ES2712074T3 - Cultivos de células madre - Google Patents

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ES2712074T3 ES16174428T ES16174428T ES2712074T3 ES 2712074 T3 ES2712074 T3 ES 2712074T3 ES 16174428 T ES16174428 T ES 16174428T ES 16174428 T ES16174428 T ES 16174428T ES 2712074 T3 ES2712074 T3 ES 2712074T3
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Abstract

Una composición que comprende un compuesto que tiene la fórmula (II):**Fórmula** y células aisladas que comprenden células madre, células progenitoras, o células diferenciadas de ellas, en donde, L2 es alquileno C1-C6 no sustituido; e y es un número entero de 0 a 3; z es un número entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; R3 es OR18, y R18 es hidrógeno o alquilo C1-C10 no sustituido; R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2N(R19)2, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; o un racemato, diastereómero, tautómero, o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCION
Cultivos de celulas madre
Las celulas madre embrionarias (ESC) son celulas pluripotentes que tienen la capacidad de autcrrenovarse indefinidamente y de diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo (Thomson, J. A. et al, Science 282 (5391):
1145-1147 (1998); Thomson, J.A. y Odorico, J.S., Trends Biotechnol 18 (2):53-57 (2000)). Esta capacidad proporciona la esperanza de que las ESC se usaran algun dfa para reemplazar a las celulas perdidas y danadas, y proporcionaran terapias mas alla del alcance de los farmacos convencionales. Sin embargo, para comprender totalmente los potenciales clmicos de las hESC, se tienen que establecer condiciones de cultivo robustas, qmmicamente definidas, sin celulas nutrientes ni productos animales. Aunque se han reportado varios medios qmmicamente definidos (Yao, S.
et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18):6907-6912 (2006); Lu, J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (15):5688-5693 (2006); Ludwig, T.E. et al., Nat Biotechnol 24 (2):185-187 (2006)), son todavfa muy insatisfactorios debido al rendimiento suboptimo de las celulas en ellos. Especialmente bajo estas condiciones, cuando las celulas se subcultivan por tripsina a celulas individuales, experimentan una muerte celular extensa. Se conocen varias rutas de senalizacion que median la autorrenovacion de las hESC, incluyendo FGF, TGF-p, Wnt, etc. (James, D. et al., Development 132 (6):1273-1282 (2005); Xu, R.H. et al., Nat Methods 2 (3):185-190 (2005); Beattie, G.M. et al., Stem
Cells 23 (4):489-495 (2005); Greber, B., Lehrach, H., y Adjaye, J., Stem Cells 25 (2):455-464 (2007); Sato, N. et al.,
Nat Med 10 (1):55-63 (2004)). Sin embargo, ninguna de ellas parece actuar como un factor de supervivencia en este proceso, cuyos mecanismos moleculares son elusivos. WO 2007/109045 describe compuestos organicos heterodclicos que se dice que inhiben, regulan y/o modulan las protemas tirosina y serina/treonina quinasas y semejantes a quinasas, tales como la quinasa RAF. WO 02/056888 describe un ensayo para la identificacion y comparacion de compuestos que tienen actividad como moduladores de la expresion y liberacion deTNF-a, IL-1 o
IL-6 en los seres humanos y animales en los que la modulacion de la actividad catalttica de PRAK (protema quinasa regulada/activada por p38) se emplea para la identificacion y comparacion de compuestos de ensayo. US 7265 138 describe ligandos del receptor vanilloide y su posible uso en el tratamiento de enfermedades.
Breve compendio de la invencion
La presente invencion proporciona una composicion que comprende un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000002_0001
y celulas aisladas que comprenden celulas madre, celulas progenitoras, o celulas diferenciadas de ellas,
en donde L2 es alquileno C1-C6 no sustituido; e y es un numero entero de 0 a 3; z es un numero entero de 0 a 5; X es
-N=, -CH= o -CR5=; R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; R3 es OR18, y R18 es hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido; R4 y R5 son independientemente CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un numero entero de 0 a 2; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no susttuido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
o un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, L2 es metileno.
En algunas realizaciones, X es -N= o -CH=.
En algunas realizaciones, z es 1.
En algunas realizaciones, y es 0 o 1.
En algunas realizaciones, L2 es metileno, X es -N= o -CH=; R1 es hidrogeno; e y y z son 0.
En algunas realizaciones, el compuesto de formula (II) tiene la formula:
Figure imgf000003_0001
o
Figure imgf000003_0002
La presente invencion tambien proporciona un medio de cultivo celular que comprende un compuesto de formula (II), como se ha definido anteriormente, o un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para aumentar la supervivencia y proliferacion celulares, metodo que comprende:
(a) obtener celulas aisladas que comprenden celulas madre, celulas progenitoras, o celulas diferenciadas de ellas; y (b) poner en contacto las celulas aisladas con una cantidad de un compuesto que tiene la formula (II) suficiente como para mejorar la supervivencia de las celulas al menos 2 veces comparado con la ausencia del compuesto, en donde el compuesto que tiene la formula (II) es como se ha definido anteriormente, o es un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el metodo permite la estabilizacion de una celula aislada in vitro. En algunas realizaciones, el metodo comprende poner en contacto una celula animal con una cantidad suficiente de un compuesto de formula (II) como para estabilizar la celula.
En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas cambiar las condiciones o entorno de la celula en presencia del compuesto, en donde la etapa de cambio en ausencia del compuesto resultana en un cambio en la programacion celular de la celula. En algunas realizaciones, la etapa de cambio comprende al menos uno de descongelar las celulas y disociar las celulas de otras celulas.
En algunas realizaciones, la celula es adherente. En algunas realizaciones, la celula esta en suspension.
En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar un fenotipo de la celula.
El metodo puede comprender aislar las celulas de un animal. El animal puede ser un ser humano. El animal puede ser un animal no humano.
En algunas realizaciones, el metodo comprende generar celulas madre, celulas progenitoras, o celulas diferenciadas aisladas; e inducir la estabilizacion de E-cadherina en las celulas aisladas, mantenimiento de esta manera la supervivencia celular.
En algunas realizaciones, la etapa de induccion comprende cultivar las celulas madre aisladas en una superficie, en donde una molecula que comprende un ectodominio de E-cadherina se ancla a la superficie.
En algunas realizaciones, el metodo comprende generar celulas aisladas; y activar la protema quinasa C (PKC) en las celulas aisladas, manteniendo de esta manera la supervivencia celular.
En algunas realizaciones, la composicion de la invencion comprende una cantidad de un compuesto de formula (II) que estabiliza a la E-cadherina en las celulas, suficiente como para mejorar la supervivencia de las celulas aisladas al menos 2 veces comparado con la ausencia del compuesto.
En algunas realizaciones, la composicion de la invencion comprende una cantidad de un compuesto de formula (II) suficiente como para mejorar la supervivencia de las celulas aisladas al menos 2 veces comparado con la ausencia del compuesto.
Definiciones
Las abreviaturas usadas en la presente memoria tienen su significado convencional en las tecnicas qrnmica y biologica.
El termino "estabilizar una celula" se refiere a reducir o eliminar sustancialmente la respuesta de una celula a un cambio en las condiciones o entorno a las que esta expuesta la celula. "Reducir sustancialmente" en este contexto significa que la respuesta es al menos un 50 % menor de lo que sena en ausencia de un componente estabilizante (p. ej., los compuestos de formula (II)).
El termino "cambiar las condiciones o entorno de una celula" se refiere a cambiar la temperatura, medio de cultivo (p. ej., fuente de carbono, concentracion de sal, factor de crecimiento), disociar las celulas en celulas aisladas, descongelar las celulas, o cambiar de otra forma un factor del entorno inmediato de una celula, Como se discute en la presente memoria, cambiar las condiciones o entorno de una celula cambiara frecuentemente el fenotipo de una celula o la programacion celular. Por ejemplo, las celulas madre, asf como otras celulas, cuando se afslan se diferenciaran y/o moriran en respuesta a determinados cambios tales como aislamiento, descongelacion, etc. Asf, el cambio de las condiciones puede reducir o eliminar la viabilidad celular, mientras las celulas estabilizadas como se describe en la presente memoria no tienen sustancialmente una viabilidad reducida bajo los mismos cambios de condicion. El cambio en la programacion de una celula tambien puede monitorizarse como la respuesta de una celula a un estfmulo espedfico que es caractenstico para un determinado tipo celular y/o como por la expresion de uno o un conjunto de genes o productos genicos caractensticos. Como un ejemplo no limitativo, las celulas madre pluripotentes humanas se sabe que expresan al menos algunos, y opcionalmente todo, los marcadores de la siguiente lista: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, t Ra -1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-I, Oct4, Rex1, y Nanog. Dicha expresion puede cambiar al perder una celula madre la pluripotencia o diferenciarse de otra forma. Una celula madre pluripotente humana estabilizada mantendra su patron de expresion caractenstico despues de un cambio en la condicion.
Una celula "aislada" se ha separado sustancialmente o purificado de otras celulas de un organismo.
El termino" disociar" celulas se refiere a un proceso de aislar celulas de otras celulas o de una superficie (p. ej., una superficie de una placa de cultivo). Por ejemplo, las celulas pueden disociarse de un animal o tejido por metodos mecanicos o enzimaticos. Alternativamente, las celulas que se agregan in vitro pueden disociarse unas de otras. En otra alternativa mas, las celulas adherentes se disocian de una placa de cultivo u otra superficie. La disociacion puede implicar asf la rotura de las interacciones de la celula con la matriz extracelular (ECM) y sustratos (p. ej., superficies de cultivo) o la rotura de la ECM entre las celulas.
"Determinar un fenotipo de una celula" se refiere a evaluar una cualidad o caractenstica de la celula. Los fenotipos pueden incluir, por ejemplo, la expresion genica caractenstica de un tipo celular. o patrones de expresion genica, respuesta de la celula a un estfmulo o entorno, capacidad de diferenciarse o desdiferenciarse, tener una morfologfa particular, etc.
Cuando se especifican los grupos qmmicos sustituyentes por sus formulas qmmicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, engloban igualmente los sustituyentes qmmicamente identicos que resultanan de escribir la estructura de derecha a izquierda, p. ej., -CH2O- es equivalente a -OCH2-.
El termino "alquilo", en sf mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a no ser que se afirme otra cosa, una cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, o combinacion de las mismas, que puede estar completamente saturada, mono o poliinsaturada y puede incluir radicales di y multivalentes, que tiene el numero de atomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, pero no estan limitados a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, noctilo, y semejantes. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o mas enlaces dobles o enlaces triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no estan limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homologos e isomeros superiores. Los grupos alquilo preferidos son grupos alquilo C1-6.
El termino "alquileno" en sf mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero limitado, por -CH2CH2CH2CH2-. Tfpicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendra de 1 a 24 atomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos atomos de carbono estando ejemplificados en la presente invencion. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno con una cadena mas corta, que tiene generalmente ocho o menos atomos de carbono. Los grupos alquileno preferidos son grupos alquileno C1-6.
El termino "heteroalquilo", en s^ mismo o en combinacion con otro termino, significa, a no ser que se afirme otra cosa, una cadena lineal o ramificada estable, o radical hidrocarburo dclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en al menos un atomo de carbono y al menos un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, P, Si y S, y en donde los atomos de nitrogeno y de azufre pueden estar oxidados opcionalmente y el heteroatomo de nitrogeno puede estar cuaternizado. El o los heteroatomos O, N, P y S y Si pueden estar situados en cualquier posicion interior del grupo heteroalquilo o en la posicion en la que el grupo alquilo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos incluyen, pero no estan limitados a, -CH2-CH2-O-CH3 , -CH2-CH2-NH-CH3 , -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, O-CH3, -O-CH2-CH3 , y -CN. Hasta dos heteroatomos pueden ser consecutivos, tal como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De forma similar, el termino "heteroalquileno" en sf mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitado, por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroatomos tambien pueden estar situados en cualquiera o ambos extremos de la cadena (p. ej., alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y semejantes). Ademas, para los grupos de union alquileno y heteroalquileno, no se implica ninguna orientacion del grupo conector por la direccion en la que se escribe la formula del grupo conector. Por ejemplo, la formula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'- como -R'C(O)2-. Como se ha descrito anteriormente, los grupos heteroalquilo, tal y como se usan en la presente memoria, incluyen aquellos grupos que estan unidos al resto de la molecula a traves de un heteroatomo, tal como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R'', -OR', -SR', y/o -SO2R'. Cuando se indica "heteroalquilo", seguido de indicaciones de grupos heteroalquilo espedficos, tales como -NR'R'' o semejantes, se entendera que los terminos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes o mutuamente exclusivos. En su lugar, los grupos heteroalquilo espedficos se indican para anadir claridad, Asf el termino "heteroalquilo" no debe interpretarse en la presente memoria como que excluye grupos heteroalquilo espedficos, tales como -NR'R'' o semejantes. Los grupos heteroalquilo preferidos son grupos heteroalquilo C1-6.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "heteroalquileno" se refiere a un grupo heteroalquilo, como se ha definido anteriormente, que une al menos otros dos grupos. Los dos restos unidos al heteroalquileno pueden estar unidos al mismo atomo o a atomos diferentes del heteroalquileno. Los grupos heteroalquileno preferidos son grupos heteroalquileno C1-6.
