KR102048464B1 - 라미닌 및 카데린를 포함하는 세포 배양 기질 - Google Patents

라미닌 및 카데린를 포함하는 세포 배양 기질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 라미닌-521, 재조합 라미닌-521을 제조하기 위한 방법, 재조합 라미닌-521을 발현하는 숙주 세포, 및 라미닌-521을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 라미닌-521은 줄기 세포 생체 외 전분화능을 유지할 수 있고, 자가-재생을 가능하게 하며, 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 생존을 가능하게 한다. 다능성 인간 배아 줄기 세포는 분화 억제제 또는 지지 세포의 부재하에서, 재조합 라미닌-521 (라미닌-11)로 코팅된 플레이트 상에서 배양되고, 상기 배아 줄기 세포는 증식하고 이들의 전분화능을 유지한다. 상기 인간 재조합 라미닌-521 (라미닌11)은 단일 세포 현탁액으로 완전한 해리 후 줄기 세포의 단일 세포 생존을 제공한다. 많아야 3.9 ng/ml의 베타 섬유아세포 성장인자 (bFGF)를 함유하는 유용한 세포 배양 배지는 또한 본 명세서에 기재된다.

Description

라미닌 및 카데린를 포함하는 세포 배양 기질 {Cell culture substrate comprising a laminin and a cadherin}
본 출원은 2011년 9월 22일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/537,940호; 2011년 11월 30일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/565,380호; 2011년 12월 1일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/565,849호; 2012년 4월 16일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/624,588호; 2012년 4월 17일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/625,321호의 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 전체적인 내용은 참조로서 본 발명에 모두 포함된다.
본 출원은 세포 생물학, 세포 분화, 세포 치료, 분자 생물학, 단백질, 재조합 인간 단백질, 핵산, 및 라미닌에 관한 것이다.
기저판 (Basal laminae) (기저막 (basement membranes))은 세포 성장, 세포 분화 (cellular differentiation), 세포 표현형 유지 (cell phenotype maintenance), 조직 발생 (tissue development), 및 조직 유지 (tissue maintenance)에서 중심 역할을 하는, 시트-같은, 세포-관련 세포외 매트릭스 (extracellular matrices)이다. 이들은 거의 모든 조직에 존재하고, 배아 발생 (embryonic development)의 초기 단계에서 나타난다.
기저판은 다양한 구조 (architectural) 및 세포-상호작용 기능의 중심이다. 예를 들어:
1. 이들은 세포에 대한 접착성 기층 (adhesive substrata)을 제공하는, 조직에 대한 구조적 지지체를 제공한다.
2. 이들은 세포의 이주를 지연시키고, 거대분자 (macromolecules)의 교환을 수동적으로 조절하는 조직 구획 (tissue compartment) 사이에 선택투과성 배리어 (perm-selective barrier)를 생성시킨다. 이들 특성은, 대부분 단백질 및 세포에 대해 투과가능하지 않는 효과적인 혈액-조직 배리어를 생성하는, 중요한 여과 구조로서 기능하는, 신장 사구체 (kidney glomerular) 기저막에 의해 설명된다.
3. 기저판은 배아발생 (embryogenesis) 및 상처 회복 (wound repair) 동안 세포 이주 (cell migration) 및 세포 신장 (cell elongation)을 촉진할 수 있는 고도의 상호작용성 표면을 생성한다. 부상 이후에, 이들은 세포가 정상 조직 기능을 회복하도록 재생시키는 표면을 제공한다.
4. 기저판은 세포의 분화, 세포사멸 (apoptosis)의 방지, 및 조직 유지에 대해 중요한 세포를 접촉시키는 이들의 구조에서 엔코드된 정보를 제공한다. 이러한 정보는 인테그린 (integrins), 디스트로글리칸 (dystroglycan), 및 세포 표면 프로테오글리칸 (proteoglycans)을 포함하는 다양한 수용체를 통해 세포와 소통된다. 신호는 충분한 친화도로 상호작용하는 매트릭스 리간드 및 상응하는 수용체의 존재뿐만 아니라, 삼-차원 매트릭스 "랜드스케이프 (landscape)"에서 리간드 밀도와 같은 지형학적 요인 및 클러스터 수용체에 대한 기저판 성분의 능력에 의존한다. 이들 매트릭스 단백질은 긴-수명을 갖기 때문에, 기저판은 거주 (resident) 및 일시적 세포 (transient cells)에 대한 기저판에서 "표면 기억 (surface memory)"을 생성한다.
상기 기저판은 복합 중합체성 구조로 차례로 체계화된 라미닌 및 타입 IV 콜라겐 이종삼량체 (heterotrimer)로 주로 구성된다. 부가적인 성분은 아그린 (agrin) 및 페레칸 (perlecan) 및 니도젠 (nidogen) (엔탁틴 (entactins))과 같은 프로테오글리칸을 포함한다. 현재까지, 여섯 개의 타입 IV 콜라겐 폴리펩타이드 사슬 및 적어도 12개의 라미닌 서브 유닛 사슬은 확인되었다. 이들 사슬은 공유된 특유의 기능을 소유하고, 특별한 시간적 (발생) 및 공간적 (조직-부위 특이) 패턴으로 표시된다.
라미닌은 기저판에 주로 거주하는 이종삼량체성 (heterotrimeric) 당단백질의 계열 (family)이다. 이들은 일 측면에 이웃하는 세포 수용체와 결합 상호작용을 통해, 그리고 다른 라미닌 분자 또는 콜라겐, 니도젠, 또는 프로테글리칸과 같은 다른 매트릭스 단백질에 결합에 의해 기능한다. 상기 라미닌 분자는 또한 세포내 거동 및 기능에 강하게 영향을 미칠 수 있는 중요한 신호 분자이다. 라미닌은 세포 성장을 촉진하고, 조직 손상 및 발생에서 분화뿐만 아니라, 세포/조직 표현형을 모두 유지하는데 중요하다.
라미닌은 보통 구조적 조직을 갖는, 큰, 다중-도메인 단백질 (multi-domain protein)이다. 상기 라미닌 분자는 한 분자에 다양한 매트릭스 및 세포 상호작용 기능을 통합한다.
라미닌 단백질 분자는 코일-코일 도메인 (coiled-coil domain)을 통해 삼량체에서 모두 서로 결합된, 하나의 α-사슬 서브유닛, 하나의 β-사슬 서브유닛, 및 하나의 γ-사슬 서브유닛을 포함한다. 도 1은 상기 라미닌 분자의 최종 구조를 나타낸다. 12개의 알려진 라미닌 서브유닛 사슬은 천연 조직 (native tissue)에서 적어도 15 삼량체의 라미닌 타입을 형성할 수 있다. 삼량체의 라미닌 구조 내에는 다른 라미닌 및 기저판 분자, 및 막-결합 수용체 (membrane-bound receptor) 쪽으로 결합 활성을 소유하는 인식가능한 도메인이 있다. 도 2는 개별적인 세 개의 라미닌 사슬 서브 유닛을 나타낸다. 예를 들어, 도메인 VI, IVb, 및 IVa는 구형 구조 (globular structure)를 형성하고, (시스테인-풍부 EGF-형 원소를 함유하는) 도메인 V, IIIb, 및 IIIa는 막대-형 구조를 형성한다. 세 개의 사슬의 도메인 I 및 II는 삼중-가닥 코일-코일 구조 (긴 팔)의 형성에 참여한다.
인간 조직에서 적어도 15 개의 다른 조합에서 발견된 다섯 개의 다른 알파 사슬, 세 개의 베타 사슬 및 세 개의 감마 사슬은 존재한다. 이들 분자는 이들의 역사적 발견에 기초하여 라미닌-1 내지 라미닌-15로 명명되지만, 선택적인 명명법은 이들의 사슬 조성, 예를 들어, 알파-1, 베타-1 및 감마-1 사슬을 함유하는 라미닌-111 (라미닌-1)에 기초한 동형단백질 (isoform)을 묘사한다. 라미닌의 네 개의 구조적으로 규명된 계열 그룹은 확인되었다. 다섯 개의 확인된 라미닌 분자의 제1 그룹은 β1 및 γ1 사슬을 공유하고, 이들의 α-사슬 조성 (α1 내지 α5 사슬)에 의해 변화한다. 라미닌-521을 포함하는, 다섯 개의 확인된 라미닌 분자의 제2 그룹은 모두 β2 및 γ1 사슬을 공유하고, 다시 이들의 α-사슬 조성에 의해 다시 변화한다. 확인된 라미닌 분자의 제3 그룹은 α3β3γ2의 사슬 조성으로, 하나의 확인된 일원 (identified member), 라미닌-332을 갖는다. 확인된 라미닌 분자의 제4 그룹은 새롭게 확인된 γ3 사슬 (α2β1γ3)을 갖는, 하나의 확인된 일원, 라미닌-213을 갖는다.
다른 라미닌 사슬이 없는 분리된 라미닌-521의 보고된바는 없었다. 지금까지, 라미닌-521의 기능에 대한 연구는 없다. 라미닌 사슬 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 공급원으로부터 라미닌-521을 정제하기 위한 시도는, 예를 들어, 라미닌-411 및 라미닌-511의 성분인, 라미닌 β1 사슬을 제거하는 것을 성공하지 못했다. 라미닌-521 (aka LN-521)를 함유하는 조성물 및 라미닌-521을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것은 바람직할 수 있다.
인간 배아 줄기 (hES) 세포는 척수 (spinal cord) 및 심장 손상 (cardiac injuries), 타입 I 당뇨병 및 파킨슨 병과 같은 신경퇴행성질환 (neurodegenerative) 과 같은, 다양한 질병에 대한 재생 의료 (regenerative medicine)의 발전을 보장할 수 있다. 줄기 세포는 특성화된 세포가 나중에 유래되는 분화되지 않는 세포이다. 배아 줄기 세포는 모든 세 개의 배엽 (germ layers)의 세포로 분화되는 잠재력을 가진 광범위한 자가-재생력 (self-renewal capacity) 및 다능성 (pluripotency)을 갖는다. 이들은 치료학적 목적을 위해 유용하고, 조직 대체 요법 (tissue replacement therapies), 약물 스크린 (drug screening), 기능적 게놈 (genomics) 및 프로테옴 (proteomics)에 대한 세포의 비제한된 공급원을 제공할 수 있다.
재생 의료에 대한 줄기 세포 유래된 세포의 발생에 대한 전제조건은 이종-없는 (xeno-free) 세포 배양 시스템뿐만 아니라, 다능성 (pluripotent) 줄기 세포의 장기간 배양, 화학적으로 규명되고 반복가능한 분화 프로토콜을 허용하는 방법이다. 그러나, 다능성 인간 배아 줄기 세포 (hES 세포) 및 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPS 세포)의 배양은 다수의 문제점에 마주친다. 하나의 주요 문제점은 hES 세포가 세포 증식 (cell propagation)에 대해 수동으로 분열하는데 필요한 클러스터 (clusters)에서 느리게 성장한다는 것이다. 세포의 해리 (Dissociation)는 일반적으로 광범위한 세포 사멸을 유도하고, 완전한 해리 후 hES 세포의 클로닝 효율 (cloning efficiency)은 ≤1 %이다.
다능성 hES 세포의 유지는 면역성 (immunogenic) 및 독성 (toxic)일 수 있고, 실험의 신뢰성을 감소시키는 광범위한 배치 대 배치 가변성 (batch variability)을 발생시키는, 쥐 종양 유래된 마트리겔 (Matrigel) 또는 세포아종 지지 세포층 (fibroblast feeder cell layer)과 유사한 세포외 매트릭스 단백질 혼합물과 같은, 복합 배양 기층이 요구한다. 지금까지, hES 세포 배양에 대해 사용된 가장 성공적인 지지세포 없는 기질 (substrate)은 마트리겔이고, 복합 종양 및 BM-유사 추출물은 쥐의 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 육종 종양 조직 (sarcoma tumor tissue)으로부터 얻어진다. 마트리겔은 주로 쥐의 LN-111, 타입 IV 콜라겐, 페레칸, 및 니도젠을 함유하지만, 또한 성장 인자 및 세포내 단백질을 포함하는, 다른 물질의 양을 변화시키고, 따라서, 이의 조성은 배치-대-배치 (batch-to-batch)로부터 한정되지 않고 변화된다. 이러한 가변성은 과학적 결과의 재생불가능을 유발할 수 있고, 기질의 동물 기원에 기인하여 인간 세포 치료를 위한 hES 세포의 확장 (expansion) 및 유지에 대한 허용가능하지 않은 마트리겔을 만든다.
그러나, hES 및 hiPS 세포의 자가-재생을 지지하는 다소 한정된 코팅 물질의 성공적 개발은 최근에 보고되었다. 재조합 비트로넥틴 (vitronectin)은 hES 세포의 자가-재생 및 접착을 지지하는 것으로 보고되었다. 여러 ECM 단백질로부터 다양한 펩타이드를 함유하는 아크릴레이트 코팅은 이전에 개발되었고, 합성 메타아크릴레이트-계 중합체는 또한 hES 세포의 자가-재생 및 접착을 촉진시키는 것으로 나타났다.
hES 세포의 대규모 증식 (large-scale propagation)에 대한 주 문제점의 하나는 이들이 단일 세포 현탁액으로 해리 후 재도말 (replating)에 열악한 생존이다. 이것은, 차례로, 지루한 계대배양 (passaging) 및 불가능한 대규모 자동 확장 (automated expansion)을 만든다. 그러나, 로-키나제 (rho-kinase) (ROCK) 억제제10 또는 블레비스테틴11 (blebbistatin)의 존재하에서 트립신 처리를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 방출된 hES 세포는 단일 클론으로부터 도말 및 확장될 수 있지만, 상기 분자는 천연 줄기 세포 니치 (niche)의 성분이 아니고, 이들은 액틴 세포골격 (actin cytoskeleton)에 영향을 미치고, 따라서 세포 손상을 유발할 수 있다. 따라서, ROCK 억제제의 사용은 세포 치료 목적을 향해 나아가는 hES 세포의 장기간 확장에 대한 바람직한 해법은 아니다.
재생 의료의 목적을 위하여, 화학적으로 규명된, 이종-없고 (xeno-free), 병원체-없는 (pathogen-free), 안정한 배치-대-배치 조건하에서 다능성 줄기 세포의 파생물 (derivation) 및 장기간 배양을 허용하는 방법을 개발하는 것에 대한 요구가 있다. 게다가, 이러한 방법은 단기간에 다능성 hES/hiPS 세포의 대량으로 획득하기 위한 빠르고, 경제적으로 효과적인 규모 확대를 허용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 또한 세포에서 세포 분류 또는 유전자 녹-아웃 (knock-out)을 포함하는 과학적 및 임상적 적용을 촉진할 수 있는, 세포 사멸의 합성 억제제를 함유하지 않는 배지에서 인간 ES 세포의 클론 생존을 허용할 수 있다.
본 발명은 분리된 라미닌-521 (또한 LN-521 또는 라미닌-11로 알려짐) 및 분리된 라미닌-521을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 라미닌-521 사슬을 발현하고, 재조합 라미닌-521을 분비하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 인간 세포 치료를 위한 세포를 개발하는 목적을 위하여 유지 및 분화를 위한 세포를 배양하는 GMP 품질 라미닌-521를 제공한다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 (carrier)와 함께 분리된 라미닌-521을 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 다른 세포외 매트릭스 성분과 함께 선택적으로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 사용을 위해 분리된 라미닌-521의 양을 효과적으로 발생시키기 위한 방법을 제공한다. 이들 사용의 바람직한 구현 예에 있어서, 재조합 라미닌-521은 사용된다. 분리된 라미닌-521의 양, 또는 원하는 효과에 대한 효과적인, 이의 약학적 조성물, 및 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트는, 또한 개시된다.
본 발명은 세포 동질성, 세포 배양 플레이트로부터 줄기세포의 제거 또는 단일 세포 현탁액에 다른 세포 지지체를 촉진시키는, 단층 (monolayer) 배양에서 줄기 세포를 배양하는 단계, 및 이러한 세포의 대규모 생산 및 줄기 세포 배양의 확장이 가능한 의미 있는 희석에서 계대배양 및 확장을 위한 단일 세포 현탁액에서 줄기 세포 재도말시키는 단계를 위한 방법을 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 단층 배양에서 라미닌-521 상에 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계, 단일 세포 현탁액에서 다른 세포를 지지하는 물질과 함께 도말된 세포 배양으로부터 줄기 세포를 제거하는 단계, 및 라미닌-521을 함유하는 매트릭스 상에 단일 세포로서 단일 세포 현탁액으로부터 줄기 세포를 재도말하는 단계를 기술하며, 이러한 공정은 고효율로 자동화된 로봇 시스템에서 수행될 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 개선된 의료 장비 및 이식을 제공하고, 여기서 개선은 효과적인 양의 분리된 라미닌-521로 이식 및 의료 장비를 제공하는 단계를 포함한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 개선된 세포 배양 장치, 세포 부착, 및 뒤이은 세포 정체 (stasis), 증식, 분화 및/또는 이주를 위한 세포 배양 장치로 효과적인 양의 분리된 라미닌-521을 제공하여, 개선된 세포 배양 장치의 제조방법, 배양에서 세포의 표현형의 성장 및 유지를 위한 방법을 제공한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 인간 재조합 라미닌-521과 같은, 조성물, 및 분화되지 않은 상태에서 생체외에서 인간 배아 줄기 세포의 빠른 확장 및 배양을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 배양 줄기 세포의 단일 세포 해리 및 어떤 Rho-연관된 키나제 (ROCK) 억제제가 없는 (예를 들어, Y-27632 없는) 배지에서 라미닌-521 코팅된 세포 배양 접시 상에 이들을 도말시키는 단계를 포함한다 (Watanabe et al., Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007)). 상기 개선은 종래의 인간 배아 줄기 세포 배양에서 보다 더 빠른 다능성 상태에서 인간 배아 줄기 세포를 확장하기 위한 가능성을 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 단일 세포 현탁액에 해리 후 인간 배아 세포 생존을 허용하는, 인간 재조합 라미닌-521과 같은, 새로운 물질을 제공한다. 상기 개선은, (예를 들어, 유전자 조작 후) 클론을 분리시키는 단계 또는 균일 및 균질한 인간 배아 줄기 세포 군을 얻는 단계에 대해 장점이 있을 수 있는, 인간 배아 줄기 세포의 더 나은 클론 생존을 제공한다.
몇몇 구현 예에서, 본 발명은: SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 알파 사슬; SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 베타 사슬; 및 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 감마 사슬;을 포함하고; 여기서 알파, 베타, 및 감마 사슬이 재조합 라미닌-521로 조립되는, 분리된 재조합 라미닌-521이다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 알파 사슬 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 상기 베타 사슬 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 상기 감마 사슬 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다.
다른 구현 예에 있어서, 상기 알파 사슬은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 더군다나, 상기 베타 사슬은 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 좀더 구체적으로, 상기 감마 사슬은 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.
상기 베타 사슬 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 가질 수 있다. 상기 베타 사슬 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 가질 수 있다.
또한 구현 예에 개시된 것은 a) 청구항 1의 분리된 재조합 라미닌-521; 및 b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물이다.
또한 구현 예에 개시된 것은 성장 배지 및 그 위에 코팅을 포함하는, 생체외에서 성장된 다능성 줄기 세포의 자가-재생을 가능하게 하는 조성물이고, 상기 코팅은 재조합 라미닌 521 (라미닌-11)을 포함한다.
