CN102307882B - 干细胞培养 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于稳定细胞的化合物和它们的使用方法。

Description

干细胞培养
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年12月3日提交的美国临时申请号61/200,808的优先权，将该申请的全部内容结合入本文中用于所有目的。
发明背景
胚胎干细胞(ESCs)是多能细胞，其具有无限地自我更新和分化成身体的所有细胞类型的能力(Thomson,J.A.等,Science(科学)282(5391):1145-1147(1998)；Thomson,J.A.&Odorico,J.S.,Trends Biotechnol(生物技术趋势)18(2):53-57(2000))。此能力提供了希望，即有一天ESC将被用来替换损失的和损伤的细胞，并且提供常规药物所不能达到的治疗。然而，为了充分实现hESC的临床潜力，需要建立化学成分限定的、无饲养细胞-和动物产品、稳定的培养条件。尽管已经报道了几种化学成分限定培养基(Yao,S.等.,Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊)103(18):6907-6912(2006)；Lu,J.等.,Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊)103(15):5688-5693(2006)；Ludwig,T.E.等.,Nat Biotechnol(自然生物技术)24(2):185-187(2006)),但由于细胞在它们中的性能欠佳，它们大多仍然是不令人满意的。尤其是在这些条件下，当细胞通过胰蛋白酶传代为单一细胞时，它们经历广泛的细胞死亡。许多介导hESC自我更新的信号传导途径是已知的，包括FGF,TGF-β,Wnt,等(James,D.等.,Development(发育)132(6):1273-1282(2005)；Xu,R.H.等.,Nat Methods(自然方法)2(3):185-190(2005)；Beattie,G.M.等.,Stem Cells(干细胞)23(4):489-495(2005)；Greber,B.,Lehrach,H.,&Adjaye,J.,Stem Cells(干细胞)25(2):455-464(2007)；Sato,N.等.,Nat Med(自然-医学)10(l):55-63(2004))。然而，它们中没有一个似乎能在此过程中充当存活因子，其分子机制是复杂的。
发明简述
本发明提供了具有下式的化合物：
其中环A是取代的或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基；
环B是取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基；
L1是-C(O)-NR2-或-C(O)-NR2-；
L2是键，取代或未被取代的亚烷基或取代或未被取代的杂亚烷基；并且
R1和R2独立地为氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基。
在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的苯基。
在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的吡唑基,取代或未被取代的呋喃基,取代或未被取代的咪唑基,取代或未被取代的异噁唑基,取代或未被取代的噁二唑基,取代或未被取代的噁唑基,取代或未被取代的吡咯基,取代或未被取代的吡啶基,取代或未被取代的嘧啶基,取代或未被取代的哒嗪基,取代或未被取代的噻唑基,取代或未被取代的三唑基,取代或未被取代的噻吩基,取代或未被取代的二氢噻吩-吡唑基,取代或未被取代的硫茚基,取代或未被取代的咔唑基,取代或未被取代的苯并噻吩基,取代或未被取代的苯并呋喃基,取代或未被取代的吲哚基,取代或未被取代的喹啉基,取代或未被取代的苯并三唑基,取代或未被取代的苯并噻唑基,取代或未被取代的苯并噁唑基,取代或未被取代的苯并咪唑基,取代或未被取代的异喹啉基,取代或未被取代的异吲哚基,取代或未被取代的吖啶基,取代或未被取代的苯并异噻唑基(benzoisazolyl)，或取代或未被取代的二甲基乙内酰脲。
在一些实施方案中，L2是取代或未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是亚甲基。
在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基；环B是取代或未被取代的杂芳基；R1是氢；并且L2是未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，R2是氢。
在一些实施方案中，R1是氢或是未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，R1是氢。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
其中，y是0至3的整数；z是0至5的整数；X是-N＝,-CH＝或-CR5＝；R3，R4和R5独立地是CN,S(O)nR6,NR7R8,C(O)R9,NR10-C(O)R11,NR12-C(O)-OR13,-C(O)NR14R15,-NR16S(O)2R17,-OR18,-S(O)2NR19,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基,其中n是0至2的整数，其中如果z大于1，两个R3结构部分任选地连接在一起形成取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基；和R6,R7,R8,R9,R10,R11,R12,R13,R14,R15,R16,R17,R18和R19独立地是氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，L2是取代或未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是亚甲基。
在一些实施方案中，X是-N＝或-CH＝。
在一些实施方案中，z是2且邻近顶点处的两个R3结构部分连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基。
在一些实施方案中，z是1。
在一些实施方案中，y是0或1。
在一些实施方案中，R3是-OR18,且R18是氢或未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是亚甲基；X是-N＝或-CH＝；R1是氢；并且y和z是0。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
本发明还提供了具有下式的化合物：
其中
环D是取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基；
L3是-C(O)NH-或-S(O)2NH-；
R20是取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基；
R21是-NR22R23或-OR24；
R22和R23独立地是氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,取代或未被取代的杂芳基,或连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基或取代或未被取代的杂芳基；
R24是取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,取代或未被取代的杂芳基,或连接在一起形成取代或未被取代的环烷基或取代或未被取代的杂环烷基。
在一些实施方案中，环D是取代或未被取代的苯基。
在一些实施方案中，R20是取代或未被取代的烷基或取代或未被取代的环烷基。
在一些实施方案中，R20是取代或未被取代的C1-C10烷基或取代或未被取代的3–7元环烷基。
在一些实施方案中，R20是取代或未被取代的C1-C5烷基或取代或未被取代的3－6元环烷基。
在一些实施方案中，R20是未被取代的C1-C5烷基或未被取代的3-6元环烷基。
在一些实施方案中，R22是氢；和R23是取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R22是氢；和R23是取代或未被取代的取代或未被取代的芳基。
在一些实施方案中，R22和R23连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R22和R23连接在一起形成取代或未被取代的吡咯基,取代或未被取代的异二氢氮杂茚基,取代或未被取代的哌啶基,或取代或未被取代的四氢喹啉基。
在一些实施方案中，化合物具有下式：
其中w是0至1的整数；q是0至7的整数；R25,R26,R27和R28独立地为-CN,-NR29R30,-C(O)R31,-NR32-C(O)R33,-NR34-C(O)-OR35,-C(O)NR36R37,-NR38S(O)2R39,-OR40,-S(O)2NR41,-S(O)vR42,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基,其中v是0至2的整数；R29,R30,R31,R32,R33,R34,R35,R36,R37,R38,R39,R40,R41和R42独立地为氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基,其中R25和R26,或R26和R27,可以连接形成取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R28为-OR40,其中R40为氢或未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，R40为氢或未被取代的C1-C5烷基。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
在一些实施方案中，R20为未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，R28为-OR40,其中R40为氢或未被取代的C1-C10烷基，或被取代或未被取代的C3-C6环烷基取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，q是1。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
本发明还提供了体外稳定分离的细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括使动物细胞与足量的式I或III化合物接触以稳定所述细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在所述化合物的存在下改变所述细胞的条件或环境，其中在缺少所述化合物的条件下所述改变步骤会导致细胞的细胞编程变化。在一些实施方案中，所述改变步骤包括使所述细胞解冻和使所述细胞与其他细胞解离的至少一个。
在一些实施方案中，所述细胞是贴壁的。在一些实施方案中，所述细胞处于混悬液中。
在一些实施方案中，该方法还包括确定所述细胞的表型。
在一些实施方案中，该方法包括从动物中分离所述细胞。在一些实施方案中，所述动物是人。在一些实施方案中，所述动物是非人动物。
在一些实施方案中，所述化合物是式I化合物。在一些实施方案中，所述化合物是式III化合物。
本发明还提供了改善动物的病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用足量的式I或III化合物于需要所述方法的动物以改善所述病症。
在一些实施方案中，所述病症选自由组织损伤、卒中和癌症组成的组。在一些实施方案中，所述组织选自由胰腺、肝、肠、肺和肾组成的组。
在一些实施方案中，所述病症包括移植组织或器官的至少部分排斥，在一些实施方案中，所述移植包括骨髓、脐带血、纯化的造血干细胞或祖细胞、心脏细胞、神经细胞、胰腺β细胞或肝细胞的移植。
在一些实施方案中，所述化合物是式I化合物。在一些实施方案中，所述化合物是式III化合物。
本发明还提供了维持细胞存活的方法。在一些实施方案中，该方法包括产生分离的非人动物干细胞、祖细胞或分化细胞；和诱导所述分离的细胞中E-钙黏着蛋白的稳定，从而维持细胞存活。
在一些实施方案中，所述诱导步骤包括使所述分离的干细胞与足以提高分离的干细胞的存活率的量的式I化合物接触，与缺少所述化合物的情况相比，所述式I化合物的量将分离的干细胞的存活率提高至少2倍。
在一些实施方案中，所述诱导步骤包括在表面上培养所述分离的干细胞，其中包含E-钙黏着蛋白胞外结构域的分子栓系(tether)在所述表面上。
本发明还提供了分离的细胞群，其包含足以提高分离的细胞的存活率的量的稳定所述细胞中的E-钙黏着蛋白的分子，与缺少所述分子的情况相比，所述分子的量将分离的细胞的存活率提高至少2倍。
在一些实施方案中，所述分子包含式I化合物。
在一些实施方案中，所述细胞选自由干细胞、诱导的干细胞、多能干细胞、祖细胞、分化细胞、β细胞和成纤维细胞组成的组。
本发明还提供了分离的细胞群，其包含足以提高分离的细胞的存活率的量的式I或III化合物，与缺少所述化合物的情况相比，所述式I或III化合物的量将分离的细胞的存活率提高至少2倍。
在一些实施方案中，所述细胞选自由干细胞、诱导的干细胞、多能干细胞、祖细胞、分化细胞、β细胞和成纤维细胞组成的组。
本发明还提供了维持干细胞存活的方法。在一些实施方案中，该方法包括产生分离的细胞；和激活所述分离的细胞中的蛋白激酶C(PKC)，从而维持细胞存活。
在一些实施方案中，所述激活步骤包括使足量的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13–乙酸酯(PMA)与所述分离的细胞接触，从而与缺少PMA时的存活率相比提高所述细胞的存活率。
