JP2005523873A

JP2005523873A - コンホメーションが拘束された副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）類似体

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Publication number: JP2005523873A
Application number: JP2003515197A
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Inventors: トーマス、ジェイ．ガルデラ
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Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2005-08-11
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Abstract

本発明は、コンホメーションが拘束された副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）類似体、ならびにそのＰＴＨ類似体の製造方法および使用方法に関する。本発明によれば、ポリペプチドの選択された位置にアミノ酸置換を含む新規なＰＴＨポリペプチド誘導体が提供される。本発明によれば、ＰＴＨ（１−３４）、ＰＴＨ（１−２１）、ＰＴＨ（１−２０）、ＰＴＨ（１−１９）、ＰＴＨ（１−１８）、ＰＴＨ（１−１７）、ＰＴＨ（１−１６）、ＰＴＨ（１−１５）、ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−１３）、ＰＴＨ（１−１２）、ＰＴＨ（１−１１）およびＰＴＨ（１−１０）ポリペプチドの誘導体が提供され、各ポリペプチドの少なくとも１つの残基が、ヘッリクス、好ましくはαヘリックスを安定化する残基である。また、本発明によれば、このようなペプチドを製造する方法も提供される。さらに、本発明は、望ましくない骨欠損のリスクのある脊椎動物における骨欠損の制限、望ましくない骨欠損を特徴とし、または骨増殖が必要であることを特徴とする病態の治療、例えば骨折または軟骨障害の治療、および必要と考えられる場合における細胞のｃＡＭＰレベルの上昇に用いられる組成物および方法を包含する。

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、コンホメーションが拘束された副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）類似体、ならびに該ＰＴＨ類似体を製造および使用する方法に関する。

背景技術
副甲状腺ホルモン
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は８４個のアミノ酸のペプチドであり、人体におけるイオン化された血中カルシウムの主要なレギュレーターである(Kronenberg, H. M., et al., In Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G.R. , and Martin, T.J., (eds), pp. 185-201, Springer-Verlag, Heidelberg (1993))。胃腸系、骨格系、神経系、神経筋系および心血管の正常な機能にはカルシウム濃度の調節が不可欠である。ＰＴＨの合成および放出は主として血清カルシウムレベルによって制御され、低レベルであればホルモンの合成と放出の双方が刺激され、高レベルであれば抑制される。そして、ＰＴＨは、消化管、骨および腎臓という３つのカルシウム交換部位においてカルシウムの血中流入を直接的または間接的に促進することによって、血清のカルシウムレベルを維持する。ＰＴＨは、腎臓での活性型ビタミンＤの合成を有利にすることにより、カルシウムの正味の胃腸管吸収に寄与する。ＰＴＨは、骨を再吸収する細胞である破骨細胞の分化を刺激することにより、骨からのカルシウムの再吸収を間接的に促進する。また、これは、尿細管のカルシウム再吸収の刺激、リン酸塩クリアランスの増進および活性型ビタミンＤの合成を完了させる酵素の増強促進という、腎臓に対する少なくとも３つの主な作用をも媒介する。ＰＴＨは、主として、受容体を媒介とするアデニル酸シクラーゼおよび／またはホスホリパーゼＣの活性化により、これらの作用を発揮するものと考えられている。

カルシウムホメオスタシスの混乱は多くの臨床疾患（例えば、重篤な骨の疾病、貧血症、腎臓障害、潰瘍、筋疾患および神経障害）をもたらし、通常、これらは副甲状腺ホルモンのレベルの変化をもたらす病態に起因するものである。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの上昇を特徴とする病態である。これは主に、副甲状腺の障害（例えば、腺腫、過形成または癌腫）の結果として過剰なＰＴＨ産生が起こる上皮小体機能亢進症を伴うことが多い。別のタイプの高カルシウム血症である悪性腫瘍の体液性高カルシウム血症(ＨＨＭ）は、最もよくある不規則過形成症候群である。ほとんどの例において、それは、腫瘍（例えば、扁平上皮癌、腎臓癌、卵巣癌、または膀胱癌）によるＰＴＨと相同なアミノ酸を有するタンパク質ホルモンクラスの産生に起因していると思われる。これらＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）は、ＰＴＨの有する所定の腎臓作用および骨格作用を模倣すると思われ、これらの組織におけるＰＴＨ受容体と相互作用すると考えられている。

骨粗鬆症
骨粗鬆症は、高齢者人口のかなりの部分、妊婦、さらに若年層にさえ見られる、肢体が不自由になる可能性のある骨格系疾患である。骨粗鬆症とは異種の疾患群をさす。臨床的には、骨粗鬆症はＩ型とII型に分かれる。Ｉ型骨粗鬆症は主として中年の女性において起こり、更年期のエストロゲン低下と関連しており、II型骨粗鬆症は加齢と関連している。骨粗鬆症患者にとっては、骨折修復を促進するためにデザインされた新規な治療法、または疾病に関連する骨折を予防もしくは軽減するためにデザインされた治療法が有用であると考えられる。

この疾病は、骨量の低下、骨のミネラル濃度（ＢＭＤ）の低下、骨強度の低下、および骨折リスクの上昇を特徴とする。これまでに、エステロゲン、カルシトニンおよびビスホスホネートによる骨粗鬆症の効果的な治癒は見出されておらず、この疾病の治療にはエチドロネートおよびアレンドロネートが用いられているが、成功の程度は様々である。これらの薬剤は骨再吸収を低下させる働きをする。副甲状腺ホルモンは血中カルシウムおよびリン酸塩レベルを調節し、間欠的に投与した場合、動物（Shen, V., et al., Calcif Tissue Int. 50:214-220 (1992); Whitefild, J. F., et al., Calcif Tissue Int. 56:227-231 (1995)およびWhitfield, J.F., et al., Calcif Tissue Int. 60:26-29 (1997)）およびヒト（Slovik, D.M., et al., J. Bone Miner. Res. 1:377-381 (1986); Dempster, D.W., et al., Endocr. Rev. 14:690-709 (1993)およびDempster, D.W., et al., Endocr. Rev. 15:261 (1994)）において骨格系に対する強い同化（骨形成）作用を有するので、ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体は、骨粗鬆症の新しい効果的な治療法のための有力な候補となる。

ＰＴＨ誘導体
ＰＴＨ誘導体としては、完全長分子に対してアミノ酸置換を有するか、または末端切断型であるポリペプチドが挙げられる。ＰＴＨの１４アミノ酸および３４アミノ酸の両アミノ末端切断型、ならびにＣ末端切断型が研究されている。さらに、これらの末端切断型ポリペプチド内のアミノ酸置換も検討されている。

合成ＰＴＨ（１−３４）はほとんどの細胞に基づくアッセイ系で完全な生物活性を示し、動物の骨量に強い同化作用を有し、最近では閉経後骨粗鬆症の女性において骨折のリスクを軽減することが示されている（Neer, R.M., et al., N.E.J.M. 344:1434-1441 (2001); Dempster, D.W., et al., Endocr Rev 14:690-709 (1993)）。ＰＴＨは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体（Ｐ１Ｒ）、アデニリルシクラーゼ／ＣＡＭＰと共役するクラスIIＧタンパク質共役７重らせん受容体およびホスホリパーゼ(phospolipase)Ｃ／リン酸イノシトール（ＩＰ）シグナル伝達経路に作用する（Rippner, H., et al., Science 254:1024-1026(1991)）。欠失分析により、ＰＴＨのアミノ末端残基が、Ｐ１Ｒを刺激してｃＡＭＰおよびＩＰシグナル伝達経路に作用する上で重要な役割を果たしていることがわかっている（Tregear, G.W., et al., Endocrinology 93:1349-1353 (1973); Takasu, H., et al., Biochemistry 38:13453-13460 (1999)）。架橋および受容体突然変異誘発研究では、ＰＴＨのアミノ末端部分が、その受容体の膜近傍領域に存在する７回膜貫通ヘリックスの細胞外ループおよび細胞外末端と相互作用することが示されている（Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 271:26469-26472 (1996); Hoare, S.R.J., et al., J. Biol. Chem 276:7741-7753 (2001); Behar, V., et al., J. Biol. Chem. 275:9-17 (1999); Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275:19456-19460 (2000); Luck, M.D., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999)）。

発明の概要

本発明によれば、そのポリペプチド内の選択された位置にアミノ酸置換を含む新規なＰＴＨポリペプチド誘導体が提供される。これらの誘導体は、ＰＴＨ−１受容体の完全またはほぼ完全なアゴニストとして機能する。それらの独特な特性のため、これらのポリペプチドは、骨粗鬆症などのヒトの骨格系疾患を治療するための薬物としての有用性を有する。

本発明によれば、ＰＴＨ（１−２１）、ＰＴＨ（１−２０）、ＰＴＨ（１−１９）、ＰＴＨ（１−１８）、ＰＴＨ（１−１７）、ＰＴＨ（１−１６）、ＰＴＨ（１−１５）、ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−１３）、ＰＴＨ（１−１２）、ＰＴＨ（１−１１）およびＰＴＨ（１−１０）ポリペプチドの誘導体が提供され、ここで各ポリペプチド中の少なくとも１つの残基は、ヘリックス、好ましくはαヘリックスを安定化する残基である。また、本発明によれば、このようなペプチドを製造する方法も提供される。さらに、本発明は、望ましくない骨欠損のリスクのある脊椎動物におけるこのような骨欠損の制限、望ましくない骨欠損を特徴とし、または骨増殖が必要であることを特徴とする病態の治療、例えば骨折または軟骨障害の治療、および必要と考えられる場合における細胞のｃＡＭＰレベルの上昇に用いられる組成物および方法を包含する。

本発明の一つの態様によれば、生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７(配列番号１）（ここで、Ｘ_０１はαヘリックス安定化残基、デスアミノＧｌｙ、デスアミノＳｅｒまたはデスアミノＡｌａであり；Ｘ_０２はαヘリックス安定化残基、Ａｌａ、またはＳｅｒであり；Ｘ_０３はＡｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；Ｘ_０４はＡｒｇ、ＨａｒまたはＬｅｕであり；Ｘ_０５はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＧｌｙであり；Ｘ_０６はαヘリックス安定化残基またはＬｙｓであり；Ｘ_０７はαヘリックス安定化残基、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；かつ、Ｘ_０１、Ｘ_０２、Ｘ_０３、Ｘ_０４、Ｘ_０５、Ｘ_０６またはＸ_０７の少なくとも１つはαヘリックス安定化残基である）からなるペプチドが提供される。

本発明の他の態様によれば、αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂ、ＡＣＰＣ（１−アミノシクロプロピルカルボン酸）、ＤＥＧ（ジエチルグリシン）および１−アミノシクロペンタンカルボン酸からなる群から選択されるものである、配列番号１が提供される。本発明の他の態様によれば、αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂである、配列番号１が提供される。

さらに、本発明によれば、配列番号１のペプチドの断片、特に、Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６（配列番号１２）、Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５（配列番号１３）、Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３Ｘ_０４（配列番号１４）およびＸ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３（配列番号１５）が提供される。本発明はさらに、上記のペプチドの医薬上許容される塩、および前記ペプチドのＮ誘導体またはＣ誘導体を包含する。本発明の好ましい実施態様によれば、Ｃ末端アミドを含む上述のいずれかのポリペプチドが提供される。

さらに、本発明によれば、生物学的に活性なポリペプチドであって、本質的に、ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号８）；アミノ酸１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６または１−１５を含むその断片；その医薬上許容される塩；またはそのＮ誘導体またはＣ誘導体、からなるポリペプチドが提供される。

さらに、本発明によれば、放射性ラベル、蛍光ラベル、生物発光ラベルまたは化学発光ラベルからなる群から選択されるラベルで標識されたいずれかの上記ポリペプチドが提供される。好ましい実施態様では、前記放射性ラベルは^１２５Ｉまたは^９９ｍＴｃとされる。