Los terminos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", en sf mismos o en combinacion con otros terminos, representan, a no ser que se afirme otra cosa, versiones dclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Ademas, para heterocicloalquilo, un heteroatomo puede ocupar la posicion en la que el heterociclo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no estan limitados a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, y semejantes. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no estan limitados a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y semejantes. Un "cicloalquileno" y "heterocicloalquileno" se refieren a un radical divalente derivado de cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente. Los grupos cicloalquilo y heterocicloalquilo pueden ser grupos cicloalquilo C3-8 y heterocicloalquilo C3-8, o grupos cicloalquilo C5-8 y heterocicloalquilo C5-8.
Los terminos "halo" o "halogeno", en si mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a no ser que se afirme otra cosa, un atomo de fluor, de cloro, de bromo o de yodo. Ademas, terminos tales como "haloalquilo", se pretende que incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el termino "haloalquilo(C1-C4)" se pretende que incluya, pero no esta limitado a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y semejantes.
El termino "arilo" significa, a no ser que se afirme otra cosa, un sustituyente hidrocarbonado aromatico poliinsaturado que puede ser un unico anillo o multiples anillos (preferiblemente, de 1 a 3 anillos) que estan fusionados conjuntamente o unidos covalentemente. El termino "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cuatro heteroatomos seleccionados de N, O, y S, en donde los atomos de nitrogeno y azufre estan opcionalmente oxidados, y el o los atomos de nitrogeno estan opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molecula a traves de un carbono o heteroatomo. Los ejemplos no limitativos de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos mas adelante. "Arileno" y "heteroarileno" se refiere a un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente. Los grupos arilo de la presente invencion tienen preferiblemente 5-12 miembros en el anillo, mas preferiblemente 6-10 miembros en el anillo. Los grupos heteroarilo de la presente invencion tienen preferiblemente 5-12 miembros en el anillo, mas preferiblemente 5-10 miembros en el anillo.
Para brevedad, el termino "arilo" cuando se usa en combinacion con otros terminos (p. ej., ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye tanto anillos arilo como heteroarilo como se ha definido anteriormente. As^ el termino "arilalquilo" se pretende que incluya aquellos radicales en los que un grupo arilo esta unido a un grupo alquilo (p. ej., bencilo, fenetilo, piridilmetilo y semejantes) incluyendo aquellos grupos alquilo en los que un atomo de carbono (p. ej., un grupo metileno) se ha reemplazado por, por ejemplo, un atomo de oxfgeno (p. ej., fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo, y semejantes).
El termino "oxo", tal y como se usa en la presente memoria, significa un oxfgeno que esta unido por enlace doble a un atomo de carbono.
El termino "alquilsulfonilo", tal y como se usa en la presente memoria, significa un resto que tiene la formula -S(O2)-R', donde R' es un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente. R' puede tener un numero especificado de carbonos (p. ej., "alquilsulfonilo C1-C4").
Cada uno de los terminos anteriores (p. ej., "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") se pretende que incluyan tanto las formas sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes ejemplares para cada tipo de radical se proporcionan mas adelante.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos que se refieren frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o mas de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitados a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogeno, -SiR'R"R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y-NO 2 en un numero que vana de cero a (2m'+1), donde m' es el numero total de atomos de carbono en dicho radical. R', R", R'" y R"" cada uno independientemente preferiblemente se refiere a hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (p. ej., arilo sustituido con 1-3 halogenos), alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R", R"' y R"" cuando esta presente mas de uno de estos grupos. Cuando R' y R" estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 4, 5, 6, o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se pretende que incluya, pero no limitado a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusion anterior de sustituyentes, un experto en la tecnica entendera que el termino "alquilo" se pretende que incluya grupos que incluyen atomos de carbono unidos a grupos distintos de grupos hidrogeno, tales como haloalquilo (p. ej., -CF3 y -CH2CF3) y acilo (p. ej., -C(O)CH3, -C(O)CF3 , -C(O)CH2OCH3, y semejantes).
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan de, por ejemplo: halogeno, -OR', -NR'R", -SR', -halogeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 , -R', -N3, -CH(Ph)2 , fluoroalcoxi(C1-C4), y fluoroalquilo(C1-C4), en un numero que vana de cero al numero total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromatico; y donde R', R", R'" y R"" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R", R'" y R"" cuando esta presente mas de uno de estos grupos.
Dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo forman opcionalmente un anillo de la formula -T-C(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace sencillo, y q es un numero entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la formula -A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un numero entero de 1 a 4. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo asf formado puede reemplazarse opcionalmente con un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la formula -(CRR')s-X'-(C"R''")d-, donde s y d son independientemente numeros enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R"' se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "heteroatomo" o "heteroatomo del anillo" se pretende que incluya oxfgeno (O), nitrogeno (N), azufre (S), fosforo (P), y silicio (Si).
Un "grupo sustituyente", tal y como se usa en la presente memoria, significa un grupo seleccionado de los siguientes restos:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3 , -NO2 , oxo, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, y heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de:
(i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, y heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de:
(a) oxo, -OH, -NH2 , -SH, -CN, -CF3, -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de oxo, -OH, -NH2 , -SH, -CN, -CF3 , -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, y heteroarilo no sustituido.
Un "sustituyente con tamano limitado" o "grupo sustituyente con tamano limitado", tal y como se usa en la presente memoria, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido.
Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", tal y como se usa en la presente memoria, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido.
El termino "sales farmaceuticamente aceptables" se pretende que incluya sales de los compuestos activos que se preparan con acidos o bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en la presente memoria. Cuando los compuestos de formula (II) contienen funcionalidades relativamente acidas, pueden obtenerse sales de adicion a base poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, bien sin disolvente o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion a base farmaceuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino organico, o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de formula (II) contienen funcionalidades relativamente basicas, pueden obtenerse sales de adicion a acido poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, bien sin disolvente o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion a acido farmaceuticamente aceptables incluyen las derivadas de acidos inorganicos como acidos clorhndrico, bromhndrico, mtrico, carbonico, monohidrogenocarbonico, fosforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosulfurico, yodhfdrico, o fosforoso y semejantes, asf como las sales derivadas de acidos organicos relativamente no toxicos como acetico, propionico, isobutmco, maleico, malonico, benzoico, succmico, suberico, fumarico, lactico, mandelico, ftalico, bencenosulfonico, p-tolilsulfonico, citrico, tartarico, metanosulfonico, y semejantes. Tambien se incluyen las sales de aminoacidos tales como arginato y semejantes, y las sales de acidos organicos como acidos glucuronico o galacturonico y semejantes (vease, por ejemplo, Berge et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Determinados compuestos espedficos de formula (II) contienen tanto funcionalidades basicas como acidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adicion bien a base o acido.
Asf, los compuestos de formula (II) pueden existir como sales con acidos farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de dichas sales incluyen hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (p. ej., (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de los mismos incluyendo mezclas racemicas, succinatos, benzoatos y sales con aminoacidos tales como acido glutamico. Estas sales pueden prepararse por metodos conocidos para los expertos en la tecnica.
Las formas neutras de los compuestos se regeneran preferiblemente poniendo en contacto la sal con una base o acido y aislando el compuesto parental de la manera convencional. La forma parental del compuesto se diferencia de las varias formas de sal en determinadas propiedades ffsicas, tales como solubilidad en disolventes polares.
En la presente memoria tambien se describen profarmacos de los compuestos y son aquellos compuestos que experimentan facilmente cambios qrnmicos en condiciones fisiologicas para proporcionar los compuestos de formula (II). Ademas, los profarmacos pueden convertirse en los compuestos de formula (II) por metodos qrnmicos o bioqmmicos en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profarmacos pueden convertirse lentamente en los compuestos de formula (II) cuando se ponen en un reservorio de un parche transdermico con una enzima o reactivo qrnmico adecuado.
Determinados compuestos de formula (II) pueden existir en formas no solvatadas, as ^ como como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y estan englobadas en el alcance de la formula (II). Determinados compuestos de formula (II) pueden existir en multiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas ffsicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invencion.
Determinados compuestos de formula (II) poseen atomos de carbono asimetricos (centros opticos) o enlaces dobles; los racematos, diastereomeros, tautomeros, isomeros geometricos e isomeros individuales estan englobados en el alcance de la formula (II). Los compuestos de formula (II) no incluyen aquellos que se sabe en la tecnica que son demasiado inestables como para ser sintetizados y/o aislados.
Los compuestos de formula (II) tambien pueden contener proporciones no naturales de isotopos atomicos en uno o mas de los atomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con isotopos radiactivos, tales como, por ejemplo, tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotopicas de los compuestos de formula (II), ya sean radiactivas o no, estan englobadas en el alcance de la formula (II).
Descripcion breve de los dibujos
Figura 1. Las nuevas moleculas pequenas sinteticas incrementan dramaticamente la supervivencia de las hESC despues de la disociacion en celulas individuales sin comprometer su autorrenovacion a largo plazo y potencial de desarrollo completo, (a) Estructuras qmmicas de Tiazovivina/Tzv y Pirintegrina/Ptn como se indica- (b) Tincion de ALP de colonias de hESC que se habfan crecido a partir de celulas individuales disociadas sembradas a baja densidad y tratadas como se indica, (c) Relacion de colonias positivas para ALP frente a las celulas totales sembradas inicialmente. (d) Inmunotincion de las hESC mantenidas a largo plazo en medio que contema Ptn o Tzv como se indica. (e) Secciones de teratomas de 5 semanas formados a partir de hESC expandidas a largo plazo mantenidas en medio que contema Tzv (i, ii) o Ptn (iii, iv). Neuroepitelio (ectodermo), cartflago (mesodermo), y epitelio simple (endodermo) (i); neuroepitelio (ectodermo), epitelio simple y epitelio de tipo hepatico (endodermo) (ii); neuroepitelio (ectodermo), cartflago (mesodermo) y epitelio tubular (endodermo) (iii); neuroepitelio (ectodermo), musculo esqueletico (mesodermo), y epitelio tubular (endodermo) (iv). (f) Analisis por bandeo G de las hESC despues de mas de 20 subcultivos, propagadas en presencia de los compuestos Ptn o Tzv. Si no se especifica, todas las hESC anteriores se crecieron en el medio qmmicamente definido y sin celulas nutrientes en las placas recubiertas con Matrigel.
Figura 2. Tzv estabiliza las E-cadherinas despues de la disociacion celular para proteger a las hESC de la muerte en el cultivo en suspension. (a) Analisis de la muerte celular de hESC disociadas crecidas en Matrigel o en suspension tratadas con o sin Ptn o Tzv. (b) Imagenes de contraste de fase de hESC crecidas en placas no recubiertas tratadas con las moleculas indicadas. (c) Analisis por transferencia Western de E-cadherinas en las hESC que se transfectaron con los ARNsi espedficos frente a E-cadherina o GFP. (d) Analisis de la muerte celular por tincion TUNEL de y (e) Tincion de ALP de hESC disociadas que se transfectaron con ARNsi espedficos frente a E-cadherina o GFP en presencia de Tzv. (f) Analisis por transferencia Western de E-cadherinas de longitud completa en hESC antes y despues de tripsina. (g) Un analisis por transferencia Western de la evolucion temporal de la expresion de E-cadherinas de longitud completa en hESC despues de la disociacion con tripsina y tratamiento con DMSO, Tzv, o Ptn durante el tiempo indicado. (h) Analisis por citometna de flujo del nivel en la superficie de E-cadherina en hESC despues de tratamiento con tripsina en presencia de Tzv. Se uso DMSO como un control. (i) RT-PCR semicuantitativa de E-cadherina en hESC tratadas con o sin Tzv. (j) Analisis de la endocitosis de E-cadherinas en ausencia o presencia de Tzv. (k) Analisis de la supervivencia celular de hESC crecidas en placas recubiertas con BSA o diferentes concentraciones de la quimera E-cad-Fc.
