KR101551998B1 - 줄기 세포 배양 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 안정화시키기 위한 화합물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

줄기 세포 배양{STEM CELL CULTURES}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2008년 12월 3일 출원된 미국 가출원 제61/200,808호를 우선권으로 주장하며, 이를 모든 목적을 위해 전체로 본원에 편입시킨다.
본 발명은 세포를 안정화시키기 위한 화합물 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포(ESC)는 무한하게 자가재생하고 신체의 모든 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 다능성 세포이다(Thomson, J.A. et al., Science 282(5391):1145-1147(1998); Thomson, J.A. & Odorico, J.S., Trends Biotechnol 18(2):53-57(2000)). 이러한 능력은 ESC가 언젠가는 상실되고 손상된 세포를 대체하는데 사용될 것이고, 통상의 약물이 미치는 범위를 뛰어넘는 요법제를 제공할 것이라는 희망을 준다. 그러나, hESC의 임상적 잠재력을 완전하게 이해하기 위해서는, 화학적으로 규명되고, 영양공급세포와 동물 생성물을 함유하지 않는, 강건한 배양 조건이 확립되어야 한다. 몇몇 화학적 규명 배지가 보고되었지만(Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(18):6907-6912(2006); Lu, J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(15):5688-5693(2006); Ludwig, T.E. et al., Nat Biotechnol 24(2):185-187(2006)), 이러한 배지들은 그들 내에서 세포의 최적 이하의 성능으로 인해 여전히 대개는 만족스럽지 못하다. 특히 이들 조건 하에서, 세포가 트립신에 의해 단일 세포로 계대될 때, 대량의 세포 사멸을 겪게된다. hESC 자가 재생을 매개하는 수많은 신호전달 경로가 알려져 있는데, FGF, TGF-β Wnt 등이 포함된다(James, D. et al., Development 132(6):1273-1282(2005); Xu, R.H. et al., Nat Methods 2(3):185-190(2005); Beattie, G.M. et al., Stem Cells 23(4):489-495(2005); Greber, B., Lehrach, H., & Adjaye, J., Stem Cells 25(2):455-464(2007); Sato, N. et al., Nat Med 10(1):55-63(2004)). 그러나, 이들 중 어떠한 것도 그 분자 기전이 분명하지 않은, 이러한 프로세스에서 생존 인자로서 작용하는 것 같지는 않다.
본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112011050666155-pct00001
상기 식에서,
고리 A는 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고;
고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이며;
L1은 -C(O)-NR2- 또는 -C(O)-NR2-이며;
L2는 결합, 치환 또는 미치환된 알킬렌 또는 치환 또는 미치환된 헤테로알킬렌이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 아릴이다.
일부 구체예에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 페닐이다.
일부 구체예에서, 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, 고리 B는 치환 또는 미치환된 피라졸릴, 치환 또는 미치환된 퓨라닐, 치환 또는 미치환된 이미다졸릴, 치환 또는 미치환된 이소옥사졸릴, 치환 또는 미치환된 옥사디아졸릴, 치환 또는 미치환된 옥사졸릴, 치환 또는 미치환된 피롤릴, 치환 또는 미치환된 피리딜, 치환 또는 미치환된 피리미딜, 치환 또는 미치환된 피리다지닐, 치환 또는 미치환된 티아졸릴, 치환 또는 미치환된 트리아졸릴, 치환 또는 미치환된 티에닐, 치환 또는 미치환된 디히드로티에노-피라졸릴, 치환 또는 미치환된 티아나프테닐, 치환 또는 미치환된 카르바졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조티에닐, 치환 또는 미치환된 벤조퓨라닐, 치환 또는 미치환된 인돌릴, 치환 또는 미치환된 퀴놀리닐, 치환 또는 미치환된 벤조트리아졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조티아졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조옥사졸릴, 치환 또는 미치환된 벤즈이미다졸릴, 치환 또는 미치환된 이소퀴놀리닐, 치환 또는 미치환된 이소인돌릴, 치환 또는 미치환된 아크리디닐, 치환 또는 미치환된 벤조이사졸릴, 또는 치환 또는 미치환된 디메틸하이단토인이다.
일부 구체예에서, L2는 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, L2는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, L2는 메틸렌이다.
일부 구체예에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 아릴이고; 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이며; R1은 수소이고; L2는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, R2는 수소이다.
일부 구체예에서, R1은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, R1은 수소이다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 II의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00002
상기 식에서, y는 0∼3의 정수이고; z는 0∼5의 정수이며; X는 -N=, -CH= 또는 -CR5=이고; R3, R4 및 R5는 독립적으로 CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고, 여기서 n은 0∼2의 정수이며, 만약 z가 1 보다 크다면, 2개의 R3 모이어티는 경우에 따라, 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성하고; R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, L2는 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, L2는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, L2는 메틸렌이다.
일부 구체예에서, X는 -N= 또는 -CH=이다.
일부 구체예에서, z는 2이고, 인접하는 정점에서 2개의 R3 모이어티는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬을 형성한다.
일부 구체예에서, z는 1이다.
일부 구체예에서, y는 0 또는 1이다.
일부 구체예에서, R3은 -OR18이고, R18은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, L2는 메틸렌이고; X는 -N= 또는 -CH=이며; R1은 수소이고; y 및 z는 0이다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00003
Figure 112011050666155-pct00004
또는
Figure 112011050666155-pct00005
본 발명은 또한, 하기 화학식 III의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112011050666155-pct00006
상기 식에서,
고리 D는 치환 또는 미치환된 아릴 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고;
L3은 -C(O)NH- 또는 -S(O)2NH-이며;
R20은 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고;
R21은 -NR22R23 또는 -OR24이고;
R22 및 R23은 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이거나, 또는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성하고;
R24는 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이거나, 또는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬을 형성한다.
일부 구체예에서, 고리 D는 치환 또는 미치환된 페닐이다.
일부 구체예에서, R20은 치환 또는 미치환된 알킬 또는 치환 또는 미치환된 사이클로알킬이다.
일부 구체예에서, R20은 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬 또는 치환 또는 미치환된 3∼7원 사이클로알킬이다.
일부 구체예에서, R20은 치환 또는 미치환된 C1-C5 알킬 또는 치환 또는 미치환된 3∼6원 사이클로알킬이다.
일부 구체예에서, R20은 미치환된 C1-C5 알킬 또는 미치환된 3∼6원 사이클로알킬이다.
일부 구체예에서, R22는 수소이고; R23은 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, R22는 수소이고; R23은 치환 또는 미치환된 치환 또는 미치환된 아릴이다.
일부 구체예에서, R22 및 R23은 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성한다.
일부 구체예에서, R22 및 R23은 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 피롤릴, 치환 또는 미치환된 이소인돌리닐, 치환 또는 미치환된 피페리디닐, 또는 치환 또는 미치환된 테트라히드로퀴놀리닐을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00007
상기 식에서, w는 0∼1의 정수이고; q는 0∼7의 정수이며; R25, R26, R27 및 R28은 독립적으로 -CN, -NR29R30, -C(O)R31, -NR32-C(O)R33, -NR34-C(O)-OR35, -C(O)NR36R37, -NR38S(O)2R39, -OR40, -S(O)2NR41, -S(O)vR42, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고, 여기서 v는 0∼2의 정수이며; R29, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41, 및 R42는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고, 여기서 R25 및 R26 , 또는 R26 및 R27은 결합되어 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, R28은 -OR40이고, 여기서 R40은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, R40은 수소 또는 미치환된 C1-C5 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00008
일부 구체예에서, R20은 미치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, R28은 -OR40이고, 여기서 R40은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬, 또는 치환 또는 미치환된 C3-C6 사이클로알킬로 치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 구체예에서, q는 1이다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00009
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00010
Figure 112011050666155-pct00011
Figure 112011050666155-pct00012
또는
Figure 112011050666155-pct00013
본 발명은 또한 시험관 내에서 단리된 세포를 안정화시키는 방법을 또한 제공한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 동물 세포를 이 세포가 안정화되도록 화학식 I 또는 III의 화합물의 충분량과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 이 방법은 화합물의 존재 하에서 세포의 조건 또는 환경을 변화시키는 단계를 더 포함하는데, 화합물의 부재 하에서 이러한 변화 단계는 세포의 세포 프로그래밍에서의 변화를 일으키게 된다. 일부 구체예에서, 변화 단계는 세포 해동 및 다른 세포로부터의 세포 해리 중 1 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 부착성이다. 일부 구체예에서, 세포는 현탁액으로 존재한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 세포의 표현형을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 동물로부터 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 동물은 인간이다. 일부 구체예에서, 동물은 인간이외의 동물이다.
일부 구체예에서, 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 일부 구체예에서, 화합물은 화학식 III의 화합물이다.
본 발명은 또한 동물에서 병태를 완화시키는 방법을 또한 제공한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 이를 필요로하는 동물에게 병태가 완화되도록 화학식 I 또는 III의 화합물의 충분량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 병태는 조직 손상, 졸중, 및 암으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 조직은 췌장, 간, 장, 폐, 및 신장으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 병태는 이식된 조직 또는 장기의 적어도 부분적인 거부를 포함한다. 일부 구체예에서, 이식은 골수, 제대혈, 정제된 조혈모세포 또는 전구 세포, 심장 세포, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 또는 간 세포의 이식을 포함한다.
일부 구체예에서, 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 일부 구체예에서, 화합물은 화학식 III의 화합물이다.
본 발명은 또한 세포 생존율을 유지하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 단리된 줄기 세포, 전구 세포, 또는 분화 세포를 생성하는 단계; 및 세포 생존율이 유지되도록, 단리된 세포에서 E-카데린의 안정화를 유도하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 유도 단계는 화합물 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 줄기 세포의 생존율을 향상시키기에 충분한 화학식 I의 화합물의 양을 단리된 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 유도 단계는 단리된 줄기 세포를 표면 상에서 배양하는 것을 포함하고, 여기서 E-카데린 엑토도메인을 포함하는 분자가 표면에 테더링(tethering)된다.
또한, 본 발명은 세포에서 E-카데린을 안정화시키는 분자 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 세포의 생존율을 향상시키기에 충분한, 세포에서 E-카데린을 안정화시키는 분자의 양을 포함하는 단리된 세포의 개체군을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 분자는 화학식 I의 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전구 세포, 분화 세포, 베타 세포 및 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 화학식 I 또는 III의 화합물 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 세포의 생존율을 향상시키기에 충분한, 화학식 I 또는 III의 화합물의 양을 포함하는 단리된 세포의 개체군을 제공한다.
일부 구체예에서, 세포는 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전구 세포, 분화 세포, 베타 세포 및 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 줄기 세포 생존율을 유지하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 단리된 세포를 생성하는 단계; 및 세포 생존율이 유지되도록, 단리된 세포에서 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화 단계는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 부재시의 생존율과 비교하여 세포의 생존율을 향상시키기 위해 단리된 세포와 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트의 충분량을 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 단백질 키나제 C(PKC) 활성인자 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 줄기 세포의 생존율을 향상시키는데 충분한 단백질 키나제 C 활성인자의 양을 포함하는 단리된 줄기 세포의 개체군을 제공한다.
-정의-
본원에서 사용되는 약어는 화학 및 생물학 분야에서 통용되는 의미를 갖는다.
용어 "세포를 안정화"는 세포가 노출되는 조건 또는 환경에서의 변화에 대한 세포의 반응을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 것을 의미한다. 여기서 "실질적으로 감소"는 반응이, 안정화 성분(예를 들어, 본 발명의 화합물)의 부재시에 일어나는 것보다 50% 이상으로 낮은 것을 의미한다.
용어 "세포의 조건 또는 환경을 변화"는 온도, 배양 배지(예를 들어, 탄소원, 염 농도, 성장 인자), 단리된 세포로 세포의 해리, 세포 해동을 변화시키거나, 또는 그외에 세포의 당면 환경의 요인 변화를 의미한다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 세포의 조건 또는 환경 변화는 대체로 세포의 표현형 또는 세포 프로그래밍이 변화하는 것이다. 예를 들어, 줄기 세포와, 일부 다른 세포는, 단리시에, 일정 변화 예컨대 단리, 해동 등에 반응하여 분화 및/또는 사멸된다. 따라서, 조건 변화는 세포 생존능을 감소 또는 제거할 수 있는 반면, 본 원에 기술된 바와 같이 안정화된 세포는 조건의 동일 변화 하에서 생존능을 실질적으로 감소시키지 않는다. 세포 프로그래밍에서의 변화는 또한 하나 또는 일련의 특징적인 유전자 또는 유전자 산물의 발현에 의해서 및/또는 일정 세포 유형에 대한 특징은 특정 자극에 대한 세포의 반응으로 모니터링될 수 있다. 비제한적인 예로서, 인간 다능성 줄기 세포는 적어도 일부, 경우에 따라 모든, 하기 열거한 마커를 발현하는 것으로 알려져 있다: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카데린, UTF-1, Oct4, Rex1, 및 Nanog. 이러한 발현은 줄기 세포가 다능성을 상실하게 됨에 따라 아니면 분화됨에 따라 변할 수 있다. 안정화된 인간 다능성 줄기 세포는 조건 변화 후에 그의 특징적인 발현 패턴이 유지된다.
"단리된" 세포는 유기체의 다른 세포로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 것이다.
용어 "해리(dissociating)" 세포는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 평판 표면)으로부터 세포를 단리하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물이나 조직으로부터 해리될 수 있다. 다르게, 시험관 내에서 응집된 세포는 서로 해리될 수 있다. 또다르게, 부착성 세포는 배양 평판 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 따라서 해리는 세포외 매트릭스(ECM) 및 기재(예를 들어, 배양 표면)와 세포의 상호작용 파괴 또는 세포간 ECM 파괴를 포함한다.
"세포의 표현형 결정"은 세포의 특징 또는 자질을 평가하는 것을 의미한다. 표현형은 예를 들어, 세포 유형-특징적인 유전자 발현, 또는 유전자 발현 패턴, 자극이나 환경에 대한 세포의 반응, 분화 또는 탈분화능력을 포함할 수 있고, 특정 형태 등을 가질 수 있다
화학 치환기가 그들의 통상의 화학식으로 특정된 경우, 좌에서 우로 기재되고, 이들은 우측에서 좌측으로 기재된 결과에 의한 화학적으로 동일한 치환기를 동등하게 포함하며, 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-와 동등하다.
