JPH0532696A - 副甲状腺ホルモン誘導体 - Google Patents
副甲状腺ホルモン誘導体Info
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- JPH0532696A JPH0532696A JP3227232A JP22723291A JPH0532696A JP H0532696 A JPH0532696 A JP H0532696A JP 3227232 A JP3227232 A JP 3227232A JP 22723291 A JP22723291 A JP 22723291A JP H0532696 A JPH0532696 A JP H0532696A
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- JP
- Japan
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- leu
- lys
- peptide
- amino acid
- hpth
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- Pending
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone (parathormone); Parathyroid hormone-related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
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- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
- A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
-
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- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【構成】ヒト副甲状腺ホルモンPTH(1−34)の
1、8、11、12、13、18、19、21、23、
25、26、27または34位の1以上を他のアミノ酸
で置換した一般式〔I〕のペプチドまたはその塩。 R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His
-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg-R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-L
eu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13〔I〕 〔R1はSerまたはAib、R2はMetまたは天然型の脂溶性ア
ミノ酸、R3はLeu,Ser,Lysまたは芳香族アミノ酸、R4
はGlyまたはD-アミノ酸、R5はLysまたはLeu、R6はMetま
たは天然型の脂溶性アミノ酸、R7はGluまたは塩基性ア
ミノ酸、R8はValまたは塩基性アミノ酸、R9はTrpまたは
2-(1,3-ジチオラン-2-イル)Trp、R10はArgまたはHis、
R11はLysまたはHis、R12はLys,GlnまたはLeu、R13はPh
eまたはPhe-NH2を示す〔ただし同時にR1がSer、R2がMe
t、R3がLeu、R4がGly、D-AlaまたはD-Pro、R5がLys、R6
がMet、R7がGlu、R8がVal、R9がTrp、R10がArg、R11がL
ys、R12がLysである場合を除く〕 【効果】種々の蛋白質分解酵素への抵抗性が増し血中で
の活性持続性が上昇するなど優れたPTH誘導体を得
て、骨疾患等の有用な医薬となる。
1、8、11、12、13、18、19、21、23、
25、26、27または34位の1以上を他のアミノ酸
で置換した一般式〔I〕のペプチドまたはその塩。 R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His
-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg-R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-L
eu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13〔I〕 〔R1はSerまたはAib、R2はMetまたは天然型の脂溶性ア
ミノ酸、R3はLeu,Ser,Lysまたは芳香族アミノ酸、R4
はGlyまたはD-アミノ酸、R5はLysまたはLeu、R6はMetま
たは天然型の脂溶性アミノ酸、R7はGluまたは塩基性ア
ミノ酸、R8はValまたは塩基性アミノ酸、R9はTrpまたは
2-(1,3-ジチオラン-2-イル)Trp、R10はArgまたはHis、
R11はLysまたはHis、R12はLys,GlnまたはLeu、R13はPh
eまたはPhe-NH2を示す〔ただし同時にR1がSer、R2がMe
t、R3がLeu、R4がGly、D-AlaまたはD-Pro、R5がLys、R6
がMet、R7がGlu、R8がVal、R9がTrp、R10がArg、R11がL
ys、R12がLysである場合を除く〕 【効果】種々の蛋白質分解酵素への抵抗性が増し血中で
の活性持続性が上昇するなど優れたPTH誘導体を得
て、骨疾患等の有用な医薬となる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はホルモンによる治療剤と
して有用な、新規副甲状腺ホルモンペプチド誘導体に関
するものである。
して有用な、新規副甲状腺ホルモンペプチド誘導体に関
するものである。
【0002】
【従来の技術】副甲状腺ホルモン(PTH)は副甲状腺で
合成された後、その標的器官である骨、腎臓、腸に作用
して、主に血中カルシウムやリン酸イオンの濃度を調節
する重要な働きをしている。PTHは84個のアミノ酸か
らなるペプチドホルモンであるがその生物学的作用はN
末端(1-34位)のペプチドフラグメントで再現できる事が
知られている〔G.W.Tregearら、エンドクリノロジー(En
docrinology),93 1349-1353(1973)〕。このヒト型P
THのN末端(1-34位)のペプチドフラグメント(ヒトP
TH(1-34)と略す)のアミノ酸配列は以下の通りであ
る。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn- Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser- 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH (配列番号:1)
合成された後、その標的器官である骨、腎臓、腸に作用
して、主に血中カルシウムやリン酸イオンの濃度を調節
する重要な働きをしている。PTHは84個のアミノ酸か
らなるペプチドホルモンであるがその生物学的作用はN
末端(1-34位)のペプチドフラグメントで再現できる事が
知られている〔G.W.Tregearら、エンドクリノロジー(En
docrinology),93 1349-1353(1973)〕。このヒト型P
