JP2023114300A - 人工多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】フィーダー細胞を使用することなく、また基材に細胞を接着させることなく体細胞を初期化することが可能な、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法を提供する。【解決手段】ｉＰＳ細胞の製造に際して、以下の工程を実施する：Ｉ．液体培地中の体細胞に初期化遺伝子を導入する工程；及びＩＩ．前記遺伝子導入した細胞を、非ゲル化培地中で、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で初期化及び増幅培養を行う工程。【選択図】なし

Description

本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を浮遊培養条件下で製造する方法に関する。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化は、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性がある。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管内で分化誘導する技術が既に開発されている。また、分化誘導した体細胞を移植した際に、多くの人で免疫拒絶が生じ難いＨＬＡホモ型のｉＰＳ細胞のストックを作製する試みが実施されており、また、最近では、患者への移植の際の免疫拒絶等のリスクを最小化するために、それぞれの患者自身のｉＰＳ細胞を作製する試みも行われている。

ｉＰＳ細胞の作製技術に代表される細胞初期化技術は、生命科学、創薬、及び再生医療における革新的基盤技術として急速に進展してきた。ｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣ等の初期化因子を体細胞に導入することによって誘導される（特許文献１、２及び非特許文献１、２）。これらの初期化因子はいずれも転写因子として、自己複製や多能性に関与する遺伝子群の発現を制御し、それによって体細胞の初期化を誘導すると考えられている。なお、これら初期化因子を体細胞に導入することによってのみｉＰＳ細胞が誘導されるわけではなく、初期化因子導入後に一定期間培養することによって徐々にｉＰＳ細胞へと誘導され樹立が完了する。さらにクローニング等により、好ましい状態に誘導されたｉＰＳ細胞を選別することが必要な場合もある。つまり、ｉＰＳ細胞の樹立は様々な要因の影響を受ける。

上記のようにして樹立したｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ細胞ストックとして大学や企業などの各利用機関に分譲または販売するために、拡大培養した後にバイアルなどの保存容器に小分けされて保存（例えば冷凍保存）されることや、あるいは、各患者に投与する製剤を作製するために、拡大培養した後に分化誘導に供されることがある。それらの拡大培養におけるｉＰＳ細胞の培養方法は、平坦な基板上に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するため、スケールアップに膨大な面積が必要となり、再生医療に必要な量の細胞を供給することが困難である。これに対して、浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養するため、スケールアップが容易であり、細胞の大量生産に適している。例えば、非特許文献３には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。また、特許文献３には、多能性幹細胞を浮遊培養する際に、未分化の状態を維持するために、培地中にプロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤とタンキレース阻害剤（ＴＮＫＳ阻害剤）を存在させる方法が開示されている。

国際公開第２００７／０６９６６６号 特開２００８－２８３９７２号公報 国際公開第２０２１／１６２０９０号

Takahashi K. and Yamanaka S., Cell, 2006, Aug 25;126(4):663-76. Takahashi K. et al., Cell, 2007, Nov 30;131(5):861-72. Sumi T, et al., PLos One, 2013; 8(5):e63378

上述した通り、樹立が完了したｉＰＳ細胞を、未分化状態を維持したまま浮遊培養を行う方法については公知である。しかしながら、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞を取得する段階を浮遊培養条件下で実施し、高純度のｉＰＳ細胞を樹立する方法は知られていない。通常、ｉＰＳ細胞の樹立は、ｉＰＳ細胞に変化しつつある細胞やｉＰＳ細胞が安定化しやすい接着培養条件下で実施されるが、フィーダー細胞や細胞外マトリックスの使用が必要となり、使用するフィーダー細胞や細胞外マトリックスの種類、培養条件等の違いによっては、必ずしも高品質のｉＰＳ細胞が得られない、という問題があった。また、接着培養条件下でのｉＰＳ細胞の樹立は、コロニー選抜等の工程が必要であったりして煩雑になることがあり、上述したような患者個々人のｉＰＳ細胞を作製するためのハイスループット化や自動化が困難であるという問題があった。

本発明の目的は、フィーダー細胞を使用することなく、また基材上に細胞を接着させることなく体細胞を初期化することが可能な、ｉＰＳ細胞の製造方法を提供することにある。

本発明は、以下を包含する。
（１）以下の工程Ｉ及びＩＩを含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法：
Ｉ．体細胞に初期化遺伝子を導入する工程；及び
ＩＩ．前記遺伝子導入した細胞を、非ゲル化培地中で、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で初期化及び増幅培養を行う工程。
（２）さらに以下の工程ＩＩＩ及びＩＶを含む、（１）に記載の方法：
ＩＩＩ．前記工程ＩＩで得られた細胞のうち、未分化マーカー陽性細胞を分取する工程；及び
ＩＶ．工程ＩＩＩで分取した細胞を浮遊培養して細胞集団を得る工程。
（３）前記工程ＩＩの増幅培養が浮遊旋回方式で行われるものであり、その旋回速度が１０～１００ｒｐｍである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記工程ＩＩの増幅培養が浮遊攪拌方式で行われるものであり、その攪拌翼の回転速度は、翼先端速度が０．０５～１．３７ｍ／ｓの範囲である、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）前記増幅培養が培養スケールの変更を伴う継代培養を含み、培養スケールの変更の前後において、体積当たりの攪拌所要動力若しくは翼先端速度の変化が１０％未満となるように攪拌翼の回転数が設定される、（４）に記載の方法。
（６）前記工程ＩＩＩが、分取した細胞を分画する工程である（２）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記未分化マーカーが、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である、（２）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記体細胞が、血液単核球である、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記体細胞に導入する遺伝子が、エピソーマルプラスミドあるいはセンダイウイルスに組み込まれて体細胞に導入される、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記導入する初期化遺伝子が、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びＬ－ＭＹＣ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１を含む、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記工程ＩＩが細胞凝集塊を回収する工程を含む、（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記工程ＩＶが細胞凝集塊を回収する工程を含む、（２）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記工程ＩＶで得られる細胞集団において、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である、（２）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）（１）～（１７）のいずれかに記載の方法により製造されるｉＰＳ細胞を含む、細胞集団。
（１９）前記工程ＩＩ、及び／又は前記工程ＩＶにおいて、細胞が、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びＷＮＴ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含む液体培地中で培養される、（１）～（１７）のいずれか１項に記載の方法。

本発明によれば、フィーダー細胞を使用することなく、また基材上に細胞を接着させることなく体細胞を初期化することが可能な、ｉＰＳ細胞の製造方法を提供することが可能である。

エピソーマルプラスミドを用いて初期化した細胞を、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の存在下で浮遊培養した細胞の、ＴＲＡ－１－６０抗体及びＳＳＥＡ－４抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。（Ａ）は全イベントの前方散乱光（ＦＳＣ）に対する側方散乱光（ＢＳＣ）のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた部分をゲーティングした。（Ｂ）は、（Ａ）でゲーティングした細胞のＴＲＡ－１－６０の蛍光強度とＳＳＥＡ－４の蛍光強度のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた範囲の細胞を分取した。（Ｃ）は、ＴＲＡ－１－６０蛍光強度のヒストグラムプロットを、（Ｄ）は、ＳＳＥＡ－４の蛍光強度のヒストグラムプロットを示す。 エピソーマルプラスミドを用いて初期化した細胞を、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の不存在下で浮遊培養した細胞の、ＴＲＡ－１－６０抗体及びＳＳＥＡ－４抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。（Ａ）は全イベントの前方散乱光（ＦＳＣ）に対する側方散乱光（ＢＳＣ）のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた部分をゲーティングした。（Ｂ）は、（Ａ）でゲーティングした細胞のＴＲＡ－１－６０の蛍光強度とＳＳＥＡ－４の蛍光強度のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた範囲の細胞を分取した。（Ｃ）は、ＴＲＡ－１－６０蛍光強度のヒストグラムプロットを、（Ｄ）は、ＳＳＥＡ－４の蛍光強度のヒストグラムプロットを示す。 実施例２におけるフローサイトメトリーで分取した、エピソーマルプラスミドを用いて初期化した細胞を、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の存在下及び不存在下で浮遊培養した、５継代目の細胞の細胞凝集塊の顕微鏡写真を示す。（Ａ）がＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の存在下で培養した細胞凝集塊、（Ｂ）がＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の不存在下で培養した細胞の細胞凝集塊の顕微鏡写真である。 初期化細胞の３つのクローン（＃１、＃２及び＃３）をＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の存在下で浮遊培養した、１１継代目の細胞凝集塊の顕微鏡写真である。（Ａ）がクローン＃１、（Ｂ）がクローン＃２、（Ｃ）がクローン＃３の細胞凝集塊の顕微鏡写真である。

１．人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法
１－１．概要
本発明のｉＰＳ細胞の製造方法（以下、「本発明の方法」とも称する）は、以下の工程Ｉ及びＩＩを含む、ことを特徴とする。
Ｉ．液体培地中の体細胞に初期化遺伝子を導入する工程；及び
ＩＩ．前記遺伝子導入した細胞を、非ゲル化培地中で、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で初期化及び増幅培養を行う工程。
さらに、本発明の方法は、任意で以下の工程ＩＩＩ及びＩＶを含む。
ＩＩＩ．前記工程ＩＩで得られた細胞のうち、未分化マーカー陽性細胞を分取する工程；及び
ＩＶ．工程ＩＩＩで分取した細胞を浮遊培養して細胞集団を得る工程。
本発明の方法は、上記の特徴を有することで、浮遊培養条件下で、フィーダー細胞を用いることなく、また基材上に細胞を接着させることなくｉＰＳ細胞を得ることを可能とする。

１－２．用語の定義
本明細書で使用する用語について、以下に定義する。
＜細胞＞
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、生体を構成するほぼすべての種類の細胞（組織細胞や生殖細胞）に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的に、多能性とは、個体を構成する胚葉（脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉）に分化できる能力を意味するが、このような細胞としては、胚性幹細胞、（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、生殖系幹細胞（ＧＳ細胞：Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、誘導多能性幹細胞とも呼ばれる）が知られる。「ｉＰＳ細胞」は、本明細書において発明の対象となる細胞であり、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって、体細胞が未分化状態へと初期化された多能性幹細胞をいう。

本明細書において「体細胞」とは、動物個体を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞をいう。本明細書において体細胞は、初期化誘導によって多能性を獲得し得る細胞であれば、限定しない。また、体細胞が由来する生物種は、多細胞生物であれば特に限定されないが、動物由来細胞、特に哺乳動物由来細胞であることが好ましい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜及び愛玩動物、並びに、ヒト、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類に由来する細胞が挙げられる。特に、ヒト由来細胞であることが好ましい。体細胞が由来する組織や器官は特に限定されないが、採取しやすく、効率的に初期化が誘導され得るものが好ましい。例えば、皮膚、肝臓等の臓器、血液、尿、がん組織、歯髄細胞等であってもよい。また、体細胞は分化細胞であるか未分化細胞であるかは問わないものとし、株化細胞であっても、組織から単離された初代培養細胞であってもよい。好ましくは分化細胞である。本明細書における体細胞の一例としては、ヒト線維芽細胞、ヒト上皮細胞、ヒト肝細胞、ヒト血液細胞、間葉系細胞、神経細胞、筋肉細胞等が挙げられる。

＜初期化（リプログラミング）＞
本明細書において「初期化（リプログラミング）」とは、体細胞から別の細胞種へと変化させる操作又は過程をいう。一般的には、分化細胞を脱分化させて未分化細胞の状態に変化することをいう。本明細書では、特に断りのない限り、体細胞からｉＰＳ細胞へと変化させる操作又は過程をいう。

本明細書において「初期化誘導」、又は「初期化を誘導する」とは、初期化を引き起こし得る操作を細胞に与えて、実際に初期化された状態にすることを意味する。これに対して、「初期化誘導を行う」とは、初期化を引き起こし得る操作を細胞に与えることを意味し、実際に初期化されるか否かを問わない。例えば、「初期化誘導を行う」とは、初期化に必要なリプログラミング因子を体細胞に導入し、導入後の体細胞を所定の条件下で培養する操作を行うことをいう。