그자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬"은, 달리 언급하지 않으면, 직쇄(즉, 미분지형) 또는 분지형이거나, 또는 이의 조합이고, 이는 완전하게 포화되고, 단일- 또는 다중불포화될 수 있으며, 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있고, 표시된 탄소 원자 개수를 갖는다(즉, C1-C10은 1∼10개 탄소를 의미함). 포화된 탄화수소 라디칼의 예는, 이에 제한되는 것은 아니고, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실,(사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성질체를 포함한다. 불포화된 알킬 기는 1 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화된 알킬 기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니고, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성질체를 포함한다. 바람직한 알킬 기는 C1 -6　알킬 기이다.
그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬렌"은 알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하며, 예로서, 이에 제한되는 것은 아니고, -CH2CH2CH2CH2-를 들 수 있다. 대체로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 탄소 원자수가 1∼24개이고, 10개 또는 그 이하의 탄소 원자를 갖는 기를 본 발명에서 예시한다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 단쇄 알킬 또는 알킬렌 기로서, 대체로 탄소 원자가 8개 또는 그 이하이다. 바람직한 알킬렌 기는 C1 -6　알킬렌 기이다.
그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여 용어 "헤테로알킬"은 달리 언급하지 않으면, 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 환형 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합을 의미하는데, 1 이상의 탄소 원자, 및 O, N, P, Si 및 S로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 이종원자로 구성되고, 여기서 질소와 황 원자는 경우에 따라 산화될 수 있고 질소 이종원자는 경우에 따라 4차화될 수 있다. 이종원자(들) O, N, P 및 S와, Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬 기가 분자의 나머지에 결합되는 위치에 존재할 수 있다. 예로는, 이에 제한되는 것은 아니고, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, O-CH3, -O-CH-2-CH3 , 및 -CN을 포함한다. 최대 2개의 이종원자가 연속될 수 있는데, 예를 들어 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3이다. 유사하게, 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로알킬렌"은 헤테로알킬에서 유도된 2가 라디칼을 의미하는데, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니고, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-를 들 수 있다. 헤테로알킬렌 기에 대해, 이종원자가 또한 사슬 말단 중 하나 또는 둘 모두를 차지할 수 있다(예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 대해, 연결기의 배향은 연결기의 화학식이 기재된 방향에 의해 암시되는 것이 아니다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2-를 나타낸다. 상기 기술한 바와 같이, 본원에서 사용되는 헤테로알킬 기는 이종원자를 통해 분자의 나머지에 결합되는 기들을 포함하며, 예컨대 -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR', 및/또는 -SO2R'를 포함한다. 특정 헤테로알킬 기, 예컨대 -NR'R" 등의 언급 후, "헤테로알킬"이 언급되는 경우, 용어 헤테로알킬 및 -NR'R"는 중복되거나 상호 배타적인 것이 아님을 이해하게 될 것이다. 다시 말해, 특정 헤테로알킬기는 명확함을 더하기 위해 언급된다. 따라서, 용어 "헤테로알킬"은 특정 헤테로 알킬기, 예컨대 -NR'R" 등을 배제하는 것으로서 본원에서 이해되어서는 안된다. 바람직한 헤테로알킬 기는 C1 -6　헤테로알킬 기이다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 2 이상의 다른 기를 연결하는, 상기 정의된 바와 같은 헤테로알킬 기를 의미한다. 헤테로알킬렌에 연결된 2 모이어티는 헤테로알킬렌의 동일 원자 또는 다른 원자에 연결될 수 있다. 바람직한 헤테로알킬렌기는 C1 -6　헤테로알킬렌 기이다.
그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은, 달리 언급하지 않으면, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환형 형태를 의미한다. 부가적으로, 헤테로사이클로알킬의 경우, 이종원자는 복소환이 분자의 나머지에 결합하는 위치를 차지할 수 있다. 사이클로알킬의 예는 이에 제한되지 않고, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함한다. 헤테로사이클로알킬의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니고, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로퓨란-2-일, 테트라히드로퓨란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐이 포함된다. "사이클로알킬렌" 및 "헤테로사이클로알킬렌"은 각각 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬에서 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬 기는 C3 -8 사이클로알킬 및 C3 -8 헤테로사이클로알킬 기, 또는 C5 -8 사이클로알킬 및 C5 -8 헤테로사이클로알킬 기일 수 있다.
그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 달리 언급하지 않으면, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 부가적으로, 용어 예컨대 "할로알킬"은 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 이에 제한되는 것은 아니고, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "아릴"은 달리 언급하지 않으면, 함께 융합되거나 또는 공유 결합된 다중고리(바람직하게 1∼3 고리) 또는 단일 고리일 수 있는, 다중불포화된, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S에서 선택된 1∼4 이종원자를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 의미하는데, 여기서 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되고, 질소 원자(들)은 경우에 따라 4차화된다. 헤테로아릴 기는 탄소 또는 이종원자를 통해 분자의 나머지에 결합할 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴 4-이소옥사졸릴 5-이소옥사졸릴 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸릴닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환기는 이하에 기술하는 허용되는 치환기의 군에서 선택된다. "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 각각 아릴 및 헤테로아릴에서 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 본 발명의 아릴 기는 5-12원 고리 구성원, 보다 바람직하게는 6-10원 고리 구성원을 갖는다. 본 발명의 헤테로릴 기는 바람직하게 5-12원 고리 구성원, 보다 바람직하게는 5-10원 고리 구성원을 갖는다.
간략하게, 다른 용어와 조합하여 사용될 때 용어 "아릴"(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)은 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 모두를 포함한다. 용어 "아릴알킬"은, 탄소 원자(예를 들어, 메틸렌 기)가 예를 들어 산소 원자로 치환된 알킬 기를 포함하는 알킬 기에 아릴 기가 결합된(예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등) 라디칼을 포함한다(예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등).
본원에 사용되는 용어 "옥소"는 탄소 원자에 이중 결합된 산호를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "알킬설포닐"은 화학식 -S(O2)-R'를 갖는 모이어티를 의미하며, 상기 식에서, R'은 상기 정의된 바와 같은 알킬 기이다. R'은 특정 개수의 탄소 원자를 가질 수 있다(예를 들어, "C1-C4 알킬설포닐").
각각의 상기 용어들(예를 들어, "알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴")은 표시된 라디칼의 치환 및 미치환된 형태 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다. 각 유형의 라디칼에 대한 예시적인 치환기는 이하에 제공한다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼에 대한 치환기(흔히 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐)는 이에 제한되는 것은 아니고, 0 내지(2m'+1)(m'은 이러한 라디칼에서의 총 탄소 원자 개수임) 범위의 개수로 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2에서 선택되는 다양한 기 중 1 이상일 수 있다. R', R", R"' 및 R""은 각각 바람직하게, 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴(예를 들어, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴), 치환 또는 미치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 의미한다. 본 발명의 화합물이 1개보다 많은 R 기를 포함할 때, 예를 들어, 각각의 R 기는, 이들 기가 1 보다 많이 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기에서 처럼 선택된다. R' 및 R"이 동일한 질소 원자에 결합할때, 이들은 질소 원자와 조합되어 4-, 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성한다. 예를 들어, -NR'R"은 이에 제한되는 것은 아니고, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함한다. 상기 치환기에 대한 설명으로부터, 당분야의 숙련가는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것을 의미함을 이해하게 된다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하고, 예를 들어 할로겐, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬에서 선택되며, 이 개수는 0∼방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총 개수 범위이고; R', R", R"' 및 R""는 바람직하게 독립적으로, 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴 및 치환 또는 미치환된 헤테로아릴에서 선택된다. 본 발명의 화합물이 1 보다 많은 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R 기는 독립적으로, 1 보다 많이 이러한 기가 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기에서와 같이 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접하는 원자 상의 2개 치환기는 경우에 따라 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 고리를 형성할 수 있고, 여기서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, q는 0∼3의 정수이다, 다르게, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접하는 원자 상의 2개 치환기는 경우에 따라 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 치환될 수 있고, 여기서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1∼4의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 경우에 따라 이중 결합으로 치환될 수 있다. 다르게, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접하는 원자 상의 2개 치환기는 경우에 따라 화학식 -(CRR')s-X'-(C"R"')d-의 치환기로 치환될 수 있고, 이 식에서 s 및 d는 독립적으로 0∼3의 정수이고, X'은 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R'"은 바람직하게 독립적으로, 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 및 치환 또는 미치환된 헤테로아릴에서 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종원자" 또는 "고리 이종원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S), 인(P), 및 규소(Si)를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "치환기(substituent, substituent group)"는 하기 모이어티에서 선택되는 기를 의미한다:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 옥소, 할로겐, 미치환된 알킬, 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 미치환된 헤테로사이클로알킬, 미치환된 아릴, 미치환된 헤테로아릴, 및
(B) 하기 (i) 및(ii)에서 선택된 1 이상의 치환기로 치환되는, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴:
(i) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 미치환된 알킬, 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 미치환된 헤테로사이클로알킬, 미치환된 아릴, 미치환된 헤테로아릴, 및
(ii) 하기 (a) 및(b)에서 선택된 1 이상의 치환기로 치환되는, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴:
(a) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 미치환된 알킬, 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 미치환된 헤테로사이클로알킬, 미치환된 아릴, 미치환된 헤테로아릴, 및
(b) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 미치환된 알킬, 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 미치환된 헤테로사이클로알킬, 미치환된 아릴, 및 미치환된 헤테로아릴에서 선택된 1 이상의 치환기로 치환되는, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴.
본원에서 사용되는 "크기 제한 치환기"는 "치환기"에 대해 상기 기술한 모든 치환기에서 선택된 기를 의미하며, 여기서 각각의 치환 또는 미치환된 알킬은 치환 또는 미치환된 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬은 치환 또는 미치환된 2∼20원 헤테로알킬이며, 각각의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 C4-C8 사이클로알킬이고, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 4∼8원 헤테로사이클로알킬이다.
본원에서 사용되는 "저급 치환기"는 "치환기"에 대해 상기 기술한 모든 치환기에서 선택된 기를 의미하고, 여기서 각각의 치환 또는 미치환된 알킬은 치환 또는 미치환된 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬은 치환 또는 미치환된 2∼8원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 C5-C7 사이클로알킬이며, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 5∼7원 헤테로사이클로알킬이다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본원에 기술한 화합물 상에 존재하는 특정 치환기에 따라서, 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해 제조되는 활성 화합물의 염을 포함함을 의미한다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성 작용기를 함유할 때, 염기 부가염은 이러한 화합물의 중성 형태를 니트(neat) 또는 적절한 불활성 용매 하에, 원하는 염기의 충분량과 접촉시켜 획득될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염기 부가염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성 작용기를 함유할 경우, 산 부가염은 이러한 화합물의 중성 형태를 니트 또는 적절한 불활성 용매 하에서, 원하는 산의 충분량과 접촉시켜 획득될 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 부가염의 예는 무기산 예컨대, 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 1수소탄산, 인산, 1수소인산, 2수소인산, 1수소황산, 요오드산, 또는 아인산 등에서 유도된 것과, 비교적 무독성 유기산 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등에서 유도된 염을 포함한다. 또한 아미노산 예컨대 아르기네이트의 염, 및 유기산 예컨대 글루쿠론산 또는 갈락투노르산의 염을 포함한다(예를 들어, Berge et al ., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19 참조). 본 발명의 일정한 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환되게하는 염기성 및 산성 작용기 둘 모두를 함유한다.
따라서, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 산과의 염으로서 존재할 수 있다. 본 발명은 이러한 염을 포함한다. 이러한 염의 예로는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 설페이트, 메탄설포네이트, 나이트레이트, 말레에이트, 아세테이트, 사이트레이트, 푸마레이트, 타르트레이트((+)-타르트레이트,(-)-타르트레이트 또는 라세믹혼합물을 포함하는 이의 혼합물), 숙시네이트, 벤조에이트 및 아미노산, 예컨대 글루탐산과의 염을 포함한다. 이들 염은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
화합물의 중성 형태는 바람직하게, 염을 염기 및 산과 접촉시키고 통상의 방식으로 모화합물을 단리하여 재생된다. 화합물의 모 형태는 일정 물리적 특성, 예컨대 극성 용매에서의 가용성 등이 다양한 염 형태와 상이하다.
염 형태 이외에도, 본 발명은 프로드러그 형태인, 화합물을 제공한다. 본원에 기술된 화합물의 프로드러그는 생리적 조건 하에서 화학적 변화가 용이하게 일어나 본 발명의 화합물을 제공하는 화합물이다. 부가적으로, 프로드러그는 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법을 통해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 프로드러그는 적절한 효소 또는 화학 시약을 함유하는 경피 팻치 저장소에 위치시 본 발명의 화합물로 서서히 전환될 수 있다.
본 발명의 일정 화합물은 수소화물 형태를 포함하여, 용매화물 형태와 비용매화물 형태로 존재할 수 있다. 대체로, 용매화물 형태는 비용매화물 형태와 균등하고 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명의 일정 화합물은 다중 결정형 또는 무정형으로 존재할 수 있다. 대체로, 모든 물리적 형태는 본 발명에서 고려되는 용도를 위해 균등하고 본 발명의 범주에 포함시키고자 한다.
본 발명의 일정 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합; 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체, 기하 이성질체를 보유하고, 개별 이성질체를 본 발명의 범주에 포함시킨다. 본 발명의 화합물은 합성 및/또는 단리하기에 너무 불안정하다고 당분야에 알려진 것들은 포함하지 않는다.
본 발명의 화합물은 또한 이러한 화합물에 포함되는 1 이상의 원자에서 비천연 부분의 원자 동위원소를 함유할 수도 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예컨대 트리튬(3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14(14C)로 방사성표지될 수 있다. 방사능과 무관하게, 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변이를 본 발명의 범주에 포함시킨다.