THのN末端(1-34位)のペプチドフラグメント(ヒトP
TH(1-34)と略す)のアミノ酸配列は以下の通りであ
る。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn- Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser- 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH (配列番号:1)
【0003】
【発明が解決しようとする課題】PTHの生物学的作用
からして、これを医薬として用いれば種々の骨疾患等に
対する有用な医薬品となり得る事が期待されるが、ペプ
チドが有する次の様な性質がそれを困難にしている。
1.体内で種々の酵素により分解を受け易い。2.種々
の経路における体内への吸収効率が非常に低い。3.例
えば酸化等、種々の物理化学的条件に対し、不安定であ
る。この様な問題点を解決すべく、又当該ホルモンの構
造活性相関を理解すべくPTH(1-34)フラグメントにつ
いて種々の誘導体の合成がなされてきたが、それらは主
にウシPTH(1-34)に関するものであり、ヒトPTH
(1-34)に関してはその例は少ない。例えばヒトPTH(1
-34)のC末端PheをPhe-NH2に変換すると活性の上昇
が見られる(特開昭58-96052)事が知られている。しか
し、これはカルボキシルペプチダーゼによる分解が抑え
られ、その結果見かけの活性上昇が観察されたものと思
われる。また、ヒトPTH(1-34)にはMetが2残基含
まれるが、これらをNleに置換した分子では酸化によ
るホルモン活性消失が防止されることが知られている
(特開昭61-24598)。しかしNleは非天然型アミノ酸
であり、医薬としての用途を考えた場合より好ましいア
ミノ酸置換が望まれる。
からして、これを医薬として用いれば種々の骨疾患等に
対する有用な医薬品となり得る事が期待されるが、ペプ
チドが有する次の様な性質がそれを困難にしている。
1.体内で種々の酵素により分解を受け易い。2.種々
の経路における体内への吸収効率が非常に低い。3.例
えば酸化等、種々の物理化学的条件に対し、不安定であ
る。この様な問題点を解決すべく、又当該ホルモンの構
造活性相関を理解すべくPTH(1-34)フラグメントにつ
いて種々の誘導体の合成がなされてきたが、それらは主
にウシPTH(1-34)に関するものであり、ヒトPTH
(1-34)に関してはその例は少ない。例えばヒトPTH(1
-34)のC末端PheをPhe-NH2に変換すると活性の上昇
が見られる(特開昭58-96052)事が知られている。しか
し、これはカルボキシルペプチダーゼによる分解が抑え
られ、その結果見かけの活性上昇が観察されたものと思
われる。また、ヒトPTH(1-34)にはMetが2残基含
まれるが、これらをNleに置換した分子では酸化によ
るホルモン活性消失が防止されることが知られている
(特開昭61-24598)。しかしNleは非天然型アミノ酸
であり、医薬としての用途を考えた場合より好ましいア
ミノ酸置換が望まれる。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者はこのような課
題を解決するために、ヒトPTH(1−34)におけるア
ミノ酸の置換を化学合成的に実施し、ヒトPTH(1−3
4)に種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性を考慮した
アミノ酸置換をほどこす事により、また予想される2次
元構造や、親水・疎水性もしくはイオン的環境を考慮し
たアミノ酸置換を試みる事により、当該ホルモンのレセ
プターへの親和性を高め、さらには酸、アルカリ性条
件、酸化条件等に対して不安定なアミノ酸を、活性を低
下させる事なく、これらの条件に対して安定なアミノ酸
に置換することによってこの目的が達成されることを見
出し、本発明を完成したものである。これにより効果的
に臨床応用可能なPTH類縁体を提供することに成功し
たものである。
題を解決するために、ヒトPTH(1−34)におけるア
ミノ酸の置換を化学合成的に実施し、ヒトPTH(1−3
4)に種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性を考慮した
アミノ酸置換をほどこす事により、また予想される2次
元構造や、親水・疎水性もしくはイオン的環境を考慮し
たアミノ酸置換を試みる事により、当該ホルモンのレセ
プターへの親和性を高め、さらには酸、アルカリ性条
件、酸化条件等に対して不安定なアミノ酸を、活性を低
下させる事なく、これらの条件に対して安定なアミノ酸
に置換することによってこの目的が達成されることを見
出し、本発明を完成したものである。これにより効果的
に臨床応用可能なPTH類縁体を提供することに成功し
たものである。
【0005】すなわち本発明は、 R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg -R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13〔I〕 〔式中R1はSerまたはAibを、R2はMetまたは天然型の脂
溶性アミノ酸を、R3はLeu,Ser,Lysまたは芳香族アミ
ノ酸を、R4はGly,またはD-アミノ酸を、R5はLysまたは
Leuを、R6はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、R7は
Glu,または塩基性アミノ酸を、R8はVal,または塩基性
アミノ酸を、R9はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イ
ル)Trpを、R10はArgまたはHisを、R11はLysまたはHis
を、R12はLys,GlnまたはLeuを、R13はPheまたはPhe-NH
2を示すが、同時にR1がSer、R2がMet、R3がLeu、R4がGl
y、D-AlaまたはD-Pro、R5がLys、R6がMet、R7がGlu、R8
がVal、R9がTrp、R10がArg、R11がLys、R12がLysである
場合を除く〕(配列番号:2)で表されるペプチドまた
はその塩に関するものである。
溶性アミノ酸を、R3はLeu,Ser,Lysまたは芳香族アミ
ノ酸を、R4はGly,またはD-アミノ酸を、R5はLysまたは
Leuを、R6はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、R7は
Glu,または塩基性アミノ酸を、R8はVal,または塩基性
アミノ酸を、R9はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イ
ル)Trpを、R10はArgまたはHisを、R11はLysまたはHis
を、R12はLys,GlnまたはLeuを、R13はPheまたはPhe-NH
2を示すが、同時にR1がSer、R2がMet、R3がLeu、R4がGl
y、D-AlaまたはD-Pro、R5がLys、R6がMet、R7がGlu、R8
がVal、R9がTrp、R10がArg、R11がLys、R12がLysである
場合を除く〕(配列番号:2)で表されるペプチドまた
はその塩に関するものである。
【0006】R2,R6における天然型の脂溶性アミノ酸と
しては天然(動物、植物または微生物)のタンパク質を
構成するアミノ酸のうち脂溶性のものをいい、具体的に