生物学的に活性な上記ペプチドの好ましい実施態様としては、ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号２）；デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号３）；デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号４）；デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号５）；ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号６）；ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号７）；ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号９）；ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１０）；ＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１１）；およびＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒ（配列番号１６）が挙げられる。アミノ酸１−１０、１−１１、１−１２または１−１３を含む上記ペプチドの断片もまた、本発明の実施態様であると考えられる。本発明はさらに、上記ペプチドの医薬上許容される塩および前記ペプチドのＮ誘導体またはＣ誘導体を包含する。

Ａｉｂと置換される他の拘束アミノ酸としては、ＡＣＰＣ（１−アミノシクロプロピルカルボン酸）、ＤＥＧ（ジエチルグリシン）および１−アミノシクロペンタンカルボン酸がある。

本発明のさらに別の態様によれば、ＰＴＨ誘導体と、医薬上許容される賦形剤、および／または生理食塩水などの医薬上許容される溶液もしくは生理学的に緩衝化された溶液とを含んでなる医薬組成物が提供される。

また、本発明によれば、骨量の低下を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に有効な骨量増進量の生物学的に活性なＰＴＨポリペプチドを投与することを含んでなる方法が提供される。本発明の好ましい実施態様によれば、骨粗鬆症などの病態が対象となる。骨粗鬆症のタイプとしては、限定されるものではないが、老年性骨粗鬆症および閉経後骨粗鬆症が挙げられる。さらなる好ましい実施態様によれば、前記ポリペプチドの有効量約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日が用いられ、前記ポリペプチドは非経口、皮下または鼻腔通気により投与される。

本発明のさらに別の態様によれば、骨再形成、骨再吸収および／または骨再構築の速度を調べる方法であって、患者に有効量の標識したＰＴＨポリペプチド、例えば配列番号１またはその誘導体などを投与し、患者の骨への前記ペプチドの取り込みを調べることを含んでなる方法が提供される。このペプチドは、放射性ラベル、蛍光ラベル、生物発光ラベルまたは化学発光ラベルからなる群から選択されるラベルで標識されている。好適な放射性ラベルの例としては、^９９ｍＴｃがある。

さらに、本発明によれば、ＰＴＨ−１受容体を有する哺乳動物細胞においてｃＡＭＰを増加させる方法であって、前記細胞にｃＡＭＰを増加させるのに十分な量の本発明によるポリペプチドを接触させることを含んでなる方法が提供される。

また、本発明によれば、ＡｌａＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔＧｌｎＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＰｈｅ（配列番号３０）で示されるラットＰＴＨ（１−３４）（ｒＰＴＨ（１−３４））の誘導体、およびＳｅｒＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＰｈｅ（配列番号３１）で示されるヒトＰＴＨ（１−３４）（ｈＰＴＨ（１−３４））の誘導体が提供される。

本発明の他の態様によれば、生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、式Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＸ_０３ＨｉｓＸ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８ＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号１９）（ここで、Ｘ_０１はαヘリックス安定化残基、デスアミノＧｌｙ、デスアミノＳｅｒまたはデスアミノＡｌａであり；Ｘ_０２はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｘ_０３はＭｅｔまたはＮｌｅであり；Ｘ_０４はＡｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；Ｘ_０５はＡｒｇ、ＨａｒまたはＬｅｕであり；Ｘ_０６はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＧｌｙであり；Ｘ_０７はαヘリックス安定化残基またはＬｙｓであり；Ｘ_０８はαヘリックス安定化残基、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；Ｘ_０９はＡｌａまたはＡｓｎであり；Ｘ_１０はＭｅｔまたはＶａｌであり；Ｘ_１１はＡｒｇまたはＧｌｕであり；Ｘ_１２はＭｅｔまたはＶａｌであり；Ｘ_１３はＧｌｎまたはＧｌｕであり；Ｘ_１４はＴｙｒまたはＰｈｅであり；かつ、Ｘ_０１、Ｘ_０２、Ｘ_０６、Ｘ_０７またはＸ_０８の少なくとも１つはαヘリックス安定化残基である）からなるペプチドが提供される。また、本発明によれば、アミノ酸１−３３、１−３２、１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、１−１４、１−１３、１−１２または１−１１を含むその断片が提供される。また、本発明によれば、配列番号１９または上記断片の医薬上許容される塩およびＮ誘導体またはＣ誘導体が提供される。

本発明の他の態様によれば、αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂ、ＡＣＰＣ（１−アミノシクロプロピルカルボン酸）、ＤＥＧ（ジエチルグリシン）および１−アミノシクロペンタンカルボン酸からなる群から選択されるものである、配列番号１９が提供される。本発明の他の態様によれば、αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂである配列番号１９が提供される。

本発明の他の態様によれば、具体的には、下記ペプチド：ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２０）；デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２１）；デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２２）；デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２３）；ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２４）；ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２５）；ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２６）；ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２７）；およびＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２８）が提供される。Ｘ_０９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３およびＸ_１４は配列番号１９に関して定義されたものと同じ意味を有する。また、本発明によれば、上記ペプチドの医薬上許容される塩、またはＮ誘導体もしくはＣ誘導体が提供される。

また、本発明によれば、生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、式ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＸ１２Ｘ１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ１４（配列番号２９）（ここで、Ｘ_１２はＭｅｔまたはＶａｌであり；Ｘ_１３はＧｌｎまたはＧｌｕであり；かつ、Ｘ_１４はＴｙｒまたはＰｈｅである）から選択される式からなるペプチドが提供される。また、本発明によれば、配列番号２９の医薬上許容される塩、またはＮ誘導体もしくはＣ誘導体が提供される。また、本発明によれば、アミノ酸１−３３、１−３２、１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、１−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、１−１４、１−１３、１−１２、または１−１１を含むその断片が提供される。

本発明の他の態様によれば、配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかが標識されている。本発明の他の態様によれば、配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかは、蛍光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、放射性ラベル、^１２５Ｉまたは^９９ｍＴｃで標識されている。

本発明の他の態様によれば、生物学的に活性なペプチドである配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかと、医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。

本発明の他の態様によれば、骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に有効な骨量増進量の、配列番号１９、配列番号２９の生物学的に活性なペプチドまたは上記ペプチドのいずれかを投与することを含んでなる方法が提供される。

本発明の他の態様によれば、骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に有効な骨量増進量の、配列番号１９、配列番号２９の生物学的に活性なペプチドまたは上記ペプチドのいずれかと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法が提供される。

本発明の他の態様によれば、治療する病態は、骨粗鬆症、老年性骨粗鬆症または閉経後骨粗鬆症である。本発明の他の態様によれば、配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかの骨量増進に有効な量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日である。本発明の他の態様によれば、投与方法は非経口、皮下または鼻腔通気とされる。

本発明の他の態様によれば、骨再形成、骨再吸収および／または骨再構築の速度を調べる方法であって、患者に有効量の配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかを投与し、患者の骨への前記ペプチドの取り込みを調べることを含んでなる方法が提供される。

本発明の他の態様によれば、ペプチドが固相合成によって合成される、配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかを製造する方法が提供される。

本発明の他の態様によれば、ペプチドがＦＭＯＣによって保護される、配列番号１９、配列番号２９または上記ペプチドのいずれかを製造する方法が提供される。

発明の具体的説明

定義
アミノ酸配列：本願のアミノ酸配列には、アミノ酸の一文字または三文字のいずれかの表記を用いる。これらの表記法は当業者に周知ものであり、例えばCooper, G.M., The Cell 1997, ASM Press, Washington, D.C.またはAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994などの容易に利用できる多くの参考文献において見出すことができる。例えば、Ｓｅｒ−３→Ａｌａまたは［Ａｌａ^３］ペプチドなどのように配列における置換が言及されている場合、そのポリペプチドのＮ末端から３番目のセリンが別のアミノ酸、この場合にはアラニンで置換されていることを意味する。

本願では、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は［Ａｌａ^３，１２，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１，Ｔｒｐ^１４］ＰＴＨ（１−１４）アミドとして定義される。［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）は［Ａｌａ^３，１２，Ｎｌｅ^８，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１，Ｔｒｐ^１４，Ａｒｇ^１９，Ｔｙｒ^２１］ＰＴＨ（１−２１）アミドとして定義される。［Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）は［Ａｌａ^３，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１］ＰＴＨ（１−１１）アミドとして定義される。

本願では、「Ａｉｂ」はα−アミノイソ酪酸を意味し、「Ｈａｒ」はホモアルギニンを意味し、「Ｎｌｅ」はノルロイシンを意味し、その他のアミノ酸は通常の一文字または三文字表記である。

タンパク質の生物学的活性：この表現はポリペプチドのいずれの生物学的活性をもさす。これらの活性の例としては、限定されるものではないが、配列番号１または配列番号８の化合物またはその誘導体の代謝機能または生理機能が挙げられ、同等の活性または改良された活性、あるいは望ましくない副作用を低下させた活性を含む。また、上記化合物の抗原活性および免疫活性も含まれる。

誘導体または機能性誘導体：「誘導体」または「機能性誘導体」とは、前記ＰＴＨ分子の「変異体」、「誘導体」または「化学誘導体」を含むものとする。例えば、配列番号１の化合物またはその誘導体などの「変異体」分子は、完全分子またはその断片と実質的に同等な分子をさすことを意味する。例えば、配列番号１の化合物またはその誘導体などの分子の「類似体」は、配列番号１の分子またはその断片と実質的に同等な非天然型分子をさすことを意味する。

ＰＴＨ誘導体は、同じ大きさの天然型ＰＴＨポリペプチドに対するポリペプチドの変化を含む。天然型ＰＴＨ（１−１４）ポリペプチドの配列は、配列番号１７（ヒトＰＴＨ（１−２１））または配列番号１８（ラットＰＴＨ（１−２１））の最初の１４個のアミノ酸である。両分子のアミノ酸配列が実質的に同じである場合、また、両分子が同じ生物学的活性を有する場合に、ある分子はもう一方の分子と「実質的に同等」といわれる。このように同等の活性を有する２つの分子は、たとえこれらの分子の一方が他方には見られない付加的なアミノ酸残基を含んでいても、あるいはアミノ酸配列が同一でなくとも、本明細書で用いる場合、変異体、誘導体または類似体であると考えられる。しかし、ＰＴＨ誘導体は天然分子と実質的に同等な生物学的活性を必ずしも有する必要はない。ＰＴＨ誘導体は、天然ＰＴＨとは実質的に異なる活性を有する場合もある。例えば、誘導体は、ＰＴＨ受容体のアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかでありうる。

本明細書において、ある分子が通常その分子の一部ではない付加的な化学部分を含んでいる場合、その分子は別の分子の「化学誘導体」であるといわれる。このような部分は、その分子の溶解度、吸収、生体半減期などを改良しうるものである。あるいは、このような部分は、分子の毒性を軽減したり、分子の望ましくない副作用を除去または緩和したりするものでありうる。このような作用を媒介しうる部分の例としては、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)に開示されており、当業者には明らかであろう。

断片：例えば配列番号１またはその誘導体などの分子の「断片」は、これらの分子のいずれかのポリペプチドサブセットをさすことを意味する。

融合タンパク質：「融合タンパク質」とは、例えば配列番号１またはその誘導体などの化合物を、そのＮ末端に連結された「選択的切断部位」（これは次に付加的なアミノ酸リーダーポリペプチド配列と連結される）とともに、またはそれを伴わずに含んでなる融合タンパク質をいう。

ポリペプチド：ポリペプチドおよびペプチドは互換的に用いられる。ポリペプチドとは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって相互に連結している２以上のアミノ酸を含んでなる全てのポリペプチドまたはタンパク質、すなわちペプチド同配体（peptide isosteres）をいう。「ポリペプチド」とは、一般に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、通常タンパク質と呼ばれる長鎖の双方をさす。ポリペプチドは、遺伝子にコードされている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよく、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによるか、または当技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。このような修飾については、基礎的なテキストおよびより詳細な単行本、ならびに研究論文に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどの場所でも行うことができる。同じタイプの修飾をあるポリペプチドの数カ所で同じ程度または異なる程度で行ってもよいと考えられる。また、あるポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。

