JP6049733B2 - ラミニンおよびカドヘリンを含む細胞培養基質 - Google Patents
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Description
この出願は、2011年9月22日に出願された米国仮特許出願第61/537,940号;2011年11月30日に出願された米国仮特許出願第61/565,380号;2011年12月1日に出願された米国仮特許出願第61/565,849号;2012年4月16日に出願された米国仮特許出願第61/624,588号;および2012年4月17日に出願された米国仮特許出願第61/625,321号からの優先権を主張する。これら全ての仮出願は、本明細書に参考として完全に援用される。
たとえば、
1.それらは、組織の構造的支持体としての役目を果たし、細胞に接着性基層(substrata)を提供する。
本開示は、単離されたラミニン−521(LN−521またはラミニン−11としても公知)および単離されたラミニン−521を生成するための方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、ラミニン−521鎖を発現し、組換えラミニン−521を分泌する組換え宿主細胞を提供する。
細書において開示される例示的な実施形態を例証する目的のために提示される図面の簡単
な説明である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
ラミニンおよびカドヘリンを含む細胞培養基質であって、前記ラミニンが完全なタンパク
質またはタンパク質断片である、細胞培養基質。
(項目2)
前記ラミニンが、ラミニン−521またはラミニン−511である、項目1に記載の基
質。
(項目3)
前記ラミニンが、有効な組換えラミニンである、項目1に記載の基質。
(項目4)
前記カドヘリンが、E−カドヘリンである、項目1に記載の基質。
(項目5)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目1に記載
の基質。
(項目6)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目1に記載
の基質。
(項目7)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンである、請求
項1に記載の基質。
(項目8)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目7に
記載の基質。
(項目9)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目7に
記載の基質。
(項目10)
細胞培養系であって、前記細胞培養系は、
少なくとも0.3mMのアルブミンを含む細胞培養培地と、
ラミニンおよびカドヘリンを含む基質と
を含み、前記ラミニンが完全なタンパク質またはタンパク質断片である、細胞培養系。
(項目11)
前記細胞培養培地が、少なくとも0.3mMのアルブミン濃度に達するように追加のアル
ブミンが添加されたmTeSR1培地である、項目10に記載の系。
(項目12)
前記細胞培養培地が、約0.39mMのアルブミンを有するmTeSR1培地である、請
求項10に記載の系。
(項目13)
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、項目10に記載の系。
(項目14)
前記ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、項目13に記載の系。
(項目15)
前記ラミニンがラミニン−521またはラミニン−511である、項目10に記載の系
。
(項目16)
前記ラミニンが有効な組換えラミニンである、項目10に記載の系。
(項目17)
前記カドヘリンがE−カドヘリンである、項目10に記載の系。
(項目18)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目10に記
載の系。
(項目19)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目10に記
載の系。
(項目20)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンである、請求
項10に記載の系。
(項目21)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目20
に記載の系。
(項目22)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目20
に記載の系。
(項目23)
前記基質および前記培地が、いかなる分化阻害剤も、フィーダー細胞も、分化誘導物質も
、アポトーシス阻害剤も含有しない、項目10に記載の系。
(項目24)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンであり、ラミ
ニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1であり、前記細胞培養培
地が、約0.39mMのアルブミンを有するmTeSR1培地である、項目10に記載
の系。
(項目25)
細胞培養系であって、前記細胞培養系は、
mTeSR1細胞培養培地と、
ラミニンおよびカドヘリンを含む基質と
を含み、前記ラミニンが完全なタンパク質またはタンパク質断片である、細胞培養系。
(項目26)
少なくとも0.3mMの最終アルブミン濃度に達するように追加のアルブミンが添加され
ている、項目25に記載の系。
(項目27)
約0.39mMの最終アルブミン濃度に達するように追加のアルブミンが添加されている
、項目25に記載の系。
(項目28)
前記ラミニンがラミニン−521またはラミニン−511である、項目25に記載の系