Figura 3. Ptn y Tzv protegen a las hESC de la muerte celular en cultivo adherente despues de la disociacion manteniendo y reactivando la actividad de las integrinas, (a) Curva de crecimiento de hESC crecidas en Matrigel con diferentes evoluciones temporales de tratamiento con Ptn y Tzv. Grupo 1, tratamiento con Ptn solo durante las primeras 24 h; Grupo 2, tratamiento continuo con Ptn durante el periodo completo de cultivo; Grupo 3, tratamiento con Tzv solo durante las primeras 24 h; Grupo 4, tratamiento continuo con Tzv durante el cultivo; Para cada condicion, se sembraron en placas 10 x 104 celulas disociadas por pocillo de una placa de 6 pocillos. (b) Imagenes de contraste de fase de hESC 12 horas despues de la siembra en diferentes matrices y tratadas con los compuestos indicados, (c) Las hESC disociadas se sembraron en placas recubiertas con Matrigel y se dejo que se adhirieran durante 3 h en presencia de compuestos o junto con anticuerpo bloqueante de integrina p i como se indica. El porcentaje de adhesion se calculo como se describe en los Materiales y Metodos. (d) Analisis por transferencia Western de integrina p i expresada por las hESC antes y despues del tratamiento con tripsina. (e) Un analisis por transferencia Western de la evolucion temporal de la expresion de integrina en las hESC despues de disociacion con tripsina y tratamiento con DMSO, Tzv, o Ptn durante el tiempo indicado. (f, g) Analisis por citometna de flujo (f), e inmunotincion (g) de las integrinas p i en la conformacion activa en las hESC disociadas con tripsina despues de tratamiento con Tzv o Ptn. (h, i) Adhesion celular (h) y tincion de ALP (i) de las hESC tratadas con o sin anticuerpo activador de p i, TS2/16. (j) Adhesion celular de las hESC tratadas con Tzv o Ptn en combinacion con o sin un inhibidor de PKC, (k) Inmunotincion de integrinas p i en la conformacion activa en las hESC tratadas con o sin PMA ( i0 nM). (l, m) Adhesion celular (l) y tincion de ALP (m) de las hESC tratadas con los compuestos indicados.
Figura 4. PI-3 K y ERK mediados por receptores de factores de crecimiento son la senalizacion principal de supervivencia y antidiferenciacion generados del nicho de las hESC, respectivamente, (a) Analisis de la muerte celular de las hESC disociadas sembradas en Matrigel y tratadas como se indica. (b) Transferencia Western que muestra el estado de fosforilacion de diferentes receptores de factores de crecimiento en las hESC tratadas con Ptn durante 2 h.
Se uso DMSO como un control, (c) Analisis de la muerte celular de las hESC disociadas en suspension tratadas con las condiciones indicadas. (d) Inmunoprecipitacion que muestra la interaccion de las E-cadherinas con EGFR1 y Erb2.
(e) Transferencia Western que muestra el estado de fosforilacion de AKT en las hESC tratadas con Ptn durante los periodos de tiempo indicados. (f) Transferencia Western que muestra el estado de fosforilacion de AKT y ERK en presencia de Ptn o junto con un anticuerpo bloqueante de integrina p1. (g) Transferencia Western que muestra el estado de fosforilacion de AKT en las hESC tratadas con Ptn o junto con los inhibidores de receptor indicados. (h) Analisis de la muerte celular de las hESC tratadas con Ptn o junto con un inhibidor de PI-3 K, o inhibidor de MEK durante 24 h. (i) Porcentaje de celulas negativas para SSEA4 despues de tratamiento con inhibidor de MEK.
Las Figuras 5A y 5B muestran compuestos de formula (II), incluyendo tiazovivina y derivados del mismo.
Las Figuras 6A , 6B , 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 6I, 6J, 6K , 6L, 6M , 6N, 6O, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6U, 6V, 6AA , 6AB y 6AC muestran compuestos incluyendo pirintegrina y derivados del mismo.
Descripcion detallada
I. Introduccion
La presente invencion proporciona composiciones y medios de cultivo celular que comprenden nuevos compuestos, asf como metodos para el uso de dichos compuestos. Se proporciona una clase de compuestos qmmicos que son moleculas pequenas en las composiciones y medios de cultivo celular que previenen la diferenciacion de celulas y promueven la supervivencia celular, incluyendo, pero no limitado a, cuando las celulas se afslan o estan de otra forma fuera de su medio normal o medio tisular. Los compuestos son utiles como compuestos profilacticos y terapeuticos para varias indicaciones de enfermedad diferentes, incluyendo, pero no limitado a, cancer, dano tisular, e ictus.
II. Compuestos que promueven la supervivencia y/o antidiferenciacion celular
En un aspecto, los compuestos presentes en las composiciones y medios de cultivo celular de la invencion promueven la supervivencia y/o antidiferenciacion celular.
El compuesto que promueve la supervivencia y/o antidiferenciacion celular tiene la formula:
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En la Formula (II), y es un numero entero de 0 a 3 y z es un numero entero de 0 a 5. X es -N=, -CH= o -CR5=. R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; L2 es alquileno C1-C6 no sustituido.
R1 puede ser hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido. En algunas realizaciones, R1 es simplemente hidrogeno.
R3 es -OR18, y R18 es hidrogeno o alquilo C1-C10 sustituido. R4 y R5 son independientemente -CN, S(O)nR6, NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un numero entero de 0 a 2.
R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustitudo, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, L2 es metileno no sustituido.
En otras realizaciones, X es -N= o -CH=. El sfmbolo z puede ser 2. El sfmbolo z tambien puede ser 1. El sfmbolo y puede ser 0 o 1.
En algunas realizaciones, L2 es metileno no sustituido, X es -N= o -CH=, R1 es hidrogeno, e y y z son 0.
En otras realizaciones, el compuesto tiene la formula:
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(algunas veces denominado Tiazovivina o "Tzv").
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o
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En algunas realizaciones, cada grupo sustituido descrito anteriormente en los compuestos de Formula (II) esta sustituido con al menos un grupo sustituyente. Mas espedficamente, en algunas realizaciones, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arlo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido, y/o heteroalquileno sustituido descrito anteriormente en los compuestos de Formula (II) esta sustituido con al menos un grupo sustituyente. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos estan sustituidos con al menos un grupo sustituyente con tamano limitado. Alternativamente, al menos uno o todos estos grupos estan sustituidos con al menos un grupo sustituyente inferior.
En otras realizaciones, en los compuestos de Formula (II), cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C20 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada grupo alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido, y/o cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C8 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas otras realizaciones, los compuestos de formula (II) pueden estar sustituidos con alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogeno, -SiR'R''R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR"R''', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, en donde cada R', R", R'" y R"" hidrogeno, alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o grupos arilalquilo.
II. Metodos de uso
Los compuestos de formula (II) son utiles para una amplia variedad de propositos. Por ejemplo, los compuestos promueven la supervivencia en situaciones (p. ej., para celulas aisladas) en las que las celulas inan de otra forma a apoptosis o morinan de otra forma. En algunas realizaciones, las celulas se estabilizan durante al menos un periodo de tiempo particular, p. ej., 10 minutos, 30 minutos, o 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, o 96 horas. Ademas, los compuestos son utiles para mantener el estado actual de diferenciacion de las celulas en condiciones en las que las celulas se diferencianan de otra forma o cambianan su programacion de otra forma. Estos efectos dan lugar a un gran numero de usos para los compuestos bien in vitro o in vivo.
A. Usos in vivo
Los compuestos de formula (II) son utiles para reducir el dano tisular y asf pueden administrate para tratar, mejorar, prevenir el dano tisular. Un compuesto de formula (II) puede adm inistrate a un individuo que tiene, o esta en riesgo de tener, dano tisular en un organo interno. Los organos internos incluyen, pero no estan limitados a, cerebro, pancreas, tngado, intestino, pulmon, rinon, o corazon, heridas, p. ej., por quemadura o corte. Por ejemplo, los compuestos de formula (II) pueden ser efectivos para reducir el tamano de un infarto en reperfusion despues de isquemia. As^ un compuesto de formula (II) puede administrarse a individuos en riesgo de tener, que tienen, o han tenido, un ictus. De forma similar, un compuesto de formula (II) puede administrarse a individuos en riesgo de tener, que tienen, o han tenido, un ataque cardiaco o dano cardiaco.
Los inventores han encontrado que los compuestos de formula (II) pueden prevenir la muerte celular, por ejemplo, en celulas epiteliales. Por ejemplo, los inventores dispersaron celulas de islotes/beta pancreaticas primarias humanas como celulas individuales en una placa de cultivo tisular que se recubrio con matrigel o laminina. En medio de cultivo celular regular para las celulas beta sin Tzv, se produjo una muerte celular sustancial. Sin embargo, cuando se anadio Tzv al medio (1-2 mM), la muerte celular se inhibio. Se observo el mismo efecto para otras celulas primarias epiteliales, tales como celulas neurales. De acuerdo con esto, en algunas realizaciones, un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo que necesite celulas beta y/o de islotes pancreaticos, en donde la administracion del compuesto produce un incremento en el numero de celulas beta o de islotes en el individuo.
Ademas, los compuestos de formula (II) son efectivos para incrementar el flujo sangumeo e inhibir respuestas inflamatorias. Por ejemplo, los compuestos de Formula (II) aumentan la adhesion y migracion de monocitos a traves de monocapas de celulas endoteliales y pueden aliviar asf respuestas inflamatorias (datos no mostrados). Asf, un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo (p. ej., que tiene isquemia cerebral) que necesita un flujo sangumeo incrementado y/o inflamacion disminuida. Aquellos que necesitan inflamacion reducida incluyen individuos con una enfermedad inflamatoria o con una enfermedad mediada por una afeccion inflamatoria. Las enfermedades inflamatorias ejemplares incluyen, pero no estan limitadas a, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, osteoartritis, tendinitis o bursitis, artritis gotosa, polimialgia reumatica, fibromialgia, enfermedad inflamatoria pelvica y artritis, incluyendo artritis reumatoide,
Los compuestos de formula (II) pueden usarse para tratar o mejorar el cancer. En algunos casos, un compuesto de formula (II) puede administrarse para tratar cancer, p. ej., carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de cuello uterino, glioblastoma, leucemia, linfoma, cancer de prostata, y linfoma de Burkitt, cancer de cabeza y cuello, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer del esofago, cancer de estomago, cancer pancreatico, cancer hepatobiliar, cancer de la vesfcula biliar, cancer del intestino delgado, cancer rectal, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de pene, cancer uretral, cancer testicular, cancer de cuello uterino, cancer vaginal, cancer uterino, cancer de ovario, cancer de tiroides, cancer de paratiroides, cancer adrenal, cancer del pancreas endocrino, cancer carcinoide, cancer oseo, cancer de piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (vease, CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. T. et al. eds 1997) para canceres adicionales).
La metastasis de celulas cancerosas es tfpicamente un proceso que implica la transicion epitelial a mesenquimal/EMT (p. ej., de celulas de tipo epitelial a celulas de tipo fibroblasto). Los inventores han encontrado que los compuestos de formula (II) (es decir, Tvz) pueden inducir MET (la inversa de EMT) e inhibir EMT, lo que indica que los compuestos son efectivos para reducir o prevenir las metastasis cancerosas. De acuerdo con esto, un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo que tiene o esta en riesgo de tener metastasis cancerosas. Por ejemplo, los inventores han encontrado que los compuestos de formula (II) inhiben las metastasis de canceres epiteliales incluyendo, pero no limitado a, cancer de mama y carcinoma hepatocelular.
Un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo que tiene, o esta en riesgo de tener, hipertension y/o aterosclerosis.