は、Leu,Ile,Val,PheおよびTrp等が挙げられる。R3
における芳香族アミノ酸としてはPhe,β−ナフチルAl
a,TrpおよびTyr等が挙げられる。R4におけるD-アミノ
酸としてはD-α-アミノ酸であれば、特に限定されるも
のではなく、具体的にはD-Leu,D-Ile,D-Nle,D-Val,
D-Ser,D-Ser(But),D-Abu,D-Thr,D-Nva,D-Met,β-
ナフチル-D-Ala,D-Trp,D-Tyr,D-Lys,D-Lys(Fmoc),
D-Phe,D-Asnなどが挙げられるが、一般に中性アミノ酸
が好ましく、例えばD-Ser,D-Leu,D-ナフチルAla,D-T
rp,D-Asn,D-Tyr等が挙げられる。R7,R8における塩
基性アミノ酸としてはArg,Lys,Asn,His等が挙げられ
る。これらの置換は一ケ所だけでなく、何ケ所かの置換
の組合せも可能であり、後述の実施例にあるように特に
3ケ所までの置換の組合せは実用的である。
しては天然(動物、植物または微生物)のタンパク質を
構成するアミノ酸のうち脂溶性のものをいい、具体的に
は、Leu,Ile,Val,PheおよびTrp等が挙げられる。R3
における芳香族アミノ酸としてはPhe,β−ナフチルAl
a,TrpおよびTyr等が挙げられる。R4におけるD-アミノ
酸としてはD-α-アミノ酸であれば、特に限定されるも
のではなく、具体的にはD-Leu,D-Ile,D-Nle,D-Val,
D-Ser,D-Ser(But),D-Abu,D-Thr,D-Nva,D-Met,β-
ナフチル-D-Ala,D-Trp,D-Tyr,D-Lys,D-Lys(Fmoc),
D-Phe,D-Asnなどが挙げられるが、一般に中性アミノ酸
が好ましく、例えばD-Ser,D-Leu,D-ナフチルAla,D-T
rp,D-Asn,D-Tyr等が挙げられる。R7,R8における塩
基性アミノ酸としてはArg,Lys,Asn,His等が挙げられ
る。これらの置換は一ケ所だけでなく、何ケ所かの置換
の組合せも可能であり、後述の実施例にあるように特に
3ケ所までの置換の組合せは実用的である。
【0007】本発明におけるペプチド合成はペプチド自
動合成装置によって行うことができる。基本的な合成過
程等はR.B.Merrifield〔アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー(Advances in Enzymology)32,221-296(1969)〕
の方法に順じている。この方法は、カルボキシル末端の
アミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ
基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰り返し
て、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目的のア
ミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得る事をその原
理としている。各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の保護
基の除去などは、ほぼ同一の条件でなされ、中間体の精
製も行なわない為、合成に際しては一般に高度な熟練は
要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種々のペ
プチドを合成するに際し、非常に便利な方法である。こ
うして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化
水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはトリフル
オロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させる事によ
り、ペプチドの樹脂からの脱離と全保護基の除去を一段
階で行うことができる。得られたペプチド粗精製物は、
ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製する
ことができる。例えばゲル濾過、陽イオン交換、もしく
は陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフ
ィー、さらには疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロ
マトグラフィー等、種々の原理によるカラムクロマトグ
ラフィーや高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明のペプチドは種々の塩の形で得られる。塩として
は、例えば無機酸や、ギ酸、酢酸、酒石酸、クエン酸な
どの有機酸との塩、もしくはナトリウムやアンモニアな
どの無機塩基や、トリエチルアミン、エチルアミン、メ
チルアミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
動合成装置によって行うことができる。基本的な合成過
程等はR.B.Merrifield〔アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー(Advances in Enzymology)32,221-296(1969)〕
の方法に順じている。この方法は、カルボキシル末端の
アミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ
基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰り返し
て、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目的のア
ミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得る事をその原
理としている。各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の保護
基の除去などは、ほぼ同一の条件でなされ、中間体の精
製も行なわない為、合成に際しては一般に高度な熟練は
要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種々のペ
プチドを合成するに際し、非常に便利な方法である。こ
うして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化
水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはトリフル
オロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させる事によ
り、ペプチドの樹脂からの脱離と全保護基の除去を一段
階で行うことができる。得られたペプチド粗精製物は、
ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製する
ことができる。例えばゲル濾過、陽イオン交換、もしく
は陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフ
ィー、さらには疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロ
マトグラフィー等、種々の原理によるカラムクロマトグ
ラフィーや高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明のペプチドは種々の塩の形で得られる。塩として
は、例えば無機酸や、ギ酸、酢酸、酒石酸、クエン酸な
どの有機酸との塩、もしくはナトリウムやアンモニアな
どの無機塩基や、トリエチルアミン、エチルアミン、メ
チルアミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
【0008】本発明の一般式(I)で表わされるヒトP
TH(1−34)誘導体ペプチドは、骨粗鬆症治療剤、副
甲状腺機能低下症の治療剤、高血圧治療剤として用いる
ことができる。そしてその剤型としては、注射剤、経鼻
吸収剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点
眼剤のようなものが挙げられるが、場合により経口投与
されることもある。該ペプチドをこのような治療剤とし
て用いる場合、哺乳動物に対してその有効量が用いられ
る。一般的には1ng〜100μg/体重kgの範囲で用
いられるが、この厳密な量については当業者によって適
宜決められるものである。このペプチドを治療剤として
用いる場合には、注意深く精製を行ない細菌や発熱物質
が存在しないように注意しなければならない。このペプ
チドを骨粗鬆症などの治療薬として用いる場合、そのま
まあるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤
と混合したのち、上記注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸収
剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。投与量は成人の場
合、注射剤の場合、1回あたり50ng〜5mg、好まし
くは1〜500μgで1〜3日に1回の投与が適当であ
る。治療剤の濃度は注射剤では10〜100μg/mlが適
当である。
TH(1−34)誘導体ペプチドは、骨粗鬆症治療剤、副
甲状腺機能低下症の治療剤、高血圧治療剤として用いる
ことができる。そしてその剤型としては、注射剤、経鼻
吸収剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点
眼剤のようなものが挙げられるが、場合により経口投与
されることもある。該ペプチドをこのような治療剤とし
て用いる場合、哺乳動物に対してその有効量が用いられ
る。一般的には1ng〜100μg/体重kgの範囲で用
いられるが、この厳密な量については当業者によって適
宜決められるものである。このペプチドを治療剤として
用いる場合には、注意深く精製を行ない細菌や発熱物質
が存在しないように注意しなければならない。このペプ
チドを骨粗鬆症などの治療薬として用いる場合、そのま
まあるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤
と混合したのち、上記注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸収
剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。投与量は成人の場
合、注射剤の場合、1回あたり50ng〜5mg、好まし
くは1〜500μgで1〜3日に1回の投与が適当であ
る。治療剤の濃度は注射剤では10〜100μg/mlが適
当である。
【0009】本発明明細書において、アミノ酸などを略
号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on
Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければL−体を示すものとする。 GlyまたはG :グリシン AlaまたはA :アラニン ValまたはV :バリン LeuまたはL :ロイシン IleまたはI :イソロイシン SerまたはS :セリン ThrまたはT :スレオニン CysまたはC :システイン MetまたはM :メチオニン GluまたはE :グルタミン酸 AspまたはD :アスパラギン酸 LysまたはK :リジン ArgまたはR :アルギニン HisまたはH :ヒスチジン PheまたはF :フェニールアラニン TyrまたはY :チロシン TrpまたはW :トリプトファン ProまたはP :プロリン AsnまたはN :アスパラギン GlnまたはQ :グルタミン Aib :アミノイソブチル酸 Nle :ノルロイシン β−Ala :β−アラニン hPTH :ヒトPTH Fmoc :9−フルオレニルメトキシカルボニ
ル Nva :ノルバリン Abu :α−アミノブチリル酸
号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on
Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければL−体を示すものとする。 GlyまたはG :グリシン AlaまたはA :アラニン ValまたはV :バリン LeuまたはL :ロイシン IleまたはI :イソロイシン SerまたはS :セリン ThrまたはT :スレオニン CysまたはC :システイン MetまたはM :メチオニン GluまたはE :グルタミン酸 AspまたはD :アスパラギン酸 LysまたはK :リジン ArgまたはR :アルギニン HisまたはH :ヒスチジン PheまたはF :フェニールアラニン TyrまたはY :チロシン TrpまたはW :トリプトファン ProまたはP :プロリン AsnまたはN :アスパラギン GlnまたはQ :グルタミン Aib :アミノイソブチル酸 Nle :ノルロイシン β−Ala :β−アラニン hPTH :ヒトPTH Fmoc :9−フルオレニルメトキシカルボニ
ル Nva :ノルバリン Abu :α−アミノブチリル酸
【0010】
【作用】PTH(1-34)に本発明のような置換を行なうこ
とによって、種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性が増
し、血中での活性の持続性が得られる。これは例えば第
1位のAib、或いは第12位のD-アミノ酸への置換で達
成された。この12位Gly付近はβ-ターン構造をもっ
ていると思われるが、これのD-アミノ酸、中でもD-Le
u,D-Trp,D-Valなどのかさ高いD−アミノ酸への置換
は、この構造の安定化に寄与し、またこの部位での蛋白
分解酵素によるペプチド鎖切断を阻止することにもなっ
ていると考えられる。また8位、18位のMetのLeuなどの
脂溶性天然アミノ酸への置換は、酸化に対する抵抗性を
増し、活性の低下ないし消失を防ぐ上で有用である。さ
らに他の部位のアミノ酸残基の置換ではPTH誘導体の
レセプターとの親和性が増し、高いPTH活性が発現さ
れている。例えば11位は本来Leuであるが、芳香環側
鎖を有するアミノ酸、例えばPheへの置換がより好ま
しいし、25、26、27位の塩基性アミノ酸部位の置換、特
に27位のLysのGln、Leuへの置換により、また23位のTrp
の2-(1,3-ジチオラン-2-イル)Trpへの置換により高い
PTH活性が発現されている。またMetの他の天然型
アミノ酸、例えばLeuやGlnへの置換は、活性を同
等もしくはそれ以上に保持し、かつ酸化反応に対して抵
