KR102323928B1

KR102323928B1 - 인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 줄기 세포의 유지 배양

Info

Publication number: KR102323928B1
Application number: KR1020217006315A
Authority: KR
Inventors: 다카히로 이와오; 다미히데 마츠나가; 사토시 곤도; 쇼타 미즈노
Original assignee: 고리츠다이가쿠호징 나고야시리츠다이가쿠; 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2021-11-08
Also published as: JP6949336B2; EP3584313A4; CA3053893A1; JPWO2018151307A1; CN110382689A; EP3584313A1; KR20210027532A; WO2018151307A1; US11725189B2; US20200002680A1; KR20190105237A

Abstract

장관 줄기 세포의 성질을 유지시킨 채로, 인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 줄기 세포를 유지·배양하는 것을 가능하게 하는 배양 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물의 존재하, 혹은 GSK-3β 저해제 및 혈청 대체물의 존재하에서 배양한다. 바람직하게는, 상피 성장 인자, TGFβ 수용체 저해제 및 선유아세포 증식 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 배양한다.

Description

인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 줄기 세포의 유지 배양{MAINTENANCE CULTURE OF INTESTINAL STEM CELLS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 발명은 인공 다능성 줄기 세포 유래의 장관 줄기 세포를 배양하는 기술 및 그 용도에 관한 것이다. 본 출원은, 2017년 2월 20일에 출원된 일본 특허출원 제2017-029448호에 기초하는 우선권을 주장하는 것이고, 당해 특허 출원의 전체 내용은 참조에 의해 원용된다.

소장에는 많은 약물 대사 효소나 약물 트랜스포터가 존재하는 점에서, 간장과 마찬가지로, 약물의 초회 통과 효과에 관련되는 장기로서 매우 중요하다. 그 때문에, 의약품 개발 조기의 단계로부터 소장에 있어서의 의약품의 막투과성이나 대사를 평가하는 것이, 약물 동태 특성이 우수한 의약품의 개발에 필요하다. 현재, 소장의 모델계로는 인간 결장암 유래의 Caco-2 세포가 다용되고 있다. 그러나, Caco-2 세포에 있어서의 약물 트랜스포터의 발현 패턴은 인간 소장과는 상이하다. 또, Caco-2 세포에는 약물 대사 효소의 발현 및 효소 유도는 거의 확인되지 않는 점에서, 정확하게 소장에서의 약물 동태를 평가하는 것은 어렵다. 따라서, 소장에 있어서의 약물 대사 및 막투과성을 종합적으로 평가하기 위해서는 초대 소장 상피 세포의 이용이 바람직하지만, 초대 소장 상피 세포의 입수는 곤란하다.

그래서, 인간 배성 줄기 세포 (embryonic stem cells : ES 세포) 와 마찬가지의 다분화능과 거의 무한의 증식능을 갖는 인간 인공 다능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells : iPS 세포) 로부터 제작되는 장관 상피 세포의 이용이 기대되고 있다.

또한, 생체의 장관으로부터 장관 줄기 세포를 단리하고, 체외에서 장관 줄기 세포나 장관 상피 세포를 배양하는 기술이나 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포를 분화 유도하는 기술은 몇 가지 보고되어 있지만 (예를 들어 특허문헌 1 ∼ 4, 비특허문헌 1 ∼ 3 을 참조), 인간 iPS 세포 유래의 장관 줄기 세포의 유지 또는 증식을 목적으로 한 배양 기술은 보고되어 있지 않다.

국제 공개 제2014/132933호 팜플렛 일본 공표특허공보 2016-512958호 일본 공표특허공보 2014-516562호 일본 재공표특허공보 2012-060315호

Yin X. et al., Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+) intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods, 2014. 11(1) : p.106-112. Wang X. et al., Cloning and Variation of Ground State In testinal Stem Cells. Nature, 522 (7555) : 173-178. (2015) Sato T. et al., Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 2011 Nov ; 141(5) : 1762-72

iPS 세포로부터 장관 상피 세포까지 분화시키려면 많은 시간과 비용이 드는 것이 과제이다. 또, 인간 iPS 세포 유래 장관 상피 세포를 대량으로 공급하기 위해서는, 분화 도중의 장관 줄기 세포의 단계에 있어서의 배양 기술의 개발이 필요 불가결하다. 그래서, 본 발명은, 장관 줄기 세포의 성질, 즉, 미분화성, 증식능 및 장관 상피 세포로의 분화능을 유지시킨 채로, iPS 세포 유래 장관 줄기 세포를 유지·배양하는 것을 가능하게 하는 배양 기술 및 그 응용·용도를 제공하는 것을 과제로 한다.

현재까지의 보고에 입각하면서, 미분화성의 유지에 필요 또는 유효하다고 생각되는 인자의 여러 가지 조합을 설정하고, 인간 iPS 세포로부터 유도한 장관 줄기 세포형 세포의 배양에 있어서의 효과·영향을 상세히 검토하였다. 그 결과, 특히 유효한 인자의 조합이 발견되었고, 당해 조합을 사용한 배양액을 사용함으로써, 그 성질을 유지시킨 채로 인간 iPS 유래 장관 줄기 세포형 세포를 유지, 증식시키는 것이 가능하게 되었다. 또, 놀랍게도, 당해 배양 방법으로 유지한 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도한 결과, 당해 배양 방법에 의한 배양을 거치지 않은 경우와 비교하여, 장관 상피 마커 및 약물 동태 관련 유전자의 발현이 크게 상승하였다. 즉, 확립에 성공한 배양 방법이, 장관 줄기 세포형 세포를 대량으로 조제하는 것이나 장기간에 걸쳐서 유지하는 것뿐만 아니라, 장관 상피 세포로의 분화 촉진 및 기능 향상에도 유용한 것이 판명되었다. 이하의 발명은, 주로, 이상의 성과에 기초한다.

[1] 인공 다능성 줄기 세포 유래의 장관 줄기 세포형 세포를 GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물의 존재하, 혹은 GSK-3β 저해제 및 혈청 대체물의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는, 인공 다능성 줄기 세포 유래의 장관 줄기 세포형 세포를 배양하는 방법.

[2] GSK-3β 저해제가 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, 인디루빈, 비키닌 또는 1-아자켄파울론이고, 히스톤 탈아세틸화 저해제가 발프로산, 보리노스타트, 트리코스타틴 A, 투바스타틴 A, 기비노스타트 또는 프라시노스타트이고, 혈청 대체물이 녹아웃 혈청 대체물인, [1] 에 기재된 방법.

[3] 상기 배양이, 상피 성장 인자, TGFβ 수용체 저해제 및 선유아세포 증식 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 실시되는, [1] 또는 [2] 에 기재된 방법.

[4] TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01 이고, 선유아세포 증식 인자가 FGF2, FGF4 또는 FGF10 인, [3] 에 기재된 방법.

[5] 상기 배양이, BMP 저해제, Wnt 시그널 활성화제 및 Wnt 아고니스트로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 실시되는, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] BMP 저해제가 노긴 (Noggin) 이고, Wnt 시그널 활성화제가 R-스폰딘 (spondin) 1 이고, Wnt 아고니스트가 Wnt3a 인, [5] 에 기재된 방법.

[7] 상기 배양이, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, p38 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 실시되는, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] p38 저해제가 SB202190 이고, ROCK 저해제가 Y-27632 인, [7] 에 기재된 방법.

[9] 인공 다능성 줄기 세포가 인간 인공 다능성 줄기 세포인, [1] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10] [1] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 배양한 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시키는 공정을 포함하는, 장관 상피 세포형 세포를 조제하는 방법.

[11] [10] 에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포.

[12] [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포를 사용한, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법.

[13] 상기 체내 동태가, 대사, 흡수, 배설, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, [12] 에 기재된 방법.

[14] 이하의 공정 (ⅰ) ∼ (ⅲ) 을 포함하는, [12] 또는 [13] 에 기재된 방법 :

(ⅰ) [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정 ;

(ⅱ) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;

(ⅲ) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하고, 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정.

[15] 이하의 공정 (Ⅰ) 및 (Ⅱ) 를 포함하는, [12] 또는 [13] 에 기재된 방법 :

(Ⅰ) [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;

(Ⅱ) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정.

[16] 이하의 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는, 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 평가하는 방법 :

(a) [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;

(b) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 판정하는 공정으로서, 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현 저하가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 장해 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정.

[17] 이하의 공정 (A) 및 (B) 를 포함하는, 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 평가하는 방법 :

(A) 소화관 점막 장해 작용을 나타내는 물질의 존재하, [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;

(B) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 판정하는 공정으로서, 상기 물질에 의한 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현 저하의 억제가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 보호 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정.

[18] [11] 에 기재된 장관 상피 세포형 세포를 포함하는, 세포 제제.

