸)などのゆっくりと分解する、非毒性、非抗原性のポリマー中に分散もしくはカプセル化されたポリペプチドまたはその塩を含む。この化合物、または好ましくはそれらの比較的不溶性の塩はまた、コレステロールもしくは他のマトリックスペレット、またはシラストマー（silastomer）マトリックス移植物中に処方されることが可能である。さらなる徐放性のデポー移植物、または注射可能な処方物は当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978およびR.W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987を参照されたい。
PTHと同様に、PTH変異体は、所定の臨床的状態を治療する際に有用な他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、骨粗鬆症および他の骨関連障害を治療する際に、PTH変異体は、食物のカルシウムサプリメントまたはビタミンDアナログとともに投与してもよい(米国特許第4,698,328号を参照されたい)。または、PTH変異体は、好ましくはサイクル的治療プログラムを使用して、例えば、米国特許第4,761,406号において記載されるようなビスホスホネートと組み合わせて、または1種またはそれ以上の治療剤、例えば、非限定的に、カルシトニンおよびエストロゲンと組み合わせて投与してもよい。
PTHアナログレセプター-シグナル伝達活性
ホルモン作用の発現の決定的な段階は、標的細胞の原形質膜表面上のレセプターとホルモンの相互作用である。ホルモン-レセプター相互作用の形成は、種々の生物学的応答を誘発するために細胞への細胞外シグナルの伝達を可能にする。
本明細書中に記載されるポリペプチドは、cAMP蓄積アッセイ法を使用して、それらのアゴニスト性特性またはアンタゴニスト性特性についてスクリーニングすることが可能である。細胞表面にPTH-1レセプターを発現する細胞は、2mM IBMX(3-イソブチル-1-メチル-キサンチン、Sigma, St.Louis, MO)の存在下で、37℃で5〜60分間、ネイティブPTH(1-84)(SEQ.ID.NO.18)とともにインキュベートされる。サイクリックAMPの蓄積は特異的ラジオイムノアッセイ法によって測定される。PTH-1レセプターへの結合についてネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)(SEQ.ID.NO.19)と競合し、かつcAMP蓄積に対するネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)の効果を阻害する化合物は、競合的アンタゴニストと見なされる。このような化合物は高カルシウム血症を治療するために有用である。
逆に、PTH-1レセプターへの結合についてネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)と競合しないが、なおネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)によるcAMP蓄積の活性化を妨害する(おそらくレセプター結合部位をブロックすることによって)本明細書中に記載されるPTHアナログまたはその誘導体は、非競合的アンタゴニストと見なされる。このような化合物もまた、高カルシウム血症を治療するために有用である。
PTH-1レセプターへの結合についてネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)と競合し、かつネイティブPTH(1-84)もしくはPTH(1-34)の存在下または非存在下でcAMP蓄積を刺激する本明細書中に記載される化合物は、競合的アゴニストである。PTH-1レセプターへの結合についてネイティブPTH(1-84)またはPTH(1-34)と競合しないが、ネイティブPTH(1-84)もしくはPTH(1-34)の存在下もしくは非存在下でcAMP蓄積を刺激することが可能であるか、または本発明の化合物もしくはその誘導体単独によって観察されるよりも高いcAMP蓄積を刺激する化合物は、非競合的アゴニストと見なされる。
PTHアナログの治療的使用
高カルシウム血症および低カルシウム血症のある型は、PTHおよびPTHrPおよびPTH-1と、レセプターとの間の相互作用に関連する。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの異常な上昇が存在する状態である;これはしばしば、他の疾患(副甲状機能亢進症、骨粗鬆症、乳房、肺、および前立腺の癌腫、頭頸部および食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、ならびに副腎腫を含む)に伴う。血清カルシウムレベルが以上に低い状態である低カルシウム血症は、例えば、甲状腺手術後に有効なPTHの欠損から生じる可能性がある。
「アゴニスト」とは、PTH-1レセプターによって媒介される細胞応答を増強または強化することが可能であるリガンドが意図される。「アンタゴニスト」とは、PTH-1レセプターによって媒介される細胞応答を阻害することが可能であるリガンドが意図される。本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がこのような細胞応答を増強、または阻害することが可能であるかどうかを、当技術分野で公知のタンパク質リガンド/レセプター細胞応答または結合アッセイ法(本願において他の箇所に記載されているものを含む)を使用して決定することが可能である。