。
(項目29)
前記ラミニンが有効な組換えラミニンである、項目25に記載の系。
(項目30)
前記カドヘリンが、E−カドヘリンである、項目25に記載の系。
(項目31)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目25に記
載の系。
(項目32)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目25に記
載の系。
(項目33)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンである、請求
項25に記載の系。
(項目34)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目33
に記載の系。
(項目35)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目33
に記載の系。
(項目36)
前記基質および前記培地が、いかなる分化阻害剤も、フィーダー細胞も、分化誘導物質も
、アポトーシス阻害剤も含有しない、項目25に記載の系。
(項目37)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンであり、ラミ
ニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1であり、前記mTeSR
1培地が約0.39mMのアルブミンを含有する、項目25に記載の系。
(項目38)
幹細胞を維持するための方法であって、
ラミニンおよびカドヘリンを含む基質上に幹細胞をプレーティングするステップであっ
て、前記ラミニンが完全なタンパク質またはタンパク質断片であるステップと、
前記幹細胞を少なくとも0.3mMのアルブミンを含む細胞培養培地に曝露するステッ
プと
を含む方法。
(項目39)
前記細胞培養培地が、少なくとも0.3mMのアルブミン濃度に達するように追加のアル
ブミンが添加されたmTeSR1培地である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記細胞培養培地が、約0.39mMのアルブミンを有するmTeSR1培地である、請
求項38に記載の方法。
(項目41)
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記ラミニンがラミニン−521またはラミニン−511である、項目38に記載の方
法。
(項目44)
前記ラミニンが有効な組換えラミニンである、項目38に記載の方法。
(項目45)
前記カドヘリンがE−カドヘリンである、項目38に記載の方法。
(項目46)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目38に記
載の方法。
(項目47)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目38に記
載の方法。
(項目48)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンである、請求
項38に記載の方法。
(項目49)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目48
に記載の方法。
(項目50)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目48
に記載の方法。
(項目51)
前記基質および前記培地が、いかなる分化阻害剤も、フィーダー細胞も、分化誘導物質も
、アポトーシス阻害剤も含有しない、項目38に記載の方法。
(項目52)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンであり、ラミ
ニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1であり、前記細胞培養培
地が、約0.39mMのアルブミンを有するmTeSR1培地である、項目38に記載
の方法。
(項目53)
前記幹細胞が、200細胞/mm2または200細胞/mm2未満の密度でプレーティン
グされる、項目38に記載の方法。
(項目54)
前記幹細胞が、200細胞/mm2または200細胞/mm2より高い密度でプレーティ
ングされる、項目38に記載の方法。
(項目55)
前記幹細胞が、いずれの2つの幹細胞も互いに接触しないようにプレーティングされる、
項目38に記載の方法。
(項目56)
幹細胞を維持するための方法であって、
ラミニンおよびカドヘリンを含む基質上で幹細胞をプレーティングするステップであっ
て、前記ラミニンが完全なタンパク質またはタンパク質断片であるステップと、
前記幹細胞をmTeSR1細胞培養培地に曝露するステップと
を含む方法。
(項目57)
少なくとも0.3mMの最終アルブミン濃度に達するように追加のアルブミンが添加され
ている、項目56に記載の方法。
(項目58)
約0.39mMの最終アルブミン濃度に達するように追加のアルブミンが添加されている
、項目56に記載の方法。
(項目59)
前記ラミニンがラミニン−521またはラミニン−511である、項目56に記載の方
法。
(項目60)
前記ラミニンが有効な組換えラミニンである、項目56に記載の方法。
(項目61)
前記カドヘリンがE−カドヘリンである、項目56に記載の方法。
(項目62)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目56に記
載の方法。
(項目63)
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目56に記
載の方法。
(項目64)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンである、請求
