WO2024101385A1

WO2024101385A1 - 多能性幹細胞の製造方法及び多能性幹細胞に対する分化誘導方法

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Publication number: WO2024101385A1
Application number: PCT/JP2023/040192
Authority: WO
Inventors: 昌神林; 洋平林; 真美 ▲高▼崎
Original assignee: 株式会社カネカ; 国立研究開発法人理化学研究所
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2023-11-08
Publication date: 2024-05-16

Abstract

三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制しながらも、分化効率が向上した多能性幹細胞を製造する。多能性幹細胞をＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む液体培地にて浮遊培養した後、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない液体培地にて浮遊培養する。

Description

多能性幹細胞の製造方法及び多能性幹細胞に対する分化誘導方法

　本発明は、浮遊培養による多能性幹細胞の製造方法及び当該製造方法により得られた多能性幹細胞に対する分化誘導方法に関する。

　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化は、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性がある。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管レベルで分化誘導する技術が既に開発されている。

　一方で、多能性幹細胞を用いた再生医療は、実用化に向けて課題が残されており、その課題の一つは、多能性幹細胞そのものの生産性である。例えば、肝臓の再生には約２×１０^１１個の細胞が必要と言われている。多能性幹細胞の培養方法は、平坦な培養基板（プレート）上に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０^６ｃｍ^２以上の培養基板（プレート）が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。このように、培養基板（プレート）表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するため、スケールアップに膨大な面積が必要となり、再生医療に必要な量の細胞を供給することは困難である。一方、浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養することから、得られる細胞数は培地体積に依存するため、浮遊培養はスケールアップが比較的現実的であり、細胞の大量生産に適していると考えられている。例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。

　また、前記再生医療の実用化に向けた別の課題としては、目的とする体細胞の生産性も挙げられる。目的体細胞を効率的に生産するための取り組みとして、質の良い多能性幹細胞を培養することで分化誘導効率を向上させる取り組みが挙げられ、その方法は種々報告されている。例えば、非特許文献２には、多能性幹細胞の接着培養において、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。また、非特許文献３には、多能性幹細胞の接着培養において、タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。

　さらに、特許文献１には、多能性幹細胞の浮遊培養において、ＰＫＣβ阻害剤と、ＷＮＴ阻害剤であるＴＮＫＳ阻害剤とを共存させることで、三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制して、多能性幹細胞の未分化状態を維持する方法が開示されている。

Ｏｌｍｅｒ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ　Ｃ，Ｖｏｌｕｍｅ　１８（１０）：７７２－７８４（２０１２）Ｍ．Ｋｉｎｅｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２０１３；８（１）：ｅ５４１２２Ｔ．Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２０１３；８（５）：ｅ６３３７８

ＷＯ２０２１／１６２０９０

　上述のように、多能性幹細胞をＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤を含む培地で浮遊培養することで三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制する技術は開発された。しかしながら、当該技術を適用して得られた多能性幹細胞を目的とする細胞へ分化させる際、ＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤のいずれも含有しない培地で浮遊培養した多能性幹細胞と比較すると分化効率が低下するといった問題があった。

　そこで、本発明は、三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制しながらも、分化効率を高く維持した多能性幹細胞を製造すること、及び得られた多能性幹細胞を使用することで優れた分化効率で分化誘導することを目的とする。

　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞の未分化状態を維持するためＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤を含む培地で浮遊培養する工程は維持しつつ、分化誘導のための培養に際して分化効率を改善する上記浮遊培養における培養条件を見いだし、本発明を完成するに至った。

　本発明は以下を包含する。
　（１）多能性幹細胞をＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む第１の液体培地にて浮遊培養する工程と、
　その後、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地にて浮遊培養する工程と
　を含む多能性幹細胞の製造方法。
　（２）上記第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤のいずれか一方を実質的に含まず、他方を含むことを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（３）上記第１の液体培地から上記第２の液体培地に培地交換する工程を含むことを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（４）上記第２の液体培地に含まれるＷＮＴ阻害剤の濃度が９０ｎＭ未満であることを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（５）上記第２の液体培地に含まれるＰＫＣβ阻害剤の濃度が２５ｎＭ未満であることを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（６）上記第１の液体培地に含まれるＷＮＴ阻害剤の濃度が９０ｎＭ以上４０μＭ以下であり、ＰＫＣβ阻害剤の濃度が２５ｎＭ以上１５μＭ以下であることを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（７）上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である細胞集団を製造することを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（８）上記第２の液体培地はＰＫＣβ阻害剤を含み、且つＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない培地であって、上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により中内胚葉系細胞への分化に適した多能性幹細胞を製造することを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（９）上記第２の液体培地はＷＮＴ阻害剤を含み、且つＰＫＣβ阻害剤を実質的に含まない培地であって、上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により外胚葉系細胞への分化に適した多能性幹細胞を製造することを特徴とする（１）記載の製造方法。
　（１０）上記（１）～（９）のいずれかに記載の製造方法により製造された多能性幹細胞を分化誘導用の培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞に対する分化誘導方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２２－１７９４７２の開示内容を包含する。

　本発明に係る多能性幹細胞の製造方法によれば、浮遊培養により多能性幹細胞集団を製造するに際して、未分化状態を維持し、優れた分化効率を示す多能性幹細胞を得ることができる。

　また、本発明に係る多能性幹細胞に対する分化誘導方法によれば、未分化状態を維持した多能性幹細胞に対して優れた分化効率を達成することができる。

比較例１、２、実施例１、２及び３で浮遊培養した細胞について、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した未分化マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２）の発現量及び分化マーカー（ＴＢＸＴ、ＳＯＸ１７及びＰＡＸ６）の発現量を示す特性図である。比較例３、４、実施例４、５及び６で分化誘導処理した細胞について、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した分化マーカー（ＴＢＸ３及びＭＥＳＰ１）の発現量及び未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）の発現量を示す特性図である。

１．多能性幹細胞の製造方法
１－１．概要
　本発明に係る多能性幹細胞の製造方法は、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養した後に、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない培地にて浮遊培養することで、未分化状態を維持し、且つ分化効率に優れた多能性幹細胞や多能性幹細胞集団を得ることに特徴がある。したがって、本発明に係る多能性幹細胞の製造方法により得られた多能性幹細胞を使用することにより、効率よく分化誘導することができる。

１－２．用語の定義
　本明細書で使用する以下の用語について定義する。
≪細胞≫
　本明細書において発明の対象となる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的には、多能性とは、個体を構成する胚葉（脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉、若しくは、中内胚葉（Ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）と呼ばれる内胚葉と中胚葉の共通の前駆細胞）に分化できる能力を意味する。このような細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ）、生殖系幹細胞（ＧＳ細胞：ｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍｃｅｌｌ)、そして人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）等が挙げられる。「ＥＳ細胞」とは、初期胚より調製された多能性幹細胞である。「ＥＧ細胞」とは、胎児の始原生殖細胞より調製された多能性幹細胞である（ＳｈａｍｂｌｏｔｔＭ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：１３７２６－１３７３１）。「ＧＳ細胞」とは、細胞精巣より調製された多能性幹細胞である（ＣｏｎｒａｄＳ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ,４５６：３４４－３４９）。また、「ｉＰＳ細胞」とは、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって体細胞を未分化状態にするリプログラミングされた多能性幹細胞をいう。

　本明細書における多能性幹細胞は、多細胞生物に由来する細胞であればよい。好ましくは動物由来細胞、より好ましくは哺乳動物由来細胞である。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物、そしてヒト、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。特に好ましくは、ヒト由来細胞である。

　本明細書で使用する多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞及びプライム型多能性幹細胞を含む。ナイーブ型多能性幹細胞は着床前の内部細胞塊でみられる多能性に近い状態であり、プライム型多能性幹細胞は着床後のエピブラスト内でみられる多能性に近い状態と定義される。プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞と比較して、キメラ形成能が低く、Ｘ染色体の転写活性が一本のみであり、転写抑制ヒストン修飾が高レベルであるといった特徴がある。また、プライム型多能性幹細胞におけるマーカー遺伝子はＯＴＸ２であり、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカー遺伝子はＲＥＸ１、ＫＬＦファミリーである。さらに、プライム型多能性幹細胞のコロニー形成は扁平であり、ナイーブ型多能性幹細胞のコロニー形成はドーム状である。本明細書で使用する多能性幹細胞は、特にプライム型多能性幹細胞を用いることが好ましい。

