JP7477983B2 - 細胞凝集抑制剤 - Google Patents
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Description
(2)前記浮遊培養工程で得られた細胞を、PKC活性化剤を含まない液体培地中で浮遊培養する工程を含む、(1)記載の製造方法。
(3)前記PKC活性化剤が、ブリオスタチン1、オカダ酸、オレイン酸、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート(PMA)、ホルボール12,13-ジブチラート、プロストラチン、インゲノール3-アンゲラート、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、1-オレオイル-2-アセチル-sn-グリセロール(OAG)、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチル-sn-グリセロール、DPC-LA、及びPIP2からなる群より選択される少なくとも1つである、(1)に記載の製造方法。
(4)前記PKC活性化剤の前記液体培地中における含有濃度が250pM以上40μM以下である、(1)から(3)のいずれかに記載の製造方法。
(5)前記液体培地が、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つを含有する、(1)から(4)のいずれかに記載の製造方法。
(6)前記増殖因子がFGF2及び/又はTGF-β1である、(5)に記載の製造方法。
(7)前記ROCK阻害剤がY-27632である(5)又は(6)に記載の製造方法。
(8)前記細胞が幹細胞である、(1)から(7)のいずれかに記載の製造方法。
(9)前記幹細胞が多能性幹細胞である、(8)に記載の製造方法。
(10)前記細胞凝集塊のOCT4、SOX2、及びNanogの陽性細胞比率がいずれも85%以上である、(1)から(9)のいずれかに記載の製造方法。
(12)前記PKC活性化剤が、ブリオスタチン1、オカダ酸、オレイン酸、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート(PMA)、ホルボール12,13-ジブチラート、プロストラチン、インゲノール3-アンゲラート、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、1-オレオイル-2-アセチル-sn-グリセロール(OAG)、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチル-sn-グリセロール、DPC-LA、及びPIP2からなる群より選択される少なくとも1つである、(11)に記載の細胞凝集抑制剤。
(13)前記PKC活性化剤の含有濃度が500pM以上100mM以下である、(11)又は(12)に記載の細胞凝集抑制剤。
(14)増殖因子及び/又はROCK阻害剤をさらに含有する、(11)から(13)のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
(15)前記増殖因子がFGF2及び/又はTGF-β1である、(14)に記載の細胞凝集抑制剤。
(16)前記ROCK阻害剤がY-27632である、(14)又は(15)に記載の細胞凝集抑制剤。
(17)前記細胞が幹細胞である、(11)から(16)のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
(18)前記幹細胞が多能性幹細胞である、(17)に記載の細胞凝集抑制剤。
(21)前記PKC活性化剤が、ブリオスタチン1、オカダ酸、オレイン酸、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート(PMA)、ホルボール12,13-ジブチラート、プロストラチン、インゲノール3-アンゲラート、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、1-オレオイル-2-アセチル-sn-グリセロール(OAG)、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチル-sn-グリセロール、DPC-LA、及びPIP2からなる群より選択される少なくとも1つである、(20)に記載の浮遊培養用培地。
(22)前記PKC活性化剤の含有濃度が250pM以上40μM以下である、(20)又は(21)に記載の浮遊培養用培地。
(23)増殖因子及び/又はROCK阻害剤をさらに含有する、(20)から(22)のいずれかに記載の浮遊培養用培地。
(24)前記増殖因子がFGF2及び/又はTGF-β1である、(23)に記載の浮遊培養用培地。
(25)前記ROCK阻害剤がY-27632である、(23)又は(24)に記載の浮遊培養用培地。
(26)前記細胞が幹細胞である、(20)から(25)のいずれかに記載の浮遊培養用培地。
1-1.概要
本発明の第1の態様は、細胞凝集抑制剤である。本態様の細胞凝集抑制剤は、浮遊培養用の薬剤であって、プロテインキナーゼC(Protein Kinase C:本明細書では、しばしば「PKC」と表記する)の活性を促進又は増幅する薬剤、すなわちPKC活性化剤を有効成分として含むことを特徴とする。本態様の細胞凝集抑制剤によれば、浮遊培養中の細胞における凝集を抑制し、細胞凝集塊の形成を阻害又は抑制することができる。それによって、浮遊培養系による細胞凝集塊の製造方法において、細胞凝集塊のサイズを適度に調製することができる。
本明細書で使用する以下の用語について定義する。なお、特に断りのない限り、本項に記載の以下の定義は、本発明の他の態様においても共通する。
本明細書において発明の対象となる「細胞」は、浮遊培養が可能な接着性細胞である。「接着性細胞」とは、細胞間接着、又は細胞-基質間接着が可能な細胞をいい、この接着性細胞が細胞又は基質と接着することを「細胞接着」という。本明細書では、特に断りのない限り、細胞接着とは細胞間接着を指すものとする。
本明細書において「細胞凝集」とは、複数の細胞が三次元的に集合して、集塊を形成することをいう。異なる細胞による凝集と同一細胞による凝集があるが、本明細書ではいずれの凝集も包含する。同一細胞による凝集は、1つの細胞の増殖によって集塊が形成される場合も含む。細胞凝集の機構としては、限定はしないが、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着等が挙げられる。