項56に記載の方法。
(項目65)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1である、項目64
に記載の方法。
(項目66)
ラミニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約10:1である、項目64
に記載の方法。
(項目67)
前記基質および前記培地が、いかなる分化阻害剤も、フィーダー細胞も、分化誘導物質も
、アポトーシス阻害剤も含有しない、項目56に記載の方法。
(項目68)
前記ラミニンがラミニン−521であり、前記カドヘリンがE−カドヘリンであり、ラミ
ニン−521対E−カドヘリンの重量比が約5:1〜約15:1であり、前記mTeSR
1培地が、約0.39mMのアルブミンを含有する、項目56に記載の方法。
(項目69)
前記幹細胞が、200細胞/mm2または200細胞/mm2未満の密度でプレーティン
グされる、項目56に記載の方法。
(項目70)
前記幹細胞が、200細胞/mm2または200細胞/mm2より高い密度でプレーティ
ングされる、項目56に記載の方法。
(項目71)
前記幹細胞が、いずれの2つの幹細胞も互いに接触しないようにプレーティングされる、
項目56に記載の方法。
本明細書において開示される組成物および方法についてのより完全な理解は、添付図面に対する参照によって得ることができる。これらの図は、単に、本開示を実証することにおける利便性および容易性に基づく略図であり、そのため、例示的な実施形態の範囲を定めるまたは限定するようには意図されない。
Press、San Diego、Calif.)、「Guide to Protein Purification」 Methods in Enzymology(M. P. Deutshcer編、(1990年) Academic Press, Inc.);PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innisら 1990年 Academic Press、San Diego、Calif.)、Culture of Animal
Cells: A Manual of Basic Technique、第2版(R. I. Freshney. 1987年 Liss, Inc. New York、N.Y.)、Gene Transfer and Expression Protocols、109〜128頁、E. J. Murray編、The Humana
Press Inc.、Clifton、N.J.)、またはAmbion 1998年 Catalog(Ambion、Austin、Tex.)などのいくつかの周知の参考文献のうちのいずれかにおいても見出され得る。
(a)R1−R2−R3、R1−R2−R4、R3、R4、R1−R3、R1−R4、R2−R3、およびR2−R4からなる群から選択されるポリペプチド構造を含むポリペプチド鎖であって、ここで、R1は、アミノ末端メチオニンであり、R2は、ポリペプチドの分泌を指示することができるシグナル配列であって、該シグナル配列が、特定のラミニン鎖についての天然のシグナル配列、他の分泌タンパク質についての天然のシグナル配列、もしくは人工配列であってもよいシグナル配列であり、R3は、α5鎖、β2鎖、およびγ1鎖からなる群から選択される分泌ラミニン鎖であり、R4は、ラミニン鎖アミノ酸配列内の任意の位置に配置することができるエピトープタグ(下記に記載されるものなど)をさらに含む、分泌α5、β2、もしくはγ1ラミニン鎖である、または、
(b)本明細書において開示される1つもしくは複数の組換えラミニン−521鎖DNA配列(配列番号4、配列番号5、配列番号6)のコード領域もしくはその部分またはその相補的配列に、高または低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド鎖、または、
(c)1つもしくは複数の開示されるラミニン−521ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(配列番号1、配列番号2、配列番号3)に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を有するポリペプチド鎖、
の1つまたは複数に従うポリペプチド鎖を指す。
Sci. USA 87巻:2264.2268頁、1990年)のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Altschulら(J. Mol. Biol. 215巻:403〜410頁、1990年)のNBLASTおよびXBLASTプログラムの中に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に対するヌクレオチド配列同一性を決定するために、NBLASTプログラム、スコア100、およびワード長=12により実行される。BLASTタンパク質検索は、本開示のポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性を決定するために、XBLASTプログラム、スコア=50、およびワード長=3により実行される。比較の目的のためのギャップアライメントを得るために、Altschulら(Nucleic Acids. Res. 25巻:3389〜3402頁、1997年)において記載されるようにGapped BLASTが利用される。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(たとえばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが、使用される。
ヒトラミニンβ2 cDNAのクローニング