　本明細書で使用する多能性幹細胞は、市販の細胞又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製した細胞を用いてもよい。なお、限定はしないが、本明細書の各発明に用いる場合、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞が好ましい。

　本明細書で使用するｉＰＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２、ＷＴＣ－１１株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、１２１０Ｂ２株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｂ２株等を使用することができる。

　また、本明細書で使用するｉＰＳ細胞が臨床用株の場合、限定はしないが、例えばＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、Ｆｆ－ｌ１４ｓ０３株、Ｆｆ－ｌ１４ｓ０４株、ＹＺＷＩ株等を使用することができる。

　また、本明細書で使用するｉＰＳ細胞が新たに作製された細胞の場合、導入される初期化因子の遺伝子の組み合わせは、限定はしないが、例えばＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせ（ＹｕＪ，ｅｔａｌ．２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ,３１８：１９１７－２０．）、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子及びＮＡＮＯＧ遺伝子の組み合わせ（ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ｅｔａｌ.２００７，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１‐７２．）を使用することができる。これらの遺伝子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入であってもよいし、タンパク質として導入してもよい。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよく、新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞を用いてもよい。

　本明細書で使用するＥＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＳＥＥＳ－４株、ＳＥＥＳ－５株、ＳＥＥＳ－６株、ＳＥＥＳ－７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。

　多能性幹細胞マーカー（未分化マーカーとも称する）は、多能性幹細胞で特異的に又は過剰に発現している遺伝子マーカーで、例えば、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。

　多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール、又はＦＭＯコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

≪培養及び培地≫
　「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養液中で細胞が培養容器等に対して固定されていない、非接着の状態をいう。また、例えば、マイクロキャリアに細胞を付着させ培養液中で浮遊させた状態で培養する培養法は、細胞がマイクロキャリアに接着してはいるが、マイクロキャリアを含む細胞塊としては培養容器に接着することなく浮遊しており、浮遊培養と見なすことができる。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、一般的に、培養開始においては主に単細胞化された状態で存在し、培養が進むにつれて培養液中で凝集した細胞塊で存在する。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、増殖させることをいう。このとき、細胞が接着している外部マトリクス等は培養液中に浮遊していないものである。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。本発明で行う浮遊培養法としては、好ましくはマイクロキャリアを使用しない浮遊培養法である。

　本明細書において、第１の液体培地及び第２の液体培地という用語を使用するが、第１の液体培地及び第２の液体培地は、前者がＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む液体培地であり、後者がＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない液体培地を意味する。なお、第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の一方を実質的に含まなければ良く、両方を実質的に含まなくても良い。

　本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び／又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上含有する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。

　本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ＳＭｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’Ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ＳＭｅｄｉｕｍ／ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては、特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地の重量比を好ましくは６０／４０以上４０／６０以下の範囲、例えば５８／４２、５５／４５、５２／４８、５０／５０、４８／５２、４５／５５、又は４２／５８等で混合した培地を用いる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
　本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。

　本明細書において「培養添加物」とは、培養目的で培地に添加される血清以外の物質である。培養添加物の具体例として、限定はしないが、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及びサイトカインは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。また、増殖因子は、限定するものではないが、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１）、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ、及びＩＧＦＢＰ－７を使用することができる。抗生剤は、限定するものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。本発明で用いる培地の培養添加物として、特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１である。

　また、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤を培地に含有することで、多能性幹細胞の浮遊培養における細胞死を大幅に抑制することができ、また、細胞塊の強度を増大させ、物理的ダメージへの耐性を向上させることができる。例えば、培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、下限を１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、７μＭ、又は１０μＭとすることができ、上限を５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、又は１０μＭとすることができる。

　さらに、培地は、特にプライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＬＩＦを含まない組成とすることが好ましい。さらに、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のいずれか一方、好ましくは両方を含まない培地組成とすることが好ましい。これらＬＩＦ、ＧＳＫ３阻害剤、及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない培地であれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ化することなく、且つ未分化状態を維持して培養することができる。

　本発明で用いる培地は、前記培養添加物を１種以上含むことができる。前記培養添加物を添加する培地としては、限定はしないが、前記基礎培地が一般的である。

　培養添加物は、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸は、２－リン酸アスコルビン酸マグネシウム等の誘導体の形態で培地に添加してもよく、セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウム等）の形態で培地に添加してもよい。また、インスリン、トランスフェリン、及びセレンに関しては、ＩＴＳ試薬（インスリン-トランスフェリン-セレン）の形態で培地に添加することもできる。また、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つが添加された市販の培地を使用することもできる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ II（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦＤｒｙＰｏｗｄｅｒｅｄＭｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８^ＴＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＲｅｐｒｏＭｅｄ（リプロセル社）、及びＳｔｅｍＳｃａｌｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。

　なお、本発明で用いる培地として最も好ましいものは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地である。特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

≪ＰＫＣβ阻害剤≫
　本明細書において「プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤」とは、ＰＫＣβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、Ｃ末端側の触媒領域及びＮ末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ＡＴＰ／Ｍｇ^２＋結合する配列とから構成される。調節領域はＣ１ドメインとＣ２ドメインから構成される。

　ＰＫＣには、在来型（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ及びＰＫＣγがある。また、ＰＫＣには、新型（Ｎｏｖｅｌ）アイソザイムとしてＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηがあり、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣζ、ＰＫＣλ及びＰＫＣμがある。

　本明細書において、ＰＫＣβという場合、これらＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの両者を含む場合、若しくは、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩのうち一方を含む場合を意味する。また、本明細書においてＰＫＣβ阻害剤という場合、これら従来型、新型及び非典型アイソザイムのうち、少なくともＰＫＣβＩ及び/又はＰＫＣβＩＩを阻害する物質を意味する。すなわち、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、ＰＫＣβＩＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、及びＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

　なお、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβの活性のみを特異的に阻害又は抑制する物質でもよいが、ＰＫＣβＩ又はＰＫＣβＩＩ以外に他のアイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質であってもよい。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩを含む、前述した全ての従来型、新型及び非典型アイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質でもよい。また、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に従来型アイソザイムであるＰＫＣα及びＰＫＣγの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。さらに、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に新型アイソザイムであるＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。

　上記のＰＫＣβ阻害剤としては、ＰＫＣβに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＰＫＣβをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

　一例として、ＰＫＣβ阻害剤は、下記構造式［式Ｉ］を有する化合物を挙げることができる。

で表される化合物又はその塩。

　式Ｉにおいて、
　Ｒ_１は水素原子または炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、　Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Ａは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
　Ｒ_３は、

、

、
又は

で表される基であり、
　Ｒ_Ｂは、水素原子、－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２）により置換された炭素数２～４のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２））、又は

で表される基であり、
　或いは、Ｒ_２とＲ_Ｂとが一体となって下記の二価基

を形成していてもよく、ここで、＃はＲ_２の結合位置への結合を指し、＃＃はＲ_Ｂの結合位置への結合を指し、
　前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、

であり、
　Ｒ_Ｃは、－Ｎ（Ｒ_Ｄ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Ｄは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。

　式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。

　上記構造式［式Ｉ］を有するＰＫＣβ阻害剤としては、具体的に、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ　Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ　Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するＰＫＣβ阻害剤の中でも、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＬＹ－３３３５３１からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。

　Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　ＧＦ１０９２０３Ｘ（２－［１－（３－ジメチルアミノプロピル）インドール－３－イル］－３－（インドール－３－イル）マレイミド）の構造式を下記に示す。

　ＬＹ－３３３５３１（（９Ｓ）－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，１０，１１－テトラヒドロ－９Ｈ，１８Ｈ－５，２１：１２，１７－ジメテノジベンゾ［ｅ，ｋ］ピロロ［３，４－ｈ］［１，４，１３］オキサジアザシクロヘキサデシン－１８，２０（１９Ｈ）－ジオン、モノヒドロキシクロライド）の構造式を下記に示す。

　Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１－メチルインドール－３－イル）－４－［１－［１－（ピリジン－２－イルメチル）ピペリジン－４－イル］インドール－３－イル］ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）キナゾリン－４－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ（３－［３－［２，５－ジヒドロ－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－３－ｙｌ］－１Ｈ－インドール－１－イル］プロピルカルバムイミドチオ酸エステルメシラート）の構造式を下記に示す。

　Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（３－［（８Ｓ）－８－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，８，９－テトラヒドロピリド［１，２－ａ］インドール－１０－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン塩酸塩）の構造式を下記に示す。

≪ＷＮＴ阻害剤≫
　本明細書において、「ＷＮＴシグナル（ＷＮＴ）阻害剤」とは、ＷＮＴシグナルを阻害、低減させる全ての物質を含む意味である。ＷＮＴは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与していることが知られている。ＷＮＴが関与するシグナル伝達経路は、細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等を制御している。ＷＮＴが関与するシグナル経路には、ＷＮＴが細胞に作用することで活性化される、幾つかの異なる細胞内シグナル伝達機構が含まれる。ＷＮＴが関与するシグナル経路には、β－カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ－カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するＰＣＰ（ｐｌａｎａｒ　ｃｅｌｌ　ｐｏｌａｒｉｔｙ、平面内細胞極性）経路、Ｃａ^２＋の細胞内動員を促進するＣａ^２＋経路等が含まれる。本明細書において、ＷＮＴ阻害剤は、ＷＮＴが関与するシグナル伝達経路に含まれるいずれの経路を阻害するものであってもよい。

　ＷＮＴ阻害剤としては、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）タンパク、スクレロスチン、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｋｒｅｍｅｎなどのタンパク質を挙げることができる。ＷＮＴ阻害剤の具体例としては、特に限定されないが、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＷＮＴ－Ｃ５９、ＸＡＶ－９３９、ＣＣＴ２５１５４５、ＫＹ１２２０、ｉＣＲＴ１４、ｉＣＲＴ３、ＬＦ３、ＰＮＵ－７４６５４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、Ｃａｐｍａｔｉｎｉｂ（ＩＮＣＢ２８０６０）、ＫＹ０２１１１、ＲＣＭ－１、Ｒｅｓｉｂｕｆｏｇｅｎｉｎ、ＭＳＡＢ、ＰＲＩ－７２４、Ｔｅｇａｔｒａｂｅｔａｎ（ＢＣ－２０５９）、ＪＷ５５、Ａｄａｖｉｖｉｎｔ（ＳＭ０４６９０）、Ｔｒｉｐｔｏｎｉｄｅ、Ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ、ＩＱ－１、Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ及びＦＨ５３５を挙げることができる。さらに、ＷＮＴ阻害剤として、ＷＮＴ受容体阻害剤、可溶型ＷＮＴ受容体、ＷＮＴ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷＮＴタンパク質を挙げることができる。

　これらＷＮＴ阻害剤の中には、いわゆるタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤が含まれており、本発明では特に、ＷＮＴ阻害剤としてＴＮＫＳ阻害剤を使用することが好ましい。

≪ＴＮＫＳ阻害剤≫
　本明細書において「タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース（タンキラーゼと称する場合もある）は、標的タンパク質をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化するポリ（ＡＤＰ－リボシル）化酵素（ＰＡＲＰ）ファミリーに属し、タンキレース１（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－１／ＰＡＲＰ－５ａ）及びタンキレース２（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－２／ＰＡＲＰ－５ｂ）が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質ＴＲＦ１をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。

　本明細書において、ＴＮＫＳという場合、これらタンキレース１及びタンキレース２の両者を含む場合、若しくはタンキレース１及びタンキレース２のうち一方を含む場合を意味する。また、本明細書においてＴＮＫＳ阻害剤という場合、タンキレース１及び/又はタンキレース２を阻害する物質を意味する。すなわち、ＴＮＫＳ阻害剤は、タンキレース１の活性のみを阻害又は抑制する物質、タンキレース２の活性のみを阻害又は抑制する物質、及びタンキレース１並びにタンキレース２の活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

　ＴＮＫＳ阻害剤は、ＴＮＫＳに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＴＮＫＳをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

　一例として、ＴＮＫＳ阻害剤としては、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＭＳＣ２５０４８７７及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、ＴＮＫＳ阻害剤の中でも、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及び/又はＸＡＶ９３９を使用することが好ましい。

　ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）の構造式を下記に示す。

　ＸＡＶ９３９（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

　Ｇ００７－ＬＫ（４－［５－［（１Ｅ）－２－［４－（２－クロロフェニル）－５－［５－（メチルスルフォニル）－２－ピリジニル］－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］エテニル］－１，３，４－オキサジアゾ－ル－２－イル］－ベンゾニトリル）の構造式を下記に示す。

　Ｇ２４４－ＬＭ（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－［２－（メチルスルフォニル）フェニル］－１－ピペラジニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

　ＷＩＫＩ４（２－［３－［［４－（４－メトキシフェニル）－５－（４－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］チオ］プロピル］－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）の構造式を下記に示す。

１－３．構成
１－３－１．第１の液体培地
　本発明に係る多能性幹細胞の製造方法にて使用する第１の液体培地は、上記１－２．で定義したＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含有する。なお、当該第１の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を有効成分として含む多能性幹細胞分化抑制剤を使用して調製することもできる。

　ここで、当該第１の液体培地に含まれるＰＫＣβ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。

　ＰＫＣβ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、第１の液体培地中の終濃度として２５ｎＭ以上とすることができ、３０ｎＭ以上とすることができ、５０ｎＭ以上とすることができ、８０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができる。

　ＰＫＣβ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲や、多能性幹細胞に対して毒性を呈しない範囲、ＰＫＣβ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、第１の液体培地中の終濃度として１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができる。

　一方、第１の液体培地に含まれるＷＮＴ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。

　ＷＮＴ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。例えば、ＷＮＴ阻害剤は、第１の液体培地中の終濃度として９０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、９００ｎＭ以上とすることができる。

　ＷＮＴ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲や、多能性幹細胞に対して毒性を呈しない範囲、ＷＮＴ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。例えば、ＷＮＴ阻害剤は、第１の液体培地中の終濃度として４０μＭ以下とすることができ、３５μＭ以下とすることができ、３０μＭ以下とすることができ、１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１．５μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができる。

　また、第１の液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率の下限は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上、１１１：１以上、５６：１以上、３３：１以上、１１：１以上、７．８：１以上、５．６：１以上、２．２：１以上、１．７：１以上、又は１．１：１以上とすることができる。第１の液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率の上限は、特に限定されないが、例えば、１：１６００以下、１：１４００以下、１：１２００以下、１：６００以下、１：４００以下、１：２００以下、１：１２０以下、１：６０以下、１：４０以下、１：３６以下、１：３２以下、１：２８以下、１：２４以下、１：２０以下、１：１６以下、１：１２以下、１：８以下、１：６以下、又は１：４以下とすることができる。第１の液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、特に限定されないが、例えば、１６７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。また、第１の液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、好ましくは、１１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、３３：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、７．８：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５．６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、２．２：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。さらに第１の液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、１６７：１以上１：１４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２４以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４以下の範囲とすることができる。

　また、有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤は、担体と組み合わせて培地に添加することもできる。担体には、溶媒及び／又は賦形剤が含まれる。

　溶媒としては、例えば、水、バッファ（ＰＢＳを含む）、生理食塩水、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、キシレン、低級アルコール）等が挙げられる。

　賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等を挙げることができる。抗生剤は、特に限定されないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、例えば、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、例えば、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、例えば、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、ｄｌ－カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、２－ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、ｌ－メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ－ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ及びその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ及びその誘導体、αリポ酸及びその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、及びこれらの混合物などが挙げられる。

　また、第１の液体培地、第２の液体培地は、１種以上の増殖因子を含有してもよい。増殖因子には、例えば、ＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１が挙げられる。