本明細書において「初期化因子（リプログラミング因子）」とは、単独で、又は他の因子と共に、体細胞に導入することによって、体細胞の初期化を引き起こし得る因子をいう。本明細書において、タンパク質や遺伝子であること等を特定せず、単に「初期化因子」という場合、その初期化因子が該当するタンパク質、当該タンパク質をコードする核酸、又は当該核酸を含む遺伝子発現ベクターのいずれかを意味するものとする。本明細書において、特に、前記タンパク質をコードする核酸は、「初期化遺伝子」とも称する。初期化因子には、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣの４因子（本明細書においてしばしば「初期化４因子」という）のいずれか、並びに前記初期化４因子のいずれかの関連因子が例示される。

本明細書において初期化４因子の「関連因子」とは、初期化４因子のいずれかの因子の代わりに体細胞に導入することによって、体細胞の初期化を誘導し得る因子をいう。

本明細書において、初期化因子が由来する動物種は問わない。初期化因子が由来する動物種は、例えば哺乳動物種である。例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等のいかなる哺乳動物種であってもよい。好ましくは、ヒトである。

初期化因子及びその関連因子を以下で例示するが、本明細書における初期化因子とその関連因子は以下の例に限定されない。

ＯＣＴ３／４の具体例としては、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるヒトＯＣＴ３／４タンパク質等が挙げられる。また、ＯＣＴ３／４の関連因子としては、ＮＲ５Ａ２（ＬＲＨ１）、ＴＢＸ３等が挙げられる。

ＫＬＦ４の具体例としては、配列番号４で示すアミノ酸配列からなるヒトＫＬＦ４タンパク質が挙げられる。また、ＫＬＦ４の関連因子として、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、本発明の変異型ＫＬＦ等が挙げられる。例えば、配列番号２で示すアミノ酸配列からなるヒトＫＬＦ１タンパク質、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるヒトＫＬＦ２タンパク質、配列番号５で示すアミノ酸配列からなるヒトＫＬＦ５タンパク質等が挙げられる。

Ｃ－ＭＹＣの具体例としては、配列番号６で示すアミノ酸配列からなるヒトＣ－ＭＹＣタンパク質が挙げられる。また、Ｃ－ＭＹＣの関連因子として、Ｃ－ＭＹＣのＴ５８Ａ変異体、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ等が挙げられる。例えば、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるヒトＮ－ＭＹＣタンパク質、及び配列番号８で示すアミノ酸配列からなるヒトＬ－ＭＹＣタンパク質等が挙げられる。

ＳＯＸ２の具体例としては、配列番号１０で示すアミノ酸配列からなるヒトＳＯＸ２タンパク質等が挙げられる。また、ＳＯＸ２の関連因子として、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、及びＳＯＸ１８等が挙げられる。例えば、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるヒトＳＯＸ１タンパク質、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるヒトＳＯＸ３タンパク質、配列番号１２で示すアミノ酸配列からなるヒトＳＯＸ１５タンパク質、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるヒトＳＯＸ１８タンパク質等が挙げられる。

この他、初期化因子やその関連因子の例としては、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＬＩＮ４１、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ＨＭＧＡ２等が挙げられる。

＜細胞凝集塊＞
本明細書において「細胞凝集塊」とは、浮遊培養において細胞凝集によって形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイド、あるいは、アグリゲートとも呼ばれる。細胞凝集塊は、通常、略球状を呈する。細胞凝集塊を構成する細胞は、１種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒトｉＰＳ細胞又はヒト胚性幹細胞等のｉＰＳ細胞で構成された細胞凝集塊は、未分化マーカーを発現している及び／又は未分化マーカーが陽性を呈する細胞を含む。

未分化マーカーは、ｉＰＳ細胞で特異的に又は過剰に発現している遺伝子マーカーで、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。

未分化マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞凝集塊を構成する細胞がｉＰＳ細胞である場合、未分化マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは９９％超１００％以下とすることができる。未分化マーカーを発現する及び／又は未分化マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。

＜培養及び培地＞
細胞培養方法は、「浮遊培養法」と「接着培養法」に大別される。本明細書において、「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養初期には培養液中でシングルセルとして存在することもあるが、培養中期以降は通常は凝集した細胞塊で存在する。「浮遊培養」とは、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養容器等の外部マトリクスに対して細胞が非接着の状態をいう。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。本明細書において、細胞を接着させたマイクロキャリア等を浮遊させて行う培養は、細胞自体は外部マトリクス等に接着しているため接着培養とする。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。

本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び／又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上含有する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。

本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’Ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地の重量比を好ましくは６０／４０以上４０／６０以下の範囲、例えば５８／４２、５５／４５、５２／４８、５０／５０、４８／５２、４５／５５、又は４２／５８等で混合した培地を用いる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。

本明細書において「培養添加物」とは、培養目的で培地に添加される血清以外の物質である。培養添加物の具体例として、限定はしないが、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及びサイトカインは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。また、増殖因子は、限定するものではないが、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ－７を使用することができる。抗生剤は、限定するものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。本発明で用いる培地の培養添加物として、特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１である。

また、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。特に、細胞がシングルセル状態である場合は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤を培地に含有することで、ｉＰＳ細胞の浮遊培養における細胞死を大幅に抑制することができる。

本発明で用いる培地は、前記培養添加物を１種以上含むことができる。前記培養添加物を添加する培地としては、限定はしないが、前記基礎培地が一般的である。

培養添加物は、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸は、２－リン酸アスコルビン酸マグネシウム等の誘導体の形態で培地に添加してもよく、セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウム等）の形態で培地に添加してもよい。また、インスリン、トランスフェリン、及びセレンに関しては、ＩＴＳ試薬（インスリン－トランスフェリン－セレン）の形態で培地に添加することもできる。また、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つが添加された市販の培地を使用することもできる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ II（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、及びＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等が挙げられる。

なお、本発明で用いる培地として好ましいものは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選択される、少なくとも１つを含有する液体培地である。また、本発明で用いる培地として好ましいものは、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１）を含む液体培地である。特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

＜ＰＫＣβ阻害剤＞
本明細書において「プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤」とは、ＰＫＣβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、Ｃ末端側の触媒領域及びＮ末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ＡＴＰ／Ｍｇ^２＋結合する配列とから構成される。調節領域はＣ１とＣ２ドメインから構成される。

ＰＫＣには、在来型（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ及びＰＫＣγがある。なお、ＰＫＣには、新型（Ｎｏｖｅｌ）アイソザイムとしてＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηがあり、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣζ、ＰＫＣλ及びＰＫＣμがある。

本明細書において、ＰＫＣβという場合、これらＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの両者を含む意味若しくはＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩのうち一方を意味する。また、本明細書においてＰＫＣβ阻害剤という場合、これら従来型、新型及び非典型アイソザイムのうち、少なくともＰＫＣβＩ及び/又はＰＫＣβＩＩを阻害する物質を意味する。すなわち、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、ＰＫＣβＩＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、及びＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

なお、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβの活性のみを特異的に阻害又は抑制する物質でもよいが、ＰＫＣβＩ又はＰＫＣβＩＩ以外に他のアイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質であってもよい。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩを含む、前述した全ての従来型、新型及び非典型アイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質でもよい。また、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に従来型アイソザイムであるＰＫＣα及びＰＫＣγの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。さらに、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に新型アイソザイムであるＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。

ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＰＫＣβをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

一例として、ＰＫＣβ阻害剤は、下記構造式［式Ｉ］を有する化合物を挙げることができる。

で表される化合物又はその塩。
式Ｉにおいて、
Ｒ_１は水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、 Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
Ｒ_Ａは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
Ｒ_３は、

、

、
又は

で表される基であり、
Ｒ_Ｂは、水素原子、－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２）により置換された炭素数２～４のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２））、又は

で表される基であり、
或いは、Ｒ_２とＲ_Ｂとが一体となって下記の二価基

を形成していてもよく、ここで、＃はＲ_２の結合位置への結合を指し、＃＃はＲ_Ｂの結合位置への結合を指し、
前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、

であり、
Ｒ_Ｃは、－Ｎ（ＲＤ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
ＲＤは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。

式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。
上記構造式［式Ｉ］を有するＰＫＣβ阻害剤としては、具体的に、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するＰＫＣβ阻害剤の中でも、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＬＹ－３３３５３１からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。

Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

ＧＦ１０９２０３Ｘ（２－［１－（３－ジメチルアミノプロピル）インドール－３－イル］－３－（インドール－３－イル）マレイミド）の構造式を下記に示す。

ＬＹ－３３３５３１（（９Ｓ）－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，１０，１１－テトラヒドロ－９Ｈ，１８Ｈ－５，２１：１２，１７－ジメテノジベンゾ［ｅ，ｋ］ピロロ［３，４－ｈ］［１，４，１３］オキサジアザシクロヘキサデシン－１８，２０（１９Ｈ）－ジオン、モノヒドロキシクロライド）の構造式を下記に示す。

Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１－メチルインドール－３－イル）－４－［１－［１－（ピリジン－２－イルメチル）ピペリジン－４－イル］インドール－３－イル］ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）キナゾリン－４－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ（３－［３－［２，５－ジヒドロ－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－３－イル］－１Ｈ－インドール－１－イル］プロピルカルバムイミドチオ酸エステルメシラート）の構造式を下記に示す。

Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（３－［（８Ｓ）－８－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，８，９－テトラヒドロピリド［１，２－ａ］インドール－１０－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン 塩酸塩）の構造式を下記に示す。

＜ＷＮＴ阻害剤＞
本明細書において「ＷＮＴ阻害剤」とは、ＷＮＴシグナル伝達タンパク質による伝達経路（ＷＮＴシグナル伝達経路）を阻害する物質全般を指す。ＷＮＴシグナル伝達経路を阻害する物質であれば、特に限定されないが、代表的なＷＮＴ阻害剤としては、タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤とＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤が挙げられる。

本明細書において「タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース（タンキラーゼと称する場合もある）は、標的タンパク質をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化するポリ（ＡＤＰ－リボシル）化酵素（ＰＡＲＰ）ファミリーに属し、タンキレース１（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－１／ＰＡＲＰ－５ａ）及びタンキレース２（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－２／ＰＡＲＰ－５ｂ）が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質ＴＲＦ１をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。

本明細書において、ＴＮＫＳという場合、これらタンキレース１及びタンキレース２の両者を含む意味若しくはタンキレース１及びタンキレース２のうち一方を意味する。また、本明細書においてＴＮＫＳ阻害剤という場合、タンキレース１及び/又はタンキレース２を阻害する物質を意味する。すなわち、ＴＮＫＳ阻害剤は、タンキレース１の活性のみを阻害又は抑制する物質、タンキレース２の活性のみを阻害又は抑制する物質及びタンキレース１並びにタンキレース２の活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

ＴＮＫＳ阻害剤は、ＴＮＫＳに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＴＮＫＳをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

一例として、ＴＮＫＳ阻害剤としては、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＭＳＣ２５０４８７７及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、ＴＮＫＳ阻害剤の中でも、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及び/又はＸＡＶ９３９を使用することが好ましい。

ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）の構造式を下記に示す。

ＸＡＶ９３９（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

Ｇ００７－ＬＫ（４－［５－［（１Ｅ）－２－［４－（２－クロロフェニル）－５－［５－（メチルスルフォニル）－２－ピリジニル］－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］エテニル］－１，３，４－オキサジアゾ－ル－２－イル］－ベンゾニトリル）の構造式を下記に示す。

Ｇ２４４－ＬＭ（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－［２－（メチルスルフォニル）フェニル］－１－ピペラジニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

ＷＩＫＩ４（２－［３－［［４－（４－メトキシフェニル）－５－（４－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］チオ］プロピル］－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）の構造式を下記に示す。