도 1. 신규 합성된 소형 분자는 장기간 재생능 및 전체 발생능을 상쇄시키지 않으면서 단일 세포 해리 이후 hESC 생존율을 상당히 증가시킨다. (a) 표시한 바와 같이 티아조비빈/Tzv 및 파이린테그린/Ptn의 화학 구조. (b) 표시한 바와 같이 처리하고 저농도로 접종한 해리된 단일 세포로부터 성장시킨 hESC 콜로니의 ALP 염색. (c) 전체 초기 접종 세포 대비 ALP 양성 콜로니의 비율. (d) 표시한 바와 같이 Ptn 또는 Tzv를 함유하는 배지에 장기간 유지시킨 hESC의 면역염색. (e) Tzv(i, ii) 또는 Ptn(iii, iv)를 함유하는 배지에서 유지시킨 장기간 증식시킨 hESC로부터 형성된 5주 기형종의 절단부. 신경상피(외배엽), 연골(중배엽), 및 단층상피(내배엽)(i); 신경상피(외배엽), 단층상피 및 간-유형 상피(내배엽)(ii); 신경상피(외배엽), 연골(중배엽) 및 관형 상피(내배엽)(iii); 신경상피(외배엽), 골격근(중배엽) 및 관형 상피(내배엽)(iv). (f) 화합물 Ptn 또는 Tzv 존재하에 20계대 이상으로 증식시킨 후, G-밴딩 분석결과. 특정하지 않으면, 상기 모든 hESC는 Matrigel-코팅된 평판 상에서 영양공급세포없이, 화학적으로 규정된 배지에서 성장시켰다.
도 2. Tzv는 현탁 배양중 사멸로부터 hESC를 보호하도록 세포 해리 후 E-카데린을 안정화시킨다. (a) Ptn 또는 Pzv로 처리 또는 미처리된 현탁액 또는 Matrigel 상에서 성장시키고 해리한 hESC의 세포 사멸 분석결과. (b) 표시한 분자로 처리된 미코팅 평판에서 성장시킨 hESC의 위상차 영상. (c) E-카데린 또는 GFP에 대하여 특이적 siRNA로 형질감염된 hESC에서 E-카데린의 웨스턴 블랏 분석결과. (d) Tzv 존재 하에 E-카데린 또는 GFP에 대한 특이적 siRNA로 형질감염된 해리시킨 hESC의 TUNEL 염색에 의한 세포 사멸 분석 결과 및 (e) ALP 염색 결과. (f) 트립신 처리 전후 hESC에서 전체 길이 E-카데린의 웨스턴 블랏 결과. (g) 트립신 해리 및 표시한 시간 동안 DMSO, Tzv, 또는 Ptn로 처리한 후 hESC에서 전체길이 E-카데린 발현의 시간경과 웨스턴 블랏 분석결과. (h) Tzv 존재 하에 트립신 처리 후 hESC에서 E-카데린 표면 수준의 유세포분석 결과. DMSO를 대조군으로 사용함. (i) Tzv 처리 또는 미처리한 hESC에서 E-카데린의 반정량적 RT-PCR 결과. (j) Tzv 존재 또는 부재하에서 E-카데린 세포내이입 분석 결과. (k) BSA- 또는 상이한 농도의 E-cad-Fc 키메라 코팅된 평판 상에서 성장된 hESC의 세포 성장률 분석 결과
도 3. Ptn 및 Tzv는 인테그린 활성을 유지하고 재활성화시켜 해리 이후 부착성 배양에서 세포 사멸로부터 hESC를 보호한다. (a) Ptn 및 Tzv 처리에 대한 상이한 시간 기간에 따른 Matrigel에서 성장시킨 hESC의 성장 그래프. 그룹 1. 처음 24시간 동안만 Ptn 처리; 그룹 2, 전체 배양 기간 동안 연속적인 Ptn 처리; 그룹 3, 처음 24시간 동안만 Tzv 처리; 그룹 4, 배양 동안 연속적인 Tzv 처리; 각 조건에 대해, 10××104 해리 세포를 6웰 평판의 웰당 플레이팅하였다. (b) 표시한 화합물로 처리하고 상이한 매트릭스 상에 접종하고 12시간 후 hESC의 위상차 영상. (c) 해리된 hESC를 Matrigel-코팅된 평판에 플레이팅하고 표시한 바와 같이 인테그린 β1 차단 항체와 함께 또는 화합물 존재하에 3시간 동안 부착시켰다. 부착율은 방법 및 재료에 설명된 대로 계산하였다. (d) 트립신 처리 전후 hESC에 의해 발현된 인테그린 β1의 웨스턴 블랏 분석. (e) 트립신 해리 및 표시된 시간 동안 DMSO, Tzv, 또는 Ptn로 처리 후 hESC에서 인테그린 발현에 대한 시간 경과 웨스턴 블랏 분석. (f, g) Tzv 또는 Ptn으로 처리한 후 트립신-해리된 hESC의 활성형에서 β1 인테그린의 유세포분석(f), 및 면역염색분석(g). (h, i) β1-활성화 항체, TS2/16 처리 또는 미처리된 hESC의 세포 부착성(h) 및 ALP 염색(i). (j) PKC 억제제와 조합하거나 또는 조합하지 않고 Tzv 또는 Ptn 처리한 hESC의 세포 부착성. (k) PMA(10 nM) 처리 또는 미처리된 hESC의 활성형에서 β1 인테그린의 면역 염색. (l, m) 표시한 화합물로 처리된 hESC의 세포 부착성(l) 및 ALP 염색(m).
도 4. 성장 인자 수용체-매개 PI-3 K 및 ERK는 각각 hESC 니체로부터 생성되는 주요 생존 및 항분화 신호이다. (a) Matrigel 상에 플레이팅하고 표시한 바와 같이 처리한 해리된 hESC의 세포 사멸 분석. (b) 2시간 동안 Ptn 처리된 hESC에서 상이한 성장 인자 수용체의 인산화 상태를 보여주는 웨스턴 블랏. DMSO를 대조군으로 사용함. (c) 표시된 조건으로 처리된 현탁액 중 해리된 hESC의 세포 사멸 분석. (d) EGFR1 및 Erb2와 E-카데린의 상호작용을 보여주는 면역침강법. (e) 표시된 시간 동안 Ptn으로 처리된 hESC에서 AKT 인산화 상태를 보여주는 웨스턴 블랏. (f) Ptn 존재 하에 또는 인테그린 β1 차단 항체와 함께 처리된 AKT 및 ERK 인산화 상태를 보여주는 웨스턴 블랏. (g) Ptn 처리 또는 표시된 수용체 억제제와 함께 처리된 hESC에서 AKT 인산화 상태를 보여주는 웨스턴 블랏. (h) 24시간 동안 Ptn으로 또는 PI-3K 억제제와 함께 또는 MEK 억제제로 처리된 hESC의 세포 사멸 분석. (i) MEK 억제제로 처리한 후 SSEA4 음성 세포의 비율.
도 5A 및 5B는 티아조비빈 및 이의 유도체를 포함하여, 본 발명의 화합물을 도시한 도면이다.
도 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 6I, 6J, 6K, 6L, 6M, 6N, 6O, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6U, 6V, 6W, 6X, 6Y, 6Z, 6AA, 6AB 및 6AC는 파이린테그린 및 이의 유도체를 포함하여, 본 발명의 화합물을 도시한 도면이다.
I. 서론
본 발명은 신규한 화합물과 이의 사용 방법을 제공한다. 이에 제한되는 것은 아니고, 세포가 단리되거나 또는 아니면 그들의 정상 배지 또는 조직 환경 외부에 존재할 때를 포함하여, 세포 생존율을 촉진하고 세포의 분화를 방지하는 2가지 부류의 소형 분자 화학적 화합물을 제공한다. 이러한 화합물은 어느정도 상이한 기전에 의해 작용하지만 이에 제한되는 것은 아니고, 암, 조직 손상 및 졸중을 포함하여, 수많은 다양한 질환 징후에 대한 예방 및 치료 화합물로서 모두 유용하다.
II . 세포 생존율 및/또는 항분화성을 촉진하는 화합물
일 측면에서, 세포 생존율 및/또는 항분화성을 촉진하는 화합물을 제공한다. 일부 구체예에서, 화합물의 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00014
상기 화학식 I에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
L1은 -C(O)-NR2- 또는 -NR2-C(O)-이다. L2는 결합, 치환 또는 미치환된 알킬렌 또는 치환 또는 미치환된 헤테로알킬렌이다.
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 아릴이다. 고리 A는 또한 치환 또는 미치환된 페닐일 수 있다.
다른 구체예에서, 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. 고리 B는 또한 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. 또 다른 구체예에서, 고리 B는 치환 또는 미치환된 피라졸릴, 치환 또는 미치환된 퓨라닐, 치환 또는 미치환된 이미다졸릴, 치환 또는 미치환된 이소옥사졸릴 치환 또는 미치환된 옥사디아졸릴, 치환 또는 미치환된 옥사졸릴, 치환 또는 미치환된 피롤릴, 치환 또는 미치환된 피리딜, 치환 또는 미치환된 피리미딜, 치환 또는 미치환된 피리다지닐, 치환 또는 미치환된 티아졸릴, 치환 또는 미치환된 트리아졸릴, 치환 또는 미치환된 티에닐, 치환 또는 미치환된 디히드로티에노-피라졸릴, 치환 또는 미치환된 티아나프테닐, 치환 또는 미치환된 카르바졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조티에닐, 치환 또는 미치환된 벤조퓨라닐, 치환 또는 미치환된 인돌릴, 치환 또는 미치환된 퀴놀리닐, 치환 또는 미치환된 벤조트리아졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조티아졸릴, 치환 또는 미치환된 벤조옥사졸릴, 치환 또는 미치환된 벤즈이미다졸릴, 치환 또는 미치환된 이소퀴놀리닐, 치환 또는 미치환된 이소인돌릴, 치환 또는 미치환된 아크리디닐, 치환 또는 미치환된 벤조이사졸릴, 또는 치환 또는 미치환된 디메틸하이단토인이다.
L2는 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬일 수 있다. 일부 구체예에서, L2는 미치환된 C1-C10 알킬일 수 있다. L2는 또한 치환 또는 미치환된 메틸렌(예를 들어, 미치환된 메틸렌)일 수 있다.
R2는 수소일 수 있다. R1은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬일 수 있다. 일부 구체예에서, R1은 간단히 수소이다.
화학식 I의 일부 구체예에서, 고리 A는 치환 또는 미치환된 아릴이고, 고리 B는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이며, R1은 수소이고, L2는 미치환된 C1-C10 알킬이다.
다른 구체예에서, 세포 생존율 및/또는 항분화성을 촉진하는 화합물은 하기 화학식 II의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00015
상기 화학식 II에서, y는 0∼3의 정수이고, z는 0∼5의 정수이다. X는 -N=, -CH= 또는 -CR5=이다. R1 및 L2는 화학식 I의 정의에서 상기 정의된 바와 같다.
R3, R4 및 R5는 독립적으로 -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고, 상기에서 n은 0∼2의 정수이며, 여기서 z가 1 보다 크면, 2개의 R3 모이어티는 경우에 따라 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성한다.
R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, L2는 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다. L2는 또한 미치환된 C1-C10 알킬일 수 있다. 다르게, L2는 치환 또는 미치환된 메틸렌(예를 들어, 미치환된 메틸렌)이다.
다른 구체예에서, X는 -N= 또는 -CH=이다. 심볼 z는 2일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인접하는 정점에서 2개의 R3 모이어티는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬을 형성한다. 심볼 z는 또한 1 일 수 있다. 심볼 y는 0 또는 1일 수 있다. R3은 -OR18일 수 있다. R18은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬일 수 있다.
일부 구체예에서, L2는 치환 또는 미치환된 메틸렌(예를 들어, 치환된 메틸렌)이고, X는 -N= 또는 -CH=이고, R1은 수소이며, y와 z는 0이다.
다른 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00016
Figure 112011050666155-pct00017
(종종 티아조비빈 또는 "Tzv"라함)
Figure 112011050666155-pct00018
또는
Figure 112011050666155-pct00019
또 다른 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 고리 A가 각각 1-5개의 R3 기로 임의 치환되는, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고; 고리 B는 각각 1-5개의 R4 기로 임의 치환되는 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴이며; L1은 -C(O)-NR2- 또는 -NR2-C(O)-이고; L2는 결합, C1 -10 알킬렌 또는 C1 -10 헤테로알킬렌이며; R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, C3 -8 사이클로알킬, C3 -8 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, 상기에서 n은 0∼2의 정수이며, 여기서 2개의 R3 모이어티는 경우에 따라 함께 결합되어 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴을 형성하고; R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 각각 독립적으로 수소, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴인 화합물이다. 또 다른 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 티아조비빈 이외의 것이다.
다른 구체예에서, 세포 생존율 및/또는 항분화성을 촉진하는 화합물은 하기 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00020
상기 화학식 III에서, 고리 D는 치환 또는 미치환된 아릴 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. L3은 -C(O)NH- 또는 -S(O)2NH-이다.
R20은 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. R21은 -NR22R23 또는 -OR24이다.
R22 및 R23은 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이거나, 또는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성한다.
R24는 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이거나, 또는 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬을 형성한다.
다른 구체예에서, L3은 결합, -O-, -C(O)NH- 또는 -S(O)2NH-이고, R20은 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이며, 고리 D 및 R21은 상기 정의한 바와 같다. 일부 다른 구체예에서, L3은 결합, -O- 또는 -S(O)2NH-이고, 고리 D, R20 및 R21은 상기 정의한 바와 같으며, 그에 따라 L3이 -S(O)2NH-일 때, R20은 수소이다. 또 다른 구체예에서, L3은 결합 또는 -O-이고, 고리 D, R20 및 R21은 상기 정의된 바와 같다.
일부 구체예에서, 고리 D는 치환 또는 미치환된 페닐이다.
다른 구체예에서, R20은 치환 또는 미치환된 알킬 또는 치환 또는 미치환된 사이클로알킬이다. R20은 치환 또는 미치환된 C1-C10 알킬 또는 치환 또는 미치환된 3∼7원 사이클로알킬일 수 있다. R20은 또한 치환 또는 미치환된 C1-C5 알킬 또는 치환 또는 미치환된 3∼6원 사이클로알킬일 수 있다. 일부 구체예에서, R20은 미치환된 C1-C5 알킬 또는 미치환된 3∼6원 사이클로알킬이다.
또 다른 구체예에서, R22는 수소이고, R23은 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다. 다르게, R22는 수소이고; R23은 치환 또는 미치환된 치환 또는 미치환된 아릴이다. 또는 R22 및 R23은 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성한다. R22 및 R23은 또한 함께 결합되어 치환 또는 미치환된 피롤릴, 치환 또는 미치환된 이소인돌리닐, 치환 또는 미치환된 피페리디닐, 또는 치환 또는 미치환된 테트라히드로퀴놀리닐을 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 IV의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00021
상기 화학식 IV에서, w는 0∼1의 정수이고, q는 0∼7의 정수이다. R20은 화학식 III의 화합물의 정의에서 상기 정의된 바와 같다. R25, R26, R27 및 R28은 독립적으로 -CN, -NR29R30, -C(O)R31, -NR32-C(O)R33, -NR34-C(O)-OR35, -C(O)NR36R37, -NR38S(O)2R39, -OR40, -S(O)2NR41, -S(O)vR42, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 치환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이고, v는 0∼2의 정수이다.