ポリペプチドは分枝していてもよく、分枝を伴った、または分枝を伴わない環状であってもよい。環状分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後修飾から得られることもあるし、合成法により作出することもできる。修飾としてはアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホフホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化やユビキチン化などトランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加が挙げられる。例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed. , T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs.1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Methods in Enzymol. 182:626-646 (1990)およびRattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci 663: 48-62 (1992)を参照されたい。

ＰＴＨ類似体−構造および機能的特性
α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を短いＮ末端ＰＴＨペプチド類似体へ導入した。種々の極性または非極性溶媒でＰＴＨ（１−３４）類似体のＮＭＲ研究を何度も行ったところ、ほぼＳｅｒ−１７からＶａｌ−３１まで伸びる安定なＣ末端ヘリックス、およびＳｅｒ−３からＬｙｓ−１３まで様々な伸びを示す、より短く、安定度の低いアミノ末端ヘリックスの２つのドメインの二次構造が示され、この２つのドメインは屈曲または折り返し領域によって連結されていた(Marx, U.C., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 267:213-220 (2000); Chen, Z., et al., Biochemistry 39:12766-12777 (2000); Marx, U.C., et al., J. Biol. Chem. 270:15194-15202 (1995); Marx, U.C., et al., J. Biol. Chem. 273:4308-4316 (1998); Pellegrini, M., et al., Biochemistry 37:12737-12743 (1998); Gronwald, W., etal., Biol. Chem. Hoppe Seyler 377:175-186 (1996); Barden, J.A., and Kemp, B.E., Biochemistry 32:7126-7132 (1993))。最近のＰＴＨ（１−３４）の結晶学的研究では、Ｓｅｒ−３からＨｉｓ−３２まで伸び、中間部にわずか１５°の屈曲しか含まない連続したαヘリックスが示されている。しかし、ＮＭＲデータからは、このＮ末端αヘリックスが比較的弱いことが示されている。Ａｉｂ残基の導入など、ヘリックスを安定化する修飾により、ペプチド特性という点で著しい利点が得られ、ＰＴＨ（１−３４）に匹敵する活性を有する短いペプチド（≦１４アミノ酸）が得られる。

本明細書では、簡単な非注入的方法により送達できるよう、十分に小さい新規な「最小化した」ＰＴＨ変異体が開示される。本発明による変異体は、ポリペプチドの最初の１４個のアミノ酸内に置換を含む。新規なポリペプチドは、成熟ＰＴＨポリペプチドの１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、１−１４、１−１３、１−１２、１−１１および１−１０アミノ酸配列に相当する。より短い変異体（≦ＰＴＨ１−１４）は２，０００ダルトン未満の分子量を有する。

天然型ヒトＰＴＨ（１−２１）ペプチドの一次アミノ酸配列（Ｎ末端→Ｃ末端）はＳｅｒＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌ（配列番号１７）であり、天然型ラットＰＴＨ（１−２１）はＡｌａＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔ（配列番号１８）である。

タンパク質産物として本明細書に記載の化合物は、液相または固相ペプチド合成の技術による生産に従う。特に、固相ペプチド合成技術はヒトＰＴＨの生産に好適に応用され、これらの化合物の生産のために使用できる（指針としては、Kimura et al., 上記,参照およびFairwell et al., Biochem. 22:2691 (1983)参照)。比較的大きなスケールでヒトＰＴＨを好適に生産できたことが、Goud et al.によりJ. Bone Min. Res. 6(8):781 (1991)で報告されている。合成ペプチド合成アプローチは通常、自動合成装置と配列番号１の目的化合物またはその誘導体のＣ末端アミノ酸を結合させる固相として適当な樹脂の使用を必要とする。その後、合成が完了するまで、典型的にはＦＭＯＣまたはＢＯＣいずれかに基づく化学プロトコールを用い、次の目的アミノ酸の適宜保護された形態を連続的に結合させることにより、Ｎ末端方向にペプチドの伸張を行う。次に、通常は樹脂からペプチドを切断すると同時にペプチドから保護基を切断した後、ペプチドを単離し、溶媒としてアセトニトリル、そしてイオン対合剤としてトリフルオロ酢酸を用い、逆相ＨＰＬＣなどの通常の技術を用いて精製する。このような手法は一般に多くの刊行物に記載されており、例えば、Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis, "2nd Edition, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984)を参照すればよい。このペプチド合成アプローチは、例えば、配列番号１、およびＡｉｂなどの遺伝的にコードされていないアミノ酸を組み込んだその誘導体などの生産に必要となると考えられる。

本発明の他の態様によれば、当技術分野で公知の標準的な方法により、本発明による化合物のＮ末端アミノ酸の遊離アミンに置換基を結合させる。例えば、アルキル基、例えばＣ_１−１２アルキルを還元的アルキル化を用いて結合させる。また、ヒドロキシアルキル基、例えばＣ_１−１２ヒドロキシアルキルも還元的アルキル化を用いて結合させ、ここで水酸基はｔ−ブチルエステルで保護する。アシル基、例えばＣＯＥ_１は、遊離の酸、例えばＥ_１ＣＯＯＨをＮ末端アミノ酸の遊離のアミノと共役させることによって結合させる。さらに、ポリペプチドのＣ末端のありうる化学修飾も、本発明の範囲内に包含される。これらの修飾は受容体に対する結合親和性を改変しうる。

また、例えば、配列番号１、および二次または三次構造が変更されている、かつ／または安定性が変更されているがなお生物学的活性を保持するその誘導体などの化合物も、本発明の範囲内にあると考えられる。このような誘導体は、ラクタム環化、ジスルフィド結合または当業者に公知のその他の方法で達成されうる。

本発明による化合物の有用性および投与
本発明による化合物またはその誘導体は、多数の用途を有する。これらには、とりわけ、ＰＴＨ受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、骨量の減少によって顕現する種々の哺乳動物の病態の予防および治療、診断プローブ、診断プローブとして用いるための抗体を調製するための抗原、および分子量マーカーとしての使用がある。ＰＴＨポリペプチドの１以上のアミノ酸を特異的に置換することができれば、特定の分子量のポリペプチドを構築することができる。

特に、本発明による化合物は、ヒトにおける骨粗鬆症およびオステオペニアの予防的または治療的処置において必要とされる。また、本発明による化合物は、他の骨疾患の予防的または治療的処置においても必要とされる。本発明による化合物はまた、上皮小体機能低下症の予防的または治療的処置においても必要とされる。最後に、本発明による化合物は、骨折修復のアゴニストとして、また、高カルシウム血症のアンタゴニストとして用いるためにも指示される。

一般に、本発明による化合物またはその塩は、約０．０１〜１μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０７〜約０．２μｇ／ｋｇ体重／日の間の量で投与される。５０ｋｇの女性被験者では、生物学的に活性な化合物の一日量は、約０．５〜約５０μｇ、好ましくは約３．５〜約１０μｇである。ウマ、イヌおよびウシなどの他の哺乳動物では、それより高い用量が必要となる場合がある。この用量は、最も有効な結果を得るための条件に応じて、単回投与により、複数回投与により、または徐放を利用して、好ましくは１日１回以上の注射により、通常の医薬組成物として送達してもよい。例えば、この用量は、鼻腔通気により通常の医薬組成物として送達してもよい。

正確な用量および組成物および最適な送達法の選択は、とりわけ、選択された本発明による化合物の薬理特性、治療する病態の性質および重篤度、ならびにレシピエントの健康状態および精神力によって左右される。

代表的な好ましい送達法としては、限定されるものではないが、経口、非経口、皮下、経皮(transcutaneous)、筋肉内および静脈内、直腸、口内（舌下を含む）、経皮(transdermal)、および鼻腔通気が挙げられる。

医薬上許容される塩は、有毒な副作用がなく、本発明による化合物の目的の生物学的活性を保持している。このような塩の例としては、（ａ）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などのような無機酸を伴って形成された酸付加塩；ならびに例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸を伴って形成された塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属陽イオンを伴って、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成された有機陽イオンを伴って形成された塩基付加塩；あるいは（ｃ）前記（ａ）と（ｂ）の組合せ、例えば亜鉛タンニン酸塩などが挙げられる。医薬上許容されるバッファーとしては、限定されるものではないが、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。また、これらの溶液は、当業者に公知の許容される保存剤を含んでもよい。

本発明のさらなる態様によれば、有効成分として本発明による化合物または本発明によるその誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を、医薬上許容される無毒な担体と混合して含んでなる医薬組成物が提供される。上記のように、このような組成物は非経口（皮下、経皮、筋肉内および静脈内）投与向けに、好ましくは液剤または懸濁剤の形態で；経口または口内投与向けに、特に錠剤またはカプセル剤の形態で；また、鼻腔内投与向けに、特に散剤、点鼻剤またはエアゾールの形態で調製することができる。

これらの組成物は、便宜には単位投与形で投与でき、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)に記載されるような、製薬分野で周知の方法のいずれを用いて調製してもよい。非経口投与用製剤は、賦形剤として滅菌水または生理食塩水、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源のオイル、水素化ナフタレンなどを含んでいてもよい。経口投与用としては、製剤は、胆汁またはアシルカルニチンの添加によって増強することができる。鼻腔投与用製剤は固形であってもよく、例えばラクトースまたはデキストランなどの賦形剤を含んでいてもよく、あるいは点鼻剤または計量スプレーの形態で用いるための水溶液または油性溶液であってもよい。口内投与用としての典型的な賦形剤としては、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファー化デンプンなどが挙げられる。

最も好ましい投与経路である鼻腔投与向けに製剤化する場合、約０．２〜１５重量％の間、好ましくは約０．５〜４重量％の間、最も好ましくは約２重量％の量の、例えばグリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコデオキシコール酸、シクロデキストリンなどのような界面活性の酸により鼻粘膜からの吸収を増強してもよい。

本発明による化合物の、長期、例えば１週間〜１年などにわたる被験体への送達は、所望の放出期間、十分な有効成分を含有する徐放系の単回投与によって達成しうる。モノリシック型またはリザーバー型マイクロカプセル、デポーインプラント、オスモティックポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入デバイス、および選択的注射投与形などの種々の徐放系がこの目的のために用いられる。有効成分の送達が望まれる部位へ局在させられることがいくつかの徐放性デバイスの付加的な特徴であり、特定の疾患の治療に有益であることがわかるであろう。

徐放性製剤の一つの形態は、Kent, Lewis, Sanders, and Tice,米国特許第４，６７５，１８９号明細書の先駆的研究に記載されているように、乳酸／グリコール酸共重合体など、分解が遅く、無毒で非抗原性のポリマーに分散または封入したポリペプチドまたはその塩を含む。また、これらの化合物または好ましくはそれらの比較的不溶性の塩を、コレステロールまたはその他の脂質マトリックスペレット、またはシラストマーマトリックスインプラント中に製剤化してもよい。その他の徐放性デポーインプラントまたは注射製剤も当業者には明らかである。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、およびR.W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987を参照されたい。

ＰＴＨと同様に、ＰＴＨ変異体も、ある臨床症状を治療する上で有用な他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、骨粗鬆症およびその他の骨関連疾患を治療する場合、ＰＴＨ変異体をダイエタリーカルシウムサプリメントまたはビタミンＤ類似体とともに投与してもよい（米国特許第４，６９８，３２８号明細書参照）。あるいは、ＰＴＨ変異体は、例えば米国特許第４，７６１，４０６号明細書に記載のように、ビスホスホネートとともに、または限定されるものではないがカルシトシンおよびエストロゲンなどの１以上の骨治療薬とともに、好ましくは周期的治療法を用いて投与してもよい。