도 1 은, 인간 iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포의 유지 배양에 있어서의 장관 줄기 세포 관련 유전자의 발현. FGF2 를 배지에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. 컨트롤은 인간 iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시킨 세포 (미계대).
도 2 는, 인간 iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포의 유지 배양에 있어서의 장관 줄기 세포 관련 유전자의 발현. FGF4 를 배지에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. 컨트롤은 인간 iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시킨 세포 (미계대).
도 3 은, 인간 iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포의 유지 배양에 있어서의 장관 줄기 세포 관련 유전자의 발현. FGF10 을 배지에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. 컨트롤은 인간 iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시킨 세포 (미계대).
도 4 는, 장관 줄기 세포로부터 분화시킨 장관 상피 세포에 있어서의 각종 마커 유전자의 mRNA 발현량. 평균치 ± S.D. (n ＝ 3) 로 결과를 나타냈다. 컨트롤은 장관 줄기 세포로서 유지 배양하지 않고 분화시킨 군.
도 5 는, 장관 줄기 세포로부터 분화시킨 장관 상피 세포에 있어서의 무틴 2 의 발현 (mRNA 레벨) 및 그것을 이용한 어세이의 결과. 세로축은, 시판되는 인간 소장 세포 (SI) 의 발현 레벨을 기준 (1) 로 한 상대치. Con : 컨트롤 (인도메타신 및 레바미피드 비첨가의 배지에서 배양한 장관 상피 세포). I50 : 인도메타신을 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 : 인도메타신을 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R50 : 레바미피드를 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R100 : 레바미피드를 농도 100 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R200 : 레바미피드를 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R50 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R100 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 100 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R200 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. SI : 시판되는 인간 소장 세포. Caco-2 : 인간 결장암 유래 세포.
도 6 은, 장관 줄기 세포로부터 분화시킨 장관 상피 세포에 있어서의 크로모그라닌 A (CgA) 의 발현 (mRNA 레벨) 및 그것을 이용한 어세이의 결과. 세로축은, 시판되는 인간 소장 세포 (SI) 의 발현 레벨을 기준 (1) 로 한 상대치. Con : 컨트롤 (인도메타신 및 레바미피드 비첨가의 배지에서 배양한 장관 상피 세포). I50 : 인도메타신을 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 : 인도메타신을 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R50 : 레바미피드를 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R100 : 레바미피드를 농도 100 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. R200 : 레바미피드를 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R50 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 50 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R100 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 100 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. I200 ＋ R200 : 인도메타신을 농도 200 μM, 레바미피드를 농도 200 μM 로 첨가한 배지에서 배양한 장관 상피 세포. SI : 시판되는 인간 소장 세포. Caco-2 : 인간 결장암 유래 세포.
도 7 은, 인간 iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포의 유지 배양에 있어서의 장관 줄기 세포 관련 유전자의 발현. P0 은 미계대. n ＝ 1, P : 계대수, SI : 인간 소장, C : Caco-2 세포.
도 8 은, 장관 줄기 세포로부터 분화시킨 장관 상피 세포에 있어서의 각종 마커 유전자의 mRNA 발현량. 평균치 ± S.D. (n ＝ 3) 로 결과를 나타냈다. P0 은 장관 줄기 세포로서 유지 배양하지 않고 분화시킨 군. P : 계대수, SI : 인간 소장, C : Caco-2 세포.
도 9 는, 장관 줄기 세포로부터 분화시킨 장관 상피 세포에 있어서의 각종 마커 유전자의 mRNA 발현량. P : 계대수, SI : 인간 소장, C : Caco-2 세포. CYP3A4 에 대해서는, Caco-2 에서의 발현은 검출되지 않음 (N.D.).

본 발명은, 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 유래의 장관 줄기 세포형 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 장관 줄기 세포의 성질, 즉, 미분화성, 증식능 및 상피 세포로의 분화능을 유지시킨 채로, iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 유지하고, 증식시키는 것이 가능해진다.

1. 용어

본 발명에 있어서 중요한 용어의 일부를 설명한다. 「iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포」란, iPS 세포를 장관 상피 세포 계보로 분화 유도함으로써 얻어지는, 생체에 있어서의 장관 줄기 세포에 유사한 특징을 나타내는 세포이다. iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 적절한 조건에서 더욱 분화 유도하면, 생체에 있어서의 장관 상피 세포에 유사한 세포 (장관 상피 세포형 세포) 가 얻어진다. 또한, 본 명세서에 있어서 「분화 유도한다」란, 특정의 세포 계보를 따라 분화하도록 작용하는 것을 말한다.

「인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)」란, 초기화 인자의 도입 등에 의해 체세포를 리프로그래밍함으로써 제작되는, 다능성 (다분화능) 과 증식능을 갖는 세포이다. 인공 다능성 줄기 세포는 ES 세포에 가까운 성질을 나타낸다. iPS 세포의 제작에 사용하는 체세포는 특별히 한정되지 않고, 분화한 체세포여도 되고, 미분화의 줄기 세포여도 된다. 또, 그 유래도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유 동물 (예를 들어, 인간이나 침팬지 등의 영장류, 마우스나 래트 등의 설치류) 의 체세포, 특히 바람직하게는 인간의 체세포를 사용한다. iPS 세포는, 현재까지 보고된 각종 방법에 의해 제작할 수 있다. 또, 향후 개발되는 iPS 세포 제작법을 적용하는 것도 당연히 상정된다.

iPS 세포 제작법의 가장 기본적인 수법은, 전사 인자인 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 의 4 인자를, 바이러스를 이용하여 세포에 도입하는 방법이다 (Takahashi K, Yamanaka S : Cell 126 (4), 663-676, 2006 ; Takahashi, K, et al : Cell 131 (5), 861-72, 2007). 인간 iPS 세포에 대해서는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nonog 의 4 인자의 도입에 의한 수립의 보고가 있다 (Yu J, et al : Science 318 (5858), 1917-1920, 2007). c-Myc 를 제외한 3 인자 (Nakagawa M, et al : Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008), Oct3/4 및 Klf4 의 2 인자 (Kim J B, et al : Nature 454 (7204), 646-650, 2008), 혹은 Oct3/4 만 (Kim J B, et al : Cell 136 (3), 411-419, 2009) 의 도입에 의한 iPS 세포의 수립도 보고되어 있다. 또, 유전자의 발현 산물인 단백질을 세포에 도입하는 수법 (Zhou H, Wu S, Joo JY, et al : Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009 ; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al : Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009) 도 보고되어 있다. 한편, 히스톤 메틸기 전이 효소 G9a 에 대한 저해제 BIX-01294 나 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 발프로산 (VPA) 혹은 BayK8644 등을 사용함으로써 제작 효율의 향상이나 도입하는 인자의 저감 등이 가능하다는 보고도 있다 (Huangfu D, et al : Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008 ; Huangfu D, et al : Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008 ; Silva J, et al : PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008). 유전자 도입법에 대해서도 검토가 진행되어, 레트로바이러스 외에, 렌티바이러스 (Yu J, et al : Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), 아데노바이러스 (Stadtfeld M, et al : Science 322 (5903), 945-949, 2008), 플라스미드 (Okita K, et al : Science 322 (5903), 949-953, 2008), 트랜스포존 벡터 (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al : Nature 458, 766-770, 2009 ; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al : Nature 458, 771-775, 2009 ; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al : Nat Methods 6, 363-369, 2009), 혹은 에피소말 벡터 (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al : Science 324, 797-801, 2009) 를 유전자 도입에 이용한 기술이 개발되어 있다.

iPS 세포로의 형질 전환, 즉 초기화 (리프로그래밍) 가 발생한 세포는 Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4, Esg-1 및 Cript 등의 다능성 줄기 세포 마커 (미분화 마커) 의 발현 등을 지표로 하여 선택할 수 있다. 선택된 세포를 iPS 세포로서 회수한다.

iPS 세포는, 예를 들어, 국립 대학 법인 교토 대학 또는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 제공을 받을 수도 있다.

2. 인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 배양

본 발명의 배양 방법의 일 양태 (이하의 설명에 있어서 「제 1 배양 방법」이라고 하는 경우가 있다) 는, iPS 세포를 분화 유도함으로써 얻어지는 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 바꾸어 말하면, 본 발명에서는, iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물의 존재하에서 배양하는 공정을 실시한다.

「GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물의 존재하」란, 이들 화합물이 배지 중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, 이들 화합물이 첨가된 배지를 사용하여 배양을 실시하면 된다. 이들 3 성분을 병용함으로써, 장관 줄기 세포의 성질, 즉, 미분화성, 증식능 및 상피 세포로의 분화능을 유지시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 설명의 편의상, GSK-3β 저해제, 히스톤 탈아세틸화 저해제, 및 혈청 대체물을 통합하여, 「제 1 군의 성분」이라고 한다.

본 발명의 다른 일 양태 (이하의 설명에 있어서 「제 2 배양 방법」이라고 하는 경우가 있다) 에서는, 제 1 군의 성분 중, 히스톤 탈아세틸화 저해제를 생략한다. 바꾸어 말하면, GSK-3β 저해제 및 혈청 대체물의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하고, 간소화된 배양 방법이 된다.

GSK-3β 저해제로서 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, 인디루빈, 비키닌, 1-아자켄파울론을 예시할 수 있다. 마찬가지로 히스톤 탈아세틸화 저해제로서 발프로산, 보리노스타트, 트리코스타틴 A, 투바스타틴 A, 기비노스타트, 프라시노스타트를 예시할 수 있다. 한편, 혈청 대체물이란, iPS 세포나 ES 세포 등을 그 미분화인 상태를 유지시킨 채로 배양하기 위해, 분화 유도 인자를 포함하는 혈청의 대신으로서 사용되는 조성물이다. 바람직하게는, 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout serum replacement (KSR)) 을 사용한다.