ヒトラミニンβ2 cDNAの5.6kb断片は、プライマー5’−GTGGTACCCACAGGCAGAGTTGAC−3’(配列番号7)および5’−GCTCTAGAGCTCTTCAGTGCATAGGC−3’(配列番号8)を使用して、ヒト肝臓cDNAライブラリー(BD Biosciences)からPCR増幅し、それにより、断片の端末上に人工のXbaIおよびKpnI切断部位を導入した。PCR増幅の間のエラー率を減少させるために、Phusion(商標)高忠実度PCRキット(Finnzymes)を使用した。続いて、断片は、XbaIおよびKpnIにより消化し、同じ制限エンドヌクレアーゼにより消化したpSKベクター(pSKHLAMB2プラスミド)へとサブクローニングした。配列の完全性を検証するために、pSKHLAMB2プラスミドのいくつかのクローンについて配列決定した。配列決定は、ABI PRISM(登録商標) BigDye(商標) Terminator Cycle Sequencing kit(PE Applied Biosystems)を使用して、ABI PRISM(商標) 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer)で実行した。NCBIデータベースのヒトラミニンβ2配列と完全にマッチするもののみを、さらなるクローニングのために選択した。
ヒトラミニンβ2鎖の発現のために、pSKHLAMB2プラスミドは、XbaIおよびKpnIにより消化し、XbaI−KpnI処理pcDNA 3.1(+)ベクター(Invitrogen)へとサブクローニングした。
抗ラミニンβ2(MAB2066)モノクローナル抗体(mAb)は、R@D Systemsから購入した。抗ラミニンα5 mAb(2F7)は、Abnovaから購入した。抗ラミニンβ1 mAb(MAB1921)は、Chemiconから購入した。抗ラミニンγ1(H−190)ウサギポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology、Inc.から購入した。
r−ラミニン−521は、37℃の加湿5%CO2大気中で、DMEM、10% FCSで培養したヒト胎児腎臓細胞(HEK293、ATCC CRL−1573)において産生した。野生型細胞は、標準的なリン酸カルシウム法を使用してHG1構築物でトランスフェクトし、安定したコロニーは、100mg/mlハイグロマイシン(Cayla)を使用して選択した。すべてのさらなる細胞培養およびクローンの増殖は、適切な選択抗生物質の継続的な存在下において実行した。その後、高度に発現するクローンは、ヒトラミニンβ2構築物によりトランスフェクトし、安定したクローンは、500mg/ml G418(Life Technologies)を使用して選択した。ラミニンγ1およびラミニンβ2の両方を高度に発現するクローンは、最終的に、HLN5Full.pcDNA構築物によりトランスフェクトし、安定したコロニーは、200mg/ml ゼオシン(Cayla)を使用して選択した。最も高度な分泌を示すクローンは、さらに増殖させた。
培地中の分泌ラミニン、および精製後の分泌ラミニンは、3〜8%勾配SDS−PAGEを使用して特徴付けた。タンパク質は、Sypro染色(Bio−Rad)を使用して可視化するかまたは、PVDF上に移した(図3)。膜は、上記に記載される抗体によりプローブした。洗浄後に、膜は、HRP結合体化ヤギ抗体と共にインキュベートした。免疫反応性は、製造業者の指示に従って、化学発光キット(Life Science Products)によって検出した。
ヒトES細胞培養物
ヒトES細胞は、5%CO2中、37℃において、化学的に特定されているO3培地(Rodinら、Nature Biotechnol.、第28巻、611〜615頁(2010年)に記載)を含む、r−ラミニン−521でコーティングした実験室用ディッシュ(laboratory dish)上で培養した。細胞は、10〜12日間ごとに1回、常習的に通過させ、37℃で5分間トリプシン−EDTA溶液(GIBCO Invitrogen)に曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして、単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤(GIBCO Invitrogen)を添加した。細胞懸濁物は、4分間、遠心分離し、上清は廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたO3培地中に再懸濁し、細胞は、その後、40μmのふるいに通過させた。その後、細胞は、30000細胞/cm2の濃度(1:25〜1:30の分割比)で新しいr−ラミニン−521をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。ほんの数滴の新鮮な培地を加えるときには、継代後の第1日を除いて、1時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を1日に1回、細胞に与えた。同じ系統の対照細胞は、Rodinら、Nature Biotechnol.、第28巻、611〜615頁(2010年)において記載されるように、O3培地中のMatrigel(BD Biosciences)上で培養した。対照細胞は、分けて継代した。
96ウェル組織細胞培養プレートは、すべて30μg/ml(5μg/cm2)の濃度のECMタンパク質である、マウスLN−111(Invitrogen)、ヒト組換えLN−511、およびヒト組換えLN−521の無菌溶液により、4℃で一晩コーティングした。対照細胞については、hESCに適したBD Matrigel(商標)(BD
Biosciences)を製造業者の指示に従って使用した。
アッセイは、記載されるように実行した(Extracellular Matrix