상기 조성물은 또한 성장 인자를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 어떠한 분화 억제제도 없을 수 있다. 상기 조성물은 또한 어떠한 지지 세포도 없을 수 있다. 상기 조성물은 또한 어떠한 분화 유도자 (inductor)도 없을 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 어떠한 분화 억제제, 지지 세포, 및 분화 유도자도 없다.
또한 구현 예에 개시된 것은 성장 배지 및 그 위에 코팅 (재조합 라미닌 521 (라미닌-11)을 포함하는 코팅)을 포함하는 기질을 제공하는 단계; 단일 세포 현탁액에 다능성 줄기 세포를 해리시키는 단계; 및 상기 코팅 상에 단일 세포 현탁액에서 다능성 줄기 세포를 놓는 단계를 포함하는, 생체 외에서 다능성 줄기 세포의 전분화능 (pluripotency)을 유지시키기 위한 방법이다.
상기 성장 배지는 성장 인자 또는 성장 인자들을 포함할 수 있다. 대표적인 성장 인자는 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor) 및 인슐린 성장 인자를 포함한다.
때때로, 상기 성장 배지 및 코팅은 어떠한 분화 억제제도 없다. 예를 들어, 백혈병 억제제 인자 (leukemia inhibitor factor)는 존재하지 않는다.
상기 조성물은 쥐의 섬유아세포 또는 인간 포피 (foreskin) 섬유아세포와 같은, 어떤 지지 세포가 없을 수 있다. 상기 조성물은 노긴 (Noggin) 또는 케라티노사이트 (keratinocyte) 성장 인자와 같은, 어떤 분화 유도자가 없을 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 어떠한 분화 억제제, 지지 세포, 및 분화 유도자도 없다.
상기 다능성 줄기 세포는 단층으로 라미닌-521 코팅 상에 놓일 수 있다.
상기 다능성 줄기 세포는 200 cells / ㎟ 이하의 밀도에서 코팅 상에 놓일 수 있다. 선택적으로, 상기 다능성 줄기 세포는 200 cells / ㎟ 이상의 밀도에서 코팅 상에 놓일 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 두 개의 줄기세포가 서로 접촉하지 않도록 코팅 상에 선택적으로 놓일 수 있다.
또한 구현 예에서 개시된 것은: 재조합 라미닌-521을 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 여기서 상기 재조합 라미닌-521은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 사슬, SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제2 사슬, 및 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제3 사슬을 포함하고, 여기서 상기 제1 , 제2, 및 제3 사슬은 재조합 라미닌-521에 조립되고; 상기 재조합 라미닌-521 사슬의 발현을 자극하는 조건 하에서 세포 배양 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계; 컬럼을 통해 상기 숙주 세포 배양 배지를 통과시키는 단계, 여기서 상기 컬럼은 상기 재조합 라미닌-521에 결합된 화합물을 함유하고; 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 상기 컬럼으로부터 결합된 재조합 라미닌-521을 용출시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 분리된 재조합 라미닌-521이다.
다른 구현 예에 개시된 것은: 그 위에 완전한 라미닌을 함유하는 코팅을 갖는 기질을 수용하는 단계; 상기 기질 상에 세포 배양 배지 및 다능성 줄기 세포를 놓는 단계; 및 PI3-키나제/Akt 경로를 활성화시키는 단계를 포함하는, 생체 외에서 다능성 줄기 세포의 전분화능을 유지시키는 방법이다.
상기 완전한 라미닌은 라미닌-521 또는 라미닌-511일 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 베타 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)과 같은, 어떤 성장 인자를 함유하지 않는다. 상기 코팅은 또한 카데린 (cadherin)을 함유할 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 200 cells / ㎟ 이하의 밀도에서 상기 코팅 상에 놓일 수 있다.
본 발명은 또한 다능성 상태에서 줄기 세포를 유지하기 위해 사용될 수 있는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 다양한 구현 예에 개시된 것은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)의 0 초과 내지 3.9 ng/mL를 포함하는, 다능성 줄기 세포에 대해 영양을 제공하는 세포 배양 배지이다.
상기 세포 배양 배지는 0.5 내지 3.5 ng/mL의 bFGF를 포함하는, 3.5 ng/mL 이하의 bFGF를 포함할 수 있다.
상기 세포 배양 배지는 적어도 하나의 무기 염, 적어도 하나의 미량의 무기물, 적어도 하나의 에너지 기질, 적어도 하나의 지질, 적어도 하나의 아미노산, 적어도 하나의 비타민, 또는 적어도 하나의 부가적 성장인자를 더욱 포함할 수 있다. 특별한 구현 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 적어도 하나의 무기염, 적어도 하나의 미량 무기물, 적어도 하나의 에너지 기질, 적어도 하나의 지질, 적어도 하나의 아미노산, 및 적어도 하나의 비타민을 더욱 포함한다.
상기 세포 배양 배지는 (1) 알부민, (2) 인슐린 또는 인슐린 대체물 (insulin substitute), 또는 (3) 트랜스페린 (transferrin) 또는 트랜스페린 대체물 중 어떤 하나를 함유하지 않을 수 있다.
상기 세포 배양 배지는 알부민, 인슐린, 염화 리튬 (lithium chloride), GABA, TGF 베타 1, 피페콜린산 (pipecolic acid), L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 및 DMEM/F12 용액을 더욱 포함할 수 있다.
상기 세포 배양 배지는 적어도 하나의 부가적인 성장 인자, 적어도 하나의 미량 무기물, 및 적어도 하나의 지질을 더욱 포함할 수 있다.
또한 개시된 것은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)의 0 초과 내지 3.9 ng/mL를 포함하는 세포 배양 배지; 및 줄기 세포에 대한 지지체를 제공하기 위한 기질을 포함하는 다능성 줄기 세포를 유지하기 위한 시스템이다.
상기 기질은 라미닌-521 또는 라미닌-511을 함유할 수 있다. 상기 기질은 또한 카데린을 함유할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 비-제한 특징은 하기에 더욱 상세하게 기술하였다.
본 특허 또는 출원은 색상으로 수행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개 사본은 요구시 사무실에 의해 제공되며, 필요한 요금은 지불될 것이다.
다음은 도면의 간단한 설명으로, 이는 본 명세서에 개시된 대표적인 구현 예를 설명하고자 하는 목적을 위한 것이지 제한을 목적으로 하지 않는다.
도 1은 재조합 라미닌 분자의 회전 음영 전자 현미경 사진 (rotary shadowing electron microscopy picture)이다.
도 2는 라미닌 α, β, 및 γ 사슬의 구조적 모티브 (motif)를 나타낸다. N-말단, 내부 (internal), 및 C-말단 구형 도메인 (globular domain)은 흰색 타원으로 묘사된다. 코일-코일 형성 도메인 (I 및 II)은 흰색 직사각형으로 나타낸다. 막대-유사 구조 (도메인 V, IIIb, 및 IlIa)은 회색 직사각형으로 묘사된다.
도 3은 SDS-PAGE을 사용하여 인간 재조합 라미닌-521의 특징의 결과를 나타낸다. 재조합 라미닌-521의 면역블럿 (immunoblot)은 (ox로 표지된) 비-환원 및 (red로 표지된) 환원 조건 하에서 만들어진다. 3-8% 겔 상의 단백질은 라미닌 α5 (2F7), β2 (MAB2066), β1 (MAB1921) 및 γ1 (H-19)에 대한 항체로 염색을 수반하는 PVDF 막 상에 전달된다.
도 4 및 5는 배양에서 하루 후, 마트리겔 (Mg), 쥐 라미닌-111 (mLN111), 인간 재조합-라미닌-511 (r-라미닌-511 또는 r-LN-511), 인간 재조합-라미닌-521 (r-라미닌-521 또는 r-LN-521), 또는 r-라미닌-511 및 r-라미닌-521의 혼합물 (mix)에 코팅된 접시에 접착한 인간 ES 세포의 크리스탈 바이올렛 염색 (Crystal Violet staining)을 나타낸다. 모든 도면은 5x 배율이다. 도 4에 있어서, 상기 세포는 ROCK 억제제 없이 배양된다. 도 5에 있어서, 상기 세포는 ROCK 억제제 Y-27632로 배양된다.
도 6은 ROCK 억제제가 없는 배양에서 한 시간 후 코팅된 접시에 (LN521로 표지된) 인간 r-라미닌-521, 인간 r-라미닌-511 (LN511), 및 마트리겔 (Mg)에 인간 ES 세포의 접착을 나타내는 그래프이다. 오차 바는 측정의 표준 오차를 나타낸다 (n=3).
도 7은 배양에서 하루 후 및 ROCK 억제제가 없는, 마트리겔 (Mg), 쥐 라미닌-111 (mLN111), 인간 r-라미닌-511 (LN-511), 인간 r-라미닌-521 (LN-521), 또는 r-라미닌-511 및 r-라미닌-521의 혼합물 (mix)에 코팅된 접시에 인간 ES 세포의 접착을 나타내는 그래프이다. 또한 배양에서 하루 후, ROCK 억제제 및 마트리겔 (In&Mg), 쥐 라미닌-111 (In&mLN111), 인간 r-라미닌-511 (In&LN511), 인간 r-라미닌-521 (In&LN521), 또는 r-라미닌-511 및 r-라미닌-521의 혼합물 (In&mix)을 갖는 접시에 대한 결과를 포함한다. 모든 실험을 위한 세포는 동일한 세포 배양 접시 상에 동일한 밀도에서 도말된다. 오차 바는 측정의 표준 오차를 나타낸다 (n=3).
도 8은 단일 세포 해리 계대배양을 사용하여 r-라미닌-521 (LN-521_1 및 LN-521_2)상에 배양된 인간 ES 세포 및 작은 덩어리 (small clumps)에서 계대배양을 사용하여 마트리겔 (Mg_1 및 Mg_2)상에 배양된 인간 ES 세포에 대한 성장 곡선을 나타낸다. 후자 세포는 Rodin et al., Nature Biotechnol ., vol. 28, pp. 611-615 (2010)에 기술된 바와 같이 계대배양된다.
도 9는 전분화능의 마커인, OCT4에 대한 r-라미닌-521 상에 몇몇 단일 세포 해리 계대배양 후 인간 ES 세포의 FACS 분석이다. 양성 세포의 퍼센트는 괄호안에 기재된다.
도 10은 OCT4에 대한 작은 덩어리에서 분열하는 것을 사용하여 마트리겔 상에 몇몇 계대배양 후 인간 ES 세포의 FACS 분석이다. 양성 세포의 퍼센트는 괄호안에 기재된다.
도 11은 몇몇의 단일 세포 해리 계대배양 후 인간 r-라미닌-521 (LN521) 상에 배양된 인간 ES 세포 및 덩어리의 세포의 몇몇 계대배양 후 마트리겔 (Mg) 상에 배양된 세포에서 전분화능 마커 Oct4 및 Nanog의 mRNA 전사 (transcript)의 수와 비교하는데 사용된 실-시간 정량의 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸다. 오차 바는 95% 신뢰구간 (confidence interval)을 나타낸다.
도 12는 도말 후 한 시간 동안 마트리겔 (Mg), LN-111, LN-511, 및 LN-521 상에 성장된 줄기 세포에서 인산화 미오신 경쇄 (phosphorylated myosin light chain) (P-MLC)의 수준을 비교하는 웨스턴 블럿 (Western blot)이다.
도 13은 도말 여섯 시간 후 마트리겔 (Mg), LN-111, LN-511, 및 LN-521 상에 성장된 줄기 세포에서 인산화 미오신 경쇄 (P-MLC)의 수준을 비교하는 웨스턴 블럿이다.
도 14는 도말 후 5 및 7 시간 사이에서 마트리겔 (Mg), LN-111, LN-511, 및 LN-521상에 성장된 인간 배아 줄기 세포의 상대적 이주를 비교하는 그래프이다.
도 15는 적용된 IgG 및 IgM 차단 항체 (IgGM) 및 적용된 인테그린 β1 (b1)에 대한 기능 차단 항체로 LN-521 상에 성장된 인간 배아 줄기 세포의 상대적 이주를 비교하는 그래프이다. 이것은 인테그린 차단이 상당하게 감소된 운동성 (motility)을 나타낸다.
도 16은 물, DMSO, LY294002 (Akt 억제제), 보르트만닌 (wortmannin) (PI3K/Akt 억제제), 및 PD 98059 (MEK1 억제제)의 존재하에서 LN-521 상에 hES 세포의 상대적 생존을 비교하는 그래프이다. 이것은 PI3K/Akt의 활성이 LN-521 상에 hEScell 생존에 대해 필수적인 것을 나타낸다. 상기 배지는 bFGF를 함유한다.
도 17은 DMSO, LY294002 (Akt 억제제), 및 PD 98059 (MEK1 억제제)의 존재하에서 LN-521 상에 hES 세포의 상대적 생존을 비교하는 그래프이다. 외인성 bFGF은 존재하지 않는다.
도 18은 대조구 세포 (DMSO)에 대해 LY 294002로 처리된 세포 및 LN-521 상의 도말 한 시간 후 수집된 세포를 비교하는 웨스턴 블럿이다.
도 19는 대조구 세포 (DMSO)에 대해 PD98059로 처리된 세포 및 LN-521 상의 도말 한 시간 후 수집된 세포를 비교하는 웨스턴 블럿이다.
도 20은 ELISA를 사용하여 얻어진, 마트리겔 (Mg), LN-111, LN-511, 또는 LN-521 상에 도말 한 시간 후 수집된 세포 용해물 (lysates)상에 Akt2 인산화 (phosphorylation)의 상대적 수준을 나타내는 그래프이다.
도 21은 ELISA를 사용하여 얻어진, 마트리겔 (Mg), LN-111, LN-511, 또는 LN-521상에 도말 한 시간 후 수집된 세포 용해물 상에 Akt1 인산화의 상대적인 수준을 나타내는 그래프이다.
도 22는 고급 bFGF 배지 (O3_100)와 비교하여 저급 bFGF 배지 (O3_3.9)에서 배양된 HS181 hES 세포의 성장 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 23은 고급 bFGF 배지 (O3_100)와 비교하여 저급 bFGF 배지 (O3_3.9)에서 배양된 HS181 hES 세포에서 두 개의 전분화능 마커 (Oct4 및 Nanog)에 대한 상대적 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 24는 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 새로운 인간 배아 줄기 HS841 세포주의 초기 단계 유도를 나타내는 사진이다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 더욱 완전한 이해는 첨부된 도면을 참조하여 얻어질 수 있다. 이들 도면은 본 발명을 설명하기 위한 편리성 및 용이성에 기초한 단지 개략적인 표현이고, 따라서, 대표적인 구현 예의 범주를 한정하거나 또는 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
비록 특정 용어가 명확성을 위하여 다음의 상세한 설명에 사용될지라도, 이들 용어는 오직 도면에서 예시를 위해 선택된 구현 예의 특별한 구조에 관한 것이지, 본 발명의 범주를 제한 또는 한정하려는 의도는 아니다. 도면 및 하기 상세한 설명에 있어서, 동일한 지정 번호는 동일한 기능의 요소를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 논의된 모든 공개, 특허, 및 특허 출원은 이들의 전체적인 내용이 참조로서 본 발명에 포함된다.
특별한 언급이 없는한, 본 출원에서 활용된 기술은 다음과 같은 몇몇 잘 알려진 참고문헌에서 확인될 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, Calif.), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Second Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), or the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, Tex.).
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "분리된 핵산 서열"은 상기 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 핵산을 자연적으로 측면에 배치된 유전자 서열 (즉, 상기 핵산이 유래된 유기체 (organism)의 게놈 DNA에서 분리된 핵 분자에 대한 유전자에 인접하게 위치되는 유전자 서열)이 없는 핵산 서열을 의미한다. 그러나, 상기 "분리된"서열은 이종기원 (heterologous) 프로모터 서열, 또는 다른 벡터 서열과 같은, 나열된 서열 (recited sequence)을 자연적으로 측면에 배치하지 않는 다른 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 본 개시에 따른 핵산 서열이 숙주 세로를 감염하기 위해 사용된 발현 벡터의 일부일 수 있기 때문에, 이것은 "분리된"으로 고려될 다른 세포 물질이 없는 분리된 핵산 서열에 필수적이지 않다 (아래 참조).
본 발명은 인간 라미닌 β2 사슬의 전체 길이 라미닌 β2 사슬 핵산 서열 (SEQ ID NO: 4)을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 몇몇 구현 예에 있어서, 발현 벡터는 이종기원 프로모터 (즉, 제공된 β2 라미닌 사슬에 대해 천연적으로 발생하는 프로모터가 아닌 프로모터)에 작동적으로 연결된, SEQ ID NO: 4에 의해 엔코딩된 핵산을 포함한다. 프로모터 및 라미닌β2 사슬 핵산 서열은 상기 프로모터가 라미닌 β2 사슬 DNA이 RNA로의 발현을 유래할 수 있는 경우 "작동적으로 연결"된다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 연결되는 것에 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 타입은 "플라스미드"이고, 이것은 부가적 DNA 세그먼트 (segment)이 클론될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미한다. 벡터의 또 다른 타입은 바이러스 벡터이고, 여기서 부가적 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈으로 클론될 수 있다. 어떤 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 복제의 박테리아 기원를 갖는 박테리아 벡터 및 에피 솜 포유류 벡터 (episomal mammalian vectors)). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는, 상기 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되고, 이에 의해 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 어떤 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"로서 본 명세서에 언급된다. 본 발명에 있어서, 상기 라미닌 폴리펩타이드 서열의 발현은 발현된 유전자에 대한 본 개시의 프로모터 서열을 작동적으로 연결시켜, 본 개시의 프로모터 서열에 의해 지시된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 활용의 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상기 플라스미드가 대부분 일반적인 벡터의 형태로 사용되기 때문에, 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 개시는, 등가 기능을 제공하는, 박테리아 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)와 같은, 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
상기 벡터는 또한 부가적 핵산 서열의 서브클론에 대한 폴리링커 (polylinker), 또는 전사물 (transcript)의 적절한 아데닐산중합반응 (polyadenylation)에 효과를 위한 아데닐산중합반응 신호와 같은 부가적인 서열을 또한 함유할 수 있다. 상기 아데닐산중합반응 신호의 본질은 본 발명의 방법의 성공적 실행에 중요하다고 믿어지지 않고, 어떤 서열은, SV40 및 소 성장 호르몬 폴리-A 부위를 제한 없이 포함하여, 사용될 수 있다. 또한 상기 벡터의 인자로서 고려된 것은 말단 서열이고, 이것은 메세지 수준을 향상시키고, 구성 (construct)으로부터 다른 서열로 통하여 읽기를 최소화하는 것을 제공할 수 있다. 부가적으로, 발현 벡터는 통상적으로 이들 벡터를 운반하는 세포의 선택을 허용하는, 종종 항생제 내성 유전자 (antibiotic resistance gene)의 형태로, 선택가능한 마커를 갖는다.
또 다른 구현 예에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 라미닌 β2 사슬-발현 재조합 발현 벡터로 감염된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터와 같은, 본 발명의 핵산이 도입된 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 세포는, 예를 들어, 본 발명의 발현 벡터의 대량을 빠르게 생산하기 위해 사용될 수 있는, 원핵 (prokaryotic)일 수 있거나, 또는 기능적 연구를 위해, 진핵 (eukaryotic)일 수 있다.