ＰＴＨ類似体受容体シグナル伝達活性
ホルモン作用の発現における重要な工程は、ホルモンと標的細胞の原形質膜表面上の受容体との相互作用である。ホルモン−受容体複合体が形成されることにより、細胞に細胞外シグナルが伝達され、種々の生体応答が誘起される。

本明細書に記載のポリペプチドは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイを用い、アゴニストまたはアンタゴニスト特性に関してスクリーニングすることができる。細胞表面でＰＴＨ−１受容体を発現する細胞は、２ｍＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン，Sigma, St. Louis, MO）の存在下、３７℃で５〜６０分間、天然型ＰＴＨ（１−８４）とともにインキュベートする。サイクリックＡＭＰの蓄積は、特異的ラジオイムノアッセイによって測定する。ＰＴＨ−１受容体に対する結合に関して天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）と競合し、かつ、ｃＡＭＰ蓄積に対する天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の作用を阻害する化合物が競合的アンタゴニストであると考えられる。このような化合物は高カルシウム血症を治療するのに有用である。

逆に、ＰＴＨ−１受容体に対する結合に関して天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）と競合しないが、天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）のｃＡＭＰ蓄積の活性化をなお妨げる（おそらく受容体活性化部位の遮断による）本明細書に記載のＰＴＨ類似体またはその誘導体は、非競合的アンタゴニストであると考えられる。このような化合物は高カルシウム血症を治療するのに有用である。

ＰＴＨ−１受容体に対する結合に関して天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）と競合し、かつ、天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の存在下または不在下でｃＡＭＰの蓄積を刺激する本明細書に記載の化合物は競合的アゴニストである。ＰＴＨ−１受容体に対する結合に関して天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）と競合しないが、天然型ＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の存在下または不在下でｃＡＭＰの蓄積をなお刺激しうるか、あるいは本発明による化合物またはその誘導体において見られるものより高いｃＡＭＰ蓄積を刺激する化合物は、非競合的アゴニストであると考えられる。

ＰＴＨ類似体の治療的使用
高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰとＰＴＨ−１受容体との相互作用に関連している。高カルシウム血症は血清カルシウムレベルの異常な上昇がみられる病態であり、これは多くの場合、上皮小体機能亢進症、骨粗鬆症、乳癌、肺癌および前立腺癌、頭頸部および食道の類表皮癌、多発性黒色腫および副腎腫をはじめとするその他の疾病と関連する。低カルシウム血症は血清カルシウムレベルが異常に低い病態で、例えば甲状腺手術後の有効なＰＴＨの欠損に起因するものである。

「アゴニスト」とは、ＰＴＨ−１受容体によって媒介される細胞応答を増強または促進しうるリガンドを意味する。「アンタゴニスト」とは、ＰＴＨ−１受容体によって媒介される細胞応答を阻害しうるリガンドを意味する。本発明による候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がこのような細胞応答を増強するか阻害するかは、本願の他の部分に記載されているものをはじめ、当技術分野で公知のタンパク質リガンド／受容体細胞応答または結合アッセイを用いて判定することができる。

本発明のさらなる態様によれば、ＰＴＨ−１受容体の変化したまたは過剰な作用に起因する医学的疾患を治療する方法であって、患者のＰＴＨ−１受容体の活性化を阻害するのに十分な治療上有効量の本発明による化合物またはその誘導体を患者に投与することを含んでなる方法が提供される。

この実施態様では、ＰＴＨ−１受容体の変化した作用に起因する疾患を有するおそれのある患者を、ＰＴＨ−１受容体の選択的アンタゴニストである本発明による化合物または本発明によるその誘導体を用いて治療することができる。このようなアンタゴニストとしては、ＰＴＨ−１受容体によって媒介される細胞の活性化と相互作用すると判定された（上記のアッセイにより）本発明による化合物または本発明によるその誘導体、あるいは同様の特性を有するその他の誘導体が挙げられる。

アンタゴニストを投与するためには、本発明による適当な化合物またはその誘導体を、一般には、例えば生理食塩水などの適当な担体または賦形剤中に製剤化することにより、薬剤の製造に用い、好ましくは、本発明による化合物またはその誘導体の、ＰＴＨ−１受容体との結合の十分な阻害をもたらす用量で、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内投与する。典型的な用量は、ペプチド１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

本発明のさらなる態様によれば、患者のＰＴＨ−１受容体を活性化するのに十分な治療上有効量の本発明による化合物またはその誘導体を患者に投与することを含んでなる、骨粗鬆症の治療方法が提供される。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰアンタゴニストに関して上記したものと同様の用量および投与が、例えば骨粗鬆症、その他の骨代謝障害、ならびに上皮小体機能低下症および関連疾患などの病態の治療を目的としたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰアゴニストの投与にも使用できる。

当業者であれば、本発明が本発明またはそのいずれかの実施態様の精神または範囲から外れない限り、組成物の幅広い同等のパラメーター、濃度、投与様式および病態まで実施することができることがわかるであろう。

以上、本発明を詳しく説明してきたが、具体例を参照すればよりよく理解できよう。なお、これらの具体例は例示のために示すものであって、特に断りのない限り本発明を限定するものではない。

以下のプロトコールおよび実験の詳細は、次に続く実施例において参照されるものである。

ペプチド：本研究に用いるペプチドは、遊離アミノ酸末端を含み、かつ、Ｃ末端にカルボキサミドを含むものとした。ペプチドは、カップリング反応のためのＦｍｏｃ主鎖保護基化学、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（モル比１：１：２）を用い、さらにＴＦＡ媒介切断／側鎖脱保護（MGH Biopolymer Synthesis Facility, Boston, MA）を用いる自動ペプチド合成装置（model 430A PE, Applied Biosystems, Foster City, CAまたはModel 396 MBS Advanced Chem Tect, Louisville, KY）にて調製した。ペプチドは総てＣ１８含有カートリッジに吸着させることによって脱塩し、さらにＨＰＬＣで精製した。乾燥ペプチド粉末を１０ｍＭ酢酸で再構成し、−８０℃で保存した。各ペプチドの純度、特性および原液濃度は、分析的ＨＰＬＣ、マトリックス・アシスト・レーザー・デソープション／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析およびアミノ酸分析によって確認した。［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の放射性標識は^１２５Ｉ−Ｎａ（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）およびクロラミン−Ｔを用いて行い、得られた放射性リガンドはＨＰＬＣによって精製した。

細胞培養：細胞系ＨＫＲＫ−Ｂ２８(Takasu, H., et al., J. Bone Miner. Res. 14:11-20 (1999))は、ヒトＰ１ＲをコードするプラスミドＤＮＡで安定的にトランスフェクトすることによってブタ腎細胞系ＬＬＣ−ＰＫ_１から誘導したものであり、細胞当たり２８０，０００もの受容体を発現する。これらの細胞ならびにＣＯＳ−７細胞およびＳａＯＳ−２−Ｂ１０細胞を、２７℃、５％ＣＯ_２を含む加湿大気下、Ｔ−７５フラスコ（７５ｍｍ^２）にて、ウシ胎児血清（１０％）、ペニシリンＧ（２０単位／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）およびアンフォテリシンＢ（０．０５μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＥＧＴＡ／トリプシンの原液および抗生物質はGIBCOから、ウシ胎児血清はHyclone Laboratories (Logan, UT)から入手した。２４ウェルプレートで継代培養したＣＯＳ−７細胞を、塩化セシウム／臭化エチジウム密度勾配遠心分離により精製した、野生型ヒトＰ１Ｒまたは残基（２４−１８１）を欠失した末端切断型ヒトＰ１Ｒ(Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275:21836-21843 (2000))をコードするプラスミドＤＮＡ（ウェル当たり２００ｎｇ）、およびＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬(Roche Indianapolis IN)により、該試薬の製造業者の奨励する手順に従ってトランスフェクトした。２４ウェルプレートにて総ての細胞を新鮮培地で処理し、アッセイ前１２〜２４時間、温度を３３℃に変更した。

ｃＡＭＰ刺激：ペプチド類似体による細胞の刺激は２４ウェルプレート上で行った。細胞を０．５ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ_２、５％熱不活性化ウマ血清、０．５％ウシ胎児血清、ＨＣｌでｐＨ７．５に調整）ですすぎ、２００μＬのｃＡＭＰアッセイバッファー（２ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、３５ｍＭＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４を含有するダルベッコ改変イーグル培地）および種々の量のペプチド類似体を含有する１００μＬの結合バッファー（最終量＝３００μＬ）で処理した。室温で３０〜６０分間インキュベートした後に培地を除去し、細胞をドライアイス上で凍結させ、０．５ｍＬの５０ｍＭＨＣｌで溶解し、再び凍結させた（−８０℃）。希釈した溶解液のｃＡＭＰ含量をラジオイムノアッセイによって測定した。ＥＣ_５０応答値を非線形回帰を用いて算出した（下記参照）。

競合結合：２４ウェルプレートにてＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞またはＣＯＳ−７細胞を用いて結合反応を行った。細胞を０．５ｍＬの結合バッファーですすいだ後、１００μＬの結合バッファー、種々の量の非標識競合リガンドを含有する１００μＬの結合バッファー、および約１００，０００ｃｐｍの^１２５Ｉ−［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）または^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１２）（約２６ｆｍｏｌ）を含有する１００μＬの結合バッファーで連続的に処理した（最終量＝３００μＬ）。４℃で４〜６時間インキュベートすると、ほぼ平衡状態に達した。その後、細胞を氷上に置き、結合培地を除去し、単層を０．５ｍＬの冷結合バッファーで３回すすいだ。次に、この細胞を０．５ｍＭの５ＮＮａＯＨで溶解し、放射活性をカウントした。各実験、各トレーサーにつき、１μＭ濃度の同じ非標識ペプチドの存在下で結合した放射活性として非特異的結合を求めたところ、各トレーサーに対して加えた全放射活性の１％以下であった。最大特異的結合（Ｂ_０）は、競合リガンドの不在下で結合した全放射活性を非特異的結合に関して補正したものであり、各トレーサーで、加えた全放射活性の８％〜２０％の範囲であった。非線形回帰を用いて結合ＩＣ_５０値を算出した（下記参照）。見かけの平衡解離定数（ｋ_Ｄａｐｐ）およびリガンド結合部位の合計数（Ｂ_ｍａｘ）の評価に２６ｆｍｏｌの^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１２）を用いた実験から得られた同種競合結合データのスキャッチャード変換を用い、ある１つのクラスの結合部位とヨウ化および非ヨウ化リガンドの対等な親和性を推定した。

リン酸イノシトール産生の刺激：上記のようにＰ１Ｒ−ＷＴでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、アッセイ前１６時間、０．１％ウシ血清アルブミンおよび［^３Ｈ］ミオイノシトール(NEN, Boston, MA)(２μＣｉ／ｍＬ）を含有する、血清およびイノシトールを含まないＤＭＥＭで処理した。アッセイ時、細胞をＬｉＣｌ（３０ｍＭ）を含有する結合バッファーですすぎ、ＰＴＨ類似体を含む、または含まない同バッファーで処理した。次に、細胞を３７℃で４０分間インキュベートし、その後、バッファーを除去し、０．５ｍＬの氷冷５％トリクロロ酢酸溶液に置換した。氷上に３時間置いた後、溶解液を回収し、エチルエーテルで２回抽出した。次に、溶解液をイオン交換カラム（樹脂ベッド０．５ｍＬ）に適用し、全リン酸イノシトールを文献の記載に従って溶出させ(Berridge, M.J. et al., Biochem. J. 212:473-482 (1983))、液体シンチレーションカクテル中でカウントした。