GSK-3β 저해제의 첨가 농도의 예 (CHIR 99021 의 경우) 를 나타내면 1 μM ∼ 100 μM, 바람직하게는 3 μM ∼ 30 μM 이다. 제 2 배양 방법의 경우에는 2 μM ∼ 20 μM 도 바람직한 첨가 농도 범위이다. 마찬가지로, 히스톤 탈아세틸화 저해제의 첨가 농도의 예 (발프로산의 경우) 를 나타내면 0.1 mM ∼ 10 mM, 바람직하게는 0.5 mM ∼ 3 mM 이고, 혈청 대체물의 첨가 농도의 예 (KSR 의 경우) 를 나타내면 5 ％ (v/v) ∼ 20 ％ (v/v), 바람직하게는 5 ％ (v/v) ∼ 10 ％ (v/v) 이다.

활성이나 증식률의 저하를 방지하는 등의 이유로부터, 필요에 따라 배지 교환을 한다. 예를 들어, 24 시간 ∼ 3 일에 1 회의 빈도로 배지 교환하면 된다. 또, 컨플루언트 또는 서브컨플루언트가 된 단계에서 계대하면 된다.

바람직한 일 양태에서는, 상기의 제 1 군의 성분에 더하여, 상피 성장 인자 (EGF), TGFβ 수용체 저해제 및 선유아세포 증식 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 배양을 실시한다. 또한, 설명의 편의상, 상피 성장 인자 (EGF), TGFβ 수용체 저해제 및 선유아세포 증식 인자를 통합하여, 「제 2 군의 성분」이라고 한다.

상피 성장 인자를 사용함으로써, 세포 증식을 촉진시키는 효과를 기대할 수 있다. 마찬가지로, TGFβ 수용체 저해제에는 간엽계 세포로의 전환과 분화 유도 인자를 억제하는 효과, 선유아세포 증식 인자에는 세포 증식을 촉진시키는 효과와, 분화를 억제하는 효과를 기대할 수 있다. 바람직하게는, 이들 제 2 군의 성분을 모두 병용한다 (제 1 군의 성분과 합하여, 합계 6 성분이 병용되게 된다).

TGFβ 수용체 저해제로서 예를 들어 A-83-01 을 사용할 수 있다. 또, 선유아세포 증식 인자로는 FGF2, FGF4 또는 FGF10 을 채용하면 된다. 이들 FGF 패밀리의 2 개 또는 3 개를 조합하여 사용해도 된다.

상피 성장 인자의 첨가 농도의 예를 나타내면 10 ng/㎖ ∼ 500 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ ∼ 200 ng/㎖ 이다. 마찬가지로, TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도의 예 (A-83-01 의 경우) 를 나타내면 0.3 μM ∼ 5 μM, 바람직하게는 0.5 μM ∼ 3 μM 이고, 선유아세포 증식 인자의 첨가 농도의 예 (FGF2 의 경우) 를 나타내면 5 ng/㎖ ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖ ∼ 50 ng/㎖ 이다. 제 2 배양 방법의 경우의 TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도에 대해서는, 0.3 μM ∼ 3 μM (A-83-01 의 경우) 도 바람직한 첨가 농도 범위이다.

더욱 바람직한 일 양태에서는, BMP 저해제, Wnt 시그널 활성화제 및 Wnt 아고니스트로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 배양을 실시한다. 또한, 설명의 편의상, BMP 저해제, Wnt 시그널 활성화제 및 Wnt 아고니스트를 통합하여, 「제 3 군의 성분」이라고 한다.

BMP 저해제를 사용함으로써, 줄기 세포의 분화를 억제하고, 줄기 세포성을 유지하는 효과를 기대할 수 있다. 마찬가지로, Wnt 시그널 활성화제에는 줄기 세포의 증식과 줄기 세포성을 유지하는 효과, Wnt 아고니스트에는 Wnt 시그널을 활성화함으로써 줄기 세포의 증식과 줄기 세포성을 유지하는 효과를 기대할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제 2 군의 성분 모두와, 이들 제 3 군의 성분 모두를 병용한다 (제 1 배양 방법의 경우, 제 1 군의 성분과 합하여, 합계 9 성분이 병용되게 된다).

BMP 저해제로서 예를 들어 노긴을 사용할 수 있다. 또, Wnt 시그널 활성화제로서 예를 들어 R-스폰딘 1 을 사용할 수 있다. Wnt 아고니스트로서 예를 들어 Wnt3a 를 사용할 수 있다.

BMP 저해제의 첨가 농도의 예 (노긴의 경우) 를 나타내면 10 ng/㎖ ∼ 500 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ ∼ 200 ng/㎖ 이다. 마찬가지로, Wnt 시그널 활성화제의 첨가 농도의 예 (R-스폰딘 1 의 경우) 를 나타내면 10 ng/㎖ ∼ 1000 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ ∼ 500 ng/㎖ 이고, Wnt 아고니스트의 첨가 농도의 예 (Wnt3a 의 경우) 를 나타내면 10 ng/㎖ ∼ 500 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ ∼ 200 ng/㎖ 이다.

한층 더 바람직한 일 양태에서는, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, p38 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 배양을 실시한다. 또한, 설명의 편의상, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, p38 저해제 및 ROCK 저해제를 통합하여, 「제 4 군의 성분」이라고 한다.

니코틴아미드를 사용함으로써, 줄기 세포성을 유지하는 효과를 기대할 수 있다. 마찬가지로, N-아세틸시스테인에는 세포사를 억제하는 효과, p38 저해제에는 세포 스트레스나 염증을 억제하는 효과, 및 분화를 억제하는 효과, ROCK 저해제에는 세포사를 억제하는 효과를 기대할 수 있다. 제 1 배양 방법에 있어서는, 바람직하게는, 상기 제 2 군의 성분 모두와, 상기 제 3 군의 성분 모두와, 이들 제 4 군의 성분 모두를 병용한다 (제 1 군의 성분과 합하여, 합계 13 성분이 병용되게 된다). 제 2 배양 방법에 있어서는, 바람직하게는, 제 3 군의 성분은 생략하고, 제 2 군의 성분 모두와, 제 4 군의 성분 중, ROCK 저해제만을 병용한다 (제 1 군의 성분 (GSK-3β 저해제와 혈청 대체물) 과 합하여, 합계 6 성분이 병용되게 된다).

p38 저해제로서 예를 들어 SB202190 을 사용할 수 있다. 또, ROCK 저해제로서 예를 들어 Y-27632 를 사용할 수 있다.

니코틴아미드의 첨가 농도의 예를 나타내면 0.1 mg/㎖ ∼ 5 mg/㎖, 바람직하게는 0.5 mg/㎖ ∼ 2 mg/㎖ 이다. 마찬가지로, N-아세틸시스테인의 첨가 농도의 예를 나타내면 0.1 mM ∼ 5 mM, 바람직하게는 0.5 mM ∼ 2 mM 이고, p38 저해제의 첨가 농도의 예 (SB202190 의 경우) 를 나타내면 1 μM ∼ 50 mM, 바람직하게는 5 μM ∼ 20 mM 이고, ROCK 저해제의 첨가 농도의 예 (Y-27632 의 경우) 를 나타내면 1 μM ∼ 50 μM, 바람직하게는 3 μM ∼ 30 μM 이다. 제 2 배양 방법의 경우의 ROCK 저해제의 첨가 농도에 대해서는, 1 μM ∼ 10 μM (Y-27632 의 경우) 도 바람직한 첨가 농도 범위이다. 또한, ROCK 저해제에 대해서는, 배지 교환에 사용하는 배양액에는 포함시키지 않는 것이 바람직하다. 단, 제 2 배양 방법의 경우에는, 배지 중에 ROCK 저해제가 항시 첨가된 조건을 채용해도 된다.

그 밖의 배양 조건 (배양 온도 등) 은, 동물 세포의 배양에 있어서 일반적으로 채용되고 있는 조건으로 하면 된다. 즉, 예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 환경하에서 배양하면 된다. 또, 기본 배지는, 장관 줄기 세포형 세포의 유지, 증식이 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상피 세포의 배양에 적절한 기본 배지 (예를 들어 D-MEM 과 햄 F12 배지의 혼합 배지, D-MEM) 를 사용한다. 배지에 첨가 가능한 성분의 예로서 소 혈청 알부민 (BSA), 항생 물질, 2-메르캅토에탄올, PVA, 비필수 아미노산 (NEAA), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 들 수 있다. 전형적으로는 배양 접시 등을 사용하여 이차원적으로 세포를 배양한다. 본 발명의 방법에 의하면, 이차원 배양에 의해 iPS 세포로부터 장관 상피 세포형 세포를 얻는 것이 가능해진다. 단, 겔상의 배양 기재 혹은 삼차원 배양 플레이트 등을 사용한 삼차원 배양을 실시하는 것으로 해도 된다.

또한, 배양 중 또는 배양 후의 세포가 원하는 성질을 유지하고 있는지 여부는, 예를 들어, 장관 줄기 세포 마커인 류신 리치 리피트를 포함하는 G 단백질 공액 수용체 5 (LGR5), 장관 전구 세포 마커인 SOX9, 후장 마커인 CDX2 의 발현을 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다.

3. iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 조제

본 발명의 배양 공정에 사용하는 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 조제 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 과거의 보고에 준하여 iPS 세포를 분화 유도함으로써 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 조제하면 된다. iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 조제 방법의 구체예를 이하에서 설명한다. 이 예의 조제 방법은, iPS 세포를 내배엽형 세포로 분화시키는 공정 (공정 (1)) 과, 얻어진 내배엽형 세포를 장관 줄기 세포형 세포로 분화시키는 공정 (공정 (2)) 을 포함한다. 또한, 특별히 언급하지 않는 배양 조건은, 동물 세포의 배양에 있어서 일반적으로 채용되고 있는 조건으로 하면 된다. 예를 들어, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 환경하에서 배양한다. 또, 기본 배지로서, 이스코프 개변 둘베코 배지 (IMDM) (GIBCO 사 등), 햄 F12 배지 (HamF12) (SIGMA 사, Gibco 사 등), 둘베코 변법 이글 배지 (D-MEM) (나카라이테스크 주식회사, 시그마사, Gibco 사 등), 글래스고우 기본 배지 (Gibco 사 등), RPMI1640 배지 등을 사용할 수 있다. 2 종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 해도 된다. 공정 (2) 에는, 바람직하게는 상피 세포의 배양에 적절한 기본 배지 (예를 들어 D-MEM 과 햄 F12 배지의 혼합 배지, D-MEM) 를 사용한다. 또, 배지에 첨가 가능한 성분의 예로서 소 혈청 알부민 (BSA), 항생 물질, 2-메르캅토에탄올, PVA, 비필수 아미노산 (NEAA), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 들 수 있다.

＜공정 (1) 내배엽형 세포로의 분화＞

이 공정에서는 iPS 세포를 배양하여, 내배엽형 세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면, 내배엽형 세포로의 분화를 유도하는 조건하에서 iPS 세포를 배양한다. iPS 세포가 내배엽형 세포로 분화하는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 통상적인 방법에 따라, 액티빈 A 를 첨가한 배지에서 배양한다. 이 경우, 배지 중의 액티빈 A 의 농도를 예를 들어 10 ng/㎖ ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖ ∼ 150 ng/㎖ 로 한다. 세포의 증식률이나 유지 등의 관점에서, 배지에 혈청 또는 혈청 대체물 (Knockout serum replacement (KSR) 등) 을 첨가하는 것이 바람직하다. 혈청은 소 태자 혈청에 한정되는 것은 아니고, 인간 혈청이나 양 혈청 등을 사용할 수도 있다. 혈청 또는 혈청 대체물의 첨가량은 예를 들어 0.1 ％ (v/v) ∼ 10 ％ (v/v) 이다.

Wnt/β-카테닌 시그널 경로의 저해제 (예를 들어, 헥사클로로펜, 퀘르세틴, Wnt 리간드인 Wnt3a) 를 배지에 첨가하여, 내배엽형 세포로의 분화의 촉진을 도모해도 된다.

바람직한 일 양태에서는, 공정 (1) 로서 2 단계의 배양을 실시한다. 1 단계째의 배양에서는 비교적 저농도의 혈청 (예를 들어, 0.1 ％ (v/v) ∼ 1 ％ (v/v)) 을 첨가한 배지에서 실시하고, 계속되는 2 단계째의 배양에서는 1 단계째의 배양보다 혈청 농도를 높인 배지 (혈청 농도를 예를 들어 1 ％ (v/v) ∼ 10 ％ (v/v) 로 높임) 에서 실시한다. 이와 같이 2 단계의 배양을 채용하는 것은, 1 단계째의 배양에 의해 미분화 세포의 증식을 억제하고, 계속되는 2 단계째에 의해 분화한 세포를 증식시키는 점에서 바람직하다.

공정 (1) 의 기간 (배양 기간) 은 예를 들어 1 일간 ∼ 10 일간, 바람직하게는 2 일간 ∼ 7 일간이다. 공정 (1) 로서 2 단계의 배양을 채용하는 경우에는 1 단계째의 배양 기간을 예를 들어 1 일간 ∼ 7 일간, 바람직하게는 2 일간 ∼ 5 일간으로 하고, 2 단계째의 배양 기간을 예를 들어 1 일간 ∼ 6 일간, 바람직하게는 1 일간 ∼ 4 일간으로 한다.

＜공정 (2) 장관 줄기 세포형 세포로의 분화＞

이 공정에서는, 공정 (1) 에서 얻어진 내배엽형 세포를 배양하여, 장관 줄기 세포형 세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면, 장관 줄기 세포형 세포로의 분화를 유도하는 조건하에서 내배엽 세포를 배양한다. 내배엽형 세포가 장관 줄기 세포형 세포로 분화하는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, FGF2 (선유아세포 증식 인자 2) 의 존재하에서 배양을 실시한다. 바람직하게는 인간 FGF2 (예를 들어 인간 재조합 FGF2) 를 사용한다.

전형적으로는, 공정 (1) 을 거쳐 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 공정 (2) 에 제공한다. 한편으로, 공정 (1) 을 거쳐 얻어진 세포 집단 중에서 내배엽형 세포를 선별한 후에 공정 (2) 를 실시하는 것으로 해도 된다. 내배엽형 세포의 선별은 예를 들어, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로우 사이토미터 (셀 소터) 로 실시하면 된다.

「FGF2 의 존재하」란, FGF2 가 배지 중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, FGF2 의 존재하에서의 배양을 실시하기 위해서는, FGF2 가 첨가된 배지를 사용하면 된다. FGF2 의 첨가 농도의 예를 나타내면 100 ng/㎖ ∼ 500 ng/㎖ 이다.

공정 (2) 의 기간 (배양 기간) 은 예를 들어 2 일간 ∼ 10 일간, 바람직하게는 3 일간 ∼ 7 일간이다. 당해 배양 기간이 지나치게 짧으면, 기대되는 효과 (분화 효율의 상승, 장관 줄기 세포로서의 기능 획득의 촉진) 가 충분히 얻어지지 않는다. 한편, 당해 배양 기간이 지나치게 길면, 분화 효율의 저하를 일으킨다.

장관 줄기 세포형 세포로 분화한 것은, 예를 들어, 장관 줄기 세포 마커의 발현을 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다. 장관 줄기 세포 마커의 예를 들면, 류신 리치 리피트를 포함하는 G 단백질 공액 수용체 5 (LGR5), 에프린 B2 수용체 (EphB2) 이다.

4. 장관 상피 세포형 세포의 조제

본 발명의 제 2 국면은, 본 발명의 배양 방법으로 배양한 장관 줄기 세포형 세포로부터 장관 상피 세포형 세포를 조제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조제 방법은, 본 발명의 배양 방법으로 배양한 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시키는 것을 특징으로 한다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 조제 방법에서는, 본 발명의 배양 방법으로 배양한 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시키는 공정 (분화 공정) 을 실시한다. 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시키는 것이 가능한 한, 당해 공정의 조작, 조건 등은 특별히 한정되지 않는다. 이하, 바람직한 분화 공정의 구체예 (예 1, 예 2) 를 나타낸다. 이하의 예 1 및 예 2 에 있어서, 특별히 언급하지 않는 배양 조건은, 동물 세포의 배양에 있어서 일반적으로 채용되고 있는 조건으로 하면 된다. 예를 들어, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 환경하에서 배양하는 것으로 하고, 기본 배지는 바람직하게는 상피 세포의 배양에 적절한 기본 배지 (예를 들어 D-MEM 과 햄 F12 배지의 혼합 배지, D-MEM) 를 사용한다. 또, 배지에 첨가 가능한 성분의 예로서 소 혈청 알부민 (BSA), 항생 물질, 2-메르캅토에탄올, PVA, 비필수 아미노산 (NEAA), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 들 수 있다.

또한, 장관 상피 세포형 세포로 분화한 것은, 예를 들어, 장관 상피 세포 마커나 약물 동태 관련 유전자의 발현, 펩티드의 흡수, 혹은 비타민 D 수용체를 개재한 약물 대사 효소의 발현 유도를 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다. 장관 상피 세포 마커 및 약물 동태 관련 유전자의 예를 들면, 빌린 1 (Villin 1), 수크라아제-이소말타아제, SLC (solute carrier) 유기 아니온 트랜스포터 2B1 (SLCO2B1/OATP2B1), SLC (solute carrier) 패밀리 멤버 15A1/펩티드 트랜스포터 1 (SLC15A1/PEPT1), SLC (solute carrier) 패밀리 멤버 46A1/프로톤 공액 엽산 트랜스포터 (SLC46A1/PCFT), ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/다제 내성 단백 1 (ABCB1/MDR1), ATP 결합 카세트 트랜스포터 G2/유방암 내성 단백 (ABCG2/BCRP), 미측형 (尾側型) 호메오박스 전사 인자 2 (CDX2), 디펩티딜펩티다아제 4 (DPP4), 프레그난 X 수용체 (PXR), 우리딘2인산-글루쿠론산 전이 효소 1A1 (UGT1A1), 우리딘2인산-글루쿠론산 전이 효소 1A4 (UGT1A4) 이다. 이 중에서도, 장관 상피에 특이성이 높은 수크라아제-이소말타아제 및 빌린 1, 소장에서의 펩티드의 흡수에 관여하는 SLC15A1/PEPT1, 소장에서의 유기 아니온의 흡수에 관여하는 SLCO2B1/OATP2B1 은 특히 유효한 마커이다.