Protocols、2000年)。手短に言えば、96ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上で600細胞/mm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーターで1時間または1日間接着させた。非接着細胞は、洗い流し、接着細胞は、5%グルタルアルデヒドによって20分間固定し、0.1%クリスタルバイオレットによって染色した。
全RNAを単離し、cDNAは、Rodinら、Nature Biotechnol.、第28巻、611〜615頁(2010年)において記載されるように合成した。リアルタイム定量的RT−PCR Taqmanアッセイは、Applied Biosystems 7300 Real−Time PCR Systemを使用して実行した。反応はすべて、対象のmRNAについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックス(Applied Biosystems)により4連で行った。各実験についての追加の反応は、RNAインプットを標準化するために使用した、GAPDHについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、7300 System SDS Software バージョン1.4により分析した。
OCT4発現は、Ludwig, T.E.ら Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24巻、185〜187頁(2006年)において記載されるように分析した。細胞をFACSCalibur Flow Cytometer(Becton Dickinson)に流した。データは、CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析した。
異なる細胞培養コーティングがいかなる添加剤もなしで、O3培地におけるヒトES細胞の単細胞の生存にどのように影響を及ぼすかを調べるために、本発明者らは、HS181細胞を完全に解離し、Matrigel、マウスラミニン−111、ヒトr−ラミニン−511、ヒトr−ラミニン−521、またはr−ラミニン−511およびr−ラミニン−521の混合物上にそれらを蒔いた。結果は図4に認められる。予想されたように、蒔いてから後24時間の間に、Matrigelおよびマウスラミニン−111に付着し続けた細胞は、ほとんどなかった。対照的に、ヒトr−ラミニン−521、上記混合物、および程度は少ないがヒトr−ラミニン−511上の細胞は、生存した。
本実施例2において、多能性hES細胞においても発現される、発現させ、精製した組換えLN−521を、培養したhES細胞およびiPS細胞に対するその効果について研究した。結果は、LN−521が、単独で、多能性hES細胞およびiPS細胞の自己再生を強く支持することを示した。そして、重要なことには、それは、高い希釈度のLN−521上の単細胞懸濁物におけるトリプシン処理幹細胞を蒔いてから後に、多能性幹細胞の生存を可能にする。LN−521の効果は、hES細胞遊走およびPI3K/Akt経路活性化の誘導を通じての、α6β1インテグリンを介したシグナル伝達によって媒介されることが示された。結果は、多能性hES細胞およびiPS細胞の大規模産生のための有効で、さらに自動化された増殖方法ならびに多能性幹細胞の自己再生のための新しい培地剤の開発に適用され得る。ここで記載された新しいhES/hiPS細胞培養方法は、たとえば、線維芽細胞を培養するために使用される標準的な細胞培養方法に密に類似しており、そのため、それは特殊技能を必要としない。それは、1回の細胞分裂あたりに消費する細胞コーティング物質が著しくより少なく、時間効率的であり、したがって、hES/hiPS細胞を培養するための以前の手順と比較して著しい経済的利益をもたらす。
ヒトES細胞培養物およびヒトiPS細胞培養物
HS181およびHS401のヒトES細胞は、37℃、5%CO2で、O3培地(Rodinら、Nature Biotechnol.、第28巻、611〜615頁(2010年)に記載、pHは7.35に調整した)、mTeSR1(STEMCELL Technologies)、および化学的に特定されており、異種由来成分不含のTeSR2(STEMCELL Technologies)中、LN−521をコーティングした培養ディッシュ上で培養した。最初に、その系統の細胞を、無菌のナイフを使用して注意深く掻いて剥がして、続いてトリプシン処理することによって、ヒトフィーダー細胞層からLN−521コーティング上に移すか、または細胞は、LN−511コーティングから単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。ほんの数滴の新鮮な培地を加えたときに、蒔いてから後の第1日を除いて、1時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を1日に1回、細胞に提供した。細胞は、10〜12日間に1回、常習的に通過させ、37℃、5%CO2で5分間Trypsin/EDTA(GIBCO Invitrogen Corporation、Paisley、Scotland)に曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤(GIBCO Invitrogen)を加えた。細胞懸濁物は、4分間、25 rcfで遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたO3培地に再懸濁し、細胞は、その後、40μmのふるいに通過させた。続いて、細胞は、1:25〜1:30の分割比で30,000細胞/cm2の濃度で新しいLN−521でコーティングしたディッシュ上に蒔いた。同じ系統の対照細胞は、以前に記載されるようにO3培地において、Matrigel(STEMCELL Technologies)およびLN−511上で培養した9。