本明細書において「Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤」とは、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、ＷＮＴタンパク質の分泌に必要なプロセスであるＷＮＴタンパク質のセリン残基へのパルミトリン酸の付加を触媒する酵素である。Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤としては、例えば、ＩＷＰ－２、ＷＮＴ－Ｃ５９等が知られる。

ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゼンチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド）の構造式を下記に示す。

ＷＮＴ－Ｃ５９（４－（２－メチル－４－ピリジニル）－Ｎ－［４－（３－ピリジニル）フェニル］ベンゼンアセトアミド）の構造式を下記に示す。

＜その他＞
本明細書において「複数」とは、例えば、２～５０、２～４５、２～４０、２～３５、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０、２～７、２～５、２～４、又は２～３の整数をいう。

１－３．構成
上記した通り、本発明の方法は、以下の工程Ｉ及びＩＩを必須構成として含む。
Ｉ．液体培地中の体細胞に初期化遺伝子を導入する工程；及び
ＩＩ．前記遺伝子導入した細胞を、非ゲル化培地中で、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で初期化及び増幅培養を行う工程。

さらに本発明の方法は、以下の工程ＩＩＩ及びＩＶを任意構成として含む。
ＩＩＩ．前記工程ＩＩで得られた細胞のうち、未分化マーカー陽性細胞を分取する工程；及び
ＩＶ．工程ＩＩＩで分取した細胞を浮遊培養して細胞集団を得る工程。
以下、工程ごとに、本発明の方法の構成を説明する。

１－３－１ 初期化遺伝子導入工程（工程Ｉ）
本発明の方法の工程Ｉにおいて、体細胞に初期化遺伝子を導入する手段として、遺伝子発現ベクターを使用できる。工程Ｉは、体細胞を、初期化遺伝子を備えた遺伝子発現ベクターを含む試薬（以下、「初期化誘導剤」をも称する）と接触させる手順を備える。

（細胞）
「１－２.用語の定義」の項に記載される通り、本発明の方法において「体細胞」は、動物個体を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞を指すが、特に、侵襲性が比較的低く採取しやすい、初期化誘導が比較的容易である、浮遊細胞であるとの観点から、血液単核球、より具体的には末梢血単核球を好適に使用できる。単核球として、特に限定しないが、例えば活性型のＴ細胞を好適に使用できる。ここで、初期化遺伝子を導入するための細胞は、液体培地中、あるいはエレクトロポレーション等による遺伝子導入を実施するための専用の溶液中にあることを要する。それらの液中にあれば、浮遊した細胞であっても、接着した細胞であってもよいが、浮遊した細胞であることが好ましい。このような浮遊細胞は、液体培地中で浮遊培養された細胞であってもよく、接着培養された細胞を基材等から剥離して浮遊させた細胞であってもよい。

（遺伝子発現ベクター）
工程Ｉで使用される遺伝子発現ベクターは、必須構成要素として、プロモーター、及び初期化遺伝子を含む。本明細書において「遺伝子発現ベクター」とは、遺伝子や遺伝子断片を発現可能な状態で含み、その遺伝子等の発現を制御できる発現単位を包含するベクターをいう。本明細書において「発現可能な状態」とは、プロモーターの制御下にあるプロモーター下流域に、発現すべき遺伝子を配置していることをいう。本発明の方法に使用可能な遺伝子発現ベクターは、初期化因子を発現可能な状態で含むベクターであり、体細胞において初期化因子又はそのペプチド断片を発現することができる。

以下、本発明の方法に使用可能な遺伝子発現ベクター、並びに該ベクターが包含するプロモーター、及びその他の選択的構成要素について説明する。前記遺伝子発現ベクターとして使用可能なベクターは、体細胞において初期化因子を発現し得るものであれば、特に限定しない。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、及び人工染色体ベクターが例示される。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターとして使用可能なウイルスベクターは、初期化の対象となる体細胞に感染可能であり、当該体細胞において初期化因子を発現し得るものであれば、特に限定しない。例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。ウイルスベクターの種類によって、搭載可能なDNAのサイズ、感染可能な細胞の種類、細胞傷害性、宿主ゲノムへの組み込みの有無、及び発現期間等に違いがあり、初期化の対象となる体細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、複製欠損持続発現型センダイウイルスベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ；ＳｅＶｄｐベクター）は、宿主ゲノムへのインテグレーションを引き起こさず、細胞質中に持続的に留まる性質を有するため、安全性が高く、特に好適に使用できる（Nishimura K., et al., J Biol Chem. 2011 Feb 11;286(6):4760-71.；Fusaki N., et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-62.）。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターとして使用可能なプラスミドベクターは、初期化の対象となる体細胞に導入された際に当該体細胞において初期化因子を発現し得るものであれば、特に限定しない。プラスミドベクターは、哺乳動物細胞と大腸菌等の細菌間とで複製可能なシャトルベクターであってもよい。具体的なプラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、放線菌由来のプラスミド（ｐＩＪ４８６等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、Ｙｃｐ５０等）の他、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターの具体例としては、ＣＭＶ６－ＸＬ３（ＯｒｉＧｅｎｅ社）、ＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＧＢＴ－９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＭ８、ｐＲＥＰ４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。特に、ｏｒｉＰ－ＥＢＮＡ１が組み込まれ、宿主のゲノムにインテグレーションを引き起こさず、自律的に複製可能なエピソーマルプラスミドを好適に使用できる。例えば、初期化遺伝子が組み込まれたエピソーマルプラスミドを含む、ｉＰＳ細胞作製用キットであるＨｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ^ＴＭ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラ社製）等を使用することができる。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターとして使用可能な人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が例示される。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターが包含するプロモーターは、初期化の対象となる体細胞内で遺伝子発現を誘導する活性を有するプロモーターである。前記遺伝子発現ベクターを導入する体細胞は、原則として哺乳動物細胞、特にヒト由来の細胞であることから、それらの細胞内で下流の遺伝子を発現できるプロモーターであればよい。例えば、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ－ＩＥプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、Ｕｂプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はＣＡＧプロモーター等が挙げられる。この他、温度によって制御可能なヒートショックプロモーターや、テトラサイクリンの有無によって制御可能なテトラサイクリン応答性プロモーター等の誘導性プロモーターも例示される。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターは、選択的な構成要素として、上記のプロモーター以外の制御配列、選択マーカー遺伝子、及び／又はレポーター遺伝子等を含んでもよい。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターが包含し得るプロモーター以外の制御配列には、発現制御配列、イントロン配列、ヌクレアーゼ認識配列、複製起点配列等が包含される。発現制御配列としては、エンハンサー、リボソーム結合配列、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等の発現制御配列が例示される。ヌクレアーゼ認識配列としては、制限酵素認識配列、Ｃｒｅ組換え酵素によって認識されるｌｏｘＰ配列、ＺＦＮやＴＡＬＥＮ等の人工ヌクレアーゼの標的となる配列、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的となる配列が例示される。複製起点配列としては、ＳＶ４０複製起点配列が例示される。

例えば、本発明の方法の遺伝子発現ベクターにおいて、初期化因子のコード領域の前後にヌクレアーゼ認識配列を導入することができる。その場合、体細胞の初期化が完了した後に、ヌクレアーゼを導入して初期化因子のコード領域を除去することができる。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターが包含し得る選択マーカー遺伝子は、前記遺伝子発現ベクターが導入された体細胞を選択することができる選択マーカー遺伝子である。選択マーカー遺伝子の具体例としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。

本発明の方法において、遺伝子発現ベクターが包含し得るレポーター遺伝子は、遺伝子発現ベクターが導入された体細胞を識別可能なレポーターをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰやＲＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子や、ルシフェラーゼ遺伝子等が例示される。

（初期化遺伝子）
本発明の方法において、初期化誘導剤は、遺伝子発現ベクターに組み込まれた１種類以上の（１）初期化遺伝子を必須構成として含む。これに加えて、初期化誘導剤は選択的に、１種類以上の（２）補助因子を含んでもよい。以下、（１）及び（２）について具体的に説明する。

（１）初期化遺伝子について、本発明の方法において、初期化誘導剤は、１種類以上の初期化遺伝子を含む。初期化遺伝子がコードする初期化因子は、体細胞の初期化を誘導し得る因子であれば限定しない。例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｃ－ＭＹＣ、及びＫＬＦ、並びにそのいずれかの関連因子が例示される。当該関連因子としては例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、Ｃ－ＭＹＣのＴ５８Ａ変異体、Ｎ－ＭＹＣ、及びＬ－ＭＹＣ、並びにＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＫＬＦ５等が例示される。これらの初期化因子は、当該初期化因子に該当するタンパク質若しくはそのペプチド断片のいずれであってもよいが、特に、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４及びＬ－ＭＹＣからなる群より選択される少なくとも１つの初期化因子を好適に使用できる。すなわち、初期化誘導剤は、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びＬ―ＭＹＣ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含むことが好ましい。

本発明の方法において、初期化誘導剤に包含される、初期化遺伝子の数は、限定しない。例えば、前記初期化誘導剤は、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、又はそれ以上の初期化遺伝子を包含してもよい。

また、前記初期化誘導剤が２以上の初期化遺伝子を包含する場合、当該２以上の初期化遺伝子は、同一のベクター中に包含されていても、別々のベクターであってもよい。

（２）初期化補助因子について、本発明の方法において、初期化誘導剤が、選択的構成要素として包含し得る「初期化補助因子」とは、上記（１）に該当するもの以外で、体細胞の初期化誘導に必須ではないものの、体細胞に導入した場合に初期化誘導の効率を上昇し得る因子である。例えば、ＮＡＮＯＧ、ＮＲ５Ａ２、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＬＩＮ４１、ＧＬＩＳ１、ＴＢＸ３、ＨＭＧＡ２、ＦＯＸＨ１、ｍｉｒ－３０２、ｍｉｒ－３６７、ｍｉｒ－１０６ａ、ｍｉｒ－３６３、ＴＰ５３に対するｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ型ＴＰ５３、又はＰ２１に対するｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ等が挙げられる。

本発明の工程Ｉにおいて、前記初期化誘導剤に含まれる初期化遺伝子を体細胞に導入する方法は、特に限定されず、遺伝子導入ベクターの種類（プラスミドベクター、ウイルスベクター等）に応じて、導入方法を適宜選択すればよい。例えば、ウイルス感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法によって、初期化遺伝子を体細胞に導入することができる。この他、Green ＆ Sambrook、2012、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York等に記載された当該分野で公知の遺伝子導入方法（形質転換方法）を用いることができる。また、初期化遺伝子を導入する際、初期化遺伝子を導入する体細胞は、特に限定されないが、例えば、液体培地中に存在してもよいし、エレクトロポレーションを実施するための専用の溶液中に存在してもよい。

１－３－２．初期化及び増幅培養工程（工程ＩＩ）
本発明の方法の工程ＩＩは、工程Ｉで初期化遺伝子が導入された細胞について、初期化及び増幅培養を行う工程である。本発明においては、工程Ｉにおいて初期化遺伝子を導入した後、長くとも５日以内、特に３日以内、さらには１日以内に、工程ＩＩに移行することが好ましい。本発明の工程ＩＩにおいて、細胞培養は、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で行われる。工程ＩＩにおいて、使用される液体培地は、非ゲル化培地である。以下、本工程及び後段の培養工程で用いる動物細胞培養法について説明する。

（培養容器）
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、Ｎｕｎｃｌｏｎ^ＴＭ Ｓｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できる。

培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。

使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、０．３２ｃｍ^２以上、０．６５ｃｍ^２以上、１．９ｃｍ^２以上、３．０ｃｍ^２以上、３．５ｃｍ^２以上、９．０ｃｍ^２以上、又は９．６ｃｍ^２以上で、上限が、１０００ｃｍ^２以下、５００ｃｍ^２以下、３００ｃｍ^２以下、１５０ｃｍ^２以下、７５ｃｍ^２以下、５５ｃｍ^２以下、２５ｃｍ^２以下、２１ｃｍ^２以下、９．６ｃｍ^２以下、又は３．５ｃｍ^２以下であることが好ましい。