R29, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41, 및 R42는 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환된 알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로알킬, 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴이다.
R25 및 R26, 또는 R26 및 R27은 결합되어 환 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 미치환된 아릴, 또는 치환 또는 미치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, R28은 -OR40이다. R40은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬이다. R40은 또한 수소 또는 미치환된 C1-C5 알킬일 수 있다.
화합물은 또한 하기 화학식 V의 구조를 가질 수 있다:
Figure 112011050666155-pct00022
상기 화학식 V에서, R20, R28, 및 q는 화학식 VI의 정의에서 상기 정의된 바와 같다. 일부 구체예에서, R20은 미치환된 C1-C10 알킬이다. R28은 -OR40일 수 있다. R40은 수소 또는 미치환된 C1-C10 알킬, 또는 치환 또는 미치환된 C3-C6 사이클로알킬로 치환되는 C1-C10 알킬이다. 심볼 q는 1 일 수 있다.
다른 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 VI의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00023
상기 화학식 VI에서, R20, R28, 및 q는 화학식 IV 또는 화학식 VI의 정의에서 상기 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112011050666155-pct00024
Figure 112011050666155-pct00025
(종종 하이린테그린 또는 "Ptn"이라함)
Figure 112011050666155-pct00026
또는
Figure 112011050666155-pct00027
다른 구체예에서, 화학식 III의 화합물은 고리 D는 각각 1-5개의 R 기로 임의 치환되는, 아릴 또는 헤테로아릴이고; L3은 -C(O)NH- 또는 -S(O)2NH-이며; R20은 각각 1-5개의 R 기로 임의 치환되는, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이며; R21은 -NR22R23 또는 -OR24이고; R22 및 R23은 독립적으로 수소, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이거나, 또는 함께 결합되어, 각각 1-5개의 R 기로 임의 치환되는, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하고; R24는 각각 1-5개의 R 기로 임의 치환되는, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이며; 각각의 R 기는 독립적으로, C1 -10　알킬, C1 -10　헤테로알킬, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 각각의 R', R", R"' 및 R""는 독립적으로, 수소, C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 및 아릴알킬 기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물이다.
일부 구체예에서, 상기 화학식 I-VI의 화합물에서 상기 기술된 각각의 치환된 기는 1 이상의 치환기로 치환된다. 보다 구체적으로, 일부 구체예에서, 화학식 I-VI의 화합물에서 상기 기술된 각각의 치환된 알킬, 치환된 헤테로알킬, 치환된 사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 알킬렌, 및/또는 치환된 헤테로알킬렌은 1 이상의 치환기로 치환된다. 다른 구체예에서, 1 이상의 또는 모든 이러한 기들은 1 이상의 크기 제한된 치환 기로 치환된다. 다르게, 1 이상 또는 모든 이들 기는 1 이상의 저급 치환기로 치환된다.
화학식 I-VI의 화합물의 다른 구체예에서, 각각의 치환 또는 미치환된 알킬은 치환 또는 미치환된 C1-C20 알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬은 치환 또는 미치환된 2∼20원 헤테로알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 C3-C8 사이클로알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 3∼8원 헤테로사이클로알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 알킬렌은 치환 또는 미치환된 C1-C20 알킬렌, 및/또는 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬렌은 치환 또는 미치환된 2∼20원 헤테로알킬렌이다.
일부 구체예에서, 각각의 치환 또는 미치환된 알킬은 치환 또는 미치환된 C1-C8 알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬은 치환 또는 미치환된 2∼8원 헤테로알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 C5-C7 사이클로알킬, 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 미치환된 5∼7원 헤테로사이클로알킬, 및/또는 각각의 치환 또는 미치환된 알킬렌은 치환 또는 미치환된 C1-C8 알킬렌, 및/또는 각각의 치환 또는 미치환된 헤테로알킬렌은 치환 또는 미치환된 2∼8원 헤테로알킬렌이다.
일부 다른 구체예에서, 화학식 I-VI의 화합물은 C1 -10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴로 치환될 수 있고, 이때 각각의 R', R", R"' 및 R""은 수소, C1-10 알킬, C1 -10 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 아릴알킬 기이다.
III . 사용 방법
본 발명은 광범위한 목적에 유용하다. 예를 들어, 화합물은 세포가 그렇지 않으면 아폽토시스 또는 사멸되는 상황(예를 들어, 단리된 세포의 경우)에서 생존율을 촉진한다. 일부 구체예에서, 세포는 적어도 특정 기간, 예를 들어, 10분, 30분 또는 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 또는 96시간 동안 안정하다. 또한, 화합물은 세포가 그렇지 않으면 분화되거나 또는 아니면 그들의 프로그래밍을 변화시키는 조건에서 세포 분화의 현재 상태를 유지시키는데 유용하다. 이러한 효과들은 시험관 내 또는 생체 내에서 이러한 화합물에 대한 수많은 용도를 이끌어 낸다.
A. 생체내 용도
본 발명의 화합물은 조직 손상을 감소시키는데 유용하고 따라서 조직 손상을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 내부 장기에 대한 조직 손상을 갖거나, 또는 조직 손상의 위험성이 있는 개체에 투여된다. 내부 장기는, 이에 제한되는 것은 아니고, 뇌, 췌장, 간, 장, 폐, 신장, 또는 심장, 예를 들어, 화상이나 절개에 의한 상해를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 재관류후 허혈에서의 경색 크기를 감소시키는데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 졸중 위험성이 있거나, 졸중을 갖거나, 또는 졸중을 가진적이 있는 개체에 투여될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물은 심장 마비 또는 심장 손상을 가질 위험성이 있거나, 가지거나 또는 가진적이 있는 개체에 투여될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 화합물이 예를 들어, 상피 세포에서의 세포 사멸을 예방할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 matrigel 또는 라미닌으로 코팅된 조직 배양 평판 상에 단일 세포로서 플레이팅된 1차 인간 췌장 섬세포/베타 세포를 분산시켰다. Tzv가 없는 베타 세포용의 일반적인 세포 배양 배지에서는 실질적인 세포 사멸이 초래되었다. 그러나, Tzv를 배지에 부가시(1-2 mM), 세포 사멸이 억제되었다. 다른 상피 1차 세포, 예컨대 신경 세포에 대해서도 동일한 효과가 관찰되었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 췌장 베타 및/또는 섬 세포를 필요로하는 개체에게 투여되고, 이때 화합물의 투여는 개체에서 베타 세포 또는 섬 세포의 수를 증가시키는 결과를 일으킨다.
또한, 본 발명의 화합물(예를 들어, 화학식 I 또는 III의 화합물들)은 혈류를 증가시키고 염증성 반응을 억제하는데 효과적이다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 내피 세포의 단층에 걸쳐 단핵구의 이동성 및 부착성을 향상시키며, 그에 따라 염증성 반응을 줄일 수 있다(데이타는 도시하지 않음). 그에 따라, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 혈류 증가 및/또는 염증 감소를 필요로하는 개체(예를 들어, 뇌허혈증이 있음)에게 투여된다. 염증 감소를 필요로하는 개체는 염증성 질환을 갖거나 또는 염증성 병태에 의해 매개되는 질환을 갖는 개체를 포함한다. 예시적인 염증성 질환은 이에 제한되는 것은 아니고, 만성 폐쇄성 폐질환, 골관절염, 건염 또는 활액낭염, 통풍성 관절염, 근류마티스성 다발성근육통, 섬유근육통, 골반 염증성 질환 및 류마티스 관절염을 포함하는 관절염을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 암을 치료 또는 완화하는데 사용된다. 일부 경우에서, 본 발명의 화합물은 암, 예를 들어, 암종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 선암종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 및 버키트 림프종, 두경부암, 결장암, 직결장암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 식도암, 위암, 췌장암, 간담즙암, 담낭암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 자궁경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 췌장내분미암, 유암종 암, 골암, 피부암, 망막아종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(부가적인 암에 대해서는 [Cancer:Principles and Practice(DeVita, V.T. et al. eds 1997] 참조)을 치료하기 위해 투여된다.
암 세포 전이는 상피에서 중간엽 이행/EMT(예를 들어, 상피형 세포에서 섬유아세포형 세포로)을 포함하는 전형적인 프로세스이다. 본 발명자들은 본 발명의 화합물(즉, Tvz 및 Ptn)이 MET(EMT의 역)를 유도하고 EMT를 억제할 수 있음을 발견하였고, 이는 본 발명의 화합물이 암 전이를 감소 또는 예방하는데 효과적임을 의미한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 암 전이를 갖거나 또는 그러한 위험성이 있는 개체에게 투여된다. 예를 들어, 본 발명자들은 화학식 I 및 화학식 III의 화합물이 이에 제한되는 것은 아니고 유방암 및 간세포 암종을 포함한 상피암의 전이를 억제하는 것을 발견하였다.
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 고혈압 및/또는 아테롬성 동맥경화증을 갖거나, 또는 그러한 위험성이 있는 개체에게 투여된다.
화학식 I 및 III의 화합물(즉, Tvz 및 Ptn)은 손상된 중추 신경계에서 축삭 재생 및 기능 회복을 촉진하는데 효과적이다. 예를 들어, 본 발명자는 Tvz가 마우스에서 유래된 1차 신경 세포로부터의 신경돌기 성장을 촉진할 수 있음을 발견하였다. Tzv(3 μM)을 마우스 P1 대뇌피질 외식편에 대해 테스트하였는데, 결과 판독물로서 축삭이 성장하였다. Tzv를 플레이팅 후 20분에 배지에 부가하였고, DMSO를 대조군으로 사용하였다. 외식편은 배양 4일 동안 관찰하였다. Tzv는 1 div로부터 눈에 띄게, 축상 성장을 촉진하는데 상당한 효과를 보였다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 중추신경계 손상을 갖거나 또는 축삭 재생이 필요하거나 또는 아니면 축삭 재생으로부터 혜택을 받을 수 있는 개체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 당뇨병, 인슐린 내성을 갖거나, 아니면 베타 세포 생존율 촉진을 필요로하거나, 또는 베타 세포 기능 손상을 가질 위험성이 있는 개체에게 투여된다.
본 발명의 화합물은 또한, 장기, 세포 또는 조직 이식의 음성 증후군을 완화시키거나, 아니면 장기, 세포 또는 조직 이식을 개선시키는 사용될 수 있음을 발견하였다. 본원에 예시한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 세포의 맥락 프로그래밍을 안정화 및 유지하는데 효과적이다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 개체에 세포, 조직 또는 장기를 이식하는 동안 및 그 이후에 투여된다. 이식의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니고, 골수, 제대혈, 정제된 조혈 줄기/전구 세포, 심장 세포, 신장 세포, 췌장 베타 세포, 및 간 세포의 이식을 포함한다.
B. 시험관내 용도
본 발명의 화합물은 광범위한 조건에 노출된 세포를 안정화시키는데 효과적이다. 수많은 동물 세포들은, 단리시(현탁물 또는 다르게는, 부착시) 생존능 상실, 아폽토시스 및/또는 프로그래밍 변화(예를 들어, 단리시 줄기 세포는 흔히 사멸 또는 분화됨)를 겪는다. 본 발명의 화합물은, 이러한 세포와 혼합시, 환경 변화에 대한 이러한 세포 반응을 방지하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 세포는 동물로부터 단리되어 세포 생존능 상실 및/또는 세포 프로그래밍 변화를 방지하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물과 접촉된다. 일부 구체예에서, 이러한 단리 세포는 단리된 세포가 단리 절차 및 단리 자체에 대한 세포의 반응으로 인해 상실할 수 있는 표현형을 유지하는지에 대한 진단용으로 유용하다. 예시적인 보유 표현형은, 예를 들어 유전자 발현 패턴, 자극, 리간드 또는 약물에 대한 세포 반응, 세포 생존능을 포함할 수 있다.
세포 개체군의 안정성은, 예를 들어, 유전자 산물의 발현을 모니터링하여, 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 일정 유전자 산물은 조직 또는 세포 유형에 특이적이고 조건 또는 환경에서의 변화(예를 들어, 세포 배지 변화, 세포 해동, 다른 세포로부터의 세포 단리 등) 전과 후를 모니터링하여 이러한 변화가 세포 프로그래밍에 영향을 주는지에 대해 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, 조건 또는 환경 변화를 막 겪으려는 세포, 또는 변화 이후 비교적 금방(예를 들어, 상황에 따라, 1분, 5분, 1시간 이내 등)인 세포를 충분량의 본 발명의 화합물과 접촉시켜 1 이상의 세포 발현 마커가 실질적으로 동일하게 유지되도록 한다. "실질적으로 동일"은 문맥에 따라 달라지게 디고 당분야에서는 이해될 것이다. 일부 구체예에서, "실질적으로 동일"은 특이적 세포 유형과 연관된 유전자 산물의 발현이 세포에 대한 특정 처리 이후(예를 들어, 처리 전과의 발현과 비교하여) 약 10%, 20% 또는 30%를 넘게 변화하지 않음을 의미한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 생체외에서 줄기 세포의 생존율 및 항분화성을 촉진하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명자들은 화학식 I 또는 III의 화합물(즉, Tzv 및 Ptn)이 세포의 단리 직후 화학식 I 또는 III의 화합물과 이러한 세포를 접촉시키는 것을 통하여 인간 배아 줄기 세포, 마우스 배아 줄기 세포, 다중 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 기질 줄기 세포 및 상피 줄기 세포에서 생존율 및 항분화성을 촉진시키데 효과적임을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 세포를 안정화, 예를 들어 조건(예를 들어, 조직으로부터 단리, 세포 해동 등) 변화에 대한 세포 반응을 방지 또는 감소시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물(예를 들어, 화학식 I 또는 III의 화합물)과 접촉하는 조직 및/또는 세포의 개체군을 제공한다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 본 발명의 화합물과 접촉하는 세포 또는 조직은 냉동 또는 액체 상태로 존재한다. 일부 구체예에서, 세포/조직은 세포 손상 또는 분화를 방지 또는 감소하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물과 접촉하면서 냉동 상태로부터 해동된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포의 개체군과 접촉된다. 예시적인 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. 예시적인 줄기 세포는 또한 인간 배아 줄기 세포, 마우스 배아 줄기 세포, 다중 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 기질 줄기 세포, 및 상피 줄기 세포를 포함한다. 임의 유형의 전구 세포를 사용할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니고, 내배엽 전구 세포, 중배엽 전구 세포(예를 들어, 근육 전구 세포, 뼈 전구 세포, 혈액 전구 세포), 및 외배엽 전구 세포(예를 들어, 상피 조직 전구 세포 및 신경 전구 세포)가 포함된다. 알려진 다양한 분화 세포가 존재한다. 분화 세포는 이에 제한되는 것은 아니고, 섬유아세포, 심장 세포, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 간 세포, 상피 세포 및 장 세포를 포함한다. 본원에 기술한 세포는 인간 세포이거나 또는 인간 이외의 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 마우스, 개, 소, 돼지, 래트 또는 인간이외의 영장류 세포이다.