本発明のなおさらなる局面に従うと、PTH-1レセプターの変化した作用、または過度の作用から生じる医学的な障害を治療するための方法が提供され、この方法は、患者のPTH-1レセプターの活性化を阻害するために十分な本発明の化合物またはその誘導体の治療有効量をその患者に投与する工程を含む。
この態様において、PTH-1レセプターの作用の変化から生じる障害を有すると疑われている患者は、PTH-1レセプターの選択的アンタゴニストである本発明の化合物または本発明のその誘導体を使用して治療することが可能である。このようなアンタゴニストには、PTH-1レセプター媒介細胞活性化を妨害すると決定された(本明細書中に記載されるアッセイ法によって)本発明の化合物もしくは本発明のその誘導体、または同様の特性を有する他の誘導体が含まれる。
アンタゴニストを投与するために、本発明の化合物またはその誘導体は、一般的には、適切なキャリアまたは賦形剤(例えば、生理食塩水など)中で製剤化されることによって医薬の製造において使用され、および好ましくは、PTH-1レセプターに結合する本発明の化合物またはその誘導体の適切な阻害を提供する投薬量で、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻内で投与される。代表的な投薬量は、kg体重あたり1日あたり1ng〜10mgのペプチドである。
本発明のなおさらなる局面に従って、骨粗鬆症を治療するための方法が提供され、この方法は、患者のPTH-1レセプターを活性化するために十分である、本発明の化合物またはその誘導体の治療有効量をその患者に投与する工程を含む。PTH/PTHrPアンタゴニストについて上記と同様の投薬量および投与が、例えば、骨粗鬆症、他の代謝的骨障害、ならびに副甲状腺機能亢進症および関連する障害などの状態の治療のために、PTH/PTHrPアゴニストの投与について使用されることが可能である。
本発明は、本発明の精神または範囲またはその任意の態様から逸脱することなく、広範な組成のパラメーター、濃度、投与の様式、および条件の範囲内で実行され得ることが当業者によって認識される。
本明細書において本発明を十分に記載してきたが、本発明は、例示目的で提供される特定の実施例に対する参照によって、より容易に理解される。本発明は、本明細書中で特定されない限り、本明細書の限定を意図するものではない。
実施例
以下のプロトコールおよび実験の詳細は、以下に続く実施例において引用される。
実施例1
材料および方法
ペプチド
本研究において使用されたペプチドのアミノ酸配列はすべてヒトまたはラットのPTH配列由来であり、遊離のアミノ末端およびアミド化されたC末端を含む。開始骨格として使用された親のペプチドは[M]PTH(1-14)であり、これは[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.13)と定義される。ペプチドは、自動ペプチド合成装置(モデル430A PE、Applied Biosystems, Foster City, CA、またはモデル396 MBS Advanced Chem. Tect, Louisville, KY)上で、FMOC-主鎖保護基化学、カップリング反応のためのHBTU/HOBr/DIEA(1:1:2モル濃度比)、およびTFA-媒介切断/側鎖脱保護(MGH Biopolymer Synthesis Facility, Boston, MA)を使用して調製した。すべてのペプチドをC18含有カートリッジ上での吸着によって脱塩し、HPLCによってさらに精製した。乾燥ペプチド粉末を10mM酢酸中で再構築し、-80℃で保存した。各ペプチドについての純度、同一性、およびストック濃度を、分析HPLC、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量スペクトル分析、およびアミノ酸分析によって保証した。[M]PTH(1-21)(SEQ.ID.NO.20)および[Aib1,3,M]PTH(1-21)(SEQ.ID.NO.21)の放射性標識を、125I-Na(2,200 Ci/mmol, NEN)およびクロラミン-Tを使用して実行した;得られる放射性リガンドをHPLCによって精製した。
細胞培養
細胞株HKRK-B28(Takasu, H., et al., J. Bone Miner. Res. 14: 11-20 (1999))は、TM3のN末端から中央領域までのオポッサムP1R、およびTM3の中央領域からC末端までのラットP1Rから構成される組換えP1RキメラをコードするプラスミドDNAを用いる安定なトランスフェクションによる、ブタ細胞株LLC-PK1由来であった。これらの細胞におけるP1Rの表面密度は細胞あたり〜280,000レセプターである。クローン性細胞株LdelNt-2は、大部分のアミノ末端細胞外ドメインが欠失している組換えヒトPTH-1レセプター構築物である、P1R-delNtをコードするプラスミドを用いる安定なトランスフェクションを介してLLC-PK1細胞に由来した。これらの細胞、ならびにCOS-7細胞およびSaOS-2-B10細胞を、胎仔ウシ血清(10%)、ペニシリンG(20単位/ml)、硫酸ストレプトマイシン(20μg/ml)およびアムホテリシンB(0.05μg/ml)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、T-75フラスコ(75mm2)中で、27℃にて、5%CO2を含む加湿大気中で培養した。EGTA/トリプシンおよび抗生物質のストック溶液はGIBCOから入手した;胎仔ウシ血清はHyclone Laboratories (Logan, UT)から入手した。24ウェルプレートにサブ培養したCOS-7細胞は、塩化セシウム/臭化エチジウム密度勾配遠心分離、およびFuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Indianapolis IN)によって、製造業者の推奨する手順に従って精製した、野生型ヒトP1Rまたは残基(24〜181)が欠失している短縮型ヒトP1RをコードするプラスミドDNAでトランスフェクトした(ウェルあたり200ng)(Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275: 21836-21843 (2000))。24ウェルプレート中のすべての細胞を、アッセイの12〜24時間前に新鮮な培地で処理し、かつ33℃に移した。