4-1. 분화 공정의 예 1

이 예에서는, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제 및 TGFβ 수용체 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물 (이하, 「제 1 유도 인자」라고도 한다) 과 EGF (이하, 「제 2 유도 인자」라고도 한다) 의 존재하에서 배양을 실시하여, 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시킨다. 전형적으로는, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 분화 공정에 제공한다. 한편으로, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 세포 집단 중에서 장관 줄기 세포형 세포를 선별한 후에 분화 공정을 실시하는 것으로 해도 된다. 장관 줄기 세포형 세포의 선별은 예를 들어, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로우 사이토미터 (셀 소터) 로 실시하면 된다.

MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제 및 TGFβ 수용체 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물 (제 1 유도 인자) 과 EGF (제 2 유도 인자) 의 존재하란, 제 1 유도 인자와 제 2 유도 인자가 배지 중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, 제 1 유도 인자와 제 2 유도 인자의 존재하에서의 배양을 실시하기 위해서는, 제 1 유도 인자와 제 2 유도 인자가 첨가된 배지를 사용하면 된다.

MEK1 저해제로서, PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEK 저해제 I, MEK 저해제 II, MEK1/2 저해제 II, SL327 을 들 수 있다. 마찬가지로, DNA 메틸화 저해제로서 5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-아자시티딘, RG108, 제부라린을 들 수 있다. TGFβ 수용체 저해제에 대해서는, A-83-01 이 TGF-β 수용체 ALK4, ALK5, ALK7 에 저해 활성을 나타낸 실험 결과를 고려하면, 바람직하게는, TGF-β 수용체 ALK4, ALK5, ALK7 의 1 이상에 대하여 저해 활성을 나타내는 것을 사용하면 된다. 예를 들어, A-83-01, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5 저해제, LY2157299, LY364947, GW788388, RepSox 가 당해 조건을 만족한다.

MEK1 저해제의 첨가 농도의 예 (PD98059 의 경우) 를 나타내면 4 μM ∼ 100 μM, 바람직하게는 10 ∼ 40 μM 이다. 마찬가지로 메틸화 저해제의 첨가 농도의 예 (5-아자-2'-데옥시시티딘의 경우) 를 나타내면 1 μM ∼ 25 μM, 바람직하게는 2.5 μM ∼ 10 μM 이고, TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도의 예 (A-83-01 의 경우) 를 나타내면 0.1 μM ∼ 2.5 μM, 바람직하게는 0.2 μM ∼ 1 μM 이다.

바람직한 일 양태에서는, 제 1 유도 인자로서, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 중의 2 이상을 병용한다. 상이한 2 이상의 제 1 유도 인자를 병용함으로써, 상가적 또는 상승적 효과가 얻어져, 장관 상피로의 분화를 촉진할 수 있다. 가장 바람직하게는, 모두 (즉 3 종류) 의 제 1 유도 인자를 병용한다.

당해 공정의 기간 (배양 기간) 은 예를 들어 7 일간 ∼ 30 일간, 바람직하게는 10 일간 ∼ 20 일간이다. 당해 배양 기간이 지나치게 짧으면, 기대되는 효과 (분화 효율의 상승, 장관 상피 세포로서의 기능 획득의 촉진) 가 충분히 얻어지지 않는다. 한편, 당해 배양 기간이 지나치게 길면, 분화 효율의 저하를 일으킨다.

바람직한 일 양태에서는 당해 공정으로서 2 단계의 배양, 즉, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 장관 줄기 세포형 세포를 GSK 저해제 (예를 들어 GSK3iXV) 및/또는 BMP 저해제 (예를 들어 도소모르핀) 와 EGF 의 존재하에서 배양하는 공정 (분화 공정 1) 과 그것에 계속해서, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제 및 TGFβ 수용체 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물 (제 1 유도 인자) 과 EGF (제 2 유도 인자) 의 존재하에서 배양하는 공정 (분화 공정 2) 을 실시한다. 따라서, 이 양태에서는, 제 1 유도 인자와 제 2 유도 인자를 사용한 배양 전에, GSK 저해제 및/또는 BMP 저해제의 존재하에서의 배양을 실시하게 된다. GSK 저해제 및/또는 BMP 저해제의 존재하에서의 배양의 주된 목적은, 장관 줄기 세포의 증식을 촉진하는 것이다.

분화 공정 1 과 분화 공정 2 를 실시하는 경우, 분화 공정 1 의 배양 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 14 일간, 바람직하게는 4 일간 ∼ 10 일간이고, 분화 공정 2 의 배양 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 21 일간, 바람직하게는 5 일간 ∼ 15 일간이다.

각 공정에 있어서, 도중에 계대 배양을 실시해도 된다. 예를 들어 컨플루언트 또는 서브컨플루언트가 되었을 때에 세포의 일부를 채취하고 다른 배양 용기로 옮겨, 배양을 계속한다. 분화를 촉진하기 위해 세포 밀도를 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들어 1 × 10⁴ 개/㎠ ∼ 1 × 10⁶ 개/㎠ 정도의 세포 밀도로 세포를 파종하면 된다.

배지 교환이나 계대 배양 등에 수반하는, 세포의 회수시에는, 세포사를 억제하기 위해 Y-27632 등의 ROCK 저해제 (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho 결합 키나아제) 로 미리 세포를 처리해 두면 된다.

목적의 세포 (장관 상피 세포형 세포) 만으로 이루어지는 세포 집단 또는 목적의 세포가 고비율 (고순도) 로 포함된 세포 집단을 얻고자 하면, 목적의 세포에 특징적인 세포 표면 마커를 지표로 하여 배양 후의 세포 집단을 선별·분취하면 된다.

4-2. 분화 공정의 예 2

이 예에서는, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하 (이하, 이 조건을 「제 1 조건」이라고 한다), 또한 cAMP 가 세포에 공급되는 조건하 (이하, 이 조건을 「제 2 조건」이라고 한다) 에서 배양하여, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시킨다. 전형적으로는, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 분화 공정에 제공한다. 한편으로, 본 발명의 배양 방법을 적용함으로써 얻어진 세포 집단 중에서 장관 줄기 세포형 세포를 선별한 후에 분화 공정을 실시하는 것으로 해도 된다. 장관 줄기 세포형 세포의 선별은 예를 들어, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로우 사이토미터 (셀 소터) 로 실시하면 된다.

제 1 조건, 즉 MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하란, 이들 화합물이 배지 중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, 제 1 조건을 만족하기 위해서는, 이들 화합물이 첨가된 배지를 사용하면 된다.

MEK1 저해제의 첨가 농도의 예 (PD98059 의 경우) 를 나타내면 4 μM ∼ 100 μM, 바람직하게는 10 ∼ 40 μM 이다. 마찬가지로 메틸화 저해제의 첨가 농도의 예 (5-아자-2'-데옥시시티딘의 경우) 를 나타내면 1 μM ∼ 25 μM, 바람직하게는 2.5 μM ∼ 10 μM 이고, TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도의 예 (A-83-01 의 경우) 를 나타내면 0.1 μM ∼ 2.5 μM, 바람직하게는 0.2 μM ∼ 1 μM 이다. 또한, 예시한 화합물, 즉, PD98059, 5-아자-2'-데옥시시티딘 및 A-83-01 과는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물 (PD98059, 5-아자-2'-데옥시시티딘, A-83-01) 의 특성의 상위 (특히 활성의 상위) 를 고려하면, 당업자이면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

제 2 조건, 즉, cAMP 가 세포에 공급되는 조건이란, 세포 내에 흡수 가능한 화합물로서, 세포 내에 흡수되면 cAMP 로서 작용하는 화합물이 존재하는 조건과 동일한 의미이다. 따라서, 제 2 조건을 만족하기 위해서는, 예를 들어, 세포 내에 흡수 가능한 cAMP 유도체가 첨가된 배지를 사용하면 된다. cAMP 유도체로서 PKA 활성제 (예를 들어, 8-Br-cAMP(8-브로모아데노신-3',5'-환형 모노포스페이트 소듐 염, CAS 번호 : 76939-46-3), 6-Bnz-cAMP(N6-벤조일아데노신-3',5'-환형 모노포스페이트 소듐 염, CAS 번호 : 1135306-29-4), cAMPS-Rp((R)-아데노신, 환형 3',5'-(히드로겐포스포로티오에이트) 트리에틸암모늄 염, CAS 번호 : 151837-09-1), cAMPS-Sp((S)-아데노신, 환형 3',5'-(히드로겐포스포로티오에이트) 트리에틸암모늄 염, CAS 번호 : 93602-66-5), 디부티릴-cAMP(N6,O2'-디부티릴 아데노신 3',5'-환형 모노포스페이트 소듐 염, CAS 번호 : 16980-89-5), 8-Cl-cAMP(8-클로로아데노신-3',5'-환형 모노포스페이트 염, CAS 번호 : 124705-03-9)), Epac 활성제 (Rp-8-Br-cAMPS(8-브로모아데노신 3',5'-환형 모노포스포티오에이트, Rp-이소머. 소듐 염, CAS 번호 : 129735-00-8), 8-CPT-cAMP(8-(4-클로로페닐티오)아데노신 3',5'-환형 모노포스페이트, CAS 번호 : 93882-12-3), 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-클로로페닐티오)-2'-O-메틸아데노신 3',5'-환형 모노포스페이트 모노소듐, CAS 번호 : 634207-53-7) 등) 를 채용할 수 있다. cAMP 유도체의 첨가 농도의 예 (8-Br-cAMP 의 경우) 를 나타내면 0.1 mM ∼ 10 mM, 바람직하게는 0.2 mM ∼ 5 mM, 더욱 바람직하게는 0.5 mM ∼ 2 mM 이다. 또한, 예시한 화합물, 즉, 8-Br-cAMP 와는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물 (8-Br-cAMP) 의 특성의 상위 (특히 활성의 상위) 를 고려하면, 당업자이면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

당해 공정의 기간 (배양 기간) 은 예를 들어 7 일간 ∼ 40 일간, 바람직하게는 10 일간 ∼ 30 일간이다. 당해 배양 기간이 지나치게 짧으면, 기대되는 효과 (분화 효율의 상승, 장관 상피 세포로서의 기능 획득의 촉진) 가 충분히 얻어지지 않는다. 한편, 당해 배양 기간이 지나치게 길면, 분화 효율의 저하를 일으킨다.