상기 용어 "숙주 세포" 및 "제조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 특별한 대상 세포에서 뿐만 아니라 이러한 세포의 후대 (progeny) 또는 잠재적 후대를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 어떤 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 세대 계승에서 발생할 수 있기 때문에, 사실상, 이러한 후대가 모 세포와 동일하지 않을 수 없지만, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
상기 숙주 세포는 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 감염될 수 있다. 원핵 및 진핵 세포로 발현 벡터의 이러한 감염은 표준 박테리아 변형, 인산 칼슘 (calcium phosphate) 공-침전 (co-precipitation), 전기천공 (electroporation), 또는 리포좀 매개된-, DEAE 덱스트란 매개된-, 다가양이온 매개된- (polycationic mediated-), 또는 바이러스 매개된 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 기술분야에서 알려진 어떤 기술을 통해 달성될 수 있다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2.sup.nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y. 참조).
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 분리된 전체 길이 인간 라미닌 β2 사슬 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "분리된 폴리펩타이드"는 폴리아크릴아미드 및 아가로오즈와 같은, 겔 제제, 및 다른 라미닌 사슬을 포함하는, 다른 단백질이 실질적으로 없는 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 분리된 라미닌 폴리펩타이드는 검출가능한 오염된 라미닌 사슬이 없다. 따라서, 상기 단백질은 천연 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 또는 재조합 단백질은 상기 논의된 감염된 숙주 세포로부터 분리될 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 분리된 라미닌-521을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "라미닌-521"은 α5, β2 및 γ1 사슬을 함께 연결시켜 형성된 단백질을 의미한다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 재조합 라미닌-521 및 이종삼량체의 라미닌-521 모두를 포괄하여 구성될 수 있다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 라미닌-521은 재조합 라미닌-521 (또는 "r-라미닌-521")을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "r-라미닌-521"는 α5, β2 및 γ1 사슬로부터 선택된 라미닌-521 사슬, 또는 가공된 또는 분비된 이의 형태를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 감염된 숙주 세포에 의해 발현된, 재조합 이종삼량체의 라미닌-521를 의미한다. 따라서 이러한 r-라미닌-521은 단일 개체, 또는 다른 개체로부터 α5, β2, 및 γ1 서열을 포함할 수 있다. 다양한 라미닌-521 사슬 DNA 서열은 기술분야에서 알려져 있고, 본 발명의 r-라미닌-521을 제조하는데 어떤 이러한 서열의 사용은 고려된다 (예를들어, Pouliot, N. et al., Experimental Cell Research 261(2):360-71, (2000); Kikkawa, Y. et al., Journal of Cell Science 113 (Pt 5):869-76, (2000); Church, H J. et al., Biochemical Journal 332 (Pt 2):491-8, (1998); Sorokin, L M. et al., Developmental Biology 189(2):285-300, (1997); Miner, J H. et al., Journal of Biological Chemistry 270(48):28523-6, (1995); Sorokin, L. et al., European Journal of Biochemistry 223(2):603-10, (1994) 참조). 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 r-라미닌-521은 재조합 인간 α5, β2, 및 γ1 폴리펩타이드 사슬로부터 형성된다.
본 발명은 이들 라미닌 분자를 포괄하는데, 여기서 재조합 이종삼량체의 라미닌-521을 구성하는오직 하나 이상의 사슬은 내인성 라미닌-521 사슬에 의해 엔코드된다. 바람직한 구현 예에 있어서, 각각의 α5, β2, 및 γ1 폴리펩타이드 사슬은 재조합으로 발현된다.
상기 라미닌-521은 완전한 단백질 (intact protein)이다. 상기 용어 "완전한"은 상기 이종삼량체의 구조를 형성하기 위해 서로 접합되는 세 개의 사슬을 갖는, α-사슬, β-사슬, 및 γ-사슬의 도메인 모두가 포함된 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 사슬, 단편 (fragment) 또는 기능적 도메인을 분리하도록 분해되지 않는다. 상기 용어 "사슬"은 라미닌 단백질의 알파, 베타, 또는 감마 사슬의 전체를 의미한다. 상기 용어 "단편"은 또 다른 분자 또는 수용체에 결합 활성을 소유하는 하나, 둘, 또는 세 개의 기능성 도메인을 함유하는 어떤 단백질 단편을 의미한다. 그러나, 사슬은 각각 사슬이 세 개의 이러한 도메인을 초과하여 소유하기 때문에 단편으로 고려되어서는 안된다. 유사하게, 완전한 라미닌 단백질은 단편으로 고려되어서는 안된다. 기능성 도메인의 예는 도메인 I, II, III, IV, V, VI, 및 G 도메인을 포함한다.
라미닌-521은 소포체 (endoplasmic reticulum) (ER), 분비 소포 (secretory vesicle), 및 신호 서열의 결과로서 세포외 공간 (extracellular space)에 전달될 수 있는, 분비 단백질이다. 만약 상기 분비된 단백질이 세포외 공간으로 방출된다면, 상기 분비된 단백질은 "성숙 (mature)" 단백질을 생산하기 위해 세포외 공정을 수행할 수 있다. 이러한 공정은 변화가능하고, 따라서 다른 버젼의 최종 "성숙 단백질"을 산출할 수 있다. 예를 들어, α5, β2, 및 γ1 사슬의 길이는 단백질 사이에 변화할 수 있다. 그러나, 최종 성숙 단백질은 사슬 길이를 변화할 지라도, 동일한 기능성을 갖는다. 본 발명의 분리된 라미닌-521은 전체 길이 폴리펩타이드 사슬 및 어떤 이러한 천연적으로 가공된 라미닌-521 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이종삼량체를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 라미닌-521 폴리펩타이드 사슬은 하나 이상의 하기에 따른 폴리펩타이드 사슬을 의미한다:
(a) R1-R2-R3, R1-R2-R4, R3, R4, R1-R3, R1-R4, R2-R3, 및 R2-R4로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 구조를 포함하고, 여기서 R1은 아미노 말단 메티오닌이고; R2는 상기 폴리펩타이드의 분비를 전달할 수 있는 신호 서열이고, 여기서 상기 신호 서열은 특별한 라미닌 사슬에 대한 천연 신호 서열, 또 다른 분비 단백질의 서열 또는 인공 서열일 수 있으며; R3는 α5 사슬, β2 사슬, 및 γ1 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된 분비된 라미닌 사슬이고; 및 R4는 상기 라미닌 사슬 아미노산 서열 내에 어떤 위치에 놓일 수 있는, (하기에 기술된 것과 같은) 에피토프 태그 (epitope tag)를 더욱 포함하는 분비된 α5, β2, 또는 γ1 라미닌 사슬인 폴리펩타이드 사슬이거나; 또는
(b) 상기 코딩 영역, 또는 이의 부분, 하나 이상의 본 명세서에 개시된 재조합 라미닌-521 사슬 DNA (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6), 또는 이의 상보적인 서열에 대해 높은 또는 낮은 엄격한 조건 하에서 하이브리드시킨 폴리뉴클레오타이드에 의해 엔코드된 폴리펩타이드 사슬; 또는
(c) 하나 이상의 상기 개시된 라미닌-521 폴리펩타이드 사슬 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3)에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 사슬.
본 명세서에 사용된 "이종교배의 엄격성 (Stringency of hybridization)"은 핵산 하이브리드가 안정한 조건 하에서 세척하는 것을 의미한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 라미닌 사슬 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열의 모두 또는 일부, 또는 이들의 상보물에 대해 (본 명세서에 정의된 바와 같은) 높은 엄격한 조건하에서 하이브리드시키는 핵산을 포함한다. 상기 하이브리드 핵산의 하이브리드 부분은 통상적으로 길이에서 적어도 50 뉴클레오타이드이다. 기술 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 상기 하이브리드의 용융 온도 (TM)에 반영된다. TM은 서열 동일성이 1% 감소할 때 마다 대략 1-1.5℃로 감소한다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수이다. 통상적으로, 상기 이종교배 반응은 더 낮은 엄격성의 조건하에서 수행되고, 변화의 세척을 수반하지만 더 높은 엄격성을 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 높은 엄격성은 약 65℃의 0.1×SSC에서 필터를 세척하는 단계를 수반하는, 50% 포름아미드, 5×SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 나트륨 (sodium citrate)), 50 mM 인산 나트륨 (sodium phosphate) (pH 7.6), 5×덴하르트의 용액 (Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 및 20 ㎍/ml 변성된, 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 42℃로 밤샘 배양을 의미한다.
또한 더 낮은 엄격한 이종교배 조건에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 하이브리드시키는 라미닌-521-엔코딩 핵산 서열은 고려된다. 이종교배의 엄격성 및 신호 검출에서 변화는 포름아미드 농도 (더 낮은 포름아미드의 퍼센트는 더 낮은 엄격성을 결과한다); 염 조건, 또는 온도의 조작 (manipulation)을 통해 주로 달성된다. 예를 들어, 더 낮은 엄격한 조건은 1×SSPE, 0.1% SDS로 50℃에서 세척을 수반하는; 6×SSPE (20×SSPE≤3M NaCl; 0.2M NaH2PO4 ; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 ㎍/ml 연어 정자 차단 DNA을 포함하는 용액에서 37℃로 밤샘 배양을 포함한다. 부가적으로, 더 낮은 엄격성을 달성하기 위하여, 엄격한 이종교배 후에 수행된 세척은 더 높은 염 농도에서 수행될 수 있다 (예를 들어, 5×SSC).
상기 조건에서 변형은 이종교배 실험에서 배경을 억압하는데 사용된 선택적 차단 시약의 내포 및/또는 치환을 통해 달성될 수 있다. 통상적 차단 시약은 덴하르트의 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA, 및 상업적으로 이용가능한 전매 제형을 포함한다. 특이 차단 시약의 내포는 호환성 (compatibility)의 문제점에 기인하여, 전술된 이종교배 조건의 변형을 요구할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 두 개의 아미노산 또는 두 개의 핵산의 "퍼센트 동일성"은 Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)의 경우에서와 같이 변형된, Karlin and Altschul의 알고리즘 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264.2268, 1990)을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al.의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다 (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). BLAST 뉴클레오타이드 조사는 본 발명의 핵산 분자에 뉴클레오타이드 서열 동일성을 결정하기 위해, NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이 (wordlength)=12로 수행된다. BLAST 단백질 조사는 본 발명의 폴리펩타이드에 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위해, XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3으로 수행된다. 비교목적을 위한 갭 정렬 (gapped alignment)을 얻기 위하여, Gapped BLAST는 Altschul et al.에 기재된 바와 같이 활용된다 (Nucleic Acids. Res. 25:3389-3402, 1997). BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 활용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 내정값 매개변수 (default parameter)는 사용된다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 6에 함유된 하나 이상의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 갖는 라미닌-521 사슬 폴리펩타이드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "α5 폴리뉴클레오타이드"는 라미닌 α5 사슬을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 특징으로 할 수 있다: (a) SEQ ID NO: 5의 선택된 서열과 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 80% 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 공유하는 폴리펩타이드를 엔코팅하는 폴리뉴클레오타이드; (b) SEQ ID NO: 5의 코딩 서열 또는 이의 상보적 서열에 대해 낮은 또는 높은 엄격한 조건 하에서 하이브리드시킨 폴리뉴클레오타이드; 또는 (c) R1-R2-R3, R1-R2-R4, R3, R4, R1-R3, R1-R4, R2-R3, 및 R2-R4로 이루어진 군으로부터 선택된 일반 구조식을 갖는 라미닌 α5 사슬 폴리펩타이드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 R1 및 R2는 전술된 바와 같고, R3는 분비된 α5 사슬이며, R4는 에피토프 태그를 포함하는 분비된 α5 사슬이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "β2 폴리뉴클레오타이드"는 동일한 명칭의 β2 라미닌 사슬을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 하기의 폴리뉴클레오타이드를 특징으로 한다: (a) SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 공유하는 폴리펩타이드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (b) SEQ ID NO: 4의 코딩 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 대한 낮은 또는 높은 엄격한 조건 하에서 하이브리드시킨 폴리뉴클레오타이드; 또는 (c) R1-R2-R3, R1-R2-R4, R3, R4, R1-R3, R1-R4, R2-R3, 및 R2-R4로부터 선택된 일반 구조식을 갖는 폴리펩타이드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 R1 및 R2는 전술된 바와 같고, R3는 분비된 β2 사슬이며, R4는 에피토프 태그를 포함하는 분비된 β2 사슬이다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "γ1 폴리뉴클레오타이드"는 동일한 명칭의 γ1 라미닌 사슬을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 하기의 폴리뉴클레오타이드를 특징으로 한다: (a) SEQ ID NO: 6의 서열로 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 공유하는 폴리펩타이드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (b) SEQ ID NO: 6의 코딩 서열 또는 이의 상보적인 서열에 대한 낮은 또는 높은 엄격한 조건 하에서 하이브리드시킨 폴리뉴클레오타이드; 또는 (c) R1-R2-R3, R1-R2-R4, R3, R4, R1-R3, R1-R4, R2-R3, 및 R2-R4로부터 선택된 일반적인 구조식을 갖는 폴리펩타이드를 엔코팅하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 R1 및 R2는 전술된 바와 같고, R3 는 분비된 γ1 사슬이며, R4는 에피토프 태그를 포함하는 분비된 γ1 사슬이다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 상기 용어 "에피토프 태그"는 키메라 단백질 (chimeric protein)의 일부로서 발현된 폴리펩타이드 서열을 의미하고, 여기서 상기 에피토프 태그는 상기 에피토프 태그에 대해 발생된 항체의 결합, 또는 상기 태그를 함유하는 서열의 친화성 정제 (affinity purification)를 위해 사용될 수 있는 다른 분자의 결합을 위한 인지 부위로서 제공한다.
바람직한 구현 예에 있어서, 상기 라미닌 α5, β2 및 γ1 사슬, 또는 이의 단편을 엔코딩하는 cDNA는 발현 벡터에 서브클론된다. 선택적으로, 하나 이상의 인트론 (intron)을 포함하는, 라미닌 α5, β2 및/또는 γ1 유전자 서열은 발현 벡터에 서브-클론하기 위해 사용될 수 있다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 라미닌-521의 α5, β2 및 γ1 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열을 엔코딩하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터로 감염된 라미닌-521 발현-세포를 제공하고, 여기서 상기 감염된 세포는 재조합 라미닌 사슬을 함유하는 이종삼량체의 라미닌-521을 분비한다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 세포는 라미닌-521의 α5, β2 및 γ1 사슬, 더욱 바람직하게는 모든 인간 사슬을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 엔코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터로 시스템적으로 감염된다. 다중 감염 후, 상기 세포는 이종삼량체의 r-라미닌-521을 형성하는, 재조합 라미닌-521 사슬을 발현한다.
진핵 세포로 발현 벡터의 감염은 인산 칼슘 공-침전, 전기천공, 또는 리포좀 매개된-, DEAE 덱스트란 매개된-, 다가양이온 매개된- (polycationic mediated-), 또는 바이러스 매개된 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 기술분야에서 잘 알려진 어떤 기술을 통해 달성될 수 있다. 박테리아 세포의 감염은 표준 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 구현 에에 있어서, 상기 세포는 안정하게 감염된다. 적절하게 감염된 세포의 선택 및 안정한 감염을 위한 방법은 기술분야에서 알려져 있다. 다른 바람직한 구현 예에 있어서, CMV 프로모터 구동 발현 벡터는 인간 신장 배아 293 세포주에서 사용된다.
r-라미닌-521을 발현 및 분비할 수 있는 어떤 세포는 사용될 수 있다. 바람직하게는, 진핵 세포는 사용되고, 가장 바람직하게는 신장 및 상피 (epithelial) 세포주를 포함하는 포유류 세포가 사용되지만, 이에 제한되지 않는다. 개별 사슬 또는 r-라미닌-521의 발현을 구동하기 위해 사용된 프로모터 서열은 (CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 어떤 다양한 프로모터에 의해 구동된) 구성 또는 (테트라사이클린 (tetracycline), 엑디손 ( ecdysone), 스테로이드-반응성 (steroid-responsive)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떤 다수의 유도성 프로모터에 의해 구동된) 유도될 수 있다. 탄수화물 및 이황화물 (disulfide) 번역-후 (post-translational) 변형은 라미닌-521 폴딩 및 기능에 대해 요구될 수 있는 것으로 믿어진다. 이것은, 비록 다른 시스템이, 예를 들어, 항체 생산에 대한 항원을 얻는데 유용하더라고, 기능성 r-라미닌-521을 생산하는데 바람직한 진핵 세포의 사용을 만든다. 가장 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 포유류 세포는 내인성으로 라미닌 β2 사슬을 발현하지 않는다. 다른 바람직한 구현 에에 있어서, 상기 세포는 내인성으로 라미닌-521의 모두를 발현하지 않는다.
단백질은 에피토프 태그 및 수송 신호와 같은, 단백질의 정제를 촉진하는데 유용한 부가적 서열을 포함할 수 있다. 이러한 에피토프 태그의 예는 FLAG (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.), myc (9E10) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, Wis.), 및 HA (Boehringer Manheim Biochemicals)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 수송 신호의 예는 출력 신호 (export signal), 분비 신호 (secretory signal), 핵 국소화 신호 (nuclear localization signal), 및 플라즈마 막 국소화 신호 (plasma membrane localization signals)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 구현 예에 있어서, 적어도 하나의 상기 라미닌 사슬 폴리펩타이드 서열, 또는 이의 단편은, 적어도 하나의 상기 사슬이 발현된 에피토프 태그로 융합 단백질로서 발현되기 위하여, "에피토프 태그"를 엔코딩하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 상기 에피토프 태그는 최종 r-라미닌-521이 기능적으로 남아있는 한, r-라미닌-521을 포함하는 어떤 폴리펩타이드 사슬에 대해 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 내부로서 발현될 수 있다.
다른 구현 예에 있어서, 상기 r-라미닌-521 사슬의 하나는 제1 에피토프 태그를 갖는 융합 단백질로서 발현되고, 적어도 하나의 다른 r-라미닌 사슬은 제2 다른 에피토프 태그를 갖는 융합 단백질로서 발현된다. 이것은 실행을 위해 여러 번의 정제를 허용한다. 선택적으로, 상기 동일한 에피토프 태그는 하나 이상의 r-라미닌 사슬을 갖는 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 에피토프 태그는 r-라미닌-521 사슬로부터 절단가능하도록 설계될 수 있다. 선택적으로, 에피토프 태그는 어떤 r-라미닌-521 사슬에 융합되지 않고, 상기 r-라미닌-521은 라미닌-521 특이 항체 또는 다른 라미닌-521 결합 분자를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 표준 기술에 의해 분리된다.
단일 라미닌 사슬로 감염된 세포로부터의 배지는 라미닌 사슬-특이 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 상에서 초기에 분석된다. 감염 후에 단일 라미닌 사슬의 발현은 일반적으로 세포 내이다. 개별적으로 감염된 사슬에 대한 반응성을 나타내는 클론은 감염된 유전자의 혼입을 확인하기 위하여, PCR, 역전사 (reverse transcription)-PCR, 또는 핵산 이종교배와 같은, 어떤 적절한 방법에 의해 확인된다. 바람직하게는, 이러한 클론으로부터 게놈 DNA 제조물의 분석은 라미닌 사슬-특이 프라이머 쌍을 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 세 개의 사슬 모두를 생산하는 감염된 클론으로부터 배지는 웨스턴 블럿 분석 및 세포 결합 분석을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해, r-라미닌-521 분비 및/또는 활성을 위해 더욱 분석된다.