「PKC」(プロテインキナーゼC)は、基質タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化するタンパク質キナーゼの一種である。少なくとも11種類のアイソザイムが存在し、大きなファミリーを形成している。PKCは、細胞増殖や細胞死、遺伝子の転写及び翻訳、細胞の形態、細胞間接触等、多くの細胞機能の制御に関与している。
本明細書において「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養容器等の外部マトリクスに対して細胞が非接着の状態をいう。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。限定はしないが、本明細書では、細胞を三次元的に培養して大量生産するための方法として使用される。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。本発明で細胞凝集塊を製造し、またそのサイズを調節するために、対象となる培養法は、浮遊培養法である。ただし、維持培養で使用される培養法は、この限りではない。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。
本態様の細胞凝集抑制剤は、細胞の浮遊培養用の薬剤であって、細胞凝集を抑制する必須の有効成分としてPKC活性化剤を含む。
本発明の細胞凝集抑制剤によれば、浮遊培養系において細胞間の接着を抑制することができ、細胞同士の過度な凝集を抑制することで細胞凝集塊の過度な成長を抑え、そのサイズを制御することができる。また、本発明の細胞凝集抑制剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化状態を維持することができる。
2-1.概要
本発明の第2の態様は、細胞凝集抑制方法である。本発明の細胞凝集抑制方法は、第1態様の細胞凝集抑制剤又はその有効成分を含む培地で細胞を浮遊培養することによって、培養液中の細胞の凝集を抑制する方法である。本発明の細胞凝集抑制方法によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を抑制することができる。
本態様の方法の基本工程は、浮遊培養工程を必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化状態を維持して細胞を増殖させるために培養する、本発明における選択工程である。維持培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。
本工程で使用する細胞は、浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「1-2.用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、幹細胞が好ましく、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、NunclonTM Sphera(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を培養容器として使用できる。
本工程で使用する培地は、分化誘導因子を含まない液体培地である。
培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば12ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり3.5cm2)を使用する場合は、1ウェルあたりの量を0.5mL以上、1.5mL以下、好ましくは約1.3mLとすることができる。また、6ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり9.6cm2)を使用する場合には、1ウェルあたりの量を下限は1.5mL以上、2mL以上、又は3mL以上とすることができ、また上限は6.0mL以下、5mL以下、4mL以下とすることができる。さらに、125mL三角フラスコ(容量が125mLの三角フラスコ)を使用する場合は、容器当たりの量を下限は10mL以上、15mL以上、20mL以上、25mL以上、20mL以上、25mL以上、又は30mL以上とすることができ、また上限は50mL以下、45mL以下、又は40mL以下とすることができる。また、容量が500mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は100mL以上、105mL以上、110mL以上、115mL以上、又は120mL以上とすることができ、また上限は150mL以下、145mL以下、140mL以下、135mL以下、130mL以下、又は125mL以下とすることができる。さらに、容量が1000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は250mL以上、260mL以上、270mL以上、280mL以上、又は290mL以上とすることができ、また上限は350mL以下、340mL以下、330mL以下、320mL以下、又は310mL以下とすることができる。例えば容量が2000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は500mL以上、550mL以上、600mL以上とすることができ、また上限は1000mL以下、900mL以下、800mL以下、700mL以下とすることができる。容量が3000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は1000mL以上、1100mL以上、1200mL以上、1300mL以上、1400mL以上、1500mL以上とすることができ、また上限は2000mL以下、1900mL以下、1800mL以下、1700mL以下、1600mL以下とすることができる。さらに、例えば容量が2Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は100mL以上、200mL以上、300mL以上、400mL以上、500mL以上、600mL以上、700mL以上、800mL以上、900mL以上、又は1000mL以上とすることができ、上限は2000mL以下、1900mL以下、1800mL以下、1700mL以下、1600mL以下、1500mL以下、1400mL以下、1300mL以下、1200mL以下、又は1100mL以下とすることができる。