Los compuestos de formula (II) (es decir, Tvz) son efectivos para promover la regeneracion axonal y la recuperacion funcional en un sistema nervioso central danado. Por ejemplo, los inventores han encontrado que Tvz puede promover el crecimiento de las neuritas a partir de celulas neuronales primarias de ratones. Se ensayo Tzv (3 |jM) en explantes corticales P1 de ratones, con un resultado de lectura de crecimiento axonal. Se anadio Tzv al medio 20 minutos despues de la siembra en placas, con DMSO como un control. Los explantes se observaron durante 4 dfas en cultivo. Tzv mostro un efecto dramatico promoviendo el crecimiento axonal, que fue notable desde la primera division. De acuerdo con esto, un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo que tiene un dano en el sistema nervioso central o que necesita o se beneficiana de otra forma de regeneracion axonal.
Un compuesto de formula (II) puede administrarse a un individuo que tiene diabetes, resistencia a insulina, o que necesita de otra forma promover la supervivencia de las celulas beta, o esta en riesgo de perder la funcion de las celulas beta.
Los compuestos de formula (II) tambien encuentran uso para la mejona de los smtomas negativos de, o mejona de otra forma, del trasplante de organos, celulas, o tejidos. Como se explica en la presente memoria, los compuestos de formula (II) son efectivos para estabilizar y mantener la programacion contextual de las celulas. Asf, un compuesto de formula (II) puede administrarse durante y despues del trasplante de celulas, tejido u organo a un individuo. Los ejemplos de trasplantes incluyen, pero no estan limitados a, trasplante de medula osea, sangre del cordon umbilical, celulas madre/progenitoras hematopoyeticas purificadas, celulas cardiacas, celulas neurales, celulas beta pancreaticas, y celulas hepaticas.
B. Usos in vitro
Los compuestos de formula (II) son efectivos para estabilizar celulas expuestas a una amplia variedad de condiciones. Muchas celulas animales, cuando se afslan (en suspension o alternativamente, cuando son adherentes) pierden viabilidad, pasan a traves de apoptosis, y/o cambian la programacion (por ejemplo, las celulas madre cuando se afslan, frecuentemente moriran o se diferenciaran). Los compuestos de formula (II), cuando se mezclan con dichas celulas, son efectivos para prevenir dichas respuestas celulares a cambios en el entorno. En algunas realizaciones, las celulas se afslan de un animal y se ponen en contacto con un compuesto de formula (II) en una cantidad suficiente como para prevenir la perdida de la viabilidad celular y/o cambios en la programacion celular. En algunas realizaciones, dichas celulas aisladas son utiles para diagnostico ya que las celulas aisladas retienen fenotipos que de otra manera se perdenan debido a la respuesta de la celula al proceso de aislamiento y al aislamiento en sf mismo. Los fenotipos retenidos ejemplares pueden incluir, por ejemplo, patrones de expresion genica, capacidad de respuesta de la celula a un estfmulo, ligando, o farmaco, viabilidad celular.
La estabilidad de una poblacion de celulas puede monitorizarse, por ejemplo, monitorizando la expresion de productos genicos. Por ejemplo, determinados productos genicos son espedficos de tejido o tipo de celula y pueden monitorizarse antes y despues de un cambio en la condicion o entorno (por ejemplo, cambio del medio celular, descongelacion de la celula, aislamiento de la celula de otras celulas, etc.) para determinar si el cambio afecta a la programacion celular. En algunas realizaciones, las celulas que se van a someter a un cambio de condicion o entorno, o relativamente poco despues (p. ej., en 1 minuto, 5 minutos, una hora, etc., dependiendo de las circunstancias) del cambio, se ponen en contacto con un compuesto de formula (II) en una cantidad suficiente de manera que uno o mas marcadores de la expresion celular permanecen sustancialmente igual. "Sustancialmente igual" dependera del contexto y se entendera en la tecnica. En algunas realizaciones, "sustancialmente igual" significa que la expresion de un producto genico asociado con un tipo celular espedfico no cambia mas de aproximadamente el 10 %, 20 % o 30 % despues de un tratamiento particular a la celula (p. ej., comparado con la expresion antes del tratamiento).
En algunas realizaciones, la invencion proporciona metodos para promover la supervivencia y antidiferenciacion en celulas madre ex vivo. Por ejemplo, los inventores han encontrado que los compuestos de Formula (II) (es decir, Tzv) son efectivos para promover la supervivencia y antidiferenciacion en celulas madre embrionarias humanas, celulas madre embrionarias de raton, multiples celulas madre neurales, celulas madre de la piel, celulas madre mesenquimales, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre estromales y celulas madre epiteliales poniendo en contacto las celulas con un compuesto de Formula (II) inmediatamente despues del aislamiento de las celulas.
De acuerdo con esto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende poblaciones de celulas aisladas que comprenden celulas madre, celulas progenitoras o celulas diferenciadas de las mismas, y una cantidad suficiente de un compuesto de Formula (II) para estabilizar las celulas, p. ej., para prevenir o reducir respuestas celulares a cambios en condiciones (p. ej., aislamiento de un tejido, descongelacion de las celulas, etc.). En algunas realizaciones, por ejemplo, las celulas en contacto con un compuesto de formula (II) estan en estados congelado o Kquido. En algunas realizaciones, las celulas se descongelan de un estado congelado mientras estan en contacto con una cantidad suficiente de un compuesto de formula (II) para prevenir o reducir el dano o diferenciacion celular.
En algunas realizaciones, un compuesto de formula (II) se pone en contacto con una poblacion de celulas madre, celulas progenitoras o celulas diferenciadas. Las celulas madre ejemplares incluyen celulas madre pluripotentes, celulas madre embrionarias, celulas madre inducidas (celulas iPS). Las celulas madre ejemplares tambien incluyen celulas madre embrionarias humanas, celulas madre embrionarias de raton, multiples celulas madre neurales, celulas madre de la piel, celulas madre mesenquimales, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre estromales, y celulas madre epiteliales. Cualquier tipo de celulas progenitoras puede usarse, incluyendo, pero no limitado a, celulas progenitoras del endodermo, celulas progenitoras del mesodermo (p. ej., celulas progenitoras del musculo, celulas progenitoras del hueso, celulas progenitoras de la sangre), y celulas progenitoras del ectodermo (p. ej., celulas progenitoras del tejido epidermico y celulas progenitoras neurales). Hay una amplia variedad de celulas diferenciadas conocidas. Las celulas diferenciadas incluyen, pero no estan limitadas a, fibroblastos, celulas cardiacas, celulas neurales, celulas beta pancreaticas, celulas hepaticas, celulas epiteliales, y celulas intestinales. Las celulas descritas en la presente memoria pueden ser celulas humanas o celulas no humanas. En algunas realizaciones, las celulas son celulas humanas. En algunas realizaciones, las celulas son celulas de raton, perro, vaca, cerdo, rata, o de primate no humano.
La capacidad de mantener la viabilidad celular y programacion celular permite metodos mejorados de cribado de farmacos y diagnostico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una celula se criba para detectar una respuesta en presencia de al menos un compuesto de formula (II), manteniendo de esta manera la viabilidad de la celula, y se pone ademas en contacto con al menos uno de una pluralidad de agentes (p. ej., una biblioteca qmmica) y se monitoriza entonces para detectar una respuesta. Se conoce un amplio rango de metodos de cribado. Este metodo encuentra un beneficio particular para el uso con celulas que de otra forma tendnan una baja viabilidad en las condiciones del metodo de cribado (por ejemplo, cuando es conveniente usar celulas aisladas, celulas en suspension, celulas adhesivas, etc.). Las celulas pueden ser, por ejemplo, celulas madre, celulas progenitoras o celulas diferenciadas, como se describe en la presente memoria. La respuesta celular puede ser cualquier respuesta deseada. Algunas respuestas en ensayos de cribado basados en celulas incluyen, pero no estan limitadas a, expresion de un gen (p. ej., sobre la base de la expresion de un gen informador o cuantificado por PCR u otra tecnologfa de deteccion), viabilidad celular o perdida de la misma, induccion de apoptosis, etc.
Los agentes usados en los metodos de cribado pueden ser, por ejemplo, compuestos organicos pequenos (p. ej., con un peso molecular menor de 10000 daltons, por ejemplo, menor de 8000, 6000, 4000, 2000 daltons), lfpidos, azucares, polipeptidos, anticuerpos, acidos nucleicos (p. ej., oligonucleotidos, ADN, ARN, ribozimas, ARN inhibidor corto (ARNsi), micro ARN (ARNmi), etc.).
En algunas realizaciones, los ensayos se disenan para cribar bibliotecas combinatorias grandes mediante la automatizacion de las etapas del ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente a los ensayos, que se operan tfpicamente en paralelo (p. ej., en formatos de microtitulacion o en placas de micropocillos en ensayos roboticos). Las bibliotecas combinatorias pueden ser completamente aleatorias, o comprender miembros que contienen una estructura central basada en uno o mas compuestos lfder prometedores. Las bibliotecas combinatorias pueden ser completamente sinteticas o pueden incluir algunos o todos los miembros que derivan de fuentes naturales, incluyendo, por ejemplo, bacterias, hongos, plantas, insectos y vertebrados (p. ej., Xenopus (rana) o Anguilla (anguila)) y animales no vertebrados (p. ej., Strongylocentrotus (erizo de mar) o moluscos). Vease, tambien, Boldi, Combinatorial Synthesis of Natural Product Based Libraries, 2006, Cr C Press.
En una realizacion, los metodos de cribado de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca combinatoria qmmica o de peptidos que contiene un gran numero de compuestos terapeuticos potenciales (compuestos potenciales moduladores o ligandos). Dichas "bibliotecas combinatorias qmmicas" o "bibliotecas de ligandos" se criban entonces en uno o mas ensayos, como se describe en la presente memoria, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases qmmicas particulares) que presentan una actividad caractenstica deseada. Los compuestos asf identificados pueden servir como "compuestos lfder" convencionales o pueden usarse en sf mismos como terapeuticos potenciales o reales.
Una biblioteca combinatoria qmmica es una coleccion de diversos compuestos qmmicos generada bien por smtesis qmmica o smtesis biologica, combinando un numero de "bloques de construccion" qmmicos, tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca combinatoria qmmica lineal tal como una biblioteca de polipeptidos se forma combinando un conjunto de bloques de construccion qmmicos (aminoacidos) de todas las maneras posibles para una longitud de compuesto dada (es decir, el numero de aminoacidos en un compuesto polipeptido). Pueden sintetizarse millones de compuestos qmmicos mediante dicho mezclado combinatorio de bloques de construccion qmmicos.
La preparacion y cribado de bibliotecas combinatorias qmmicas es muy conocido para los expertos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5663046; 5958792; 6185506; 6541211; 6721665. Dichas bibliotecas combinatorias qmmicas incluyen, pero no estan limitadas a, bibliotecas de peptidos (vease, p. ej., Pat. U.S. No. 5010 175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991); Houghton, et al., Nature 354:84-88 (1991); y Combinatorial Peptide Library Protocols, Cabilly, ed., 1997, Humana Press. Tambien pueden usarse otras qmmicas para generar bibliotecas con diversidad qmmica. Dichas qmmicas incluyen, pero no estan limitadas a: peptoides (p. ej., Publicacion PCT No. WO 91/19735), peptidos codificados (p. ej., Publicacion PCT WO 93/20242), bio-oligomeros aleatorios (p. ej., Publicacion PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (p. ej., Pat. U.S. No. 5288 514), diversomeros, tales como hidantomas, benzodiazepinas y dipeptidos (Hobbs et al, Proc. Nat. Acad. ScL USA 90:6909-6913 (1993)), polipeptidos vinilogos (Hagihara et al, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomimeticos no peptfdicos con soporte de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), smtesis organica analoga de bibliotecas de compuestos pequenos (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994); Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential, Cortese, ed., 1995, Walter De Gruyter Inc; y Obrecht y Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, 1998, Elsevier Science Ltd), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261 :1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de acidos nucleicos (vease, Ausubel, infra, Sambrook y Russell, infra y Patentes U.S. Nos. 6 955 879; 6 841 347; 6 830 890; 6 828 098; 6 573 098; y 6 399 334), bibliotecas de acidos nucleicos peptfdicos (veanse p. ej., las Pat. U.S. Nos. 5539083; 5864010 y 6756 199), bibliotecas de anticuerpos (vease, p. ej., Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (vease, p. ej., Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996); Pat. U.S. No. 5593 853; y Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries, Seeberger, ed., 2004, John Wiley & Sons (E­ book)), bibliotecas de moleculas organicas pequenas (vease, p. ej., benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de enero, pagina 33 (1993) y Pat. U.S. No. 5288514; isoprenoides, Pat. U.S. No. 5569 588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Pat. U.S. No. 5549974; pirrolidinas, Pat. U.S. Nos. 5525735 y 5519 134; compuestos morfolino, Pat. U.S. No. 5506 337, y semejantes). Vease tambien, Combinatorial Library Design and Evaluation: Principles, Software Tools, and Applications in Drug Discovery, Ghose, et al., eds., 2001, Marcel Dekker; Molecular Diversity and Combinatorial Chemistry: Libraries and Drug Discovery, Chaiken y Janda, eds., 1996, Oxford Univ Pr.; y Combinatorial Library Methods and Protocols, English, ed., 2002, Humana Press.