바람직한 구현 예에 있어서, r-라미닌-521의 정제는 항체 친화성 컬럼을 통해 감염된 세포로부터 배지를 통과시켜 달성된다. 몇몇 구현 예에 있어서, 적어도 하나의 재조합 사슬 상에 발현된 펩타이드 에피토프에 대한 항체는 친화성 컬럼에 부착되고, 상기 배지로 분비된 r-라미닌-521를 결합시킨다. 상기 r-라미닌-521은 상기 컬럼에 대해 과량의 펩타이드를 통과시켜 컬럼으로부터 제거된다. 용출된 분획은 겔 전기영동 및 웨스턴 블럿 분석을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해 분석된다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 펩타이드 에피토프는 정제 후 절단될 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, 둘 또는 셋의 개별 r-라미닌 사슬은 2 회 또는 3회 정제 및 이중 또는 삼중 분리된 r-라미닌-521을 허용하는, 다른 에피토프 태그를 각각 갖는, 융합 단백질로서 발현된다. 상기 에피토프 태그는 정제 후 r-라미닌-521 사슬로부터 절단가능하도록 설계될 수 있다. 선택적으로, 에피토프 태그가 어떤 r-라미닌-521 사슬에 융합되지 않고, 상기 r-라미닌-521는 라미닌-521 특이 항체 또는 다른 라미닌-521 결합 분자를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 표준 기술에 의해 분리된다.
다른 구현 예에 있어서, r-라미닌-521의 정제는 겔-여과 크로마토그래피 컬럼을 통해 감염된 세포로부터 배지를 통과시켜 달성된다. 용출된 분획은 겔 전기영동 및 웨스턴 블럿 분석법을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해 분석된다. r-라미닌-521을 함유하는 분획은 수집되고, 검체 (specimen)의 순도는 겔 전기영동법 및 웨스턴 블럿 분석법을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해 평가된다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 단백질 용액은 고순도의 단백질을 얻기 위하여 다시 겔-여과 크로마토그래피 컬럼을 통하여 통과될 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 고순도의 r-라미닌-521 용액을 달성하기 위하여, 이전의 정제 단계로부터 배지 또는 r-라미닌-521 용액은 이온-교환 컬럼을 통해 통과될 수 있다. 용출된 분획은 겔 전기영동법 및 웨스턴 블럿 분석법을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해 분석된다. r-라미닌-521을 함유하는 분획은 수집되고, 상기 검체의 순도는 전술된 방법을 포함하는, 어떤 적절한 방법에 의해 평가된다.
본 발명의 라미닌-521 폴리펩타이드 사슬은 또한 (i) 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전적 코드에 의해 엔코딩될 수 있거나 또는 될 수 없는, 하나 이상의 비-보존된 아미노산 잔기로 치환, 또는 (ii) 치환기를 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환, 또는 (iii) 상기 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 용해도를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴레에틸렌 글리콜)과 같은, 또 다른 화합물로 성숙 폴리펩타이드의 융합, 또는 (iv) IgG Fc 융합 영역 펩타이드, 또는 리더 (leader) 또는 분비성 서열, 또는 서열 용이 정제와 같은, 부가적 아미노산과 폴리펩타이드의 융합을 포함한다. 이러한 변형 폴리펩타이드는 본 명세서에서 교시로부터 기술분야의 당업자의 범주 내에서 고려된다.
예를 들어, 다른 전하 또는 중성 아미노산으로 전하 아미노산의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩타이드 변형은 더 적은 응집과 같은, 개선된 특징으로 단백질을 생산할 수 있다. 약학적 제형의 응집은 응집의 면역성의 활성에 기인하여 활성을 감소 및 클리어런스 (clearance)를 증가시킨다 (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).)
특별한 구현 예에 있어서, 상기 분리된 라미닌-521은 세 개의 사슬을 포함한다. 제1 사슬은 SEQ ID NO: 1 (즉, α5 라미닌 사슬)의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 사슬은 SEQ ID NO: 2 (즉, β2 라미닌 사슬)의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 사슬은 SEQ ID NO: 3 (즉, γ1 라미닌 사슬)의 폴리펩타이드 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 제1, 제2, 및 제3 사슬은 재조합 라미닌-521로 조립된다.
더욱 특별한 구현 예에 있어서, 제1 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 갖고, 제2 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 가지며, 및 제3 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는다.
좀더 특별한 구현 예에 있어서, 제1 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 갖고, 제2 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 가지며, 제3 사슬의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
특별한 구현 예에 있어서, 제1 사슬은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 제2 사슬은 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 제3 사슬은 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특별한 구현 예에 있어서, 제1 사슬은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 서열이고, 제2 사슬은 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 서열이며, 제3 사슬은 SEQ ID NO: 3의 폴리펩타이드 서열이다.
본 발명은 분리된 라미닌-521 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 약학적인 조성물은 분리된 r-라미닌-521을 포함한다. 본 발명의 이들 관점에 따르면, 다른 제제는, 처리된 조건에 의존하여, 약학적인 조성물에 포함될 수 있다. 상기 약학적인 조성물은 콜라겐, 다른 라미닌 타입, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카데린, 인테그린, α-디스트로글리칸, 엔탁틴/니도젠, α-디스트로글리칸, 당단백질, 프로테오글리칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (heparan sulfate proteoglycan), 글리코아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 상피 성장 인자, 혈관내피 성장 인자 (vascular endothelial), 섬유아세포 성장 인자, 또는 신경 성장 인자, 및 이의 펩타이드 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 다른 화합물을 더욱 포함한다.
분리된 라미닌-521을 포함하는 약학적 제조물은 어떤 적절한 형태로 제조될 수 있고, 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 분리된 라미닌-521를 포함한다. 상기 담체는 주사가능한 담체, 국소 (topical) 담체, 경피 (transdermal) 담체, 및 등등을 포함할 수 있다. 상기 제조물은 연고, 겔, 크림, 스프레이, 분산액, 현탁액 또는 페이스트와 같은 국소 투여를 위한 형태가 유리할 수 있다. 상기 제조물은 또한 전통적인 것과 같은 조성 및 품질에서, 보존제, 항박테리아, 항균, 항산화제, 삼투성 제제 (osmotic agent), 및 유사한 물질을 더욱 유리하게 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 사용을 위해 적절한 용액은 멸균하고, 제안된 적용을 위해 유해하지 않으며, 멸균과 같은 종래의 약학적 작동에 대해 적용될 수 있고, 및/또는 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 버퍼 등과 같은 종래의 보조제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형을 보조하기 위하여, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1975)을 참조할 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 개선된 생체친화성 (biocompatibility)을 갖는 의료 장치를 포함하고, 여기서 상기 장치의 외부 표면은 분리된 라미닌-521 또는 이의 약학적인 조성물, 단독 또는 상기 장치 표면의 생체친화성을 증가시키기 위해 제공하는 다른 단백질 또는 시약과 조합으로 코팅된다. 상기 코팅된 장치는 (내피 세포 (endothelial cell) 부착과 같은) 세포 부착을 자극하고, 상기 장치의 출입 부위에 염증 및/또는 감염을 감소시키도록 제공한다.
이러한 의료 장치는 몸에 이식하기 위해 사용된 어떤 물질일 수 있고, 바람직하게는 스테인레스 스틸 또는 티타늄과 같은, 생체적합한 금속 (biocompatible metal)으로 코팅 또는 만들어진다. 선택적으로, 상기 장치는 세라믹 물질 또는 폴리에스테르, 폴리글리코산 (polyglycolic acid), 또는 폴리갈락토오즈-폴리글리코산 (polygalactose-polyglycolic acid) 공중합체와 같은 중합체로 코팅 또는 만들어진다.
만약 상기 장치가 메쉬, 시트 또는 섬유의 형태로, 천연 또는 합성의 생분해가능한 물질로 만들어진다면, 분리된 라미닌-521 또는 이의 약학적인 조성물은 이의 표면에 직접적으로 적용될 수 있다. 적절한 세포는 그 다음 치과 지대주 조각 (dental abutment pieces), 바늘, 금속 핀 또는 막대 (rod)를 포함하는, 카테터 (catheter), 인공 항문 튜브 (colostomy tube), 의료용 메쉬 (surgical mesh) 및 분리된 라미닌-521로 코팅이 바람직한 어떤 다른 적용을 포함하는, 이식가능한 또는 주입가능한 장치의 형태로 매트릭스 상에서 배양될 수 있다. 선택적으로, 상기 장치는 이식될 수 있고, 세포는 생체 내에서 부착하는 것을 허용될 수 있다.
분리된 라미닌-521의 결합은 (흡착에 의한 것과 같은) 비-공유, 또는 공유 수단일 수 있다. 상기 장치는 상기 분리된 라미닌-521 또는 이의 약학적 조성물로 침지, 배양, 또는 분사될 수 있다.
본 발명의 분리된 라미닌-521을 사용하여 다양한 치료를 위한 복용량 용법 (dosage regimen)은 부상의 타입 또는 조건, 나이, 체중, 성별, 개별의 의학적 상태, 상태의 심각도, 및 투여 경로를 포함하는, 다양한 인자에 기초한다. 따라서, 상기 복용량 용법은 매우 광범위할 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 의사에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 라미닌은 매우 효능이 강한 분자이고, 세포당 하나 또는 몇몇 분자가 효과를 생산할 수 있다. 따라서, 밀리미터 범위당 피코-그램에서 효과적인 복용량은 만약 운반이 최적화된다면 가능하다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 새로운 물질인, 분리된 라미닌-521을 제공하고, 이것은 단일 세포 현탁액으로 해리 후 인간 배아 줄기 세포 생존을 허용한다. 상기 줄기 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 원심분리에 의해 펠렛화되며, 03 배지로 재현탁되고, 40 mm 체를 통해 여과되며, 분리된 라미닌-521, 라미닌-511, 또는 마트리겔에 의해 예비코팅된 세포 배양 접시 상에 30 Kcells/㎠의 밀도로 도말된다. 배양에서 하루가 지난 후, 상기 세포는 기술분야에서 알려진 바와 같이, 다이드된 (died) 마트리겔 상에 도말된다. 상기 인간 배아 줄기 세포는 라미닌-521 상에 도말되고, 대부분의 경우에 있어서, 라미닌-511 상에 다능성 세포의 작은 콜로니를 형성하여, 생존하고 증식을 시작된다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 다능성 상태에서 인간 배아 줄기 세포를 확장하기 위한 방법을 제공한다. 라미닌-521 상에 단일 세포 현탁액에 도말된 인간 배아 줄기 세포가 기술분야에서 알려진 종래의 방법보다 더 높은 비율로 생존하고 증식하는 것을 보여준다. 3 계대배양 후 (1 개월), 단일 세포 현탁액에서 계대배양된 세포는 20 계대배양 후 (3 개월) 마트리겔 상의 조각으로 계대배양된 세포 배양의 것과 같이 동일 수의 세포 분열 (cell division)을 수행한다. 따라서, 새로운 방법은 상당한 경제적 이득을 제공할 수 있어, 시간 및 노동의 관점에서 유리하다.
라미닌-521은 인간 다능성 배아 줄기 세포에 의해 명목상 발현되고 분비되며, 신장, 신경근접합부 (neuromuscular junctions), 폐, 및 태반 (placenta)에서 발견될 수 있다.
순수한 라미닌-521의 활용도는 세포내 표현형의 유지 및 세포내 분화 상에 단백질의 효과를 연구할 수 있게 한다. 따라서, 조직에 대한 상처를 치료, 세포 부착을 촉진, 확장 및 이동, 체외 세포 치료법 (ex vivo cell therapy), 의료 장치의 생체친화성을 개선, 및 개선된 세포 배양 장치 및 배지를 제조하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다수의 연구 및 치료학적 목적은, 만약 순수 완전히 분리된 라미닌-521이 이용가능하다면 더 나아갈 수 있을 것이다. 또한, 줄기 세포 상에 순수 라미닌-521의 효과는 이러한 단백질이 초기 포유류 배아에서 발현됨에 따른 연구에 중요할 것이다.
따라서, 조사 및 치료의 목적을 위한 분리된 라미닌-521, 및 분리된 라미닌-521을 제조하기 위한 방법에 대한 기술이 필요하다. 라미닌-521은 완전히 화학적으로 규명된, 지주-없는, 및 동물-단백질-없는 (이종-없는) 상태하에서 해리된 인간 ES 및 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포의 빠른 증식 (multiplication) 및 장기간 자가-재생에 대한 매트릭스로서 제공할 수 있다. LN-521계 시스템은 사용하는 것이 쉽고, 자동화가 쉬우며, 인간 ES/iPS 배양의 빠른 스케일-업을 허용한다.
본 발명은 또한 세포, 특히 줄기 세포에 영양을 제공하기 위해 사용될 수 있는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 이러한 관점에 있어서, 줄기 세포는 통상적으로 배양될 두 개의 것이 필요하다: (1) 상기 줄기 세포에 대한 구조적 지지체를 제공하는 기질 또는 코팅; 및 (2) 상기 줄기 세포에 영양을 제공하기 위한 세포 배양 배지. 상기 기질 또는 코팅 (1)은 일반적으로, 예를 들어, 페트리 접시 또는 몇몇 다른 용기 상에 도말된다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "자가-재생"은 세포 분열 및 분화되지않은 나머지 (즉, 다능성)의 다수의 사이클을 통해 진행하는 줄기세포의 능력을 의미한다. 자체의 전분화능은 어떤 세포 타입으로 분화하기 위한 줄기 세포의 능력을 의미한다. 상기 용어 "증식 (proliferation)"은 분열하는 줄기세포의 능력을 의미한다. 생존은 분화되거나 또는 분화되지 않던지 간에, 살아남는 줄기 세포의 능력을 의미하고, 분열하거나 또는 분화하기 위한 이의 능력을 유지하기 것을 줄기 세포에 요구하지 않는다.
본 발명의 세포 배양 배지는 라미닌-521 및/또는 라미닌-511을 함유하는 기질과 함께 사용되는데 특히 적절하다. 이들 라미닌은 차례로 PI3K/Akt 경로의 활성을 유도하는, α6β1 인테그린을 활성화시킨다. 이것은 상기 줄기 세포의 전분화능, 자가-재생, 및/또는 증식을 증가시킨다. 상기 기질은 완전한, 개별 사슬 또는 이의 단편으로서, 라미닌-521 또는 라미닌-511로 이루어질 수 있다는 것이 고려된다. 재조합 라미닌-521 및 재조합 라미닌-511은 상업적으로 이용가능하다. 다수의 다른 분자는 다른 효율로, PI3K/Akt 경로를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, TGF 베타 1 및 bFGF은 이러한 경로를 활성화시킨다. 상기 라미닌-521 및/또는 라미닌-511의 사용은 세포 배양 배지에서 감소될 이러한 분자의 양을 허용한다. 라미닌-521은 PI3K/Akt 경로를 활성화하는, α6β1 인테그린을 통해 가장 많은 신호의 양을 전달한다. 라미닌-521의 사용은 단일-세포 효소성 해리 후 생존한 세포를 증가시키기 위한 세포-결정성 로-키나제 (ROCK) 억제제의 첨가 없는 단일-세포 현탁액 계대배양을 허용한다. 이전에, 인공적 세포사멸 억제제를 사용하지 않고 인간 ES 세포의 단일-세포 효소성 계대배양은 불가능하였다. 상기 계대배양 절차의 간편성은 실험의 변화가 감소되고, 높은-처리량 세포 배양을 위한 자동화된 공정을 허용하며, 세포 배양 요원의 광범위한 훈련 및 비용 없는 것을 결과한다. 부가적으로, 인간 ES 및 iPS 세포는 일분자층으로 성장하는 라미닌-521 또는 라미닌-511 상에 도말하고, 이것은 세포가 상기 매트릭스 및 세포 배양 배지에 동등하게 노출되기 때문에 균일한 배양을 만든다. ROCK 억제제의 부재하에서 단일 세포로서 계대배양된, 라미닌-521 상에 화학적으로 규명된, 이종-없는 환경에서 성장된, 이러한 인간 ES 세포 배양은 덩어리 (clump)로 계대배양된 마트리겔 상에 성장된 세포와 비교하여 더 우수한 성장률로 몇 개월 동안 연속적으로 확장한다. 이들 다능성 장기간 확장된 세포는 Oct4를 균일하게 발현하고, 핵형적으로 (karyotypically) 정상을 유지한다. 따라서, 지속된 생존 및 증식 능력을 갖는 인간 ES 및 iPS 세포를 얻을 수 있다.
평균 접촉 면적 및 분산 균일성 (spreading homogeneity)은 다른 이용가능한 기층과 비교하여 라미닌-511 상에서 배양된 세포에 대해 훨씬 더 크다. 3 개월에 걸쳐 라미니-511 상에서 성장된 인간 ES 세포는 전분화능을 유지하고, SCID 쥐에 유전자이식 후 기형종 (teratomas)을 발생시킬 수 있다. 라미닌-511은 또한, 다른 알려진 매트릭스가 몇 주를 넘길 수 없는 경우, LIF 또는 지주세포의 존재 없이 5 개월에 걸쳐 쥐의 ES 세포의 자가-재생을 지지한다.
이러한 세포 배양 배지로 성장될 수 있는 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 양막의 줄기 세포, 및 일반적으로 어떤 다능성 줄기 세포로 유도될 수 있다.
통상적으로, 세포 배양 배지는 분화를 억제하고 및 증식을 개선하기 위해 다량 및 다수의 다양한 성장 인자 및 사이토킨을 포함한다. 본 발명의 세포 배양 배지의 하나의 장점은 많은 성장 인자 또는 사이토킨, 또는 이러한 높은 양을 함유하지 않는 것이다.
가장 일반적으로, 본 발명의 세포 배양 배지는 통상적으로 사용된 것보다 더 적은 양의 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 요구한다. 이것은 상기 세포 배양 배지가 bFGF의 밀리미터 (ng/mL)당 0 초과 내지 3.9 나노그램을 포함할 수 있다. 상기 bFGF는 세포 배양 배지가 전체적으로 인간의 것으로 한정되는 인간 bFGF이다. 몇몇 더욱 구체적인 구형 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 3.5 ng/mL 이하의 bFGF를 포함할 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 0.5 내지 3.5 ng/mL의 bFGF를 포함할 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 0 bFGF, 즉 bFGF가 존재하지 않을 수 있다.
일반적으로, 상기 세포 배양 배지는 적어도 하나의 무기 염, 적어도 하나의 미량의 무기질, 적어도 하나의 에너지 기질, 적어도 하나의 지질, 적어도 하나의 아미노산, 적어도 하나의 비타민, 및 적어도 하나의 (bFGF 이외의) 성장 인자가 용해된 액체 상을 포함한다. 하기 표 1은 본 발명의 세포 배양 배지에 존재할 수 있는 다양한 이러한 성분 (ingredient), 및 만약 상기 성분이 존재한다면, 최대 및 최소 농도의 목록을 포함한다. 상기 값은 과학적 기수법으로 표시된다. 예를 들어, "4.1E-01"은 4.1 x 10- 01으로 해석될 수 있다.
[표 1]
Figure 112014038425461-pct00001
Figure 112014038425461-pct00002
Figure 112014038425461-pct00003
상기 세포 배양 배지의 액체 상은 물, 혈청 또는 알부민일 수 있다.
상기 표 1에 기재된 다수의 성분 또는 요소는 필수적이지 않거나, 또는 더 낮은 농도에서 사용될 수 있다.
상기 세포 배양 배지는 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유할 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 상기 세포 배양 배지는 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물을 함유할 수 있다.
좀더 특별한 구현 예에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 (1) 알부민, (2) 인슐린 또는 인슐린 대체물, (3) 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 또는 이들 세 개 요소의 어떤 조합을 함유하지 않을 수 있는 것으로 고려된다.
다른 세포 배양 배지가 인터루킨-1 베타 (IL-11β 또는 카바볼린 (catabolin)), 인터루킨-6 (IL6), 또는 색소 상피-유래 인자 (pigment epithelium derived factor) (PEDF)와 같은 성장 인자를 함유할 수 있다는 것이 주목될 수 있다. 이러한 성장 인자는 본 발명의 세포 배양 배지에서 존재하지 않는다.