cAMP刺激
ペプチドアナログを用いる細胞の刺激を24ウェルプレートにおいて実行した。細胞を0.5mLの結合緩衝液(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、5%熱不活化ウシ血清、0.5%胎仔ウシ血清、HClでpH 7.5に調整)ですすぎ、200μLのcAMPアッセイ緩衝液(2mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、1mg/mLウシ血清アルブミン、35mM Hepes-NaOH, pH 7.4を含むダルベッコ改変イーグル培地)および種々の量のペプチドアナログを含む100μLの結合緩衝液で処理した(最終容量=300μL)。室温での30〜60分間のインキュベーション後に培地を除去し、細胞をドライアイス上で凍結させ、0.5mLの50mM HClで溶解し、そして再凍結させた(〜80℃)。希釈した溶解物のcAMP含量をラジオイムノアッセイ法によって決定した。EC50応答値を非線形回帰を使用して計算した(以下を参照されたい)。
FMOC(フルオレニルメトキシカルボニル基)
カラムクロマトグラフィー後に容易に検出可能である蛍光アミノ酸誘導体を形成するため、または他の官能基が反応を受けているときにアミノ酸もしくはヌクレオチドのアミノ基を保護するためのいずれかの目的のためのアミノ基への連結に使用される基。この基を導入するために有用な試薬は、9-フルオレニルメチルクロロホルメートおよび9-フルオレニル-メチルスクシニミジルカーボネートである。
競合結合
結合反応を、24ウェルプレート中でHKRK-B28細胞またはCOS-7細胞を用いて実行した。細胞を0.5mLの結合緩衝液ですすぎ、次いで、100μLの結合緩衝液、種々の量の未標識競合リガンドを含む100μLの結合緩衝液、および約100,000cpmの
Figure 0004334480
を含む100μLの結合緩衝液(約26fmol;最終容量=300μL)で連続的に処理した。インキュベーションは4℃にて4〜6時間であり、この時点でほぼ平衡状態に達した。次いで、細胞を氷上に配置し、結合媒体を除去し、単層を0.5mLの冷結合緩衝液で3回洗浄した。続いて、細胞を0.5mLの5N NaOHで溶解し、放射能を計数した。各トレーサーについて、および各実験において、非特異的結合を、1μMの濃度で同じ未標識ペプチドの存在下で結合した放射能として決定し、それは各トレーサーについて加えられた全体の放射能の約1％だった。最大特異的結合(B0)は、競合リガンドの非存在下で結合した全体の放射能であり、各トレーサーについて、全体の放射能の8%から20%までの範囲が加えられた。非線形回帰が使用されて、結合IC50値を計算した(以下を参照されたい)。26fmolの
Figure 0004334480
を用いる研究に由来する相同競合結合データのスキャッチャード変換を、単一のクラスの結合部位およびヨード化リガンドおよび非ヨード化リガンドの等しいアフィニティーを仮定して、見かけの平衡解離定数(kDapps)およびリガンド結合部位の総数(Bmax)の見積もりのために利用した。
イノシトールリン酸産生の刺激
上記のようにP1R-WTでトランスフェクトされたCOS-7細胞を、0.1%ウシ血清アルブミンおよび[3H]ミオ-イノシトール(NEN、Boston、MA)(2μCi/mL)を含み、血清を含まない、イノシトールを含まないDMEMで、アッセイの前16時間処理した。アッセイの時点で、細胞を、LiCl(30mM)を含む結合緩衝液ですすぎ、かつPTHアナログを含むかまたは含まない同じ緩衝液で処理した。次いで、細胞を37℃で40分間インキュベートし、その後緩衝液を除去し、0.5mLの氷冷5%トリクロロ酢酸溶液によって置換した。氷上にて3時間後、溶解物を収集し、かつエチルエーテルで2回抽出した。次いで、溶解物をイオン交換カラム(0.5mL樹脂ベッド)に適用し、全体のイノシトールリン酸を、以前に記載されたように溶出させ(Berridge, M.J., et al., Biochem. J. 212: 473-482 (1983))、液体シンチレーションカクテル中で計数した。
胚性マウス中足骨における軟骨細胞分化の阻害
胚性日数(E)15.5胚からの中足骨を切除し、かつ24ウェルプレート中で、無血清αMEM培地中で、37℃加湿インキュベーター(5%CO2)中で培養した。16時間後、PTHアナログまたはビヒクルを加え、試料をさらに48時間、37℃で、24時間の時点で再度加えたペプチドまたはビヒクルとともにインキュベートした。64時間のインキュベーション時間の終わりに、試料を10%ホルマリン/リン酸緩衝化生理食塩水で固定化し、次いで白色光を使用して解剖顕微鏡で直接観察した。切片を、X型コラーゲンmRNA(成長板の肥大性軟骨細胞においてのみ発現される発生マーカー遺伝子)に特異的な35S標識リボプローブを使用して、インサイチューハイブリダイゼーション分析のために処理した。
円二色性偏光分析