また、容量が10Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は500mL以上、1L以上、2L以上、3L以上、4L以上、又は5L以上とすることができ、上限は10L以下、9L以下、8L以下、7L以下、又は6L以下とすることができる。例えば容量が20Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は1L以上、2L以上、3L以上、4L以上、5L以上、6L以上、7L以上、8L以上、9L以上、10L以上とすることができ、上限は20L以下、19L以下、18L以下、17L以下、16L以下、15L以下、14L以下、13L以下、12L以下、11L以下とすることができる。例えば容量が50Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は1L以上、2L以上、5L以上、10L以上、15L以上、20L以上、25L以上とすることができ、上限は50L以下、45L以下、40L以下、35L以下、30L以下とすることができる。
培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度(播種密度)は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は0.01×105 cells/mL以上、0.1×105 cells/mL以上、1×105 cells/mL以上、又は2×105 cells/mL以上、そして、上限は20×105 cells/mL以下、又は10×105cells/mL以下の範囲にあればよい。後述する第3態様の細胞凝集塊製造方法では、播種密度をこの範囲にしたときに、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易いため好ましい。
培養温度、時間、CO2濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が20℃以上、又は35℃以上、そして上限が45℃以下、又は40℃以下であればよいが、好ましくは37℃である。また、培養時間は下限が0.5時間以上又は6時間以上、そして上限が7日間以下、6日間以下、5日間以下、4日間以下、72時間以下、又は48時間以下の範囲にあればよい。培養時のCO2濃度は、下限が4%以上、又は4.5%以上、そして上限が10%以下、又は5.5%以下であればよいが、好ましくは5%である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、5日に1回以上、4日に1回以上、3日に1回以上、2日に1回以上、1日に1回以上、又は1日に2回以上で行えばよいがそれらに限定されない。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。
培養中の培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよいが、好ましくは流動培養である。
本工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ(PBSバッファを含む)、生理食塩水、又は培地(次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい)で洗浄後、次の工程に供すればよい。
「浮遊培養工程」は、第1態様に記載の細胞凝集抑制剤又はその有効成分であるPKC活性化剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する、本発明における必須の工程である。
本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「2-2-1.維持培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは維持培養工程に既述の方法と共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。
本工程で使用する細胞は、限定はしないが、維持培養工程後に調製された細胞が好ましい。細胞の種類も、維持培養工程に記載のように、幹細胞が好ましく、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。
本工程は、分化誘導因子を含まず、PKC活性化剤を含む液体培地で培養することを最大の特徴とし、この点において、維持培養工程で使用する培地と相違する。培地の種類は、細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。
本工程では、浮遊培養を行う。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。PKC活性化剤を含む培地で目的の細胞を浮遊培養することによって、その細胞の凝集を抑制することができる。
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
浮遊培養法で培養した場合、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態5分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば100×g以上、300×g以上、800×g以上、又は1000×g以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば1600×g以下、1500×g以下、又は1400×g以下であればよい。また処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば30秒以上、1分以上、3分以上、又は5分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば10分以下、8分以下、6分以下、又は30秒以下であればよい。濾過(フィルトレーション)で液体成分を除去する場合、例えば、不織布や市販のメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、フィルターに残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム(カネカ社)のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。
接着培養法で培養した場合、培養後、多くの細胞は培養容器や培養担体等の外部マトリクスに接着した状態で存在する。したがって、培養容器から培養液を除去するには、培養後の容器を静かに傾けて液体成分を流し出せばよい。外部マトリクスに接着した細胞が培養容器内に残るため、培養液と細胞を容易に分離することができる。