세포 배양 배지에 대한 하나의 특정 제제는 표 2에 제공된다.
[표 2]
Figure 112014038425461-pct00004
이러한 관점에 있어서, MEM 비-필수 아미노산 용액은 통상적으로 100x 농도로 제공된다. 표 2의 MEM은 원래의 1x로 희석 후 사용되고, 표 3에 기재된 하기 농도에서 수반하는 아미노산을 함유한다:
[표 3]
Figure 112014038425461-pct00005
DMEM/F12는 표 4에 기재된 하기 성분을 함유한다:
[표 4]
Figure 112014038425461-pct00006
Figure 112014038425461-pct00007
본 발명의 세포 배양 배지와 라미닌 기질의 조합은 더 저렴한 세포 배양 시스템을 결과하지만, 다능성 줄기 세포를 유지하는 더 높은 효율을 제공한다. 필수적으로, 요구된 모든 것은 라미닌 및 최소량의 영양 성분이다. 이것은 이러한 세포 배양 배지와 조합으로 사용된 라미닌이 LN-511 또는 LN-521인 것으로 특히 고려된다.
하기 실시 예는 본 발명을 더욱 예시하기 목적을 위한 것이다. 실시 예들은 단지 예시적이고, 본 발명에 설정된 물질, 조건 또는 공정 매개변수에 대해 본 발명에 따라 만들어진 장치를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시 예
실시 예 1
인간 라미닌 β2 cDNA의 클로닝
인간 라미닌 β2 cDNA의 5.6 kb 단편은 프라이머 5'-GTGGTACCCACAGGCAGAGTTGAC-3'(SEQ ID NO: 7) 및 5'-GCTCTAGAGCTCTTCAGTGCATAGGC-3'(SEQ ID NO: 8)을 사용하여 인간 간 cDNA 라이브러리 (BD Biosciences)로부터 PCR-증폭되고, 따라서 상기 단편의 말단 상에 인공적 XbaI 및 KpnI 절단 부위를 도입한다. 상기 PCR 증폭동안 오류율을 감소시키기 위해, Phusion™high-fidelity PCR Kit (Finnzymes)는 사용된다. 그 다음, 상기 단편은 XbaI 및 KpnI로 소화되고, 동일한 제한 엔도뉴클레아제 (restriction endonucleases) (pSKHLAMB2 플라스미드)로 소화된 pSK 벡터로 서브클론된다. 상기 서열의 완전성을 확인하기 위하여, pSKHLAMB2 플라스미드의 몇몇 클론은 서열화된다. 서열화 (Sequencing)는 ABI PRISM® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems)을 사용하여 ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) 상에서 수행된다. NCBI 데이터베이스 인간 라미닌 β2 서열과 완벽하게 쌍을 이루는 것만이 또 다른 클로닝을 위해 선택된다.
발현 구성체 (Expression Constructs)
인간 라미닌 β2 사슬 pSKHLAMB2의 발현을 위하여 플라즈미드는 XbaI 및 KpnI로 소화되고, XbaI-KpnI 처리된 pcDNA 3.1(+) 벡터 (인비트로겐)로 서브클론된다.
인간 라미닌 α5 (HLN5Full.pcDNA 구조) 및 γ1 (HG1 구성체)의 발현을 위해 사용된 구성체는 이전에 기재되었다 (Doi, M. et al., J. Biol. Chem. 277(15), 12741-8 (2002)).
항체
항-라미닌 β2 (MAB2066) 단일클론 항체 (mAb)는 R@D Systems으로부터 구매된다. 항-라미닌 α5 mAb (2F7)는 Abnova로부터 구매된다. 항-라미닌 β1 mAb (MAB1921)는 Chemicon으로부터 구매된다. 항-라미닌 γ1 (H-190) 토끼 다클론 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc로부터 구매된다.
재조합 라미닌-521의 생산 및 정제
r-라미닌-521은, 37℃에서 가습된 5% CO2 분위기에서 10% FCS, DMEM에서 배양된 인간 배아 신장 세포 (HEK293, ATCC CRL-1573)에서 생산된다. 야생-형 세포는 HG1 구성체로 표준 인산 칼슘 (calcium-phosphate) 방법을 사용하여 감염되고, 안정한 클론은 100 mg/ml 하이드로마이신 (hygromycin) (Cayla)을 사용하여 선택된다. 모든 다른 세포 배양 및 클론 확장 (clonal expansion)은 연관된 선택 항생제의 연속적인 존재하에서 수행된다. 많이 발현하는 클론은 그 다음 인간 라미닌 β2 구성체로 감염되고, 안정한 클론은 500 mg/ml G418 (Life Technologies)을 사용하여 선택된다. 라미닌 γ1 및 라미닌 β2 모두를 고도로 발현하는 클론은 최종적으로 HLN5Full.pcDNA 구성체로 감염되고, 안정한 클론은 200 mg/ml 지오신 (zeocin) (Cayla)을 사용하여 선택된다. 가장 높은 분비를 나타내는 클론은 더욱 확장된다.
r-라미닌-521의 생산을 위하여, 융합성 세포 (confluent cell)는 5일까지 DMEM에서 배양된다. r-라미닌-521는 항-FLAG M2 매트릭스 (Sigma)를 사용하여 친화성 정제된다. 상기 수집된 배지는 교반하면서 4℃에서 밤새도록 매트릭스와 배치 모드에서 배양된다. 결합된 r-라미닌-521는 실온에서 TBS/E (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)에서 50 mg/ml FLAG 펩타이드 (Sigma)로 경쟁적으로 용출된다. 상기 용출물은 농축되고, 버퍼는 30 kD 컷-오프 초여과 (cut-off ultrafiltration) (Millipore)를 사용하여 PBS에 의해 대체된다. 최종적으로 상기 농축된 용액은 자가-응집된 중합체를 제거하기 위해 0.2 mm 필터를 통해 통과된다.
재조합 라미닌-521의 특징화
배지 및 정제 후 분비된 라미닌은 3-8% 구배 SDS-PAGE를 사용하여 특징화된다. 단백질은 시프로 염색 (Sypro staining) (Bio-Rad)을 사용하여 가시화되고 또는 PVDF 상에 전달된다 (도 3). 막은 전술된 항체로 프로브된다. 세척 후, 상기 막은 HRP-접합된 염소 항체와 배양된다. 면역반응도는 제조자의 설명서에 따라, 화학발광 키트 (chemiluminescent kit) (Life Science Products)에 의해 검출된다.
방법
인간 ES 세포 배양
인간 ES 세포는 5% CO2의 37℃에서 (Rodin et al., Nature Biotechnol., vol. 28, pp. 611-615 (2010)에서 기재된) 화학적으로 규명된 03 배지에서 r-라미닌-521-코팅된 실험 접시 상에서 배양된다. 세포는 37℃에서 5분 동안 트립신-EDTA 용액 (GIBCO 인비트로겐)에 노출시켜 10-12 일마다 한 번씩 정기적으로 통과된다. 이들은 그 다음 단일-세포 현탁액으로 파쇄하기 위해 조심스럽게 피펫되고, 규명된 트립신 억제제 (GIBCO 인비트로겐)는 첨가된다. 상기 세포 현탁액은 4분 동안 원심분리되고, 상층액은 따라내고, 미리가온된 03 배지에 재현탁된 세포 펠렛, 및 세포는 그 다음 40 ㎛ 체를 통해 통과된다. 그 후 세포는 30 Kcells/㎠ 농도 (1:25-1:30 분열비)에서 새로운 r-라미닌-521-코팅된 접시 상에 도말된다. 오직 약간의 방울의 신선한 배지가 첨가되는 경우, 계대배양 후 첫번째 날을 제외하고는, 세포는 1시간 동안 배양기에서 미리가온된 신선한 배지로 하루에 한번 주입된다. 동일한 세포주의 대조구 세포는 Rodin et al., Nature Biotechnol., vol. 28, pp. 611-615 (2010)에서 기재된 바와 같은 03 배지에서 마트리겔 (BD Biosciences) 상에서 배양된다. 대조구 세포는 조각으로 계대배양된다.
세포 배양 접시 코팅
96 웰 조직 세포 배양 플레이트는 모두 30 mg/ml (5 mg/㎠)의 농도에서, ECM 단백질 쥐 LN-111 (인비트로겐), 인간 재조합 LN-511, 인간 재조합 LN-521의 멸균 용액으로 4℃에서 밤새 코팅된다. 대조구 세포에 대하여, 획득된 BD 마트리겔™ hESC (BD Biosciences)는 제조자의 설명에 따라 사용된다.
세포 접착 분석
상기 분석은 기재된 바와 같이 수행된다 (Extracellular Matrix Protocols, 2000). 간단하게, 96-웰 플레이트는 전술된 바와 같이 세포외 매트릭스 단백질에 의해 코팅되고, 소 혈청 알부민을 함유하는 03 배지에 의해 차단된다. 상기 ES 세포는 세포외 매트릭스-코팅된 플레이트 상에 600 cell / ㎟의 세포 밀도로 도말되고, 세포 배양기에 1 시간 또는 1일 동안 접착하기 위해 남겨둔다. 비-접착 세포는 세척되고, 접착 세포는 0.1% Crystal Violet에 의해 염색된, 5% 글루타르알데하이드에 의해 20분 동안 고정된다.
mRNAs의 실-시간 PCR 정량화
총 RNA는 분리되고, cDNA는 Rodin et al., Nature Biotechnol ., vol. 28, pp. 611-615 (2010)에 기재된 바와 같이 합성된다. 실-시간 정량 RT-PCR Taqman 분석법은 Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System을 사용하여 수행된다. 모든 반응은 관심의 mRNA에 대한 프라이머 및 프로브를 함유하는 미리개발된 유전자 발현 분석 혼합체 (Applied Biosystems)로 네 번 반복하여 수행된다. GAPDH에 대한 미리개발된 유전자 발현 분석 혼합체를 포함하는 각 실험에 대한 부가적 반응은 RNA 입력을 정상화하기 위해 사용된다. 모든 데이터는 7300 System SDS Software version 1.4로 분석된다.
FACS 분석
OCT4 발현은 Ludwig, T.E. et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined condition. Nat. Biotechnol.24, 185-187 (2006)에 기재된 바와 같이 분석된다. 세포는 FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson)에서 실행된다. 데이터는 CellQuest software (Becton Dickinson)로 분석된다.
실시 예 1의 결과
다른 세포 배양 코팅이 어떤 첨가제 없이 03 배지에서 인간 ES 세포의 단일 세포 생존에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HS181 세포를 완전하게 해리시키고, 마트리겔, 쥐의 라미닌-111, 인간 r-라미닌-511, 인간 r-라미닌-521, 또는 r-라미닌-511 및 r-라미닌-521의 혼합물 상에 이들을 도말하였다. 그 결과는 도 4에서 알 수 있다. 예상된 바와 같이, 도말 후 24 시간에 마트리겔 또는 쥐의 라미닌-111에 접착하여 유지된 세포는 거의 없다. 대조적으로, 사람 r-라미닌-521, 혼합물, 및 적은 정도로 사람 r-라미닌-511 상에 세포는 생존하였다.
실험은 ROCK 억제제 Y-27632로 처리된 03 배지에서 사람 ES 세포 상에서 반복된다. 이들 결과는 도 5에서 알 수 있다. 나머지 줄기 세포는 모두 5 코팅 상에 접착된다.
이러한 효과를 정량화하기 위하여, 본 발명자들은 도말 1 시간 및 1일 후에 상기 언급된 코팅 모두 (즉, Y-27632이 있거나 없이, 각각의 다섯 코팅) 상에서 세포 접착 실험을 수행하였다. 도 6은 Y-27632 없이 LN-521, LN-511, 및 마트리겔 (MG)에 대한 1-시간 실험 동안 결과를 나타낸다. 어떤 첨가제 없는 03 배지에서 사람 ES 세포의 접착은 현시점에서 거의 동일하다.
도 7은 상기 코팅 모두에 대해 1-일 실험에 대한 결과를 나타낸다. Y-27632 억제제를 함유하는 플레이트는 상기 코팅과 함께 "in&"로 표지된다. 도말 1일 후에, 첨가제 없는 LN-521에 접착된 줄기 세포는 첨가제 없는 마트리겔에 접착된 줄기세포보다 20배 더 많다. 부가하여, 상기 결과는 첨가제 없는 LN-521에 대한 세포의 접착이 ROCK 억제제를 포함하는 모든 접시 상에 세포의 접착과 유사한 것으로 나타난다. 다시말해서, ROCK 억제제는 상기 ROCK 억제제를 함유하는 코팅과 유사한 결과를 얻기 위하여 LN-532 코팅이 필수적이지 않다.
본 발명자들은 인간 r-라미닌-521 상에 인간 ES 세포를 1:25 내지 1:30 비에서 10-12일 마다 단일 세포 현탁액으로 완전한 해리 후 이들을 계대배양하여 배양하였다. 상기 세포는 적어도 9 계대배양 (3개월)동안 안정하고 높은 비율로 왕성하게 증식한다. 게다가, 3 계대배양 (1 개월) 후, 이들은 종래의 방법을 사용하여 배양된 20 계대배양 (100 일) 후 줄기 세포와 같이 동일한 수의 세포 배가 (doubling)를 겪는다. 이것은, 세포 수 대 시간에서 증가를 나타내는, 도 8에서 예시된다. LN-521 상에 세포는 마트리겔 상에서 보다 휠씬 더 빠른 속도로 증가된다. 따라서, 새로운 r-라미닌-521 hES 세포 배양 방법은 시간 및 노동력의 관점에서 유리하다.
어떤 첨가제 없는 03 배지에서 인간 r-라미닌-521 상에 여러번의 단일 세포 현탁액 계대배양 후 hES 세포의 동일성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 전분화능의 마커인, Oct4에 대한 FACS 분석을 수행하였다. 도 9는 r-LN-521 상에서 성장한 세포에 대한 결과를 나타내는 반면, 도 10은 마트리셀 상에서 성장한 세포에 대한 결과를 나타낸다. 양성 세포의 퍼센트는 괄호에 기재되었다. R-LN-521는 휠씬 더 높은 퍼센트의 다능성 세포를 갖는다.
부가하여, 상기 전분화능 마커 Oct4 및 Nanog의 mRNA 전사물의 수는 정량화된다. 도 11은 이들 결과를 나타낸다. 두 개의 마커에 대하여, LN-521 상에 세포는 더 많은 수의 전사물을 나타낸다.
두 방법들은 새로운 방법이, 작은 덩어리에서 세포의 계대배양 및 세포 배양 접시 코팅 물질로서 마트리겔을 사용하는, 종래의 방법보다 동일하거나 또는 더 우수한 품질의 hES 세포를 제공한다는 것을 나타낸다.
실시 예 2
본 실시 예 2에 있어서, 다능성 hES 세포에서 또한 발현되는 발현 및 정제된 재조합 LN-521은 배양된 hES 및 iPS 세포 상에 이의 효과에 대해 연구된다. 상기 결과는 LN-521, 단독으로 다능성 hES 및 iPS 세포의 자가-재생을 강하게 지지하고, 중요하게는, 이것이 높은 희석에서 LN-521 상에 단일 세포 현탁액에서 트립신화된 줄기 세포의 도말 후에 다능성 줄기 세포의 생존을 허용하는 것을 나타낸다. LN-521의 효과는 hES 세포 이주 및 PI3K/Akt 경로 활성의 유도를 통해 α6β1 인테그린을 통해 신호에 의해 매개되는 것을 나타낸다. 상기 결과는 줄기 세포의 다능성의 자가-재생을 위한 새로운 배지 제형의 뿐만 아니라, 다능성 hES 및 iPS 세포의 대량 생산을 위한 효과적이고 자동화된 확장 방법에 대해 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 새로운 hES/hiPS 세포 배양 방법은 표준 세포 배양 방법, 예를 들어, 섬유아세포를 배양하기 위해 사용된 방법과 밀접하게 유사하고, 따라서 특별한 기술을 요구하지 않는다. 이것은 하나의 세포 분열 당 세포 코팅 물질이 상당히 적게 소비되고, 효과적인 시간이며, 따라서 hES/hiPS 세포를 배양하기 위한 이전의 절차와 비교하여 상당한 경제적 이득을 제공한다.
이전에 순수한 형태로 이용가능할 수 없는, 인간 재조합 LN-521은 전체-길이 라미닌 β2 cDNA를 클로닝하여 생산되고, 인간 라미닌 α5, β2 및 γ1 사슬로 HEK293 세포의 삼중-감염을 수행한다. 인간 재조합 LN-111 및 LN-121은 전체-길이 α1 및 β2 사슬 cDNA의 클로닝 및 각각의 사람 α1, β1 및 γ1 및 α1, β2 및 γ1 사슬 cDNA와 HEK293 세포의 삼중 감염 후에 유사하게 발생된다. 정제된 LN-521, LN-111 및 LN-121 단백질은 단백질 염색 및 웨스턴 블럿 분석에 의해 알 수 있는 바와 같이, 각각, α1, β2 및 γ1 사슬뿐만 아니라, 순수한 α5, β2, 및 γ1 사슬, α1, β1 및 γ1 사슬을 함유하는 것으로 나타난다.
방법
인간 ES 및 iPS 세포 배양
HS181 및 HS401의 인간 ES 세포는 5% CO2의 37℃에서 (7.35로 조정된 pH를 갖는 Rodin et al., Nature Biotechnol ., vol. 28, pp. 611-615 (2010)에서 기재된) O3 배지, mTeSR1 (STEMCELL Technologies) 및 화학적으로 규명된, 이종-없는 TeSR2 (STEMCELL Technologies)에서 LN-521-코팅된 배양 접시 상에서 배양된다. 초기에, 세포주의 세포들은 후속 트립신처리법 (trypsinization)으로 멸균 칼을 사용하여 조심스럽게 스크래칭하여 인간 지주 세포층으로부터 LN-521 코팅으로 전달되거나, 또는 상기 세포는 LN-511 코팅으로부터 단일 세포 현탁액으로 트립신화된다. 상기 세포는, 오직 신선한 배지의 몇몇 방울이 첨가된 경우, 도말 후 첫날을 제외하고, 한 시간 동안 배양기에서 미리-가온된 신선한 배지로 하루에 한번 제공된다. 세포는 5% CO2, 37℃에서 5 분동안 트립신/EDTA (GIBCO Invitrogen Corporation, Paisley, Scotland)에 노출시켜 10-12 일에 한번 정기적으로 통과된다. 이들은 그 다음 단일-세포 현탁액을 파쇄하기 위해 조심스럽게 피펫되고, 규명된 트립신 억제제 (GIBCO Invitrogen)는 첨가된다. 상기 세포 현탁액은 4분 동안 25 rcf에서 원심분리되고, 상기 상층액은 따라 내며, 상기 세포 펠렛은 미리가온된 03 배지에서 재현탁되고, 및 상기 세포는 그 다음 40 ㎛ 체를 통해 통과된다. 그 뒤에, 상기 세포는 1:25-1:30 분할비에서 30,000 cells/㎠의 농도로 새로운 LN-521-코팅된 접시 상에 도말된다. 동일한 세포주의 대조구 세포는 이전에 기술된 바와 같은 03 배지에서 마트리겔 (STEMCELL Technologies) 및 LN-511 상에서 배양된다.9
규명된 이종-없는 배양을 위하여, TeSR2 (STEMCELL Technologies) 배지 및 어떤 동물 유래된 성분 TrypLE™ Select (GIBCO Invitrogen Corporation, Paisley, Scotland)을 면한 규명된 효소는 사용된다. 상기 세포들은 5% CO2의 37℃에서 4-5분 동안 TrypLE™ Select에 노출시켜 10-14일마다 통과된다. 그 다음, 상기 효소는 조심스럽게 흡입되고, 미리가온된 TeSR2 배지는 첨가된다. 그 후, 상기 세포는 단일-세포 현탁액으로 파쇄하기 위해 조심스럽게 피펫되고, 원심분리되며, 상층액은 따라 내고, 세포 펠렛은 미리가온된 TeSR2에서 재현탁된다. 상기 세포는 그 다음 40 ㎛ 체를 통해 통과되고, 신선한 LN-521 코팅된 접시 상에 도말된다.