円二色性スペクトルをJascoモデル710分光偏光計で記録した;ペプチドを、50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4、または20%(v/v)で2,2,2-トリフルオロエタノールを含む同じ緩衝液中、20μMの濃度で分析した。分光学的スキャンを、20℃で、185と255nMの間の波長で実行し、データを各1nM間隔で記録した。スペクトルのバンド幅は1.5nMであり、8回のスキャンを蓄積し、各試料毎に平均した。各波長において、平均残基楕円率[θ×100/lxCxn];ここでθは生の楕円率値であり(ミリ度の次元)、lは試料経路長であり、C=ペプチドモル濃度であり、そしてnはペプチド中の残基の数である(Bowen, W.P. and Jerman, J.C., Trends in Pharmacol. Sci. 16: 413-417 (1995))。各ペプチドのヘリックス含量は、そのペプチドについて222nMで観察された[θ]を-28,100(これは、モデルヘリックスデカペプチドについて報告された[θ]222obsである)で除算することによって見積もられた(Bowen, W.P. and Jerman, J.C., Trends in Pharmacol. Sci. 16: 413-417 (1995))。
データ計算
計算はMicrosoft(登録商標)Excelを使用して実行した。結合およびcAMP用量-応答データの非線形分析を、4パラメーター方程式: yp=Min+[(Max-Min)/(1+(IC50/x)傾き)]を使用して実行した。Excel Solver関数を、以前に記載されたように(Carter, P.H., et al., Endocrinology 140: 4972-4981 (1999): Bowen, W.P. and Jerman, J.C., Trends in Pharmacol. Sci. 16: 413-417 (1995))、パラメーター最適化のために利用した。対のデータセット間の違いを、2つのセットについての不均等な分散を仮定して、1方向スチューデントt検定を使用して統計学的に評価した。
実施例2
α,α-二置換アミノ酸を含むアナログのP1-R結合親和性
[M]PTH(1-14)[M=Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14](SEQ.ID.NO.13)の1位および/または3位におけるAibから区別されるα,α-置換アミノ酸を導入することの効果を分析した。6種のアミノ酸を選択した:α-アミノイソブチル酪酸(Aib)、α,α-ジエチルグリシン(Deg);1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(Ac3c);1-アミノ-シクロブタン-カルボン酸(Ac4c)、1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸(Ac5c)、および1-アミノ-シクロヘキサン-カルボン酸(Ac6c)(これらのいくつかは図1に示される)。
hPTHレセプターを安定に発現するLLC-PK1-由来細胞株(B28)において、
Figure 0004334480
トレーサーを使用して実行される競合結合アッセイ法において、Deg3およびAc5c3含有アナログの親和性は、[M]PTH(1-14)の親和性と比較し得るものであった(IC50s〜3μM)。Ac3c3含有アナログの親和性は、[M]PTH(1-14)の親和性よりも14倍低く、Deg、Ac3c、およびAc5c置換ペプチドの親和性は、[M]PTH(1-14)の親和性よりも3〜50倍高かった(IC50〜0.6μM)。
アナログ[Ac5c1,Aib3,M]PTH(1-14)(SEQ.ID.NO.15)は、現在までに研究されたいかなるPTH(1-14)アナログのうちでも、最大の結合親和性の1つ(IC50=100nM)および最大のcAMP強度の1つ{M[M]PTH(1-14)についての200nMと比較して、EC50=0.9n}を示した。Ac5c1修飾は、親の[M]PTH(1-14)アナログ{[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]ヒトPTH(1-14)-NH2}(SEQ.ID.NO.13)と比較して親和性を50倍改善し、かつcAMP強度を〜35倍改善した。それゆえに、1位のシクロペンタン環は、Aibの2つのCαメチルが行うよりもより好ましいP1Rとの相互作用を可能にする。これらの1位における構造的に区別されるアミノ酸の各々が親和性/強度を改善することは、これらの増強効果がこれらの特異的側鎖のトポロジーに起因するのではなく、むしろα-ヘリックス構造の安定化であるバックボーンコンホメーションに対するこれらの効果に起因することを示唆する。Deg3置換は、ほぼ1.5倍、最低限の親和性の改善を示したが、シグナル伝達強度は約40倍、顕著に減少した。
実施例3
Ac5cペプチドアゴニスト活性
ペプチド[Ac5c1,Aib3,M]PTH(1-14)(SEQ.ID.NO.15)は、B28細胞への
Figure 0004334480
の結合の阻害について、およびアデニリルシクラーゼを刺激することについて、ならびにホスホリパーゼCを刺激することについて、[Aib1,3,M]PTH(1-14)(SEQ.ID.NO.3)よりも〜2倍強力であった(図2)。従って、このペプチドは、これまでに同定された、最も強力なPTH(1-14)アナログの1つである。Deg1およびDeg3と組み合わせることは、適度な親和性で結合するペプチドを生じたが(図1A)、cAMP形成については真の部分的アゴニストであった(図1B)。