세포 생존능 및 세포 프로그래밍을 유지하는 능력은 개선된 약물 스크리닝법 및 진단법을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 1 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, 화학식 I 또는 III의 화합물)의 존재 하에서 반응에 대해 세포를 스크리닝하여, 세포의 생존을 유지시키고, 1 이상의 다수 성분(예를 들어, 화학 라이브러리)과 더욱 접촉시킨 후, 반응을 모니터링한다. 광범위한 스크리닝법이 공지이다. 이러한 방법은 스크리닝 방법의 조건에서 생존이 불충분할 수 있는 세포를 이용하는 경우(예를 들어, 단리된 세포, 현탁 세포, 부착성 세포 등을 이용하는 것이 편리한 경우) 특히 유용하다. 세포는 예를 들어, 본원에 기술한 바와 같이, 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포일 수 있다. 세포 반응은 바람직한 임의의 반응일 수 있다. 세포 기반 스크리닝 분석법에서의 일부 반응은, 이에 제한되는 것은 아니고, 유전자의 발현(예를 들어, 리포터 유전자의 발현을 기반으로 하거나 또는 PCR이나 다른 검출법에 의한 정량화), 세포 생존 또는 이의 상실, 아폽토시스 유도 등을 포함한다.
스크리닝법에 사용되는 제제는 예를 들어, 소형 유기 화합물(예를 들어, 분자량이 10,000 달톤 미만, 예를 들어 8000, 6000, 4000, 2000 달톤 미만), 지질, 당류, 폴리펩티드, 항체, 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 리보자임, 짧은 억제성 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 등)일 수 있다.
일부 구체예에서, 분석법은 통상 동시에 수행되는(예를 들어, 로보트 분석으로 마이크로타이터 포맷 또는 마이크로웰 평판에서), 분석 단계들을 자동화하고 임의의 편리한 공급원으로부터 분석에 화합물을 제공하는 것에 의해 대량의 조합 라이브러리를 스크리닝하도록 설계된다. 조합 라이브러리는 완전하게 무작위적이거나, 또는 1 이상의 유망한 선도 화합물을 기초로하는 코어 구조를 포함하는 구성원을 포함할 수 있다. 조합 라이브러리는 완전하게 합성되거나 또는 예를 들어 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 척추동물(예를 들어, 제노푸스(Xenopus)(개구리) 또는 안귈라(Anguilla)(장어)) 및 무척추동물(예를 들어, 스트론질로센트로투스(Strongylocentrotus)(성게) 또는 연체동물)을 포함하는, 천연 발생 공급원에서 유래되는 일부 또는 모든 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Boldi, Combinatorial Synthesis of Natural Product Based Libraries, 2006, CRC Press]를 참조한다.
일 구체예에서, 고수율 스크리닝법은 대량의 잠재적인 치료 화합물(잠재적인 조정인자 또는 리간드 화합물)을 포함하는 조합적 화학 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 "조합적 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"는 본원에 기술된 바와 같은, 1 이상의 분석법으로 스크리닝하여, 원하는 특징적 활성을 발현하는 라이브러리 구성원(특정 화학종 또는 하위부류)을 동정한다. 이렇게 동정된 화합물은 통상적인 "선도 화합물"로서 제공되거나 또는 그 자체가 잠재적이거나 또는 실제적인 치료제로서 사용될 수 있다.
조합적 화학 라이브러리는 다수의 화학적 "빌딩 블록" 예컨대 시약을 배합하여, 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학 화합물의 콜렉션이다. 예를 들어, 선형의 조합적 화학 라이브러리 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 소정의 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물에서 아미노산의 개수)에 대해 모든 가능한 방식으로 일련의 화학 빌딩 블록(아미노산) 세트를 조합하여 형성된다. 수백만개의 화학 화합물이 이러한 화학적 빌딩 블록의 조합적 혼합을 통해 합성될 수 있다.
조합적 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당분야의 숙련가에게 잘알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,663,046호; 제5,958,792호; 제6,185,506호; 제6,541,211호; 제6,721,665호를 참조하며, 이들 개시 내용을 참조하여 본원에 편입시킨다. 이러한 조합 화학 라이브러리는 이에 제한되는 것은 아니고, 펩티드 라이브러리를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,010,175호; Furka, Int . J. Pept . Prot . Res. 37:487-493(1991); Houghton, et 　 al., Nature 354:84-88(1991); and Combinatorial Peptide Library Protocols, Cabilly, ed., 1997, Humana Press). 화학적으로 다양한 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학법을 또한 사용할 수 있다. 이러한 화학법은, 이에 제한되는 것은 아니고, 펩토이드(예를 들어, PCT 공개 특허 WO 91/19735), 코팅된 펩티드(예를 들어, PCT 공개 특허 WO　93/20242), 무작위 생올리고머(예를 들어, PCT 공개 특허WO 92/00091), 벤조디아제핀(예를 들어, 미국 특허 제5,288,514호), 디버소머 예컨대 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs et al., Proc . Nat . Acad . Sci. USA 90:6909-6913(1993)), 비닐로거스 폴리펩티드(Hagihara et al, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)), 포도당 스캐폴딩을 이용한 비펩티드성 펩티드모방체(Hirschmann et al., J. Amer . Chem. Soc. 114:9217-9218(1992)), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성법(Chen et al., J. Amer . Chem . Soc. 116:2661(1994); Combinatorial Libraries : Synthesis , Screening and Application Potential, Cortese, ed., 1995, Walter De Gruyter Inc; and Obrecht and Villalgordo, Solid - Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small - Molecular - Weight Compound Libraries, 1998, Elsevier Science Ltd), 올리고카르바메이트(Cho et al., Science 261:1303(1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al., J. Org . Chem. 59:658(1994)), 핵산 라이브러리(see Ausubel, infra, Sambrook and Russell, infra 및 미국 특허 제6,955,879호; 제6,841,347호; 제6,830,890호; 제6,828,098호; 제6,573,098호; 및 제6,399,334호), 펩티드 핵산 라이브러리, 예를 들어, 미국 특허 제5,539,083호; 제5,864,010호 및 제6,756,199호), 항체 라이브러리(예를 들어, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996) 및 PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리(예를 들어, Liang et al., Science, 274:1520-1522(1996); 미국 특허 제5,593,853호; 및 Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries, Seeberger, ed., 2004, John Wiley & Sons(E-book)), 소형 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C&EN, January 18, page 33(1993) 및 미국 특허 제5,288,514호; 이소프레노이드, 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호 등). 예를 들어, 이하 문헌을 참조한다: Combinatorial Library Design and Evaluation : Principles, Software Tools , and Applications in Drug Discovery, Ghose, et al., eds., 2001, Marcel Dekker; Molecular Diversity and Combinatorial Chemistry : Libraries and Drug Discovery, Chaiken and Janda, eds., 1996, Oxford Univ Pr.; and Combinatorial Library Methods and Protocols, English, ed., 2002, Humana Press.
조합적 라이브러리를 제조하기 위한 디바이스는 시판된다(예를 들어, Advanced Chem Tech, Louisville KY., Symphony, Rainin, Woburn, MA., Applied Biosystems, Foster City, CA., Millipore, Bedford, MA and Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA 참조).
일부 구체예에서, 스크리닝 분석법은 다중웰 평판(예를 들어, 96-웰, 384-웰 등)에서 용이하게 수행할 수 있는데, 여기서 스크리닝되는 각각의 물질을 개별적으로 단일 웰에서 테스트한다. 일부 구체예에서, 2 이상의 후보 물질을 단일 반응 혼합물에서 테스트한다.
C. 유사 효과를 얻기위한 대안 표적
이하 실시예에 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명자는 본 발명의 화합물에 대한 세포 반응에 있어서 몇몇 유전자 산물의 역할에 관해 알 수 있었고 그에 따라 또한 세포가 이하 설명하는 바와 같이 그 유전자 산물의 유전자조작에 의해 안정화될 수 있음을 발견하였다.
1. E- 카데린
본 발명자들은 E-카데린의 발현 증가가 줄기 세포 생존율을 증강시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 세포에서 E-카데린의 발현을 안정화 및/또는 증가시켜서, 그렇지 않으면 세포의 생존에 치명적일 수 있는 조건 변화로부터 세포를 안정화시키는 방법을 제공한다. E-카데린의 안정화는, 예를 들어, 세포를, E-카데린의 발현을 증가시키거나 또는 어떻게든 단백질가수분해로부터 E-카데린을 보호하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 경우에 따라 다른 성분 예컨대 융합 단백질에 연결된, 적어도 E-카데린의 엑토도메인을 포함하는 단백질로 코팅된 표면을 갖는 용기에서 줄기 세포(이에 제한되는 것은 아니고 인간 또는 마우스 배아 줄기 세포를 포함함)를 배양하여, 세포를 안정화(예를 들어, 세포의 생존을 유지 또는 증가 및/또는 세포 프로그래밍을 유지)시키는 방법을 제공한다. 엑토도메인은 세포외 공간(세포 바깥 공간)으로 연장되는 막 단백질 부분이다. 일부 구체예에서, 엑토도메인은 신호 전달을 일으키는 표면과의 접촉을 개시하는 단백질의 일부이다. E-카데린의 엑토도메인은 예를 들어, 문헌 [Ito et al ., Oncogene 18(50):7080-90(1999)]에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 적어도 E-카데린의 엑토도메인은 이량체화 폴리펩티드 서열에 융합되어, 엑토도메인의 안정화된 이량체를 가능하게 한다. "이량체화 폴리펩티드"는 동종 이량체를 형성하여, 2 폴리펩티드가 이량체화되도록 하는 아미노산 서열을 의미한다. 예시적인 이량체화 폴리펩티드는 이에 제한되는 것은 아니고, IgG Fc 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 줄기 세포(이에 제한되는 것은 아니고, 인간 또는 마우스 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS 세포 포함)가 상호 해리되어, 경우에 따라 다른 성분 예컨대 융합 단백질에 연결된, 적어도 E-카데린의 엑토도메인을 포함하는 단백질로 코팅된 표면을 갖는 용기에서 배양시켜서, 폴리펩티드 코팅이 없는 용기에서 배양시킨 유사 처리된 세포의 생존율과 비교하여 세포의 생존율을 개선시켜 세포를 안정화시킨다.
2. 단백질 키나제 C
본 발명은 세포를 단백질 키나제 C 활성인자와 접촉시켜 세포를 안정화시키기 위해 제공된다. 본원에서 설명하는 바와 같이, matrigel 매트릭스의 존재 하에 성장시킨 단백질 키나제 C 활성인자로 해리된 hESC를 처리한 결과 세포 부착성 및 콜로니 형성이 유의하게 개선되어, 세포 생존능이 향상되었다. 따라서, 본 발명은 단백질 키나제 C 활성인자의 존재하에 세포를 배양시켜, 세포 생존, 성장 및/또는 부착을 개선시켜 생포 생존능을 개선시키기 위해 제공된다. 일부 구체예에서, 단백질 키나제 C 활성인자를 세포 생존능 및/또는 생존력 및/또는 부착성을 개선시키기에 충분한 양으로 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포의 개체군에 접촉시킨다. 예시적인 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포(iPS 세포) 또는 본원에 달리 기술된 바와 같은 것을 포함한다. 예시적인 단백질 키나제 C 활성인자는 이에 제한되는 것은 아니고, 포볼 에스테르(예를 들어, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 또는 미국 공개 특허 출원 제20080226589호에 기술된 바와 같은 포볼 에스테르) 또는 펩티드 작용제(예를 들어, 미국 특허 제6,165,977호에 기술된 바와 같음)를 포함한다.
3. 인테그린 β1
본 발명은 또한 세포를 인테그린 β1 활성인자와 접촉시켜 세포를 안정화시키기 위해 제공된다. 본원에 설명되는 바와 같이, 세포를 라민에서 성장시키고, 해리된 hESC를 인테그린 β1 활성인자로 처리하는 것은, 세포 부착 및 콜로니 형성을 유의하게 개선시켰고, 그에 따라 세포 생존능이 개선되었다. 따라서, 본 발명은 인테그린 β1 활성인자의 존재 하에 세포를 배양하여, 세포 생존능, 성장 및/또는 부착을 개선시켜 세포 생존능을 개선시키기 위해 제공된다. 일부 구체예에서, 인테그린 β1 활성인자를 세포 생존능 및/또는 생존율 및/또는 부착성을 개선시키기에 충분한 양으로 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포의 개체군과 접촉시킨다. 예시적인 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포(iPS 세포) 또는 본원에서 달리 기술한 바와 같은 것을 포함한다. 예시적인 인테그린 β1 활성인자는, 이에 제한되는 것은 아니고 인테그린 β1 활성화 항체, 예컨대 TS2/16(예를 들어, Thermo Scientific, Rockfield, Ill.에서 시판됨)를 포함한다.