조직 세포 배양 플레이트는 30 ㎍/ml (5 ㎍/㎠)의 농도에서 모두, 인간 재조합 LN-521과 같이, ECM 단백질의 멸균 용액으로 4℃에서 밤새 코팅된다. 대조구 플레이트는 STEMCELL Technologies의 설명서에 따라 마트리겔로 코팅된다. 사용하기 전에, 접시는 한 시간 동안 배양기에서 미리-가온된 후, 가온된 03 배지는 접시의 부가적인 세척 없이 첨가된다. 새로운 접시에 신선한 LN-521 용액을 적용한 후, 나머지 LN-521 용액은 적어도 한번 이상 사용될 수 있다. 접착, 생존, 생존 실험의 억제 모두는 신선한 코팅 물질을 사용하여 수행된다.
상기 인간 iPS 세포, ChiPSW 세포주는, OCT-4/SOX2/NANOG/LIN28 재프로그래밍 유전자로 렌티바이러스성 (lentivirally) 형질도입된 인간 포스킨 (foreskin) 섬유아세포 (HFF)로부터 유래된다. 상기 ChiPSW 세포주는 다른 계대배양에서 반복되는 시험에서 정상 남성의 염색체 (normal male karyotype), 46,XY를 갖는다. 세포 배양 및 계대배양 실험 전에, 상기 세포는 전분화능 마커의 발현에 대해 생체외에서 먼저 특징화된다. Oct3/4 (SC-5279), Nanog (SC-33759), TRA-1-60 (SC-21705) 및 SSEA4 (sc-21704)에 대한 항체를 갖는 면역형광법 (Immunofluorescence) 연구는 상기 세포가 전분화능의 이들 마커 모두를 발현시키는 것으로 나타난다. RT-PCR 분석은 상기 세포가 바이러스성 도입유전자 (transgene)의 발현이 결핍되는 것을 확인한다. ChiPSW 세포의 전분화능은 생체외 (배양체 (embryoid bodies) 형성 및 면역형광법 연구) 및 생체 내 (쥐에 SCID로 피하 주사) 실험에 의해 확인된다. ChiSW의 세포주는 박동 심근 세포 (beating cardiomyocytes)로 더욱 분화될 수 있다. 이들은 또한 조혈적 분화를 겪을 수 있다.
본 지지세포 없는 배양에 받아들이기 전에, 상기 iPS 세포는 조사된 인간 포스킨 섬유아세포에 걸쳐 유지되고 확장된다. 녹-아웃 혈청 (KSR, 인비트로겐)-보충 배지는 증식을 위해 사용되고, 8 ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, R&D 시스템)로 보충된다. 세포는 콜라겐나제 IV (1 mg/ml, Roche) 또는 요구시 수동 절개 (dissection)를 사용하여 매일 및 매주 계대배양시 주입된다.
이들 실험 전에, 상기 CutB1.2 세포는 바이러스 도입유전자의 발현이 결핍되는, 전분화능 마커 Oct4/Nanog/Skox2/TRA-1-60/TRA-1-81을 발현하는 것으로 나타나고, 상기 세포의 전분화능은 생체 내 및 생체 외 분화 연구에 의해 모두 확인된다.
라미닌-521 및 다른 코팅 물질
BioLamina, AB, Stockholm (www.biolamina.com)으로부터 이용가능한, 인간 재조합 LN-521은, 전술된 바와 같이 필수적으로 전체-길이 라미닌 γ1, β2 및 α5 구성체로 연속적으로 감염된 인간 배아 신장 세포 (HEK293; ATCC CRL-1573)에서 생산된다. 단백질 생산을 위하여, 상기 HEK293 세포는 6일 동안 GlutaMax I로 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양된다. 상기 LN-521 분자는 항-FLAG 매트릭스 (Sigma)를 사용하여 친화성-정제되고, 그 다음 환원 및 비환원 상태 하에서 3-8 % 및 4-15 % 구배 SDS-PAGE를 사용하여 특징화된다. 상기 단백질은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막 상에 사슬의 면역염색 및 Sypro Ruby (Bio-Rad) 단백질 염색을 사용하여 가시화된다. 단백질을 더욱 특징화하기 위하여, 상기 라미닌 α5, β2 및 γ1 사슬에 대한 항체로 웨스턴 블럿 분석은 수행된다. 인간 재조합 라미닌-111 및 라미닌-121은 LN-521과 유사하게 생산되고, 웨스턴 및 SDS-PAGE에 의해 예견된 분자 크기의 교정된 사슬을 함유하는 것으로 나타난다. 만약 별도의 언급이 없다면, 상응하는 쥐 라미닌-111 (인비트로겐)은 LN-111로 표시된다.
시약 및 항체
InSolution™ LY 294002 (특이 Akt 억제제), InSolution™ Wortmannin (특이 PI3K 억제제), 및 InSolution™ 98059 (특이 MEK1/Erk 억제제)는 Calbiochem으로부터 구매된다. 포스포-Akt (#4060), 총-Akt (#9272), 포스포-Erk (#9101), 및 총-Erk (#9102)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology로부터 얻어진다. PathScan Phospho-Akt1 sandwich ELISA kit (#7160), PathScan total Akt1 sandwich ELISA kit (#7170), PathScan Phospho-Akt2 sandwich ELISA kit (#7048), 및 PathScan total Akt2 sandwich ELISA kit (#7046)은 또한 Cell Signaling Technology로부터 구매된다. Calnexin (#ab10286)에 대한 항체는 Abcam으로부터 얻어진다. 다양한 인테그린 서브유닛, 쥐 이소타입 항체, 및 α-디스트로글리칸 (dystroglycan)에 대한 기능성 차단 항체는 Millipore로부터 구매된다. αV (MAB1980) 및 α6 (MAB1378)에 대한 기능성 차단 항체가 아지드산 나트륨 (sodium azide)을 갖는 용액에 존재하기 때문에, 생존 실험의 억제 전에 알파 인테그린 서브유닛에 대한 항체 모두는 각 2시간 동안 03 배지에 대해 세 번 투석된다. 랫트 이소타입 대조구 항체뿐만 아니라, 루테란 수용체 및 α-페토단백질 (α-fetoprotein)에 대한 항체는 R&D 시스템으로부터 얻어진다. Oct4, Nanog, SSEA-4, 평활근 액틴 (smooth muscle actin) 및 MAP-2에 대한 항체는 Millipore로부터 구매된다.
면역형광법
면역형광법 연구를 위하여, ES 세포는 한 시간 동안 0.1 % Tween-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com)을 함유하는 인산염-식염수 버퍼 (phosphate-saline buffer) (PBS)에 10% 소 태아 혈청 (GIBCO Invitrogen Corporation)에 의해 차단되고, 0.1 % Triton-X에 의해 투과가능한, 4 % 파라포름알데하이드에 의해 96-월 플레이트 웰 또는 8-웰 슬라이드 챔버 (BD Biosciences)에 고정되고, 배양된다. 1차 항체로 배양은 실온에서 1.5시간 동안 수행된다. 2차 항체로 배양 및 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Molecular Probes)은 40분 동안 수행된다. 배양 사이에, 상기 검체는 PBS 버퍼에 0.1% Tween-20으로 3 내지 5번 세척된다. 검체는 형광 마운팅 배지 (fluorescence mounting medium) (Dako, Glostrup, Denmark, http://www.dako.com)에 보존되고, 형광 현미경 (Leica, Heerbrugg, Switzerland, http://www.leica.com)하에서 관찰된다.
다른 mRNA의 실-시간 PCR 정량화
총 RNA는 제조자의 설명서에 따라 Absolutely RNA Microprep Kit (Stratagene, La Jolla CA, www.stratagene.com)를 사용하여 분리된다. cDNA는 제조자의 설명서에 따라, 올리고(dT)12-18 프라이머 및 Superscript II 역 트랜스크립타아제 (GIBCO Invitrogen Corporation)를 함유하는, 20 ㎍ 반응 혼합물에 0.2 ㎍의 총 RNA를 사용하여 합성된다. 실-시간 정량 RT-PCR Taqman 분석법은 Applied Biosystems 7300 실-시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행된다. 모든 반응은 관심의 mRNA에 대한 프로브 및 프라이머를 함유하는 미리-개발된 유전자 발현 분석 혼합 (Applied Biosystems)을 사용하여 네 번 수행된다. 각각 실험에 대한 부가적 반응은 RNA 입력을 정상화하기 위해 GAPDH에 대한 미리-개발된 유전자 발현 분석 혼합을 포함한다. 모든 데이터는 7300 System SDS Software v 1.4로 분석된다.
FACS 분석
세포는 트립신/EDTA로 배양 접시로부터 제거되고, 단일 세포 현탁액으로 해리되며, 찬-얼음 FACS 버퍼 (Hank의 버퍼에 2 % 소태아 혈청, 0.1 % 아지드 나트륨 (sodium azid))에서 재현탁된다. (Millipore, Billerica, MA, http://www.millipore.com)로부터의 SSEA-4에 대한 1차 항체로 배양은 얼음에서 한 시간 동안 수행된다. 그 다음, 상기 세포는 찬-얼음 FACS 버퍼로 세 번 세척된다. 나중에, 상기 세포는 암실에서 30분 동안 Alexa Fluor 항-쥐 2차 항체 (GIBCO Invitrogen Corporation)의 1:400 희석으로 FACS 버퍼에서 프로브되고, 네 번 세척된다. 대조구 세포는 쥐의 면역글로블린으로 배양되고, 이어서 전술된 바와 같은 2차 항체로 배양된다. 세포는 FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서 분석된다. 데이터는 CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)로 분석된다.
핵형분석 (Karyotyping)
상기 세포주의 핵형 분석은 표준 Q-밴딩 기술을 사용하여 수행된다. 세포의 샘플은 트립신/EDTA 용액 (Gibco Invitrogen Corporation)으로 해리를 수반하여, 4시간 동안 콜세미드 (colcemid) KaryoMAX (0.1 mg/ml; Gibco Invitrogen Corporation)로 처리된다. 상기 세포는 원심분리를 통해 펠렛되고, 미리-가온된 0.0375 M KCl 저장액 (hypotonic solution)에서 재현탁되며, 10분 동안 배양된다. 원심분리 후에, 상기 세포는 정착액 (fixative) (3:1 메탄올:아세트산)에서 재현탁된다. 중기 염색제 전개 (Metaphase spreads)는 유리 현미경 슬라이드 상에서 준비되고 트립신에 명확히 노출시켜 G-밴드되며, 4:1 Gurr's/Leishmann's stain (Sigma-Aldrich Co.)로 염색된다. 최소 10개 중기 염색체 전개는 분석되고, 부가적 20개는 계산된다.
기형종 형성 (Teratoma formation)
기형종 형성 실험은 어린 (7-주-령) 중증 합병성 면역결핍 장애 (SCID) 쥐의 고환의 막낭 (testicular capsule) 아래에 대략 106 세포의 이식에 의해 수행된다. 각 세포주 당 세 개의 동물이 사용된다. 기형종 성장은 매주 마다 촉진에 의해 관찰되고, 상기 쥐는 이식 8 주 후 희생시킨다. 상기 기형종은 고정되고, 섹션은 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin) (HE) 또는 헤마톡실린, 에오신 및 PAS (HE-PAS)로 염색된다. 세 개의 배아 정자 세포주 층 모두의 조직 성분의 존재는 염색된 섹션으로부터 분석에 따라, 입증된다. 모든 동물 실험은 윤리위원회의 승인에 따라 Karolinska University Hospital의 감염-없는 동물 시설에서 수행된다.
배양체 형성
LN-521 코팅된 세포 배양 접시로부터의 ES 세포는 5% CO2의 37℃에서 1분 동안 TrypLE™ Select에 노출되고, 배지에서 두번 세척되며, 큰 조각으로 분쇄되고, 낮은 접착 플레이트에 현탁액에서 배양된다. 이를 위해 사용된 배지는 2 mM L-글루타민, 20% 소 태아 혈청 (GIBCO Invitrogen Corporation), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (GIBCO Invitrogen Corporation) 및 1% 비-필수 아미노산 (GIBCO Invitrogen Corporation)으로 보충된 녹아웃 DMEM (GIBCO Invitrogen Corporation)이다. 현탁액에서 1-2 주 후, 상기 배양체는 젤라틴 코팅된 조직 세포 배양 96-웰 플레이트 (Sarstedt) 상에 전달되고, 1-2 주 동안 배양되며, 그 다음 고정되고, 세 개의 배아 정자 세포주 층 (평활근 액틴, MAP-2 및 α-페토단백질)의 마커에 대한 항체로 염색되며, 면역형광법에 대해 전술된 바와 같이 분석된다.
세포 접착 분석법
간단히, 96-웰 플레이트는 전술된 바와 같은 세포외 매트릭스 단백질에 의해 코팅되고, 소 혈청 알부민을 함유하는 03 배지에 의해 차단된다. ES 세포는 세포외 매트릭스-코팅된 플레이트 상에 50,000 cells/㎠의 세포 밀도로 도말되고, 세포 배양기에 1시간 동안 접착을 위해 남긴다. 상기 플레이트는 미-접착 세포를 제거하기 위해 배지를 세 번 세척한 후, 그 다음 접착 세포는 0.1% Crystal Violet (Kebo Lab, Spanga, Sweden,http://www.kebolab.se)에 의해 염색된, 5% 글루타알데하이드에 의해 20 분 동안 고정된다. 한 시간 후 물로 3번 세척한 후, Crystal Violet은 10% 아세트산으로 추출되고, 570 nm에서 광학 밀도를 측정하여 정량화된다. 모든 실험은 네 번 중복하여 수행된다.
생존 분석의 세포 생존 및 억제
상기 생존 분석은 상기 세포가 24시간 동안 세포 배양기에 남겨두는 것을 제외하고, 전술된 세포 접착 분석에 대해 기재된 바와 같이 수행된다. 생존 분석의 억제에 대하여, 상기 세포는 30분 동안 교본에 지시된 농도의 경로 억제제 또는 제조업자에 의해 권장된 농도의 기능성 차단 항체를 갖는 배지에 유지되고, 그 다음 상기 코팅 접시에 도말된다. 모든 실험은 네 번 중복하여 수행된다.
웨스턴 블럿 및 ELISA.
HS 181 세포는 전술된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로 트립신처리된다. 억제 실험을 위하여, 상기 세포는 30분 동안 경로 억제제 또는 차단 항체를 갖는 03 배지에 유지되고, 그 다음 450K 세포는 적절한 매트릭스 코팅으로 미리코팅된 35 mm 접시 상에 도말된다. 다른 실험을 위하여, 동일한 수의 세포는 트립신처리 (trypsinization) 후 직접 도말된다. 모든 경우에 있어서, 세포는 5% CO2의 37℃에서 1시간 동안 확산시키는 것이 허용된다. 찬-얼음 PBS에서 두 번의 세척 후, 세포를 갖는 플레이트는 액체 질소에서 스냅 동결되고 (snap frozen), -80℃에 저장된다. 웨스턴 블럿 및 ELISA를 위한 샘플을 준비하기 위하여, 상기 플레이트는 느리게 해동되고, 상부에 100-150 ml의 용해 버퍼 (lysis buffer) (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.5% 디옥시콜레이트 (deoxycholate), 0.5% SDS, 1% Triton X-100, 1% Igepal, Complete™ (Roche) 및 Phospho-Stop™ (Roche))로 얼음 상에 유지된다. 그 다음, 상기 세포는 27G ¾" 바늘을 통해 긁어내고, 피펫되며, 전단된다. 그 후, 상기 세포 펠렛은 4℃에서 15분 동안 16,100 rcf에서 원심분리하여 정 정화된다. 웨스턴 블럿을 위하여, 4-12% 구배 겔은 SDS 전기영동을 위해 사용되고, 상기 단백질은 PVDF 막으로 전달된다. 상기 막은 제조자의 설명서에 따라 관심의 항체와 이종교잡된다. Amersham Biosciences으로부터 화학발광 (Chemoluminescent) HRP-기질은 가시화를 위해 사용된다. 밀도계 분석 (densitometry analysis)을 위하여, 필름은 2,400 dpi에서 스캔되고, ChemiImager5500 프로그램 (1D-Multi Line 밀도계 모드)에 의해 분석된다. ELISA을 위하여, 상기 샘플은 제조자의 설명서에 따라 웰에 적용된다.
생체 내에서 영상 및 이주 분석
24-웰 플레이트는 세포외 매트릭스 단백질에 의해 코팅되고, 소 혈청 알부민을 함유하는 03 배지에 의해 차단된다. 상기 ES 세포는 세포외 매트릭스-코팅된 플레이트 상에 30,000-40,000 cells/㎠의 세포 밀도로 도말되고, 세포 배양기에서 한 시간에 절반이 접착하도록 남겨둔다. 그 후, 상기 플레이트는 5% CO2의 37℃를 유지하도록 허용된, 환경적 대조구 유닛이 장착된 고 함량 영상 시스템 Operetta (PerkinElmer)로 전달된다. 만들어진 두 개의 영상을 위하여, 밝은 부분 영상은 Harmony software (PerkinElmer)을 사용하여 도말 후 24시간 동안 15분에 한번 씩 찍고, 분석을 위해 전송하고, 및 ImageJ software (NIH, the US)을 사용하여 분석된다. 이주 분석을 위하여 상기 영상은 도말 후 18시간 동안 8분마다 찍는다. 도말 후 다섯 번째 및 일곱 번째 시간 사이에 획득한 영상은 MTrackJ pluγ-in (University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands)을 사용하여 분석된다. 각 코팅 상에서 100 부착된 세포는 미량이고, 현재부터 트랙의 이전 시점까지의 평균 거리는 계산된다. 오류 바는 평균 s.e.m. (n≤100)의 표준 오차를 나타낸다.
통계. 통계적 중요성은 이분산성 (unequal variances)을 위한 Student's two-tailed t-test에 의해 결정된다.
실시 예 2에 대한 결과의 논의
다능성 hES 세포는 α1, α5, β1, β2 및 γ1 라미닌 사슬을 발현한다. 단일 세포 현탁액으로부터 다른 코팅 기층으로 도말된 hES 세포의 접착 및 클론 생존을 비교하기 위하여, LN-511 상에 단층 또는 지지층 상에 클러스터로서 성장한 hES 세포는 03 배지에서 단일 세포 현탁액으로 트립신처리되고, ROCK 억제제 (Y-27632)의 존재 또는 부재하에서, 마트리겔, LN-111, LN-511, LN-521 또는 LN-511 및 LN-521의 혼합물로 코팅된 세포 배양 접시 상에 도말되고, 24 시간 후 분석된다.
상기 세포는 마트리겔 또는 LN-111 상에서 생존하지 않지만, 두 개의 혼합물 상뿐만 아니라, 인간 재조합 LN-511 및 LN-521 상에 단일 세포로서 생존한다. 그러나, LN-521 상에 세포의 생존은 (아래 수로 비교하여) LN-511 상에서 상당히 더 높다. 인간 재조합 LN-111 또는 LN-121 상에 도말된 세포는 24 시간 후 생존에 실패하였고 (나타낸 데이터 없음), 이것은 라미닌 삼량체에서 β2 사슬의 존재가 효과를 지지하기에 충분하지 않다는 것을 입증한다. ROCK 억제제 Y-27632의 존재에 있어서, 상기 hES 세포는 모든 표면상에 생존하였다.