本发明还提供了分离的干细胞群，其包含足以提高分离的干细胞的存活率的量的蛋白激酶C激活物，与缺少所述PKC激活物的情况相比，所述蛋白激酶C激活物将分离的干细胞的存活率提高至少2倍。
定义
本文使用的缩写具有化学和生物学领域中它们的常规含义。
术语“稳定细胞”是指基本上减少或消除细胞对该细胞所暴露的条件或环境中的变化的反应。在此上下文中的“基本上减少”的含义是该反应比在缺少稳定成分(例如，本发明的化合物)的条件下发生的反应少至少50％。
术语“改变细胞的条件或环境”是指改变温度，培养基(例如，碳源，盐浓度，生长因子),使细胞解离成分离的细胞，使细胞解冻，或否则改变细胞的直接环境的因素。如本文所讨论的，改变细胞的条件或环境经常改变细胞的表型或细胞编程。例如，干细胞，以及一些其他细胞，当分离时将响应于某些变化诸如分离、解冻等而分化和/或死亡。因此，改变条件可以减少或消除细胞活力，而如本文所述的稳定的细胞在相同的条件变化下活力基本上不减小。细胞编程的变化也可以作为细胞对特定刺激的反应来监测，所述反应对某种细胞类型是特征性的和/或通过一个或一组特征性基因或基因产物的表达来监测。作为非限制性实例，已知人多能干细胞表达下面列表中的至少一些标志物和任选地全部标志物：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,TRA-2-49/6E,ALP,Sox2,E-钙黏着蛋白(E-钙黏着蛋白),UTF-1,Oct4,Rex1和Nanog。当干细胞丧失多能性或否则分化时这样的表达可能会改变。稳定的人多能干细胞在条件变化后将保持其特征性表达谱。
“分离的”细胞已经与生物体的其他细胞基本上分离或从其中纯化出来。
术语使细胞“解离(dissociating)”是指将细胞与其他细胞或与表面(例如，培养板表面)分离的过程。例如，细胞可以通过机械或酶学方法从动物或组织中解离。备选地，体外聚集的细胞可以彼此解离。还在另一种备选方法中，贴壁细胞从培养板或其他表面解离。因此解离可以涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和基底(例如，培养表面)之间的相互作用或破坏细胞之间的ECM。
“确定细胞的表型”是指评价细胞的质量或特性。表型可以包括，例如，细胞类型-特征性基因表达，或基因表达谱，细胞对刺激或环境的反应，分化或脱分化的能力，具有特殊的形态学等。
当化学取代基由它们的常规化学结构式指定，从左向右书写时，它们同样包涵从右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-等同于-OCH2-。
术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，除非另外指明，是指直链(即，无支链)或支链，或其组合，其可以是完全饱和的，单-或多不饱和的，并且可以包括二价-和多价基团，具有标注的碳原子数(即，C1-C10是指1-10个碳)。饱和烃基的实例包括，但不限于，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基的基团，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括，但不限于，乙烯基,2-丙烯基,丁烯基,2-异戊烯基,2-(丁二烯基),2,4-戊二烯基,3-(1,4-戊二烯基),乙炔基,1-和3-丙炔基,3-丁炔基,和高级同系物和异构体。优选的烷基是C1-6烷基。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷基的二价基团，作为实例，但不限于，-CH2CH2CH2CH2-。典型地，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，在本发明中作为实例的是具有10个以下碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，通常具有8个以下碳原子。优选的亚烷基是C1-6亚烷基。
术语“杂烷基”本身或与另一术语组合，除非另外说明，是指稳定的直链或支链，或环状烃基，或其组合，其由至少一个碳原子和至少一个杂原子组成，所述杂原子选自由O、N、P、Si和S组成的组，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子O,N,P和S和Si可以置于杂烷基的任何内部位置处或烷基与分子的剩余部分连接的位置处。实例包括，但不限于，-CH2-CH2-O-CH3,-CH2-CH2-NH-CH3,-CH2-CH2-N(CH3)-CH3,-CH2-S-CH2-CH3,-CH2-CH2，-S(O)-CH3,-CH2-CH2-S(O)2-CH3,-CH＝CH-O-CH3,-Si(CH3)3,-CH2-CH＝N-OCH3,-CH＝CH-N(CH3)-CH3,O-CH3,-O-CH2-CH3,和-CN。至多两个杂原子可以是连续的，诸如，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。同样，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自杂烷基的二价基团，作为实例，但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基,杂原子还可以占用链末端之一或两个链末端(例如，亚烷基氧基，亚烷基二氧基，亚烷基氨基,亚烷基二氨基，等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的结构式书写的方向也不表示该连接基团的定向。例如，式-C(O)2R'-代表-C(O)2R'-和-R'C(O)2-两者。如上所述，本文使用的杂烷基包括通过杂原子连接至分子的其余部分的那些基团，诸如-C(O)R',-C(O)NR',-NR'R",-OR',-SR',和/或-SO2R'。在描述“杂烷基”，紧接着列举具体的杂烷基的情况下，诸如-NR'R″等，要理解术语杂烷基和-NR'R"不是重复的或相互排斥的。而是，具体的杂烷基的描述增加了清楚性。因此，在本文中术语“杂烷基”不应该被解释为不包括具体的杂烷基，诸如-NR'R″等。优选的杂烷基是C1-6杂烷基。
本文使用的术语“杂亚烷基”是指如上所定义的连接至少两个其他基团的杂烷基。与杂亚烷基连接的两个结构部分可以连接至杂亚烷基的同一原子或不同的原子。优选的杂亚烷基是C1-6杂亚烷基。
术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合，除非另外说明，分别是指“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占用杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括，但不限于，环戊基,环己基,1-环己烯基,3-环己烯基,环庚基等。杂环烷基的实例包括，但不限于,1-(1,2,5,6-四氢吡啶基),1-哌啶基,2-哌啶基,3-哌啶基,4-吗啉基,3-吗啉基,四氢呋喃-2-基,四氢呋喃-3-基,四氢噻吩-2-基,四氢噻吩-3-基,1-哌嗪基,2-哌嗪基等。“环亚烷基”和“杂环亚烷基”是指分别衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。环烷基和杂环烷基可以是C3-8环烷基和C3-8杂环烷基，或C5-8环烷基和C5-8杂环烷基。
术语“卤(halo)”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分，除非另外说明，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语诸如“卤烷基”的含义包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”的含义包括，但不限于，三氟甲基,2,2,2-三氟乙基,4-氯丁基,3-溴丙基等。
术语“芳基”，除非另外说明，是指多不饱和的芳族烃取代基，其可以是单环或多环(优选1-3个环)，所述多个环稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，且氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过碳或杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基,1-萘基,2-萘基,4-联苯基,1-吡咯基,2-吡咯基,3-吡咯基,3-吡唑基,2-咪唑基,4-咪唑基,吡嗪基,2-噁唑基,4-噁唑基,2-苯基-4-噁唑基,5-噁唑基,3-异噁唑基,4-异噁唑基,5-异噁唑基,2-噻唑基,4-噻唑基,5-噻唑基,2-呋喃基,3-呋喃基,2-噻吩基,3-噻吩基,2-吡啶基,3-吡啶基,4-吡啶基,2-嘧啶基,4-嘧啶基,5-苯并噻唑基,嘌呤基,2-苯并咪唑基,5-吲哚基,1-异喹啉基,5-异喹啉基,2-喹喔啉基,5-喹喔啉基,3-喹啉基,和6-喹啉基。对于上面提到的芳环系和杂芳环系的每一种的取代基选自下述可接受的取代基的组。“亚芳基”和“杂亚芳基”是指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基团。本发明的芳基优选具有5-12个环成员，更优选6-10个环成员。本发明的杂芳基优选具有5-12个环成员，更优选5-10个环成员。
简言之，术语“芳基”当与其他术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)组合使用时包括如上面定义的芳环和杂芳环两者。因此，术语“芳基烷基”的含义包括其中芳基与烷基连接的那些基团(例如，苄基,苯乙基,吡啶基甲基等)包括其中碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧原子替换的那些烷基(例如，苯氧甲基,2-吡啶氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基，等)。
本文使用的术语“氧代(oxo)”是指与碳原子双键键合的氧。
本文使用的术语“烷基磺酰基”是指具有结构式-S(O2)-R'的结构部分，其中R'是如上所定义的烷基。R'可以具有指定数目的碳(例如，"C1-C4烷基磺酰基")。
上述术语的每一个(例如，“烷基”，“杂烷基”，“芳基”和“杂芳基”)的含义包括指定基团的取代的和未被取代形式两者。下面提供每种类型基团的示例性取代基。
烷基和杂烷基(包括经常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于下列的多种基团中的一种或多种：-OR',＝O,＝NR',＝N-OR',-NR'R",-SR',-卤素,-SiR'R"R″'，-OC(O)R',-C(O)R',-CO2R',-CONR'R",-OC(O)NR'R",-NR"C(O)R',-NR'-C(O)NR"R"',-NR"C(O)2R',-NR-C(NR'R"R'")＝NR"",-NR-C(NR'R")＝NR'",-S(O)R',-S(O)2R',-S(O)2NR'R",-NRSO2R',-CN和-NO2，其数量范围为0至(2m'+1)，其中m'是所述基团中碳原子的总数。R',R",R'"和R""各自优选地独立地指氢,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基),取代或未被取代的烷基,烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，当R',R",R'"和R""基团中的超过一个存在时每个R基团独立地选择为每个R',R",R'"和R""基团。当R'和R"与同一个氮原子连接时，它们可以与氮原子组合形成4-,5-,6-,或7-元环。例如，-NR'R"的含义包括，但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面对取代基的讨论，本领域技术人员将理解术语“烷基”的含义包括这样的基团，其包含与氢基团以外的基团结合的碳原子，诸如卤烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3,-C(O)CF3,-C(O)CH2OCH3,等)。
类似于对烷基基团所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基有所变化，并且选自，例如：卤素,-OR',-NR'R",-SR',-卤素,-SiR'R"R"',-OC(O)R',-C(O)R',-CO2R',-CONR'R",-OC(O)NR'R",-NR"C(O)R',-NR'-C(O)NR"R"',-NR"C(O)2R',-NR-C(NR'R"R'")＝NR"",-NR-C(NR'R")＝NR'",-S(O)R',-S(O)2R',-S(O)2NR'R",-NRSO2R',-CN和-NO2,-R',-N3,-CH(Ph)2,氟(C1-C4)烷氧基,和氟(C1-C4)烷基，其数量范围为0至芳环系上开放原子价的总数；并且其中R',R",R'"和R""优选独立地选自氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基和取代或未被取代的杂芳基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，当R',R",R'"和R""基团中的超过一个存在时每个R基团独立地选择为每个R',R",R'"和R""基团。
芳环或杂芳环的邻近原子上的取代基中的两个可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-,-O-,-CRR'-或单键，并且q为0至3的整数。备选地，芳环或杂芳环的邻近原子上的取代基中的两个可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地是-CRR'-,-O-,-NR-,-S-,-S(O)-,-S(O)2-,-S(O)2NR'-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键替换。备选地，芳环或杂芳环的邻近原子上的取代基中的两个可以任选地被式-(CRR')s-X'-(C"R'")d-的取代基替换，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X'是-O-,-NR'-,-S-,-S(O)-,-S(O)2-,或-S(O)2NR'-。取代基R,R',R"和R'"优选独立地选自氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,和取代或未被取代的杂芳基。