IV . 세포 개체군
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 1 이상의 화합물(예를 들어, 화학식 I 또는 III의 화합물- 이에 제한되는 것은 아니고, Tzv 및 Pt 포함 - 또는 단백질 키나제 C 활성인자 또는 인테그린 β1 활성인자)과의 혼합물 상태의 세포(예를 들어, 세포 배양물)를 제공한다. 일부 구체예에서, 화합물은 세포 환경 또는 조건(예를 들어, 해동)의 변화에 반응하여 생존능 또는 세포 프로그래밍을 유지하기에 충분한 농도의 혼합물로 존재한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 화합물은 0.1 nM 이상, 예를 들어 적어도 1, 10, 100, 1000, 10000, 또는 100000 nM, 예를 들어, 0.1 nM∼100000 nM, 예를 들어, 1 nM 내지 10000 nM, 예를 들어, 10 nM∼10000 nM, 예를 들어, 1-10 μM의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 이 혼합물은 합성 용기(예를 들어, 테스트 튜브, 페트리디쉬 등)에 존재한다. 따라서, 일부 구체예에서, 세포는 단리된 세포이다(동물의 일부가 아님). 일부 구체예에서, 세포는 부착성이거나 또는 현탁 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 동물(인간 또는 인간 이외) 유래의 조직 샘플(예를 들어, 생검)에서 단리되거나 또는 해리되어, 용기에 놓여지고, 본원에 기술된 1 이상의 화합물(예를 들어, 화학식 I 또는 III의 화합물)과 접촉된다. 이후 세포를 배양하고, 경우에 따라 세포를 특정 세포 유형 또는 계통으로 분화되도록 자극시킨 이후에, 또는 재조합 발현 카세트를 세포에 도입시킨 이후에, 경우에 따라 동일 또는 다른 동물에 다시 삽입시킬 수 있다.
V. 세포의 배양
세포는 당분야에 알려진 임의의 방법에 따라 배양할 수 있다. 세포는 적절하다면 부착성 세포로서 또는 현탁물로서 배양시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 세포(예를 들어, 줄기 세포)는 영양공급 세포와 접촉시켜 배양된다. 예시적인 영양공급 세포는, 이에 제한되는 것은 아니고, 섬유아세포 세포, 예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포를 포함한다. 영양공급 세포 상에서 세포를 배양하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 세포는 영양공급 세포 없이 배양된다. 예를 들어, 세포는 분자 테더(tether)를 통해, 예를 들어 고체 배양 표면(예를 들어, 배양 평판)에 직접 부착될 수 있다. 예시적인 분자 테더는 이에 제한되는 것은 아니고, matrigel, 세포외 매트릭스(ECM), ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴 또는 콜라겐을 포함한다. 그러나, 당분야의 숙련가는 이것이 비제한적인 목록이며 다른 분자를 사용하여 세포를 고체 표면에 부착시킬 수 있다는 것을 인식한다. 고체 표면에 테더의 초기 부착을 위한 방법은 당분야에서 공지이다.
VI . 조제물 및 투여 방법
투여에 적절한 조제물(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 화합물 포함)은 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액으로서, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 조제물이 등장성이게 하는 용질을 함유할 수 있는 것들, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에서, 조성물은 예를 들어, 경구, 비내, 국소, 정맥내, 복강내 또는 경막내 투여될 수 있다. 화합물의 조제물은 단위 용량 또는 복수 용량 밀봉된 용기, 예컨대 앰풀 및 바이알로 존재할 수 있다. 용액 및 현탁액은 앞서 기술한 바와 같은 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 조절인자를 또한 준비된 음식 또는 약물의 일부로서 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 환자에 투여되는 용량은 시간 경과에 따라 피험체에서 이로운 반응을 유도하기에 충분해야한다. 임의의 환자에 최적인 용량 수준은 적용되는 특정 조절인자의 효능, 환자의 연령, 체중, 신체 활성 및 식이를 포함하는 다양한 요인들, 다른 약물과의 가능한 조합, 및 대상 질환 또는 병태의 중증도에 따라 좌우된다. 용량 크기는 또한 특정 피험체에서 특정 화합물 또는 벡터의 투여로 수반되는 임의의 불리한 부작용의 존재, 성질 및 그 수준에 의해 결정될 수 있다.
투여되는 활성 성분의 유효량을 결정시, 의사가 화합물 또는 제제의 순환 혈장 농도, 화합물 또는 제제 독성, 및 항화합물 또는 제제 항체의 생성을 평가하게 된다. 대체로, 화합물 또는 제제의 용량 당량은 전형적인 피험체에 대해 약 1 ng/kg∼10 mg/kg이다.
VII . 실시예
이하 실시예는 단지 예시를 위해 제공되는 것이며, 청구되는 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1:
화학적으로 규명된 배지 조건을 개선하고 단일 세포 해리 이후 hESC 사멸의 분자 기전을 밝히기 위해, 본 발명자는 50,000 합성 화합물에 대한 고수율 표현형 스크리닝을 수행하여 트립신 해리 후 hESC 생존율을 촉진시키는 소형 분자를 동정하였다. 스크리닝을 통해, 해리 이후 세포 생존율을 유의하게 증가시키고 또한 hESC 콜로니 형태 및 알칼리 포스파타제(ALP) 발현을 유지시키는 2가지 화학적 부류가 동정되었다. 추가적인 화학적 최적화 및 활성 분석 결과 2가지 선도 분자, 2,4-이중치환된 티아졸(티아조비빈/Tzv이라함) 및 2,4-이중치환된 피리미딘(파이린테그린/Ptn)(도 1a)를 얻었고, 후속적으로 기능 및 기전을 특징규명하였다.
Figure 112011050666155-pct00028
Figure 112011050666155-pct00029
Figure 112011050666155-pct00030
화합물 Tzv 또는 Ptn는 효소 해리 이후 Matrigel-코팅된 평판 상에서 20배 보다 높게 단일 hESC의 생존율을 증강시킨다(도 1b, c). hESC는 20 세대가 넘는 동안 Tzv 또는 Ptn-함유 화학적 규명 배지에서 연속 계대하였다. 이런 조건 하에서, 세포는 균질하게, hESC의 특징적인 형상, 전형적인 다능성 마커, 및 정상적인 핵성을 유지하였다(도 1d, e). 이들 세포를 누드 마우스에 주사했을 때, 이들은 모든 3종의 1차 배엽층 조직으로 구성되는 복합 기형종을 생성하였다(도 1f). 이러한 결과들은, 몇몇 독립적인 hESC 세포주로 확증되었고, 종합적으로 확실하게 2 화합물이 자가 재생성 및 완전한 발생 잠재력을 손상시키지 않고 hESC 생존을 실질적으로 촉진할 수 있음을 증명해 주었다.
hESC는 대규모의 세포 사멸로 인해 단일 세포 해리 이후 현탁 배양시에 배상체(EB) 형성이 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 또한 Tzv 또는 Ptn이 현탁물로 해리된 hESC의 생존율을 촉진할 수 있는지 여부를 검사하였다. 흥미롭게도, Tzv는 부착 및 현탁 배양 둘 모두에서 hESC의 생존율을 상당히 개선시켰다. 대조적으로, Ptn은 부착 배양(예를 들어, Matrigel-코팅된 평판)에서의 hESC의 생존율만을 촉진하였고, 현탁 배양에는 어떠한 효과도 없었다(도 2a). 이러한 관찰 결과들은 ECM/Matrigel 또는 현탁 조건 하에서 이들 2 유형의 세포 사멸에 2 이상의 상이한 기전이 관여하고, Tzv와 Ptn은 상이하게 기능한다는 것을 시사한다. hESC는 Tzv 존재하에서 현탁물로 성장시 적당한 세포 응집체를 형성하였고(도 2b), 다양한 계통으로 분화될 수 있었다(데이타는 도시하지 않음). 세포 응집은 가장 빈번하게 세포-세포 부착을 통해 매개되고 E-카데린이 1차적인 세포-세포 부착 분자이며, 또한 hESC에서 고도로 발현되므로(Eastham, A.M. et al., Cancer Res 67(23):11254-11262(2007)), 본 발명자들은 복수세포 응집체 형성에 대한 특이적 E-카데린 차단 항체의 효과를 검사하였다. 세포를 이러한 항체 존재 하에 배양시, Tzv 처리에 의해 유도된 거대하고, 조밀한 응집체의 형성 및 세포 생존이 심각하게 억제되었으며, 이는 Tzv에 의해 유도된 복수세포 응집체의 어셈블리 및 세포 생존에 기능성 E-카데린이 관여함을 시사한다(도 2b). 또한, hESC에서 특이적 siRNA에 의한 E-카데린의 넉다운은 Tzv 처리에 의해 유도된 세포 생존을 감소시켰고, ALP 양성 콜로니의 수를 상당히 감소시켰다(도 2c,d,e). 이들 결과는 Tzv가 현탁 배양에서 hESC 생존율을 증강시키는데, 아마도 E-카데린-매개 세포-세포 부착을 통해 작용할 수 있음을 의미한다.
다음으로, 본 발명자들은 트립신 해리 이후 hESC에서 E-카데린 발현을 조사하였다. 본 발명자는 대부분의 전체 길이 E-카데린이 트립신 해리 이후에 절단됨을 확인하였다(도 2f). 이러한 관찰결과는 E-카데린의 세포외 영역이 경막 도메인 근처에 내단백질가수분해(endoproteolysis) 절단 부위를 갖는다는 보고와 일관적이었다(Damsky, C.H. et al., Cell 34(2):455-466(1983)). Tzv-미처리 세포에서, 새롭게 합성되는 전체길이 E-카데린은 효소 처리 이후 1 시간 경에 나타나서 4시간 후에 사라졌으며, 이러한 결과는 해리된 hESC에서 새롭게 합성되는 E-카데린이 안정하지 않음을 시사하는 것이다. 그러나, Tzv-처리 세포에서, E-카데린 발현은 유의하게 증가하였다(도 2g). 뿐만 아니라, 유세포 분석법은 hESC에서 세포 표면 E-카데린이 Tzv에 의해 유의하게 증가한다는 것을 밝혀주었다(도 2h). 따라서, Tzv는 E-카데린의 세포 표면 수준을 조정하여 세포 부착에 영향을 주는 듯 하다. 반정량화 RT-PCR은 모의 대조군 및 Tzv-처리 세포에서 E-카데린 전사체가 비슷한 양인 것을 밝혀주었고(도 2i), 이러한 결과는 E-카데린 단백질 수준의 차이가 전사 수준 변화에 의한 것이 아님을 시사한다. Tzv는 세포 표면 상의 E-카데린의 안정화를 통해서 그 효과를 발휘하는 듯 하다. 마지막으로, 세포내 이입 분석은 E-카데린의 내재화가 Tzv에 의해 유의하게 차단됨을 밝혀주었다. 이러한 결과들은 Tzv는 E-카데린의 세포내이입 억제를 통해 E-카데린 활성을 조절함을 의미한다(도 2j).
트립신에 의한 세포-세포 해리는 E-카데린의 신속한 절단과 후속 탈안정화를 초래한다. 본 발명자들은 E-카데린 안정성은 이의 세포간 동종친화성-상호작용에 의해 매개될 수도 있다고 가정하였다. 따라서, 재조합 리간드와 E-카데린의 동종친화성 결찰이 E-카데린을 안정화시키고 hESC 생존율에 영향을 줄 수 있다. 이러한 가정을 시험하기 위해, 본 발명자는 IgG Fc 단편에 융합된 E-카데린 엑토도메인을 함유하는 이량체 E-카데린-Fc 키메라 단백질(Ecad-Fc)로 평판을 코팅하였다. 현저하게, 해리된 hESC는 코팅 표면에 부착하였고 이들의 생존율은 용량 의존적 방식으로 유의하게 증가하여(도 2k), E-카데린에 의해 매개되는 세포-세포 부착이 hESC 생존을 위해 중요한 조절인자임이 검증되었다.
Tzv 및 Ptn 둘 모두는 Matrigel-코팅된 평판 상에서 성장한 hESC의 생존에 극적인 영향을 미친다. 이러한 생존 촉진 효과는 세포 성장에 대한 영향에 의한 것은 아닌 듯하며, 대체로 세포 해리와 접종 과정 이후 세포 부착능의 증가에 기인하는 것인 듯 하다(도 3a,b). 또한, Tzv 또는 Ptn으로 처리된 해리된 hESC는 Matrigel 또는 라미닌에 대한 부착성이 상당히 증가한 것으로 나타났다. 대조적으로, 인테그린이 관여하지 않는, 젤라틴 또는 폴리-리신(도 3b, 및 데이타 도시하지 않음)에 대한 hESC의 부착은 Ptn 또는 Tzv 처리에 의해 영향받지 않았다. Matrigel의 주요 성분은 라미닌이고, 라미닌 수용체 β1 인테그린이 hESC에서 고도로 발현된다는 것이 보고된 바 있다(Xu, C. et al., Nat Biotechnol 19(10):971-974(2001)). Ptn 또는 Tzv가 β1 인테그린을 통해 작용하는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 세포를 β1 인테그린에 대한 차단 항체로 사전처리하고, 화합물 처리에 의해 유도된 세포 부착 증가가 완전하게 없어지는지 관찰하였다. 이 결과는 Tzv 및 Ptn이 β1 인테그린을 통해 ECM 기질에 대한 세포 부착을 매개함을 시사한다(도 3c).
Tzv 및 Ptn에 의한 β1 인테그린 조절 기전에 대한 이해를 위해, 본 발명자들은 화합물의 효과가 인테그린 발현 변화에 의한 것인지 여부를 조사하였다. E-카데린과 대조적으로, β1 인테그린은 트립신에 의해 절단되지 않았다. 웨스턴 블랏 분석은 화합물의 효과가 β1 인테그린의 발현 증가에 기인한 것이 아님을 밝혀주었다. 따라서, Tzv 및 Ptn은 인테그린 활성을 조정하여 세포 부착에 영향을 주는 듯 하다(도 3d,e). β1 인테그린의 활성에 대한 화합물 처리 효과를 조사하기 위해, 본 발명자는 β1 인테그린의 활성형에 특이적으로 결합하는, 단일클론 항체 HUTS-21를 사용하였다(Luque, A. et al., J Biol Chem 271(19):11067-11075(1996)). 주목할만하게, 화합물 처리는 HUTS-21 결합 수준을 증가시켰다(도 3f,g). 이러한 결과들은 총체적으로, Tzv 및 Ptn이 인테그린 활성의 인사이드-아웃(inside-out) 조정에 의해 세포 부착을 증가시킴을 시사한다.