그러나, 도말 24 시간 후 ROCK 억제제의 부재 또는 존재하에서 LN-521 상에 성장하는 세포들 사이의 세포 모양과 관련하여 명백한 차이점이 있다. 도말 24 시간 후 ROCK 억제제의 부재하에 있어서, LN-521 상에 성장하는 세포는 원형인 반면, ROCK 억제제의 존재하에서 성장하는 세포는 액틴 세포골격의 재배열에 의해 가능하게 유발된 스핀들 (spindle) 또는 초승달 (crescent) 유사 모양을 채택한다.
시험을 위하여 만약 LN-521이 인간 다능성 세포의 장기간 자가-재생에 대한 세포 코팅 물질로서 사용될 수 있다면, HS181, HS401, H1 세포 및 인간 iPS ChiPSW 및 Cutβ1.2 세포는 O3, mTeSR1 또는 TeSR2 배지 내의 단백질 상에 배양된다. O3 또는 TeSR1 배지에 성장하는 세포는 1:20-1:30의 비로 10-14일 마다 단일 세포 현탁액에서 통과된다. 다능성 hES 세포는 작은 덩어리에서 통과된 경우 LN-511 또는 마트리겔 상에서 성장된 세포와 유사 또는 더 높은 안정 비율로 증식된다. 따라서, LN-521 상에서 1회 계대배양은 덩어리에서 두 번 통과된 대조구 세포의 세포 분열과 같거나 또는 더 높은 수의 세포 분열을 산출한다. HS181, HS401, 및 H1 세포는 O3 배지에서 각각, 적어도 24, 5 및 15 계대배양을 위해 증식된다 (9, 2 및 6 개월). Cutβ1.2 iPS 및 ChiPSW 세포는 각각 mTeSR1에서 5 및 3 계대배양을 위해 배양된다. 흥미롭게도, 해리된 hES 세포는 TeSR2 배지 및 TrypLE Select 효소를 사용하여, 완전하게 규명되고 이종-없는 조건하의 LN-521 상에서 배양될 수 있다. 계대배양 후 도말 효율은 O3 또는 mTeSR1 배지에서의 세포의 것보다 다소 낮지만, 상기 해리된 세포는 1:15-1:20 비로 10-14일 마다 정상적으로 통과된다. H1 및 HS401 세포는 TeSR2에서 각각 (5 및 1.5 개월), 12 및 4 계대배양 동안 배양된다.
상기 hES 세포는 LN-521으로 코팅된 배양 접시의 1 ㎠ 당 30,000 세포에서 단일 세포 현탁액에 일반적으로 도말되고, 그 후 개별 세포는 서로 어떤 직접적 접촉이 결핍된다. 도말 8 시간 후, 상기 hES 세포는 전분화능 마커 Oct4, Nanog, 및 Sox2를 발현하는 단일 세포로서 관찰될 수 있다. 도말 24 시간 후, 상기 세포는 상기 웰의 대부분을 피복하는 단층의 커다란 섬으로 궁극적으로 조합되는 작은 단층 콜로니를 형성한다.
LN-521 상에 성장된 세포는, 마트리겔 상에 도말된 세포에서와 유사하고, 작은 덩어리로서 통과되는, 전분화능 마커 Oct4, Nanog, 및 SSEA4의 안정한 발현 수준을 나타낸다. LN-521 및 마트리겔 배양에서 자발적 분화의 수준을 비교하기 위하여, 마트리겔 배양 및 LN-521 배양에서 발현된 분화 마커 PAX6, SOX17 및 SOX7에 대한 mRNA의 양은 1회 (10일) 및 10 계대배양 (4 개월) 후 비교된다. 정량적 RT-PCR은 계대배양 수에 독립적으로 LN-521 배양에서 분화의 모든 세 개 마커의 유사하거나 또는 적은 수준의 발현을 나타낸다.
핵형은 03 배지에서 LN-521 상에, 각각, 12 및 10 계대배양 후 hES 세포주 HS181 및 H1에 대해 및 TeSR2 배지에서 7 계대 배양 후 H1에 대해 정상적이라는 것으로 확인된다. 기형종의 조직검사 조사는 03 배지에서 LN-521 상에, 각각 13 및 12 계대배양을 위해 배양된 HS181 및 H1 세포, 및 인간 배아의 모든 세 개의 생식 계통 세포를 함유하는 조직의 발달이 나타난 TeSR2에서 LN-521상에서 7 계대배양 후 배양된 H1 세포의 주입 후 SCID 쥐에 형성된다. 생체 외에서 분화는 또한, 세 가지 경우에 있어서, 상기 세포가 중간엽 (mesoderm) (평활근 액틴), 외배엽 (ectoderm (MAP-2) 및 내배엽 (endoderm) (α-페토단백질 (fetoprotein))의 마커를 발현하는 배양체를 형성하기 위한 기능 (competence)을 보유하는 것으로 나타난다.
상기 코팅 기층의 효율을 정량화하기 위하여, 마트리겔, LN-111, LN-511, LN-521, 및 LN-511 및 LN-521의 균등 혼합물 상에서 해리된 hES 세포의 1시간 후 접착 및 24 시간 후 생존은 연구된다. 흥미롭게도, 비록 상기 세포의 분산이 마트리겔 또는 LN-111 (도시되지 않음) 상에서 보다 LN-521 및 LN-511 상에서 더욱 명백할지라도, 한 시간 후 약 동일한 75-80%의 세포는 상기 코팅 모두에 접착된다. 24 시간 후, 마트리겔 또는 LN-111 상에 생존한 세포는 거의 없고, LN-511상에는 매우 적다. 반대로, LN-521 상의 hES 세포의 생존은 마트리겔보다 약 20배 더 많고, LN-511보다 세 배 많다.
LN-521 및 ROCK 억제제 (Y-27632)의 효과를 정량적으로 비교하기 위하여, 본 발명자들은 10 mM의 Y-27632를 함유하는 배지에서 동일한 도말 밀도 (1 ㎠당 40,000 세포)에서 동일한 단일 세포 현탁액으로부터 세포를 도말하고, 다른 코팅 상에 이들의 생존을 연구하였다. LN-521 상에 미처리된 세포 및 마트리겔 상에 Y-27632 처리된 세포는 도말 24 시간 후 유사한 생존 비율을 나타낸다. 흥미롭게도, Y-27632 처리된 인간 ES 세포 조차도 마트리겔보다 LN-521에서 더 생존한다.
만약 외인성 bFGF가 03 배지로부터 제거된다면, 상기 세포는 마트리겔보다 LN-521에서 20배 더 높은 생존을 여전히 나타낸다. 게다가, hES 세포는, 상기 TeSR1 제형 (bFGF, LiCl, γ-아미노부티르산 (aminobutyric acid) (GABA), 피페콜린산 및 TGFb)16의 성장 인자 모두가 결핍된 배지에서 조차도, 도말 24 시간 후 LN-521 상에 생존하며, 이는 상기 생존 메카니즘이 이들 인자에 의해 유도된 신호에 독립적인 것을 제시한다.
상기 플라즈마 막에 LN-521에 대한 잠재적 수용체에 대해 기능-차단 항체를 사용하는 세포 생존의 억제에 대한 분석은 인테그린 α6에 대한 항체, 및 β1에 대한 다소 적은 함량에 대한 항체가, LN-521 상에 인간 ES 세포의 생존을 억제하는 것으로 나타난다. 루터란 (Lutheran) 수용체 및 α-디스트로글리칸뿐만 아니라, 다른 시험된 인테그린 서브유닛에 대한 기능-차단 항체는 만약 LN-521 상에 인간 ES 세포 생존 상에 어떤 영향을 미친다면 거의 없는 것을 나타낸다.
최근, ROCK 억제제 및 블레비스타틴 (blebbistatin)이, 미오신 경쇄 (MLC)의 인산화에 의해 이주되는, 액틴-미오신 수축성 (contractility)의 폐기 (abrogation)을 통해 작용하는 것을 보여준다. 시험을 위하여, 만약 LN-521이 유사한 활성을 갖는다면, 포스포릴화된 MLC의 수준은 도말 1 시간 및 6 시간 후 마트리겔, LN-111, LN-511, 및 LN-521 상에 해리된 세포들 사이가 비교된다 (도 12 및 도 13). 흥미롭게도, 웨스턴 블럿은 MLC의 인산화가 마트리겔 및 LN-111 상에 세포보다 LN-511 및 LN-521 상의 세포에서 더 높은 것을 나타낸다. 액틴-미오신 재배열이 수축뿐만 아니라 세포 운동성에 필수적이기 때문에, 본 발명자들은 세포 이주가 LN-521 및 이것의 인테그린 수용체 α6β1 사이의 상호작용에 의해 유발될 수 있는 것으로 추측하였다. 생체 내에서 마트리겔 및 LN-521 상에 세포의 영상은 상기 세포가 후자에서 훨씬 더 빠르게 이주하고, 작은 빠른 이동 콜로니로 응집하여 생존하는 것을 나타낸다. 네 개의 코팅 상에 hES 세포의 이주는 또한 상기 세포가 모든 경우에 있어서 여전히 부착된 경우 도말 다섯 시간 및 일곱 시간 후 사이를 비교한다 (도 14). LN-521에 상기 hES 세포의 운동성은 다른 코팅 상의 세포의 운동성보다 더 많고, 이들에서 생존하기 위한 능력과 연관된다. 인테그린 β1에 대해 기능 차단 항체로 처리는 LN-521 상에 세포의 운동성 (도 15) 및 접착 (나타낸 데이터 없음)을 상당히 감소시킨다.
광범위한 데이터의 내용은 인테그린에 의해 MEK1/Erk 또는 PI3-키나제/Akt 경로의 활성이 아노이키스 (anoikis)를 차단할 수 있는 것을 나타낸다. 각각 Akt 및 MEK1의 특이 억제제인, LY 294002 및 PD 98059의 효과는 LN-521에서 hES 세포 생존에서 이들 경로의 잠재적 역할을 노출시키는 것으로 조사된다. LY 294002에 의해 Akt 활성의 차단 (Blockade)은 LN-521 상에 도말 24 시간 후 생존한 세포가 없는, hES 세포 사멸 및 분리 (detachment)를 촉진하는 것을 확인하였다 (도 16). 반대로, PD 98059로 처리는 심각하게 생존에 영향을 미치지 않는다. 또 다른 PI3K/Akt 특이 억제제인, Wortmannin으로 처리된 hES 세포는 또한 PI3K/Akt의 활성이 LN-521 상에 세포 생존을 위해 필수적인 것을 확인하는, LN-521 상에 도말 24 시간 후 생존에 실패하였다.
bFGF가 MEK1/Erk 경로의 강력한 활성자로 알려져 있기 때문에, 이의 영향은 PD 98059에 의해 전체적으로 억제될 수 없고, 본 발명자들은 동일한 결과를 갖는 외인성 bFGF 없는 03 배지에 동일한 실험에서 수행한다 (도 17). LY 294002 및 PD 98059 처리의 효율은 처리된 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인되고, 대조구 세포는 LN-521 상에 도말 한 시간 후 수집된다 (도 18 및 도 19).
포스포-Akt에 대한 항체를 갖는 마트리겔 및 LN-521에서 성장하는 세포의 추출물의 웨스턴 블럿 분석은 PI3K/Akt 경로가 두 경우에 있어서 활성이라는 것을 나타낸다 (나타낸 데이터 없음). 다른 코팅 상에 세포에서 Akt 활성의 수준을 결정하기 위해, ELISA는 상기 세포가 서로 직접 접촉하지 않는 경우 마트리겔, LN-111, LN-511 및 LN-521 상에 도말 한 시간 후 수집된 세포 용해물 상에서 수행된다 (도 20 및 도 21). 다른 코팅 상에 세포에서 Akt2 인산화의 수준은 이들 상에 생존성 (survivability)과 연관된다.
이것은 α6 및 β1 인테그린이 각각 알파 및 베타 서브유닛 가운데 인간 ES 세포에서 가장 풍부하게 발현된 인터그린 동종단백질이라는 것이 입증되었다. 인테그린 α6β1은 다른 라미닌으로 향하는 특이성의 광범위한 스펙트럼을 나타내지만, LN-521 또는 LN-511에 대한 결합 친화성은 LN-111에 대해 것 보다 더 크다. 최근에, β2 라미닌은 β1 라미닌보다 인테그린에 대해 더 높은 친화성을 갖는 것으로 확립되었다. 따라서, 인테그린에 대한 가장 높은 친화성을 갖는, LN-521은 이주에 대한 최선의 정착을 제공할 수 있고, 비록, 예를 들어, LN-511이 더 낮은 정도에서 이를 수행할 수 있을지라도, 해리된 다능성 hES 세포의 최선의 생존성 (best survivability)를 결과하는 α6β1 인터그린을 통해 가장 많은 량의 신호를 전달할 수 있다.
이러한 작업의 결과는 일반적으로 다능성 인간 줄기 세포의 확장 및 배양을 촉진시킬 수 있고, 임상 적용을 목표로 하는 세포를 포함하는 가능한 세포의 자동화된 확장을 만든다. LN-521 상에 해리된 hES 세포의 생존은 이주에 의존하는 것으로 나타나고, 따라서 상기 세포는 초저 밀도로 도말 후 생존할 수 없다. 본 명세서에 기재된 새로운 hES 세포 배양 방법은 ROCK 억제제 또는 브레비르타틴 처리로서 세포 골격을 손상하지 않는 오직 자연적으로 발생하는 LN-521 접착 단백질을 활용한다. 따라서, LN-521는 아마도 세포 표면 상에 교정 인테그린 프로파일을 오직 갖는 세포의 생존을 가장 선호한다. 본 발명의 결과는 또한 1 ㎠ 당 20,000-30,000 세포의 상대적으로 낮은 밀도에서 LN-521에 도말된 hES 세포가 적어도 다른 hES 배양 시스템에서의 효율만큼 증가시키고 생존할 수 있다는 것을 나타낸다. 새로운 방법은 표준 세포 배양 절차, 예를 들어, 섬유아세포의 배양과 밀접하게 유사하고, 따라서, hES 세포의 배양이 기술적 도전이기 때문이기 이전에 주요한 문제점을 가졌던, LN-521 상에 hES 세포 배양은 특별히 훈련된 개인이 필요하지 않는다.
인간 다능성 줄기 세포 자기-재생에 대해 광범위하게 사용된 TeSR1 제형은 마트리겔로 사용하기 위해 초기에 개발하였고, 이것은 다능성hES 세포에 대해 유리한 효과를 갖는 것으로 널리 고려되지 않는, MEK1/Erk 경로를 주로 표적으로 하는 높은 투여량의 bFGF를 함유한다. 본 결과는, 인간 ES 세포 자가-재생에 대해 중요한, 코팅 물질 및 구체적인 표적화 경로로서 LN-521의 이점을 활용하는 새로운 배지 제형의 개발을 유도할 수 있다.
요약하면, 본 작업은 다능성 hES에 의해 정상적으로 분비된, LN-521이 LN-511과 유사하게, 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 자가-재생을 지지하는 단독 코팅 물질로서 사용될 수 있다. 라미닌 모두는 생체 외에서 동종의 단층으로 세포의 성장을 촉진한다. 그러나, 두 라미닌들 사이의 중요한 차이점은, 세포 클러스터의 수동 분열에 대립되는 바와 같이, 마트리겔 또는 지지 세포에 성장된 hES/iPS 세포의 확장을 위해 현재 요구되듯이, hES/hiPS 세포가 단일 세포 현탁액으로 트립신처리될 수 있고, 도말되고 LN-521에 단일 세포로부터 효과적으로 확장될 수 있다. 이러한 작업의 결과는 다능성 인간 줄기 세포의 배양을 촉진할 수 있고, 이러한 세포의 자동적 확장을 촉진할 수 있다.
실시 예 3
인간 배아 줄기 세포는 두 개의 다른 세포 배양 배지에서 라미니-521 기질 상에서 배양된다. 상기 두 개의 세포 배양 배지는 bFGF의 투여양이, 3.9 ng/ml 및 100 ng/ml으로 다르다.
도 22는 고체 블랙 (solid black)에서 5 계대배양 후 (40일) 라미닌-521 기질과 3.9 ng/mL의 bFGF을 포함하는 03 배지에서 배양된 HS181 hES 세포의 성장 곡선을 나타낸다. 상기 03 배지는 오직 동물 유도 성분으로서 소 혈청 알부민을 갖는 다양한 상업적으로 이용가능한 화학적으로 규명된 mTeSR1 배지이다. 라미닌-521 기질과 100 ng/mL의 bFGF을 포함하는 03 배지에서 배양된 HS181 hES 세포의 성장 곡선은 파선으로 나타난다. 상기 세포는 계대배양을 위해 단일 세포 현탁액으로 해리된다. 본 명세서에서 알수 있는 바와 같이, 더 낮은 양의 bFGF에 대한 성장 곡선은 bFGF의 더 많은 양 만큼 양호하거나 또는 우수하다.
도 23은 두 개의 배지에 대하여 5 계대배양 (40일) 후 전분화능 마커 Oct4 및 Nanog에 대한 mRNA 전사물의 상대적인 양을 나타내고, 이것은 실-시간 정량적 역 전사 폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR) 분석을 사용하여 얻어진다. 다시, 유사한 양은 더 적은 양의 bFGF에서 줄기 세포가 전분화능을 유지하는 것을 나타내는, 모두의 세포 배양 배지에서 얻어진다. 따라서, 더 적은 양의 bFGF는 사용될 수 있고, 특히 라미닌-521 기질과 조합에서, 우수한 결과를 얻는다.
실시 예 4
실시 예 1 및 2에 있어서, 상기 해리된 줄기 세포는 LN-521 상에 활성 운동성 및 단층을 작게 효과적으로 성장 및 이주시키는 연관성을 통해 대부분 생존한다. 상기 세포는 프로그램된 세포 사멸로부터 구체화된, 아이노이키스를 통해 다이드된, 매우 낮은, 클로닝 밀도로 도말된다. 정상적으로, 세포외 매트릭스 분자, 예를 들어, 라미닌, 및 카데린-연관된 세포-세포 신호로부터 인터그린-연관된 신호는, 아이노이키스를 예방할 수 있다. 인간 ES 세포 표면 상에 가장 풍부한 카데린 동종 단백질은 상피-카데린 (E-카데린)이다. 실시 예 3에서 실험은 만약 LN-521 및 E-카데린의 조합이 아이노이키스로부터 인간 ES 세포를 보호할 수 있다면 확인하기 위해 수행되고, 상기 세포의 클론 생존을 허용한다.
hES 세포는 ㎠ 당 250 세포의 밀도에서 다른 코팅 상에 mTeSR1 배지에 도말되고, 알칼리 포스파타제 염색 키트 (alkaline phosphatase staining kit)를 사용하여 배양에서 5 일 후 관찰된다. 라미닌-521 또는 E-카데린 단독으로 개별화된 hES 세포의 효과적인 클론 생존이 허용하는 것은 없다.
다음, 라미닌-521 및 E-카데린의 조합은 상기 조합이 상기 세포의 클론 생존을 지속할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 시험된다. 라미닌-521의 고정된 양은 E-카데린로 적정된 조합에서 세포 배양 접시 코팅을 위해 사용된다. 세포의 클론 생존은 약 1:10 w/w 내지 약 1:5 w/w를 포함하는 E-카데린 대 라미닌-521의 다른 비율로 달성된다.