抗性を有する誘導体を得る事を目的とするものである。
ここに挙げた代表的なアミノ酸置換の例は本発明を制限
するものと解釈されるべきではない。
とによって、種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性が増
し、血中での活性の持続性が得られる。これは例えば第
1位のAib、或いは第12位のD-アミノ酸への置換で達
成された。この12位Gly付近はβ-ターン構造をもっ
ていると思われるが、これのD-アミノ酸、中でもD-Le
u,D-Trp,D-Valなどのかさ高いD−アミノ酸への置換
は、この構造の安定化に寄与し、またこの部位での蛋白
分解酵素によるペプチド鎖切断を阻止することにもなっ
ていると考えられる。また8位、18位のMetのLeuなどの
脂溶性天然アミノ酸への置換は、酸化に対する抵抗性を
増し、活性の低下ないし消失を防ぐ上で有用である。さ
らに他の部位のアミノ酸残基の置換ではPTH誘導体の
レセプターとの親和性が増し、高いPTH活性が発現さ
れている。例えば11位は本来Leuであるが、芳香環側
鎖を有するアミノ酸、例えばPheへの置換がより好ま
しいし、25、26、27位の塩基性アミノ酸部位の置換、特
に27位のLysのGln、Leuへの置換により、また23位のTrp
の2-(1,3-ジチオラン-2-イル)Trpへの置換により高い
PTH活性が発現されている。またMetの他の天然型
アミノ酸、例えばLeuやGlnへの置換は、活性を同
等もしくはそれ以上に保持し、かつ酸化反応に対して抵
抗性を有する誘導体を得る事を目的とするものである。
ここに挙げた代表的なアミノ酸置換の例は本発明を制限
するものと解釈されるべきではない。
【0011】
【0012】
【実施例1】PTH部分ペプチド(1-34位)類縁体の合成
と精製 本ペプチドの合成はメリフィールドらにより開発された
ペプチドの固相合成法(R.B.Merrifield.アドバンシズ
イン エンザイモロジー(Adv.Enzymol)32巻、221-296頁
1969年)の変法に順じて行われ、自動ペプチド合成機430
A(アプライドバイオシステムズ社)を用いた。保護ペ
プチド−樹脂の合成はアプライドバイオシステムズ社指
定のプロトコールを用いた。カルボキシル末端が遊離カ
ルボン酸の誘導体を得る場合には保護アミノ酸−pオキ
シメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂(ポリスチレ
ンー1%ジビニルベンゼン)を、またカルボキシルアミ
ドの誘導体を得る場合には4−メチルベンズヒドリル樹
脂を出発原料とし、これに遂次保護アミノ酸を縮合させ
た、縮合時に各アミノ酸のα−アミノ基を保護するた
め、三級ブチルオキシカルボニル(BOC)基を用い
た。側官能基保護は次のように行なった。セリンとスレ
オニンのヒドロキシル基は0−ベンジルエーテルとし
て、チロシンのヒドロキシル基又はp−ブロモベンジル
オキシカルボニルエスチルとして、グルタミン酸及びア
スパラギン酸のカルボキシル基はベンジルエステルとし
て、ヒスチジンのイミダゾール窒素はベンジルオキシメ
チルによって、リジンの側鎖アミノ基は2−クロルベン
ジルオキシカルボニルで、アルギニンのグアニジン官能
基はp−トルエンスルホニル基で、トリプトファンのイ
ンドールイミンはホルミル基で保護した。すべてのアミ
ノ酸は、アプライド・バイオシステムズジャパン社又は
バチェム・ケミカルズから入手した。
と精製 本ペプチドの合成はメリフィールドらにより開発された
ペプチドの固相合成法(R.B.Merrifield.アドバンシズ
イン エンザイモロジー(Adv.Enzymol)32巻、221-296頁
1969年)の変法に順じて行われ、自動ペプチド合成機430
A(アプライドバイオシステムズ社)を用いた。保護ペ
プチド−樹脂の合成はアプライドバイオシステムズ社指
定のプロトコールを用いた。カルボキシル末端が遊離カ
ルボン酸の誘導体を得る場合には保護アミノ酸−pオキ
シメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂(ポリスチレ
ンー1%ジビニルベンゼン)を、またカルボキシルアミ
ドの誘導体を得る場合には4−メチルベンズヒドリル樹
脂を出発原料とし、これに遂次保護アミノ酸を縮合させ
た、縮合時に各アミノ酸のα−アミノ基を保護するた
め、三級ブチルオキシカルボニル(BOC)基を用い
た。側官能基保護は次のように行なった。セリンとスレ
オニンのヒドロキシル基は0−ベンジルエーテルとし
て、チロシンのヒドロキシル基又はp−ブロモベンジル
オキシカルボニルエスチルとして、グルタミン酸及びア
スパラギン酸のカルボキシル基はベンジルエステルとし
て、ヒスチジンのイミダゾール窒素はベンジルオキシメ
チルによって、リジンの側鎖アミノ基は2−クロルベン
ジルオキシカルボニルで、アルギニンのグアニジン官能
基はp−トルエンスルホニル基で、トリプトファンのイ
ンドールイミンはホルミル基で保護した。すべてのアミ
ノ酸は、アプライド・バイオシステムズジャパン社又は
バチェム・ケミカルズから入手した。
【0013】樹脂上に全てのアミノ酸を縮合した後、保
護ペプチド樹脂を合成機から取り出し、乾燥した。ペプ
チド樹脂(1g)を、p−クレゾール(1ml)、1,2−エ
タンジチオール(1ml)、2−メルカプトピリジン(100
mg)を含んだ、無水フッ化水素(8ml)と、0℃で2時
間反応させた。反応終了後、フッ化水素を留去し、残留
物をジエチルエーテルで洗浄し、大部分の混合試薬を除
去した。ペプチドを3%酢酸(10ml)で抽出し、濾過に
より樹脂を除いた。濾液をセファデックスG−25を用い
るゲル濾過により精製した。ゲル濾過の条件は、カラム
サイズ2.8×60cm、検出波長230もしくは280nm;溶媒、3
%酢酸;流速40ml/時間であった。ペプチドを含むフラ
クションを集めて凍結乾燥し、得られた粉末標品をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
YMC−パック、A−324 ODS(10×250mm)溶出溶媒
A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%水;溶出溶媒B,
0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセトニトリル;溶出
濃度勾配プログラム、0分(90%A+10%B)、30分(60%A
+40%B)(但し必要ならば他の溶出プログラムを用い
る事もある。)溶出速度1.6ml/分、検出波長230または
280nm。純粋な目的物を含むピーク画分を集めてバイオ
ラッドAGI×8(酢酸型、1.8×5cm)のカラムに通
し、洗液も集めアセトニトリルを留去した後、凍結乾燥
した。
護ペプチド樹脂を合成機から取り出し、乾燥した。ペプ
チド樹脂(1g)を、p−クレゾール(1ml)、1,2−エ
タンジチオール(1ml)、2−メルカプトピリジン(100
mg)を含んだ、無水フッ化水素(8ml)と、0℃で2時
間反応させた。反応終了後、フッ化水素を留去し、残留
物をジエチルエーテルで洗浄し、大部分の混合試薬を除
去した。ペプチドを3%酢酸(10ml)で抽出し、濾過に
より樹脂を除いた。濾液をセファデックスG−25を用い
るゲル濾過により精製した。ゲル濾過の条件は、カラム
サイズ2.8×60cm、検出波長230もしくは280nm;溶媒、3
%酢酸;流速40ml/時間であった。ペプチドを含むフラ