本文使用的术语“杂原子”或“环杂原子”的含义包括氧(O),氮(N),硫(S),磷(P),和硅(Si)。
本文使用的“取代基”是指选自下列结构部分的基团：
(A)-OH,-NH2,-SH,-CN,-CF3,-NO2,氧代,卤素,未被取代的烷基，未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,未被取代的杂环烷基,未被取代的芳基,未被取代的杂芳基,和
(B)烷基,杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基，和杂芳基,它们被选自下列的至少一个取代基取代：
(i)氧代,-OH,-NH2,-SH,-CN,-CF3,-NO2,卤素,未被取代的烷基,未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,未被取代的杂环烷基,未被取代的芳基,未被取代的杂芳基,和
(ii)烷基,杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,和杂芳基,它们被选自下列的至少一个取代基取代：
(a)氧代,-OH,-NH2,-SH,-CN,-CF3,-NO2,卤素,未被取代的烷基,未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,未被取代的杂环烷基,未被取代的芳基,未被取代的杂芳基,和
(b)烷基,杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,或杂芳基,它们被选自下列的至少一个取代基取代：氧代,-OH,-NH2,-SH,-CN,-CF3,-NO2,卤素,未被取代的烷基,未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,未被取代的杂环烷基,未被取代的芳基，和未被取代的杂芳基。
本文使用的“尺寸限制的取代基”或“尺寸限制的取代基团”是指选自上面对“取代基团”所述的所有取代基的基团，其中每个取代或未被取代的烷基是取代或未被取代的C1-C20烷基，每个取代或未被取代的杂烷基是取代或未被取代的2-20元杂烷基,每个取代或未被取代的环烷基是取代或未被取代的C4-C8环烷基,且每个取代或未被取代的杂环烷基是取代或未被取代的4-8元杂环烷基。
本文使用的“低级取代基”或“低级取代基团”是指选自上面对“取代基团”所述的所有取代基的基团，其中每个取代或未被取代的烷基是取代或未被取代的C1-C8烷基,每个取代或未被取代的杂烷基是取代或未被取代的2-8元杂烷基,每个取代或未被取代的环烷基是取代或未被取代的C5-C7环烷基,且每个取代或未被取代的杂环烷基是取代或未被取代的5-7元杂环烷基。
术语“药用盐”的含义包括活性化合物的盐，其使用相对无毒性的酸或碱制备，这取决于本文所述的化合物中出现的特定取代基。当本发明的化合物包含相对酸性的官能团时，通过将此类化合物的中性形式与足量的所需碱以纯净的形式或在合适的惰性溶剂中接触可以获得碱加成盐。药学可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐，或类似盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能团时，通过将此类化合物的中性形式与足量的所需酸以纯净的形式或在合适的惰性溶剂中接触可以获得酸加成盐。药学可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的盐，以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、酞酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐，如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge等，“药物盐(PharmaceuticalSalts)”，Journal of Pharmaceutical Science(药物科学杂志)，1977,66,1-19)。本发明的一些特殊的化合物同时含有碱性和酸性官能团，这允许该化合物转化成碱或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以作为与药学可接受的酸的盐存在。本发明包括这样的盐。此类盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐,(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，和与氨基酸诸如谷氨酸的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
所述化合物的中性形式可优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式在某些物理特性上有别于许多盐形式，如在极性溶剂中的溶解度。
除了盐形式，本发明提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是那些在生理条件下容易进行化学变化以提供本发明化合物的化合物。此外，在离体环境下通过化学或生化方法可使前药转化成本发明的化合物。例如，当将前药置于含有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂储库中时它可缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的一些化合物可以非溶剂化的形式以及溶剂化的形式存在，包括水合物形式。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并同样包含在本发明的范围之内。本发明的一些化合物可以多晶型或无定形形式存在。通常，对于本发明所考虑的用途来说，所有的物理形式都是等价的且意在包括在本发明的范围之内。
本发明的一些化合物含有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和单独的异构体都包含在本发明的范围之内。本发明的化合物不包括本领域中已知太不稳定从而不能合成和/或分离的那些化合物。
本发明的化合物还可以在一个或多个构成该化合物的原子上含有非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素放射性标记该化合物，诸如例如用氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)进行标记。本发明化合物所有的同位素变体，无论是否是放射性同位素，都包括在本发明的范围之内。
附图简述
图1.在单细胞解离后新合成的小分子极大地增加了hESC存活率而不损害其长期的自我更新和完全发育潜能，(a)Thiazovivin/Tzv和Pyrintegrin/Ptn如所示那样的化学结构,(b)已经从低密度接种和如所示那样处理的解离的单细胞生长成的hESC集落的ALP染色,(c)ALP阳性集落相对于全部初始接种细胞的比率,(d)如所示那样在含有Ptn或Tzv的培养基中长期培养的hESC的免疫染色,(e)由培养在含有Tzv(i,ii)或Ptn(iii,iv)的培养基中的长期扩增的hESC形成的5周畸胎瘤的切片。神经上皮(外胚层),软骨(中胚层),和单层上皮(内胚层)(i)；神经上皮(外胚层),单层上皮和肝型上皮(内胚层)(ii)；神经上皮(外胚层),软骨(中胚层)和管状上皮(内胚层)(iii)；神经上皮(外胚层),骨骼肌(中胚层),和管状上皮(内胚层)(iv).(f)在化合物Ptn或Tzv的存在下繁殖超过20代后hESC的G带带型分析。如果没有指定，所有上面的hESC生长在不含饲养细胞(feeder free)的基质胶(Matrigel)包被板上的化学成分限定培养基中。
图2.在细胞解离后Tzv稳定E-钙黏着蛋白以保护hESC免于在悬浮培养中死亡，(a)在用或不用Ptn或Tzv处理的基质胶上或混悬液中生长的解离的hESC的细胞死亡分析。(b)在用指示分子处理的未包被板上生长的hESC的相差图像,(c)用针对E-钙黏着蛋白或GFP的特异性siRNA转染的hESC中的E-钙黏着蛋白的Western印迹分析。(d)通过TUNEL染色对在Tzv的存在下用针对E-钙黏着蛋白或GFP的特异性siRNA转染的解离的hESC进行的细胞死亡分析和(e)对在Tzv的存在下用针对E-钙黏着蛋白或GFP的特异性siRNA转染的解离的hESC进行的ALP染色。(f)在胰蛋白酶消化前后hESC中的全长E-钙黏着蛋白的Western印迹分析,(g)在胰蛋白酶解离和用DMSO,Tzv,或Ptn处理指示的时间后hESC中全长E-钙黏着蛋白表达的时程Western印迹分析。(h)在Tzv的存在下在胰蛋白酶处理后hESC中E-钙黏着蛋白表面水平的流式细胞分析。DMSO用作对照，(i)在用或不用Tzv处理的hESC中E-钙黏着蛋白的半定量RT-PCR。(j)在缺少或存在Tzv的条件下的E-钙黏着蛋白胞吞作用分析。(k)在BSA包被板或不同浓度的E-cad-Fc嵌合体包被板上生长的hESC的细胞存活分析。
图3.Ptn和Tzv通过维持和再激活整联蛋白活性保护hESC在解离后的贴壁培养中免于发生细胞死亡,(a)采用不同时程的Ptn和Tzv处理，在基质胶上生长的hESC的生长曲线。1组,仅在第一个24h期间进行Ptn处理；2组,在整个培养期期间进行连续的Ptn处理；3组，仅在第一个24h期间进行Tzv处理；4组,在培养期间进行连续的Tzv处理；对于每种条件，6孔板的每孔接种10×104解离细胞,(b)在不同的基质上接种并用指示的化合物处理后12小时hESC的相差图像,(c)解离的hESC接种在基质胶包被板上并如指示的那样在化合物的存在下或在化合物以及整联蛋白βl封闭抗体的存在下贴壁3h。如材料和方法中所述计算粘附的百分比，(d)在胰蛋白酶处理前后hESC表达的整联蛋白βl的Western印迹分析，(e)在胰蛋白酶解离和用DMSO,Tzv,或Ptn处理指示的时间后hESC中整联蛋白表达的时程Western印迹分析,(f,g)在用Tzv或Ptn处理后胰蛋白酶解离的hESC中处于活性构象的整联蛋白β1的流式细胞分析(f),和免疫染色(g)分析。(h,i)用或不用β1-激活抗体TS2/16处理的hESC的细胞粘附(h)和ALP染色(i)。(j)用Tzv或Ptn结合或不结合PKC抑制剂处理的hESC的细胞粘附，(k)在用或不用PMA(10nM)处理的hESC中处于活性构象的β1整联蛋白的免疫染色。(l,m)用指示的化合物处理的hESC的细胞粘附(l)和ALP染色(m)。
图4.生长因子受体介导的PI-3K和ERK分别是从hESC小生境(niche)中产生的主要的存活和抗分化信号传导,(a)在基质胶上接种并如指示的那样处理的解离的hESC的细胞死亡分析,(b)显示在用Ptn处理2h的hESC中不同的生长因子受体的磷酸化状态的Western印迹。DMSO用作对照，(c)用指示的条件处理的处于悬液中的解离的hESC的细胞死亡分析,(d)显示E-钙黏着蛋白与EGFR1和Erb2的相互作用的免疫沉淀。(e)显示在用Ptn处理指示的时期的hESC中AKT磷酸化状态的Western印迹。(f)显示在Ptn的存在下或在Ptn以及整联蛋白β1封闭抗体的存在下AKT和ERK磷酸化状态的Western印迹，(g)显示在用Ptn或用Ptn以及指示的受体抑制剂处理的hESC中AKT磷酸化状态的Western印迹,(h)用Ptn或用Ptn以及PI-3K抑制剂，或MEK抑制剂处理24h的hESC的细胞死亡分析。(i)在用MEK抑制剂处理后SSEA4阴性细胞的百分比。
图5A和5B显示本发明的化合物，包括thiazovivin及其衍生物。
图6A,6B,6C,6D,6E,6F,6G,6H,61,6J,6K,6L,6M,6N,6O,6P,6Q,6R,6S,6T,6U,6V,6W,6X,6Y,6Z,6AA,6AB和6AC显示本发明的化合物，包括pyrintegrin及其衍生物。
详述
I.介绍
本发明提供了新型化合物以及它们的使用方法。提供了两类小分子化学化合物，它们防止细胞分化并促进细胞存活，包括但不限于，当细胞被分离或另外地在其正常培养基或组织环境外时。所述化合物以稍有不同的机制工作，但两者均可用作多种不同疾病适应证(包括但不限于，癌症，组织损伤，和卒中)的预防性和治疗性化合物。
II.促进细胞存活和/或抗分化的化合物
在一个方面，提供了促进细胞存活和/或抗分化的化合物。在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
在式(I)中，环A是取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。环B是取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基。
L1是-C(O)-NR2-或-NR2-C(O)-。L2是键，取代或未被取代的亚烷基或取代或未被取代的杂亚烷基。
R1和R2独立地为氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基。环A还可以是取代或未被取代的苯基。