１－３－２．第２の液体培地
　本発明に係る多能性幹細胞の製造方法においては、第１の液体培地を用いた培養の後、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない液体培地（第２の液体培地）中で多能性幹細胞を培養する。

　第２の液体培地は、上述の第１の液体培地と比較してＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含有しない点で相違する液体培地である。ここで、本明細書においては、第２の液体培地がＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含有しないという条件は、培地中にＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤が全く含まれないか、培地中のＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤が検出限界以下である場合に限定されず、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤が、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を示す濃度未満である場合を含む。

　ＰＫＣβ阻害剤が多能性幹細胞の分化を抑制する作用を示す濃度未満とは、多能性幹細胞の種類やその他の培地組成や培養条件によって異なるが、例えば、終濃度として２５ｎＭ未満である場合も含むと解釈する。言い換えると、第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤を終濃度として２５ｎＭ未満、２３ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は３ｎＭ未満とすることができる。最も好ましくは、第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤が検出限界以下の場合である。

　ＷＮＴ阻害剤が多能性幹細胞の分化を抑制する作用を示す濃度未満とは、多能性幹細胞の種類やその他の培地組成や培養条件によって異なるが、例えば、終濃度として９０ｎＭ未満である場合も含むと解釈する。言い換えると、第２の液体培地は、ＷＮＴ阻害剤を終濃度として９０ｎＭ未満、８５ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、７０Ｍ未満、６５ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４５ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３５ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は３ｎＭ未満とすることができる。最も好ましくは、第２の液体培地は、ＷＮＴ阻害剤が検出限界以下の場合である。

　なお、第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まなければよく、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤のいずれか一方が含まれていてもよい。第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤のいずれか一方を含む場合、その濃度は上記１－３－１．第１の液体培地の項目で説明した濃度とすることができる。

　第２の液体培地を用いた浮遊培養は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む第１の液体培地を用いた浮遊培養の後の多能性幹細胞を培養するため、多能性幹細胞を播種する段階で第１の液体培地に含まれていたＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を持ち込む可能性がある。しかしながら、多能性幹細胞を播種する際にＰＫＣβ阻害剤やＷＮＴ阻害剤が第２の液体培地に持ち込まれたとしても、上述した濃度範囲であれば、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含有しない第２の液体培地にて多能性幹細胞を浮遊培養するという態様となる。

　また、第２の液体培地にて培養する多能性幹細胞の種類や培養条件等によっては、上述したＰＫＣβ阻害剤やＷＮＴ阻害剤に限らず、ＰＫＣβやＷＮＴシグナルに対する阻害作用を有する物質が培地中に産生される場合がある。この場合であっても、上述した濃度範囲であれば、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含有しない第２の液体培地にて多能性幹細胞を浮遊培養するという態様に含まれる。

１－４．効果
　本発明の多能性幹細胞の製造方法によれば、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地で多能性幹細胞を培養することで、分化誘導に供する多能性幹細胞を製造する。このように第２の液体培地を用いて多能性幹細胞を培養することで、得られた多能性幹細胞の分化効率を向上させることができる。したがって、本発明の多能性幹細胞の製造方法を適用することで、分化効率に優れた多能性幹細胞を取得することができる。

　特に、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の両方を実質的に含まない第２の液体培地で多能性幹細胞を培養することで、外胚葉、中胚葉及び内胚葉のいずれに対しても優れた分化効率を示す多能性幹細胞を製造することができる。また、ＷＮＴ阻害剤を含み、ＰＫＣβ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地で多能性幹細胞を培養することで、外胚葉に対して優れた分化効率を示す多能性幹細胞を製造することができる。さらに、また、ＰＫＣβ阻害剤を含み、ＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地で多能性幹細胞を培養することで、中胚葉及び内胚葉に対して優れた分化効率を示す多能性幹細胞を製造することができる。

２．多能性幹細胞の製造方法の更に詳細な説明
２－１．概要
　以下では、本発明に係る多能性幹細胞の製造方法に含まれる、第１の液体培地を用いて浮遊培養する工程と、その後、第２の液体培地を用いて浮遊培養する工程と、更にその他の任意の工程について説明する。

２－２．方法
　本態様の方法は、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程と、第２の液体培地を用いた浮遊培養工程とを必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を任意の選択工程として含む。

２－２－１．第１の液体培地を用いた浮遊培養工程
　第１の液体培地を用いた浮遊培養工程では、容器、担体等の培養基材に接着させながら培養する接着培養若しくは浮遊培養で維持された細胞、細胞集団或いは細胞塊を、未分化状態を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。

（培養容器）
　培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば、生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、Ｎｕｎｃｌｏｎ^ＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できる。

　培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。

　使用する培養容器の容量は適宜選択することができ、特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、０．３２ｃｍ^２以上、０．６５ｃｍ^２以上、１．９ｃｍ^２以上、３．０ｃｍ^２以上、３．５ｃｍ^２以上、９．０ｃｍ^２以上、又は９．６ｃｍ^２以上で、上限が、１０００ｃｍ^２以下、５００ｃｍ^２以下、３００ｃｍ^２以下、１５０ｃｍ^２以下、７５ｃｍ^２以下、５５ｃｍ^２以下、２５ｃｍ^２以下、２１ｃｍ^２以下、１０ｃｍ^２以下、又は３．５ｃｍ^２以下であることが好ましい。

　また使用する培養容器の容量は、適宜選択することができ、特に限定されないが、第１の液体培地を収容し培養可能な体積の下限が、１ｍＬ以上、２ｍＬ以上、４ｍＬ以上、１０ｍＬ以上、２０ｍＬ以上、３０ｍＬ以上、５０ｍＬ以上、１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、３Ｌ以上、５Ｌ以上、１０Ｌ以上、又は２０Ｌ以上で、上限が、１００Ｌ以下、５０Ｌ以下、２０Ｌ以下、１０Ｌ以下、５Ｌ以下、３Ｌ以下、１Ｌ以下、５００ｍＬ以下、２００ｍＬ以下、１００ｍＬ以下、５０ｍＬ以下、又は３０ｍＬ以下であることが好ましい。

（培養液量）
　第１の液体培地の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。特に限定されないが、これらに関して例示する。例えば、１２ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり３．５ｃｍ^２）を使用する場合は、１ウェルあたりの量を０．５ｍＬ以上、１．５ｍＬ以下、好ましくは約１．３ｍＬとすることができる。また、６ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり９．６ｃｍ^２）を使用する場合には、１ウェルあたりの量を下限は１．５ｍＬ以上、２ｍＬ以上、又は３ｍＬ以上とすることができ、また、上限は６ｍＬ以下、５ｍＬ以下、４ｍＬ以下とすることができる。さらに、１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、容器当たりの量を下限は１０ｍＬ以上、１５ｍＬ以上、２０ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、又は３０ｍＬ以上とすることができ、また、上限は５０ｍＬ以下、４５ｍＬ以下、又は４０ｍＬ以下とすることができる。また、容量が５００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、１０５ｍＬ以上、１１０ｍＬ以上、１１５ｍＬ以上、又は１２０ｍＬ以上とすることができ、また上限は１５０ｍＬ以下、１４５ｍＬ以下、１４０ｍＬ以下、１３５ｍＬ以下、１３０ｍＬ以下、又は１２５ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は２５０ｍＬ以上、２６０ｍＬ以上、２７０ｍＬ以上、２８０ｍＬ以上、又は２９０ｍＬ以上とすることができ、また、上限は３５０ｍＬ以下、３４０ｍＬ以下、３３０ｍＬ以下、３２０ｍＬ以下、又は３１０ｍＬ以下とすることができる。さらに、例えば、容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、３００ｍＬ以上、４００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、６００ｍＬ以上、７００ｍＬ以上、８００ｍＬ以上、９００ｍＬ以上、又は１０００ｍＬ以上とすることができ、上限は２０００ｍＬ以下、１９００ｍＬ以下、１８００ｍＬ以下、１７００ｍＬ以下、１６００ｍＬ以下、１５００ｍＬ以下、１４００ｍＬ以下、１３００ｍＬ以下、１２００ｍＬ以下、又は１１００ｍＬ以下とすることができる。また、容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、又は５Ｌ以上とすることができ、上限は１０Ｌ以下、９Ｌ以下、８Ｌ以下、７Ｌ以下、又は６Ｌ以下とすることができる。また、容量が１Ｌのシングルユースリアクターを使用する場合は、１リアクター当たりの量を下限は３００ｍＬ以上、３５０ｍＬ以上、４００ｍＬ以上、４５０ｍＬ以上、又は５００ｍＬ以上とすることができ、上限は１Ｌ以下、９００ｍＬ以下、８００ｍＬ以下、７００ｍＬ以下、又は６００ｍＬ以下とすることができる。また、任意の容量の攪拌翼型リアクターを使用する場合は、各メーカー指定のワーキングボリュームの範囲内とすることができる。