Technologies)培地および特定されており、いかなる動物由来の構成成分も含まないTrypLE(商標)Select(GIBCO Invitrogen Corporation、Paisley、Scotland)酵素を使用した。細胞は、10〜14日間ごとに通過させ、37℃、5%CO2で4〜5分間TrypLE(商標)Selectに曝露させた。その後、酵素を注意深く吸引し、あらかじめ温めたTeSR2培地を加えた。その後、細胞は、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたTeSR2に再懸濁した。細胞は、その後、40μmのふるいに通過させ、新鮮なLN−521をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。
BioLamina、AB、Stockholm(www.biolamina.com)から入手可能なヒト組換えLN−521は、ヒト胎児腎臓細胞(HEK293;ATCC CRL−1573)において産生され、本質的に以前に記載されるように、完全長ラミニンγ1、β2、およびα5構築物により逐次的にトランスフェクトした。タンパク質産生のために、HEK293細胞は、6日間まで、GlutaMax Iを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において培養した。LN−521分子は、抗FLAGマトリックス(Sigma)を使用してアフィニティー精製し、その後、還元および非還元条件下で3〜8%および4〜15%の勾配SDS−PAGEを使用して特徴付けた。タンパク質は、ポリビニリデンジフルオリド膜上の鎖の、Sypro Ruby(Bio−Rad)タンパク質染色および免疫染色を使用して可視化した。タンパク質をさらに特徴付けるために、ラミニンα5、β2、およびγ1鎖に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を実行した。ヒト組換えラミニン−111およびラミニン−121は、LN−521と同様に産生され、ウエスタンおよびSDS−PAGEによって予測分子サイズの正確な鎖を含有することが示された。その他に指定されない限り、対応するマウスラミニン−111(Invitrogen)は、LN−111として示された。
InSolutionTM LY 294002(特異的Akt阻害剤)、InSolutionTM ウォルトマニン(特異的PI3K阻害剤)、およびInSolutionTM 98059(特異的MEK1/Erk阻害剤)は、Calbiochemから購入した。ホスホAkt(#4060)、全Akt(#9272)、ホスホErk(#9101)、および全Erk(#9102)に対する抗体は、Cell Signaling
Technologyから得た。PathScan ホスホAkt1サンドイッチELISAキット(#7160)、PathScan 全Akt1サンドイッチELISAキット(#7170)、PathScan ホスホAkt2サンドイッチELISAキット(#7048)、およびPathScan 全Akt2サンドイッチELISAキット(#7046)もCell Signaling Technologyから購入した。カルネキシン(#ab10286)に対する抗体は、Abcamから得た。様々なインテグリンサブユニットに対する機能遮断抗体、マウスアイソタイプ抗体およびα−ジストログリカンは、Milliporeから購入した。αVに対する機能遮断抗体(MAB1980)およびα6に対する機能遮断抗体(MAB1378)は、アジ化ナトリウムを有する溶液中で提供されたので、生存実験における阻害の前に、アルファインテグリンサブユニットに対する抗体はすべて、毎回、2時間、O3培地に対して3回透析した。Lutheran受容体およびα−フェトプロテインに対する抗体ならびにラットアイソタイプ対照抗体は、R&D Systemsから得た。Oct4、Nanog、SSEA−4、平滑筋アクチン、およびMAP−2に対する抗体は、Milliporeから購入した。
免疫蛍光検査による調査のために、ES細胞は、培養し、4%パラホルムアルデヒドによって、8ウェルスライドチャンバー(BD Biosciences)または96ウェルプレートウェルにおいて固定し、0.1% Triton−Xによって透過処理し、1時間、0.1% Tween−20(Sigma−Aldrich、St.Louis、http://www.sigmaaldrich.com)を含有するリン酸塩−食塩水緩衝液(PBS)中10%ウシ胎仔血清(GIBCO Invitrogen Corporation)によってブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、室温で1.5時間実行した。二次抗体および4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、Molecular Probes)とのインキュベーションは、40分間実行した。インキュベーションの間、被検物は、PBS緩衝液中0.1%Tween−20により3〜5回洗浄した。被検物は、蛍光封入剤(Dako、Glostrup、Denmark、http://www.dako.com)中に保持し、蛍光顕微鏡(Leica、Heerbrugg、Switzerland、http://www.leica.com)下で観察した。
全RNAは、製造業者の指示に従って、Absolutely RNA Microprep Kit(Stratagene、La Jolla CA、www.stratagene.com)を使用して単離した。cDNAは、製造業者の指示に従って、oligo(dT)12−18プライマーおよびSuperscript II逆転写酵素(GIBCO Invitrogen Corporation)を含有する20μl反応混合物中の0.2μgの全RNAを使用して合成した。リアルタイム定量的RT−PCR