在其他实施方案中，环B是取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基。环B还可以是取代或未被取代的杂芳基。还在其他实施方案中，环B是取代或未被取代的吡唑基,取代或未被取代的呋喃基,取代或未被取代的咪唑基,取代或未被取代的异噁唑基,取代或未被取代的噁二唑基,取代或未被取代的噁唑基,取代或未被取代的吡咯基,取代或未被取代的吡啶基,取代或未被取代的嘧啶基,取代或未被取代的哒嗪基,取代或未被取代的噻唑基,取代或未被取代的三唑基,取代或未被取代的噻吩基,取代或未被取代的二氢噻吩-吡唑基,取代或未被取代的硫茚基,取代或未被取代的咔唑基,取代或未被取代的苯并噻吩基,取代或未被取代的苯并呋喃基,取代或未被取代的吲哚基,取代或未被取代的喹啉基,取代或未被取代的苯并三唑基,取代或未被取代的苯并噻唑基,取代或未被取代的苯并噁唑基,取代或未被取代的苯并咪唑基,取代或未被取代的异喹啉基,取代或未被取代的异吲哚基,取代或未被取代的吖啶基,取代或未被取代的苯并异噻唑基(benzoisazolyl),或取代或未被取代的二甲基乙内酰脲。
L2可以是取代或未被取代的C1-C10烷基。在一些实施方案中，L2是未被取代的C1-C10烷基。L2还可以是取代或未被取代的亚甲基(例如，未被取代的亚甲基)。
R2可以是氢。R1可以是氢或未被取代的C1-C10烷基。在一些实施方案中，R1只是氢。
在式(I)的一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基,环B是取代或未被取代的杂芳基,R1是氢，L2是未被取代的C1-C10烷基。
在另一个实施方案中，促进细胞存活和/或抗分化的化合物具有下式：
在式(II)中，y是0至3的整数且z是0至5的整数。X是-N＝,-CH＝或-CR5＝。R1和L2如上面式(I)的定义中所定义。
R3，R4和R5独立地是-CN,-S(O)nR6,-NR7R8,-C(O)R9,-NR10-C(O)R11,-NR12-C(O)-OR13,-C(O)NR14R15,-NR16S(O)2R17,-OR18,-S(O)2NR19,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基,其中n是0至2的整数，其中如果z大于1，两个R3结构部分任选地连接在一起形成取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
R6,R7,R8,R9,R10,R11,R12,R13,R14,R15,R16,R17,R18和R19独立地是氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，L2是取代或未被取代的C1-C10烷基。L2也可以是未被取代的C1-C10烷基。备选地，L2是取代或未被取代的亚甲基(例如，未被取代的亚甲基)。
在其他实施方案中，X是-N＝或-CH＝。符号z可以是2。还在其他实施方案中，邻近顶点处的两个R3结构部分连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基。符号z也可以是1。符号y可以是0或1。R3可以是-OR18。R18可以是氢或未被取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L2是取代的或未被取代的亚甲基(例如，取代的亚甲基),X是-N＝或-CH＝,R1是氢，且y和z是0。
在其他实施方案中，所述化合物具有下式：
(有时称为Thiazovivin或“Tzv”)，
还在其他实施方案中，式I化合物是这样的化合物，其中环A是环烷基,杂环烷基,芳基，或杂芳基,每个任选地被1-5个R3基团取代；环B是杂环烷基或杂芳基,每个任选地被1-5个R4基团取代；L1为-C(O)-NR2-或-NR2-C(O)-；L2为键，C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基；R1和R2独立地为氢,C1-10烷基,C1-10杂烷基,C3-8环烷基,C3-8杂环烷基,芳基,或杂芳基；每个R3和R4独立地为-CN,-S(O)nR6,-NR7R8,-C(O)R9,-NR10-C(O)R11,-NR12-C(O)-OR13,-C(O)NR14R15,-NR16S(O)2R17,-OR18,-S(O)2NR19,C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基，或杂芳基,其中n为0至2的整数，其中两个R3结构部分任选地连接在一起形成环烷基,杂环烷基,芳基,或杂芳基；和R6,R7,R8,R9,R10,R11,R12,R13,R14,R15,R16,R17,R18和R19各自独立地为氢,C1-10烷基，C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,或杂芳基。还在其他的实施方案中，式I化合物是Thiazovivin以外的化合物。
在其他的实施方案中，促进细胞存活和/或抗分化的化合物具有下式：
在式(III)中，环D是取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基。L3是-C(O)NH-或-S(O)2NH-。
R20是取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。R21是-NR22R23或-OR24。
R22和R23独立地是氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,取代或未被取代的杂芳基,或连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基或取代或未被取代的杂芳基。
R24是取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,取代或未被取代的杂芳基,或连接在一起形成取代或未被取代的环烷基或取代或未被取代的杂环烷基。
在其他实施方案中，L3是键，-O-,-C(O)NH-或-S(O)2NH-,R20是氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基,并且环D和R21如上所定义。在一些其他实施方案中，L3是键,-O-或-S(O)2NH-,并且环D,R20和R21如上所定义，使得当L3是-S(O)2NH-时，R20是氢。还在其他的实施方案中，L3是键或-O-,且环D,R20和R21如上所定义。
在一些实施方案中，环D是取代或未被取代的苯基。
在其他的实施方案中，R20是取代或未被取代的烷基或取代或未被取代的环烷基。R20可以是取代或未被取代的C1-C10烷基或取代或未被取代的3–7元环烷基。R20还可以是取代或未被取代的C1-C5烷基或取代或未被取代的3－6元环烷基。在一些实施方案中，R20是未被取代的C1-C5烷基或未被取代的3-6元环烷基。
还在其他实施方案中，R22是氢，和R23是取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。备选地，R22是氢；和R23是取代或未被取代的取代或未被取代的芳基。或R22和R23连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基,或取代或未被取代的杂芳基。R22和R23还可以连接在一起以形成取代或未被取代的吡咯基,取代或未被取代的异二氢氮杂茚基,取代或未被取代的哌啶基,或取代或未被取代的四氢喹啉基。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
在式(IV)中，w是0至1的整数，且q是0至7的整数。R20如上面式(III)的化合物的定义中所定义。R25,R26,R27和R28独立地为-CN,-NR29R30,-C(O)R31,-NR32-C(O)R33,-NR34-C(O)-OR35,-C(O)NR36R37,-NR38S(O)2R39,-OR40,-S(O)2NR41,-S(O)vR42,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基,其中v是0至2的整数。
R29,R30,R31,R32,R33,R34,R35,R36,R37,R38,R39,R40,R41和R42独立地为氢,取代或未被取代的烷基,取代或未被取代的杂烷基,未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基。
R25和R26,或R26和R27,可以连接形成取代或未被取代的环烷基,取代或未被取代的杂环烷基,取代或未被取代的芳基,或取代或未被取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R28为-OR40。R40为氢或未被取代的C1-C10烷基。R40还可以是氢或未被取代的C1-C5烷基。
所述化合物还可以具有下式：
在式(V)中，R20,R28和q如上面式(IV)的定义中所定义。在一些实施方案中，R20为未被取代的C1-C10烷基。R28可以是-OR40。R40为氢或未被取代的C1-C10烷基，或被取代或未被取代的C3-C6环烷基取代的C1-C10烷基。符号q可以是1。
在另一个实施方案中，所述化合物具有下式：
在式(VI)中，R20,R28和q如上面式(IV)或式(VI)的定义中所定义。
在另一实施方案中，所述化合物具有下式：
(有时称为Pyrintegrin或“Ptn”)，
在其他实施方案中，式III的化合物是这样的化合物，其中环D为芳基或杂芳基,每个任选地被1-5个R基团取代；L3为-C(O)NH-或-S(O)2NH-；R20为C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,或杂芳基,每个任选地被1-5个R基团取代；R21为-NR22R23或-OR24；R22和R23独立地为氢,C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,杂芳基,或连接在一起形成杂环烷基或杂芳基,每个任选地被1-5个R基团取代；R24为C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基,杂芳基,每个任选地被1-5个R基团取代；和每个R基团独立地选自由下列各项组成的组：C1-10烷基,C1-10杂烷基,-OR',＝O,＝NR',＝N-OR',-NR'R",-SR',-卤素,-SiR'R″R'",-OC(O)R',-C(O)R',-CO2R',-CONR'R",-OC(O)NR'R",-NR″C(O)R',-NR'-C(O)NR"R"',-NR″C(O)2R',-NR-C(NR'R"R'")＝NR"",-NR-C(NR'R")＝NR'",-S(O)R',-S(O)2R',-S(O)2NR'R",-NRSO2R',-CN,-NO2,环烷基,杂环烷基,芳基和杂芳基,其中每个R',R",R'"和R""独立地选自由氢,C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基和芳基烷基组成的组。
在一些实施方案中，上面式(I)-(VI)的化合物中所述的每个取代的基团被至少一个取代基取代。更具体地，在一些实施方案中，式(I)-(VI)的化合物中上述的每个取代的烷基,取代的杂烷基,取代的环烷基,取代的杂环烷基,取代的芳基,取代的杂芳基,取代的亚烷基,和/或取代的杂亚烷基被至少一个取代基取代。在其他的实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个尺寸限制的取代基取代。备选地，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基取代。
在式(I)-(VI)的化合物的其他实施方案中，每个取代或未被取代的烷基是取代或未被取代的C1-C20烷基，每个取代或未被取代的杂烷基是取代或未被取代的2-20元杂烷基,每个取代或未被取代的环烷基是取代或未被取代的C3-C8环烷基,每个取代或未被取代的杂环烷基是取代或未被取代的3-8元杂环烷基,每个取代或未被取代的亚烷基是取代或未被取代的C1-C20亚烷基,和/或每个取代或未被取代的杂亚烷基是取代或未被取代的2-20元杂亚烷基。
在一些实施方案中，每个取代或未被取代的烷基是取代或未被取代的C1-C8烷基，每个取代或未被取代的杂烷基是取代或未被取代的2-8元杂烷基,每个取代或未被取代的环烷基是取代或未被取代的C5-C7环烷基,每个取代或未被取代的杂环烷基是取代或未被取代的5-7元杂环烷基,和/或每个取代或未被取代的亚烷基是取代或未被取代的C1-C8亚烷基,和/或每个取代或未被取代的杂亚烷基是取代或未被取代的2-8元杂亚烷基。
在一些其他的实施方案中，式(I)-(VI)的化合物可以被C1-10烷基,C1-10杂烷基,-OR',＝O,＝NR',＝N-OR',-NR'R",-SR',-卤素,-SiR'R″R'",-OC(O)R',-C(O)R',-CO2R',-CONR'R",-OC(O)NR'R",-NR″C(O)R',-NR'-C(O)NR"R"',-NR″C(O)2R',-NR-C(NR'R"R'")＝NR"",-NR-C(NR'R")＝NR'",-S(O)R',-S(O)2R',-S(O)2NR'R",-NRSO2R',-CN,-NO2,环烷基,杂环烷基,芳基或杂芳基取代,其中每个R',R",R'"和R""是氢,C1-10烷基,C1-10杂烷基,环烷基,杂环烷基,芳基或芳基烷基。
III.使用方法
本发明的化合物可用于大量的目的。例如，在细胞否则经历凋亡或否则死亡的情况下(例如，对于分离的细胞)所述化合物促进存活。在一些实施方案中，细胞稳定至少特定的时期，例如，10分钟,30分钟，或1,2,4,6,8,10,24,48或96小时。此外，所述化合物可用于在细胞否则分化或否则改变其编程的条件下保持细胞的现有分化状态。这些作用导致所述化合物在体外或体内的大量用途。
A.体内用途
本发明的化合物可用于减少组织损伤，因此可以被施用用来治疗、改善或防止组织损伤。在一些实施方案中，本发明的化合物施用于具有内部器官的组织损伤或处于发生内部器官的组织损伤的危险中的个体。内部器官包括，但不限于，脑,胰腺,肝,肠,肺,肾,或心脏,创伤，例如，由烧伤或切割导致。例如，在一些实施方案中，本发明的化合物有效地减少缺血后再灌注中的梗塞尺寸。因此，本发明的化合物可以施用于处于发生卒中的危险中的个体，发生卒中的个体，或已经发生卒中的个体。类似地，本发明的化合物可以施用于处于发生心脏病发作或心脏损害的危险中的个体，发生心脏病发作或心脏损害的个体，或已经发生心脏病发作或心脏损害的个体。