（播種密度）
　浮遊培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度（播種密度）は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は、例えば、０．０１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、０．１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、そして、上限は、例えば、２０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、又は１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲である。

（培養条件）
　培養温度、時間、ＣＯ_２濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば、培養温度は下限が２０℃以上、又は３５℃以上、そして上限が４５℃以下、又は４０℃以下であればよく、好ましくは３７℃である。また、１継代期間の培養時間は下限が０．５時間以上又は６時間以上、そして上限が９日間以下、７日間以下、１２０時間以下、９６時間以下、７２時間以下、又は４８時間以下の範囲である。培養時のＣＯ_２濃度は、下限が０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は４．５％以上、そして上限が１０％以下、又は５．５％以下であればよく、好ましくは５％である。なお、培養時のＣＯ_２濃度は一定である必要はなく、培養途中で変更・変化してもよい。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上、又は１日に２回以上で行えばよいが、それらに限定されない。また、灌流方式で常に連続して培地交換を行ってもよい。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞塊を分散させた後、再度培養すればよい。灌流方式で培地交換を行う場合は、培養系中に細胞を留めるためにフィルターで細胞と培地を分離し培地交換すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。

　また、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングは、例えば、培地中の乳酸濃度に基づいて決定することもできる。乳酸は、培養中に細胞により産生され、培地中に蓄積される。細胞が産生した乳酸、或いは、元から培地中に含まれていた乳酸は、細胞にダメージを与え、その結果、多能性幹細胞の未分化性維持を阻害し、増殖、特に継代後の細胞増殖能を低下させるなどの悪影響を与えることが知られている。そこで、培地中の乳酸濃度に基づいて培養終了のタイミング及び／又は培地交換のタイミングや量を決定することで、乳酸による未分化性維持の阻害作用、乳酸による細胞増殖能の低下作用を回避することができる。

　さらに、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程の終期は、後述する第２の液体培地を用いた浮遊培養工程と併せて設定することもできる。すなわち、後述する第２の液体培地を用いた浮遊培養工程に必要な培養時間を先に設定しておき、培養対象の多能性幹細胞に必要な全体の培養時間から差し引くことで、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程の培養時間を設定することができる。

（培養方法）
　本方法では、浮遊培養、すなわち容器に細胞が接着しない状態で培養するため、第１の液体培地が流動する流動培養が適用される。「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の場合、細胞の凝集を促進するように培地を流動させる方法が好ましい。そのような培養方法として、例えば、旋回培養法、揺動培養法、撹拌培養、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

　「旋回培養法」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。

　旋回速度は、特に限定されないが、下限は、例えば、１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、８３ｒｐｍ以上、８５ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば、２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下とすることができる。旋回培養に使用するシェーカーの振幅は、特に限定されないが、下限は、例えば、１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、又は２０ｍｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば、２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、又は３０ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径も特に限定されないが、好ましくは振幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は、例えば、５ｍｍ以上又は１０ｍｍ以上であり、上限は、例えば、１００ｍｍ以下又は５０ｍｍ以下とすることができる。特に、後述する細胞塊の製造方法等では、旋回条件を前記範囲にすることで、適切なサイズの細胞塊を製造することが容易となるため好ましい。

　「揺動培養法」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば、１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に５０回以下、２５回以下、２０回以下、又は１５回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０．１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は２０°以下、１８°以下、１５°以下、１２°以下又は１０°以下とすることができる。後述する細胞塊の製造方法等では、揺動条件を前記範囲とすることで、適切なサイズの細胞塊を製造することが容易となるため好ましい。

　さらに、上記旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

　「撹拌培養法」とは、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌手段を用いて容器内の培地を撹拌する条件で培養する方法をいう。例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで撹拌培養を達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。上記撹拌手段による撹拌速度は特に限定されないが、下限は１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、又は７０ｒｐｍ以上、９０ｒｐｍ以上、１１０ｒｐｍ以上、１３０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は２００ｒｐｍ以下、又は１５０ｒｐｍ以下とすることができる。

　また、「撹拌培養法」においては、培養中の細胞にかかる剪断応力を制御することが好ましい。多能性幹細胞を含む動物細胞は、一般的に、他の細胞と比較して物理的ストレスに弱い場合が多い。そのため、攪拌培養に際して細胞に負荷される剪断応力が大きすぎると、細胞が物理的なダメージを受け、増殖能が低下したり、多能性幹細胞であれば未分化性を維持できなくなったりする場合がある。

　攪拌培養において細胞に負荷される物理的なダメージは、攪拌翼周辺の局所的な剪断応力に影響される場合がある。攪拌翼周辺の局所的な剪断応力は、限定されないが、例えば、翼先端速度（翼径が最も大きな部分での周速）と関係する。翼先端速度は、翼径［ｍ］×円周率×回転数［ｒｐｓ］＝翼先端速度［ｍ／ｓ］として求めることができる。

　具体的には、第１の液体培地を用いた浮遊培養においては、翼先端速度が０．２３ｍ／ｓ以上といった非常に大きな値であっても、多能性幹細胞の未分化性を維持しながら攪拌培養することができる。

　また、翼先端速度は、必ずしも限定されないが、０．０５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．０８ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１７ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．３０ｍ／ｓ以上とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、細胞同士の過凝集を抑制することができる。

　さらに、翼先端速度は、必ずしも限定されないが、１．３７ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、１．００ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．８４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．５０ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．４２ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．３４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく０．３０ｍ／ｓ以下とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、培養系内の培地流動状態を安定化することができる。

　上記の翼先端速度の好ましい範囲は、多能性幹細胞の浮遊培養用に提供されているＡＢＬＥ社のシングルユースリアクターにも適用することができる。また攪拌培養において、特に限定するものではないが、培養スケールを変更する際はＰｖ一定の式を用いて攪拌翼の回転数を決定すれば良い。Ｐｖとは単位体積当たりの攪拌所要動力のことであり、Ｐｖを同じにすることで異なるスケール間で同様に攪拌培養することができる。Ｐｖ一定の式は、単位時間当たりの回転数［ｒｐｍ、又は、ｒｐｓ］×（翼径［ｍ］）^２／３＝定数と表すことができる。

　本工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。

２－２－２．第２の液体培地を用いた浮遊培養工程
　第２の液体培地を用いた浮遊培養工程は、本発明に係る多能性幹細胞の製造方法において、上述した第１の液体培地を用いた浮遊培養工程の後の工程であって、分化誘導処理に供する、未分化状態を維持した多能性幹細胞を得るための工程である。本項では、第２の液体培地を用いた浮遊培養工程を説明するが、第２の液体培地を使用する以外は、基本的に前述の「２－２－１．第１の液体培地を用いた浮遊培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは上述した「２－２－１．第１の液体培地を用いた浮遊培養工程」と共通する説明については省略し、第２の液体培地を用いた浮遊培養工程に特徴的な点についてのみ詳述する。

　本工程で使用する多能性幹細胞は、上述した第１の液体培地を用いた浮遊培養工程で得られた多能性幹細胞である。第１の液体培地を用いた浮遊培養工程で得られた多能性幹細胞は、単一細胞の状態にして本工程に供しても良いし、細胞塊の状態のまま本工程に供しても良い。本工程は、上述した第２の液体培地を使用することで、未分化状態を維持しつつ、且つ、分化効率に優れた多能性幹細胞を得ることができる。