本工程は、上記「１－２．用語の定義」の項で定義したＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤を含む培地で培養することに特徴がある。培地の種類は、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤を含み、かつ細胞を増殖及び／又は維持できる培地であれば、限定はしない。

（培地）
本工程において使用される培地は、非ゲル化培地である。すなわち、固形培地及び半固形培地は使用されず、流動性の高い液体培地が使用される。本明細書において「非ゲル化培地」、すなわち液体培地は、粘度が０．９０ｍＰａ・Ｓ以下の培地を指し、好ましくは０．８５ｍＰａ・Ｓ以下の培地を指す。具体的には、「１－２．用語の定義」の項に列記した液体基礎培地に、任意で培養添加物を加えたものを指す。本工程で用いる培地として好ましいものは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選択される、少なくとも１つを含有する液体培地である。また、本発明で用いる培地として好ましいものは、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１）を含む液体培地である。特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。さらに、本工程で用いる培地としては、ＲＯＣＫ阻害剤（好ましくはＹ－２７６３２）を含有する液体培地が好ましい。

（ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤）
本工程で使用される液体培地には、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤が含まれていてもよい。ＰＫＣβ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。ＷＮＴ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤のうち、ＰＫＣβ阻害剤のみが含まれていてもよく、ＷＮＴ阻害剤のみが含まれていてもよく、また、両方が含まれていてもよい。より好ましくは、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤が共存する。

培地がＰＫＣβ阻害剤を含む場合、濃度の下限は、特に限定されず、初期化遺伝子を導入した細胞（以下、「初期化細胞」とも称する）の接着が抑制される範囲に応じて決定することができる。

例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として２５ｎＭ以上とすることができ、３０ｎＭ以上とすることができ、５０ｎＭ以上とすることができ、８０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、５μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができる。

培地中のＰＫＣβ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、初期化細胞の接着が抑制される範囲やＰＫＣβ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができ、７００ｎＭ以下とすることができ、５００ｎＭ以下とすることができ、２００ｎＭ以下とすることができ、１５０ｎＭ以下とすることができ、１００ｎＭ以下とすることができ、８０ｎＭ以下とすることができ、５０ｎＭ以下とすることができ、３０ｎＭ以下とすることができる。

なお、ＰＫＣβ阻害剤を組成物として培地に添加する場合、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を２倍希釈して使用する場合、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の下限は、５０ｎＭ以上とすることができ、６０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１６０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．４μＭ以上とすることができ、２μＭ以上とすることができ、６μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、２０μＭ以上とすることができる。

なお、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の上限は、特に限定されず、ＰＫＣβ阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の上限を２００ｍＭとすることができる。

ＷＮＴ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、初期化細胞の接着が抑制される範囲に応じて決定することができる。

例えば、ＷＮＴ阻害剤は、液体培地中の終濃度として９０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、９００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．５μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、５μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、１５μＭ以上とすることができ、３０μＭ以上とすることができ、３５μＭ以上とすることができる。

培地中のＷＮＴ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、初期化細胞の接着が抑制される範囲やＷＮＴ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

例えば、ＷＮＴ阻害剤は、液体培地中の終濃度として４０μＭ以下とすることができ、３５μＭ以下とすることができ、３０μＭ以下とすることができ、１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１．５μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができ、９００ｎＭ以下とすることができ、８００ｎＭ以下とすることができ、７００ｎＭ以下とすることができ、６００ｎＭ以下とすることができ、５００ｎＭ以下とすることができ、４００ｎＭ以下とすることができ、３００ｎＭ以下とすることができ、２００ｎＭ以下とすることができ、１５０ｎＭ以下とすることができ、１００ｎＭ以下とすることができる。

なお、ＷＮＴ阻害剤を組成物として培地に添加する場合、当該組成物中のＷＮＴ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を２倍希釈して使用する場合、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の下限は、１８０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．２μＭ以上とすることができ、１．４μＭ以上とすることができ、１．６μＭ以上とすることができ、１．８μＭ以上とすることができ、２μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、６μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、２０μＭ以上とすることができ、３０μＭ以上とすることができ、６０μＭ以上とすることができ、７０μＭ以上とすることができる。

なお、当該組成物中のＷＮＴ阻害剤の上限は、特に限定されず、ＷＮＴ阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のＷＮＴ阻害剤の上限を１１３ｍＭとすることができる。

液体培地中にＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤とを共存させる場合、ＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度の比率の下限は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上、１１１：１以上、５６：１以上、３３：１以上、１１：１以上、７．８：１以上、５．６：１以上、２．２：１以上、１．７：１以上、又は１．１：１以上とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度の比率の上限は、特に限定されないが、例えば、１：１６００以下、１：１４００以下、１：１２００以下、１：６００以下、１：４００以下、１：２００以下、１：１２０以下、１：６０以下、１：４０以下、１：３６以下、１：３２以下、１：２８以下、１：２４以下、１：２０以下、１：１６以下、１：１２以下、１：８以下、１：６以下、又は１：４以下とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度の比率は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。また、液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度の比率は、１１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、３３：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、７．８：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５．６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、２．２：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。さらに液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度の比率は、１６７：１以上１：１４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２４以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４以下の範囲とすることができる。

（組成物）
培養添加物、ＰＫＣβ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤等は、これらを有効成分として含む組成物として培地に添加されてもよい。その場合、当該組成物が、有効成分と組み合わされる他の成分として、担体が挙げられる。担体には、溶媒及び／又は賦形剤が含まれる。

溶媒としては、例えば、水、バッファ（ＰＢＳを含む）、生食、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、キシレン、低級アルコール）等が挙げられる。

賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等を挙げることができる。抗生剤は、特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、ｄｌ－カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、２－ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、ｌ－メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ－ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ及びその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ及びその誘導体、αリポ酸及びその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、及びこれらの混合物などが挙げられる。

（培養）
本工程ＩＩでは、工程Ｉで初期化因子を導入した体細胞を用いるが、初期化因子を導入した体細胞が浮遊状態であればそのまま本工程ＩＩにおいて引き続き浮遊培養することができ、初期化因子を導入した体細胞が容器や基材等に接着している状態であれば、酵素処理等で剥離することで、本工程ＩＩに供することができる。培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば、９６ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり０．３５ｃｍ^２）を使用する場合は、１ウェルあたりの量を０．０５ｍＬ以上、０．３ｍＬ以下、好ましくは約０．１ｍＬとすることができる。また、１２ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり３．５ｃｍ^２）を使用する場合は、１ウェルあたりの量を０．５ｍＬ以上、１．５ｍＬ以下、好ましくは約１．３ｍＬとすることができる。また、６ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり９．６ｃｍ^２）を使用する場合には、１ウェルあたりの量を下限は１．５ｍＬ以上、２ｍＬ以上、又は３ｍＬ以上とすることができ、また上限は６．０ｍＬ以下、５ｍＬ以下、４ｍＬ以下とすることができる。さらに、３０ｍＬスピナーフラスコ（容量が３０ｍＬのスピナーフラスコ）を使用する場合には、容器当たりの量を下限は２０ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、３０ｍＬ以上とすることができ、また上限は４０ｍＬ以下、３５ｍＬ以下、３０ｍＬ以下とすることができる。さらに、１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、容器当たりの量を下限は１０ｍＬ以上、１５ｍＬ以上、２０ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、又は３０ｍＬ以上とすることができ、また上限は５０ｍＬ以下、４５ｍＬ以下、又は４０ｍＬ以下とすることができる。また、容量が５００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、１０５ｍＬ以上、１１０ｍＬ以上、１１５ｍＬ以上、又は１２０ｍＬ以上とすることができ、また上限は１５０ｍＬ以下、１４５ｍＬ以下、１４０ｍＬ以下、１３５ｍＬ以下、１３０ｍＬ以下、又は１２５ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は２５０ｍＬ以上、２６０ｍＬ以上、２７０ｍＬ以上、２８０ｍＬ以上、又は２９０ｍＬ以上とすることができ、また上限は３５０ｍＬ以下、３４０ｍＬ以下、３３０ｍＬ以下、３２０ｍＬ以下、又は３１０ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０００ｍＬの攪拌型リアクターを使用する場合は、容器当たりの量を下限は３００ｍＬ以上、３１０ｍＬ以上、又は３２０ｍＬ以上とすることができ、また上限は１０００ｍＬ以下、９００ｍＬ以下、８００ｍＬ以下、７００ｍＬ以下、又は６００ｍＬ以下とすることができる。さらに、例えば容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、３００ｍＬ以上、４００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、６００ｍＬ以上、７００ｍＬ以上、８００ｍＬ以上、９００ｍＬ以上、又は１０００ｍＬ以上とすることができ、上限は２０００ｍＬ以下、１９００ｍＬ以下、１８００ｍＬ以下、１７００ｍＬ以下、１６００ｍＬ以下、１５００ｍＬ以下、１４００ｍＬ以下、１３００ｍＬ以下、１２００ｍＬ以下、又は１１００ｍＬ以下とすることができる。また、容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、又は５Ｌ以上とすることができ、上限は１０Ｌ以下、９Ｌ以下、８Ｌ以下、７Ｌ以下、又は６Ｌ以下とすることができる。

工程ＩＩは、培地交換手順及び新たな培地への播種（継代培養）の手順を含んでいてもよい。継代培養において、新たな培地に播種する細胞の密度（播種密度）は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は、０．００１×１０^５細胞／ｍＬ以上、０．０１×１０^５細胞／ｍＬ以上、０．１×１０^５細胞／ｍＬ以上、１×１０^５細胞／ｍＬ以上、又は２×１０^５細胞／ｍＬ以上、そして、上限は２０×１０^５細胞／ｍＬ以下、又は１０×１０^５細胞／ｍＬ以下の範囲にあればよい。

培養温度、時間、ＣＯ_２濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が２０℃以上、又は３５℃以上、そして上限が４５℃以下、又は４０℃以下であればよいが、好ましくは３７℃である。また、培養時間は下限が０．５時間以上又は６時間以上、そして上限が７日間以下、１２０時間以下、９６時間以下、７２時間以下、又は４８時間以下の範囲にあればよい。培養時のＣＯ_２濃度は、下限が０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は４．５％以上、そして上限が１０％以下、又は５．５％以下であればよいが、好ましくは５％である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上、又は１日に２回以上で行えばよいがそれらに限定されない。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。あるいは、常に連続して培養液の一定量を吸引除去し続け、かつ新鮮な培地を加え続けてもよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。

また、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングは、例えば、培地中の乳酸濃度に基づいて決定することもできる。乳酸は、培養中に細胞により産生され、培地中に蓄積される。細胞が産生した乳酸或いは元から培地中に含まれていた乳酸は、細胞にダメージを与え、その結果、ｉＰＳ細胞の未分化性維持を阻害し、増殖、特に継代後の細胞増殖能を低下させるなどの悪影響を与えることが知られている。そこで、培地中の乳酸濃度に基づいて培養終了のタイミング及び／又は培地交換のタイミングを決定することで、乳酸による未分化性維持の阻害作用、乳酸による細胞増殖能の低下作用を回避することができる。

（浮遊培養）
本工程の培養は、浮遊培養であり、かつ、流動培養である。本明細書において「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の場合、シングルセル状態の細胞の凝集を促進し、かつ過凝集を抑制するように培地を流動させる方法が好ましい。そのような培養方法として、例えば、浮遊旋回方式、浮遊揺動形式、浮遊撹拌方式、又はそれらの組み合わせが挙げられる。特に、浮遊旋回方式又は浮遊攪拌方式を好適に使用できる。