クションを集めて凍結乾燥し、得られた粉末標品をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
YMC−パック、A−324 ODS(10×250mm)溶出溶媒
A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%水;溶出溶媒B,
0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセトニトリル;溶出
濃度勾配プログラム、0分(90%A+10%B)、30分(60%A
+40%B)(但し必要ならば他の溶出プログラムを用い
る事もある。)溶出速度1.6ml/分、検出波長230または
280nm。純粋な目的物を含むピーク画分を集めてバイオ
ラッドAGI×8(酢酸型、1.8×5cm)のカラムに通
し、洗液も集めアセトニトリルを留去した後、凍結乾燥
した。
【0014】このようにして得たペプチドと、そのアミ
ノ酸分析結果ならびに逆相高速液体クロマトグラフィー
における保持時間を表1に示す。なお、表1中のa,
b,cは以下の通りである。 a:4%チオグリコール酸存在下、6規定塩酸で減圧封
管中、110℃、24時間加水分解後アミノ酸分析に付し
た。カッコ内は理論値。 b:化合物名(末尾に何も付いていないのはカルボン酸
タイプである): (1)(Leu18)hPTH(1−34) (2)(Aib1)hPTH(1−34) (3)(Phe11)hPTH(1−34) (4)(D−Trp12)hPTH(1−34) (5)(Leu8)hPTH(1−34)NH2 (6)(D−Tyr12)hPTH(1−34)NH2 (7)(D−Ser12)hPTH(1−34)NH2 (8)(D−Leu12)hPTH(1−34)NH2 (9)〔3−(2−ナフチル)−D−Ala12〕hPT
H(1−34)NH2 (10)(Ser11)hPTH(1−34)NH2 (11)(Phe11,Leu18)hPTH(1−34)NH2 (12)(Leu8,Phe11,Leu18)hPTH(1−3
4)NH2 (13)(Lys11)hPTH(1−34)NH2 (14)(Phe11)hPTH(1−34)NH2 (15)(Arg19’21)hPTH(1−34)NH2 (16)〔3−(2−ナフチル)−Ala11〕hPTH
(1−34)NH2 (17)(His26)hPTH(1−34)NH2 (18)(His25)hPTH(1−34) (19)(Gln27)hPTH(1−34) (20)〔Arg19’21,2−(1,3−ジチオラン−2
−イル)−Trp23〕hPTH(1−34)NH2 (21)(Leu27)hPTH(1−34) (22)(Lys11)hPTH(1−34) c:誘導体の高速液体クロマトグラフィーによる保持時
間。分析条件:バりアン社製VISTA5000高速液体クロマ
トグラムとウォーターズ社712Wオートサンプラーを連
結して用いた。カラム,YMC A−303ODS(4.6
×250mm);溶出液A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%
水;溶出溶媒B,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセ
トニトリル;溶出濃度勾配プログラム,0分(80%A+
20%B),30分(50%A+50%B);流速0.7ml/分;
検出波長280nm。
ノ酸分析結果ならびに逆相高速液体クロマトグラフィー
における保持時間を表1に示す。なお、表1中のa,
b,cは以下の通りである。 a:4%チオグリコール酸存在下、6規定塩酸で減圧封
管中、110℃、24時間加水分解後アミノ酸分析に付し
た。カッコ内は理論値。 b:化合物名(末尾に何も付いていないのはカルボン酸
タイプである): (1)(Leu18)hPTH(1−34) (2)(Aib1)hPTH(1−34) (3)(Phe11)hPTH(1−34) (4)(D−Trp12)hPTH(1−34) (5)(Leu8)hPTH(1−34)NH2 (6)(D−Tyr12)hPTH(1−34)NH2 (7)(D−Ser12)hPTH(1−34)NH2 (8)(D−Leu12)hPTH(1−34)NH2 (9)〔3−(2−ナフチル)−D−Ala12〕hPT
H(1−34)NH2 (10)(Ser11)hPTH(1−34)NH2 (11)(Phe11,Leu18)hPTH(1−34)NH2 (12)(Leu8,Phe11,Leu18)hPTH(1−3
4)NH2 (13)(Lys11)hPTH(1−34)NH2 (14)(Phe11)hPTH(1−34)NH2 (15)(Arg19’21)hPTH(1−34)NH2 (16)〔3−(2−ナフチル)−Ala11〕hPTH
(1−34)NH2 (17)(His26)hPTH(1−34)NH2 (18)(His25)hPTH(1−34) (19)(Gln27)hPTH(1−34) (20)〔Arg19’21,2−(1,3−ジチオラン−2
−イル)−Trp23〕hPTH(1−34)NH2 (21)(Leu27)hPTH(1−34) (22)(Lys11)hPTH(1−34) c:誘導体の高速液体クロマトグラフィーによる保持時
間。分析条件:バりアン社製VISTA5000高速液体クロマ
トグラムとウォーターズ社712Wオートサンプラーを連
結して用いた。カラム,YMC A−303ODS(4.6
×250mm);溶出液A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%
水;溶出溶媒B,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセ
トニトリル;溶出濃度勾配プログラム,0分(80%A+
20%B),30分(50%A+50%B);流速0.7ml/分;
検出波長280nm。
【0015】
【表1−1】
【0016】
【表1−2】
【0017】
【表1−3】
【0018】
【表1−4】
【0019】
【実施例2】〔Arg19’21,2−(1,3−ジチオラ
ン−2−イル)−Trp23〕hPTH(1−34)NH2
の合成と精製 〔Arg19’21〕hPTH(1−34)NH2を合成した
ペプチド樹脂(560mg)を、p−クレゾール(620μl)、
エタンジチオール(620μl)、2−メルカプトピリジン
(50mg)存在下、無水フッ化水素(5ml)で、0℃、2
時間処理した。フッ化水素を留去して除いた時、残留物
を0.1%2−メルカプトエタノールを含んだエーテル
で洗浄した。これを乾燥した後、トリフルオロ酢酸(5m
l)を加えペプチドを溶解させ、樹脂をろ去した。エー
テルを加え、生じた沈殿をろ取し、エーテルで洗浄し
た。粗精製物として280mgのペプチドが得られた。これ
を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
YMC−パック、A−324 ODS(10×250mm);溶出溶媒
A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%水;溶出溶媒B,
0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセトニトリル;溶出
濃度勾配プログラム、0分(70%A+30%B)、40分(55%
A+45%B);流速1.6ml/分。このクロマトグラフィ
ーで2本の大きなピーク(保持時間17.0分および1
8.2分)が見られた。前のピーク(保持時間17.0