　未分化状態を維持しているかは、本工程後に得られる多能性幹細胞集団において多能性幹細胞マーカー(例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、未分化マーカーとも称する)を発現する、及び／又は、多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）に基づいて判断することができる。

　なお、本工程では、浮遊培養途中の多能性幹細胞の一部を取り出し、未分化状態を維持しているか確認することができる。例えば、培養中に取り出した多能性幹細胞に発現する多能性幹細胞マーカーの発現度合いを測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。多能性幹細胞マーカーとしては、上述したように、例えば、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。これら多能性幹細胞マーカーの検出方法も、上述したように、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。

　本工程の終了後の培地又は培養中の培地から取り出した多能性幹細胞のなかで多能性幹細胞マーカーの陽性率が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の場合、未分化を維持していると判断することができる。

　また、第２の液体培地を用いた浮遊培養の工程において、培養途中で取り出した多能性幹細胞における三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現度合いを測定することで、未分化状態を維持しているか確認することもできる。すなわち、これら内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、より好ましくは７％以下、より好ましくは６％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは検出限界以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

　内胚葉系細胞マーカーとは、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する。

　中胚葉系細胞マーカーとは、中胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＴＢＸＴ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。なお、中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。

　外胚葉系細胞マーカーとは、外胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＦＧＦ５、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６等を挙げることができる。なお、外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）、水晶体、末梢神経系などを形成する。また、外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。

　これら三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現度合いは、当該技術分野において任意の検出方法により測定することができる。三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定する方法としては、限定はしないが、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法、ノーザンハイブリダイゼーション、又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等が挙げられる。定量的リアルタイムＰＣＲ解析においては、測定対象のマーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対する相対発現量に換算し、当該相対発現量に基づいてマーカー遺伝子の発現量を評価できる。内部標準遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子やβ－アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子を挙げることができる。

　一方、得られた多能性幹細胞における分化効率は、分化誘導処理後の細胞における三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）に基づいて判断することができる。例えば、分化誘導のための培養を開始してから比較的に短時間でこれらマーカーの発現が向上した場合、分化効率に優れた多能性幹細胞と評価することができる。なお、このとき、上述した多能性幹細胞マーカーの発現が低下することを併せて確認し、分化効率を評価しても良い。

　特に、第２の液体培地として、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の両方を実質的に含まない培地を使用した場合、内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの全てを多能性幹細胞における分化効率の指標とすることができる。また、第２の液体培地として、ＷＮＴ阻害剤を含み、ＰＫＣβ阻害剤を実質的に含まない培地を使用した場合、外胚葉系細胞マーカーを多能性幹細胞における外胚葉系細胞への分化効率の指標とすることができる。さらに、第２の液体培地として、ＰＫＣβ阻害剤を含み、ＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない培地を使用した場合、中胚葉系細胞マーカー及び内胚葉系細胞マーカーを多能性幹細胞における中内胚葉系細胞への分化効率の指標とすることができる。

　例えば、第２の液体培地を用いた浮遊培養後の多能性幹細胞に対して分化誘導のための培養を行い、内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーのいずれかについて、陽性率が例えば、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％となるまで培養時間を測定し、第１の液体培地を用いた浮遊培養後の多能性幹細胞に対して分化誘導した場合と比較して有意に短くなっている場合、第２の液体培地を用いた浮遊培養後の多能性幹細胞の分化効率が向上していると評価することができる。

　なお、三胚葉マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール、又はＦＭＯコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。そして、陽性を呈する細胞の比率を「陽性率」として定義することができる。

　一つの態様として、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程の終了後に回収した多能性幹細胞を、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地に接種し、浮遊培養を開始することができる。このとき、回収した多能性幹細胞を洗浄することで第１の液体培地に含まれていたＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の持ち込みを回避することができる。

　また、別の態様として、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程において、灌流方式で連続して培地交換を行う場合、徐々にＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤の濃度を低減することで、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤が実質的に含まない第２の液体培地を用いた浮遊培養工程へと移行することできる。このとき、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程において灌流に使用する培地として、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地を使用することができる。また、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程において灌流に使用する培地に含まれるＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤の濃度を徐々に低減し、灌流し続けることによって、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地を用いた浮遊培養工程へと移行することもできる。

（培養時間）
　第２の液体培地で多能性幹細胞を浮遊培養する本工程は、得られた多能性幹細胞における、上述のように定義できる分化効率が向上する培養時間とすることができる。すなわち、培養時間の下限は、得られた多能性幹細胞における、上述のように定義できる分化効率が向上する培養時間とすることができる。この培養時間は、使用する多能性幹細胞の株や品質、培地条件、培養条件などによって異なるため、一義的に定めることはできない。一例としては、使用する多能性幹細胞の種類や、培地条件、培養条件、分化誘導処理条件などを揃えた予備実験を行い、分化誘導処理後の陽性率が有意に高くなる培養時間を設定することができる。より具体的には、多能性幹細胞を第２の液体培地で浮遊培養を開始してから、例えば８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後、９６時間後、１０８時間後、１２０時間後、１３２時間後、又は１４４時間後を第２の液体培地を用いた浮遊培養の工程の終期とすることができる。

　ところで、第２の液体培地で多能性幹細胞を浮遊培養する本工程では、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＷＮＴ阻害剤が実質的に含まれていない培地を使用するため、培養時間が長期間になると、未分化状態を維持できなくなる場合がある。よって、第２の液体培地を用いた浮遊培養工程は、多能性幹細胞が未分化状態を維持できる範囲で終了することが好ましい。

　第２の液体培地で多能性幹細胞を浮遊培養する本工程の培養時間については、使用する多能性幹細胞の種類や、培地条件、培養条件などによって異なるため、一義的に定めることはできない。一例としては、使用する多能性幹細胞の種類や、培地条件、培養条件などを揃えた予備実験を行い、上述した内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、より好ましくは７％以下、より好ましくは６％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは検出限界以下となる条件として培養時間を設定することができる。

　また、本工程は、上述のように未分化性を維持する条件に加えて、細胞に対する悪影響を有する乳酸の濃度を指標として培養時間を設定することもできる。本工程では、培養液に蓄積される乳酸濃度が１５ｍＭ以下、１４ｍＭ以下、１３ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１０ｍＭ以下となる培養時間とすることができ、特に、培養液に蓄積される乳酸濃度が９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下となる培養時間とすることが好ましい。培養液に蓄積される乳酸濃度がこの範囲であれば、細胞に対する悪影響を回避することができる。

　さらに、本工程は、上述のように未分化性を維持する条件に加えて、細胞塊のサイズに基づいて培養時間を設定することもできる。例えば、本工程は、細胞塊のサイズの上限については、例えば、８００μｍ、７００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、又は２００μｍとすることができる。また、細胞塊のサイズの下限については、例えば、５０μｍ、１００μｍ、又は１５０μｍとすることができる。この範囲の細胞塊は（なかでも、小サイズの細胞塊ほど）、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。第２の液体培地を用いた浮遊培養において、培地をサンプリングし、培地中にこのサイズの細胞塊が含まれている場合、第２の液体培地を用いた浮遊培養の工程の終期とすることができる。あるいは、観察された細胞塊のうち、上記範囲で定義される細胞塊が体積基準で１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％となった段階で、第２の液体培地を用いた浮遊培養の工程の終期とすることができる。

　一例として、多能性幹細胞を第２の液体培地で浮遊培養を開始してから、例えば１２時間後、２４時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後、９６時間後、１０８時間後、１２０時間後、１３２時間後、又は１４４時間後を第２の液体培地を用いた浮遊培養の工程の終期とすることができる。

２－２－３．回収工程
　「回収工程」は、第１の液体培地を用いた浮遊培養工程、又は第２の液体培地を用いた浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞或いは細胞塊を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。