本发明人已经发现本发明的化合物可以防止细胞死亡，例如，在上皮细胞中。例如，本发明人将作为单一细胞接种的原代人胰岛/β细胞分散在包被以基质胶或层粘连蛋白的组织培养板上。在用于β细胞的不含Tzv的常规细胞培养基中导致大量细胞死亡。然而，当Tzv加入至培养基(1-2mM)中时，细胞死亡被抑制。对于其他上皮原代细胞，诸如神经细胞，观察到相同的效应。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物被施用于需要胰腺β和/或岛细胞的个体，其中所述化合物的施用导致所述个体中许多β或岛细胞的数量增加。
此外，本发明的化合物(例如，式I或III的那些化合物)有效地增加血流量并抑制炎症反应。例如，式I化合物增强单核细胞跨越内皮细胞单层的粘附和迁移并且因此可以减轻炎症反应(未显示的数据)。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物施用于需要增加的血流量和/或减少的炎症的个体(例如，具有脑缺血)。需要减少炎症的个体包括患有炎性疾病或患有由炎性病症介导的疾病的个体。示例性的炎性疾病包括，但不限于，慢性阻塞性肺病，骨关节炎，腱炎或滑囊炎，痛风性关节炎,风湿性多肌痛，纤维肌痛,盆腔炎性疾病和关节炎，包括类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本发明的化合物用来治疗或改善癌症。在一些情况下，本发明的化合物施用来治疗癌症，例如，癌,神经胶质瘤,间皮瘤,黑素瘤,淋巴瘤,白血病,腺癌,乳腺癌,卵巢癌,宫颈癌,成胶质细胞瘤,白血病,淋巴瘤，前列腺癌,和伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma),头颈癌,结肠癌,结直肠癌,非小细胞肺癌,小细胞肺癌,食道癌,胃癌,胰腺癌,肝胆管癌,胆囊癌,小肠癌,直肠癌,肾癌,膀胱癌,前列腺癌,阴茎癌,尿道癌,睾丸癌,宫颈癌,阴道癌，子宫癌,卵巢癌,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,胰腺内分泌癌,类癌,骨癌,皮肤癌,视网膜母细胞瘤,霍奇金淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤(对于其他的癌症参见，CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE(癌症：原理和实践)(DeVita,V.T.等，编辑，1997))。
癌细胞转移典型地是涉及上皮至间质转变/EMT(例如，从上皮型细胞转变为成纤维细胞型细胞)的过程。本发明人已经发现本发明的化合物(即，Tvz和Ptn)可以诱导MET(逆转EMT)并抑制EMT,表明该化合物有效地减少或防止癌症转移。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物施用于具有癌症转移或处于发生癌症转移的危险的个体。例如，本发明人已经发现式I和III化合物抑制上皮癌包括但不限于乳腺癌和肝细胞癌的转移。
在一些实施方案中，本发明的化合物施用于患有高血压和/或动脉粥样硬化，或处于发生高血压和/或动脉粥样硬化的危险的个体。
式I和III化合物(即，Tvz和Ptn)有效地促进受损的中枢神经系统中的轴突再生和功能恢复。例如，本发明人已经发现Tvz可以促进神经突从来自小鼠的原代神经元细胞向外长出。Tzv(3μM)在小鼠P1皮质外植体上测试，轴突向外生长作为结果读数。在接种后20分钟将Tzv加入至培养基中，DMSO作为对照。在培养物中观察外植体持续4天。Tzv显示对促进轴突向外生长的显著效应，从1div就很明显。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物施用于具有中枢神经系统损伤的个体或有需要或另外会受益于轴突再生的个体。
在一些实施方案中，本发明的化合物施用于患有糖尿病、胰岛素抗性，或另外需要促进β细胞存活，或处于丧失β细胞功能的危险中的个体。
本发明的化合物还用于改善器官、细胞或组织移植的负性症状，或另外改善器官、细胞或组织移植。如本文所解释的那样，本发明的化合物有效地稳定和维持细胞的关联编程(contextual programming)。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物在细胞、组织或器官的移植期间和之后施用于个体。移植的实例包括，但不限于，骨髓、脐带血、纯化的造血干细胞/祖细胞、心脏细胞、神经细胞、胰腺β细胞和肝细胞的移植。
B.体外用途
本发明的化合物有效地稳定暴露于众多条件的细胞。许多动物细胞，当分离时(处于混悬液中或备选地，当贴壁时)丧失活力，经历凋亡，和/或改变编程(例如，干细胞当分离时，经常死亡或分化)。本发明的化合物当与这些细胞混合时有效地防止这些细胞对环境改变的反应。在一些实施方案中，细胞从动物中分离并与足以防止细胞活力丧失和/或细胞编程改变的量的本发明的化合物接触。在一些实施方案中，当分离的细胞保留了否则将由于细胞对分离过程和分离本身的反应而导致丧失的表型时，此类分离的细胞可用于诊断。示例性的保留的表型可以包括，例如，基因表达谱，细胞对刺激、配体或药物的反应性，细胞活力。
细胞群的稳定性可以，例如，通过监测基因产物的表达来监测。例如，某些基因产物是组织或细胞类型特异的，并且可以在条件或环境(例如，细胞培养基的改变，细胞的解冻，细胞与其他细胞的分离，等)改变之前和之后监测以确定所述改变是否影响细胞编程。在一些实施方案中，准备要接受条件或环境改变的细胞，或在所述改变后相对短的时间内(例如，1分钟之内，5分钟之内，1小时以内等，取决于具体情况)细胞与足量的本发明的化合物接触使得一种或多种细胞表达标志物保持基本上不变。“基本上不变”将取决于上下文并在本领域中是可以理解的。在一些实施方案中，“基本上不变”的含义是与特定细胞类型相关的基因产物的表达在对所述细胞进行特殊的处理之后改变不超过约10％,20％或30％(例如，与处理之前的表达相比)。
在一些实施方案中，本发明提供了促进离体干细胞存活和抗分化的方法。例如，本发明人已经发现通过在分离小鼠胚胎干细胞，多种神经干细胞，皮肤干细胞，间质干细胞，造血干细胞，基质干细胞和上皮干细胞后立即使所述细胞与式I或III化合物接触，式I或III化合物(即，Tzv和Ptn)有效地促进所述细胞的存活和抗分化。
因此，本发明提供了与足量的本发明的化合物(例如，式I或III的化合物)接触的细胞群和/或组织以稳定所述细胞，例如，以防止或减少细胞对条件改变(例如，从组织中分离，细胞的解冻，等)的反应。在一些实施方案中，例如，与本发明的化合物接触的细胞或组织处于冷冻或液体状态。在一些实施方案中，细胞/组织从冷冻状态解冻，同时与足量的本发明的化合物接触以防止或减少细胞损害或分化。
在一些实施方案中，本发明的化合物与干细胞群、祖细胞群或分化细胞群接触。示例性的干细胞包括多能干细胞，胚胎干细胞,诱导的干细胞(iPS细胞)。示例性的干细胞还包括小鼠胚胎干细胞，多种神经干细胞，皮肤干细胞，间质干细胞，造血干细胞，基质干细胞和上皮干细胞。可以使用任意类型的祖细胞，包括但不限于,内胚层祖细胞,中胚层祖细胞(例如，肌肉祖细胞，骨祖细胞，血液祖细胞),和外胚层祖细胞(例如，表皮组织祖细胞和神经祖细胞)。已知有大量的分化细胞。分化细胞包括，但不限于，成纤维细胞,心脏细胞，神经细胞，胰腺β细胞，肝细胞，上皮细胞，和肠细胞。本文所述的细胞可以是人细胞或非人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是小鼠,犬,牛，猪,大鼠或非人灵长类动物细胞。
保持细胞活力和细胞编程的能力允许改进药物筛选和诊断的方法。例如，在一些实施方案中，在至少一种本发明的化合物(例如，式I或III的化合物)的存在下筛选细胞的反应，从而保持所述细胞的活力，并进一步与多种试剂(例如，化学文库)中的至少一种接触，然后监测反应。大量的筛选方法是已知的。此方法发现特别有益于采用否则在该筛选方法的条件下活力很差的细胞来应用(例如，在方便地使用分离的细胞，处于混悬液中的细胞，贴壁细胞等的情况下)。所述细胞可以是，例如，干细胞，祖细胞或分化细胞，如本文所述。细胞反应可以是任何所需的反应。在基于细胞的筛选测定中的一些反应包括，但不限于，基因的表达(例如，基于报告基因的表达或通过PCR定量或其他检测技术),细胞活力或丧失活力，凋亡的诱导，等。
在筛选方法中使用的试剂可以是，例如，小的有机化合物(例如，分子量小于10,000道尔顿，例如，小于8000,6000,4000,2000道尔顿),脂质,糖,多肽,抗体,核酸(例如，寡核苷酸,DNA,RNA,核酶,短抑制性RNA(siRNA),微小RNA(miRNA),等)。
在一些实施方案中，所述测定被设计为通过将测定步骤自动化和为测定提供来自任何便利的来源的化合物来筛选大的组合文库，其典型地并行地运行(例如，在自动测定中的微量滴定板或微孔板中)。该组合文库可以是完全随机的，或包括包含基于一个或多个有前景的前导化合物的核心结构的成员。所述组合文库可以是完全合成的或可以包括来源于天然存在来源的成员中的一些或全部，所述天然存在来源包括，例如，细菌，真菌，植物，昆虫和脊椎动物(例如，非洲爪蟾属(Xenopus)(蛙)或鳗鲡属(Anguilla)(鳗鱼))和无脊椎动物(例如，球海胆属(Strongylocentrotus)(海胆)或软体动物)。还参见，Boldi,Combinatorial Synthesis of Natural Product BasedLibraries(基于天然产品的文库的组合分析),2006,CRC Press。
在一个实施方案中，高通量筛选方法涉及提供组合的化学或肽文库，所述文库包含大量的潜在治疗性化合物(潜在的调节剂或配体化合物)。然后如本文所述，这样的“组合化学文库”或“配体文库”在一个或多个测定中筛选，以鉴定显示所需的特征性活性的那些文库成员(特定的化学物种或子类)。由此鉴定的化合物可以充当常规的“前导化合物”或本身可以用作潜在的或实际的治疗剂。
组合化学文库是通过组合许多化学“结构单元(building block)”诸如试剂由化学合成或生物学合成而产生的多种多样的化学化合物的集合体。例如，线性组合化学文库诸如多肽文库是通过以对于指定化合物长度(即，多肽化合物中氨基酸的数目)的每一种可能方式组合一组化学结构单元(氨基酸)而形成的。通过化学结构单元的这种组合式混合可以合成数百万种化学化合物。
组合化学文库的制备和筛选对于本领域技术人员是公知的。参见，例如，美国专利号5,663,046；5,958,792；6,185,506；6,541,211；6,721,665,将它们的公开内容通过引用合并入本文中。
这样的组合化学文库包括，但不限于，肽文库(参见，例如，美国专利号5,010,175；Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.(国际肽和蛋白研究杂志)37:487-493(1991)；Houghton,等,Nature(自然)354:84-88(1991)；和Combinatorial Peptide Library Protocols(组合肽文库实验技术),Cabilly,编辑,1997,Humana Press。也可以使用用于产生化学多样性文库的其他化学原理。这样的化学原理包括，但不限于：拟肽(peptoids)(例如，PCT公开号WO 91/19735),编码的肽(例如，PCT公开号WO 93/20242),随机生物寡聚体(例如，PCT公开号WO 92/00091),苯并二氮(benzodiazepines)(例如，美国专利号5,288,514),diversomers诸如乙内酰脲,苯并二氮和二肽(Hobbs等,Proc.Nat.Acad.Sci USA(美国国家科学院院刊)90:6909-6913(1993)),插烯多肽(vinylogous polypeptides)(Hagihara等,J.Amer.Chem.Soc.(美国化学会会志)114:6568(1992)),具有葡萄糖支架的非肽性拟肽类(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann等,J.Amer.Chem.Soc.(美国化学会会志)114:9217-9218(1992)),小化合物文库的模拟有机合成(Chen等,J.Amer.Chem.Soc.(美国化学会会志)116:2661(1994)；CombinatorialLibraries:Synthesis,Screening and Application Potential(组合文库：合成，筛选和应用潜力),Cortese,编辑，1995,Walter De Gruyter Inc；以及Obrecht和Villalgordo,Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesisof Small-Molecular-Weight Compound Libraries(小分子量化合物文库的固载化组合和并行合成),1998,Elsevier Science Ltd),低聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等.,Science(科学)261:1303(1993)),和/或肽基膦酸酯(Campbell等.,J.Org.Chem.(有机化学杂志)59:658(1994)),核酸文库(参见Ausubel,见下,Sambrook和Russell,见下和美国专利号6,955,879；6,841,347；6,830,890；6,828,098；6,573,098；和6,399,334),肽核酸文库(参见，例如，美国专利号5,539,083；5,864,010和6,756,199),抗体文库(参见，例如，Vaughn等.,Nature Biotechnology(自然生物技术),14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287),糖文库(参见，例如，Liang等.,Science(科学),274:1520-1522(1996)；美国专利号5,593,853；和SolidSupport Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries(固体载体寡糖合成和组合碳水化合物文库),Seeberger,编辑,2004,JohnWiley&Sons(E-book)),小有机分子文库(参见，例如，苯并二氮(benzodiazepines),Baum C&EN,1月18日,33页(1993)和美国专利号5,288,514；类异戊二烯(isoprenoids),美国专利号5,569,588；噻唑烷酮和间噻嗪酮(thiazolidinones and metathiazanones),美国专利号5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines),美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物(morpholino compounds),美国专利号5,506,337,等)。还参见，Combinatorial Library Design and Evaluation:Principles,Software Tools,andApplications in Drug Discovery(组合文库设计和评价：原理，软件工具和在药物发现中的应用),Ghose,等,编辑,2001,Marcel Dekker；MolecularDiversity and Combinatorial Chemistry:Libraries and Drug Discovery,(分子多样性和组合化学：文库和药物发现)Chaiken和Janda,编辑,1996,Oxford Univ Pr.；和Combinatorial Library Methods and Protocols(组合文库方法和实验技术),英语版,2002,Humana Press。