부가적인 시험은 mTeSR1 배지에 대해 다양한 변형의 효과를 시험하기 위해 수행된다. 약 1:10 w/w의 비에서 E-카데린 대 라미닌-521의 혼합물은 플레이트를 코팅하기 위해 사용된다. 예상밖으로, 이것은 2x 증가한 알부민 농도가 상기 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 hES 세포의 클론 생존을 상당하게 개선시키는 것으로 발견되었다. 이들 조건 하에서 개별화된 hES 세포 생존의 비율은 10 내지 15%이고, 부가적인 알부민을 갖는 mTeSR1 배지 및 mTeSR1 배지 모두에서 마트리겔, 라미닌-521, 또는 E-카데린 단독 상에서 세포보다 적어도 10배 높다. 상기 세포의 저속 사진 (Time-lapse photography)은 라미닌-521/E-카데린 코팅이 다른 세포의 응집을 통하지 않는, 단일 세포의 증식을 통한 세포 생존을 촉진한다는 것을 확인하였다. 라미닌-521/E-카데린은 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)의 첨가로 완전하게 화학적으로 규명된, 이종-없는 TeSR2 배지에서 세포의 클론 생존을 유사하게 지속한다.
부가적인 시험에 있어서, hES 세포주는 유도된다. 24 웰 조직 세포 배양 접시 플레이트는 듀베코의 인산 버퍼 식염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 두번 세척된다. 다음, 상기 접시 플레이트는 라미닌-521/E-카데린 매트릭스를 생산하기 위해 48 μL의 100 ㎍/mL 라미닌-521 (BioLamina AB, Stockholm); 6 μL의 82 ㎍/mL E-카데린 (R@DSystems); 및 칼슘 및 마그네슘 (GIBCO)을 갖는 300 μL의 DPBS를 함유하는 멸균 용액으로 37℃에서 2 시간 동안 코팅된다.
hES 세포주를 유도하기 위해 사용된 기부된 배아는 대상자 및 윤리적 승인 모두의 동의를 얻은 후 시험과 수정 클리릭에서 인가받을 것으로부터 얻어진다. 불임치료에 대해 사용될 수 없는, 신선한 또는 냉동된 배아만이 유도 절차에서 사용된다. 하나 또는 두 개의 세포들은 이러한 목적을 위해 설계된 레이저 장치로 투명대 (zona pellucida)에 작은 개구를 만든 후 마이크로피펫을 사용하여 8-세포 단계 배아로부터 분리된다. 이러한 절차는 미리-이식 유전자 진단 (pre-implantation genetic diagnostics) (PGD)에서 임상적 사용을 위해 인가받았다. 상기 세포는 부가적 rHSA를 갖는 TeSR2 배지에서 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 놓인다. 상기 세포는 성공적으로 부착되고, 증식을 시작한다. 부모 배아는 배반포 단계 (blastocyst stage)에 성장 및 동결을 허용한다. 상기 배아 배양은 37℃ 및 5% O2/10% CO2에 오일 하에서 방울로 생체 외 수정 배양 배지에서 표준화된 이종-없이 사용하여 수행된다. 투명대 (zona pellucida)의 제거 후, 다섯 개 인간 배반포의 내부 세포 덩어리는 기계적으로 분리되고, 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 4-웰 배양 플레이트 (Nunc)에 도말된다. 배양의 초기 48 시간 후에, 상기 배양 배지는 매일 대체된다. 10 내지 14일 후, 결과물 (outgrowth)은 기계적으로 분리되고, 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 대체된다. 기계적 계대배양은 뒤이은 2 내지 3 계대배양 동안 사용된 후, 콜로니는 TrypLE Select (GIBCO)을 사용하여 계대배양된다.
부가적 소 알부민을 포함하는 mTeSR1 배지로 전술된 라미닌-521/E-카데린 매트릭스를 사용하여, 세 개의 새로운 hES 세포주는 여섯개 배양된 배반포로부터 유도된다. 도말 4일 후, 내부 세포 덩어리는 줄기 세포-유사 결과물을 제공한다. 도 24는 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 새로운 인간 배아 줄기 HS841 세포주의 초기 단계 유도를 나타낸다. 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 상에 도말 및 내부 세포 덩어리의 기계적 분리 4일 후 하루에 6 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 결과하는 형태학적으로 통상적인 인간 배아 줄기 세포는 나타낸다.
예기치 않게, 상기 세포 배양 시스템 및 방법은 표준 방법보다 더 높은 유도율인, 6 배아 중 3 아웃 (50%)의 안정한 hES 세포주를 제공한다.
완전하게 화학적으로 규명되고 이종-없는 환경인, 부가적인 rHSA를 갖는 라미닌-521/E-카데린 매트릭스 및 TeSR2 배지의 사용은, 새로운 hES 세포주의 유도에서 유사한 결과를 산출한다.
하기 표 5는 이러한 실시 예에서 사용된 mTeSR1 배지에 대한 제형을 제공한다. 각 성분의 양은 20%까지 변화할 수 있다.
특별한 구현 예에 있어서, 인간 혈청 알부민 (HSA)의 양은 0.3 mM 내지 1 mM 또는 0.3 mM 내지 약 0.4 mM를 포함하는, 0.195 mM 내지 1 mM의 농도로 변화될 수 있다. bFGF의 양은 0 내지 약 105 ng/mL, 또는 0 내지 3.9 ng/mL, 또는 0.5 ng/mL 내지 3.5 ng/mL으로 변화할 수 있다. HSA 및 bFGF의 양에서 이들 두 가지 변형은 독립적으로 또는 함께 발생할 수 있다.
[표 5]
Figure 112014038425461-pct00008
Figure 112014038425461-pct00009
Figure 112014038425461-pct00010
부가적인 알부민을 갖는 LN-521/e-카데린 기질 및 mTeSR1 배지를 함유하는 시스템은 지지 또는 세포사멸의 어떤 억제제 없는 이종-없는 조건 및 완전하게 화학적으로 규명된 환경에서 분화되지 않은 줄기 세포 (예를 들어, 배아 및 유도 다능성 줄기 세포)를 유지 및 증식하기 위해 매우 잘 작동한다.
이러한 상황에 있어서, LN-521 및 LN-511은 e-카데린과 조합된 기질에서 사용될 수 있다. 상기 LN-521/LN-511는 완전한 단백질 또는 단백질 단편으로 존재할 수 있다. 다시, "단편"은 또 다른 분자 또는 수용체에 대해 결합 활성을 소유하는 하나, 둘, 또는 세 개의 기능적 도메인을 함유한다. 일반적으로, 어떤 효과적인 라미닌은 사용될 수 있고, 여기서 그 효과성은 줄기 세포가 상기 기질상에서 증식될 수 있는 지의 여부에 의해 결정된다. 상기 라미닌은 일반적으로 재조합이 잘 된다.
전술된 것의 변형 및 다은 특징 및 기능, 또는 이들의 대안은 많은 다른 시스템 또는 적용으로 조합될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 본 명세서에서 현재 다양하게 예측하지 못하거나 또는 기대하지 않는 대안, 변형, 변경 또는 개선은 당업자들에 의해 나중에 만들어질 수 있고, 또한 하기 청구항에 의해 포괄될 수 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Tryggvason, Karl Rodin, Sergey <120> Cell Culture Medium <130> LCTI-200006WO03 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Lys Arg Leu Cys Ala Gly Ser Ala Leu Cys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Arg Gly Pro Ala Pro Leu Leu Leu Val Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Ala Arg Ala Arg Glu Glu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Leu His Pro Pro 35 40 45 Tyr Phe Asn Leu Ala Glu Gly Ala Arg Ile Ala Ala Ser Ala Thr Cys 50 55 60 Gly Glu Glu Ala Pro Ala Arg Gly Ser Pro Arg Pro Thr Glu Asp Leu 65 70 75 80 Tyr Cys Lys Leu Val Gly Gly Pro Val Ala Gly Gly Asp Pro Asn Gln 85 90 95 Thr Ile Arg Gly Gln Tyr Cys Asp Ile Cys Thr Ala Ala Asn Ser Asn 100 105 110 Lys Ala His Pro Ala Ser Asn Ala Ile Asp Gly Thr Glu Arg Trp Trp 115 120 125 Gln Ser Pro Pro Leu Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Asn Glu Val Asn Val 130 135 140 Thr Leu Asp Leu Gly Gln Val Phe His Val Ala Tyr Val Leu Ile Lys 145 150 155 160 Phe Ala Asn Ser Pro Arg Pro Asp Leu Trp Val Leu Glu Arg 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Ile Ser Ser His Gly Ala Phe Gly Pro Asn Ser Ala 1205 1210 1215 Ala Cys Leu Pro Ser Arg Phe Pro Lys Pro Pro Gln Pro Ile Ile 1220 1225 1230 Leu Arg Asp Cys Gln Val Ile Pro Leu Pro Pro Gly Leu Pro Leu 1235 1240 1245 Thr His Ala Gln Asp Leu Thr Pro Ala Met Ser Pro Ala Gly Pro 1250 1255 1260 Arg Pro Arg Pro Pro Thr Ala Val Asp Pro Asp Ala Glu Pro Thr 1265 1270 1275 Leu Leu Arg Glu Pro Gln Ala Thr Val Val Phe Thr Thr His Val 1280 1285 1290 Pro Thr Leu Gly Arg Tyr Ala Phe Leu Leu His Gly Tyr Gln Pro 1295 1300 1305 Ala His Pro Thr Phe Pro Val Glu Val Leu Ile Asn Ala Gly Arg 1310 1315 1320 Val Trp Gln Gly His Ala Asn Ala Ser Phe Cys Pro His Gly Tyr 1325 1330 1335 Gly Cys Arg Thr Leu Val Val Cys Glu Gly Gln Ala Leu Leu Asp 1340 1345 1350 Val Thr His Ser Glu Leu Thr Val Thr Val Arg Val Pro Lys Gly 1355 1360 1365 Arg Trp Leu Trp Leu Asp Tyr Val Leu Val Val Pro Glu Asn Val 1370 1375 1380 Tyr Ser Phe Gly Tyr Leu Arg Glu Glu Pro Leu Asp Lys Ser Tyr 1385 1390 1395 Asp Phe Ile Ser His Cys Ala Ala Gln 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1595 1600 1605 Gln Cys Ser Leu Gly Thr Phe Ser Leu Asp Ala Ala Asn Pro Lys 1610 1615 1620 Gly Cys Thr Arg Cys Phe Cys Phe Gly Ala Thr Glu Arg Cys Arg 1625 1630 1635 Ser Ser Ser Tyr Thr Arg Gln Glu Phe Val Asp Met Glu Gly Trp 1640 1645 1650 Val Leu Leu Ser Thr Asp Arg Gln Val Val Pro His Glu Arg Gln 1655 1660 1665 Pro Gly Thr Glu Met Leu Arg Ala Asp Leu Arg His Val Pro Glu 1670 1675 1680 Ala Val Pro Glu Ala Phe Pro Glu Leu Tyr Trp Gln Ala Pro Pro 1685 1690 1695 Ser Tyr Leu Gly Asp Arg Val Ser Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Arg 1700 1705 1710 Tyr Glu Leu His Ser Glu Thr Gln Arg Gly Asp Val Phe Val Pro 1715 1720 1725 Met Glu Ser Arg Pro Asp Val Val Leu Gln Gly Asn Gln Met Ser 1730 1735 1740 Ile Thr Phe Leu Glu Pro Ala Tyr Pro Thr Pro Gly His Val His 1745 1750 1755 Arg Gly Gln Leu Gln Leu Val Glu Gly Asn Phe Arg His Thr Glu 1760 1765 1770 Thr Arg Asn Thr Val Ser Arg Glu Glu Leu Met Met Val Leu Ala 1775 1780 1785 Ser Leu Glu Gln Leu Gln Ile Arg Ala Leu Phe Ser Gln Ile Ser 1790 1795 1800 Ser Ala 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Ala Pro Gly Phe Tyr Gly Asn 2000 2005 2010 Ala Leu Leu Pro Gly Asn Cys Thr Arg Cys Asp Cys Thr Pro Cys 2015 2020 2025 Gly Thr Glu Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Cys Leu Cys Lys 2030 2035 2040 Ala Gly Val Thr Gly Arg Arg Cys Asp Arg Cys Gln Glu Gly His 2045 2050 2055 Phe Gly Phe Asp Gly Cys Gly Gly Cys Arg Pro Cys Ala Cys Gly 2060 2065 2070 Pro Ala Ala Glu Gly Ser Glu Cys His Pro Gln Ser Gly Gln Cys 2075 2080 2085 His Cys Arg Pro Gly Thr Met Gly Pro Gln Cys Arg Glu Cys Ala 2090 2095 2100 Pro Gly Tyr Trp Gly Leu Pro Glu Gln Gly Cys Arg Arg Cys Gln 2105 2110 2115 Cys Pro Gly Gly Arg Cys Asp Pro His Thr Gly Arg Cys Asn Cys 2120 2125 2130 Pro Pro Gly Leu Ser Gly Glu Arg Cys Asp Thr Cys Ser Gln Gln 2135 2140 2145 His Gln Val Pro Val Pro Gly Gly Pro Val Gly His Ser Ile His 2150 2155 2160 Cys Glu Val Cys Asp His Cys Val Val Leu Leu Leu Asp Asp Leu 2165 2170 2175 Glu Arg Ala Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile His Glu Gln Leu Arg 2180 2185 2190 Gly Ile Asn Ala Ser Ser Met Ala Trp Ala Arg Leu His Arg 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gcaggggcgg ggtgggggga aagaaactat tatctgacac actggtgcta 6300 ttaattattt caaatttata tttttgtgtg aatgttttgt gttttgttta tcatgattat 6360 agaataagga atttatgtaa atatacttag tcctatttct agaatgacac tctgttcact 6420 ttgctcaatt tttcctcttc actggcacaa tgtatctgaa tacctccttc cctcccttct 6480 agaattcttt ggattgtact ccaaagaatt gtgccttgtg tttgcagcat ctccattctc 6540 taaaattaat ataattgctt tcctccacac ccagccactg taaagaggta acttgggtcc 6600 tcttccattg cagtcctgat gatcctaacc tgcagcacgg tggttttaca atgttccaga 6660 gcaggaacgc caggttgaca agctatggta ggattaggaa agtttgctga agaggatctt 6720 tgacgccaca gtgggactag ccaggaatga gggagaaatg ccctttctgg caattgttgg 6780 agctggatag gtaagtttta taagggagta cattttgact gagcacttag ggcatcagga 6840 acagtgctac ttactgatgg gtagactggg agaggtggtg taacttagtt cttgatgatc 6900 ccacttcctg tttccatctg cttgggatat accagagttt accacaagtg ttttgacgat 6960 atactcctga gctttcactc tgctgcttct cccaggcctc ttctactatg gcaggagatg 7020 tggcgtgctg ttgcaaagtt ttcacgtcat tgtttcctgg ctagttcatt tcattaagtg 7080 gctacatcct aacatatgca tttggtcaag gttgcagaag aggactgaag attgactgcc 7140 aagctagttt gggtgaagtt cactccagca agtctcaggc cacaatgggg tggtttggtt 7200 tggtttcctt ttaactttct ttttgttatt tgcttttctc ctccacctgt gtggtatatt 7260 ttttaagcag aattttattt tttaaaataa aaggttcttt acaagatgat accttaatta 7320 cactcccgca acacagccat tattttattg tctagctcca gttatctgta ttttatgtaa 7380 tgtaattgac aggatggctg ctgcagaatg ctggttgaca cagggattat tatactgcta 7440 tttttccctg aatttttttc ctttgaattc caactgtgga ccttttatat gtgccttcac 7500 tttagctgtt tgccttaatc tctacagcct tgctctccgg ggtggttaat aaaatgcaac 7560 acttggcatt tttatgtttt aagaaaaaca gtattttatt tataataaaa tctgaatatt 7620 tgtaaccctt ta 7632 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtggtaccca caggcagagt tgac 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctctagagc tcttcagtgc ataggc 26

Claims (71)

  1. 라미닌 및 카데린을 포함하며, 여기서 상기 라미닌은 완전한(intact) 단백질 또는 단백질 단편이고;
    상기 라미닌은 라미닌-521이며; 및
    상기 카데린은 e-카데린인 다능성 인간 줄기 세포 배양 기질.
  2. 삭제
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  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 라미닌 대 카데린의 중량비는 5:1 내지 15:1인 다능성 인간 줄기 세포 배양 기질.
  5. 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트로서,
    적어도 0.3 mM의 알부민을 포함하는 세포 배양 배지; 및
    라미닌 및 카데린을 포함하며, 상기 라미닌이 완전한(intact) 단백질 또는 단백질 단편인 기질을 포함하고;
    상기 라미닌은 라미닌-521이며; 및
    상기 카데린은 e-카데린인 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 알부민은 인간 혈청 알부민인 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 라미닌 대 카데린의 중량비는 5:1 내지 15:1인 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  10. 청구항 5에 있어서,
    상기 기질 및 상기 배지는 어떠한 분화 억제제, 지지 세포, 분화 유도자, 및 세포사멸 억제제도 함유하지 않는 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  11. 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트로서,
    mTeSR1 세포 배양 배지; 및
    라미닌 및 카데린을 포함하며, 상기 라미닌이 완전한(intact) 단백질 또는 단백질 단편인 기질을 포함하고;
    상기 라미닌은 라미닌-521이며; 및
    상기 카데린은 e-카데린인 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    부가적 알부민은 적어도 0.3 mM의 최종 알부민 농도에 도달하도록 첨가되는 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  13. 삭제
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 라미닌 대 카데린의 중량비는 5:1 내지 15:1인 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  15. 청구항 11에 있어서,
    상기 기질 및 배지는 어떠한 분화 억제제, 지지 세포, 분화 유도자 및 세포 사멸 억제제도 함유하지 않는 다능성 인간 줄기 세포 배양 키트.
  16. 완전한(intact) 단백질 또는 단백질 단편인 라미닌, 및 카데린을 포함하는 기질 상에 다능성 인간 줄기 세포를 도말하는 단계; 및
    적어도 0.3mM의 알부민을 포함하는 세포 배양 배지에 다능성 인간 줄기 세포를 노출시키는 단계를 포함하며;
    여기서 상기 라미닌은 라미닌-521이고; 및
    상기 카데린은 e-카데린인, 다능성 인간 줄기 세포를 유지하기 위한 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 라미닌 대 카데린의 중량비는 5:1 내지 15:1인 다능성 인간 줄기 세포를 유지하기 위한 방법.
  18. 청구항 16에 있어서,
    상기 다능성 인간 줄기 세포는 200 cells / ㎟ 이상의 밀도로 도말되는 다능성 인간 줄기세포를 유지하기 위한 방법.
  19. 청구항 16에 있어서,
    상기 다능성 인간 줄기 세포는 두 개의 다능성 인간 줄기 세포가 서로 접촉하지 않도록 도말되는 다능성 인간 줄기세포를 유지하기 위한 방법.
  20. 완전한(intact) 단백질 또는 단백질 단편인 라미닌, 및 카데린을 포함하는 기질 상에 다능성 인간 줄기 세포를 도말하는 단계; 및
    mTeSR1 세포 배양 배지에 상기 다능성 인간 줄기 세포를 노출시키는 단계를 포함하며;
    여기서 상기 라미닌은 라미닌-521이고; 및
    상기 카데린은 e-카데린인, 다능성 인간 줄기 세포를 유지하기 위한 방법.
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