Los dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias estan disponibles comercialmente (vease, p. ej., Advanced Chem Tech, Louisville KY., Symphony, Rainin, Woburn, MA., Applied Biosystems, Foster City, CA., Millipore, Bedford, MA y Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
En algunas realizaciones, los ensayos de cribado pueden llevarse a cabo convenientemente en placas con multiples pocillos (p. ej., 96 pocillos, 384 pocillos, etc.), en donde cada agente que se va a cribar se ensaya individualmente en un unico pocillo. En algunas realizaciones, dos o mas agentes candidatos se ensayan en una unica mezcla reaccion
C. Dianas alternativas para obtener efectos similares
Como se describe con detalle en los ejemplos siguientes, los inventores han aprendido acerca del papel de varios productos genicos en la respuesta celular a los compuestos de formula (II) y esto ha dado lugar al descubrimiento de que las celulas tambien pueden estabilizarse mediante la manipulacion de los productos genicos como se explica mas adelante.
1. E-cadherina
Los inventores han encontrado que el incremento de la expresion de la E-cadherina aumenta la supervivencia de las celulas madre. Asf, la presente invencion proporciona metodos para estabilizar y/o incrementar la expresion de E-cadherina en una celula, estabilizando de esta manera a la celulas frente a un cambio de condiciones que de otra forma sena perjudicial para la viabilidad de la celula. La estabilizacion con E-cadherina puede incluir, por ejemplo, poner en contacto las celulas con un compuesto que incrementa la expresion de E-cadherina o protege de alguna manera a la E-cadherina frente a la escision proteolttica.
En la presente memoria se describen metodos para cultivar celulas madre (incluyendo, pero no limitado a, celulas madre embrionarias humanas o de raton) en un contenedor que tiene una superficie recubierta con una protema que comprende al menos un ectodominio de E-cadherina, unido opcionalmente a otro componente tal como una protema de fusion, estabilizando de esta manera las celulas (p. ej., manteniendo o incrementando la viabilidad de las celulas y/o manteniendo la programacion celular). Un ectodominio es la parte de una protema de membrana que se extiende en el espacio extracelular (el espacio fuera de la celula). En algunas realizaciones, los ectodominios son la parte de una protema que inician el contacto con la superficie que da lugar a la transduccion de la senal. El ectodominio de la E-cadherina se describe, p. ej., en Ito et al, Oncogene 18(50):7080-90 (1999) Al menos el ectodominio de la E-cadherina puede fusionarse con una secuencia de polipeptido de dimerizacion, permitiendo de esta manera la formacion de dfmeros estabilizados del ectodominio. Un "polipeptido de dimerizacion" se refiere a una secuencia de aminoacidos que forma homodfmeros, permitiendo de esa manera que dos polipeptidos dimericen. Los polipeptidos de dimerizacion ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, un fragmento Fc de IgG. Las celulas madre (incluyendo, pero no limitado a, celulas madre embrionarias humanas o de raton, celulas madre pluripotentes, celulas iPS) pueden disociarse una de otra y cultivarse en un contenedor que tiene una superficie recubierta con una protema que comprende al menos un ectodominio de E-cadherina, unido opcionalmente a otro componente tal como una protema de fusion, estabilizando de esta manera las celulas y mejorando la tasa de supervivencia de las celulas comparado con la tasa de supervivencia de celulas tratadas de forma similar cultivadas en un contenedor que carece del recubrimiento con el polipeptido.
2. Protema quinasa C
En la presente memoria tambien se describen metodos para estabilizar celulas poniendo en contacto las celulas con un activador de la protema quinasa C. Como se explica en la presente memoria, el tratamiento de hESC disociadas con un activador de la protema quinasa C crecidas en presencia de una matriz de matrigel produjo una adhesion celular y formacion de colonias significativamente mejoradas, mejorando de esta manera la viabilidad celular. De acuerdo con esto, la viabilidad celular puede mejorarse cultivando las celulas en presencia de un activador de la protema quinasa C, mejorando de esta manera la viabilidad, crecimiento y/o adhesion de las celulas. Un activador de la protema quinasa C puede ponerse en contacto con una poblacion de celulas madre, celulas progenitoras o celulas diferenciadas en una cantidad suficiente como para mejorar la viabilidad y/o supervivencia y/o adhesion de las celulas. Las celulas madre ejemplares incluyen celulas madre pluripotentes, celulas madre embrionarias, celulas madre inducidas (celulas iPS) o como se describe de otra forma en la presente memoria. Los activadores de la protema quinasa C ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, esteres de forbol (p. ej., 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) o esteres de forbol como se describe en la Publicacion de Patente US No. 20080226589) o agonistas peptfdicos (p. ej., como se describe en la Patente US No. 6 165977).
3. Integrina p1
En la presente memoria tambien se describen metodos para estabilizar celulas poniendo en contacto las celulas con un activador de la integrina p1. Como se explica en la presente memoria, el tratamiento de hESC disociadas con un activador de la integrina p1, cuando las celulas se crecen en lamina produjo una adhesion celular y formacion de colonias significativamente mejoradas, mejorando de esta manera la viabilidad celular. De acuerdo con esto, la viabilidad celular puede mejorarse cultivando las celulas en presencia de un activador de la integrina p1, mejorando de esta manera la viabilidad, crecimiento y/o adhesion de las celulas. Un activador de la integrina p1 puede ponerse en contacto con una poblacion de celulas madre, celulas progenitoras o celulas diferenciadas en una cantidad suficiente como para mejorar la viabilidad y/o supervivencia y/o adhesion de las celulas. Las celulas madre ejemplares incluyen celulas madre pluripotentes, celulas madre embrionarias, celulas madre inducidas (celulas iPS) o como se describe de otra forma en la presente memoria. Los activadores de la integrina p i ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, un anticuerpo activador de la integrina p i tal como, p. ej., TS2/16 (disponible comercialmente en, p. ej., Thermo Scientific, Rockfield, III.).
IV. Poblaciones celulares
Como se discute en la presente memoria, la presente invencion proporciona celulas en una mezcla (p. ej., un cultivo celular) con uno o mas compuestos de formula (II) - incluyendo, pero no limitado a, Tzv. En algunas realizaciones, el compuesto esta en la mezcla a una concentracion suficiente como para mantener la viabilidad o la programacion celular en respuesta a un cambio del entorno o condicion celular (p. ej., descongelacion). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los compuestos estan en una concentracion de al menos 0.1 nM, p. ej., al menos 1, 10, 100, 1000, 10 000, o 100 000 nM, p. ej., entre 0.1 nM y 100 000 nM, p. ej., entre 1 nM y 10 000 nM, p. ej., entre 10 nM y 10 000 nM, p. ej., entre 1-10 |jM. En algunas realizaciones, las mezclas estan en un recipiente sintetico (p. ej., un tubo de ensayo, una placa Petri, etc.). Las celulas son celulas aisladas (no son parte de un animal). En algunas realizaciones, las celulas son celulas adherentes o celulas en suspension. En algunas realizaciones, las celulas se afslan o disocian de una muestra de tejido (p. ej., una biopsia) de un animal (humano o no humano), se ponen en un recipiente, y se ponen en contacto con uno o mas compuestos de formula (II). Las celulas pueden cultivarse posteriormente y, opcionalmente, insertarse de nuevo en el mismo animal o uno diferente, opcionalmente despues de que las celulas se hayan estimulado para diferenciarse en un tipo o linaje celular particular, o despues de la introduccion de un casete de expresion recombinante en las celulas.
V. Cultivo de las celulas
Las celulas pueden cultivarse segun cualquier metodo conocido en la tecnica. Las celulas pueden cultivarse en suspension o como celulas adherentes, segun sea apropiado.
En algunas realizaciones, las celulas (p. ej., celulas madre) se cultivan en contacto con celulas nutrientes. Las celulas nutrientes ejemplares incluyen, pero no estan limitadas a, celulas fibroblastos, p. ej., celulas fibroblastos embrionarios de raton (MEF). Los metodos para cultivar celulas en celulas nutrientes son conocidos en la tecnica.
En algunas realizaciones, las celulas se cultivan en ausencia de celulas nutrientes. Las celulas, por ejemplo, pueden unirse directamente a una superficie de cultivo solida (p. ej., una placa de cultivo), p. ej., a traves de un anclaje molecular. Los anclajes moleculares ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, matrigel, una matriz extracelular (ECM), analogos de ECM, laminina, fibronectina, o colageno. Los expertos en la tecnica reconoceran, sin embargo, que esta es una lista no limitativa y que pueden usarse otras moleculas para unir celulas a una superficie solida. Los metodos para la union inicial de los anclajes a la superficie solida son conocidos en la tecnica.
VI. Formulaciones y metodos de administracion
En la presente memoria se describen formulaciones que comprenden un compuesto de formula (II), que son adecuadas para administracion, que incluyen disoluciones acuosas y no acuosas, disoluciones isotonicas esteriles, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, y solutos que hacen que la formulacion sea isotonica, y suspensiones acuosas y no acuosas esteriles que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes. Las composiciones pueden administrarse, por ejemplo, oralmente, nasalmente, topicamente, intravenosamente, intraperitonealmente, o intratecalmente. Las formulaciones de los compuestos pueden presentarse en contenedores sellados de dosis unitaria o multiples dosis, tales como ampollas y viales. Las disoluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos, granulos, y comprimidos esteriles de la clase descrita previamente. Los moduladores tambien pueden administrarse como parte de un alimento o farmaco preparado.
La dosis administrada a un paciente debena ser suficiente como para inducir una respuesta beneficiosa en el sujeto con el tiempo. El nivel de dosis optimo para cualquier paciente dependera de una variedad de factores incluyendo la eficacia del modulador espedfico empleado, la edad, peso corporal, actividad ffsica, y dieta del paciente, de una posible combinacion con otros farmacos, y de la gravedad de la enfermedad o afeccion en cuestion. El tamano de la dosis tambien se determinara por la existencia, naturaleza, y grado de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompanan a la administracion de un compuesto o vector particular en un sujeto particular
En la determinacion de la cantidad efectiva de un ingrediente activo que se va a administrar, un medico puede evaluar los niveles plasmaticos circulantes del compuesto o agente, toxicidad del compuesto o agente, y la produccion de anticuerpos anticompuesto o agente. En general, la dosis equivalente de un compuesto o agente es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto tfpico.
VII. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invencion reivindicada
Ejemplo 1:
Para mejorar las condiciones del medio qmmicamente definido y descubrir el mecanismo molecular de la muerte de las hESC despues de la disociacion en celulas individuales, realizamos un cribado fenotipico de alto rendimiento de 50 000 compuestos sinteticos para identificar moleculas pequenas que promueven la supervivencia de las hESC despues de la disociacion con tripsina. A partir del cribado, se identificaron dos clases qmmicas que incrementaron significativamente la supervivencia celular despues de la disociacion y tambien mantuvieron la morfologfa de las colonias de las hESC y la expresion de la fosfatasa alcalina (ALP). Las optimizaciones qmmicas y analisis de actividad adicionales dieron lugar al descubrimiento de dos moleculas lfder, un tiazol disustituido en 2,4 (denominado Tiazovivina/Tzv) y una pirimidina disustituida en 2,4 (denominada Pirintegina/Ptn) (Fig. 1a), para caracterizaciones funcionales y mecamsticas adicionales
Tabla 1. Datos de actividad
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El compuesto Tzv o Ptn aumenta la supervivencia de hESC individuals mas de 20 veces en placas recubiertas con Matrigel despues de la disociacion enzimatica (Fig. 1b, c). Las hESC se habfan subcultivado de forma seriada en medio qmmicamente definido que contema Tzv o Ptn durante mas de 20 generaciones. En dichas condiciones, las celulas mantuvieron de forma homogenea la morfologfa caractenstica de las hESC, la expresion de marcadores pluripotenciales tipicos, y un cariotipo normal (Fig. 1d, e). Cuando estas celulas se inyectaron en ratones desnudos, generaron teratomas complejos que consistfan en los tres tejidos de la capa germinal primarios (Fig. 1f). Estos resultados, confirmados con varias lmeas de hESC independientes, demostraron de forma colectiva y convincente que ambos compuestos podnan promover sustancialmente la supervivencia de las hESC sin comprometer la autorrenovacion y la potencia de desarrollo completa.