用于制备组合文库的装置是可商购的(参见，例如，Advanced ChemTech(高级化学技术),路易斯维尔KY.,Symphony,Rainin,沃本,MA.,Applied Biosystems(应用生物系统),福斯特城,CA.,Millipore(密理博),贝德福德,MA和Caliper Life Sciences(生命科学),Hopkinton,MA)。
在一些实施方案中，筛选测定可以方便地在多孔板(例如，96孔,384孔，等)中进行，其中待筛选的每种药剂在单个孔中单独地测试。在一些实施方案中，两种或多种候选药剂在单一反应混合物中测试。
C.获得类似效应的备选靶标
如下面实施例中所详述的那样，本发明人已经了解了几种基因产物在细胞对本发明的化合物的反应中的作用，并且这导致了下面的发现：即，通过如下面所解释的那样通过操作基因产物也可以稳定细胞。
1.E-钙黏着蛋白
本发明人已经发现增加E-钙黏着蛋白的表达提高了干细胞存活率。因此，本发明提供了稳定和/或增加细胞中E-钙黏着蛋白的表达的方法，从而稳定所述细胞不受条件改变的影响，否则所述条件改变将损害细胞的活力。稳定E-钙黏着蛋白可以包括，例如，使细胞与增加E-钙黏着蛋白的表达或以某种方式保护E-钙黏着蛋白不被蛋白水解切割的化合物接触。
在一些实施方案中，本发明提供了在具有用蛋白包被的表面的容器中培养干细胞(包括但不限于，人或小鼠胚胎干细胞)从而稳定所述细胞(例如，维持或增加所述细胞的活力和/或维持细胞编程)的方法，所述蛋白包含至少E-钙黏着蛋白的胞外结构域，其任选地连接至另一成分，诸如融合蛋白。胞外结构域是膜蛋白延伸至细胞外空间(细胞外部的空间)的部分。在一些实施方案中，胞外结构域是蛋白中促使与表面接触的部分，所述接触导致信号转导。E-钙黏着蛋白的胞外结构域记载在，例如，Ito等,Oncogene(癌基因)18(50):7080-90(1999)中。在一些实施方案中，至少E-钙黏着蛋白的胞外结构域与二聚化多肽序列融合，从而能够获得稳定化的胞外结构域二聚体。“二聚化多肽”是指形成同型二聚体从而允许两个多肽二聚化的氨基酸序列。示例性的二聚化多肽包括，但不限于，IgG Fc片段。在一些实施方案中，干细胞(包括但不限于人或小鼠胚胎干细胞，多能干细胞，iPS细胞)彼此解离并且在具有用蛋白包被的表面的容器中培养，从而稳定所述细胞，使得与在缺少所述多肽涂层的容器中培养的类似处理的细胞的存活率相比所述细胞的存活率得到提高，所述蛋白包含至少E-钙黏着蛋白的胞外结构域，任选地连接至另一成分，诸如融合蛋白。
2.蛋白激酶C
本发明还提供了通过使细胞与蛋白激酶C激活物接触来稳定所述细胞。如本文所解释的那样，用蛋白激酶C激活物处理在存在基质胶基质的条件下生长的解离的hESC导致显著提高的细胞粘附和集落形成，从而提高细胞活力。因此，本发明提供了通过在蛋白激酶C激活物的存在下培养细胞来提高细胞活力，从而提高细胞活力、生长和/或粘附。在一些实施方案中，蛋白激酶C激活物以足以提高细胞活力和/或存活率和/或粘附的量与干细胞群、祖细胞群或分化细胞群接触。示例性的干细胞包括多能干细胞，胚胎干细胞，诱导的干细胞(iPS细胞)或如本文另外所述。示例性的蛋白激酶C激活物包括，但不限于，佛波醇酯(例如，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13–乙酸酯(PMA)或如美国专利公开号20080226589中所述的佛波醇酯)或肽激动剂(例如，如美国专利号6,165,977中所述)。
3.整联蛋白(Integrin)β1
本发明还提供了通过使细胞与整联蛋白β1激活物接触来稳定细胞。如本文解释的那样，用整联蛋白β1激活物处理解离的hESC(其中所述细胞生长在核纤层蛋白(lamin)上)导致明显提高的细胞粘附和集落形成，从而提高细胞活力。因此，本发明提供了通过在整联蛋白β1激活物的存在下培养细胞来提高细胞活力，从而提高细胞活力、生长和/或粘附。在一些实施方案中，整联蛋白β1激活物以足以提高细胞活力和/或存活率和/或粘附的量与干细胞群、祖细胞群或分化细胞群接触。示例性的干细胞包括多能干细胞，胚胎干细胞，诱导的干细胞(iPS细胞)或如本文另外所述。示例性的整联蛋白β1激活物包括，但不限于，整联蛋白β1激活抗体诸如，例如，TS2/16(可商购自例如，Thermo Scientific,Rockfield,Ill.)。
IV.细胞群
如本文所讨论的那样，本发明提供了处于混合物中(例如，细胞培养物)的细胞，所述混合物中包含一种或多种如本文所述的化合物(例如，式I或III化合物-包括但不限于Tzv和Pt–或蛋白激酶C激活物或整联蛋白β1激活物)。在一些实施方案中，所述化合物以足以维持对细胞环境或条件的改变(例如解冻)反应时的活力或细胞编程的浓度存在于所述混合物中。例如，在一些实施方案中，所述化合物的浓度为至少0.1nM,例如，至少1,10,100,1000,10000,或100000nM,例如，0.1nM～100000nM,例如，1nM～10000nM,例如，10nM～10000nM,例如，1～10μM。在一些实施方案中，所述混合物处于合成容器器皿(例如，试管，陪替氏培养皿(Petri dish),等)中。因此，在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞(非动物的一部分)。在一些实施方案中，所述细胞是贴壁细胞或处于混悬液中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞从来自动物(例如，人或非人)的组织样品(例如，活组织检查)中分离或解离,置于器皿中，并与如本文所述的一种或多种化合物(例如，式I或III化合物)接触。所述细胞可以随后进行培养，和任选地在所述细胞已经被刺激分化成为特定的细胞类型或谱系后，或在将重组表达盒引入至所述细胞中后，任选地植入回同一动物或不同的动物中。。
V.细胞的培养
可以根据本领域中已知的任何方法培养细胞。根据需要细胞可以在混悬液中培养或作为贴壁细胞培养。
在一些实施方案中，细胞(例如，干细胞)与饲养细胞接触培养。示例性的饲养细胞包括，但不限于，成纤维细胞，例如，小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞。在饲养细胞上培养细胞的方法在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，在无饲养细胞的条件下培养所述细胞。例如，细胞可以直接附着于固体培养表面(例如，培养板)，例如，经由分子栓链(molecular tether)附着。示例性的分子栓链包括，但不限于，基质胶，细胞外基质(ECM),ECM类似物，层粘连蛋白，纤连蛋白或胶原。然而本领域技术人员将认识到这是非限制性的列举，并且可以使用其他分子来使细胞附着在固体表面上。使栓链初步附着在固体表面上的方法在本领域中是已知的。
VI.制剂和给药方法
制剂(例如，包含本发明的化合物,包括但不限于适合于给药的制剂)包括水溶液和非水性溶液,等渗无菌溶液,其可以包含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，和使所述制剂等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可以包含悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。在本发明的实施中，组合物可以例如，经口，经鼻，局部地，静脉内地，腹膜内地或鞘内地施用。化合物的制剂可以以单位剂量或多次剂量的密封容器(诸如安瓿和小瓶)存在。可以由前述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备溶液和混悬液。调节剂也可以作为已制成的食品或药物的一部分施用。
施用于患者的剂量，就本发明的内容而言，应当足以随着时间推移在受试者中诱发有益的反应。对于任何患者的最佳剂量水平将取决于多种因素包括采用的具体调节剂的功效，患者的年龄，体重，体力活动，和饮食，取决于与其他药物的可能组合，以及取决于所关心的疾病或病症的严重度。剂量的大小还由特定受试者中伴随特定化合物或载体的施用产生的任何不利副作用的存在，性质和程度来决定。
在确定待施用的活性成分的有效量时，医生可以评价化合物或药剂的循环血浆水平，化合物或药剂毒性，以及抗化合物或药剂抗体的产生。通常，对于典型受试者来说，化合物或药剂的剂量当量为约1ng/kg-10mg/kg。
VII.实施例
提供下列的实施例以举例说明，但非限制要求保护的发明。
实施例1:
为了改善化学成分限定培养基条件和揭开单细胞解离后hESC死亡的分子机制，我们对50,000种合成化合物进行了高通量表型筛选以鉴定胰蛋白酶解离后促进hESC存活的小分子。从筛选中，鉴定了两种化学类型，它们显著地增加解离后的细胞存活，并且还维持了hESC集落形态学和碱性磷酸酶(ALP)表达。进一步化学优化和活性分析发现了两个前导分子，2,4-二取代的噻唑(命名为Thiazovivin/Tzv)和2,4-二取代的嘧啶(命名为Pyrintegin/Ptn)(图1a),用于进一步功能和机理表征。
表1.活性数据
1ALP阳性集落相对于初始接种的全部细胞的比率。
化合物Tzv或Ptn将酶解离后单一hESC在基质胶包被板上的存活率增加20倍以上(图1b,c)。hESC在含有Tzv或Ptn的化学成分限定培养基中连续传代20代以上。在这样的条件下，细胞同质地保持了hESC的特征形态学,典型多能性标志物的表达，和正常核型(图1d,e)。当将这些细胞注射至裸鼠中时，它们生成了复杂的畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三个原胚层组织组成(图1f)。用几种独立的hESC系证实的这些结果，总体地和令人信服地证明两种化合物均基本上能够促进hESC存活而不损害自我更新和完全发育潜能。
hESC已知由于过多的细胞死亡而难以在单细胞解离后在悬浮培养物中形成类胚体(EB)。因此，我们还测试了Tzv或Ptn是否能够促进解离的hESC在混悬液中的存活。有趣的是，Tzv在贴壁培养和悬浮培养中均极大地提高hESC的存活率。相反，Ptn仅在贴壁培养(例如，在基质胶包被板上)中促进hESC的存活，但对悬浮培养没有作用(图2a)。这些观察表明在ECM/基质胶或悬浮条件下至少两种不同的机制参与了这两种类型细胞的死亡，并且Tzv和Ptn不同地发挥作用。当在混悬液中生长并存在Tzv时，hESC形成的好细胞(nice cell)聚集在一起(图2b),并且能够分化成多种谱系(未显示的数据)。因为细胞聚集最常通过细胞-细胞粘附介导，并且E-钙黏着蛋白是主要的细胞-细胞粘附分子，并在hESC中高度表达(Eastham,A.M.等,Cancer Res(癌症研究)67(23):11254-11262(2007)),我们测试了特异性E-钙黏着蛋白封闭抗体对多细胞聚集体形成的作用。当细胞在所述抗体的存在下培养时，由Tzv处理诱导的细胞存活和大的致密聚集体的形成被大大抑制，表明Tzv诱导的细胞存活和多细胞聚集体的组装涉及功能性E-钙黏着蛋白(图2b)。另外，在hESC中通过特异性siRNA对E-钙黏着蛋白的敲低极大地减少了Tzv处理诱导的细胞存活，并且显著地减少了ALP阳性集落的数目(图2c,d,e)。这些结果提示Tzv增加混悬液中的hESC存活，推测这可能通过E-钙黏着蛋白-介导的细胞-细胞粘附发挥作用。
然后我们检查了胰蛋白酶解离后hESC中的E-钙黏着蛋白表达。我们发现在胰蛋白酶解离后大多数全长E-钙黏着蛋白已经被裂解(图2f)。此观察与下面的报道是一致的：E-钙黏着蛋白的细胞外区域在跨膜结构域附近具有内切蛋白酶解切割位点(Damsky,CH.等.,Cell(细胞)34(2):455-466(1983))。在未用Tzv处理的细胞中，新合成的全长E-钙黏着蛋白在酶处理后1h出现，并在4h后消失，提示在解离的hESC中新合成的E-钙黏着蛋白是不稳定的。然而，在Tzv处理的细胞中，E-钙黏着蛋白表达显著增加(图2g)。此外，流式细胞分析揭示Tzv显著地增加了hESC中的细胞表面E-钙黏着蛋白(图2h)。因此，Tzv可能通过调节E-钙黏着蛋白的细胞表面水平来影响细胞粘附。半定量RT-PCR揭示在假处理对照和Tzv处理的细胞中E-钙黏着蛋白转录物的量是相当的(图2i)，提示E-钙黏着蛋白蛋白水平的差异不是由于转录水平改变引起的。Tzv有可能通过稳定细胞表面上的E-钙黏着蛋白来发挥其作用。最后，胞吞作用测定揭示Tzv显著地阻断E-钙黏着蛋白的内化。这些结果表明Tzv通过抑制E-钙黏着蛋白的胞吞作用来调节E-钙黏着蛋白活性(图2j).