　本明細書において「（細胞の）回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。

　第１の液体培地を用いた浮遊培養工程、及び第２の液体培地を用いた浮遊培養工程の後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態で５分程度置き、沈降した細胞や細胞塊を残して上清を除去すればよい。また、遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば、１００×ｇ以上、３００×ｇ以上、８００×ｇ以上、又は１０００×ｇ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば、１６００×ｇ以下、１５００×ｇ以下、又は１４００×ｇ以下であればよい。また、処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば１０分以下、８分以下、６分以下、又は３０秒以下であればよい。フィルトレーションで液体成分を除去する場合、例えば、不織布やメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム（カネカ社）のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。

　回収した細胞及び細胞塊は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば、前述の維持培養工程における「工程後処理」に記載の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（例えばＰＢＳバッファ）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。

３．分化誘導方法の更に詳細な説明
３－１．概要
　以下では、本発明に係る多能性幹細胞の分化誘導方法について説明する。本発明に係る分化誘導方法は、上述した多能性幹細胞の製造方法で製造された多能性幹細胞を使用する点に特徴がある。従来、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む液体培地で浮遊培養して得られた多能性幹細胞においては、分化抑制シグナルが細胞内に残留するため、当該分化抑制シグナルを除去するための回復培養が必要であった。これに対して、本発明に係る多能性幹細胞の分化誘導方法によれば、使用する多能性幹細胞における分化効率に優れるため、回復培養が不要となり、得られた多能性幹細胞又は所定期間保存後の多能性幹細胞をそのまま分化誘導のための培養に供することができる。

３－２．方法
　本発明に係る多能性幹細胞の分化誘導方法は、上記多能性幹細胞の製造方法、すなわち、第１の液体培地を用いて浮遊培養する工程と、その後、第２の液体培地を用いて浮遊培養する工程と含む多能性幹細胞の製造方法によって得られた多能性幹細胞を、分化誘導用の培地にて培養する工程（分化誘導工程）を含む。

　本態様の方法は、上記分化誘導工程を必須の工程として、また、上記製造方法で得られた多能性幹細胞を回収する回収工程、分化誘導後の細胞又は細胞塊を回収する回収工程を任意の選択工程として含む。

３－２－１．分化誘導工程
　分化誘導とは、上述のように製造された多能性幹細胞が、他の細胞との接触や分化誘導因子などの刺激により、異なる細胞に分化を引き起こす現象を意味する。

　ここで、分化誘導因子とは、分化誘導を促進する目的で使用される物質を意味し、例えば、増殖因子等の生体内の遺伝子産物、生体内の遺伝子産物の働きを制御する低分子化合物、ホルモン類、ビタミン等生理活性物質類などが挙げられるが、特に限定されない。分化誘導因子の具体例として、限定はしないが、Ａｃｔｉｖｉｎ／ＴＧＦβシグナル活性化剤又は阻害剤、ＢＭＰシグナル活性化剤、ＢＭＰシグナル阻害剤、レチノイン酸シグナル活性化剤、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ヘッジホッグシグナル阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、ＷＮＴ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル活性化剤、ＪＮＫシグナル阻害剤、Ｓｒｃシグナル阻害剤、ＡＭＰＫシグナル阻害剤、ＥＧＦシグナル活性化剤、ＥＧＦシグナル阻害剤、ＨＧＦシグナル活性化剤、ＶＥＧＦシグナル活性化剤が挙げられる。

　本工程では、上述した第２の液体培地を用いた浮遊培養で得られた多能性幹細胞を、分化誘導因子を含む培地にて培養する。分化誘導因子を添加する培地については、特に限定されず、従来、分化誘導に際して使用されている培地を適宜使用することができる。本工程で使用する培地としては、上述した第１の液体培地及び第２の液体培地に関して説明した培地を使用することができる。

　特に、上記製造方法における第２の液体培地として、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の両方を実質的に含まない培地を使用して得られた多能性幹細胞は、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は外胚葉系細胞、若しくは中内胚葉系細胞（内胚葉と中胚葉の共通の初期分化細胞）への分化効率が優れている。よって、この場合、当該多能性幹細胞を使用することで内胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は外胚葉系細胞、若しくは中内胚葉系細胞を効率よく取得することができる。

　また、上記製造方法における第２の液体培地として、ＷＮＴ阻害剤を含み、ＰＫＣβ阻害剤を実質的に含まない培地を使用して得られた多能性幹細胞は、外胚葉系細胞への分化効率が優れている。よって、この場合、当該多能性幹細胞を使用することで外胚葉系細胞を効率よく取得することができる。

　さらに、上記製造方法における第２の液体培地として、ＰＫＣβ阻害剤を含み、ＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない培地を使用して得られた多能性幹細胞は、中内胚葉系細胞、中胚葉系細胞及び内胚葉系細胞への分化効率が優れている。よって、この場合、当該多能性幹細胞を使用することで中内胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞を効率よく取得することができる。

　以下、実施例により、多能性幹細胞の製造方法を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

（参考例１：ヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の接着培養）
　凍結された状態のヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株を解凍後、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ社）を０．５μｇ／ｃｍ^２でコーティングした１５０ｃｍ^２ディッシュ２枚に、３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、細胞を播種した日を培養０日目とし、培養１日目、培養４日目、培養６日目に全量培地交換を行った。培地量は、培養１日目の培地交換時のみ６０ｍＬ／ディッシュとし、それ以外は３０ｍＬ／ディッシュとした。細胞播種時のみＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。培養７日目に継代のため１０μＭのＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を添加したＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で細胞を処理し、培養面から細胞を剥離しながら単一細胞に分散した。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、及び２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（富士フイルム和光純薬社）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）で懸濁し回収した。

（製造例１：ヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　参考例１で回収した細胞を用いて、浮遊培養を行った。培養容器としてシングルユースボトル(佐竹マルチミクス社)を用い、また培養を制御するためのリアクターシステムとしてＶＭＦリアクター（佐竹マルチミクス社）を用いた。リアクターに備え付けのｐＨセンサーＤＯセンサーのキャリブレーションはメーカー指定の方法で行った。培養液量は３００ｍＬ、培養開始時の細胞密度が１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を播種し培養を開始した。播種時の培地は終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、培養中、培養温度は３７℃、供給ガス量は０．１Ｌ／ｍｉｎを保ち、ｐＨが７．１～７．２に保たれるように炭酸ガス供給を自動制御した。なお、供給ガスは空気に任意量の炭酸ガスを混合することで調製し、上面通気させた。攪拌速度は８０ｍｍ／ｓｅｃとした。培養開始した日を培養０日目として、培養１日目、培養２日目に培地を全量交換した。交換後の培地には、培養１日目には終濃度６．９μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目には終濃度３．０μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した。培養３日目に細胞凝集塊を回収し、ＴｒｙｐＬＥ　ＳＥＬＥＣＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で処理して、ピペッティングによって単細胞化した。

（製造例２：ヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例１で回収し、単細胞化した細胞を、播種時の培地として終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した以外は製造例１と同様に浮遊培養し、回収した。

（比較例１：ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を用いたヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例２で回収した細胞を用いて、浮遊培養を行った。培養容器として３０ｍＬリアクター(エイブル社)を用い、３７℃、５％ＣＯ_２条件のインキュベーター内で、１００ｒｐｍの攪拌速度で培養した。培養液量は３０ｍＬ、培養開始時の細胞密度が１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を播種し培養を開始した。播種時の培地は終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した。培養開始した日を培養０日目として、培養１日目、培養２日目に培地を全量交換した。交換後の培地には、培養１日目には終濃度７．７μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目には終濃度３．６μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した。培養３日目に細胞凝集塊を回収し、ＴｒｙｐＬＥ　ＳＥＬＥＣＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で処理して、ピペッティングによって単細胞化した。

（比較例２：ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を濃度漸減で用いたヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例２で回収した細胞を用いて浮遊培養するに際して、培養１日目に培地交換に用いる培地として終濃度７．７μＭのＹ－２７６３２、終濃度１１．８μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度０．５９μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目に培地交換に用いる培地として終濃度３．６μＭのＹ－２７６３２、終濃度２．９μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、終濃度０．１５μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した以外は比較例１と同様に培養した。