이들 2 화학물이 인테그린을 활성 형태로 전환시키는 것에 의해 세포 부착을 증강시켰다면, 활성 형태로 인테그린을 고정시키는, 인테그린-활성화 항체를 이용한 세포 처리는 화합물과 유사한 효과를 보여야만 한다. 실제로, 해리된 hESC를 TS2/16, β1 인테그린에 대한 활성화 항체(van de Wiel-van Kemenade, E. et al., J Cell Biol 117(2):461-470(1992)) 존재 하에 라미닌 상에 플레이팅할 경우, 세포 부착이 유의하게 증가되었고 세포는 대조군에 비해 증가된 수의 콜로니를 형성시켰다(도 3h,i). 이들 결과는 세포를 상기 화합물들로 처리시 일어나는, 부착 증가는 인테그린 활성화를 유도시키는 기전을 포함함을 시사한다.
Tzv 및 Ptn가 인테그린 활성을 조절하는 분자 기전을 더욱 상세 분석하기 위해, 본 발명자들은 몇몇 경로 억제제들의 효과를 조사하였다. 본 발명자는 PKC의 특이적 억제제인, 비스인돌릴말레이미드 I이 Ptn에 의해 유도되는 세포 부착 증가를 길항할 수 있지만, Tzv에 의해 유도된 세포 부착에 대해서는 영향이 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 PKC가 Ptn의 작용을 매개하지만 Tzv의 작용을 매개하지 않을 수 있음을 시사한다(도 3j). hESC 생존에 대한 PKC의 역할을 더욱 검증하기 위해, 해리된 hESC를 PKC 작용제 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리하였다. PMA 처리는 인테그린 활성화를 야기시킬 뿐만 아니라, 세포 부착 및 콜로니 형성을 실질적으로 증가시켰다(도 3k,l,m).
줄기 세포 운명은 성장 인자, 세포-ECM 상호작용, 및 세포-세포 상호작용으로 구성되는, 그 세포의 니체에 의해 영향받는다. hESC 생존이 세포-세포 상호작용 및/또는 세포-ECM 상호작용에 고도로 의존적이라는 사실은, hESC에 대해 이전에 미인식된 시험관 내 니체의 중요성을 확인시켜 주었다. 보다 중요하게, 세포의 고유한 단백질 발현(예를 들어, E-카데린 및 인테그린) 및 조절 기전(예를 들어, 단백질 안정화 및 활성화)은 필수 니체 성분들일뿐만 아니라, 또한 그에 반응하여, 이러한 결과는 세포의 자가조절 니체 기전에 참여하고 이를 향상시킬 수 있는, 다른 외적 인자 또는 세포 유형의 부재 시에 그들 자신의 니체를 구성할 수 있는 고유한 능력을 보유함을 시사한다.
물리적/구조적 환경 및 성장 인자간 상호작용은 세포 운명 조절에서 매우 중요한 역할을 한다(Comoglio, P.M., Boccaccio, C., & Trusolino, L., Curr Opin Cell Biol 15(5):565-571(2003)). 성장 인자가 인테그린-매개 hESC 생존율에 관여하는지 조사하기 위해, 본 발명자는 해리된 hESC를 개별적인 고도로 특이적인 성장 인자 수용체 억제제와 함께 Tzv 또는 Ptn로 처리하였다. 본 발명자는 FGFR, IGFR, EGFR1 또는 Erb2의 화학적 억제가 Tzv 또는 Ptn 처리에 의해 유도된 생존 촉진 효과가 상당히 감소시킴을 확인하였다(도 4a). 또한, Ptn는 성장 인자 수용체의 인산화를 유의하게 증가시켰고, 이는 성장 인자 수용체의 관여가 인테그린-매개 세포 생존에 필요하다는 것을 의미한다(도 4b). 유사하게, FGFR, IGFR, EGFR1 또는 Erb2의 억제는 또한 현탁 배양에서 Tzv-유도된 hESC 생존을 상당히 없애주었다. 또한, Tzv는 EGFR1 및 ERB2에 대한 E-카데린의 결합을 유도시켰고, 이러한 결과는 E-카데린 매개 세포 생존에 있어 성장 인자 수용체의 역할이 중요함을 시사한다(도 4c, d).
포스파티딜이노시톨-3-키나제(PI-3K) 신호전달 및 MAPK/ERK는 hESC 자가 재생을 위한 주요 조절인자이다(Armstrong, L. et al., Hum Mol Genet 15(11):1894-1913(2006); Paling, N.R. et al., J Biol Chem 279(46):48063-48070(2004); Pyle, A.D., Lock, L.F., & Donovan, P.J., Nat Biotechnol 24(3):344-350(2006); Li, J. et al., Differentiation 75(4):299-307(2007)). PI-3의 하류 이펙터인, EKR 및 AKT의 인산화는 해리된 hESC를 Ptn으로 처리시에 증가하였고, 이러한 증가는 인테그린 차단 항체에 의해 없어졌다(도 4e, f). 또한, Ptn에 의한 AKT 및 ERK의 활성화는 FGFR, IGFR, EGFR 또는 Erb2의 억제제에 의해 차단되었다(도 4g 및 데이타를 도시하지 않음). PI-3K 작용의 화학적 억제는 Ptn에 의해 유도된 생존 효과를 유의하게 길항시켰다(도 4h). ERK의 억제는 Ptn에 의해 유도된 생존에 극적인 효과를 보이지 않았지만, hESC 분화를 유도시켰다(도 4i). 이러한 결과들은 PI-3K의 활성화가 주요한 생존 신호전달이고, ERK의 활성화는 성장 인자 수용체의 활성화를 통하여 니체에 의해 생성되는 항분화 신호전달임을 보여주는 것이다.
요약하면, 본 발명자는 고수율 표현형 스크리닝을 통해서, 단일 세포 해리 이후 hESC 생존율을 상당히 증강시키는, 고유한 작용 기전을 갖는 신규한 2종의 합성 소형 분자를 동정하였다. 기전 특징 규명을 통한 이러한 화학적 도구 및 새롭게 동정된 생물학적 도구(예를 들어, 부착 배양에서 hESC 부착에 대한 규정된 재조합 Ecad-Fc; 증강된 세포 생존 및 부착에 대한 활성화 항체)는 보다 강건한 hESC 배양을 가능하게 하고 유전자 표적화 또는 약물 개발 등과 같은 hESC의 응용을 상당히 용이하게 한다. 보다 중요하게, 심도있는 기전 특징규명은 hESC 생존과 증식을 지속시키는데 요구되는 이전에 미인식되었던 니체 기전을 밝혀주었다. 이러한 니체는 hESC 자체간의 E-카데린 매개 상호작용, 인테그린 매개 세포-ECM 상호작용, 및 성장 인자로 구성된다. 초기 연구들은 hESC 자가 재생에 대한 성장 인자들의 역할 중요성을 지적하였다. 그러나, 성장 인자 신호전달의 전체 활성화는 성장 인자와 수용체의 존재뿐만 아니라 특정 미세 환경과의 상호작용도 필요로 한다. 이러한 물리/구조적 환경이 파괴되면, 성장 인자 단독으로는 ESC의 자가 재생에 충분치 않다.
최근에, 자가 재생 배양되는 hESC로부터 만들어진 분화된 섬유아세포가 hESC를 위한 시험관 내 니체를 생성한다는 보고가 있었다(Bendall, S.C. et al., Nature 448(7157):1015-1021(2007)). 우리와 다른 화학적 규명 배지 조건 하에서, 본 발명자는 장기 배양 동안 이러한 분화 세포를 매우 드물게 관찰되었기 때문에, 이러한 인공적인 니체는 배지 차이로 인해 생성되는 것으로 여겨진다. 그럼에도, 우리의 연구들은 생체 내에서 성체 줄기 세포 운명을 제어하는데 중요한 역할을 할 수 있는, hESC 생존율 및 자가 재생성에 대한 고유한 세포-자율성(즉, 세포-세포 상호작용) 및 비세포-자율성(즉, 세포-ECM 및 세포-성장 인자) 니체 기전을 밝혀주었다.
트립신에 의한 세포-세포 해리는 E-카데린의 탈안정화뿐만 아니라 인테그린의 불활성화를 초래하여, 인테그린 활성을 유지하는 신호전달이 효소 처리에 감응성임을 시사한다. 영양공급 세포-조건화 배지(성장 인자 풍부 혈청 포함)는 단일 세포 해리 이후 세포 사멸에 대해 충분한 보호성을 제공하지 않았다. 또한, 고밀도 세포 접종이 또한 세포 부착/생존율 증가를 유도한다는 사실은 인테그린 활성을 유지하는데 필요한 신호전달이 분비성 인자로부터 일어나는 것이 아니라, 대신 물리적 세포-세포 상호작용으로부터 일어남을 시사한다. Tzv는 E-카데린의 세포내이입을 억제하므로, 세포를 현탁시 사멸로부터 보호한다. 유사하게, 세포내이입을 억제하여, Tzv는 세포 표면으로부터의 안정화 신호전달을 통해 인테그린 활성을 유지할 수 있다. 한편, Ptn은 PKC를 활성화시키기 위해 물리적 세포-세포 상호작용으로부터의 하류 신호전달을 모방할 수 있다. Ptn의 향후 표적 동정은, 세포-세포 부착이 세포-ECM 상호작용을 조절하는 기전에 대한 새로운 실마리를 제공해 줄 수 있을 것이다. 우리의 연구는 또한 줄기 세포 연구에 있어서 고수율 화학적 스크리닝의 진보 및 실행가능성을 예시하였다. 줄기 세포에서의 이러한 화학적 접근법의 후속 개발 및 응용은, 의심할 여지없이, 시험관 내 및 생체 내에서 세포 운명을 정밀하게 제어하기 위한 부가적인 새로운 소형 분자의 동정과 기전 이해를 이끌게 될 것이다.
방법
세포 배양
인간 ESC 세포주 H1, HUES7 및 HUES9는 2 mM L-글루타민, 1x 불필수 아미노산, 20% 혈청 대체물(Invitrogen) 및 10 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(Invitrogen)가 보충된 DMEM-F12 중에, 조사된 MEF 영양공급 세포 상에서 배양하였다. 화학적으로 규정되고, 영양공급 세포가 없는 hESC 배양은 이전에 기술되어 있었다(Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(18):6907-6912(2006)). 간략하게, hESC는 N2B27-CDM(1x N2 보충물, 1x B27 보충물, 2 mM L-글루타민, 0.11 mM 2-머캅토에탄올, 1x 불필수 아미노산, 및 0.5 mg/mL BSA(분획 V)가 보충된 DMEM-F12) 및 20 ng/mL bFGF 중에 Matrigel-코팅된 조직 배양 평판 상에서 성장시켰다. 인간 ESC는 0.05% 트립신을 이용해 5-6일마다 계대하였다.
클론 생존 분석을 위해, 단일 hESC를 클론 밀도로 희석하고 96웰 Matrigel-코팅 평판에 플레이팅하였다. 저밀도 생존 분석을 위해, 500 세포를 96웰 Matrigel-코팅 평판에 플레이팅하였다. hESC 콜로니를 가시화하기 위해, 배양물을 5분간 PBS 중 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 1회 PBS로 세척한 후, 제조사의 설명서에 기술된 바와 같이 알칼리 포스파타제 활성을 위해 염색하였다. ALP 양성 콜로니를 도립 현미경 상에서 계측하였다.
시약
ALP 검출 키트 및 인테그린 항체는 Chemicon에서 구매하였다. AG825(Erb2 억제제), AG1478(EGFR 억제제), PPP(IGFR1 억제제)는 Calbiochem에서 구매하였다. E-카데린의 세포질내 꼬리부에 대해 생성시킨 항체(Transduction Laboratories, Lexington, KY)를 면역침강용으로 사용하였다. 항체 TS2/16은 Pierce에서 구매하였다. E-카데린 분자의 세포외 도메인에 대한 항체는 Zymed(Carlsbad)에서 구매하였다. 세포외 신호-조절 키나제/MAPK, EGFR1, ERB2, GADPH, 및 AKT의 인산화형태에 대한 항체는 Cell Signaling에서 구매하였다. 마우스 단일클론 항-포스포티로신(4G-10 클론)은 Upstate Biotechnology에서 구매하였다. Ptn 및 Tzv는 2 μM로 배양 배지에 부가하였다.
고수율 화학적 스크린
트립신처리가능한(trypsinable) hESC 세포주 HUES7 또는 HUES9를 스크리닝용으로 사용하였다. hESC는 상기 기술한 바와 같이 Matrigel-코팅된 평판 상에 화학적으로 규명된 배지에서 배양하였다. 다음으로, 세포를 트립신을 통해 회수하였다. hESC를 Matrigel-코팅된 384웰 평판 상에 웰당 4,000 세포로 플레이팅하였다. 세포가 정착되고 1시간 후, 50,000개의 개별적인 복소환 라이브러리로부터의 화합물을 각 웰에 부가하였다(2 μM 최종 농도). 3일경에 배지와 화합물을 변경시켜주고, 부가적인 6일의 항온반응 이후, 세포를 ALP 발현에 대해 염색시키고 조밀한 콜로니 형태를 조사하였다.
면역염색 분석
면역염색은 이전에 기술된 대로 수행하였다(Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(18):6907-6912(2006)). 간략하게, 세포를 15분간 실온(Rt)에서 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 다음으로, 세포를 1 시간 동안 차단 완충액 중에 RT에서 항온반응시켰다. 1차 항체 항온반응은 밤새 4℃에서 수행하였다. 이하의 시판 항체를 차단 완충액중에서 1:100의 농도로 사용하였다: 항-SSEA4, 항-Oct4(Chemicon??) 항-Nanog(Chemicon). FITC, cy3 또는 cy5(Jackson ImmunoResearch)에 접합된 2차 항체를 이용해 염색을 가시화하였다.
기형종 형성 및 핵형분석
기형종 형성 실험은 누드 마우스의 신장 피막 하에 3-5백만 hESC(화합물 Tvz 또는 Ptn 존재 하에 유지됨)를 주사하여 수행하였다. 4-5주 이후, 모든 마우스는 기형종이 발생되었고, 이를 제거분리한 후 The Scripps Research Institute Research Histology Service and Animal Resources를 통해 면역조직분석하였다. 화합물 처리된 세포는 Children's Hospital Oakland, Cytogenetics Laboratory에서 표준 G-밴딩을 통해 핵형분석되었다. 10종의 무작위 선택된 핵에서 어떠한 염색체 이상도 발견되지 않았다.
TUNEL 분석
상이하게 처리된 hESC를 트립신으로 해리하고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그리고 염색은 제조사의 설명서(MBL Laboratories, Watertown, MA)에 따라 수행하였다. 염색 후, 샘플은 FACS 칼리버 유세포측정기(BD)를 이용해 유세포분석법으로 분석하였다.