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
本態様の細胞凝集抑制方法によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に抑制することにより、細胞凝集塊の過度な成長を抑制することができる。
3-1.概要
本発明の第3の態様は、細胞凝集塊製造方法、及びその方法で得られる細胞凝集塊である。本発明の細胞凝集塊製造方法は、第2態様の細胞凝集抑制方法を用いて、生産物として細胞凝集塊を得る方法である。本製造方法によれば、細胞凝集を抑制して、適度なサイズの細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法における基本工程は、第2態様の細胞凝集抑制方法に準ずる。すなわち、必須の工程として浮遊培養工程を、また選択工程として維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、前述の通りである。
本態様の細胞凝集塊製造方法により、浮遊培養に適切なサイズの細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、浮遊培養において細胞の凝集を適度に抑制し、適当なサイズの細胞凝集塊を製造することで、未分化状態を維持した細胞凝集塊を効率的に製造し、また死細胞頻度を低減させることができる。
4-1.概要
本発明の第4の態様は、多能性幹細胞集団製造方法である。本発明の多能性幹細胞集団製造方法は、第2態様の細胞凝集抑制方法を用いて、多能性幹細胞凝集塊を培養する方法である。本製造方法によれば、多能性幹細胞凝集を抑制して、適度なサイズの多能性幹細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の多能性幹細胞集団製造方法における基本工程は、第2態様の細胞凝集抑制方法に準ずる。すなわち、必須の工程として、ROCK阻害剤及びPKC活性化剤を含む培地で多能性幹細胞を播種し、浮遊培養する工程(第一工程)を含み、また選択工程として、ROCK阻害剤非存在下において、PKC活性化剤を含む液体培地中で多能性幹細胞凝集塊を浮遊培養する工程(第二工程)、維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、原則として第2態様に記載の通りである。
本態様の多能性幹細胞集団製造方法によれば、適切なサイズの多能性幹細胞凝集塊を、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ培養することができる。例えば、本態様の多能性幹細胞集団製造方法により得られた多能性幹細胞集団において、多能性幹細胞マーカー(例えばOCT4、SOX2、Nanog)を発現する及び/または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合(比率)は、例えば90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以下である。
本態様の多能性幹細胞集団製造方法によれば、浮遊培養において多能性幹細胞の凝集を適度に抑制しながら、適当なサイズの多能性幹細胞凝集塊を製造することができる。特に、未分化状態を維持した多能性幹細胞凝集塊を効率的に製造し、また死細胞頻度を低減させることができる。
5-1.概要
本発明の第5の態様は、細胞の浮遊培養用培地である。本態様の浮遊培養用培地を使用すれば、培地中で細胞凝集塊の凝集を抑制することができる。
本態様の細胞の浮遊培養用培地は、第1態様に記載の細胞凝集抑制剤、又はその有効成分であるPKC活性化剤を少なくとも含み、浮遊培養における細胞凝集塊の形成を抑制するための細胞増殖用培地で構成される。
本発明の浮遊培養用培地を用いて細胞を浮遊培養すれば、細胞の凝集を抑制することができる。
6-1.概要
本発明の第6の態様は、細胞凝集抑制キットである。本態様のキットは、PKC活性化剤を必須の構成要素として含み、細胞内のPKC活性を促進、又は増幅することで、浮遊培養における細胞の凝集を抑制する。本態様の細胞凝集抑制キットを用いることで、細胞の凝集を抑制して、適度なサイズの細胞凝集塊を形成することができる。
本態様の細胞凝集抑制キットは、必須の構成要素としてPKC活性化剤を、また選択的構成要素として培地、及び/又はプロトコルを包含する。
(目的)
本発明の細胞凝集抑制剤を含まない培地でヒトiPS細胞を浮遊培養したときの細胞凝集塊の形成、培養上清中のグルコース濃度、及びL-乳酸濃度について検証した。
(1)工程1
Vitronectin(VTN-N)Recombinant Human Protein,Truncated(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を0.5μg/cm2でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトiPS細胞201B7株(京都大学iPS細胞研究所)を播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で接着培養を行った。培地はStemFit(登録商標)AK02N(味の素社)を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみY-27632(富士フイルム和光純薬社)を最終濃度が10μMとなるように培地に添加した。
前記工程1で接着培養したヒトiPS細胞201B7株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をROCK阻害剤であるY-27632を最終濃度10μMで含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を1mLあたり2×105個の細胞を含むように、再び最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて調製した。浮遊培養用12ウェルプレートに1ウェルあたり1.3mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー(オプティマ社)上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養5日目まで浮遊培養を行い、培養1、3、4日目に培地交換を実施した。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を回収し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに細胞凝集塊を再懸濁し、元のウェルに戻した。培養1日目の培地交換では、培地交換用のStemFit(登録商標)AK02N培地にY-27632を最終濃度5μMで添加し、培養3日目及び4日目ではY-27632を添加しなかった。