ペプチド[Ac5c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)(SEQ.ID.NO.22)は、10-4Mにて、マイクロモル濃度の強度にも関わらず完全なcAMPアゴニストであり、[Ac5c1,Aib3]PTH(1-9)(SEQ.ID.NO.31)は、明確はアゴニスト活性を示し、このことは、このペプチドを、信頼できるcAMPアゴニスト活性を有する最も短いPTHアナログペプチドにした。
実施例4
Ac5cペプチドアンタゴニスト活性
アンタゴニストとして機能するリガンドは副甲状腺機能亢進症を治療するために有用であり得る。N末端修飾を含む[Ac5c1,Aib3,M]PTH(1-14)(親)(SEQ.ID.NO.15)のアナログは、シグナル伝達および結合親和性を解離させることが予測された（例えば、デスアミノ-1、Trp-1、Bpa-2、Arg-2、Deg-1,3）。置換の大部分は、P1R結合親和性を適度に減少させ、cAMP-刺激活性を強力に減少させた。
Trp2アナログ[Ac5c1,Trp2,Aib3,M]PTH(1-14))(SEQ.ID.NO.23)は10-5Mにおいて[Aib1,3,M]PTH(1-14)(SEQ.ID.NO.3)のアゴニスト活性を、10-9Mにおいて〜50%阻害する。
実施例5
PTH(1-14)における1位および3位の単一置換
ジアルキルアミノ酸の単一置換は、親の骨格ペプチド[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.13)の1位および3位に導入した。これらの研究における1位および3位で利用されるアミノ酸の図解的構造を図1に示し、ペプチド配列を表1に提示する。1位および3位にアラニンを含む親のペプチド[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.13)は、220±80nMの強度(EC50)値でHKRK-B28細胞中でのcAMP蓄積を刺激し、かつ
Figure 0004334480
トレーサー放射性リガンドのこれらの細胞への結合を、27±3μMの見かけの親和性(IC50)値で阻害した。親のアナログと比較して、1位で置換されたアナログは、cAMP蓄積を刺激することについて、〜2倍(Ac3c、P=0.1)、11倍(Deg、P=0.02)、または61倍(Ac5c、P=0.02)より強力であった。これらの強度の増加には、見かけの結合親和性に対するそれ相応の効果が伴った。3位においては、シクロアルカンアミノ酸、Ac3c、またはAc5cのいずれかを用いる置換は、適度にcAMP刺激強度を増加した(<2倍)のに対して、直鎖状アミノ酸、Degを用いる置換は強度をほぼ10倍減少した;Ac5c-3およびDeg-3は結合親和性にほとんど効果がないか、または全く効果がなかったのに対して、Ac3c-3は約10倍、親和性を低下させた。
実施例6
PTH(1-14)アナログにおける1位および3位の組み合わせ置換
ジアルキルアミノ酸を、親の骨格ペプチド[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.13)の1位と3位の両方に導入した。1位および3位にAc3cを導入することは、アナログ[Ac3c1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.28)を生じ、これは、結合親和性およびシグナル伝達強度によって親のペプチドと比較可能であった。これらの位置にAc5cを導入することは、アナログ[Ac5c1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.29)を生じ、これは、親のペプチドよりも20倍高い親和性でP1Rに結合し(P=0.001)、かつcAMPシグナル伝達については30倍強力であった(P=0.02;表2)。1位および3位におけるDeg置換を組み合わせることは、[Deg1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.27)を生じ、これは、親のペプチドよりも50倍高い親和性でP1Rに結合したが(P=0.001)、部分的なアゴニスト応答のみを誘発し、これは、親のペプチドによって達成されたものの45%に過ぎない最大を達成した。
実施例7
PTH(1-9)アナログおよびPTH(1-10)アナログ
最短の活性アナログを、PTH・PTHレセプター相互作用メカニズムを機能的に探査するために使用されるように開発した。PTH(1-14)よりも短いネイティブN末端PTHアナログは細胞に基づくアッセイ法において不活性であり、測定可能なcAMP応答は、アナログ[Aib1,3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.35)についてP1Rトランスフェクトされた細胞において検出することが可能である。[Ac3c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.22)および[Ac5c1,Aib3]PTH(1-9)NH2(SEQ.ID.NO.31)を調製し、それらの活性をHKRK-B28細胞において評価した。1×10-4Mまでの高さの濃度で試験した場合、いずれのペプチドもP(1-21)トレーサー放射性リガンドの結合を阻害しなかった。各アナログは、これらの細胞において明確なcAMP応答を誘導した。[Ac5c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.22)の用量-応答分析から、EC50値を約3μMと見積もった。PTH(1-9)アナログを単一の高濃度で(1×10-4M)アッセイし、基礎レベルと比較して6倍のcAMPレベルの増加を誘導することを見出した(P=0.001);同じ濃度では、[Aib1,3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.35)は、cAMP蓄積の2倍の増加を誘導し(P=0.52)、ネイティブPTH(1-9)(SEQ.ID.NO.33)は不活性であった。