유세포분석
E-카데린, 활성화된 인테그린 및 SSEA4의 발현을 평가하기 위해, 해리된 세포(3x105)를 PBS로 세척하고 2% 염소 혈청이 함유된 PBS에 재현탁하였다. 다음으로, 세포를 적절한 항체로 1시간 동안 4℃에서 항온반응시켰고, 차단액으로 세척한 후, FITC-접합된 2차 항체로 30분간 4℃에서 표지화시켰다. 이어 세포를 세척하고 FACS 칼리버 유세포측정기에서 분석하였다.
세포 부착 분석
세포 부착 분석은 Matrigel로 코팅된 96웰 마이크로타이터 평판에서 수행하였다. 트립신 이후, hESC는 원하는 화합물을 함유하는 화학적으로 규명된 배지에 재현탁시켰다. 다음으로, 세포를 마이크로타이터 웰에 부가하고 3시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다. 미결합 및 느슨하게 결합된 세포를 진탕 및 세척을 통해 제거하고, 남은 세포를 즉시 고정시켰다. 웰을 3회 200 ㎕의 H2O로 세척하고, 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛(Sigma)으로 염색하였다. 570 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 차단 항체를 이용한 실험을 위해, 세포를 얼음 상에서 30분간 항체와 사전항온반응시켰고, 부착 분석을 항체 존재 하에 수행하였다. 각 샘플은 3회 독립적으로 분석하였다.
세포내이입 ( Endocytosis ) 분석
hESC를 1.5 mg/mL 설포숙신이미딜 2-(바이오틴아미도) 에틸-디티오프로프리오네이트(설포-NHS-SS-바이오틴)(Pierce Chemical Co.)와 얼음 상에서 항온반응시킨 후, 세척하고 켄칭하였다. E-카데린의 세포내이입은 Ca2 + 고갈 및 37℃ 항온반응을 통해 개시시켰다. 다음으로, 0℃에서 글루타티온 용액(60 mM 글루타티온, 0.83 M NaCl 포함, 0.83 M NaOH 및 1% BSA를 사용전 부가함)의 2회 20분 세척으로 항온반응시켰고 모든 세포 표면 바이오틴 기를 제거하였다. 잔류하는 바이오틴화된 단백질이 세포내이입에 의해 세포 내에 격리되어서, 글루타티온 스트리핑으로부터 보호되었다. 바이오틴화된 단백질을 스트렙타비딘 비드 상에서 회수하고 SDS-PAGE로 분석하였다. E-카데린은 면역블랏팅을 통해 검출하였다. 세포내 이입전 표면 E-카데린의 총 수준을 기준으로 이용하였다.
실시예 2: N-벤질-2-(피리미딘-4- 일아미노 )티아졸-4-카르복스아미드( 티아 조비빈)의 합성
화학 합성
이하에 기술한 화학 합성 실시예 및 당분야에 일반적으로 알려진 화학 합성법을 이용하여, 당분야의 숙련가는 본원에 개시한 화합물(예를 들어, 화학식 I∼VI의 화합물)을 제조할 수 있다.
구매한 모든 화합물은 후속 정제없이 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker(400 MHz) 장치에서 기록하였다. 화학 이동(δ)은 ppm으로 측정하였고 결합 상수(J)는 Hz로 기록하였다. LCMS는 API-ES 이온화 소스가 구비된 역상 액체 크로마토그래피-질상 분광분석계 Agilent 1100 LCMS 시스템을 통해 수행하였다. 고압 액체 크로마토그래피는 C18 컬럼을 이용하였고, 용매 B(0.05% 트리플루오로아세테이트를 포함하는 물) 중 10% 용매 A(0.035% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴) 내지 90% 용매 A 선형 구배로, 7시간 30분간 실시 후, 2시간 30분간 90% A로 용리하였다.
N-벤질-2-(피리미딘-4- 일아미노 )티아졸-4- 카르복스아미드(티아조비빈)의 합성
벤질아민을 환원성 아민화를 통해 PAL-벤질 아민 수지를 제공하는 4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시메틸 작용화 폴리스티렌 수지(PAL)에 적재시켰다. 예를 들어, 문헌 [Ding, S.; Grey, N. S. Wu, X.; Ding, Q.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1594-1596]을 참조한다. DMF(3 mL) 중에 PAL-벤질 아민 수지(200 mg, 0.2 mmol), 2-브로모티아졸-4-카르복실산(83 mg, 0.4 mmol), 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀산 클로라이드(BOP-Cl)(153 mg, 0.6 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.17 mL, 1 mmol)을 함유하는 반응 플라스크를 24시간 동안 실온에서 진탕하였다. 이 수지를 메탄올, 디클로로메탄으로 세척하고 진공 건조하여 PAL 수지-N-벤질-2-브로모티아졸-4-카르복스아미드를 제공한 후, 이를 화염 건조된 반응 바이알에 부가하고, 4-아미노피리미딘(95 mg, 1 mmol), Pd2(dba)3(46 mg, 0.05 mmol), Xantphos(87 mg, 0.15 mmol) 및 NaOtBu(192 mg, 2 mmol)를 부가하였다. 상기 바이알을 안전하게 캡핑하고 탈가스화한 후, 아르곤과 무수 디옥산(1.5 mL)을 충전시켰다. 반응물을 24시간 동안 90℃에서 진탕하였다. 수지를 나트륨 디에틸디티오카르바메이트 용액(DMF 중 0.05 M), 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고 진공건조시켰다. 이후 수지를 절단 칵테일 TFA:CH2Cl2:H2O(45:55:5)(2 mL)로 2시간 동안 절단시켰다. 수지를 여과하고, 여과물을 회수하여 진공 증발시켜 미정제물을 얻었고 이를 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 얻었다(30 mg, 48%).
Figure 112011050666155-pct00031
N -벤질-2-(피리미딘-4- 일아미노 )티아졸-4- 카르복스아미드
C15H13N5OS에 대해 계산된 정밀 질량: 311.1, LCMS 측정치 m/z = 334.1(M+Na+).
1H NMR(400 MHz, d 6-DMSO) 4.49(d, J = 6.3 Hz, 2H), 5.76(s, 1H), 7.21-7.27(m, 2H), 7.30-7.34(m, 4H), 7.85(s, 1H), 8.45(t, J = 6.3 Hz, 1H), 8.51(d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.94(s, 1H).
실시예 3: 티아조비빈 유도체의 합성
Figure 112011050666155-pct00032
적절한 아민 R1NH2을 환원성 아민화를 통해 PAL-벤질 아민 수지가 제공되도록 4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시메틸 작용화 폴리스티렌 수지(PAL)에 적재하였다. 무수 DMF(3 mL) 중 PAL-벤질 아민 수지(200 mg, 0.2 mmol, 1.0 eq.), 2-브로모티아졸 카르복실산 1(0.4 mmol, 2. 0 eq.), 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀산 클로라이드(BOP-Cl)(0.6 mmol, 3. 0 eq.) 및 디이소프로필에틸아민(1 mmol, 5.0 eq.)의 혼합물을 24시간 동안 대기 온도에서 진탕하였다. 이 수지를 메탄올, 디클로로메탄으로 세척하고 진공 건조한 후, 화염 건조된 반응 바이알에 부가하고, 이어 상응하는 R2NH2(1 mmol, 5.0 eq.), Pd2(dba)3(0.05 mmol), Xantphos(0.15 mmol) 및 NaOtBu(2 mmol, 10.0 eq.)를 부가하였다. 상기 바이알을 안전하게 캡핑하고 탈가스화시킨 후, 아르곤 및 무수 디옥산(1.5 mL)을 충전시켰다. 반응물을 24시간 동안 90℃에서 진탕시켰다. 수지를 나트륨 디에틸디티오카르바메이트 용액(DMF 중 0.05 M), 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고 진공 건조시켰다. 이후 수지를 절단 칵테일: TFA:CH2Cl2:H2O = 45:55:5(2 mL)을 이용해 2시간 동안 절단하였다. 수지를 여과하고 여과물을 회수한 후 진공증발시켜 미정제물을 얻고, 이어 HPLC로 정제하여 원하는 표제 화합물 3을 얻었다.
Figure 112011050666155-pct00033
Figure 112011050666155-pct00034
실시예 4: N-( 사이클로프로필메틸 )-4-(4-(6-히드록시-3,4- 디히드로퀴놀린 -1(2H)-일)피리미딘-2- 일아미노 ) 벤젠설폰아미드 ( 파이린테그린 )의 합성
n-부탄올(10 mL) 중 2,4-디클로로피리미딘(372 mg, 2.5 mmol), 6-메톡시-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린(489 mg, 3 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.52 mL, 3 mmol)을 함유하는 반응 플라스크를 40℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 2-클로로-4-(6-메톡시-3,4-디히드로퀴놀린-1(2H)-일)피리미딘(551 mg, 80%)를 얻었다. 이 중간체(250 mg, 0.91 mmol)를 이어서 디클로로메탄에 용해시키고 BBr3(디클로로메탄 중 1 M)(1 mL, 1 mmol)로 -78℃에서 처리하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 승온시키고 1시간 동안 교반하고, 물에 부은 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 배합된 유기물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 2-클로로-4-(6-히드록시-3,4-디히드로퀴놀린-1(2H)-일)피리미딘(154 mg, 65%)을 얻었다. DMF(0.5 mL) 중 2-클로로-4-(6-히드록시-3,4-디히드로퀴놀린-1(2H)-일)피리미딘(29 mg, 0.11 mmol) 및 4-아미노-N-(사이클로프로필메틸)벤젠설폰아미드(27 mg, 0.12 mmol)의 교반 용액에 p-톨루엔설폰산(디옥산 중 2 M)(55 ㎕, 0.11 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 밤새 교반한 후, HPLC을 통해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(27 mg, 56%).
Figure 112011050666155-pct00035
N -( 사이클로프로필메틸 )-4-(4-(6-히드록시-3,4- 디히드로퀴놀린 -1(2H)-일)피리미딘-2- 일아미노 ) 벤젠설폰아미드
C23H25N5O3S에 계산된 정밀 질량: 451.2, LCMS 측정치 m/z = 452.3(M+H+).
1H NMR(400 MHz, d 6-DMSO) 0.05-0.09(m, 2H), 0.32-0.36(m, 2H), 0.75-0.81(m, 1H), 1.90-1.95(m, 2H), 2.64(t, J = 6.4 Hz, 4H), 3.93(t, J = 6.5 Hz, 2H), 6.59(d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.66-6.70(m, 2H), 7.25-7.28(m, 1H), 7.64(t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.74(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.82(d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.01(d, J = 7.1 Hz, 1H), 10.79(s, 1H).
실시예 5: 파이린테그린 유도체의 합성
Figure 112011050666155-pct00036
n-부탄올 중 2,4-디클로로피리미딘 4(1.0 eq.), R1NH2 (1.2 eq.) 및 디이소프로필에틸아민(1.2 eq.)의 혼합물을 80℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 우수한 수율로 중간체 10(> 80%)을 얻고, 이를 DMF 중 R2NH2 (1.2 eq.)로 처리하고 p-톨루엔설폰산(디옥산 중 2 M)(1.2 eq.)을 부가하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 밤새 교반한 후, 분취용 HPLC로 직접 정제하여 파이린테그린 유도체 11을 우수한 수율로 얻었다.
Figure 112011050666155-pct00037
Figure 112011050666155-pct00038
Figure 112011050666155-pct00039
Figure 112011050666155-pct00040
본원에 기술한 실시예 및 구체예들은 단지 예시를 위한 목적이며 이의 다양한 변화 또는 변형이 가능함을 당분야의 숙련가에게 제안하며 본 출원서의 정신 및 범위, 그리고 첨부된 청구항의 범주 내에 포함시키고자 함을 이해할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개 출판물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체로 참조하여 본원에 편입된다.

Claims (76)

  1. 하기 화학식 II의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체 또는 기하 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure 112014014018418-pct00091

    상기 식에서,
    L2는 미치환된 C1-6 알킬렌이고;
    y는 0∼1의 정수이고;
    z는 0∼2의 정수이며;
    X는 -N= 또는 -CH=이고;
    R1은 수소 또는 미치환된 C1-6 알킬이며;
    R3은 -C(O)NR14R15, -OR18, 또는 치환 또는 미치환된 C1-6 알킬이고, 이때 치환된 C1-6 알킬은 할로겐으로 치환되고, z가 2이면, 인접한 정점에서 2개의 R3 모이어티는 함께 결합되어 O, N, P, Si 및 S로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 이종원자를 갖는, 미치환된 C3-8 헤테로사이클로알킬을 형성하고;
    R4는 -OR18이며;
    R14, R15 및 R18은 독립적으로 수소 또는 미치환된 C1-6 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, L2는 메틸렌인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R1은 수소인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    L2는 메틸렌이고;
    X는 -N= 또는 -CH=이며;
    R1은 수소이고;
    y 및 z는 0인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 구조를 갖는 것인 화합물, 또는 이의 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체 또는 기하 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure 112014014018418-pct00092
    .
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 구조를 갖는 것인 화합물, 또는 이의 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체 또는 기하 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure 112014014018418-pct00093
    .
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 구조를 갖는 것인 화합물, 또는 이의 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체 또는 기하 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure 112014014018418-pct00094
    .
  8. 하기 화학식의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 라세미화합물, 부분입체이성질체, 호변체 또는 기하 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure 112014014018418-pct00095
    .
  9. 시험관 내에서 단리된 동물 세포를 안정화시키는 방법으로서, 동물 세포를 충분량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시켜 이 세포를 안정화시키는 단계를 포함하는 안정화 방법.
  10. 세포 생존율을 유지시키는 방법으로서,
    단리된 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포를 생성시키는 단계; 및
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물의 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 세포의 생존율을 개선시키기에 충분한 양의 상기 화합물과 단리된 줄기 세포를 접촉시킴으로써 단리된 세포에서 E-카데린의 안정화를 유도시켜 세포 생존율을 유지시키는 단계를 포함하는 유지 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을, 상기 화합물의 부재시와 비교하여 2배 이상으로 단리된 세포의 생존율을 개선시키기에 충분한 양으로 포함하는 단리된 세포의 개체군.
  12. 제11항에 있어서, 세포는 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전구 세포, 분화 세포, 베타 세포 및 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 세포의 개체군.
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