Se sabe que es diffcil que las hESC formen cuerpos embrioides (EB) en cultivo en suspension despues de la disociacion en celulas individuales debido a una muerte celular extensa. Asf, tambien ensayamos si Tzv o Ptn podfan promover la supervivencia de las hESC disociadas en suspension. De forma interesante, Tzv mejoro en gran medida la supervivencia de las hESC tanto en cultivos adherentes como en suspension. Por el contrario, Ptn solo promovio la supervivencia de las hESC en cultivo adherente (p. ej., en placas recubiertas con Matrigel), pero no tuvo efecto en el cultivo en suspension (Fig. 2a). Estas observaciones sugieren que al menos dos mecanismos distintos estan implicados en estos dos tipos de muerte celular en condiciones de ECM/Matrigel o suspension, y que Tzv y Ptn funcionan de forma diferente. Las hESC formaron buenos agregados celulares cuando se crecieron en suspension y en presencia de Tzv (Fig.2b), y pudieron diferenciarse en varios linajes (datos no mostrados). Como la agregacion celular esta mediada lo mas frecuentemente a traves de adhesiones celula-celula y la E-cadherina es la molecula de adhesion celula-celula principal, y tambien esta altamente expresada en hESC (Eastham, A.M. et al., Cancer Res 67 (23): 11254-11262 (2007)), ensayamos el efecto de un anticuerpo bloqueante de E-cadherina espedfico sobre la formacion de agregados multicelulares. Cuando las celulas se cultivaron en presencia del anticuerpo, la supervivencia celular y la formacion de agregados grandes compactos inducida por el tratamiento con Tzv se inhibio en gran medida, indicando que la supervivencia celular y el ensamblaje de los agregados multicelulares inducido por Tzv implica a la E-cadherina funcional (Fig. 2b). Ademas, la inactivacion de la E-cadherina por ARNsi espedficos en hESC redujo dramaticamente la supervivencia celular inducida por el tratamiento con Tzv, y disminuyo significativamente el numero de colonias positivas para ALP (Fig. 2c,d,e). Estos resultados sugieren que Tzv aumenta la supervivencia de las hESC en suspension, presumiblemente actuando a traves de la adhesion celula-celula mediada por la E-cadherina.
Examinamos entonces la expresion de la E-cadherina en hESC despues de la disociacion con tripsina. Encontramos que la mayor parte de la E-cadherina de longitud completa se habfa escindido despues de la disociacion con tripsina (Fig. 2f). Esta observacion fue consistente con el reporte de que la region extracelular de la E-cadherina tiene un sitio de escision endoproteolftico cerca del dominio transmembrana (Damsky, CH. et al., Cell 34 (2):455-466 (1983)). En celulas no tratadas con Tzv, aparecio E-cadherina de longitud completa sintetizada de novo 1 h despues del tratamiento enzimatico y desaparecio despues de 4 h, sugiriendo que las E-cadherinas sintetizadas de novo en las hESC disociadas no eran estables. Sin embargo, en las celulas tratadas con Tzv, la expresion de E-cadherinas se incremento significativamente (Fig. 2g). Ademas, el analisis por citometna de flujo revelo que las E-cadherinas de la superficie celular en las hESC se incrementaron significativamente por Tzv (Fig. 2h). Por lo tanto, es probable que Tzv afecte la adhesion celular modulando el nivel en la superficie celular de E-cadherinas. La RT-PCR semicuantitativa revelo cantidades comparables de transcritos de E-cadherina en controles simulados y celulas tratadas con Tzv (Fig. 2i), sugiriendo que la diferencia en los niveles de protema E-cadherina no era debida a niveles alterados de la transcripcion. Es probable que Tzv ejerza su efecto a traves de la estabilizacion de la E-cadherina en la superficie celular. Finalmente, el ensayo de endocitosis revelo que la internalizacion de las E-cadherinas se bloqueo significativamente por Tzv. Estos resultados indican que Tzv regula las actividades de las E-cadherinas a traves de la inhibicion de la endocitosis de las E-cadherinas (Fig. 2j).
La disociacion celula-celula por la tripsina da lugar a una escision rapida y desestabilizacion posterior de las E-cadherinas. Establecimos la hipotesis de que la estabilidad de las E-cadherinas tambien podna estar mediada por su interaccion homofflica entre las celulas. Asf, la ligacion homofflica de las E-cadherinas con ligandos recombinantes puede estabilizar a las E-cadherinas y afectar la supervivencia de las hESC. Para ensayar esta hipotesis, recubrimos placas con una protema quimera dimerica de E-cadherina-Fc que contema el ectodominio de la E-cadherina fusionado con el fragmento Fc de IgG (Ecad-Fc). De forma notable, las hESC disociadas unidas a la superficie recubierta y su tasa de supervivencia se incrementaron significativamente de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2k), confirmando que la adhesion celula-celula mediada por las E-cadherinas es un regulador importante para la supervivencia de las hESC.
Tanto Tzv como Ptn tienen un efecto dramatico en la supervivencia de las hESC crecidas en placas recubiertas con Matrigel. Parece improbable que dicho efecto promotor de la supervivencia se deba a la influencia sobre el crecimiento celular y puede atribuirse en gran medida al incremento en la capacidad de adhesion celular despues de los procesos de disociacion celular y siembra (Fig. 3a,b). De hecho, las hESC disociadas que se trataron con Tzv o Ptn presentaron una adhesion dramaticamente incrementada a Matrigel o laminina. Por el contrario, la adhesion de las hESC a gelatina o polilisina (Fig. 3b y datos no mostrados), que no implica a las integrinas, no se vio afectada por el tratamiento con Ptn o Tzv. El componente principal de Matrigel es laminina, y se ha reportado que el receptor de la laminina integrina p i esta altamente expresado en hESC (Xu, C. et al, Nat Biotechnol 19 (10):971-974 (2001)). Para ensayar si Ptn o Tzv actua a traves de la integrina p i, pretratamos las celulas con un anticuerpo bloqueante frente a la integrina p i, y observamos que la union celular incrementada inducida por el tratamiento con el compuesto se suprimio completamente. Esto sugiere que Tzv y Ptn median la adhesion celular a sustratos ECM a traves de la integrina p i (Fig. 3c).
Para obtener informacion acerca del mecanismo de la regulacion de la integrina p i por Tzv y Ptn, investigamos si el efecto de los compuestos se debe a cambios en la expresion de la integrina. A diferencia de la E-cadherina, la integrina p i no se escindio por tripsina. Los analisis por transferencia Western revelaron que es improbable que el efecto de los compuestos se deba a expresiones incrementadas de la integrina p i. Asf, es probable que Tzv y Ptn afecten la adhesion celular modulando la actividad de la integrina (Fig. 3 d,e). Para examinar los efectos del tratamiento con los compuestos sobre la actividad de la integrina p i, usamos el anticuerpo monoclonal HUTS-2i, que se une espedficamente a la forma activada de la integrina p i (Luque, A. et al., J Biol Chem 27i (i9): i i067 - ii075 (i996)). Notablemente, el tratamiento con los compuestos incremento el nivel de union de HUTS-2i (Fig. 3f,g). Estos resultados sugieren de forma colectiva que Tzv y Ptn incrementan la adhesion celular por la modulacion de dentro a afuera de la actividad de la integrina.
Si ambos compuestos qdmicos aumentaban la adhesion celular convirtiendo las integrinas en una conformacion activa, el tratamiento de las celulas con el anticuerpo que activa las integrinas, que bloquea a las integrinas en una conformacion activa, debena tener un efecto similar al de los compuestos. De hecho, cuando se sembraron en placas hESC disociadas en laminina en presencia de TS2/i6, un anticuerpo activador de la integrina p i (van de Wiel-van Kemenade, E. et al, J Cell Biol i i 7 (2):46i-470 (i992)), la adhesion celular se incremento significativamente y las celulas formaron un numero incrementado de colonias comparado con el control (Fig. 3h,i). Estos resultados sugieren que la adhesion incrementada, que se produce cuando las celulas se tratan con estos compuestos, implica un mecanismo que induce la activacion de la integrina.
Para diseccionar adicionalmente el mecanismo molecular por el que Tzv y Ptn regulan la actividad de la integrina, examinamos los efectos de varios inhibidores de la ruta. Encontramos que bisindolilmaleimida I, un inhibidor espedfico de PKC, podfa antagonizar la adhesion celular incrementada inducida por Ptn, pero no tema efecto en la adhesion celular inducida por Tzv. Esto sugiere que la PKC puede mediar la accion de Ptn pero no de Tzv (Fig. 3j). Para confirmar adicionalmente el papel de la PKC en la supervivencia de las hESC, se trataron hESC disociadas con el agonista de la PKC i2-miristato i3 -acetato de forbol (PMA). El tratamiento con PMA causo la activacion de la integrina, asf como un incremento sustancial en la adhesion celular y la formacion de colonias (Fig. 3k,l,m).
El destino de las celulas madre esta influido por su nicho celular, que consiste en factores de crecimiento, interaccion celula-ECM, e interaccion celula-celula. El hecho de que la supervivencia de las hESC sea altamente dependiente de la interaccion celula-celula y/o interaccion celulas-ECM, revelo la importancia de dicho nicho in vitro previamente no reconocido para las hESC. De forma mas importante, las expresiones de protemas intrmsecas de las celulas (p. ej., E-cadherinas e integrinas) y mecanismos reguladores (p. ej., estabilizacion y activacion de protemas), no solo responden a, pero tambien son, componentes esenciales del nicho, lo que sugiere que las celulas madre poseen la capacidad intrmseca de construir su propio nicho en ausencia de otros factores extrmsecos o tipos celulares, que, sin embargo, participan y aumentan el mecanismo de las celulas del nicho autorregulador.
La interaccion entre el entorno ffsico/estructural y el factor de crecimiento juega un papel muy importante en la regulacion del destino de las celulas (Comoglio, P.M., Boccaccio, C, y Trusolino, L., Curr Opin Cell Biol 15 (5):565-571 (2003)). Para examinar si los factores de crecimiento estan implicados en la supervivencia de las hESC mediada por integrinas, tratamos hESC disociadas con Tzv o Ptn junto con inhibidores de receptores de factores de crecimiento individuales altamente espedficos. Encontramos que la inhibicion qrnmica de FGFR, IGFR, EGFR1 o Erb2 disminuyo en gran medida el efecto promotor de la supervivencia inducido por el tratamiento con Tzv o Ptn (Fig. 4a). Ademas, Ptn incremento significativamente la fosforilacion del receptor del factor de crecimiento, sugiriendo que la union de los receptores de factores de crecimiento se requiere para la supervivencia celular mediada por integrinas (Fig. 4b). De forma similar, la inhibicion de FGFR, IGFR, EGFR1 o Erb2 tambien suprimio en gran medida la supervivencia de las hESC inducida por Tzv en cultivo en suspension. Ademas, Tzv indujo la union de E-cadherinas a EGFR1 y ERB2, indicando el papel importante de los receptores de factores de crecimiento en la supervivencia celular mediada por E-cadherina (Fig. 4c, d).