바람직하게는, 분화 공정으로서 이하의 A ∼ C 중 어느 배양 공정을 실시한다.

＜배양 공정 A＞

배양 공정 A 에서는, (a-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하에서의 배양과, 당해 배양에 계속되는, (a-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하, 또한 cAMP 가 세포에 공급되는 조건하에서의 배양을 실시한다. 즉, cAMP 가 세포에 공급되는 조건의 유무로 상이한 2 단계의 배양을 실시한다. 이와 같이 하면, 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과가 얻어진다. (a-1) 의 배양의 기간은 예를 들어 1 일간 ∼ 5 일간이다. 마찬가지로, (a-2) 의 배양의 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 15 일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항 (각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등) 에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(a-2) 의 배양을, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 에 더하여 cAMP 분해 효소 저해제도 존재하는 조건에서 실시하는 것으로 해도 된다. 당해 조건을 채용하면, cAMP 의 분해 저해에 의해 세포 내 cAMP 농도의 저하가 억제되고, 장관 상피로의 분화 유도, 특히 장관 상피 세포로서의 기능의 획득이 촉진되는 것을 기대할 수 있다. 즉, 당해 조건은, 보다 기능적인 장관 상피 세포형 세포의 조제에 유리한 것이다. cAMP 분해 효소 저해제로서, IBMX (3-이소부틸-1-메틸잔틴) (MIX), 테오필린 (Theophylline), 파파베린 (Papaverine), 펜톡시필린 (Pentoxifylline) (Trental), KS-505, 8-메톡시메틸-IBMX, 빈포세틴 (Vinpocetine) (TCV-3B), EHNA, 트레퀸신 (Trequinsin) (HL-725), 릭사지논 (Lixazinone) (RS-82856), (LY-186126), 실로스타미드 (Cilostamide) (OPC3689), 베모라단 (Bemoradan) (RWJ-22867), 아네르그렐리드 (Anergrelide) (BL4162A), 인돌리단 (Indolidan) (LY195115), 실로스타졸 (Cilostazol) (OPC-13013), 밀리논 (Milrinone) (WIN47203), 시구아조단 (Siguazodan) (SKF-94836), 5-메틸-이마조단 (CI 930), SKF-95654, 피릴로벤단 (Pirilobendan) (UD-CG 115 BS), 에녹시몬 (Enoximone) (MDL 17043), 이마조단 (Imazodan) (CL 914), SKF-94120, 베스나리논 (Vesnarinone) (OPC 8212), 롤리프람 (Rolipram) (Ro-20-1724), (ZK-62711), 덴부필린 (Denbufylline), 자프리나스트 (Zaprinast) (M&B-22, 948), 디피리다몰 (Dipyridamole), 자르다베린 (Zardaverine), AH-21-132, 술마졸 (Sulmazol) (AR-L 115 BS) 를 예시할 수 있다. cAMP 분해 효소 저해제의 첨가 농도의 예 (IBMX 의 경우) 를 나타내면, 0.05 mM ∼ 5 mM, 바람직하게는 0.1 mM ∼ 3 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 mM ∼ 1 mM 이다. 또한, 예시한 화합물, 즉, IBMX 와는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물 (IBMX) 의 특성의 상위 (특히 활성의 상위) 를 고려하면, 당업자이면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

(a-2) 의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하에서의 배양 ((a-3) 의 배양) 을 실시하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들어 1 일간 ∼ 10 일간으로 한다. 이 배양을 실시하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과가 얻어진다.

＜배양 공정 B＞

배양 공정 B 에서는, (b-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하, 또한 cAMP 가 세포에 공급되는 조건하에서의 배양과, 당해 배양에 계속되는, (b-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 분해 효소 저해제의 존재하에서의 배양을 실시한다. 이와 같이, cAMP 가 세포에 공급되는 조건에서 배양한 후, cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건에서 배양하면, 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과가 얻어진다. (b-1) 의 배양의 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 15 일간이다. 마찬가지로, (b-2) 의 배양의 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 15 일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항 (각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등) 에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(b-1) 의 배양을, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 에 더하여 cAMP 분해 효소 저해제도 존재하는 조건에서 실시하는 것으로 해도 된다. 당해 조건을 채용하면, 이른 단계부터 세포 내 cAMP 농도의 저하가 억제되고, 장관 상피로의 분화 유도, 특히 장관 상피 세포로서의 기능의 획득이 촉진되는 것을 기대할 수 있다. 즉, 당해 조건은, 보다 기능적인 장관 상피 세포형 세포의 효율적인 조제에 유리한 것이다.

(b-2) 의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하에서의 배양 ((b-3) 의 배양) 을 실시하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들어 1 일간 ∼ 10 일간으로 한다. 이 배양을 실시하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과가 얻어진다.

＜배양 공정 C＞

배양 공정 C 에서는, (c-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하, 또한 cAMP 가 세포에 공급되는 조건하에서의 배양을 실시한다. (c-1) 의 배양의 기간은 예를 들어 3 일간 ∼ 15 일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항 (각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등) 에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(c-1) 의 배양을, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 에 더하여 cAMP 분해 효소 저해제도 존재하는 조건 (cAMP 가 세포에 공급되는 조건도 병용된다) 에서 실시하는 것으로 해도 된다. 당해 조건을 채용하면, cAMP 를 세포에 공급하면서, 세포 내 cAMP 농도의 저하를 억제할 수 있다. 따라서, 세포 내 cAMP 를 고레벨로 유지하기 위해 유효한 조건이 되고, 장관 상피 세포로의 효율적인 분화 유도가 촉진되는 것을 기대할 수 있다.

(c-1) 의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF 의 존재하에서의 배양 ((c-2) 의 배양) 을 실시하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들어 1 일간 ∼ 10 일간으로 한다. 이 배양을 실시하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과가 얻어진다.

본 발명을 구성하는 각 공정에 있어서, 도중에 계대 배양을 실시해도 된다. 예를 들어 컨플루언트 또는 서브컨플루언트가 되었을 때에 세포의 일부를 채취하고 다른 배양 용기로 옮겨, 배양을 계속한다. 분화를 촉진하기 위해 세포 밀도를 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들어 1 × 10⁴ 개/㎠ ∼ 1 × 10⁶ 개/㎠ 정도의 세포 밀도로 세포를 파종하면 된다.

5. 장관 상피 세포형 세포의 용도

본 발명의 추가적인 국면은 장관 상피 세포형 세포의 용도에 관한 것이다. 제 1 용도로서 각종 어세이가 제공된다. 본 발명의 장관 상피 세포형 세포는 장관, 특히 소장의 모델계에 이용 가능하고, 장관, 특히 소장에서의 약물 동태 (흡수, 대사 등) 의 평가나 독성의 평가에 유용하다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 장관 상피 세포형 세포는, 화합물의 체내 동태의 평가나 독성의 평가에 그 이용이 도모된다.

구체적으로는, 본 발명의 장관 상피 세포형 세포를 사용하여 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 시험할 수 있다. 즉, 본 발명은, 장관 상피 세포형 세포의 용도의 하나로서, 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 평가하는 방법 (제 1 양태) 을 제공한다. 당해 방법에서는, (ⅰ) 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정과, (ⅱ) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (ⅲ) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하고, 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정을 실시한다. 또한, 피검 물질의 흡수성에 대해서는, 후술하는 방법 (제 2 양태) 으로도 평가할 수 있다.

공정 (ⅰ) 에서는, 전형적으로는, 반투과성막 (다공성막) 상에서 장관 상피 세포형 세포를 배양하고, 세포층을 형성시킨다. 구체적으로는, 예를 들어, 컬처 인서트를 구비한 배양 용기 (예를 들어, 코닝사가 제공하는 트랜스웰 (등록상표)) 를 사용하고, 컬처 인서트 내에 세포를 파종하고 배양함으로써, 장관 상피 세포형 세포로 구성된 세포층을 얻는다.

공정 (ⅱ) 에서의 「접촉」은, 전형적으로는, 배지에 피검 물질을 첨가함으로써 실시된다. 피검 물질의 첨가의 타이밍은 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 피검 물질을 포함하지 않는 배지에서 배양을 개시한 후, 어느 시점에서 피검 물질을 첨가하는 것으로 해도 되고, 미리 피검 물질을 포함하는 배지에서 배양을 개시하는 것으로 해도 된다.