マウス胚中足骨における軟骨細胞分化の阻害：胚発生日数（Ｅ）１５．５日のマウス胚から中足骨を摘出し、３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ_２）にて、２４ウェルプレートの無血清αＭＥＭ培地中で培養した。１６時間後、ＰＴＨ類似体またはビヒクルを加え、サンプルを３７℃でさらに４８時間インキュベートした。なお、ペプチドおよびビヒクルは２４時間の時点で再び加えた。６４時間のインキュベーションが終わったところで、サンプルを１０％ホルマリン／リン酸緩衝生理食塩水で固定した後、白色光を用い、解剖顕微鏡で直接可視化した。in situハイブリダイゼーション分析のため、成長プレートの肥厚性軟骨細胞でしか発現しない発達マーカー遺伝子であるＸ型コラーゲンｍＲＮＡに特異的な^３５Ｓ標識リボプローブを用いて切片を処理した。

円偏光二色性：円偏光二色性スペクトルはJascoモデル７１０分光偏光計で記録し、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４、または２０％（ｖ／ｖ）の２，２，２−トリフルオロエタノールを含有する同バッファー中２０μＭの濃度でペプチドを分析した。分光スキャンは２０℃、１８５〜２５５ｎＭの間の波長で行い、１ｎＭ間隔でデータをとった。バンド幅は１．５ｎＭとし、８回のスキャンを累積し、各サンプルに関して平均をとった。各波長において、平均残基楕円性［θ×１００／ｌ×Ｃ×ｎ］｛式中、θは生の楕円率の値（１００分の１度の大きさ）、ｌはサンプルパス長であり、Ｃはペプチドのモル濃度であり、ｎはペプチドの残基の数である）。各ペプチドのヘリックス含量は、そのペプチドについて２２２ｎＭで測定された［θ］を、モデルのヘリックスデカペプチドについて報告されている［θ］_２２２測定値である−２８，１００(Bowen, W.P., and Jerman, J.C., Trends in Pharmacol. Sci. 16:413-417 (1995))で割ることによって割り出した。

データの計算：計算はMicrosoft（登録商標）Excelを用いて行った。結合およびｃＭＡＰ用量−応答データの非線形回帰分析は４パラメーター方程式：ｙ_ｐ＝Ｍｉｎ＋［（Ｍａｘ−Ｍｉｎ）／（１＋（ＩＣ_５０／ｘ）^{ｓｌｏｐｅ}）］を用いて行った。これまでに記載されているようにパラメーターの最適化にはExcel Solver関数を用いた(Carter, P.H., et al., Endocrinology 140:4972-4981 (1999); Bowen, W.P. and Jerman, J.C., Trends in Pharmacol. Sci. 16:413-417 (1995))。対となるデータ間の差は２つのセットの不等分散を推定するスチューデントの片側ｔ検定を用いて統計学的に評価した。

実施例１：［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）におけるＡｉｂスキャン
足場ペプチドに［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の各位置にそれぞれＡｉｂ置換を導入する効果(Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001)(In Press))を分析した。ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞におけるｃＡＭＰ刺激アッセイでは、親ペプチド［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）ＰＴＨ（１−３４）によって誘導された細胞内ｃＡＭＰにおいてほぼ同じ（〜７０倍）最大（Ｅｍａｘ）増加を刺激したが、より短いペプチドの能力（ＥＣ_５０）はＰＴＨ（１−３４）のもの（それぞれＥＣ_５０＝１００±２０および２．５±０．４ｎＭ）（図１および表１）よりも４０倍低かった。ほとんどのＡｉｂ置換は能力を低下させた。６番、８番および９番の位置でのＡｉｂ置換ではいくらかの低下が見られ（総て＞２，３００倍）２番、４番、５番および１１番の位置での置換では中程度の低下が見られ（総て１７０〜６７０倍）、７番、１０番、１２番、１３番および１４番の位置での置換では小さな低下が見られた（総て＜３倍；表１）。１番および３番の位置のＡｉｂの置換の結果、「Ｍ」ＰＴＨ（１−１４）に対してそれぞれ１０倍および８倍の効力を有するペプチドが得られた（Ｐ≦０．０１）。これらのＡｉｂスキャンデータは従前のアラニンスキャンおよびＰＴＨ（１−１４）類似体の置換分析を拡張し、ここでは残基３を除く（１−９）領域の残基が置換に耐えられないことがわかり、残基３および１０〜１４は比較的耐性であることがわかった(Luck, M.D., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999); Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275:19456-19460 (2000); Pellegrini, M., et al., J. Biol. Chem. 273:10420-10427 (1998))。

これらの類似体のＰ１Ｒ結合特性はＨＫＲＫ−Ｂ８細胞で行った競合研究でアッセイした。従前の研究では、ＰＴＨ（１−１４）結合は^１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−３４）および関連のＮ末端が完全な放射性リガンドと比較的修飾されていない放射性リガンドを用いても検出できなかった(Luck, M. D., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999))。しかし、トレーサー放射性リガンドとして^１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−３４）を用いた場合には測定可能なＰＴＨ（１−１４）結合が見られた(Hoare, S.R.J., et al., J. Biol. Chem 276:7741-7753 (2001); Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001) (In Press))。受容体結合親和性は検討する［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）類似体と構造的に相同であったトレーサー放射性リガンドを用いて評価した。放射性標識ペプチド^１２５Ｉ−［Ａｌａ^３，１２Ｎｌｅ^８Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１，Ｔｒｐ^１４，Ｔｙｒ^１５］ＰＴＨ（１−１５）アミドを評価したが、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞と検出可能には結合しなかった。２１番の位置に延長され、Ｇｌｕ^１９→Ａｒｇの親和性増強置換(Takasu, H., et al., Biochemistry 38:13453-13460 (1999); Kronenberg, H.M., et al., Recent Prog. Horm. Res. 53:283-301 (1998))を含んだ同様の置換も作製した。得られた放射性リガンド^１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−２１）はＰ１Ｒ発現完全ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞と十分結合し、特異的に結合した放射活性の量（例えば非標識［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）ペプチドによって阻害できた量）としては加えた全放射活性の〜１５％〜２０％であり、非トランスフェクトＬＬＣ−ＰＫ１細胞と結合した量は加えた全量ｍの＜２％であった。従って、このトレーサーリガンドは競合分析に適したものであった。

ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞に対する^１２５Ｉ−［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の結合はＰＴＨ（１−３４）によって完全に阻害され（ＩＣ_５０＝１８±３ｎＭ）、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）によっては完全に近いが若干弱く阻害された（ＩＣ_５０＝１３，０００±３，０００ｎＭ，表１）。［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の見かけの結合親和性と比較して、ｃＡＭＰシグナル伝達能に対するこれに相当する作用によれば、ほとんどのＡｉｂ置換は親和性を低下させた（表１）。有意に親和性が向上した唯一のＡｉｂ置換は、１番および３番の位置のものであった（それぞれ１３倍および８倍、１０番の位置のＡｉｂは親和性に１．４倍の向上を生じる傾向があった、Ｐ＝０．１６）。４番、７番、８番および９番の位置におけるＡｉｂ置換では親和性に著しい低下（＞１０倍）が起こったが、２番、５番、１２番、１３番および１４番の位置におけるＡｉｂ置換では緩やかな低下（＜１０倍）しか起こらなかった。ほとんどのＡｉｂ置換はｃＡＭＰシグナル伝達能に対するそれらの作用にほぼ比例した受容体結合親和性に対する作用を示したが、２番および６番の位置のものはこの能力に対してではなく結合に対しての作用の低下を示した。従って、これら２つの置換は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）に対して〜３倍親和性を低下させたが、それらはそれぞれ〜４７０倍および〜２，３００倍能力を低下させた（表１）。

１番と３番の位置のＡｉｂ置換を組み合わせたところ、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）はｃＡＭＰシグナル伝達経路に作用の形成刺激において［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の場合より９０倍能力が高く（それぞれＥＣ_５０＝１．１±０．１ｎＭ、１００±２０ｎＭ）、ＰＴＨ（１−３４）とは少なくとも同等であった（ＥＣ_５０＝２．５±０．４ｎＭ，Ｐ＝０．０１，図２Ａおよび表１）ことから、相加的作用であることが明らかであった。また、受容体結合親和性に対する１番および３番の位置の単独のＡｉｂ置換の作用も、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）が［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の場合より１００倍高い見かけの親和性で結合したことから、相加的なものであった（図２Ｂおよび表１）。次に、この対となる置換がより短いペプチド配列の親和性を増強できるかどうかを調べるために［Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）類似体の１番および３番の位置にＡｉｂ置換を導入した。従前に、（１−１４）よりも短い天然型ＰＴＨペプチドはｃＡＭＰシグナル伝達活性を欠いているが(Luck, M.D., et al., Molecular Endocrinology 13 :670-680 (1999))、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）などの修飾型ＰＴＨ（１−１１）類似体は、能力はＰＴＨ（１−３４）よりも１，０００倍近く弱い（ＥＣ_５０＝３μＭ）にもかかわらず、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞において完全なｃＡＭＰ応答を誘導できた(Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001) (In Press))ことが示されている。ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞におけるｃＡＭＯシグナル伝達アッセイでは、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）は完全に有効であり、その能力（ＥＣ_５０４．０±０．８ｎＭ）は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）よりも１，０００倍高かく(Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001) (In Press))、ＰＴＨ（１−３４）とほぼ同等であった（図２Ａ、表１）。［Ａｉｂ^１，３，Ｇｌｎ^１０］ＰＴＨ（１−１０）はこれまでに最も能力の高かったＰＴＨ（１−１０）類似体［Ａｌａ^３，Ｇｌｎ^１０］ＰＴＨ（１−１０）よりも５０倍高い能力であった（それぞれＥＣ５０＝１６±２μＭおよび〜８００μＭ）(Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001) (In Press))ことから、Ａｉｂ−１，３修飾もＰＴＨ（１−１０）類似体の能力を向上させた（図２Ａ、表１）。［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）に比べて［Ａｉｂ^１，３，Ｇｌｎ^１０］ＰＴＨ（１−１０）で４０００倍弱い能力が示されたことから、Ａｉｂを含有するペプチドの活性における１１番残基（ホモアルギニン）の位置の重要性が示唆された。［Ａｉｂ^１，３］ＰＴＨ（１−９）ではｃＡＭＰ蓄積の刺激はほとんど、あるいは全く見られなかった（図２Ａおよび表１）。競合結合アッセイでは、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）はＨＫＲＫ−Ｂ８細胞に対する^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の結合を効果的に阻害したが（ＩＣ_５０＝９７０±３００ｎＭ）、［Ａｉｂ^１，３，Ｇｌｎ^１０］ＰＴＨ（１−１０）および［Ａｉｂ^１，３］ＰＴＨ（１−９）は分離可能な(detachebly)結合は生じなかった（図２Ｂおよび表１）。