分)を集め、イオン交換樹脂により酢酸塩とした後凍結
乾燥して〔Arg19’21〕hPTH(1−34)NH2が
4.9mg得られた。この化合物は酸加水分解後のアミノ酸
分析で正しいアミノ酸組成値を示し、紫外吸収曲線もト
リプトファン含有ペプチドに特徴的な曲線を示した。後
のピークからは6.9mgの化合物が得られたが、この化合
物は酸加水分解後のアミノ酸分析値は正しい値を示した
が、トリプシン消化に続くアミノペプチダーゼM消化物
のアミノ酸分析でトリプトファンは0.28残基しか検出さ
れず、グルタミン酸も理論値よりも0.65残基少なく検出
された。又、紫外線吸収曲線では289nmにピークを、255
nmに谷を示した。この結果、この化合物ではトリプトフ
ァン側鎖が修飾されていることが予想され、以下のよう
にして、それが1,3−ジチオラン基がトリプトファン側
鎖インドールの2位炭素に結合したものであることを明
らかにすることができた。
ン−2−イル)−Trp23〕hPTH(1−34)NH2
の合成と精製 〔Arg19’21〕hPTH(1−34)NH2を合成した
ペプチド樹脂(560mg)を、p−クレゾール(620μl)、
エタンジチオール(620μl)、2−メルカプトピリジン
(50mg)存在下、無水フッ化水素(5ml)で、0℃、2
時間処理した。フッ化水素を留去して除いた時、残留物
を0.1%2−メルカプトエタノールを含んだエーテル
で洗浄した。これを乾燥した後、トリフルオロ酢酸(5m
l)を加えペプチドを溶解させ、樹脂をろ去した。エー
テルを加え、生じた沈殿をろ取し、エーテルで洗浄し
た。粗精製物として280mgのペプチドが得られた。これ
を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
YMC−パック、A−324 ODS(10×250mm);溶出溶媒
A,0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%水;溶出溶媒B,
0.1%トリフルオロ酢酸−99.9%アセトニトリル;溶出
濃度勾配プログラム、0分(70%A+30%B)、40分(55%
A+45%B);流速1.6ml/分。このクロマトグラフィ
ーで2本の大きなピーク(保持時間17.0分および1
8.2分)が見られた。前のピーク(保持時間17.0
分)を集め、イオン交換樹脂により酢酸塩とした後凍結
乾燥して〔Arg19’21〕hPTH(1−34)NH2が
4.9mg得られた。この化合物は酸加水分解後のアミノ酸
分析で正しいアミノ酸組成値を示し、紫外吸収曲線もト
リプトファン含有ペプチドに特徴的な曲線を示した。後
のピークからは6.9mgの化合物が得られたが、この化合
物は酸加水分解後のアミノ酸分析値は正しい値を示した
が、トリプシン消化に続くアミノペプチダーゼM消化物
のアミノ酸分析でトリプトファンは0.28残基しか検出さ
れず、グルタミン酸も理論値よりも0.65残基少なく検出
された。又、紫外線吸収曲線では289nmにピークを、255
nmに谷を示した。この結果、この化合物ではトリプトフ
ァン側鎖が修飾されていることが予想され、以下のよう
にして、それが1,3−ジチオラン基がトリプトファン側
鎖インドールの2位炭素に結合したものであることを明
らかにすることができた。
【0020】前記の高速液体クロマトグラフィーによ
り、保持時間18.2分のピークより得られた化合物(4m
g)を60mM炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.0(2.6ml)に溶
かし、TPCK−トリプシン(160μg)を加え、37
℃、24時間反応した後、100℃に5分間加熱して失
活させた。反応液をpH7に調整した後、アミノペプチ
ダーゼ−M(0.5mg)を加え37℃で24時間反応させ
た。24時間後、更に同酵素(0.5mg)を追加し、さらに
48時間後に緩衝液(10ml)と同酵素(1mg)を加え、以
後70時間反応させた。反応物を逆相高速液体クロマトグ
ラフィーに付し、修飾を受けたトリプトファンを分離し
た。カラム,YMC D−ODS−5 S5 120A(20×250
mm);溶出溶媒は上記と同じ;溶出プログラム、0分(8
0%A+20%B)、40分(65%A+35%B);流速,5ml/
分;280nmで検出。単離された化合物は、289nmに紫外吸
収の極大値を示した。又、4%チオグリコール酸含有6
N塩酸による加水分解後のアミノ酸分析ではトリプトフ
ァンが検出された。この化合物を高分解能FAB−マス
スペクトル(日本電子社、AX−505W型二重収束質
量分析計を用いた)に付したところ、309.0734(M+H
+)のピークが観測され、これより分子式がC14H17N2
O2S2と予想された。さらに約30μgを1H−NMR
(日本電子社、JNM−GX400を用いた)に付し
た。〔DMSO−d6〕,α−CH δ=4.06(1
H,dd like),β−CH2 3.54(1H,d
d),3.30(1H,dd);1−NH 10.88
(1H);5−CH 7.50(1H,d);6−CH
7.30(1H,t like);7−CH 7.20
(1H,t like);8−CH 7.68(1H,
d);ジチオラン 2CH 6.14(1H,S);ジチ
オラン 4CH2と5CH23.64(2H,m)と3.
49(2H,m)。以上の結果より単離したhPTH
(1−34)NH2誘導体は23位に2−(1,3−ジチ
オラン−2−イル)−トリプトファンを含む化合物であ
ることが解った。分析結果は表1に記載した。
り、保持時間18.2分のピークより得られた化合物(4m
g)を60mM炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.0(2.6ml)に溶
かし、TPCK−トリプシン(160μg)を加え、37
℃、24時間反応した後、100℃に5分間加熱して失
活させた。反応液をpH7に調整した後、アミノペプチ
ダーゼ−M(0.5mg)を加え37℃で24時間反応させ
た。24時間後、更に同酵素(0.5mg)を追加し、さらに
48時間後に緩衝液(10ml)と同酵素(1mg)を加え、以
後70時間反応させた。反応物を逆相高速液体クロマトグ
ラフィーに付し、修飾を受けたトリプトファンを分離し
た。カラム,YMC D−ODS−5 S5 120A(20×250
mm);溶出溶媒は上記と同じ;溶出プログラム、0分(8
0%A+20%B)、40分(65%A+35%B);流速,5ml/
分;280nmで検出。単離された化合物は、289nmに紫外吸
収の極大値を示した。又、4%チオグリコール酸含有6
N塩酸による加水分解後のアミノ酸分析ではトリプトフ
ァンが検出された。この化合物を高分解能FAB−マス
スペクトル(日本電子社、AX−505W型二重収束質
量分析計を用いた)に付したところ、309.0734(M+H
+)のピークが観測され、これより分子式がC14H17N2
O2S2と予想された。さらに約30μgを1H−NMR
(日本電子社、JNM−GX400を用いた)に付し
た。〔DMSO−d6〕,α−CH δ=4.06(1
H,dd like),β−CH2 3.54(1H,d
d),3.30(1H,dd);1−NH 10.88
(1H);5−CH 7.50(1H,d);6−CH
7.30(1H,t like);7−CH 7.20
(1H,t like);8−CH 7.68(1H,
d);ジチオラン 2CH 6.14(1H,S);ジチ
オラン 4CH2と5CH23.64(2H,m)と3.