「浮遊旋回方式」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。

旋回速度は、特に限定されないが、１０～１００ｒｐｍとすることが好ましい。旋回速度は、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、８３ｒｐｍ以上、８５ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下とすることができる。浮遊旋回方式に使用するシェイカーの振幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、又は２５ｍｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、又は２５ｍｍ以下とすることができる。浮遊旋回方式での培養の際の回転半径も特に限定されないが、好ましくは振幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上又は１０ｍｍ以上であり、上限は例えば１００ｍｍ以下又は５０ｍｍ以下とすることができる。特に、旋回条件を前記範囲にすることで、生成される細胞凝集塊が適切なサイズとなりやすい、という利点がある。

「浮遊撹拌方式」とは、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌手段を用いて容器内の培地を撹拌する条件で培養する方法をいう。例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで浮遊撹拌方式を達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。

「浮遊撹拌方式」においては、培養中の細胞にかかる剪断応力を制御することが好ましい。ｉＰＳ細胞を含む動物細胞は、一般的に、他の細胞と比較して物理的ストレスに弱い場合が多い。そのため、攪拌培養に際して細胞に負荷される剪断応力が大きすぎると、細胞が物理的なダメージを受け、増殖能が低下したり、ｉＰＳ細胞であれば未分化性を維持できなくなったりする場合がある。攪拌翼の回転数は、特に限定されないが、下限は１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、又は７０ｒｐｍ以上、９０ｒｐｍ以上、１１０ｒｐｍ以上又は１３０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は２００ｒｐｍ以下又は１５０ｒｐｍ以下とすることができる。

また、浮遊撹拌方式において細胞に負荷される剪断応力は、限定されないが、例えば翼先端速度に依存する。翼先端速度とは、攪拌翼先端部の周速であり、翼径［ｍ］×円周率×回転数［ｒｐｓ］＝翼先端速度［ｍ／ｓ］として求めることができる。なお、翼径が、攪拌翼の先端形状により複数求められる場合には、最も大きな距離とすることができる。

翼先端速度は、０．０５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．０８ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１７ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．３０ｍ／ｓ以上とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、ｉＰＳ細胞の未分化を維持しながら、細胞同士の過凝集を抑制することができる。

さらに、翼先端速度は、１．３７ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、１．００ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．８４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．５０ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．４２ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．３４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく０．３０ｍ／ｓ以下とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、ｉＰＳ細胞の未分化を維持しながら、培養系内の培地流動状態を安定化することができる。

上記した通り、工程ＩＩは、継代培養の手順を含んでいてもよく、継代培養は培養スケールの変更、好適には培養スケールの上昇（スケールアップ）を伴うものとすることができる。培養スケールの変更を伴う継代培養において、変更前後の撹拌手段の攪拌翼の回転数は、培養スケールに合わせて、体積当たりの攪拌所要動力若しくは翼先端速度が同等、好適には±１０％未満、より好適には±５％未満になるように設定することができる。ｉＰＳ細胞の初期化・樹立時には、少ない細胞数から培養し徐々に増殖させ、多量の細胞を得ることになるため、培養の進行に伴って培養スケールを大きくすることが必要となる。その際、培養液の体積当たりの攪拌所要動力又は翼先端速度がいつも同等になるように設定することで、スケールによらず、同等の培養環境で培養することが可能となる。例えば、このように培養スケールを大きくしていく際に、培養スケールを相似形で変更する際は、Ｐｖ一定の式を用いて攪拌翼の回転数を決定することができる。Ｐｖとは単位体積当たりの攪拌所要動力のことであり、Ｐｖを同等とすることで異なるスケール間で同等の条件での攪拌培養することができる。Ｐｖ一定の式は、単位時間当たりの回転数［ｒｐｍ、又は、ｒｐｓ］×（翼径［ｍ］）^２／３＝定数として表すことができる。

「浮遊揺動方式」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に１５回以下、２０回以下、２５回以下、又は５０回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０．１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は２０°以下、１８°以下、１５°以下、１２°以下又は１０°以下とすることができる。特に、揺動条件を前記範囲とすることで、生成される細胞凝集塊が適切なサイズとなりやすい、という利点がある。

さらに、上記旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

本工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。本工程によって、初期化された細胞、すなわちｉＰＳ細胞を含む細胞集団を得ることができる。

（回収）
工程ＩＩは、上記条件での培養後、常法により培養液と細胞を分離して、細胞集団を回収する手順を含むことが好ましい。この時、回収される細胞集団は、通常は細胞凝集塊を形成している。本発明の方法は、好ましくは、工程ＩＩにおいて、形成された細胞凝集塊を回収する手順を含む。

工程ＩＩにおける培養後の細胞は、通常は細胞凝集塊として培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで回収することができる。濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態に５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば１００×ｇ以上、３００×ｇ以上、８００×ｇ以上、又は１０００×ｇ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００×ｇ以下、１５００×ｇ以下、又は１６００×ｇ以下であればよい。また処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば１０分以下、８分以下、６分以下、又は３０秒以下であればよい。フィルトレーションで液体成分を除去する場合、例えば、不織布やメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム（カネカ社）のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。

回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用することができる。

（工程ＩＩの効果）
工程Ｉにおいて、初期化遺伝子が導入された体細胞は、工程ＩＩにおいて流動培養が開始されることで、接着培養によらず、浮遊培養条件下で、初期化、すなわち、ｉＰＳ細胞へと変化することができる。工程Ｉ及び工程ＩＩにより、ｉＰＳ細胞を製造することが可能であり、工程ＩＩの後、得られたｉＰＳ細胞を含む細胞凝集塊について、既知の任意手法でｉＰＳ細胞の純度を上げることが可能である。本発明は、ｉＰＳ細胞を高い純度で含む細胞集団を簡易な方法で得ることが可能な、工程ＩＩＩ及び工程ＩＶをさらに提供する。

１－３－３．分取工程(工程ＩＩＩ)
本発明の方法の工程ＩＩＩは、工程ＩＩで得られた細胞のうち、未分化マーカー陽性細胞を分取する工程である。本明細書において「（細胞の）分取」とは、ある特徴を有する細胞を他の細胞から分離する手順を指す。工程ＩＩＩにおいては、具体的には、未分化マーカー陽性の細胞を、未分化マーカー陰性の細胞群から分離する手順を指す。細胞分取の手法は、常法に従えばよく、特に限定するものではない。

（単一細胞化）
工程ＩＩＩは、細胞を分画する工程とすることが好ましい。そのため、工程ＩＩＩは、回収した細胞の単一細胞化の手順を備えることが好ましい。「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。本工程において、分画された細胞の個数は特に限定されないが、通常は１０個以下であり、好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であり、さらには１細胞ずつに分画するのが好ましい。

単一細胞化は、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。例えば、単一細胞化にトリプシンを使用する場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５体積％以上、０．１８体積％以上、０．２０体積％以上、又は０．２４体積％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、０．３０体積％以下、０．２８体積％以下、又は０．２５体積％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば３０分以下、２８分以下、２５分以下、２２分以下、２０分以下、又は１８分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコールに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。

単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記と同様に行えばよい。

（シングルセルソーティング）
工程ＩＩＩは、回収した細胞群、好ましくは単一細胞化した細胞群について、細胞表面の未分化マーカーの発現の有無を検出する手順を備える。細胞表面の未分化マーカーを検出する手段としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

検出対象となる細胞表面の未分化マーカーとしては、「１－２．用語の定義」の項に記載した通り、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。特に、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの未分化マーカーとすることが好ましい。具体的には、これらの未分化マーカーの少なくとも１つに特異的に結合する蛍光標識抗体を使用して細胞を蛍光染色して、フローサイトメトリーを用いて、例えば１細胞ごとに検出、分取を行うことができる（シングルセルソーティング）。

（工程ＩＩＩの効果）
上記の通り、工程ＩＩ及びこれに続く工程ＩＩＩにより、フィーダー細胞や基材を用いる接着培養及びコロニー選抜を行うことなく、体細胞の初期化によるｉＰＳ細胞の作製と分取を実現することが可能となる。また、ｉＰＳ細胞は各細胞での初期化効率の差により、初期化された個々の細胞の品質が少しずつ異なりうるため、シングルセルソーティングを行うことで、初期化時に異常が生じていないｉＰＳ細胞や、より品質が安定しているｉＰＳ細胞、あるいは特定の細胞種への分化能が高いｉＰＳ細胞などを選択的に培養し増幅させることも可能となる。

１－３－４．浮遊培養工程（工程ＩＶ）
本発明の方法の工程ＩＶは、工程ＩＩＩで分取した未分化マーカー陽性細胞を浮遊培養して増殖させ、ｉＰＳ細胞を含む細胞集団を得る工程である。本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「１－３－２．初期化及び増幅培養工程（工程ＩＩ）」の項に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは工程ＩＩと共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。

（細胞）
本工程で培養する細胞は、工程ＩＩＩで分取した未分化マーカー陽性の単一細胞である。すなわち、細胞表面にＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等の既知の未分化マーカー、好ましくは、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの未分化マーカーの発現が確認された細胞である。

（培地）
本工程で使用する培地は、工程ＩＩで使用される培地の同じ組成であっても、異なる組成であってもよい。他の任意構成については、「１－３－２．初期化及び増幅培養工程（工程ＩＩ）」の項に記載の構成と同様である。

（浮遊培養）
本工程では、浮遊培養を行うことが好ましい。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。流動培養により、ｉＰＳ細胞を浮遊培養することによって、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持することができる。

（未分化マーカー検出）
本工程では、培養途中の細胞の一部を取り出し、未分化状態を維持しているか確認することができる。例えば、培養中に取り出したｉＰＳ細に発現する未分化マーカーの発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。未分化マーカーとしては、上述したように、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。これら未分化マーカーの検出方法も、上述したように、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。

培養中に取り出した細胞のなかで未分化マーカーの陽性率が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは９９％超１００％以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

本工程において、ｉＰＳ細胞を含む細胞集団において、未分化マーカーのうち、特に、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であることが好ましい。

（三胚葉マーカー検出）
また、本工程において、培養途中で取り出した一部の細胞の三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。すなわち、これら内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、より好ましくは７％以下、より好ましくは６％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは検出限界以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

内胚葉系細胞マーカーとは、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する。

中胚葉系細胞マーカーとは、中胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、Ｔ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、ＳＭＡ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。なお中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。

外胚葉系細胞マーカーとは、外胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＦＧＦ５、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＴＵＪ１等を挙げることができる。なお外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体、末梢神経系などを形成する。また、外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。

これら三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現は、当該技術分野において任意の検出方法により測定することができる。三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定する方法としては、限定はしないが、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等が挙げられる。定量的リアルタイムＰＣＲ解析においては、測定対象のマーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対する相対発現量に換算し、当該相対発現量に基づいてマーカー遺伝子の発現量を評価できる。内部標準遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子やβ－アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子を挙げることができる。

（三胚葉分化能の評価）
あるいは、本工程において、培養途中で取り出した一部の細胞の三胚葉への分化能を確認してもよい。三胚葉への分化能の評価手法は、特に限定されないが、具体例としては、以下の手法をとることができる。取り出した細胞を、未分化維持培地で数日間培養して胚葉体を作らせてから、血清を含むＤＭＥＭ培地等の通常の動物細胞培養用培地及びフィーダー細胞又は基材を用いて接着培養条件下で培養を行う。培養は通常の培養条件、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターを用いて静置培養し、２～３日おきに培地交換又は継代培養を行い、１６～２１日間の培養を行う。培養により得られた細胞集団について、三胚葉マーカーの発現を測定することで、細胞が三胚葉への分化能を維持しているか確認することができる。すなわち、培養後の細胞集団中に、内胚葉系細胞マーカーが陽性の細胞、中胚葉系細胞マーカーが陽性の細胞及び外胚葉系細胞マーカーが陽性の細胞が、大きな偏りなく発現していることが確認された場合、当該細胞集団中の細胞において、三胚葉への分化能が維持されているといえる。