피검 물질에는 여러 가지 분자 사이즈의 유기 화합물 또는 무기 화합물을 사용할 수 있다. 유기 화합물의 예로서 핵산, 펩티드, 단백질, 지질 (단순 지질, 복합 지질 (포스포글리세리드, 스핑고지질, 글리코실글리세리드, 셀레브로시드 등), 프로스타글란딘, 이소프레노이드, 테르펜, 스테로이드, 폴리페놀, 카테킨, 비타민 (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E 등) 을 예시할 수 있다. 의약품, 영양 식품, 식품 첨가물, 농약, 향장품 (화장품) 등의 기존 성분 혹은 후보 성분도 바람직한 피검 물질의 하나이다. 식물 추출액, 세포 추출액, 배양 상청 등을 피검 물질로서 사용해도 된다. 2 종류 이상의 피검 물질을 동시에 첨가함으로써, 피검 물질 간의 상호 작용, 상승 작용 등을 조사하는 것으로 해도 된다. 피검 물질은 천연물 유래여도 되고, 혹은 합성에 의한 것이어도 된다. 후자의 경우에는 예를 들어 콤비나토리얼 합성의 수법을 이용하여 효율적인 어세이계를 구축할 수 있다.

피검 물질을 접촉시키는 기간은 임의로 설정 가능하다. 접촉 기간은 예를 들어 10 분간 ∼ 3 일간, 바람직하게는 1 시간 ∼ 1 일간이다. 접촉을 복수 회로 나누어 실시하는 것으로 해도 된다.

공정 (ⅲ) 에서는, 세포층을 투과한 피검 물질을 정량한다. 예를 들어, 트랜스웰 (등록상표) 과 같은 컬처 인서트를 구비한 배양 용기를 사용한 경우에는, 컬처 인서트를 투과한 피검 물질, 즉, 세포층을 개재하여 상부 혹은 하부 용기 내로 이동한 피검 물질을, 피검 물질에 따라, 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법 (예를 들어 형광 면역 측정법 (FIA 법), 효소 면역 측정법 (EIA 법)) 등의 측정 방법으로 정량한다. 정량 결과 (세포층을 투과한 피검 물질의 양) 와 피검 물질의 사용량 (전형적으로는 배지에 대한 첨가량) 에 기초하여, 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 판정·평가한다.

본 발명은 다른 양태 (제 2 양태) 로서, 피검 물질의 대사 또는 흡수를 평가하는 방법도 제공한다. 당해 방법에서는, (Ⅰ) 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (Ⅱ) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정을 실시한다.

공정 (Ⅰ), 즉 장관 상피 세포형 세포와 피검 물질의 접촉은, 상기 공정 (ⅱ) 와 동일하게 실시할 수 있다. 단, 미리 세포층을 형성시키는 것은 필수는 아니다.

공정 (Ⅰ) 의 후, 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가한다 (공정 (Ⅱ)). 공정 (Ⅰ) 의 직후, 즉, 피검 물질의 접촉 후, 실질적인 시간 간격을 두지 않고 대사 등을 측정·평가해도, 혹은, 일정한 시간 (예를 들어 10 분 ∼ 5 시간) 을 경과한 후에 대사 등을 측정·평가하는 것으로 해도 된다. 대사의 측정은, 예를 들어, 대사 산물의 검출에 의해 실시할 수 있다. 이 경우에는, 통상, 공정 (Ⅰ) 후의 배양액을 샘플로 하여, 예상되는 대사 산물을 정성적 또는 정량적으로 측정한다. 측정 방법은 대사 산물에 따라 적절한 것을 선택하면 되지만, 예를 들어, 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법 (예를 들어 형광 면역 측정법 (FIA 법), 효소 면역 측정법 (EIA 법)) 등을 채용 가능하다.

전형적으로는, 피검 물질의 대사 산물이 검출되었을 때, 「피검 물질이 대사되었다」라고 판정 내지 평가한다. 또, 대사 산물의 양에 따라 피검 물질의 대사량을 평가할 수 있다. 대사 산물의 검출 결과와, 피검 물질의 사용량 (전형적으로는 배지에 대한 첨가량) 에 기초하여, 피검 물질의 대사 효율을 산출하는 것으로 해도 된다.

장관 상피 세포형 세포에 있어서의 약물 대사 효소 (사이토크롬 P450 (특히 CYP3A4), 우리딘2인산-글루쿠론산 전이 효소 (특히 UGT1A8, UGT1A10), 황산 전이 효소 (특히 SULT1A3 등)) 의 발현을 지표로 하여 피검 물질의 대사를 측정하는 것도 가능하다. 약물 대사 효소의 발현은 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨로 평가할 수 있다. 예를 들어, 약물 대사 효소의 mRNA 레벨에 상승을 확인했을 때, 「피검 물질이 대사되었다」라고 판정할 수 있다. 마찬가지로, 약물 대사 효소의 활성에 상승을 확인했을 때, 「피검 물질이 대사되었다」라고 판정할 수 있다. 대사 산물을 지표로 하여 판정하는 경우와 마찬가지로, 약물 대사 효소의 발현량에 기초하여 정량적인 판정·평가를 실시하는 것으로 해도 된다.

피검 물질의 흡수를 평가하기 위해서는, 예를 들어, 배양액 중의 피검 물질의 잔존량을 측정한다. 통상, 공정 (Ⅰ) 후의 배양액을 샘플로 하여 피검 물질을 정량한다. 측정 방법은 피검 물질에 따라 적절한 것을 선택하면 된다. 예를 들어, 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법 (예를 들어 형광 면역 측정법 (FIA 법), 효소 면역 측정법 (EIA 법)) 등을 채용 가능하다. 전형적으로는, 배양액 중의 피검 물질의 함유량의 저하를 확인했을 때, 「피검 물질이 흡수되었다」라고 판정·평가한다. 또, 저하의 정도에 따라 피검 물질의 흡수량 내지 흡수 효율을 판정·평가할 수 있다. 또한, 세포 내에 흡수된 피검 물질의 양을 측정하는 것에 의해서도, 흡수의 평가는 가능하다.

또한, 대사의 측정·평가와 흡수의 측정·평가를 동시에 또는 병행하여 실시하는 것으로 해도 된다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용하여 조제한 인공 다능성 줄기 세포 유래 장관 상피 세포형 세포에서는, 인간 소장 상피 세포에서 고발현을 확인하는 무틴 2 및 크로모그라닌 A (CgA) 가, 소장의 모델계로서 빈용되고 있는 Caco-2 세포 (인간 결장암 유래의 세포) 와는 비교가 되지 않는 레벨로 고발현하고 있는 것이 판명되었다. 이 사실은 당해 세포가 소장의 모델계로서 매우 이용 가치가 높은 것을 뒷받침함과 함께, 당해 세포를 사용한 어세이의 지표로서 무틴 2 및 CgA 의 발현이 유용한 것을 나타낸다. 그래서 본 발명은, 장관 상피 세포형 세포를 사용한 어세이의 추가적인 양태 (제 3 양태) 로서, 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 지표로 한 2 가지의 평가법, 즉, 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 평가하는 방법 (제 3 양태. 이하, 「장해 작용 평가법」이라고 약칭하는 경우가 있다) 과 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 평가하는 방법 (제 4 양태. 이하, 「보호 작용 평가법」이라고 약칭하는 경우가 있다) 을 제공한다. 또한, 본 발명의 장해 작용 평가법은, 부작용으로서 점막 장해 (궤양) 를 일으킬 가능성이 있는 약물의 예측 (부작용 리스크의 예측) 에 특히 유용하고, 본 발명의 보호 작용 평가법은 이와 같은 부작용 또는 스트레스성 궤양을 억제하는 작용을 가지는 신규 약물의 스크리닝에 특히 유용하다.

본 발명의 장해 작용 평가법 (제 3 양태) 에서는, (a) 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (b) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 판정하는 공정으로서, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 장해 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정을 실시한다.

공정 (a), 즉 장관 상피 세포형 세포와 피검 물질의 접촉은, 상기 양태 (제 1 양태, 제 2 양태) 와 동일하게 실시할 수 있다. 단, 미리 세포층을 형성시키는 것은 필수는 아니다. 사용 가능한 피검 물질에 대해서도, 상기의 양태 (제 1 양태 및 제 2 양태) 와 동일하기 때문에, 그 설명을 생략한다.

공정 (a) 에 계속되는 공정 (b) 에서는, 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 판정한다. 즉, 본 발명에서는 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 이용하여 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용이 판정된다. 보다 구체적으로는, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하가 확인되는 것을, 피검 물질이 소화관 점막 장해 작용을 갖는 것의 지표로서 사용한다. 따라서, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 확인한 경우에 피검 물질은 소화관 점막 장해 작용을 갖는다고 판정하고, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 확인하지 않는 경우에 피검 물질은 소화관 점막 장해 작용을 가지지 않는다고 판정한다. 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하의 정도 (레벨) 에 기초하여, 소화관 점막 장해 작용의 강도 (정도) 를 결정하는 것으로 해도 된다. 또, 복수의 피검 물질을 사용한 경우에는, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하의 정도 (레벨) 에 기초하여, 각 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용의 강약을 비교 평가하는 것으로 해도 된다.