実施例8
P1R-delNT細胞におけるアナログ活性
P1R-delNtを発現する細胞における選択されたアナログのアゴニスト活性を試験した。このPTH-1レセプター構築物はNドメインの大部分を欠くが、それにも関わらず、N末端PTHアナログに対する完全なアゴニスト応答を媒介し、従って、リガンド相互作用プロセスに対するレセプターのNドメインおよびJドメインの関連する役割が評価されることを可能にする。クローン性細胞株LdelNT-2を使用した。これは、ヒトP1R-delNt構築物をコードするプラスミドを用いる安定なトランスフェクションによって、LLC-PK1から誘導された。これらの細胞において、[Ac5c1,Aib3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.15)は、強い強度を伴うcAMP蓄積の70倍の増加を誘導した(EC50=6.4±2.3nM);[Ac5c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.22)は、より弱い効力を示し(EC50〜40μM)、[Deg1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.27)は部分的なアゴニスト性挙動を示した(Emax=基礎レベルの23倍;EC50=1.4±0.5μM)。
（表1）PTHペプチド配列
Figure 0004334480
*ヨード化チロシンを示す
これまで、理解の明確化の目的のために例証および例示によっていくぶん詳細に本発明を完全に記載してきたが、本発明は、広範かつ等価な範囲の条件、製剤、およびその他のパラメーターを用いて、本発明を改変または変更することによって実行されることが可能であること、ならびにこのようは改変および変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されることは、当業者に明らかである。
本明細書中上記に言及されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個別の刊行物、特許、および特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、その全体がおよび参照により本明細書に組み入れられる。
（図１）α,α-二置換アミノ酸アナログAib、Deg、Ac3c、Ac5cの構造である。制約されたφ/ψ回転はヘリックス形成を支持することに注意されたい(R.KauおよびP.Balaram, Bioorganic Medicinal Chemistry, 7 105-117 (1999)より改変)。
（図２）PTH(1-14)アナログの1位または3位における単一のα,α-二置換アミノ酸置換の、HKRK-B28細胞におけるcAMP刺激強度およびP1R結合親和性に対する効果である。ペプチド[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(親)(SEQ.ID.NO.13)およびそのアナログ(アラニン-1またはアラニン-3が1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(Ac3c);1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸(Ac5c)またはα,α-ジエチルグリシン(Deg)で置換された)が、細胞内cAMP蓄積を刺激するそれらの能力について(A)、(C)、および
Figure 0004334480
の結合を阻害するその能力について（B）（D）、HKRK-B28細胞において評価された。cAMP応答は親のペプチドについての各実験において観察された最大応答のパーセントとして表現され、その平均はウェルあたり225±21ピコモルのcAMPであった(n=7);対応する基礎cAMPレベルはウェルあたり3.8±0.1ピコモルであった。ペプチドおよびそれらの対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図３）PTH(1-14)アナログの1位および3位における組み合わせたα,α-二置換アミノ酸置換の、HKRK-B28細胞におけるcAMP刺激強度および結合親和性に対する効果である。ペプチド
Figure 0004334480
は細胞内cAMP蓄積を刺激する能力について(A)および
Figure 0004334480
の結合を阻害する能力について（B）、HKRK-B28細胞において評価された。親のペプチド[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2 (SEQ.ID.NO.13)を用いて観察された応答もまた示される。cAMP応答は親のペプチドについての各実験において観察された最大応答のパーセントとして表現される。ペプチドおよび対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図４）hP1Rを発現するCOS-7細胞におけるPTH(1-14)アナログのホスホリパーゼCシグナル伝達特性である。
Figure 0004334480