胰蛋白酶的细胞-细胞解离导致E-钙黏着蛋白的迅速裂解和随后的失稳。我们假设E-钙黏着蛋白稳定性也可能通过其在细胞之间的嗜同性相互作用来介导。因此E-钙黏着蛋白与重组配体的嗜同性结合可以稳定E-钙黏着蛋白并影响hESC存活。为了测试这种假设，我们用二聚体E-钙黏着蛋白-Fc嵌合蛋白包被板，所述嵌合蛋白包含与IgG Fc片段融合的E-钙黏着蛋白胞外结构域(Ecad-Fc)。值得注意的是，解离的hESC附着在包被的表面上，并且它们的存活率以剂量依赖的方式显著增加(图2k)，证实E-钙黏着蛋白介导的细胞-细胞粘附是hESC存活的重要调节因子。
Tzv和Ptn两者对在基质胶包被板上生长的hESC的存活具有显著作用。这样的存活促进作用似乎不可能是由于对细胞生长的影响所引起的，并且可能主要归因于细胞解离和接种过程后细胞粘附能力的增加(图3a,b)。实际上，用Tzv或Ptn处理的解离的hESC显示与基质胶或层粘连蛋白的粘附显著增加。相反，hESC与明胶或聚赖氨酸的粘附(不涉及整联蛋白)不受Ptn或Tzv处理的影响(图3b和未显示的数据)。基质胶的主要成分是层粘连蛋白，并且据报道层粘连蛋白受体β1整联蛋白在hESC中高度表达(Xu,C.等,Nat Biotechnol(自然生物技术)19(10):971-974(2001))。为了测试Ptn或Tzv是否通过β1整联蛋白发挥作用，我们用针对β1整联蛋白的封闭抗体预处理细胞，并且观察到化合物处理诱导的细胞粘附增加被完全消除。这提示Tzv和Ptn通过β1整联蛋白介导与ECM基底的细胞粘附(图3c)。
为了了解Tzv和Ptn的β1整联蛋白调节的机制，我们研究了所述化合物的作用是否是由于整联蛋白表达的改变所引起的。与E-钙黏着蛋白相反，β1整联蛋白不被胰蛋白酶切割。Western印迹分析揭示所述化合物的作用不可能是由于β1整联蛋白的表达增加所引起的。因此，Tzv和Ptn有可能通过调节整联蛋白活性来影响细胞粘附(图3d,e)。为了检查化合物处理对β1整联蛋白的活性的作用，我们使用了单克隆抗体HUTS-21,其特异性地结合β1整联蛋白的激活形式(Luque,A.等.,J Biol Chem(生物学和化学杂志)271(19):11067-11075(1996))。值得注意的是，化合物处理增加HUTS-21结合的水平(图3f,g)。这些结果总体地提示Tzv和Ptn通过整联蛋白活性的翻转(inside-out)调节来增加细胞粘附。
如果两种化学物质均通过将整联蛋白转变成活性构象来增强细胞粘附，则用整联蛋白激活抗体处理细胞(将整联蛋白锁定在活性构象)应该具有与化合物类似的作用。实际上，当在TS2/16(β1整联蛋白的激活抗体)(van de Wiel-van Kemenade,E.等,J Cell Biol(细胞生物学杂志)117(2):461-470(1992))的存在下将解离的hESC接种在层粘连蛋白上时,细胞粘附显著增加，并且与对照相比细胞形成的集落数增加(图3h,i)。这些结果提示当细胞用这些化合物处理时发生的增加的粘附涉及诱导整联蛋白激活的机制。
为了进一步剖析Tzv和Ptn调节整联蛋白活性的分子机制，我们检查了几种途径抑制剂的作用。我们发现一种特异性PKC抑制剂，双吲哚基马来酰亚胺I能够拮抗Ptn诱导的细胞粘附增加，但对Tzv诱导的细胞粘附没有作用。这提示PKC可介导Ptn的作用但不介导Tzv的作用(图3j)。为了进一步证实PKC对hESC存活的作用，解离的hESC用PKC激动剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13–乙酸酯(PMA)处理。PMA的处理导致整联蛋白激活，以及细胞粘附和集落形成的大幅增加(图3k,l,m)。
干细胞的命运受其细胞小生境的影响，所述细胞小生境包括生长因子、细胞-ECM相互作用和细胞-细胞相互作用。hESC存活高度依赖于细胞-细胞相互作用和/或细胞-ECM相互作用的事实揭示了这种以前未认识到的体外小生境对hESC的重要性。更重要地，细胞内在性蛋白表达(例如，E-钙黏着蛋白和整联蛋白)和调控机制(例如，蛋白稳定和激活)不仅仅对小生境成分发生反应，而且是基本的小生境成分，提示干细胞在缺少其他外源性因子或细胞类型的条件下拥有构建其自身小生境的固有能力，然而所述其他外源性因子或细胞类型可以参与并增强细胞的自身调节小生境机制。
物理/结构环境和生长因子之间的相互作用在细胞命运调节中具有非常重要的作用(Comoglio,P.M.,Boccaccio,C,&Trusolino,L.,Curr Opin CellBiol(现代细胞生物学观点)15(5):565-571(2003))。为了检查生长因子是否参与整联蛋白介导的hESC存活中，我们用Tzv或Ptn与单种高度特异的生长因子受体抑制剂一起处理解离的hESC。我们发现对FGFR,IGFR,EGFR1或Erb2的化学抑制极大地减少了Tzv或Ptn处理诱导的存活促进作用(图4a)。另外，Ptn显著地增加了生长因子受体的磷酸化，提示生长因子受体的参与是整联蛋白介导的细胞存活所需要的(图4b)。对FGFR,IGFR,EGFR1或Erb2的类似抑制也极大地消除了在悬浮培养中Tzv-诱导的hESC存活。此外，Tzv诱导的E-钙黏着蛋白与EGFR1和ERB2的结合，表明生长因子受体在E-钙黏着蛋白-介导的细胞存活中的重要作用(图4c,d)。
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K)信号传导和MAPK/ERK是hESC自我更新的主要调节物(Armstrong,L.等,Hum Mol Genet(人类分子遗传学)15(11):1894-1913(2006)；Paling,N.R.等.,J Biol Chem(生物学和化学杂志)279(46):48063-48070(2004)；Pyle,A.D.,Lock,L.F.,&Donovan,P.J.,NatBiotechnol(自然生物技术)24(3):344-350(2006)；Li,J.等.,Differentiation(分化)75(4):299-307(2007))。在用Ptn处理解离的hESC后ERK和AKT(PI-3K的下游效应器)的磷酸化增加，并且整联蛋白封闭抗体消除了这种增加(图4e,f)。而且，FGFR,IGFR,EGFR或Erb2的抑制剂阻断了Ptn对AKT和ERK的激活(图4g和未显示的数据)。对PI-3K作用的化学抑制显著地拮抗了Ptn诱导的存活作用(图4h)。ERK抑制对Ptn诱导的存活没有显著的作用，但诱导hESC分化(图4i)。这些结果证明PI-3K的激活是主要的存活信号传导，并且ERK的激活是通过激活生长因子受体由小生境产生的抗分化信号。
总之，我们从高通量表型筛选中鉴定了两种新的具有不同的作用机制的合成小分子，它们极大地增加了单细胞解离后的hESC存活率。这样的化学手段和通过机理表征新鉴定的生物学手段(例如，用于贴壁培养中hESC粘附的限定的重组Ecad-Fc；用于增加细胞存活和粘附的激活抗体)将能够使hESC培养物更稳定并显著地促进hESC的应用诸如基因靶向或药物开发。更重要的是，全面深入的机理表征揭示了以前未认识到的小生境机制，其是维持hESC存活和增殖所需要的。这样的小生境包括E-钙黏着蛋白-介导的hESC本身之间的相互作用，整联蛋白介导的细胞-ECM相互作用，和生长因子。早期研究已经指出了生长因子对hESC自我更新的重要作用。然而，生长因子信号传导的完全激活不仅需要生长因子和受体的存在，而且需要与特定微环境的相互作用。当这种物理/结构环境被破坏时，对于ESC的自我更新仅生长因子是不够的。
近年来，有报道称在自我更新培养中由hESC产生的分化的成纤维细胞为hESC建立了体外小生境(Bendall,S.C.等.,Nature(自然)448(7157):1015-1021(2007))。在我们和其他人的化学成分限定培养基条件下，我们在长期培养中很少观察到这样的分化细胞，提示这种人工小生境的建立可能是由于培养基差异所引起的。然而，我们的研究揭示了对于hESC存活和自我更新独特的细胞-自发(即，细胞-细胞相互作用)和非细胞-自发(即，细胞-ECM和-生长因子)小生境机制，其可能在控制体内成人干细胞命运中具有重要的作用。
胰蛋白酶的细胞-细胞解离不仅导致E-钙黏着蛋白的失稳，而且导致整联蛋白的失活，表明维持整联蛋白活性的信号传导对酶处理敏感。饲养细胞条件培养基(采用富生长因子血清)对单细胞解离后的细胞死亡没有提供更多的保护作用。另外，高密度细胞接种也诱导细胞粘附/存活增加的事实提示维持整联蛋白活性所需的信号传导可能不是来自分泌的因子而是来自细胞-细胞的物理相互作用。Tzv抑制E-钙黏着蛋白的胞吞作用，因此保护细胞在混悬液中免于死亡。同样，通过抑制胞吞作用，Tzv可以通过稳定从细胞表面发出的信号传导来维持整联蛋白活性。另一方面，Ptn可以模拟由细胞-细胞的物理相互作用发出的下游信号传导来激活PKC。未来对Ptn的靶标鉴定可能找到新的机制，通过该机制细胞-细胞粘附调节细胞-ECM相互作用。我们的研究还举例说明了高通量化学筛选在干细胞研究中的可行性和进展。此类化学手段在干细胞中的进一步发展和应用无疑将导致鉴定其他新的小分子和对精确地控制体外和体内的细胞命运的机理的了解。
方法
细胞培养
人ESC谱系H1,HUES7和HUES9在补充了2mM L-谷氨酰胺,1x非必需氨基酸,20％血清替代品(serum replacement)(Invitrogen)和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)的DMEM-F12中在被辐照的MEF饲养细胞上培养。化学成分限定的和无饲养细胞的hESC培养如前所述(Yao,S.等.,Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊)103(18):6907-6912(2006))。简言之，hESC在包被基质胶的组织培养板上在N2B27-CDM(补充了1x N2补充剂,1x B27补充剂,2mM L-谷氨酰胺,0.11mM 2-巯基乙醇,1x非必需氨基酸,和0.5mg/ml BSA(级分V)的DMEM-F12)和20ng/mlbFGF中生长。人ESC每5-6天用0.05％胰蛋白酶传代。
对于克隆存活测定，单一的hESC稀释至克隆密度并接种在96孔基质胶包被板上。对于低密度存活测定,将500个细胞接种在96孔基质胶包被板上。为了使hESC集落可视化，培养物在4％多聚甲醛/PBS中固定5min，在PBS中洗涤一次，然后如生产厂商的说明书中所述进行碱性磷酸酶活性染色。在倒置显微镜上对ALP阳性集落进行计数。
试剂
ALP检测试剂盒和整联蛋白抗体来自Chemicon.AG825(Erb2抑制剂),AG 1478(EGFR抑制剂),PPP(IGFRl抑制剂)购自Calbiochem。将针对E-钙黏着蛋白的胞质内尾部产生的抗体(Transduction Laboratories,Lexington,KY)用于免疫沉淀。抗体TS2/16来自Pierce。E-钙黏着蛋白分子的细胞外结构域的抗体来自Zymed(Carlsbad)。针对细胞外信号调节激酶/MAPK,EGFR1,ERB2,GADPH以及AKT的磷酸化形式的抗体来自Cell Signaling(细胞信号传导)。小鼠抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G-10克隆)来自UpstateBiotechnology。Ptn和Tzv以2μM加入至培养基中。
高通量化学筛选
可胰蛋白酶消化的hESC谱系HUES7或HUES9用于筛选。如上所述在基质胶包被板上在化学成分限定培养基中培养hESC。然后通过胰蛋白酶消化收获细胞。将hESC以4,000个细胞/孔接种在基质胶包被的384孔板上。1h后当细胞沉淀时，来自50,000个不同的杂环文库的化合物加入至每孔中(终浓度为2μM)。在另外温育6天后，其中培养基和化合物在第3天时更换，对细胞进行关于ALP表达的染色并检查致密集落(compactcolony)形态学。
免疫染色分析
如以前所述进行免疫染色(Yao,S.等,Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊)103(18):6907-6912(2006))。简言之，将细胞用4％低聚甲醛在室温下(RT)固定15min。然后细胞在RT下在封闭缓冲液中温育1小时。初次抗体在4℃下温育过夜。下面的商购抗体以在封闭缓冲液中1:100的浓度使用：抗-SSEA4,抗-Oct4(Chemicon？？)抗-Nanog(Chemicon)。使用与FITC,cy3或cy5(Jackson ImmunoResearch)缀合的二次抗体使染色可视化。