Taqmanアッセイは、Applied Biosystems 7300 Real−Time PCR System(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して実行した。反応はすべて、対象のmRNAについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックス(Applied Biosystems)を使用して4連で行った。各実験についての追加の反応は、RNAインプットを標準化するためのGAPDHについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、7300 System SDS Software v1.4により分析した。
細胞は、トリプシン/EDTAにより培養ディッシュから取り出し、単細胞懸濁物へと解離させ、氷冷FACS緩衝液(ハンクス緩衝液中2%ウシ胎仔血清、0.1%アジ化ナトリウム(sodium azid))中に再懸濁させた。SSEA−4に対する一次抗体(Millipore、Billerica、MA、http://www.millipore.comからの)とのインキュベーションは、氷上で1時間実行した。その後、細胞は、氷冷FACS緩衝液により3回洗浄した。続いて、細胞は、暗所中、30分間、Alexa Fluor抗マウス二次抗体(GIBCO Invitrogen Corporation)の1:400希釈物により、FACS緩衝液中でプローブし、4回洗浄した。対照細胞は、マウス免疫グロブリン、続いて上記に記載される二次抗体と共にインキュベートした。細胞をFACSCalibur Flow Cytometer(Becton Dickinson)で分析した。データは、CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson, San, Jose, CA)により分析した。
細胞系の核型分析は、標準的なQバンド技術を使用して実行した。細胞の試料は、4時間まで、コルセミドKaryoMAX(0.1μg/ml;Gibco Invitrogen Corporation)により処理し、その後、トリプシン/EDTA溶液(Gibco Invitrogen Corporation)により解離させた。細胞は、遠心分離を介してペレットにし、あらかじめ温めた0.0375M KCl低張溶液中に再懸濁し、10分間インキュベートした。遠心分離の後に、細胞は、固定液(3:1メタノール:酢酸)中に再懸濁した。分裂中期スプレッド(metaphase spread)は、ガラス製顕微鏡用スライドグラス上で調製し、トリプシンに対する短時間の曝露によってGバンド染色し、4:1 Gurr/Leishmann染色(Sigma−Aldrich Co.)により染色した。最低10個の分裂中期スプレッドを分析し、さらに20個を集計した。
奇形腫形成実験は、若い(7週齢)重症複合免疫不全(SCID)マウスの睾丸被膜下におよそ106細胞を移植することによって実行した。各細胞系当たり3匹の動物を使用した。奇形腫成長は、毎週の触診によって観察し、マウスは、移植の8週間後に犠牲にした。奇形腫は、固定し、切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)によりまたはヘマトキシリン、エオシン、およびPAS(HE−PAS)により染色した。3つの胎児性生殖系列層すべての組織構成成分の存在が、染色した切片から分析されるように実証された。動物実験はすべて、倫理委員会の承認に従って、Karolinska University Hospitalの感染のない動物施設で実行した。
LN−521をコーティングした細胞培養ディッシュからのES細胞は、37℃、5%CO2で1分間、TrypLE(商標)Selectに曝露し、培地により2回洗浄し、多くの小片へとばらばらにし、低接着プレート中で懸濁培養した。これに使用した培地は、2mM L−グルタミン、20%ウシ胎仔血清(GIBCO Invitrogen Corporation)、0.1mM β−メルカプトエタノール(GIBCO Invitrogen Corporation)、および1%非必須アミノ酸(GIBCO
Invitrogen Corporation)を補充したノックアウトDMEM(GIBCO Invitrogen Corporation)とした。懸濁物で1〜2週間経った後、胚様体は、ゼラチンをコーティングした組織細胞培養96ウェルプレート(Sarstedt)に移し、1〜2週間培養し、その後、固定し、3つの胎児性生殖系列層すべてのマーカー(平滑筋アクチン、MAP−2、およびα−フェトプロテイン)に対する抗体により染色し、免疫蛍光検査について上記に記載されるように分析した。
手短に言えば、96ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に50,000細胞/cm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で1時間接着させた。その後、プレートは、非接着細胞を除去するために培地により3回洗浄し、その後、接着細胞は、5%グルタルアルデヒドによって20分間固定し、0.1%クリスタルバイオレットによって染色した(Kebo Lab、Spanga、Sweden、http://www.kebolab.se)。水による1時間および3回の洗浄後に、クリスタルバイオレットは、10%酢酸により抽出し、570nmでの光学濃度を測定することによって定量化した。実験はすべて、4連で実行した。
細胞を24時間、細胞インキュベーター中に置いておいた以外は、上記の細胞接着アッセイについて記載されるように、生存アッセイを実行した。生存アッセイにおける阻害については、製造業者によって推奨される濃度の機能遮断抗体またはテキストに示される濃度の経路阻害剤と共に、細胞を、30分間、培地中に保ち、その後、コーティングしたディッシュ上に蒔いた。実験はすべて、4連で実行した。