La senalizacion a traves de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI-3K) y MAPK/ERK son reguladores principales para la autorrenovacion de las hESC (Armstrong, L. et al, Hum Mol Genet 15 (11):1894-1913 (2006); Paling, N.R. et al., J Biol Chem 279 (46):48063-48070 (2004); Pyle, A.D., Lock, L.F., y Donovan, P.J., Nat Biotechnol 24 (3):344-350 (2006); Li, J. et al., Differentiation 75 (4):299-307 (2007)). La fosforilacion de ERK y AKT, un efector aguas abajo de PI-3K, se incrementaron despues del tratamiento de hESC disociadas con Ptn, y este incremento se suprimio con el anticuerpo bloqueante de integrinas (Fig. 4e,f). Ademas, la activacion de AKT y ERK por Ptn se bloqueo por inhibidores de FGFR, IGFR, EGFR o Erb2 (Fig. 4g y datos no mostrados). La inhibicion qrnmica de la accion de PI-3K antagonizo significativamente el efecto sobre la supervivencia inducido por Ptn (Fig. 4h). La inhibicion de ERK no tuvo un efecto dramatico sobre la supervivencia inducida por Ptn, pero indujo la diferenciacion de las hESC (Fig. 4i). Estos resultados demostraron que la activacion de la PI-3K es una senalizacion para la supervivencia importante y que la activacion de ERK es una senalizacion antidiferenciacion generada por el nicho a traves de la activacion de receptores de factores de crecimiento.
En resumen, identificamos dos moleculas pequenas sinteticas nuevas con distintos mecanismos de accion a partir de un cribado fenotfpico de alto rendimiento que aumentan en gran medida la supervivencia de las hESC despues de disociacion en celulas individuales. Dichas herramientas qrnmicas y herramientas biologicas recien identificadas a traves de caracterizaciones mecamsticas (p. ej., Ecad-Fc recombinantes definidas para la union de hESC en cultivo adherente; anticuerpos activadores para una supervivencia y union celular aumentadas) permitiran un cultivo mas robusto de las hESC y facilitaran significativamente las aplicaciones de las hESC tales como direccionamiento genico o descubrimiento de farmacos. De forma mas importante, las caracterizaciones mecamsticas en profundidad descubrieron mecanismos de nicho previamente no reconocidos que se requieren para sostener la supervivencia y proliferacion de las hESC. Dicho nicho consiste en la interaccion mediada por E-cadherina entre las hESC en sf mismas, interaccion celula-ECM mediada por integrinas, y factores de crecimiento. Los estudios anteriores han apuntado a un papel importante de los factores de crecimiento en la autorrenovacion de las hESC. Sin embargo, la activacion completa de la senalizacion de los factores de crecimiento requiere no solo la presencia de los factores de crecimiento y receptores sino tambien una interaccion con un microentorno particular. Cuando este entorno ffsico/estructural se destruye, los factores de crecimiento solos no son suficientes para la autorrenovacion de las ESC.
Recientemente, se reporto que fibroblastos diferenciados generados a partir de hESC en cultivo de autorrenovacion crearon un nicho in vitro para las hESC (Bendall, S. C. et al., Nature 448 (7157): 1015-1021 (2007)). En nuestras, y de otros, condiciones de medio qmmicamente definido, observamos raramente dichas celulas diferenciadas en cultivo a largo plazo, sugiriendo que dicho nicho artificial podna crearse debido a diferencias en los medios. No obstante, nuestros estudios revelan mecanismos unicos de nicho autonomos de celulas (es decir, interaccion celula-celula) y no autonomos de celulas (es decir, celula-ECM y -factor de crecimiento) para la supervivencia y autorrenovacion de las hESC, que pueden jugar, probablemente, papeles importantes en el control del destino de las celulas madre adultas in vivo.
La disociacion celula-celula por tripsina dio lugar no solo a la desestabilizacion de las E-cadherinas sino tambien a la inactivacion de integrinas, indicando que la senalizacion que mantiene la actividad de las integrinas es sensible al tratamiento enzimatico. El medio condicionados de celulas nutrientes (con suero rico en factores de crecimiento) no proporciono mucha proteccion frete a la muerte celular despues de la disociacion en celulas individuales. Ademas, el hecho de que la siembra de celulas a alta densidad tambien induce un incremento en la adhesion/supervivencia celulares sugiere que la senalizacion requerida para mantener la actividad de las integrinas puede no venir de factores secretados sino de interacciones ffsicas celula-celula. Tzv inhibe la endocitosis de E-cadherina, y asf protege a las celulas de la muerte en suspension. De forma similar, mediante la inhibicion de la endocitosis, Tzv puede mantener la actividad de las integrinas mediante la estabilizacion de la senalizacion desde la superficie celular. Por otra parte, Ptn puede mimetizar la senalizacion aguas abajo desde la interaccion ffsica celula-celula para activar la PKC. La identificacion futura de dianas de Ptn puede arrojar nueva luz sobre el mecanismo por el que la adhesion celula-celula regula la interaccion celula-ECM. Nuestra investigacion tambien ejemplifico la idoneidad y avance de cribado qmmico de alto rendimiento en estudios de celulas madre. Un desarrollo y aplicacion adicionales de dicha estrategia qrnmica en las celulas madre dara lugar sin dudas a la identificacion de nuevas moleculas pequenas adicionales e informacion mecamstica para controlar de manera precisa el destino de las celulas in vitro e in vivo.
Metodos
Cultivo celular
Las lmeas de ESC humanas H1, HUES7 y HUES9 se cultivaron en celulas nutrientes MEF irradiadas en DMEM-F12 suplementado con L-glutamina 2 mM, 1x aminoacidos no esenciales, 20% de reemplazo de suero (Invitrogen) y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico (Invitrogen). El cultivo de hESC qmmicamente definido y sin celulas nutrientes se ha descrito previamente (Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18):6907-6912 (2006)). Brevemente, las hESC se crecieron en placas de cultivo tisular recubiertas con Matrigel en N2B27-CDM (DMEM-F12 suplementado con 1x suplementos de N2, 1x suplementos B27, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 0.11 mM, 1x aminoacidos no esenciales, y 0.5 mg/ml de BSA (fraccion V)) y 20 ng/ml de bFGF. Las ESC humanas se subcultivaron cada 5-6 dfas con 0.05% de tripsina.
Para los ensayos de supervivencia clonal, se diluyeron hESC individuales hasta la densidad clonal y se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel. Para los ensayos de supervivencia a baja densidad, se sembraron 500 celulas en placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel. Para visualizar las colonias de hESC, los cultivos se fijaron en 4% de paraformaldehndo en PBS durante 5 min, se lavaron una vez en PBS, despues se tineron para detectar la actividad fosfatasa alcalina como se describe en las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas para ALP se contaron en un microscopio invertido.
Reactivos
El kit de deteccion de ALP y los anticuerpos frente a integrinas fueron de Chemicon. AG825 (inhibidor de Erb2), AG1478 (inhibidor de EGFR), PPP (inhibidor de IGFR1) se adquirieron en Calbiochem. Los anticuerpos producidos frente a la cola intracitoplasmica de E-cadherinas (Transduction Laboratories, Lexington, KY) se usaron para la inmunoprecipitacion. El anticuerpo TS2/16 fue de Pierce. Los anticuerpos frente al dominio extracelular de la molecula de E-cadherina fueron de Zymed (Carlsbad). Los anticuerpos frente a la quinasa regulada por senal extracelular/MAPK, EGFR1, ERB2, GADPH y la forma fosforilada de AKT fueron de Cell Signaling. El monoclonal antifosfotirosina de raton (clon 4G-10) fue de Upstate Biotechnology. Ptn y Tzv se anadieron al medio de cultivo a 2 |jM.
Cribado qmmico de alto rendimiento.
Las lmeas de hESC tripsinizables HUES7 o HUES9 se usaron para el cribado. Las hESC se cultivaron en medio qmmicamente definido en la placa recubierta con Matrigel como se ha descrito anteriormente. Despues, las celulas se recogieron con tripsina. Las hESC se sembraron en placas a 4 000 celulas por pocillo en placas de 384 pocillos recubiertas con Matrigel. Despues de 1 h cuando las celulas se establecieron, se anadieron compuestos de una biblioteca de 50000 heterociclos discretos a cada pocillo (concentracion final 2 j M). Despues de 6 dfas adicionales de incubacion, en los que el medio y los compuestos se cambiaron en el dfa 3, las celulas se tineron para detectar la expresion de ALP y se examinaron para detectar morfologfa de colonias compacta.
Analisis por inmunotincion.
La inmunotincion se realizo como se ha descrito previamente (Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18):6907-6912 (2006)). Brevemente, las celulas se fijaron con 4 % de paraformaldetndo a temperatura ambiente (RT) durante 15 min. Las celulas se incubaron entonces a RT en tampon de bloqueo durante 1 hora. La incubacion con anticuerpos primarios se llevo a cabo toda la noche a 4 °C. Se usaron los siguientes anticuerpos disponibles comercialmente a una concentracion de 1:100 en tampon de bloqueo: anti-SSEA4, anti-Oct4 (Chemicon??) anti-Nanog (Chemicon). La tincion se visualizo usando anticuerpos secundarios conjugados con FITC, cy3 o cy5 (Jackson ImmunoResearch).
Formacion de teratomas y cariotipado.
Los experimentos de formacion de teratomas se realizaron inyectando 3-5 millones de hESC (mantenidas en presencia de los compuestos Tvz o Ptn) bajo la capsula renal de ratones desnudos. Despues de 4-5 semanas, todos los ratones desarrollaron teratomas, que se retiraron y se analizaron inmunohistologicamente por The Scripps Research Institute Research Histology Service and Animal Resources. Las celulas tratadas con los compuestos se cariotiparon por bandeo G estandar en el Children's Hospital Oakland, Cytogenetics Laboratory. No se encontraron anormalidades cromosomicas en los 10 nucleos elegidos aleatoriamente
Ensayo TUNEL
Las hESC bajo diferentes tratamientos se disociaron con tripsina y se fijaron con 4 % de paraformaldehndo. La tincion se llevo a cabo segun las instrucciones del fabricante (MBL Laboratories, Watertown, MA). Despues de la tincion, las muestras se analizaron por citometna de flujo usando un citometro de flujo FACS Calibur (BD).
Analisis por citometffa de flujo
Para evaluar la expresion de E-cadherina, integrina activada y SSEA4, las celulas disociadas (3x105) se lavaron con PBS y se resuspendieron en PBS que contema 2 % de suero de cabra. Las celulas se incubaron entonces con el anticuerpo apropiado durante 1 h a 4 °C, se lavaron con la disolucion de bloqueo, y se marcaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C. Las celulas se lavaron entonces y se analizaron en un citometro de flujo FACS Calibur.
Ensayo de adhesion celular
Los ensayos de adhesion celular se realizaron en placas de microtitulacion de 96 pocillos recubiertas con Matrigel. Despues de la tripsina, las hESC se resuspendieron en el medio qmmicamente definido que contema los compuestos deseados. Las celulas se anadieron entonces a los pocillos de microtitulacion y se incubaron durante 3 h a 37 °C. Las celulas no unidas o poco unidas se retiraron agitando y lavando, y las celulas restantes se fijaron entonces inmediatamente. Los pocillos se lavaron 3 veces con 200 |jl de H2O, y las celulas unidas se tineron con Cristal Violeta (Sigma). Se midio entonces la absorbancia de cada pocillo a 570 nm. Para los experimentos con anticuerpos bloqueantes, las celulas se preincubaron con anticuerpos en hielo durante 30 min, y los ensayos de adhesion se realizaron en presencia de anticuerpos. Cada muestra se ensayo independientemente tres veces.
Ensayo de endocitosis
Las hESC se incubaron con 1.5 mg/ml de sulfosuccinimidil 2-(biotinamido) etil-ditioproprionato (sulfo-NHS-SS-biotina) (Pierce Chemical Co.) en hielo, seguido de lavado y parada. La endocitosis de la E-cadherina se inicio por la deplecion de Ca2+ y la incubacion a 37 °C. Las celulas se incubaron entonces en dos lavados de 20 min de disolucion de glutation (glutation 60 mM, NaCl 0.83 M, con NaOH 0.83 M y 1 % de BSA anadida antes del uso) a 0 °C, lo que elimino todos los grupos biotina de la superficie celular. Las protemas biotiniladas restantes se secuestraron en el interior de las celulas por endocitosis y se protegieron, por lo tanto, del arrastre de glutation. Las protemas biotiniladas se recuperaron en lechos de estreptavidina y se analizaron por SDS-PAGE. Las E-cadherinas se detectaron por inmunotransferencia. El nivel total de E-cadherina en la superficie antes de la endocitosis se uso como referencia.