（回収）
工程ＩＶにおいて、常法により培養液と細胞を分離して、細胞集団を回収する手順を設けることが好ましい。この時、回収される細胞集団は、好ましくは細胞凝集塊を形成している。本発明の方法は、好ましくは、形成された細胞凝集塊を回収する手順を含む。細胞集団の回収手順の具体的な手段、条件等は、「１－３－２．初期化及び増幅培養工程（工程ＩＩ）」の項に記載の事項に準じる。

回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄条件の詳細についても、「１－３－２．初期化及び増幅培養工程（工程ＩＩ）」の項に記載の事項に準じる。

１－３－５．その他の工程
本発明の方法は、上記の工程ＩＶの後に、さらに任意の工程、例えば、得られたｉＰＳ細胞又はｉＰＳ細胞を含む細胞集団の保存工程、特定の細胞への分化誘導工程、凍結バイアルの融解による再培養工程等を含んでいてもよい。

（保存工程）
ｉＰＳ細胞又はｉＰＳ細胞を含む細胞集団の保存工程は、ｉＰＳ細胞が未分化の状態を維持した状態で保存されれば、具体的な条件は特に限定されず、任意の既知のｉＰＳ細胞の保存手法をいずれも使用できる。ｉＰＳ細胞の保存手法としては、例えば、バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（株式会社ＧＣリンフォテック）、ＣＰ－５Ｅ、ＣＰ－１（極東製薬工業株式会社）、ステムセルキープ（株式会社バイオベルデ）、ＤＡＰ２１３（株式会社リプロセル）、ステムセルバンカー（登録商標）（ゼノジェンファーマ株式会社）などの既存の市販凍結保存液に懸濁させて、凍結保存する手法をとることができる。

２．ｉＰＳ細胞を含む細胞集団
本発明の細胞集団は、１．人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法」の項に記載のｉＰＳ細胞の製造方法（本発明の方法）を用いて製造されたｉＰＳ細胞を含む、ことを特徴とする。より具体的には、本発明の細胞集団は、本発明の方法を用いて得られたｉＰＳ細胞を浮遊培養することで得られる細胞集団である。

本発明の細胞集団における細胞の未分化マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは９９％超１００％以下である。ここでいう未分化マーカーは、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。特に、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上、特に、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが好ましい。

本発明の細胞集団において、未分化マーカーのうち、特に、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であることが好ましい。

本発明の細胞集団において、内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、２０％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は検出限界以下であることが好ましい。

本発明の細胞集団は、三胚葉への分化能が維持されることが好ましい。三胚葉への分化能が維持されるか否かは、例えば「１－３－４．浮遊培養工程（工程ＩＶ）」の項に記載の方法で確認することができる。

本発明の細胞集団は、通常は細胞凝集塊の形態をとり得る。細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上であればよい。一方、その上限は１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、又は２００μｍ以下であればよい。因みにヒトｉＰＳ細胞１個の観察像での最大幅のサイズは約１０～３０μｍである。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

前記細胞凝集塊の集団のうち、体積基準で１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

前記細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。

以下、実施例により、本発明に係るｉＰＳ細胞の製造方法を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１：センダイウイルスを用いたｉＰＳ細胞の樹立＞
（１－１）血球細胞の培養
末梢血単核球の凍結バイアル（ＡｃｃｕＣｅｌｌ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ｐｕｒｉｆｉｅｄ、１×１０^７細胞／バイアル）を液体窒素タンクから取り出し、安全キャビネット中で、凍結バイアルの蓋を開けて解凍した。１５ｍＬチューブに９ｍＬの単核球培養培地（１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－６、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－３、３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンドを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃ＳＴ－０９８０５））を入れ、これに解凍した細胞懸濁液を移して懸濁後、２００ｇ×１０分間遠心した。上清を除去した後、細胞を４ｍＬの単核球培養培地に懸濁し、浮遊培養用の６ウェルプレート（住友ベークライト ＃ＭＳ－８００６Ｒ）に播種した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間の旋回培養（９０ｒｐｍ）を行った。

旋回培養した単核球細胞を５ｍＬピペットで１５ｍＬチューブに移し、２００ｇ×１０分間遠心した。沈殿を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再度遠心した（２００ｇ×１０分間）。沈殿にＡｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク）１ｍＬを添加し、３７℃で５分インキュベートした。１０００μＬのピペットチップを用いて数回ピペッティングして細胞を解離させた後、４ｍＬの単核球培養培地を添加した。その際、細胞数をカウントした。

（１－２）センダイウイルスによる初期化因子の導入と初期化の開始
ＣｙｔｏＴｕｎｅ^ＴＭ ＥＸ－ｉＰＳキット（ＩＤファーマ社）を使用してｉＰＳ細胞への誘導因子の導入を行った。キットのプロトコールに従い、１×１０^６細胞に対しＭＯＩ＝５となるようｈＫＯＳ・ｈＫＬＦ４・ｈＬ－ＭＹＣを単核球培養培地で希釈し、ウイルス液を調製した。（１）で培養した１×１０^６ 細胞の単核球細胞分の細胞懸濁液を２本の１５ｍＬチューブに分注して、２００ｇ×１０分間遠心した。

上清を除去して、細胞を２ｍＬの単核球培養培地に懸濁した。この細胞懸濁液２ｍＬの入った１５ｍＬチューブに、ウイルス液２ｍＬ、単核球培養培地４ｍＬを入れ（合計８ｍＬ）、５ｍＬのプラスチックピペットで静かに混合した。その細胞－ウイルス混合液を速やかに４ｍＬ／ウェル（５×１０^５細胞／ウェル、浮遊培養用６ウェルディッシュで２ウェル）に播種して、９０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で旋回培養を開始した。培養３、５、７日目に、各ウェルの培地にＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素社）（事前にＡ～Ｃ液、１％ ペニシリン／ストレプトマイシンと混合したもの、以後、「ＳｔｅｍＦｉｔ培地」と表記）２．０ｍＬを追加添加して培養を継続した。培養９、１１、１３、１５日目に培地をＳｔｅｍＦｉｔ培地で半量交換（４ｍＬ）した。

（１－３）継代培養（初期化培養）
浮遊培養サンプルは、培養１６日目に１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。沈殿を５ｍＬのＰＢＳで洗浄して遠心した（２００ｇ×１分間）。沈殿をＡｃｃｕｔａｓｅで懸濁して、３７℃で浮遊培養サンプルを１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。沈殿を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、遠心して（２００ｇ×１分間）、沈殿をＡｃｃｕｔａｓｅで再懸濁後、３７℃で５～１０分インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングした後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加して、２００ｇ×２分間遠心した。沈殿を１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、和光純薬）を含有）で懸濁した。全細胞をＳｔｅｍＦｉｔ培地（＋１０μＭ Ｙ－２７６３２）のみ、又はＳｔｅｍＦｉｔ培地＋化合物（１μＭ Ｌｙ３３３５３１、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１０μＭ Ｙ－２７６３２）で全量が４ｍＬとなるように懸濁し、６ウェルプレートの１ウェルに再播種した。旋回培養を開始し（９０ｒｐｍ、３７℃，５％ＣＯ_２）、以降、２日おきに、培地を半量交換した。

培養２３日目に上記の各培養条件で培養された細胞の半量ずつ、６ウェルプレートの２個のウェルへと継代した。この時、半量はＳｔｅｍＦｉｔ培地（＋１０μＭ Ｙ－２７６３２）のみ、半量はＳｔｅｍＦｉｔ培地＋化合物（１μＭ Ｌｙ３３３５３１、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１０μＭ Ｙ－２７６３２）で全量が４ｍＬとなるように懸濁し、これまでと同じ条件で培養を継続した。以降、２日ごとに培地交換を行った。培養２８日目、３３日目、３８日目、４３日目に同様に継代を行った。ＳｔｅｍＦｉｔ培地＋化合物添加細胞は、培養４８日目に１×１０^６細胞／ウェル程度の増殖を確認し、これをここから４×１０^５細胞／ウェルとなるよう播種した。培養５２日目に１．６×１０^６細胞／ウェル程度の増殖を確認し、４×１０^５細胞／ウェルとなるように播種した。培養５７日目に２．５×１０^６細胞／ウェル程度の増殖を確認し、４×１０^５細胞／ウェルで播種した。

（１－４）細胞特性の解析
（１－４－１）フローサイトメトリー解析による細胞の未分化マーカー発現の評価
培養６２日目に細胞を回収し、フローサイトメトリー解析による細胞の未分化マーカー発現評価を以下の手順で実施した。

浮遊培養中の細胞塊を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートする。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

細胞数をカウント後、チェック用（ネガティブコントロール用など）に２．５×１０^５細胞分を３本、それぞれ１５ｍＬチューブに分取し、２００ｇ×３分間遠心した。遠心後、上清を捨てＰＢＳを１～２ｍＬ添加した。遠心後、上清を捨てフローサイトメトリーバッファ（０．１％ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を２５０μＬ添加し、ピペットチップでピペッティングして懸濁した。

各サンプルチューブに以下の１次抗体を加え、氷上で遮光しながら１時間ほどインキュベートした。
－抗体なし
－ＴＲＡ－１－６０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ ４８８ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＴＲＡ－１－６０ ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３３０６１４）（２．５μＬ）
インキュベーション後、フローサイトメトリーバッファを７５０μＬ加え、２００ｇ×３分間遠心した。遠心後、上清を除去して、フローサイトメトリーバッファ５００μＬを加えてピペッティングして懸濁した。細胞懸濁液をセルストレーナーに通した。以後、サンプルは氷上・遮光状態で維持した。

細胞懸濁液中の細胞について、フローサイトメトリー装置Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ソニー社 ＳＨ８００）で計測を行った。ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０陽性分画から細胞を回収し、１×１０^５細胞程度を、４ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭ Ｙ－２７６３２、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１μＭ ＬＹ－３３３５３１含有）を入れた１５ｍＬチューブに直接回収し、浮遊培養用の６ウェルプレートに移した後、旋回培養を開始した（９０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２）。以後、細胞の様子を見ながら５～６日おきに継代を継続し、順次、凍結ストック（５×１０^５～１×１０^６細胞／バイアル、ステムセルバンカーに懸濁）を調製した。

培養６２日目の細胞について、フローサイトメトリーでＴＲＡ－１－６０陽性率を計測した結果、ＴＲＡ－１－６０陽性率は９８．２７％であった。これにより、浮遊培養条件下でｉＰＳ細胞の生成が可能であることが示された。

（１－４－２）免疫染色法による未分化マーカーの検出
培養５７日目の細胞を回収し、免疫染色法で未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ－４タンパク質の発現を同定した。免疫染色法は、以下の手順で実施した。浮遊培養細胞塊を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

１×１０^５細胞／ウェル／１ｍＬ培地となるようにＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２、０．５μｇ／ｃｍ^２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｓｉｌｋを含有）に細胞を懸濁し、２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、３時間培養した。２４ウェルプレートから培地を除去し、ＰＢＳ １ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを除去後、各ウェルにＰＦＡ液（４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）５００μＬを入れて室温で１０分間静置して固定した。ＰＦＡ液を除去して、各ウェルに５００μＬの０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を添加し、シェイカー上で１０分間インキュベートした（ＳＳＥＡ－４検出用のウェルのみ、この工程を行わなかった）。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を捨て、各ウェルに５００μＬのＰＢＳを添加し、シェイカー上で５分間置き、ＰＢＳを除去した（洗浄操作）。洗浄操作をさらに３回行った。

ＰＢＳを除去後、各ウェルに５００μＬの０．１％ブロッキングバッファ（０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加し、シェイカー上で３０～６０分間置き、ブロッキングを行った。ブロッキング後、下記の１次抗体液を５００μＬ添加して４℃で１晩静置し、抗体を反応させた。１次抗体は、いずれも０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで下記の通り希釈した。
－マウス抗ヒトＯＣＴ３／４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、＃ｓｃ－５２７９、１／４００希釈）
－ウサギ抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（リプロセル社、＃ＲＣＡＢ００４Ｐ－Ｆ、１／４００希釈）
－ＡＰＣ標識ラット抗ヒトＳＳＥＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、＃３３０４１８、１／１００希釈）
抗体反応時は、アルミ箔でプレートを包んで遮光した。