実施例２：ＣＯＳ−７細胞における類似体の活性
１番および３番の位置におけるＡｉｂ置換の活性増強作用が受容体の膜近傍（Ｊ）領域によって媒介された可能性を、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔで一次トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で検討した。Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔは、アミノ末端細胞外ドメインの大部分を欠いた末端切断型Ｐ１Ｒである。この受容体構築物を用いた場合、ＰＴＨ（１−３４）は、Ｐ１Ｒ−ＷＴを用いる場合よりもはるかに弱いアゴニストであったが、その他のＰＴＨ（１−１４）類似体は、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを用いてもＰ１Ｒ−ＷＴを用いる場合とほぼ同等の能力を示した（Kaul, R. , and Balaram, P., Bioorganic & Medicinal Chemistry 7:105-117 (1999)）。このことに一致して、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対する［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）のｃＡＭＰシグナル伝達能（ＥＣ_５０＝０．７３±０．１６ｎＭ）はＰ１Ｒ−ＷＴを発現するＣＯＳ−７細胞に対するその能力（１．２±０．６ｎＭ）に匹敵するものであった（表２）。Ｐ１ＲｄｅｌＮｔに対して、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）（ＥＣ_５０＝４０±２ｎＭ，図３Ａおよび表２）の場合よりも５５倍能力が高かった。この結果は、Ａｉｂ−１，３置換の能力増強作用が受容体のＪドメインを介して発揮されたことを示唆するものであった。特に、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は、ＰＴＨ（１−３４）がＰ１Ｒ−ＷＴに対して発揮したものと同等の能力をＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対して発揮し（それぞれＥＣ_５０＝０．７３±０．１６ｎＭおよび１．４±０．７ｎＭ，Ｐ＝０．４，表２）、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）がＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対して誘導したＥＭａｘは、ＰＴＨ（１−３４）がＰ１Ｒ−ＷＴに対して誘導したものとほぼ等しかった（それぞれ２５０±２０ピコモル／ウェルおよび２４０±５０ピコモル／ウェル，Ｐ＝０．７，表２）。予想されたように、ＰＴＨ（１−３４）はＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対してＰ１Ｒ−ＷＴに対するよりも〜５００倍弱かった（それぞれＥＣ_５０＝６８０±１１０ｎＭおよび１．４±０．７ｎＭ；図３Ａおよび表２）。

これまでのところ、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）をはじめ、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを発現する細胞においていずれのＰＴＨ類似体に関してもＰＬＣ応答は証明できていなかった。しかし、予想されたようにＰＴＨ（１−３４）および［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は不活性であったが、類似体［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを発現するＣＯＳ−７細胞において基本レベルのリン酸イノシトール（ＩＰ）に対してＩＰ産生に約３倍の上昇を誘導した（図３Ｂ）。このように、末端切断型受容体は、Ａｉｂ含有ＰＴＨペプチドで刺激した場合、ＰＣＬシグナル伝達経路と共役することができる。Ｐ１Ｒ−ＷＴを用いた場合、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）はいずれも、この受容体に作用するＰＴＨ（１−３４）で見られたＩＰ形成と同じ４倍の増強を刺激し、この受容体を用いた場合、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）よりも６６倍能力が高かった（それぞれＥＣ_５０＝７１±９ｎＭおよび４，７００±２，０００ｎＭ，表２）。このように、Ａｉｂ−１，３置換は、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔと同様に、Ｐ１Ｒ−ＷＴによる、リガンドのＰＬＣ活性刺激能を増強する。

ＨＫＲＫ−Ｂ８細胞における上記結合研究で用いた放射性リガンド^１２５Ｉ−［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）は、Ｐ１Ｒ−ｄｅＩＮｔとは検出可能には結合しなかった。このペプチドの親和性を向上させることができるかもしれないと考え、対となるＡｉｂ−１，３修飾を導入して［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）を作製した。相当する放射性ヨウ素化したペプチド^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）はＰ１Ｒ−ＷＴを発現するＣＯＳ−７細胞に結合したことから、このトレーサーの特異的結合（例えば、過剰量の非標識［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）ペプチドによって阻害できたもの）は各受容体についてそれぞれ加えた全放射活性の〜１０％および〜１５％であった。ベクターＤＮＡ単独でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で見られた全特異的結合は、加えた全放射活性の＜２％であった。従って、この放射性リガンドにより、野生型および末端切断型双方のＰＴＨ−１受容体で競合結合実験を行うことが可能となった。トレーサー放射性リガンドとしての^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）および種々の量の非標識［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）を用いて得られた同種競合結合データのスキャッチャード変換によれば、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔにおけるリガンドの親和性はＰ１Ｒ−ＷＴの場合よりも若干（＜２倍）弱く（それぞれＫ_Ｄａｐｐ＝２９±３および１７±２ｎＭ，Ｐ＝０．０１）、この２つの受容体に対応するＢ_ｍａｘ値に有意な差はない（それぞれ１．３±０．１×１０^６受容体／細胞および１．９±０．８×１０^６受容体／細胞，Ｐ＝０．３）ことが示された。

末端切断型受容体、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の他［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１２）の結合を効果的に阻害したが、ＰＴＨ（１−３４）は阻害しなかった（図３Ｃ）。［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）同様、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）がＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔにおいて示した見かけの結合親和性は野生型Ｐ１Ｒで見られた相当する親和性に匹敵するものであった（表２）。Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔにおいてもＰ１Ｒ−ＷＴにおいても、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の結合親和性は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）について見られた相当する親和性よりも〜１０倍高かった。従ってこれらのＡｉｂ置換はＰ１ＲのＪドメインに対するリガンドの結合親和性を増強するものであった。

実施例３：骨細胞における活性
骨および腎臓におけるＰＴＨ標的細胞の表面で発現されるＰＴＨ−１受容体の数は明らかではないが、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞で見られるものよりかなり少ないものと思われる。従って、Ａｉｂを埋め込んだＰＴＨ類似体のいくつかはＳａＯＳ−２細胞を用いて評価した。これらの細胞はヒト骨肉腫由来であり、骨芽細胞様の特性を示し、比較的低レベルのＰＴＨ−１受容体（〜２０，０００受容体／細胞）を内在発現する(Marx, U.C., et al, J. Biol. Chem. 273:4308-4316 (1998))。これらの細胞では、［Ａｉｂ^１，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ａｉｂ^３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は、ｃＡＭＰ形成の刺激において、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の場合よりも１５倍および８倍能力が高く、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）よりも１３０倍能力が高かった（図４および表３）。このように、ＳａＯＳ−２細胞では、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）はＰＴＨ（１−３４）よりも１３倍低い能力しかなく、１０μＭの用量でも活性が検出できなかった天然型ＰＴＨ（１−１４）よりは少なくとも５オーダー高い能力であった（図４）。

［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）活性がより完全な骨系で検出できるかどうかを、エクスプラントアッセイにより検討した。エクスプラントアッセイでは、Ｅ１５．５マウス胚から単離した後に血清フリー培地を含有するマルチウェルプレートで培養した軟骨性中足骨原基を用いた。ＰＴＨペプチド類似体またはビヒクル対照を、外植１６時間後、さらに２４時間後に再び培養物に加えた。２４時間後にインキュベーションを終了し、６４時間中、全部で４８時間の処理とした。ＰＴＨの不在下では軟骨細胞の分化が見られ、実験の終了までに骨の中央断面において濃度の高い鉱化が見られた（図５Ａ）。分化は、ＰＴＨ（１−３４）（０．１μＭ）または［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）（１μＭ）の存在により阻害され、鉱化は見られなかった（図５ＢおよびＣ）。また、鉱化は、これらのアッセイでは［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）によっても阻害されたが、天然型ＰＴＨ（１−１４）（２μＭ）では作用は全く検出されなかった（図５Ｄ）。３回の反復実験の各々で匹敵する結果が得られた。さらに、外植中足骨に対して行ったｍＲＮＡのin situハイブリダイゼーション分析では、ＰＴＨ（１−３４）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）はいずれも骨発達マーカー遺伝子であるコラーゲンＸ遺伝子の発現を阻害した（データは示していない）。これらの阻害作用は、発達中の長骨の成長プレート軟骨において軟骨細胞の分化を遅延させるＰＴＨｒＰの既知の能力(Pellegrini, M., et al., Biochemistry 37:12737-12743 (1998))と一致していた。

実施例４：円偏光二色性
円偏光二色性（ＣＤ）分光法を利用して、ペプチドが液相に遊離している場合にペプチドの二次構造に対してＡＩｂ置換がおよぼす作用を分析した。サンプルは、リン酸水溶液バッファー、およびＴＨＰペプチド断片を含むオリゴペプチドでヘリックス構造を促進する(Pellegrini, M., et al., J. Biol. Chem. 273:10420-10427 (1998); Gronwald, W., et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler 377:175-186 (1996); Barden, J.A., and Kemp, B.E., Biochemistry 32:7126-7132 (1993))有機溶媒２，２，２−トリフルオロエタノールを含有するリン酸バッファーの両者において分析した。リン酸バッファーでは、各ペプチドのヘリックス含量は、２２２ｎＭで見られる楕円性から見積もったところ、小さいものであった（≦１６％）が、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）は［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）のほぼ２倍のヘッリクスを含み（それぞれ１６％および８．１％）、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）もまた、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）のほぼ２倍のヘッリクスを含んでいた（それぞれ１３％および７．５％，表４）。２，２，２−トリフルオロエタノールでは、各ペプチドのヘリックス含量は増加し、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１１）はいずれも最高レベルのヘリックス含量を示し（それぞれ５６％および５７％）、各々それらのＡｌａ−１，３を含有する、対応するペプチドよりもヘリックスが多かった（図６および表４）。これら２つのペプチドの高いヘリックス含量は、１９２ｎＭおよび２２２ｎＭの負の楕円率から明らかなだけでなく、１９２ｎＭの正の楕円率からも明らかであった（図６）。非修飾型ＰＴＨ（１−１１）は最低量のヘリックス構造（３０％）を示したが、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１０）は約４７％のヘリックスであった（図６および表４）。これらの結果は、Ａｉｂ−１，３修飾が遊離の液相でＮ末端ＰＴＨオリゴペプチドのヘリックス構造を増加させることを示唆している。

実施例５：ＰＴＨ類似体
第一の工程としては、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の各位置にＡｉｂを導入した。Ａｉｂスキャンデータは、ほとんどの位置での置換が活性を低下させることを示した。しかし、Ａｉｂスキャンデータにより、１番および３番の位置に置換を有する場合にｃＡＭＰシグナル伝達能が著しく向上する（８〜１０倍）ことが明らかになり、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞においてＥＣ_５０が〜１ｎＭである［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）が［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）よりも１００倍能力が高く、ＰＴＨ（１−３４）と少なくとも同等の能力であることから、これらの作用は相加的なものであった。

^１２５Ｉ−［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）を用いて行った競合結合実験では、ほとんどのＡｉｂ置換は、少なくともある部分、ＰＴＨ−１受容体結合親和性を変化させることにより能力に対するそれらの作用を発揮する（正または負）ことが示された。このように、Ａｉｂ−１置換およびＡｉｂ−３置換は各々、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞に対する［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の見かけの親和性を約１０倍高め、複合型のＡｉｂ−１，３置換は親和性を約１００倍高めた。同様に、その他のほとんどのＡｉｂ置換によって生じるｃＡＭＰシグナル伝達能の上昇は、全体として結合親和性が一般に相当するｃＡＭＰシグナル伝達能よりも１０〜１００倍弱かったとしても、見かけの結合親和性の低下によって説明することができよう。これに対する例外が２番および６番の位置で置換されたペプチドであり、この位置においては、シグナル伝達能は相当する見かけの結合親和性に匹敵するものである（２番の位置）か、〜１０倍弱いものであった。バリン−２またはグルタミン−６に対するＡｉｂの置換が、受容体結合親和性よりもシグナル伝達活性を損なったことは、結合親和性に比べて、ＰＴＨ（１−３４）類似体の３つの位置における置換によって生じるシグナル伝達能における不均衡な低下と一致し、実際にはＰＴＨ−１Ｒアンタゴニストとなる(Cohen, F.E., et al., J. Biol. Chem. 266:1997-2004(1991); Gardella, T.J.,et al., J. Biol. Chem. 266:13141-13146 (1991), Carter 1999 #1180)。