Ejemplo 2: Síntesis de W-bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (Tiazovivina)
Síntesis qmmica
Usando los ejemplos de smtesis qmmica presentados mas adelante y los metodos de smtesis qmmica conocidos generalmente en la tecnica, un experto en la tecnica es capaz de preparar los compuestos descritos en la presente memoria (es decir, los compuestos de formula (II)).
Todos los productos qmmicos obtenidos comercialmente se usaron sin mas purificacion. Los espectros de RMN se registraron en un instrumento Bruker (400 MHz). Los desplazamientos qmmicos (8) se midieron en ppm y las constantes de acoplamiento (J) se reportan en Hz. La LCMS se realizo por cromatograffa lfquida en fase reversaespectrometro de masa sistema de LCMS Agilent 1100 con fuente de ionizacion API-ES. La cromatograffa ffquida de alta presion se realizo con una columna C18 con un gradiente lineal de 10 % de disolvente A (acetonitrilo con 0.035 % de acido trifluoroacetico) en disolvente B (agua con 0.05 % de acido trifluoroacetico) a 90 % de A en siete minutos y medio, seguido de dos minutos y medio de elucion con 90 % de A.
Síntesis de A/-bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (Tiazovivina)
Se cargo bencil amina en una resina de poliestireno funcionalizada con 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetilo (PAL) mediante aminacion reductora para proporcionar una resina PAL-bencil amina. Vease, Ding, S.; Grey, N. S. Wu, X.; Ding, Q.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1594-1596. Un matraz de reaccion que contema resina PAL-bencil amina (200 mg, 0.2 mmoles), acido 2-bromotiazol-4-carboxflico (83 mg, 0.4 mmoles), cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosffnico (BOP-Cl) (153 mg, 0.6 mmoles) y diisopropiletilamina (0.17 mL, 1 mmol) en DMF (3 mL) se agito durante 24 h a temperatura ambiente. La resina se lavo con metanol, diclorometano y se seco in vacuo para proporcionar resina PAL-A/- bencil-2-bromotiazol-4-carboxamida, que se anadio entonces a un vial de reaccion secado con llama, seguido de 4-aminopirimidina (95 mg, 1 mmol), Pd2(dba)3 (46 mg, 0.05 mmoles), Xantphos (87 mg, 0.15 mmoles) y NaO(Bu (192 mg, 2 mmoles). El vial se tapo de manera segura y se desgasifico, despues se cargo con argon y dioxano anhidro (1.5 mL). La reaccion se agito durante 24 horas a 90 °C. La resina se lavo con disolucion de dietilditiocarbamato de sodio (0.05 M en DMF), metanol y diclorometano y se seco in vacuo. La resina se escindio posteriormente con mezcla de escision TFA:CH2Ch:H2O (45:55:5) (2 mL) durante 2 h. La resina se filtro, el filtrado se recogio y se evaporo in vacuo para proporcionar el crudo que se purifico entonces por HPLC para proporcionar el compuesto del fftulo (30 mg, 48 %).
Figure imgf000024_0001
W-Bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida
Masa exacta calculada para C15H13N5OS: 311.1, encontrado LCMS m/z = 334.1 (M+Na+).
1H RMN (400 MHz, de-DMSO) 4.49 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 5.76 (s, 1H), 7.21-7.27 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 4H), 7.85 (s, 1H), 8.45 (t, J= 6.3 Hz, 1H), 8.51 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 8.94 (s, 1H).
Ejemplo 3: Síntesis de derivados de tiazovivina
Figure imgf000024_0002
Las aminas R1NH2 apropiadas se precargaron en resina de poliestireno funcionalizada con 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetilo (PAL) mediante aminacion reductora para proporcionar resina PAL-bencil amina. Una mezcla de resina PAL-bencil amina (200 mg, 0.2 mmoles, 1.0 eq.), acido 2-bromotiazol carboxflico 1 (0.4 mmoles, 2.0 eq.), cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BOP-Cl) (0.6 mmoles, 3.0 eq.) y diisopropiletilamina (1 mmol, 5.0 eq.) en DMF anhidro (3 mL) se agito durante 24 ha temperatura ambiente. La resina se lavo con metanol, diclorometano y se seco in vacuo, que se anadio entonces a un vial de reaccion secado con llama, seguido de la R2NH2 correspondiente (1 mmol, 5.0 eq.), Pd2(dba)3 (0.05 mmoles), Xantphos (0.15 mmoles) y NaO(Bu (2 mmoles, 10.0 eq.). El vial se tapo de forma segura y se desgasifico, despues se cargo con argon y dioxano anhidro(1.5 mL). La reaccion se agito durante 24 horas a 90 °C. La resina se lavo con disolucion de dietilditiocarbamato de sodio (0.05 M en DMF), metanol y diclorometano y se seco in vacuo. La resina se escindio posteriormente con mezcla de escision: TFA:CH2Ch:H2O = 45:55:5 (2 mL) durante 2 h. La resina se filtro y el filtrado se recogio y se evaporo in vacuo para proporcionar el crudo que se purifico entonces por HPLC para proporcionar el compuesto del tftulo 3 deseado. Los compuestos marcados con un asterisco (*) en la Tabla siguiente no son compuestos segun la formula (II).
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Ejemplo de referencia 4: Síntesis de /V-(ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino)bencenosulfonamida (Pirintegrina)
El matraz de reaccion que contema 2,4-dicloropirimidina (372 mg, 2.5 mmoles), 6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (489 mg, 3 mmoles) y diisopropiletilamina (0.52 mL, 3 mmoles) en n-butanol (10 mL) se calento a 40 °C toda la noche.
El disolvente se evaporo, y el residuo se purifico por cromatograffa en columna flash para proporcionar 2-cloro-4-(6-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (551 mg, 80 %). Este intermedio (250 mg, 0.91 mmoles) se disolvio entonces en diclorometano y se trato con BBr3 (1 M en diclorometano) (1 mL, 1 mmol) a -78 °C. La mezcla de reaccion se calento lentamente hasta temperatura ambiente y se agito durante 1 h, se vertio en agua, se extrajo con diclorometano. Los organicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron. El residuo se purifico por cromatograffa en columna flash para proporcionar 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (154 mg, 65 %). A una disolucion agitada de 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (29 mg, 0.11 mmoles) y 4-amino-A/-(ciclopropilmetil)bencenosulfonamida (27 mg, 0.12 mmoles) en DMF (0.5 mL) se anadio acido p-toluenosulfonico (2 M en dioxano) (55 pL, 0.11 mmoles). La mezcla de reaccion se agito a 90 °C toda la noche, despues se purifico por HPLC para proporcionar el compuesto del fftulo (27 mg, 56 %).
Figure imgf000027_0001
W-(Oclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino)bencenosulfonamida
Masa exacta calculada para C23H25N5O3S: 451.2, encontrado LCMS m/z = 452.3 (M+H+).
1H RMN (400 MHz, de-DMSO) 0.05-0.09 (m, 2H), 0.32-0.36 (m, 2H), 0.75-0.81 (m, 1H), 1.90-1.95 (m, 2H), 2.64 (t, J= 6.4 Hz, 4H), 3.93 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 6.59 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 6.66-6.70 (m, 2H), 7.25-7.28 (m, 1H), 7.64 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 7.74 (d, J= 8 .8 Hz, 2H), 7.82 (d, J= 8 .8 Hz, 2H), 8.01 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 10.79 (s, 1H).
Ejemplo de referenda 5: Síntesis de derivados de pirintegrina
Figure imgf000027_0002
A una mezcla de 2,4-dicloropirimidina 4 (1.0 eq.), R1NH2 (1.2 eq.) y diisopropiletilamina (1.2 eq.) en n-butanol se calento a 80 °C toda la noche. El disolvente se evaporo y el residuo se purifico por cromatograffa en columna flash hasta el intermedio 10 con un rendimiento excelente (> 80 %), que se trato entonces con R2NH2 (1.2 eq.) en DMF se anadio acido p-toluenosulfonico (2 M en dioxano) (1.2 eq.). La mezcla de reaccion se agito a 90 °C toda la noche, y despues se purifico directamente por HPLC preparativa para proporcionar los derivados de Pirintegrina 11 con rendimientos excelentes.
Figure imgf000027_0003
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Figure imgf000029_0001
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un compuesto que tiene la formula (II):
    Figure imgf000033_0001
    y celulas aisladas que comprenden celulas madre, celulas progenitoras, o celulas diferenciadas de ellas,
    en donde,
    L2 es alquileno C1-C6 no sustituido; e
    y es un numero entero de 0 a 3;
    z es un numero entero de 0 a 5;
    X es -N=, -CH= o -CR5=;
    R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    R3 es OR18, y R18 es hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido;
    R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9 , -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2N(R19)2, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un numero entero de 0 a 2; y R6 , R7 , R8 , R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    o un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
    2. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende una sal farmaceuticamente aceptable del compuesto que tiene la formula (II).
    3. Un medio de cultivo celular que comprende un compuesto de formula (II):
    Figure imgf000033_0002
    en donde,
    L2 es alquileno C1-C6 no sustituido; e
    y es un numero entero de 0 a 3;
    z es un numero entero de 0 a 5;
    X es -N=, -CH= o -CR5=;
    R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    R3 es OR18, y R18 es hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido;
    R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2N(R19)2, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un numero entero de 0 a 2; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    o un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
    4. El medio de cultivo celular de la reivindicacion 3, en donde el medio es un medio de cultivo celular qmmicamente definido.
    5. Un metodo para aumentar la supervivencia y proliferacion celulares, metodo que comprende:
    (a) obtener celulas aisladas que comprenden celulas madre, celulas progenitoras, o celulas diferenciadas de ellas; y (b) poner en contacto las celulas aisladas con una cantidad de un compuesto que tiene la formula (II) suficiente como para mejorar la supervivencia de las celulas al menos 2 veces comparado con la ausencia del compuesto:
    Figure imgf000034_0001
    en donde,
    L2 es alquileno C1-C6 no sustituido; e
    y es un numero entero de 0 a 3;
    z es un numero entero de 0 a 5;
    X es -N=, -CH= o -CR5=;
    R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    R3 es OR18, y R18 es hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido;
    R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2N(R19)2, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un numero entero de 0 a 2 ; y
    R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustitudo, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    o un racemato, diastereomero, tautomero, o un isomero geometrico del mismo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
    6. El metodo de la reivindicacion 5, en donde las celulas aisladas
    (a) estan en cultivos adherentes;
    (b) estan en cultivos en suspension;
    (c) son celulas individuales disociadas; o
    (d) son celulas agregadas.
    7. El metodo de la reivindicacion 5, en donde la etapa de puesta en contacto comprende ademas:
    subcultivar las celulas en cultivos que comprenden el compuesto que tiene la formula (II) durante al menos 5, 10, 15 o 2 0 , o mas generaciones.
    8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde los cultivos:
    (a) son qmmicamente definidos;
    (b) carecen de celulas nutrientes o condicionado de celulas nutrientes; y/o
    (c) carecen de productos animales.
    9. El metodo de la reivindicacion 5 o 7, en donde las celulas contactadas:
    (a) permanecen homogeneas;
    (b) mantienen la pluripotencia;
    (c) expresan marcadores de pluripotencia;
    (d) mantienen el cariotipo normal;
    (e) son capaces de autorrenovacion;
    (f) tienen una muerte celular reducida;
    (g) son capaces de formar teratomas;
    (h) tienen una diferenciacion celular reducida;
    (i) son capaces de diferenciarse en tres capas germinales primarias;
    (j) son capaces de diferenciacion espedfica de linaje;
    (k) son capaces de formar cuerpos embrioides despues de la disociacion en celulas individuales; y/o
    (l) tienen una capacidad de adhesion celular incrementada despues de la disociacion en celulas individuales.
    10. El metodo de la reivindicacion 5, en donde la etapa de puesta en contacto comprende ademas:
    (a) modular el nivel de E-cadherinas de la superficie celular que comprende (i) estabilizar las E-cadherinas en la superficie celular; y/o (ii) inhibir la endocitosis de las E-cadherinas; o
    (b) modular la actividad de las integrinas que comprende (i) incrementar la expresion de las integrinas; y/o (ii) convertir a las integrinas en una conformacion activa.
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