の能力。hP1Rで一過性にトランスフェクトされたCOS-7細胞における3H-イノシトールリン酸(IP1+IP2+IP3)の形成を刺激することが評価された。ペプチドおよび対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図５）HKRK-B28細胞におけるPTH(1-9)アナログおよびPTH(1-10)アナログによるcAMP形成の刺激である。パネルAは、HKRK-B28細胞における細胞内cAMP蓄積を様々な濃度の[Ac5c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.22)が刺激する能力を示す。[Ala1,3,12,Gln10,Har11,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.13)に対する応答は、図2Aから再び示される。パネルBは、緩衝液単独(基礎)または、ネイティブなPTH(1-9)NH2、[Aib1,3]PTH(1-9)NH2(SEQ.ID.NO.37)もしくは[Ac5c1,Aib3]PTH(1-9)NH2(SEQ.ID.NO.34)のいずれかを、各々100μMの濃度で含む緩衝液で処理された細胞におけるcAMPレベルを示す(P対基礎=0.052(*)または<0.0001(a);P対[Aib1,3]PTH(1-9)NH2=0.001(b)(SEQ.ID.NO.37)。10μMにおける[Ac5c1,Aib3,Gln10]PTH(1-10)NH2(SEQ.ID.NO.22)および10nMにおける[Ac5c1,Aib3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.15)(これらについて基礎と比較してcAMPレベルが33倍(P=0.0003)および38倍(P=0.006)増大する)がそれぞれ観察された。ペプチドおよび対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図６）LdelNt-2細胞におけるPTH(1-14)アナログおよびPTH(1-10)アナログのcAMP刺激能力である。ペプチド
Figure 0004334480
はLdelNt-2細胞におけるcAMP刺激強度について評価された。この細胞は、安定なトランスフェクションを介してhP1R-delNtを発現する、クローン性のLLC-PK1-由来細胞である。データは、[Ac5c1,Aib3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]PTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.15)についての各実験において観察された最大応答のパーセントとして表現され、これはウェルあたり125±19ピコモルのcAMPであり;基礎cAMPレベルはウェルあたり1.8±0.3ピコモルであった。対応するEC50値は6.4±1.6nMであった。
Figure 0004334480
ペプチドおよび対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図７）PLC活性の刺激である。PTH(1-14)アナログは、hP1R-WTを一過性に発現するCOS-7細胞においてPLC活性を刺激した。ペプチドおよび対応する記号は記号一覧にて同定される。
（図８）PTHアナログのインビボにおけるアゴニスト活性である。マウスに、ビヒクル、または[Nle8,21,Tyr34]ラットPTH(1-34)NH2(SEQ.ID.NO.14)、もしくは[Ac5c1,Aib3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]ヒトPTH(1-14)NH2(SEQ.ID.NO.15)のいずれかを含むビヒクルを腹腔内注射し、3分後に血液試料を取り出し、血漿cAMPレベルをラジオイムノアッセイ法によって決定した。有効なPTHペプチド濃度は、PTH(1-34)アナログについては体重キログラムあたり20×10-9モルであり、PTH(1-14)アナログについては体重キログラムあたり200×10-9モルであった。各バーは4匹のマウスから得られたデータの平均(±s.e.m.)cAMP値を表す。

Claims (32)

  1. 以下より選択される式を含む、生物学的に活性なペプチドであって、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：１のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩;
    ここで、
    X01はAc 5 cであり;
    X02はα-ヘリックス安定化残基、AlaまたはSerであり;
    X03はAla、Gln、またはAsnであり;
    X04はArg、Har、またはLeuであり;
    X05はα-ヘリックス安定化残基、Ala、またはGlyであり;
    X06はα-ヘリックス安定化残基またはLysであり;
    X07はα-ヘリックス安定化残基、Trp、またはHisであり、
    ここで該α-ヘリックス安定化残基は、Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6cおよびDegからなる群から独立して選択されるものである、生物学的に活性なペプチド。