培養1日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。位相差画像を図1のAに示す。PKC活性化剤を含まないStemFit(登録商標)AK02N培地では細胞が凝集し、培養1日目で大小の細胞凝集塊が形成された。培養5日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を回収した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。トリパンブルーは死細胞を染色する。
(目的)
本発明の細胞凝集抑制剤の有効成分であるPKC活性化剤を含む培地でヒトiPS細胞を浮遊培養したときの細胞凝集塊の形成、培養上清中のグルコース濃度、及びL-乳酸濃度について検証した。
浮遊培養の播種培地に対し、PKC活性化剤であるPMA(12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート)を最終濃度1μMで添加した点を除き、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
培養1日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。位相差画像を図1のBに示す。実施例1では比較例1と比較して顕著に小さい細胞凝集塊が形成された。この結果から、PKC活性化剤には細胞凝集を抑制する効果があることが示された。
(目的)
本発明の細胞凝集抑制剤を含まない培地でヒトiPS細胞を浮遊培養したときの細胞凝集塊の形成について検証した。
浮遊培養を培養1日目で終了した点を除き、比較例1と同じ方法で実施した。培養1日目の細胞凝集塊の位相差画像を図5のAに示す。
(目的)
本発明の細胞凝集抑制剤の有効成分であるPKC活性化剤を様々な濃度で含む培地でヒトiPS細胞を浮遊培養したときの細胞凝集塊の形成について検証した。
PKC活性化剤を培地に添加した点を除き、比較例2と同じ方法で実施した。浮遊培養の播種培地に添加するPKC活性化剤はPMAとし、最終濃度30μM、10μM、100nM、10nM、1nM、及び300pMで添加した。
培養1日目の細胞凝集塊の位相差画像を図5に示す。PMAの最終濃度は、Bが30μM、Cが10μM、Dが100nM、Eが10nM、Fが1nM、そしてGが300pMである。比較例2と比較して、実施例2では、顕著に小さい細胞凝集塊が形成された。この結果から、PKC活性化剤は、少なくとも最終濃度300pM以上30μM以下の濃度範囲で添加すれば細胞凝集を抑制できることが示された。
(目的)
PKC活性化剤存在下での浮遊培養によるヒトiPS細胞の未分化状態を維持について検証した。
浮遊培養の播種培地にPKC活性化剤としてPMAを最終濃度300nMで添加し、培地交換を行わずに培養した。培養方法は、培養2日目まで浮遊培養した点を除いて、比較例2と同じである。培養2日目に細胞凝集塊をAccutaseで処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をPBSで洗浄し、4%PFA(パラホルムアルデヒド)により室温で20分間固定後、PBSで3回洗浄した。続いて、冷メタノールにより-20℃で一晩透過処理を行った。さらに、PBSで3回洗浄後、3%FBS(ウシ胎仔血清)/PBSにより室温で1時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを2つに分けてそれぞれ50μLずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗OCT4、抗SOX2、及び抗NANOG抗体をそれぞれ加えて混合し、もう一方には蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体を加えて混合し、4℃、遮光状態で1時間染色した。使用した抗体とその添加量を表1に示す。
結果を表2及び図6に示す。
Claims (7)
- 細胞凝集塊の製造方法であって、
液体培地中で細胞を浮遊培養する工程を含み、
前記細胞凝集塊のサイズが30μm以上、1000μm以下であり、
前記液体培地は、分化誘導因子を含まず、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート(PMA)を含む、前記製造方法。 - ブリオスタチン1、オカダ酸、オレイン酸、ホルボール12,13-ジブチラート、プロストラチン、インゲノール3-アンゲラート、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、1-オレオイル-2-アセチル-sn-グリセロール、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチル-sn-グリセロール、DPC-LA、及びPIP2からなる群より選択される少なくとも1つをさらに含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート(PMA)の前記液体培地中における含有濃度が250pM以上40μM以下である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記液体培地が、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つを含有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記増殖因子がFGF2及び/又はTGF-β1である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記ROCK阻害剤がY-27632である請求項4又は5に記載の製造方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項1から6のいずれか1項に記載の製造方法。
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