（実施例１：ヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例２で回収した細胞を用いて浮遊培養するに際して、培養１日目に培地交換に用いる培地として終濃度７．７μＭのＹ－２７６３２を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目に培地交換に用いる培地として終濃度３．６μＭのＹ－２７６３２を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した以外は比較例１と同様に培養した。

（実施例２：ＰＫＣβ阻害剤を用いたヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例２で回収した細胞を用いて浮遊培養するに際して、培養１日目に培地交換に用いる培地として終濃度７．７μＭのＹ－２７６３２、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目に培地交換に用いる培地として終濃度３．６μＭのＹ－２７６３２、終濃度１μＭのＬＹ－３３３５３１を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した以外は比較例１と同様に培養した。

（実施例３：ＷＮＴ阻害剤を用いたヒトｉＰＳ細胞Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株の浮遊培養）
　製造例２で回収した細胞を用いて浮遊培養するに際して、培養１日目に培地交換に用いる培地として終濃度７．７μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を、培養２日目に培地交換に用いる培地として終濃度３．６μＭのＹ－２７６３２、終濃度２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した以外は比較例１と同様に培養した。

（比較例３：ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を用いて浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞の中内胚葉分化誘導）
　比較例１で回収した細胞を、中内胚葉分化誘導のための浮遊培養へと播種した。培養容器として６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２条件のインキュベーター内で、９０ｒｐｍの旋回速度で培養した。培養液量は４ｍＬ／ｗｅｌｌ、培養開始時の細胞密度が１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を播種し培養を開始した。播種時の培地は終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、終濃度２ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）（Ａ液、Ｂ液のみ）を使用した。培養開始した日を培養０日目として、培養１日目に、終濃度１２ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ、終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、終濃度１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）（Ａ液、Ｂ液のみ）で培地交換した。

（比較例４：ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を漸減で用いて浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞の中内胚葉分化誘導）
　比較例２で回収した細胞を、比較例３と同様に培養し、中内胚葉へと分化誘導した。

（実施例４：浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞の中内胚葉分化誘導）
　実施例１で回収した細胞を、比較例３と同様に培養し、中内胚葉へと分化誘導した。

（実施例５：ＰＫＣβ阻害剤を用いて浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞の中内胚葉分化誘導）
　実施例２で回収した細胞を、比較例３と同様に培養し、中内胚葉へと分化誘導した。

（実施例６：ＷＮＴ阻害剤を用いて浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞の中内胚葉分化誘導）
　実施例３で回収した細胞を、比較例３と同様に培養し、中内胚葉へと分化誘導した。

（評価例１：定量的リアルタイムＰＣＲ解析）
　比較例１、２、実施例１、２、３の培養後に回収した細胞をＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ　Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた溶液からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを単離及び精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、５００ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲｎａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ_２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍に希釈し、３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ　ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレートに添加して混合した。３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　７　Ｆｌｅｘ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。

　定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示した。
ＡＣＴＢ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＯＣＴ４（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
ＯＣＴ４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
ＳＯＸ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
ＳＯＸ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
ＮＡＮＯＧ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
ＮＡＮＯＧ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
ＴＢＸＴ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号９）
ＴＢＸＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１０）
ＳＯＸ１７（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
ＰＡＸ６（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
ＰＡＸ６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）

　定量的リアルタイムＰＣＲ解析により遺伝子発現を測定した結果を図１に示す。各検体ともに、未分化マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２）の発現は十分に高く、且つ、分化マーカー（ＴＢＸＴ（中胚葉マーカー遺伝子）、ＳＯＸ１７（内胚葉マーカー遺伝子）及びＰＡＸ６（外胚葉マーカー遺伝子））の発現も十分に低く抑えられていることが示された。また、分化誘導のための浮遊培養の直前の浮遊培養において、ＰＫＣβ阻害剤とＷＮＴ阻害剤を両方含む培地を使用した条件と比べて、いずれか一方又は両方を含まない培地を使用した条件もすべて同等の結果であった。このことから、分化誘導のための浮遊培養の直前の浮遊培養であればＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤の一方又は両方を含まない培地を用いても、未分化状態を高度に維持して多能性幹細胞の浮遊培養が可能であることが示された。

（評価例２：定量的リアルタイムＰＣＲ解析）
　評価例２では、中胚葉への分化誘導後の細胞に対して未分化マーカー及び分化マーカーを定量的リアルタイムＰＣＲ解析により測定した。すなわち、比較例３、４、実施例４、５、６の培養２日目の細胞を用いて、評価例１と同様に定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。評価例２では、未分化マーカーとしてＮＡＮＯＧ、中胚葉分化マーカーとしてＴＢＸ３及びＭＥＳＰ１を測定した。

　定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示した。
ＡＣＴＢ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＮＡＮＯＧ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
ＮＡＮＯＧ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
ＴＢＸ３（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＴＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ－３’（配列番号１５）
ＴＢＸ３（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡ－３’（配列番号１６）
ＭＥＳＰ１（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＣＴ－３’（配列番号１７）
ＭＥＳＰ１（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡ－３’（配列番号１８）

　定量的リアルタイムＰＣＲ解析により遺伝子発現を測定した結果を図２に示す。ＷＮＴ阻害剤を含む培地で浮遊培養した直後の多能性幹細胞を用いて分化誘導をした比較例３、４及び実施例６に比べて、ＷＮＴ阻害剤を含まない培地で浮遊培養した直後の多能性幹細胞を用いて分化誘導をした実施例４及び５において、分化マーカーであるＴＢＸ３とＭＥＳＰ１の発現が顕著に高く、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧの発現が顕著に低下していることが明らかとなった。この結果より、分化誘導のための浮遊培養の直前の浮遊培養においてＷＮＴ阻害剤を含まない培地を使用することで、中内胚葉への分化誘導がより効率的に進行したことが示された。換言すると、多能性幹細胞の浮遊培養を、中内胚葉への自発的分化による品質低下を抑制するためにＷＮＴ阻害剤を用いて行った場合、直後に分化誘導に供すると細胞内に強力な分化の抑制シグナルが残留しているために、目的とする中内胚葉への分化が阻害されることが示された。

　以上の結果より、多能性幹細胞の浮遊培養を、外胚葉への自発的分化による品質低下を抑制するためにＰＫＣβ阻害剤を用いて行った場合、直後に分化誘導に供すると細胞内に強力な分化の抑制シグナルが残留しているために、目的とする外胚葉への分化が阻害されることが示唆される。しかし、分化誘導のための浮遊培養の直前の浮遊培養においてＰＫＣβ阻害剤を含まない培地を使用することで、外胚葉への分化誘導がより効率的に進行する蓋然性が高いといえる。

Claims

　多能性幹細胞をＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤を含む第１の液体培地にて浮遊培養する工程と、
　その後、ＰＫＣβ阻害剤及び/又はＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない第２の液体培地にて浮遊培養する工程と
　を含む多能性幹細胞の製造方法。
　上記第２の液体培地は、ＰＫＣβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤のいずれか一方を実質的に含まず、他方を含むことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第１の液体培地から上記第２の液体培地に培地交換する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第２の液体培地に含まれるＷＮＴ阻害剤の濃度が９０ｎＭ未満であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第２の液体培地に含まれるＰＫＣβ阻害剤の濃度が２５ｎＭ未満であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第１の液体培地に含まれるＷＮＴ阻害剤の濃度が９０ｎＭ以上４０μＭ以下であり、ＰＫＣβ阻害剤の濃度が２５ｎＭ以上１５μＭ以下であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である細胞集団を製造することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第２の液体培地はＰＫＣβ阻害剤を含み、且つＷＮＴ阻害剤を実質的に含まない培地であって、上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により中内胚葉系細胞への分化に適した多能性幹細胞を製造することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　上記第２の液体培地はＷＮＴ阻害剤を含み、且つＰＫＣβ阻害剤を実質的に含まない培地であって、上記第２の液体培地で浮遊培養する工程により外胚葉系細胞への分化に適した多能性幹細胞を製造することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
　請求項１乃至９いずれか一項記載の製造方法により製造された多能性幹細胞を分化誘導用の培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞に対する分化誘導方法。