  2. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：４のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  3. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b))配列番号：４６のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  4. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：４７のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  5. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：２９のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  6. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：１５のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  7. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：５１のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  8. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：５２のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  9. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    および
    (b)その薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項1記載のペプチド。
  10. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：９のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項１記載のペプチド。
  11. ペプチドが、
    (a)
    Figure 0004334480
    (b)配列番号：１０のアミノ酸1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、もしくは1〜13を含むペプチド;および
    (c)(a)もしくは(b)の薬学的に許容される塩
    より選択される、請求項１記載のペプチド。
  12. ペプチドが、
    (a)Ac 5 cValAibGluIleGlnLeuMetHisGln (SEQ. ID. NO. 22)；または
    (b)その薬学的に許容される塩
    である、請求項６記載のペプチド。
  13. ペプチドが、
    (a)Ac 5 cValAibGluIleGlnLeuMetHis (SEQ. ID. NO. 31)；または
    (b)その薬学的に許容される塩
    である、請求項６記載のペプチド。
  14. ペプチドが、
    (a)Ac 5 cValAibGluIleGlnLeuMetHisGlnArgAlaLysTrp (SEQ. ID. NO. 30)；または
    (b)その薬学的に許容される塩
    である、請求項１記載のペプチド。
  15. ペプチドがC末端アミドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載のペプチド。
  16. ペプチドが、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および放射性標識からなる群より選択される標識で標識される、請求項１〜１５のいずれか一項記載のペプチド。
  17. ペプチドが125Iで標識される、請求項１６項記載のペプチド。
  18. ペプチドが99mTcで標識される、請求項１６記載のペプチド。
  19. 請求項１〜１５のいずれか一項記載の生物学的に活性なペプチド、および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。
  20. 骨質量の減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を治療するための薬学的組成物の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項記載の生物学的に活性なペプチドの骨質量増加有効量の使用。
  21. 薬学的組成物が薬学的に許容されるキャリアを含む、請求項２０記載の使用。
  22. 患者において骨再編成、骨再吸収、および/または骨再構築の速度を決定するための薬学的組成物の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドの有効量の使用。
  23. 治療される状態が副甲状腺機能亢進症である、請求項２０記載の使用。
  24. 治療される状態が高カルシウム血症である、請求項２０記載の使用。
  25. 骨質量を増加させるためのペプチドの有効量が0.01μg/kg/日〜1.0μg/kg/日である、請求項２０記載の使用。
  26. 薬学的組成物が非経口投与に適切である、請求項２０記載の使用。
  27. 薬学的組成物が皮下投与に適切である、請求項２０記載の使用。
  28. 薬学的組成物が経鼻吸入法に適切である、請求項２０記載の使用。
  29. 薬学的組成物が経口投与に適切である、請求項２０記載の使用。
  30. ペプチドが固相合成によって合成される、請求項１〜１５のいずれか一項記載のペプチドを作製するための方法。
  31. ペプチドが液相合成によって合成される、請求項１〜１５のいずれか一項記載のペプチドを作製するための方法。
  32. ペプチドがFMOCによって保護される、請求項３０記載のペプチドを作製するための方法。
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