畸胎瘤形成和核型分析
通过在裸鼠的肾囊下方注射3-5百万个hESC(在化合物Tvz或Ptn的存在下培养)来进行畸胎瘤形成实验。4-5周后，所有小鼠发生畸胎瘤，将其取出，然后由斯克里普斯研究所组织学研究服务中心和动物资源中心(The Scripps Research Institute Research Histology Service and AnimalResources)进行免疫组织学分析。将化合物处理的细胞在奥克兰儿童医院细胞遗传学实验室(Children's Hospital Oakland,Cytogenetics Laboratory)通过标准的G带带型分析进行核型分析。在10个随机挑取的细胞核中没有发现染色体异常。
TUNEL测定
经不同处理的hESC通过胰蛋白酶消化解离，并通过4％低聚甲醛固定。并根据生产厂商的说明书进行染色(MBL Laboratories,Watertown,MA)。染色后，样品使用FACS Calibur流式细胞仪(BD)通过流式细胞术进行分析。
流式细胞分析
为了评估E-钙黏着蛋白,激活的整联蛋白和SSEA4的表达，将解离的细胞(3x105)用PBS洗涤，并重新悬浮在含有2％山羊血清的PBS中。然后将细胞与合适的抗体在4℃温育1h，用封闭溶液洗涤，并用FITC-缀合的二次抗体在4℃下标记30min。然后洗涤细胞并在FACS Calibur流式细胞仪上进行分析。
细胞粘附测定
在包被以基质胶的96孔微量滴定板中进行细胞粘附测定。胰蛋白酶消化后，将hESC重新悬浮在含有所需化合物的化学成分限定培养基中。然后将细胞加入至微量滴定板的孔中，并在37℃下温育3h。通过摇动和洗涤去除未结合的和不紧密结合的细胞，然后将剩余的细胞立即固定。各孔用200μl H2O洗涤3次，并且将贴壁细胞(attached cell)用结晶紫(Sigma)染色。然后测量每孔在570nm的吸光度。对于使用封闭抗体的实验，将细胞与抗体在冰上预孵育30min,并且在抗体的存在下进行粘附测定。每个样品独立地测定三次。
胞吞作用测定
将hESC与1.5mg/ml磺基琥珀酰亚胺基2-(生物素酰氨基(biotinamido))乙基-二硫代丙酸酯(磺基-NHS-SS-生物素)(Pierce ChemicalCo.)在冰上孵育，紧接着洗涤和骤冷。通过Ca2+耗减并在37℃下温育起始E-钙黏着蛋白的胞吞作用。然后将细胞在0℃下在谷胱甘肽溶液(60mM谷胱甘肽,0.83M NaCl,在使用前加入0.83M NaOH和1％BSA)的两次20min洗涤液中温育，从而去除所有细胞表面生物素基团。剩余的生物素化蛋白通过胞吞作用被隔离在细胞内部，并且因此被保护不被谷胱甘肽剥离。在链霉亲和素珠子上回收生物素化蛋白并且通过SDS-PAGE分析。通过免疫印迹法检测E-钙黏着蛋白。将胞吞作用前表面E-钙黏着蛋白的总水平用作参照值。
实施例2:N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺 (carboxamide)(Thiazovivin)的合成
化学合成
使用下面给出的化学合成实施例和本领域中普遍已知的化学合成方法，技术人员能够制备本文公开的化合物(例如，式(I)至(VI)的化合物)。
使用商购获得所有化学品，无需进一步纯化。在Bruker(400MHz)仪器上记录NMR光谱。以ppm测量化学位移(δ)，并且以Hz报告偶合常数(J)。通过带有API-ES电离源的反相液相色谱-质谱仪Agilent 1100LCMS系统进行LCMS。使用C18柱进行高压液相色谱，线性梯度为在7.5分钟内从溶剂B(含0.05％三氟乙酸的水)中的10％溶剂A(含0.035％三氟乙酸的乙腈)至90％A，紧接着用90％A进行2.5分钟的洗脱。
N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺(Thiazovivin)的合成
将苄胺负载至4-甲酰基-3,5-二甲氧基苯氧基甲基官能化聚苯乙烯树脂(PAL)上经还原胺化得到PAL-苄胺树脂。参见，Ding,S.；Grey,N.S.Wu,X.；Ding,Q.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)2002,124,1594-1596。包含处于DMF(3mL)中的PAL-苄胺树脂(200mg,0.2mmol),2-溴噻唑-4-甲酸(carboxylic acid)(83mg,0.4mmol),双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)(153mg,0.6mmol)和二异丙基乙胺(0.17mL,1mmol)的反应烧瓶在室温下摇动24hr。将树脂用甲醇，二氯甲烷洗涤，并真空干燥得到PAL树脂-N-苄基-2-溴噻唑-4-甲酰胺，然后将其加入至火焰干燥的(flame-dried)反应瓶中，然后加入4-氨基嘧啶(95mg，1mmol)，Pd2(dba)3(46mg，0.05mmol)，4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)(87mg，0.15mmol)和NaOtBu(192mg，2mmol)。该瓶确保安全地加盖并脱气，然后充以氩气和无水二噁烷(1.5mL)。将反应物在90℃摇动24小时。用二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液(在DMF中0.05M)，甲醇和二氯甲烷洗涤树脂并真空干燥。随后用裂解混合物TFA：CH2Cl2∶H2O(45∶55∶5)(2mL)裂解树脂2hr。将该树脂过滤，收集滤液并真空蒸发得到粗产物，然后将粗产物通过HPLC纯化得到标题化合物(30mg，48％)。
N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺
关于C15H13N5OS计算的准确质量：311.1，实测值LCMS m/z＝334.1(M+Na+)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)4.49(d，J＝6.3Hz，2H)，5.76(s，1H)，7.21-7.27(m，2H)，7.30-7.34(m，4H)，7.85(s，1H)，8.45(t，J＝6.3Hz，1H)，8.51(d，J＝6.1Hz，1H)，8.94(s，1H).
实施例3：Thiazovivin衍生物的合成
将合适的胺R1NH2预先负载至4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基甲基官能化聚苯乙烯树脂(PAL)，经还原胺化得到PAL-苄胺树脂。将PAL-苄胺树脂(200mg，0.2mmol，1.0当量)，2-溴噻唑甲酸1(0.4mmol，2.0当量)，双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)(0.6mmol,3.0当量)和二异丙基乙胺(1mmol,5.0当量)在无水DMF(3mL)中的混合物在环境温度下摇动24hr。将树脂用甲醇，二氯甲烷洗涤，并真空干燥，然后加入至火焰干燥的反应瓶中，然后加入相应的R2NH2(1mmol,5.0当量),Pd2(dba)3(0.05mmol),4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)(0.15mmol)和NaOtBu(2mmol,10.0当量)。该瓶确保安全地加盖并脱气，然后充以氩气和无水二噁烷(1.5mL)。将反应物在90℃摇动24小时。用二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液(在DMF中0.05M),甲醇和二氯甲烷洗涤树脂并真空干燥。随后用裂解混合物TFA:CH2Cl2:H2O＝45:55:5(2mL)裂解树脂2hr。将该树脂过滤，收集滤液并真空蒸发得到粗产物，然后将粗产物通过HPLC纯化得到所需的标题化合物3。
实施例4：N-(环丙基甲基)-4-(4-(6-羟基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)嘧啶-2-基 氨基)苯磺酰胺(Pyrintegrin)的合成
将包含在正丁醇(10mL)中的2,4-二氯嘧啶(372mg,2.5mmol),6-甲氧基-1,2,3,4-四氢喹啉(489mg,3mmol)和二异丙基乙胺(0.52mL,3mmol)的反应烧瓶在40℃加热过夜。蒸发溶剂，通过快速柱色谱法纯化残余物得到2-氯-4-(6-甲氧基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)嘧啶(551mg,80％)。然后将此中间体(250mg,0.91mmol)溶解在二氯甲烷中并用BBr3(在二氯甲烷中1M)(1mL,1mmol)在-78℃下处理。将反应混合物缓慢地加热至室温并搅拌1hr，倾倒至水中，用二氯甲烷萃取。将合并的有机物在无水Na2SO4上干燥并浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化得到2-氯-4-(6-羟基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)嘧啶(154mg,65％)。向2-氯-4-(6-羟基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)嘧啶(29mg,0.11mmol)和4-氨基-N-(环丙基甲基)苯磺酰胺(27mg,0.12mmol)在DMF(0.5mL)中的搅拌溶液中加入对甲苯磺酸(在二噁烷中2M)(55μL，0.11mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌过夜，然后通过HPLC纯化得到标题化合物(27mg，56％)。
N-(环丙基甲基)-4-(4-(6-羟基-3，4-二氢喹啉-l(2H)-基)嘧啶-2-基氨基)苯磺酰胺
关于C23H25N5O3S计算的准确质量：451.2，实测值LCMS m/z＝452.3(M+H+)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)0.05-0.09(m，2H)，0.32-0.36(m，2H)，0.75-0.81(m，1H)，1.90-1.95(m，2H)，2.64(t，J＝6.4Hz，4H)，3.93(t，J＝6.5Hz，2H)，6.59(d，J＝7.1Hz，1H)，6.66-6.70(m，2H)，7.25-7.28(m，1H)，7.64(t，J＝5.9Hz，1H)，7.74(d，J＝8.8Hz，2H)，7.82(d，J＝8.8Hz，2H)，8.01(d，J＝7.1Hz，1H)，10.79(s，1H).
实施例5：Pyrintegrin衍生物的合成
将2，4-二氯嘧啶4(1.0当量)，R1NH2(1.2当量)和二异丙基乙胺(1.2当量)在正丁醇中的混合物在80℃下加热过夜。蒸发溶剂，并通过快速柱色谱法纯化残余物，以良好的收率(＞80％)得到中间体10，然后用DMF中的R2NH2(1.2当量)处理该中间体，加入对甲苯磺酸(在二噁烷中2M)(1.2当量)。将反应混合物在90℃下搅拌过夜，然后通过制备性HPLC直接纯化，以良好的收率得到Pyrintegrin衍生物11。
要理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且本领域熟练技术人员建议依照它们的多种改进或变化并且这些改进或变化要包括在本申请的精神和界限以及后附的权利要求的范围内。本文引用的所有出版物，专利和专利申请的全部内容通过引用合并于此用于所有目的。

Claims (7)

1.具有下式的化合物：
其中，
L2是未被取代的C1-C6亚烷基；
y是0至1的整数；
z是0至1的整数；
X是N或CH；
R1是氢或未被取代的C1-6烷基；
R3是-OR18,或取代或未被取代的C1-6烷基,其中所述取代的C1-6烷基被卤素取代；
R4是-OR18；并且
R18是氢,或未被取代的C1-6烷基，
或所述化合物的药用盐。
2.权利要求1所述的化合物，其中L2是亚甲基。
3.权利要求1所述的化合物，其中R1是氢。
4.权利要求1所述的化合物，其中
L2是亚甲基；
X是N或CH；
R1是氢；并且
y和z是0。
5.权利要求1所述的化合物，具有下式：
6.权利要求1所述的化合物，具有下式：
7.权利要求1所述的化合物，具有下式：
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