49(2H,m)。以上の結果より単離したhPTH
(1−34)NH2誘導体は23位に2−(1,3−ジチ
オラン−2−イル)−トリプトファンを含む化合物であ
ることが解った。分析結果は表1に記載した。
【0021】
【実施例3】 PTH部分ペプチド(1-34位)類縁体の生
物活性の測定 PTH部分ペプチド(1-34位)類縁体の生物活性をシゲ
ノら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第263巻、第18369〜18377頁、1980年Shigenoら
〔The Journal of Biological Chemistry,263:18369-1
8377(1988)〕により報告された方法を修正して評価し
た。96穴マルチ・プレート〔ヌンクロン(Nunclon)、ヌ
ンク〕上で培養したマウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞
株、MC3T3-EI細胞に、0.01,0.1,1,10あるいは100nM
の類縁体を含む、100μlの培養液〔20mMのN-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPE
S)、0.1%牛血清アルブミン(BSA)および0.5mMのイソ
ブチルメチルキサンチンを含む。Hank's液〕を加え、30
分間室温で反応させた。0.2規定度の塩酸100μlを加え
た後、沸騰水中に2分半浸し、PTH受容体によって産
生されたサイクリック・アデノシン・1リン酸(cAMP)
を細胞から抽出した。培養液中および細胞内の総cAM
P測定は、市販のラジオイムノアッセイキット〔サイク
リックAMP[125I]キット「デュポン−第一」、第一化学
薬品〕を用いて行った。標準として添加したヒトPTH
部分ペプチド(1-34位)の濃度に依存したcAMPの産生量
の増加が常に認められた。PTH部分ペプチド(1-34
位)類縁体の生物活性については表2に示した。
物活性の測定 PTH部分ペプチド(1-34位)類縁体の生物活性をシゲ
ノら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第263巻、第18369〜18377頁、1980年Shigenoら
〔The Journal of Biological Chemistry,263:18369-1
8377(1988)〕により報告された方法を修正して評価し
た。96穴マルチ・プレート〔ヌンクロン(Nunclon)、ヌ
ンク〕上で培養したマウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞
株、MC3T3-EI細胞に、0.01,0.1,1,10あるいは100nM
の類縁体を含む、100μlの培養液〔20mMのN-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPE
S)、0.1%牛血清アルブミン(BSA)および0.5mMのイソ
ブチルメチルキサンチンを含む。Hank's液〕を加え、30
分間室温で反応させた。0.2規定度の塩酸100μlを加え
た後、沸騰水中に2分半浸し、PTH受容体によって産
生されたサイクリック・アデノシン・1リン酸(cAMP)
を細胞から抽出した。培養液中および細胞内の総cAM
P測定は、市販のラジオイムノアッセイキット〔サイク
リックAMP[125I]キット「デュポン−第一」、第一化学
薬品〕を用いて行った。標準として添加したヒトPTH
部分ペプチド(1-34位)の濃度に依存したcAMPの産生量
の増加が常に認められた。PTH部分ペプチド(1-34
位)類縁体の生物活性については表2に示した。
【0022】 表2 PTH(1-34)部分ペプチドの生物活性〔hPTH(1-34)との相対活性で表わした もの〕 hPTH(1−34) 1.00 〔Leu18〕hPTH(1−34) 0.4 〔Aib1〕hPTH(1−34) 1.7 〔Phe11〕hPTH(1−34) 1.1 〔Leu8〕hPTH(1−34)NH2 0.5 〔D−Ser12〕hPTH(1−34)NH2 0.8 〔D−Leu12〕hPTH(1−34)NH2 0.5 〔3−(2−ナフチル)−D−Ala12〕hPTH(1−34)NH2 0.9 〔Ser11〕hPTH(1−34)NH2 0.8 〔Leu8,Phe11,Leu18〕hPTH(1−34)NH2 0.9 〔Lys11〕hPTH(1−34)NH2 1.1 〔Phe11〕hPTH(1−34)NH2 1.3 〔Arg19’21〕hPTH(1−34)NH2 0.9 〔3−(2−ナフチル)−Ala11〕hPTH(1−34)NH2 1.7 〔His26〕hPTH(1−34)NH2 0.9 〔His25〕hPTH(1−34) 1.0 〔Gln27〕hPTH(1−34) 2.5 〔Arg19’21,2−(1,3−ジチオラン−2−イル)−Trp23〕hPTH (1−34)NH2 1.7 〔Leu27〕hPTH(1−34) 1.2
【0023】
【配列表】配列番号:1 配列の長さ: 34 配列の種類: ペプチド トポロジー: 直鎖状 配列の型: アミノ酸 配列の特徴: 部分ペプチド 配列: Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe。
【0024】配列番号:2 配列の長さ: 34 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列の特徴: 存在位置:1 他の情報:Xaa= Ser またはAib、 存在位置:8 他の情報:Xaa= Met または脂溶性天然アミノ酸 存在位置:11 他の情報:Xaa= Leu,Ser,Lysまたは芳香族アミノ酸 存在位置:12 他の情報:Xaa= GlyまたはD-アミノ酸 存在位置:13 他の情報:Xaa= LysまたはLeu 存在位置:18 他の情報:Xaa= Met または脂溶性天然アミノ酸 存在位置:19 他の情報:Xaa= Glu または塩基性アミノ酸 存在位置:21 他の情報:Xaa= Glu または塩基性アミノ酸 存在位置:23 他の情報:Xaa= Trp または2-(1,3-ジチオラン-2-イル)
Trp 存在位置:25 他の情報:Xaa= Arg またはHis 存在位置:26 他の情報:Xaa= Lys またはHis 存在位置:27 他の情報:Xaa= Lys ,GlnまたはLeu 存在位置:34 他の情報:Xaa= PheまたはPhe-NH2 配列: Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Xaa Xaa Xaa His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Arg Xaa Glu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val 20 25 30 His Asn Xaa 34
Trp 存在位置:25 他の情報:Xaa= Arg またはHis 存在位置:26 他の情報:Xaa= Lys またはHis 存在位置:27 他の情報:Xaa= Lys ,GlnまたはLeu 存在位置:34 他の情報:Xaa= PheまたはPhe-NH2 配列: Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Xaa Xaa Xaa His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Arg Xaa Glu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val 20 25 30 His Asn Xaa 34
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 37/24 AEG 8314−4C C07K 99:00
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項1】 R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg -R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13〔I〕 〔式中R1はSerまたはAibを、 R2はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、 R3はLeu,Ser,Lysまたは芳香族アミノ酸を、 R4はGly,またはD-アミノ酸を、 R5はLysまたはLeuを、 R6はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、 R7はGlu,または塩基性アミノ酸を、 R8はVal,または塩基性アミノ酸を、 R9はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イル)Trpを、 R10はArgまたはHisを、 R11はLysまたはHisを、 R12はLys,GlnまたはLeuを、 R13はPheまたはPhe-NH2を示す。〔ただし、同時に、R1
がSer、R2がMet、R3がLeu、R4がGly、D-AlaまたはD-Pr
o、R5がLys、R6がMet、R7がGlu、R8がVal、R9がTrp、R
10がArg、R11がLys、R12がLysである場合を除く〕で表
されるペプチドまたはその塩。
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