［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）に対するＡｉｂ−１，３修飾によって得られたｃＡＭＰ刺激能の１００倍の増強は、ＰＴＨ−１受容体の活性化にはＰＴＨのＮ末端部分のαヘリックスが必要であるという仮説と一致するものと思われる。オリゴペプチドのαヘリックスを安定化させるＡｉｂの能力は、そのＣ°原子と対称的に結合した２つのメチル基によって課せられたＡｉｂ残基のＮ−Ｃ°（Φ）およびＣ°−ＣＯ（Ψ）の周りの回転に対する立体的制限によるものである(Kaul, R., and Balaram, P., Bioorganic & Medicinal Chemistry 7:105-117 (1999); Burgess, A.W., and Leach, S. J., Biopolymers 12:2599-2605 (1973))。このＣ°原子の周りのねじれ角ΦおよびΨは、αヘリックスにおいて見られるものには強い制限があるが、Ａｉｂのジアルキル置換されたＣ°原子の対称性により、右手型または左手型いずれかのαヘリックスが考えられる。このような「逆」配置が、どちらかといえば右手型ヘリックスで見られれば、Ａｉｂ残基は、おそらくは総てターンを導くので、へリックスは終結する(Kaul, R., and Balaram, P., Bioorganic & Medicinal Chemistry 7:105-117 (1999); Venkataram Prasad, B.V., et al., Biopolymers 18:1635-1646 (1979))。この逆配置は、右手型配置に比べ、ペプチド構造ではまれであるが(Kaul, R., and Balaram, P., Bioorganic & Medicinal Chemistry 7:105-117 (1999))、なお、ＰＴＨ（１−１４）のアミノ末端におけるＡｉｂがαヘリックスの安定化以外のいくつかの機構によって能力を高める可能性を残している。

また、ＰＴＨ（１−３４）類似体での構造研究では残基３のＮ末端構造は検出されなかったことから、１番および３番の位置におけるＡｉｂ置換でペプチド能力／親和性に対する最も有益な作用が見られたことも注目に値する。１番の位置のＡｉｂはそのヘリックスに参加するそれ自体の中の「下流の」残基のヘリックス形成の核となる可能性がある。あるいは、この修飾は単に天然配列が極めて不安定でＮＭＲ分光光度法またはＸ線結晶学によって検出できないペプチドのまさにＮ末端のヘリックス構造を誘導または安定化する可能性がある。いずれにせよ、［Ａｌａ^３，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１］ＰＴＨ（１−１１）と比べて［Ａｉｂ^１，３，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１］ＰＴＨ（１−１１）により１０００倍高いｃＡＭＰシグナル伝達能が示されたことで（それぞれＥＣ_５０〜６ｎＭ対３μＭ，表１および（Shimizu, M., et al., Endocrinology (2001) (In Press))、Ａｉｂ置換の作用が、例えばペプチドの最初の１１のアミノ酸など、局部的に発揮されることが示される。

これらの類似体の、遊離ペプチドとしての、あるいは可能性としてはＰＴＨ−１受容体との複合体での直接的構造解析は、リガンドをＰＴＨ−１受容体に対するアゴニストとして働かせるリガンド構造に対する有益な考察を提供することができよう。これに関して、上記のデータから得られた情報はＰＴＨ−１受容体のペプチドミメティックスのデザインに用いることができる。天然型ＰＴＨペプチド配列の観点からこの問題の解決を図るのは、ペプチド主鎖のどの位置でもコンホメーションの多様性が存在しうることから、難しい。Ａｉｂなどの立体化学的に拘束されたアミノ酸をペプチド鎖に組み込めば、推定可能なペプチド構造の核となる働きをするので、この問題は軽減される。従って、このようなアプローチは、ＰＴＨ−１受容体のペプチドまたは非ペプチドアゴニストの新たなデザインを促しうる。骨粗鬆症を治療する上で最近判明したＰＴＨ（１−３４）の有用性(Neer, R.M., et al., N.E.J.M. 344:1434-1441 (2001))を考えれば、このようなアゴニストは重要な医学的インパクトを持つはずである。

分子レベルで、［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ類似体がいかにしてその受容体と相互作用するかは今のところわかっておらず、現在、天然型ＰＴＨ類似体との相互作用のかなり特殊なコンピューターモデルが開発中であるが(Jin, L., et al., J. Biol. Chem. 275:27238-27244 (2000); Rolz, C., and Mierke, D.F., Biophysical Chemistry (2000) (In Press))、どのようなＰＴＨリガンドについてもまだ知られていない。末端切断型ＰＴＨ−１受容体であるＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを用いた上記実験では、１番および３番の位置におけるＡｉｂ置換の促進作用は、細胞外ループおよび膜貫通ドメインを含む受容体の膜近傍領域（Ｊドメイン）を介して媒介されることが示されたことから、いくつかの考察が得られる。この知見はＰＴＨ／ＰＴＨ−１受容体相互作用における重複置換および突然変異データと一致し、このことは、ＰＴＨの（１−１４）ドメインの残基が、そのアミノ末端細胞外ドメイン（Ｎドメイン）とは対照的に、もっぱらというわけではないが主として受容体のＪドメインと相互作用することを示す(Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 271:26469-26472 (1996); Hoare, S.R.J., et al., J. Biol. Chem 276:7741-7753 (2001); Behar, V., et al., J. Biol. Chem. 275:9-17 (1999); Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275:19456-19460 (2000); Luck, M.D. et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999); Shimizu, M., et al., J. Biol. Chem. 275:21836-21843 (2000); Caeter, P.H., and Gardella, T.J., Biochem. Biophys. Acta 1538:290-304 (2001); Gardella, T.J., et al., Endocrinology 132:2024-2030 (1993); Bisello, A., et al., J. Biol. Chem. 273:22498-22505 (1998))。

［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）がｃＡＭＰアッセイで低ナノモルの能力と完全な効力を示し、また、ＰＬＣアッセイでほぼ完全な効力を示したという、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを用いた本発明者らの研究から引き出されるもう１つの重要な結論は、Ｎドメインのほぼ総てを欠いた末端切断型受容体が小さなアゴニストリガンドに感受性の高い強い応答を付与することができるということである。Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔと結合する放射性リガンド^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）が利用できることにより、はじめてこの末端切断型受容体に対して結合研究が行えるようになった。本発明者らによる同種競合結合データのスキャッチャード解析から、Ｐ１Ｒ−ＷＴで見られたものとは有意には異ならない、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔのＢｍａｘ値が得られた（それぞれ１．３±０．１受容体／細胞対１．９±０．８受容体／細胞、Ｐ＝０．３）。従って、この末端切断型受容体はＣＯＳ−７細胞の表面でよく発現する。驚くことではないが、ＰＴＨ（１−３４）はＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対する^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の結合を阻害できなかったが、この結果、ホルモン−受容体複合体全体を安定化させる上での、この受容体のＮドメインと天然型ペプチドのＣ末端（１５−３４）ドメインの間の相互作用の重要性が強調される。また、この結果はＰＴＨのアミノ末端部分と受容体のＪドメインとの間の相互作用が親和性の極めて弱いものであるという見解(Hoare, S.R.J., et al., J. Biol. Chem 276:7741-7753 (2001))を支持している。Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔと結合した^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）との見かけの親和性（ＩＣ５０〜１，５００ｎＭ）は、トレーサーの結合を阻害できなかった天然型ＰＴＨ（１−１４）のものよりはるかに高かったことから、明らかにこの相互作用の親和性は著しく向上させることができる。Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔと結合した［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）との親和性において本発明者らが観測した５０倍の差は、残基１４のＣ末端の残基（例えば残基１５−２１）が受容体のＪドメインとの結合相互作用に寄与していることを示す。関連の類似体における研究では、この作用の少なくとも一部は残基１９を含むということを示唆している。

要するに、ペプチドのＮ末端においてコンホメーション的に拘束されたアミノ酸Ａｉｂを導入することによって能力の高いＰＴＨ（１−１４）類似体が得られる。Ａｉｂがαヘリックス構造を安定化させる傾向、そして、それで修飾された類似体がＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを活性化する高い能力は、ＰＴＨのＮ末端部分が、受容体の活性化ドメインと結合するとαヘリックスとなることを示す。これらの結果はまた、Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔで示されるようなＰＴＨ−１Ｒの活性化ドメインがアゴニストリガンドとの高い親和性と生産的相互作用を完全に媒介しうるということを確実なものとする。

実施例６：ＰＴＨ（１−３４）誘導体
本発明者らは、ＰＴＨ（１−３４）における１番および３番の位置のＡｉｂ置換（［Ｔｙｒ３４］ｈＰＴＨ（１−３４）アミド）が、ＣＯＳ−７細胞で発現されるＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対するｃＡＭＰ刺激能を、非修飾ＰＴＨ（１−３４）に比べて〜１００倍高めることを見出した（表５および図７Ｂ参照）。Ａｉｂ置換は、ＣＯＳ−７細胞において完全な野生型ＰＴＨ−１受容体に対するＰＴＨ（１−３４）の能力を検出可能には向上させず（表５および図７Ａ）、この結果は、極めて高レベルの完全な受容体を発現するこれらの細胞における天然型ＰＴＨ（１−３４）によって媒介される、すでに最大の応答によるものでありうる。受容体のほとんど全部のアミノ末端細胞外ドメインが欠失しているｄｅｌＮＴ受容体を伴うもの、またはおそらくは低レベルの内因性ＰＴＨ受容体を発現する動物の骨細胞における場合など、感受性の低い細胞系では、ＰＴＨ（１−３４）の能力に対するＡｉｂ−１，３置換の効果は著しい。その他、上記の修飾（例えば、Ｇｌｎ１０，ホモＡｒｇ１１，Ａｌａ１２，Ｔｒｐ１４，Ａｒｇ１９）を伴ったペプチドも同様に、ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔを発現するＣＯＳ−７細胞において、ＰＴＨ（１−３４）よりもはるかに高い能力を有する。例えば、［Ａｉｂ^１，３，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１，Ａｌａ^１２，Ｔｒｐ^１４，Ａｒｇ^１９，Ｔｙｒ^３４］ｈＰＨＴ（１−３４）のＰ１Ｒ−ｄｅｌＮｔに対するＥＣ_５０値は１．９±０．６ｎＭである。上記の修飾はまた感受性の低いその他の天然骨細胞系でもＰＴＨ（１−３４）よりもはるかに能力が高くなる。

以上、理解を明確にする目的で例示および実施例で本発明を詳細に説明したが、当業者ならば幅広い同等の条件、方式およびその他のそのパラメーターで本発明を改変および変更することで同等のものが実施できること、また、そのような改変または変更も付属のクレームの範囲内に含まれるということが明らかであろう。

以上に記載された刊行物、特許および特許出願は総て、各々個々の刊行物、、特許および特許出願が具体的かつそれぞれに引用することにより本明細書の一部とされることが示されている場合と同等に引用することにより全開示内容が本明細書の一部とされる。

ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞における修飾ＰＴＨ（１−１４）類似体のＡｉｂスキャン。ペプチド［Ａｌａ^３，１２，Ｇｌｎ^１０，Ｈａｒ^１１，Ｔｒｐ^１４］ＰＴＨ（１−１４）アミド｛［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）｝、および各残基の一つの位置に単一のＡｉｂ置換を含むそのペプチドの誘導体の、ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞において細胞内ｃＡＭＰの蓄積を刺激する能力を評価した。１−７番に置換を有するペプチドがパネルＡに示され、８−９番に置換を有するものがパネルＢに示されている。３〜１０回の二重の実験からのデータを合わせたもの（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示している。記号は凡例で定義されている。ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞におけるＰＴＨ類似体のｃＡＭＰシグナル伝達および結合特性。ＨＫＲＫ−Ｂ２８細胞において、ペプチドの、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を刺激する能力（Ａ）および^１２５Ｉ−［Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の結合を阻害する能力（Ｂ）を評価した。３回または４回の二重の実験からのデータを合わせたもの（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示している。ペプチドおよび対応する記号は凡例で示されている。Ｎ末端切断型Ｐ１Ｒを発現するＣＯＳ−７細胞におけるＰＴＨ類似体のシグナル伝達および結合特性。ＣＯＳ−７細胞を、アミノ末端細胞外ドメインの大部分を欠いている末端切断型Ｐ１ＲであるＰＩＲ−ｄｅＩＮｔで一時的にトランスフェクトした後、示されたＰＴＨ類似体の、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を刺激する能力（Ａ）；^３Ｈリン酸イノシトール（ＩＰ^１＋ＩＰ^２＋ＩＰ^３）の形成を刺激する能力（Ｂ）；および^１２５Ｉ−［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−２１）の結合を阻害する能力（Ｃ）を評価するために用いた。各曲線は、３〜６回の二重の実験からのデータを合わせたもの（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示している。^３Ｈ−リン酸イノシトール（２，９２９±８７７ｃｐｍ／ウェル）の平均基本レベルが波線で示されている。ペプチドおよび対応する記号は凡例で示されている。ＳａＯＳ−２細胞におけるＰＴＨ類似体のｃＡＭＰシグナル伝達特性。ヒト骨肉腫由来の細胞系ＳａＯＳ−２において、ペプチドＰＴＨ（１−３４）、天然型ＰＴＨ（１−１４）、［Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を刺激する能力を評価した。３回または４回の二重の実験からのデータを合わせたもの（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示している。記号は凡例で定義されている。マウス胚中足骨における骨鉱化に対するＰＴＨ類似体の効果。Ｅ１５．５マウス胚から軟骨性中足骨原基を摘出し、血清フリー培地を含む組織培養プレートに移した。４８時間サンプルにビヒクル：（Ａ）；ＰＴＨ（１−３４）（０．１μＭ）（Ｂ）；［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）（１μＭ）（Ｃ）または天然型ＰＴＨ（１−１４）（２μＭ）（Ｄ）を加えた。サンプルを外植し、３７℃で全部で６４時間インキュベートした。なお、ペプチドまたはビヒクルは１６時間目、さらに２４時間目に加えた。インキュベートが終わったところで、サンプルを固定し、切片とし、解剖顕微鏡を用いて白色光下で直接可視化した。ビヒクルおよび天然型ＰＴＨ（１−１４）で処理したサンプルでは、鉱化が骨原基の中央に黒いものとして検出できる。ＰＴＨ（１−３４）および［Ａｉｂ^１，３，Ｍ］ＰＴＨ（１−１４）の両者は鉱化を阻害した。１回の実験からのデータを示しているが、他の３回の反復実験でも匹敵する結果が得られた。円偏光二色性分光光度顕微鏡法。２０％の２，２，２−トリフルオロエタノールを含有する５０ｎＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）にて、各２０μＭの示されたＮ末端ＰＴＨオリゴペプチドのスペクトルを記録した。非Ａｉｂ含有ペプチドに比べてＡｉｂ含有ＰＴＨ類似体でより明確な、〜２０９ｎＭおよび〜２２２ｎＭでの負のスペクトル極大、および〜１９２ｎＭでの正の極大がヘリックス含有量の指標となる。野生型Ｐ１Ｒ（ｈＰ１Ｒ−ＷＴ，図７Ａ）およびＮ末端切断型Ｐ１Ｒ（ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴ，図７Ｂ）を発現するＣＯＳ−７細胞における、ｈＰＴＨ（１−３４）類似体のシグナル伝達および結合特性。ＣＯＳ−７細胞を用いて、示されたＰＴＨ類似体の細胞内ｃＡＭＰ蓄積刺激能を評価した。ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴを発現する細胞は上記と同様に調製した。ペプチドおよび対応する記号は凡例で示されている。

Claims

生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、
（ａ）Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７(配列番号１）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
（ここで、
Ｘ_０１はαヘリックス安定化残基、デスアミノＧｌｙ、デスアミノＳｅｒまたはデスアミノＡｌａであり、
Ｘ_０２はαヘリックス安定化残基、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、
Ｘ_０３はＡｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり、
Ｘ_０４はＡｒｇ、ＨａｒまたはＬｅｕであり、
Ｘ_０５はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ_０６はαヘリックス安定化残基またはＬｙｓであり、
Ｘ_０７はαヘリックス安定化残基、ＴｒｐまたはＨｉｓであり、かつ、
Ｘ_０１、Ｘ_０２、Ｘ_０５、Ｘ_０６またはＸ_０７の少なくとも１つはαヘリックス安定化残基である）
から選択される式からなる、ペプチド。
αヘリックス安定化アミノ酸が、Ａｉｂ、ＡＣＰＣ（１−アミノシクロプロピルカルボン酸）、ＤＥＧ（ジエチルグリシン）および１−アミノシクロペンタンカルボン酸からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号２）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号３）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号４）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号５）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐ（配列番号６）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号７）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号９）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１０）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
（ａ）ＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１１）、
（ｂ）アミノ酸１−１１、アミノ酸１−１２またはアミノ酸１−１３を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号８）、
（ｂ）アミノ酸１−２０、アミノ酸１−１９、アミノ酸１−１８、アミノ酸１−１７、アミノ酸１−１６またはアミノ酸１−１５を含むその断片、
（ｃ）その医薬上許容される塩、または
（ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される式からなる、ペプチド。
ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号２）である、請求項１に記載のペプチド。
デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号３）である、請求項１に記載のペプチド。
デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号４）である、請求項１に記載のペプチド。
デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号５）である、請求項１に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐ（配列番号６）である、請求項１に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号７）である、請求項１に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号８）である、請求項１２に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号９）である、請求項１に記載のペプチド。
ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１０）である、請求項１に記載のペプチド。
ＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐ（配列番号１１）である、請求項１に記載のペプチド。
標識されている、請求項１または１２に記載のペプチド。
蛍光ラベルで標識されている、請求項２３に記載のペプチド。
化学発光ラベルで標識されている、請求項２３に記載のペプチド。
生物発光ラベルで標識されている、請求項２３に記載のペプチド。
放射性ラベルで標識されている、請求項２３に記載のペプチド。
^１２５Ｉで標識されている、請求項２７に記載のペプチド。
^９９ｍＴｃで標識されている、請求項２７に記載のペプチド。
請求項１または１２に記載の生物学的に活性なペプチドと、医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効な骨量増進量の、請求項１または１２に記載の生物学的に活性なペプチドを投与することを含んでなる、方法。
骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効な骨量増進量の、請求項１または１２に記載の生物学的に活性なペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物を投与することを含んでなる、方法。
骨再形成、骨再吸収および／または骨再構築の速度を調べる方法であって、患者に有効量の請求項１または１２に記載のペプチドを投与し、患者の骨への前記ペプチドの取り込みを調べることを含んでなる、方法。
治療する病態が骨粗鬆症である、請求項３２に記載の方法。
治療する病態が老年性骨粗鬆症である、請求項３２に記載の方法。
治療する病態が閉経後骨粗鬆症である、請求項３２に記載の方法。
骨量増進に有効な前記ペプチドの量が約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日である、請求項３２に記載の方法。
投与方法が非経口である、請求項３２に記載の方法。
投与方法が皮下である、請求項３２に記載の方法。
投与方法が鼻腔通気である、請求項３２に記載の方法。
ペプチドが固相合成により合成される、請求項１または１２に記載のペプチドの製造方法。
ペプチドがＦＭＯＣにより保護される、請求項１または１２に記載のペプチドの製造方法。
αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂである、請求項２に記載のペプチド。
生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、
（ａ）Ｘ_０１ＶａｌＸ_０２ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＸ_０３ＨｉｓＸ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８ＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号１９）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
（ここで、
Ｘ_０１はαヘリックス安定化残基、デスアミノＧｌｙ、デスアミノＳｅｒまたはデスアミノＡｌａであり、
Ｘ_０２はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘ_０３はＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｘ_０４はＡｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり、
Ｘ_０５はＡｒｇ、ＨａｒまたはＬｅｕであり、
Ｘ_０６はαヘリックス安定化残基、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ_０７はαヘリックス安定化残基またはＬｙｓであり、
Ｘ_０８はαヘリックス安定化残基、ＴｒｐまたはＨｉｓであり、
Ｘ_０９はＡｌａまたはＡｓｎであり、
Ｘ_１０はＭｅｔまたはＶａｌであり、
Ｘ_１１はＡｒｇまたはＧｌｕであり、
Ｘ_１２はＭｅｔまたはＶａｌであり、
Ｘ_１３はＧｌｎまたはＧｌｕであり、
Ｘ_１４はＴｙｒまたはＰｈｅであり、かつ、
Ｘ_０１、Ｘ_０２、Ｘ_０６、Ｘ_０７またはＸ_０８の少なくとも１つはαヘリックス安定化残基である）
から選択される式からなる、ペプチド。
αヘリックス安定化アミノ酸が、Ａｉｂ、ＡＣＰＣ（１−アミノシクロプロピルカルボン酸）、ＤＥＧ（ジエチルグリシン）および１−アミノシクロペンタンカルボン酸からなる群から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２０）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２１）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２２）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２３）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２４）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２５）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２６）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２７）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
（ａ）ＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２８）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
から選択される、請求項４４に記載のペプチド。
生物学的に活性なペプチドであって、本質的に、
（ａ）ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２９）、
（ｂ）その医薬上許容される塩、または
（ｃ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体
（ここで、
Ｘ_１２はＭｅｔまたはＶａｌであり、
Ｘ_１３はＧｌｎまたはＧｌｕであり、かつ、
Ｘ_１４はＴｙｒまたはＰｈｅである）
から選択される式からなる、ペプチド。
ＡｉｂＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２０）である、請求項４４に記載のペプチド。
デスアミノＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２１）である、請求項４４に記載のペプチド。
デスアミノＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２２）である、請求項４４に記載のペプチド。
デスアミノＧｌｙＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２３）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２４）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２５）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２６）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＡｌａＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２７）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＳｅｒＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＧｌｎＨａｒＡｌａＬｙｓＴｒｐＬｅｕＸ_０９ＳｅｒＸ_１０Ｘ_１１ＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２８）である、請求項４４に記載のペプチド。
ＡｉｂＶａｌＡｉｂＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＮｌｅＨｉｓＧｌｎＨａｒＧｌｙＬｙｓＴｒｐＬｅｕＡｌａＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｒｇＸ_１２Ｘ_１３ＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓＡｓｎＸ_１４（配列番号２９）である、請求項５５に記載のペプチド。
標識されている、請求項４４または５５に記載のペプチド。
蛍光ラベルで標識されている、請求項６６に記載のペプチド。
化学発光ラベルで標識されている、請求項６６に記載のペプチド。
生物発光ラベルで標識されている、請求項６６に記載のペプチド。
放射性ラベルで標識されている、請求項６６に記載のペプチド。
^１２５Ｉで標識されている、請求項７０に記載のペプチド。
^９９ｍＴｃで標識されている、請求項７０に記載のペプチド。
請求項４４または５５に記載の生物学的に活性なペプチドと、医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効な骨量増進量の、請求項４４または５５に記載の生物学的に活性なペプチドを投与することを含んでなる、方法。
骨量の減少を特徴とする哺乳動物の病態を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効な骨量増進量の、請求項４４または５５に記載の生物学的に活性なペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物を投与することを含んでなる、方法。
骨再形成、骨再吸収および／または骨再構築の速度を調べる方法であって、患者に有効量の請求項４４または５５に記載のペプチドを投与し、患者の骨への前記ペプチドの取り込みを調べることを含んでなる、方法。
治療する病態が骨粗鬆症である、請求項７５に記載の方法。
治療する病態が老年性骨粗鬆症である、請求項７５に記載の方法。
治療する病態が閉経後骨粗鬆症である、請求項７５に記載の方法。
骨量増進に有効な前記ペプチドの量が約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日である、請求項７５に記載の方法。
投与方法が非経口である、請求項７５に記載の方法。
投与方法が皮下である、請求項７５に記載の方法。
投与方法が鼻腔通気である、請求項７５に記載の方法。
ペプチドが固相合成により合成される、請求項４４または５５に記載のペプチドの製造方法。
ペプチドがＦＭＯＣにより保護される、請求項４４または５５に記載のペプチドの製造方法。
αヘリックス安定化アミノ酸がＡｉｂである、請求項４５に記載のペプチド。