遮光条件下で、ＰＢＳによる洗浄操作を４回行った。洗浄操作終了後、各ウェルに下記の２次抗体液５００μＬを添加し（ＳＳＥＡ－４染色用ウェルは、この工程を行わず、ＰＢＳを入れた）、遮光条件下、室温でシェイカー上で１～２時間インキュベートした。
－ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｒｏｓｓ－Ａｂｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－２１２０２））
－ロバ抗ウサギ ＩｇＧ（ＤｙＬｉｇｈｔ^ＴＭ４８８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、＃４０６４０４）
遮光条件下でＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、各ウェルにＤＡＰＩ溶液（Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｎｏｎ－Ｈａｒｄｅｎｉｎｇ Ｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ナカライテスク社、＃１２７４５－７４））を１滴滴下した。蛍光顕微鏡（キーエンス社、ＢＺ－Ｘ８１０）でＤＡＰＩによる核染色と免疫染色によるそれぞれのマーカータンパク質の陽性細胞の有無を観察した。

培養５７日目の浮遊培養細胞における、各未分化マーカーの陽性率（ＤＡＰＩ陽性細胞に対するＯＣＴ４陽性率、ＮＡＮＯＧ陽性率、ＳＳＥＡ陽性率）を算出した結果、表１に示す通り、いずれも非常に高い陽性率を示した。

（１－４－３）細胞の胚葉体形成による多能性評価
（１－４－３－１）胚葉体形成
培養５７日目の浮遊培養細胞の一部について、三胚葉への分化能を評価した。浮遊培養細胞を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

１５ｍＬチューブに１．２×１０^６細胞／１２ｍＬ ＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）になるように細胞数を調整して懸濁した。細胞懸濁液全量をリザーバー（アズワン社、＃２－７８４４－０２）に移し、浮遊培養用Ｖ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ分注した（細胞数は１．０×１０^４細胞／ウェルとなる）。プレートを２００ｇ×３分間遠心した後、３７℃、５％ＣＯ_２で培養を開始した。培養２日目にＥＢ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ピルビン酸ナトリウム＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）を培養プレートに１００μＬ／ウェル加えた。培養４、６日目に、培地を１００μＬ／ウェル交換した。

培養８日目より、接着培養を開始した。１２ウェルプレートの４ウェルにゼラチン溶液（０．１ｗ／ｖ％液、富士フィルム和光純薬社、＃１９０－１５８０５）をそれぞれ５００μＬ入れ、３７℃で約１時間静置した後、ゼラチン溶液を除去してゼラチンコーティングプレートを調製した。上記で培養したＥＢ培地中の細胞を各ウェルから回収し、１２～２４細胞ずつ１２ウェルプレートの各ウェルに移した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を開始した。２日おき（１０日目、１２日目、１４日目…）にＥＢ培地１ｍＬで培地交換を行った。培養開始後２０日前後で、免疫染色法による胚葉体の分化評価を行った。

（１－４－３－２）三胚葉分化の評価（免疫染色法）
１２ウェルプレートからＥＢ培地を除去し、ＰＢＳ ２ｍＬを添加して洗浄した。ＰＢＳを除去後、各ウェルにＰＦＡ液を５００μＬ入れ、室温で１０分間固定した。ＰＦＡ液を除去して、各ウェルに１ｍＬの０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を添加し、シェイカー上で１０分間インキュベートした。０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を除去して、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、シェイカー上で５分間置いたのちに液を除去した（洗浄操作）。１～２時間後、洗浄操作を４回実施した後、各ウェルに５００μＬの０．１％ ブロッキングバッファを添加し、シェイカー上で３０～６０分間インキュベートした（ブロッキング）。

ブロッキング終了後、各ウェルに下記１次抗体液を５００μＬ添加した。１次抗体液は、０．１ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で下記濃度に希釈した。プレートをパラフィルムでシールして、４℃で一晩静置した。
外胚葉マーカーＴＵＪ１検出用：マウス抗ヒトβ－３ チューブリン抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１１９５、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）
中胚葉マーカーＳＭＡ検出用：(マウス抗ヒトα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１４２０、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）
内胚葉マーカーＡＦＰ検出用：（マウス抗ヒトα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１３６８、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）

ＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、各ウェルに２次抗体液（ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－２１２０２)を０．１ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００～１０００倍希釈したもの）５００μＬを添加した。以後、遮光のためにプレートをアルミ箔で包んだ。プレートを室温にてシェイカー上で１～２時間インキュベートした後、ＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、ＤＡＰＩ溶液を各ウェルに１滴添加した。蛍光顕微鏡でＤＡＰＩによる核染色、免疫染色法により各々のマーカータンパク質の陽性細胞の有無を観察した。

その結果、分化誘導２３日目に、培養細胞において、ＴＵＪ１、ＳＭＡ、ＡＦＰの各胚葉マーカーの陽性細胞の存在をいずれも同定した。これにより、浮遊培養細胞が多能性を維持することが確認できた。

（１－５）保存
以後の浮遊培養細胞は、４－５日おきに継代し、各継代時に回収した細胞を１×１０^６細胞／バイアルでステムセルバンカーに懸濁し、凍結ストックを調製した。

＜実施例２：エピソーマルプラスミドベクターを用いたｉＰＳ細胞の樹立＞
（２－１）血球細胞の培養
血球細胞の培養は、実施例１（１－１）と同様の方法で実施した。

（２－２）初期化因子の導入と、初期化の開始
１．５ｍＬチューブ内でＡｍａｘａ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 ＶＡＰＡ－１００３）のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ８１．８μＬ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ １８．２μＬ及びｉＰＳ ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社）３．０２μＬを混合し、遺伝子導入試薬１０３μＬを調製した。

２－１で培養した単核球細胞を２．５×１０^６細胞／チューブとなるように１５ｍＬチューブに分注した。２００ｇ×１０分間遠心した後、上清を除去して、前記遺伝子導入試薬１０３μＬを添加して注意深く懸濁した。調製した細胞／プラスミド混合液を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にセットしてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、キット付属のスポイトを用いて細胞懸濁液をキュベットから単核球培養培地を入れた１．５ｍＬチューブに素早く移し混合し、全量を１０００μＬとした。エレクトロポレーション済の細胞懸濁液を１ウェル当たり約５×１０^５細胞となるよう播種した。

単核球培養培地４ｍＬ／ウェルを入れた６ウェルプレートの２ウェルに細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２条件下で旋回培養（９０ｒｐｍ）を開始した。培養３、５、７日目に各ウェルに、ＳｔｅｍＦｉｔ培地、又はＳｔｅｍＦｉｔ培地＋ＬＹ－３３３５３１（１μＭ）＋ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ（１０μＭ）を２．０ｍＬ追加した。培養９日目、に培地を全量交換（４ｍＬ／ウェル）した。培養１１日目、１３日目、１５日目に培地を半量交換（２ｍＬ／ウェル）して培養を継続した。その後、４～５日おきに培地交換を行った。

（２－３）継代培養（初期化培養）
浮遊培養サンプルを１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。沈殿を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、遠心し（２００ｇ×１分間）、沈殿をＡｃｃｕｔａｓｅで再懸濁して、３７℃で５～１０分間インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングした後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。沈殿を１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭ Ｙ２７６３２含有）で懸濁した。全細胞を最終４ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（＋１０μＭ Ｙ２７６３２）、又はＳｔｅｍＦｉｔ培地＋化合物（１μＭ ＬＹ－３３３５３１、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１０μＭ Ｙ２７６３２）で懸濁した。各懸濁液を６ウェルプレートに播種して、旋回培養を継続した（９０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２）。以後、２日おきに培地を半量交換し、４～５日おきに継代を行った。

培養３１日目に２×１０^５細胞／ウェル程度の増殖を確認し、全量を播種した。培養３６日目に２×１０^６細胞／ウェル程度の増殖を確認し、４×１０^５細胞／ウェルとなるように播種した。１×１０^６細胞について、フローサイトメトリー解析を行い（後述の実施例３を参照のこと）、セルソーティングによりＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ－４陽性細胞を分取した。分取した細胞について、ＳｔｅｍＦｉｔ培地＋化合物（１μＭ ＬＹ－３３３５３１、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１０μＭ Ｙ２７６３２）に播種し、旋回培養を実施した（９０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２）。２日おきに、培地を半量交換し、５～６日おきに継代を行った。分取後、３継代目で７×１０^５細胞程度への増殖を確認し、全量を継代した。４継代目で約４×１０^６／ウェルの増殖を確認し、４×１０^５細胞／ウェルとなるように継代した。各継代時に回収した細胞を１×１０^６細胞／バイアルで、ステムセルバンカーに懸濁した凍結ストックを調製した。

（２－４）細胞特性の解析
（２－４－１）フローサイトメトリー解析による細胞の未分化マーカー発現の評価とシングルセルソーティング
（２－４－１－１）手順
浮遊培養中の細胞塊を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートする。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

細胞数をカウント後、チェック用（ネガティブコントロール用など）に２．５×１０^５細胞分を３本、ソーティング用には１×１０^６細胞分を１本、それぞれ１５ｍＬチューブに分取し、２００ｇ×３分間遠心した。遠心後、上清を捨てＰＢＳを１～２ｍＬ添加した。遠心後、上清を捨てフローサイトメトリーバッファ（０．１％ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を２５０μＬ（チェック用）又は１０００μＬ（ソーティング用）添加し、ピペットチップでピペッティングして懸濁した。

各サンプルチューブに以下の１次抗体を加え、氷上で遮光しながら１時間ほどインキュベートした。
－チェック用
－抗体なし
－ＳＳＥＡ－４（ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＳＳＥＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３３０４１８）のみ（２．５μＬ）
－ＴＲＡ－１－６０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ ４８８ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＴＲＡ－１－６０ ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３３０６１４）のみ（２．５μＬ）
－ソーティング用
－ＳＳＥＡ－４（１０μＬ）＋ＴＲＡ－１－６０（１０μＬ）
－ＴＲＡ－１－６０のみ（１０μＬ）
インキュベーション後、フローサイトメトリーバッファをチェック用チューブに７５０μＬ、ソーティング用チューブに３ｍＬ加え、２００ｇ、３分間遠心した。遠心後、上清を除去して、フローサイトメトリーバッファ５００μＬを加えてピペッティングして懸濁した。細胞懸濁液をセルストレーナーに通した。以後、サンプルは氷上・遮光状態で維持した。

細胞懸濁液中の細胞について、フローサイトメトリー装置Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ソニー社 ＳＨ８００）で計測、ソーティングを行った。ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０陽性分画から細胞を回収し、１×１０^５細胞程度を、４ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭ Ｙ－２７６３２、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１μＭ ＬＹ－３３３５３１含有）を入れた１５ｍＬチューブに直接回収し、浮遊培養用の６ウェルプレートに移した後、旋回培養を開始した（９０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２）。以後、細胞の様子を見ながら５～６日おきに継代を継続し、順次、凍結ストック（５×１０^５～１×１０^６細胞／バイアル、ステムセルバンカーに懸濁）を調製した。

シングルセルソーティングは、各ウェルに２００μＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭ Ｙ－２７６３２、１０μＭ ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ、１μＭ ＬＹ－３３３５３１含有）を入れた浮遊培養用の９６ウェルプレートを準備し、１細胞／ウェルの条件で回収してそのまま播種することで実施した。シングルセルソーティング後、１．５ヶ月程（継代８回程度）かけて（２－２）及び（２－３）と同様の条件で浮遊培養（培地交換、継代培養）を行い、クローンを樹立した。シングルソーティング後、浮遊培養条件下で増幅培養した細胞についても、上記と同様の条件で未分化マーカーの検出を行った。