HS 181細胞は、上記に記載されるように、単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。阻害実験については、細胞は、30分間、遮断抗体または経路阻害剤と共にO3培地中に保ち、その後、450Kの細胞は、適切なマトリックスコーティングによりあらかじめコーティングした35mmディッシュ上に蒔いた。他の実験については、同数の細胞を、トリプシン処理後に直接蒔いた。すべての場合において、37℃、5%CO2で1時間、細胞を拡散させた。氷冷PBSでの2回の洗浄の後に、細胞を有するプレートは、液体窒素中で急速凍結し、−80℃で保存した。ウエスタンブロットおよびELISAのための試料を調製するために、プレートは、ゆっくり解凍し、上に100〜150μlの溶解緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.5%デオキシコレート、0.5% SDS、1% Triton X−100、1% Igepal、Complete(商標)(Roche)、およびPhospho−Stop(商標)(Roche))を乗せて、氷上で保った。その後、細胞は、こすり取り、ピペットで移し、27G 3/4”針により煎断した。その後、細胞ペレットは、4℃で15分間、16,100 rcfで遠心分離することによって澄明にした。ウエスタンブロットについては、4〜12%勾配ゲルをSDS電気泳動に使用し、タンパク質はPVDF膜に移した。膜は、製造業者の指示に従って対象の抗体とハイブリダイズさせた。Amersham Biosciencesからの化学発光HRP基質を視覚化に使用した。デンシトメトリー分析については、フィルムは、2,400dpiでスキャンし、ChemiImager5500プログラム(1D−Multi Lineデンシトメトリーモード)によって分析した。ELISAについては、試料は、製造業者の指示に従ってウェルに適用した。
24ウェルプレートは、細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に30,000〜40,000細胞/cm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で30分間接着させた。その後、プレートは、37℃、5%CO2に保つのを可能にする環境制御ユニットを装備したハイコンテントイメージングシステムOperetta(PerkinElmer)の中に移した。作製した2つの動画について、Harmonyソフトウェア(PerkinElmer)を使用して、蒔いた後24時間の間に、15分間に1回、明視野画像を撮り、エクスポートし、ImageJソフトウェア(NIH、US)を使用して分析した。遊走アッセイについては、蒔いた後18時間の間に7分ごとに画像を撮った。蒔いた後5〜7時間目に得られる画像は、MTrackJプラグイン(University Medical Center、Rotterdam、The Netherlands)を使用して分析した。各コーティング上の100の付着細胞を、追跡し、現在の位置から以前の位置までの進路の平均距離を計算した。誤差のバーは、平均値の標準誤差、s.e.m.を示す(n=100)。
多能性hES細胞は、α1、α5、β1、β2、およびγ1ラミニン鎖を発現する。単様々なコーティング基層に蒔いた細胞懸濁物由来のhES細胞の接着およびクローン性生存を比較するために、LN−511上で単層としてまたはフィーダー層上でクラスターとして成長しているhES細胞を、O3培地中で単細胞懸濁物へとトリプシン処理し、ROCK阻害剤(Y−27632)の非存在下または存在下において、Matrigel、LN−111、LN−511、LN−521、またはLN−511およびLN−521の混合物でコーティングした細胞培養ディッシュ上に蒔き、24時間後に分析した。
ヒト胚性幹細胞を、2つの異なる細胞培養培地においてラミニン−521基質上で培養した。2つの細胞培養培地は、bFGFの量、3.9ng/mlおよび100ng/mlが異なった。
実施例1および2において、解離した幹細胞は、LN−521上での活性な運動性および小さな、有効に成長し、遊走する単層の、島へと会合することを介してほとんど生存した。非常に低いクローニング密度で蒔いた細胞は、プログラム細胞死の特殊な形態であるアノイキスにより死滅した。通常、細胞外マトリックス分子、たとえばラミニンからのインテグリン関連性のシグナル伝達およびカドヘリン関連性の細胞間シグナル伝達は、アノイキスを予防することができる。ヒトES細胞表面上の最も豊富なカドヘリンアイソフォームは、上皮カドヘリン(E−カドヘリン)である。実施例3における実験は、LN−521およびE−カドヘリンの組み合わせが、アノイキスからヒトES細胞を保護することができ、細胞のクローン性生存を可能にすることができるかどうかを調べるために実行した。
Claims (3)
- 幹細胞のための細胞培養系であって、前記細胞培養系は、
少なくとも0.3mMのアルブミンを含む細胞培養培地と、
ラミニンおよびカドヘリンを含む基質と
を含み、前記ラミニンが、完全なタンパク質、または他のラミニン分子および基底板分子ならびに膜結合受容体に結合することができるタンパク質断片であり、
前記基質が、前記幹細胞に構造的支持体を提供し、
前記ラミニンがラミニン−521であり、
前記カドヘリンがE−カドヘリンであり、
前記ラミニン対前記カドヘリンの重量比が5:1〜10:1である、細胞培養系。 - 前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項1に記載の系。
- 前記基質および前記培地が、いかなる分化阻害剤も、フィーダー細胞も、分化誘導物質も、アポトーシス阻害剤も含有しない、請求項1に記載の系。
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