（２－４－１－２）結果
初期化遺伝子導入後の細胞を化合物（ＬＹ－３３３５３１＋ＩＷＲ１－ｅｎｄｏ）添加条件、化合物非添加条件でそれぞれ浮遊培養した、培養３５日目の細胞を回収し、フローサイトメトリーでＴＲＡ－１－６０陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞を計測した。図１に化合物添加条件で浮遊培養した細胞のフローサイトメトリーの結果、図２に化合物非添加条件で浮遊培養した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。図１、図２ともに、（Ａ）は全イベントの前方散乱光（ＦＳＣ）に対する側方散乱光（ＳＳＣ）のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた部分をゲーティングした。（Ｂ）は、（Ａ）でゲーティングした細胞のＴＲＡ－１－６０の蛍光強度とＳＳＥＡ－４の蛍光強度のドットプロットを示す。図中の線で囲まれた範囲の細胞を分取した。（Ｃ）は、ＴＲＡ－１－６０蛍光強度のヒストグラムプロットを、（Ｄ）は、ＳＳＥＡ－４の蛍光強度のヒストグラムプロットを示す。化合物添加条件は、８７％がＴＲＡ－１－６０陽性・ＳＳＥＡ－４陽性だったのに対し、化合物非添加条件は、７２％がＴＲＡ－１－６０陽性・ＳＳＥＡ－４陽性であった。

前記の培養３５日目の細胞について、さらに継代培養を行った。図３に化合物添加条件及び化合物非添加条件で培養した、５継代目の細胞の細胞凝集塊の顕微鏡写真を示す。（Ａ）が化合物添加条件で培養した細胞凝集塊、（Ｂ）が化合物非添加条件で培養した細胞の細胞凝集塊の顕微鏡写真である。化合物添加条件で培養した細胞において、均一な細胞凝集塊が得られることが示された。同継代細胞を、前記の（２－４－１－１）手順と同じくフローサイトメトリーでＴＲＡ－１－６０陽性細胞ＳＳＥＡ－４陽性細胞を計測した結果、化合物添加条件では９９％、化合物非添加条件では、３９％であった。

培養３５日目の細胞について、セルソーターを用いてＴＲＡ－１－６０／ＳＳＥＡ－４陽性細胞のシングルセルソーティングを行った。９６ウェルプレートの各ウェルに１細胞ずつ播種し、化合物添加条件及び化合物非添加条件で１．５ヶ月の浮遊培養（８回の継代）を行い、１０クローンを得た。図４に、このうち３クローン（＃１、＃２及び＃３）の浮遊培養細胞の細胞凝集塊の顕微鏡写真を示す。（Ａ）がクローン＃１、（Ｂ）がクローン＃２、（Ｃ）がクローン＃３の顕微鏡写真を示す。これらのクローン＃１、＃２及び＃３について、フローサイトメトリーを用いてＴＲＡ－１－６０陽性率を計測した結果、それぞれ９３．６６％、９４．１８％及び８１．９９％といずれも高い値を示した。

（２－４－２）免疫染色による細胞の未分化マーカー発現の評価
２－４－１で分取・増幅培養した３クローン（＃１～３）の１１継代目の細胞を対象として、免疫染色を以下の手順で実施した。各クローンの浮遊培養細胞塊を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

１×１０^５細胞／ウェル／１ｍＬ培地となるようにＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２、０．５μｇ／ｃｍ^２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｓｉｌｋを含有）に細胞を懸濁し、２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、３時間培養した。２４ウェルプレートから培地を除去し、ＰＢＳ １ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを除去後、各ウェルにＰＦＡ液（４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）５００μＬを入れて室温で１０分間静置して固定した。ＰＦＡ液を除去して、各ウェルに５００μＬの０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を添加し、シェイカー上で１０分間インキュベートした（ＳＳＥＡ－４検出用のウェルのみ、この工程を行わなかった）。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を捨て、各ウェルに５００μＬのＰＢＳを添加し、シェイカー上で５分間置き、ＰＢＳを除去した（洗浄操作）。洗浄操作をさらに３回行った。

ＰＢＳを除去後、各ウェルに５００μＬの０．１％ブロッキングバッファ（０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加し、シェイカー上で３０～６０分間置き、ブロッキングを行った。ブロッキング後、下記の１次抗体液を５００μＬ添加して４℃で１晩静置し、抗体を反応させた。１次抗体は、いずれも０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで下記の通り希釈した。
－マウス抗ヒトＯＣＴ３／４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、＃ｓｃ－５２７９、１／４００希釈）
－ウサギ抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（リプロセル社、＃ＲＣＡＢ００４Ｐ－Ｆ、１／４００希釈）
－抗ＳＳＥＡ抗体（ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＳＳＥＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、＃３３０４１８、１／１００希釈）
抗体反応時は、アルミ箔でプレートを包んで遮光した。

遮光条件下で、ＰＢＳによる洗浄操作を４回行った。洗浄操作終了後、各ウェルに下記の２次抗体液５００μＬを添加し（ＳＳＥＡ－４染色用ウェルは、この工程を行わず、ＰＢＳを入れた）、遮光・室温条件下、シェイカー上で１～２時間インキュベートした。
－ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｒｏｓｓ－Ａｂｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－２１２０２））
－ロバ抗ウサギ ＩｇＧ（ＤｙＬｉｇｈｔ^ＴＭ４８８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、＃４０６４０４）
遮光条件下でＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、各ウェルにＤＡＰＩ溶液（Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｎｏｎ－Ｈａｒｄｅｎｉｎｇ Ｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ナカライテスク社、＃１２７４５－７４））を１滴滴下した。蛍光顕微鏡（キーエンス社、ＢＺ－Ｘ８１０）でＤＡＰＩによる核染色と免疫染色によるそれぞれのマーカータンパク質の陽性細胞の有無を観察した。

エピソーマルプラスミドを用いて初期化及び増幅培養され、分取された３クローン（＃１～３）の細胞を培養して得られた細胞凝集塊（細胞集団）について、各未分化マーカーの陽性率（ＤＡＰＩ陽性細胞に対するＯＣＴ４陽性率、ＮＡＮＯＧ陽性率、ＳＳＥＡ陽性率）を算した結果、表２に示す通り、いずれも非常に高い陽性率を示した。

（２－４－３）細胞の胚葉体形成による多能性評価
（２－４－３－１）細胞の三胚葉への分化
２－４－１で分取・増幅培養した３クローン（２－４－２で未分化マーカーの発現を評価したクローン＃１～３と同じ）の浮遊培養中の１２継代目の細胞塊を１５ｍＬチューブに移して遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、さらに遠心した（２００ｇ×１分間）。上清を吸引除去し、沈殿した細胞塊に対して１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、３７℃、５～１０分間インキュベートした。ピペットチップで数回ピペッティングして細胞を解離後、等量のＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、２００ｇ×２分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿に対して１ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）を加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

１５ｍＬチューブに１．２×１０^６細胞／１２ｍＬ ＳｔｅｍＦｉｔ培地（１０μＭのＹ－２７６３２含有）になるように細胞数を調整して懸濁した。細胞懸濁液全量をリザーバー（アズワン社、＃２－７８４４－０２）に移し、浮遊培養用Ｖ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ分注した（細胞数は１．０×１０^４細胞／ウェルとなる）。プレートを２００ｇ×３分間遠心した後、３７℃、５％ＣＯ_２で培養を開始した。培養２日目にＥＢ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ピルビン酸ナトリウム＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）を培養プレートに１００μＬ／ウェル加えた。培養４、６日目に、培地を１００μＬ／ウェル交換した。

培養８日目より、接着培養を開始した。１２ウェルプレートの４ウェルにゼラチン溶液（０．１ｗ／ｖ％液、富士フィルム和光純薬社、＃１９０－１５８０５）をそれぞれ５００μＬ入れ、３７℃で約１時間静置した後、ゼラチン溶液を除去してゼラチンコーティングプレートを調製した。上記で培養したＥＢ培地中の細胞を各ウェルから回収し、１２～２４細胞ずつ１２ウェルプレートの各ウェルに移した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を開始した。２日おき（１０日目、１２日目、１４日目…）にＥＢ培地１ｍＬで培地交換を行った。培養開始後２０日前後で、免疫染色法による胚葉体の分化評価を行った。

（２－４－３－２）三胚葉分化の評価（免疫染色法）
１２ウェルプレートからＥＢ培地を除去し、ＰＢＳ ２ｍＬを添加して洗浄した。ＰＢＳを除去後、各ウェルにＰＦＡ液を５００μＬ入れ、室温で１０分間固定した。ＰＦＡ液を除去して、各ウェルに１ｍＬの０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を添加し、シェイカー上で１０分間インキュベートした。０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ溶液を除去して、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、シェイカー上で５分間置いたのちに液を除去した（洗浄操作）。１～２時間後、洗浄操作を４回実施した後、各ウェルに５００μＬの０．１％ ブロッキングバッファを添加し、シェイカー上で３０～６０分間インキュベートした（ブロッキング）。

ブロッキング終了後、各ウェルに下記１次抗体液を５００μＬ添加した。１次抗体液は、０．１ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で下記濃度に希釈した。プレートをパラフィルムでシールして、４℃で一晩静置した。
外胚葉マーカーＴＵＪ１検出用：マウス抗ヒトβ－３ チューブリン抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１１９５、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）
中胚葉マーカーＳＭＡ検出用：(マウス抗ヒトα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１４２０、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）
内胚葉マーカーＡＦＰ検出用：（マウス抗ヒトα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１３６８、終濃度２．５～５μｇ／ｍＬ）

ＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、各ウェルに２次抗体液（ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－２１２０２)を０．１ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００～１０００倍希釈したもの）５００μＬを添加した。以後、遮光のためにプレートをアルミ箔で包んだ。プレートを室温にてシェイカー上で１～２時間インキュベートした後、ＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、ＤＡＰＩ溶液を各ウェルに１滴添加した。蛍光顕微鏡でＤＡＰＩによる核染色、免疫染色法により各々のマーカータンパク質の陽性細胞の有無を観察した。

３つのクローンの細胞集団において、ＴＵＪ１、ＳＭＡ、ＡＦＰ陽性細胞の存在がいずれも確認できた。これらのクローンがいずれも多能性を維持していることが確認できた。

Claims (18)

1. 以下の工程Ｉ及びＩＩを含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法：
   Ｉ．体細胞に初期化遺伝子を導入する工程；及び
   ＩＩ．前記遺伝子導入した細胞を、非ゲル化培地中で、培地が流動した状態の浮遊培養条件下で初期化及び増幅培養を行う工程。
2. さらに以下の工程ＩＩＩ及びＩＶを含む、請求項１に記載の方法：
   ＩＩＩ．前記工程ＩＩで得られた細胞のうち、未分化マーカー陽性細胞を分取する工程；及び
   ＩＶ．工程ＩＩＩで分取した細胞を浮遊培養して細胞集団を得る工程。
3. 前記工程ＩＩの増幅培養が浮遊旋回方式で行われるものであり、その旋回速度が１０～１００ｒｐｍである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記工程ＩＩの増幅培養が浮遊攪拌方式で行われるものであり、その攪拌翼の回転速度は、翼先端速度が０．０５～１．３７ｍ／ｓの範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記増幅培養が培養スケールの変更を伴う継代培養を含み、培養スケールの変更の前後において、体積当たりの攪拌所要動力若しくは翼先端速度の変化が１０％未満となるように攪拌翼の回転数が設定される、請求項４に記載の方法。
6. 前記工程ＩＩＩが、分取した細胞を分画する工程である、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記未分化マーカーが、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記体細胞が、血液単核球である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記体細胞に導入する遺伝子が、エピソーマルプラスミドあるいはセンダイウイルスに組み込まれて体細胞に導入される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記導入する初期化遺伝子が、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びＬ－ＭＹＣ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法
12. 前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法
13. 前記工程ＩＩ以降に使用される液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記工程ＩＩが細胞凝集塊を回収する工程を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記工程ＩＶが細胞凝集塊を回収する工程を含む、請求項２～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記工程ＩＶで得られる細胞集団において、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である、請求項２～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法により製造されるｉＰＳ細胞を含む、細胞集団。