무틴 2 와 CgA 는 어느 쪽이나 분비 단백질이다. 무틴 2 는 장관 점막의 보호에 관련되어 있는 점막질이고, 무틴 2 의 질이나 양의 저하는 궤양성 대장염이나 암을 유발하는 것이 알려져 있다. 한편, CgA 는 자율 신경이 흥분함으로써 분비되는 물질이고, 혈중 농도에 있어서는 임상 화학적으로 종양 마커의 하나로서 알려져 있고, 또, 최근, 타액의 CgA 농도는 스트레스의 지표로서 주목받고 있다 (토요타 중앙 연구소 R&D 리뷰 Vol.34 No.3, 17-22 (1999. 9), 코치 여자 대학 간호 학회지 VOL.40, NO.1, pp24-30 2014 등).

무틴 2 및 CgA 의 발현은 예를 들어 통상적인 방법에 따라 검출하면 된다. 무틴 2 및 CgA 의 검출 방법으로서, RT-PCR 법이나 리얼타임 PCR 법 (mRNA 의 측정/정량), 형광 면역 측정법 (FIA 법) 이나 효소 면역 측정법 (EIA 법) 등의 면역학적 수법, 질량 분석법 등을 예시할 수 있다. CgA 에 대해서는, 검출용 시약이나 키트 (예를 들어 주식회사 야나이하라 연구소가 제공하는 YK070 Human Chromogranin A) 도 있고, 이들을 이용할 수도 있다.

통상은, 비교 대조로서, 피검 물질에 접촉시키지 않는 장관 상피 세포형 세포 (그 밖의 조건은 동일하게 한다) (이하, 「컨트롤」이라고 한다) 를 준비하고, 그 무틴 2 또는 CgA 의 발현도 검출한다. 그리고, 당해 컨트롤의 발현 레벨과 비교함으로써, 피검 물질이 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 저하시켰는지 판단한다. 이와 같이 컨트롤과의 비교에 의해 피험 물질의 소화관 점막 장해 작용을 판정하면, 보다 신뢰성이 높은 판정 결과가 얻어진다.

본 발명의 보호 작용 평가법 (제 4 양태) 에서는, (A) 소화관 점막 장해 작용을 나타내는 물질의 존재하, 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (B) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 판정하는 공정으로서, 상기 물질에 의한 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하의 억제가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 보호 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정을 실시한다.

공정 (A) 에서는, 소화관 점막 장해 작용을 나타내는 물질 (이하, 「점막 장해제」라고 호칭한다) 의 존재하에서, 장관 상피 세포형 세포와 피검 물질의 접촉이 실시된다. 장관 상피 세포형 세포와 피검 물질의 접촉은, 상기 양태 (제 3 양태) 와 동일하게 실시할 수 있고, 전형적으로는, 점막 장해제와 피검 물질의 존재하 (즉 배지에 이들 양자가 첨가된 상태) 에서 장관 상피 세포형 세포를 배양하게 된다. 점막 장해제와 피검 물질의 첨가의 타이밍은 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 점막 장해제와 피검 물질을 포함하지 않는 배지에서 배양을 개시한 후, 어느 시점에서 점막 장해제와 피검 물질을 첨가하는 것으로 해도 되고, 미리 점막 장해제와 피검 물질을 포함하는 배지에서 배양을 개시하는 것으로 해도 된다. 또, 점막 장해제와 피검 물질의 첨가의 순서는 특별히 묻지 않는다. 즉, 전자를 먼저 첨가, 후자를 먼저 첨가, 양자를 동시에 첨가의 어느 것이어도 된다.

무틴 2 및/또는 CgA 의 발현을 저하시킴으로써 소화관 점막을 장해하는 각종 물질을, 본 발명에 있어서의 점막 장해제로서 채용할 수 있다. 점막 장해제로서 사용하는 것이 가능한 물질의 예를 들면, 인도메타신, 아스피린, 케토프로펜, 이브프로펜 등이다. 점막 장해제의 사용량 (첨가 농도) 은, 사용하는 점막 장해제의 작용에 관한 과거의 보고 등을 참고로 하여, 혹은 예비 실험을 통하여 설정하면 된다. 2 이상의 물질을 병용하는 것으로 해도 된다. 또한, 사용 가능한 피검 물질에 대해서는, 상기의 양태 (제 1 양태 및 제 2 양태) 와 동일하기 때문에, 그 설명을 생략한다.

공정 (A) 에 계속되는 공정 (B) 에서는, 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 판정한다. 즉, 본 발명에서는 무틴 2 또는 CgA 의 발현을 이용하여 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용이 판정된다. 보다 구체적으로는, 점막 장해제에 의한 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하의 억제가 확인되는 것을, 피검 물질이 소화관 점막 보호 작용을 갖는 것의 지표로 사용한다. 따라서, 점막 장해제에 의한 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 억제한 경우에 피검 물질은 소화관 점막 보호 작용을 갖는다고 판정하고, 점막 장해제에 의한 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 억제하지 않는 경우에 피검 물질은 소화관 점막 보호 작용을 가지지 않는다고 판정한다. 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 억제한 정도 (레벨) 에 기초하여, 소화관 점막 보호 작용의 강도 (정도) 를 결정하는 것으로 해도 된다. 또, 복수의 피검 물질을 사용한 경우에는, 무틴 2 또는 CgA 의 발현 저하를 억제한 정도 (레벨) 에 기초하여, 각 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용의 강약을 비교 평가하는 것으로 해도 된다.

상기 양태 (제 3 양태) 와 마찬가지로, 보다 신뢰성이 높은 판정 결과를 얻기 위해, 비교 대조 (컨트롤) 를 형성하고, 컨트롤과의 비교에 의해 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 판정하는 것이 바람직하다. 이 경우의 컨트롤로는, 점막 장해제의 비존재하에서 피검 물질을 접촉시킨 장관 상피 세포형 세포, 및/또는 피검 물질에 접촉시키지 않는 장관 상피 세포형 세포 (점막 장해제는 존재하) 를 사용할 수 있다.

위에서도 언급한 바와 같이, 당해 양태 (제 4 양태) 의 평가법은, 약물의 부작용으로서의 점막 장해 또는 스트레스성 궤양을 억제하는 작용을 가지는 신규 약물의 스크리닝에 특히 유용하다. 본 발명의 평가법을 스크리닝에 이용하는 경우에는, 공정 (B) 에서의 판정 결과에 기초하여 유효한 피검 물질을 선발한다. 선택한 물질이 충분한 약효를 갖는 경우에는, 당해 물질을 그대로 장관 점막 보호약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 한편으로 충분한 약효를 가지지 않는 경우에는 화학적 수식 등의 개변을 실시하여 그 약효를 높인 후에, 장관 점막 보호약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 물론, 충분한 약효를 갖는 경우에도, 추가적인 약효의 증대를 목적으로 하여 동일한 개변을 실시해도 된다.

본 발명의 분화 유도 방법으로 조제한 장관 상피 세포형 세포의 제 2 용도로서 장관 상피 세포형 세포를 함유하는 세포 제제가 제공된다. 본 발명의 세포 제제는 각종 장 질환의 치료에 적용 가능하다. 특히, 장해된 (기능 부전을 포함한다) 장관 상피 조직의 재생·재건용의 재료로서의 이용이 상정된다. 즉, 재생 의료에 대한 공헌을 기대할 수 있다. 본 발명의 세포 제제는, 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 장관 상피 세포형 세포를 생리 식염수나 완충액 (예를 들어 인산계 완충액) 등에 현탁하는 것, 혹은 당해 세포를 사용하여 삼차원 조직체 (오르가노이드나 스페로이드) 를 제작하는 것에 의해 조제할 수 있다. 치료상 유효량의 세포를 투여할 수 있도록, 1 회 투여분의 양으로서 예를 들어 1 × 10⁵ 개 ∼ 1 × 10¹⁰ 개의 세포를 함유시키면 된다. 세포의 함유량은, 사용 목적, 대상 질환, 적용 대상 (리시피언트) 의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 세포의 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다.

세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭시드 (DMSO) 나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입을 저지하는 것을 목적으로 하여 항생 물질 등을, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 하여 각종 성분 (비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등) 을 본 발명의 세포 제제에 함유시켜도 된다. 추가로, 제제상 허용되는 다른 성분 (예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등) 을 본 발명의 세포 제제에 함유시켜도 된다.

실시예

A. 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 신규 배양 방법의 개발

장관 줄기 세포의 성질을 유지시킨 채로 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 유지·증식 가능한 배양 방법의 확립을 목표로 하여, 이하의 검토를 실시하였다.

1. 방법

(1) 세포

인간 iPS 세포 (iPS-51 : Windy) 는, 인간 태아 폐 선유아세포 MRC-5 에 옥타머 결합 단백질 (octamer binding protein) 3/4 (OCT3/4), 성 결정 부위 (sex determining region) Y-box 2 (SOX2), 크루펠-유사 인자 (kruppel-like factor) 4 (KLF4), v-myc 골수세포종 바이러스 종양유전자 호모로그 (myelocytomatosis viral oncogene homolog) (조류) (c-MYC) 를, 판트로픽 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입 후, 인간 ES 세포형 콜로니를 클론화한 것이고, 국립 성육 의료 연구 센터 우메자와 아키히로 박사로부터 공여 받았다. 피더 세포는 마우스 태자 선유아세포 (MEF) 를 사용하였다.

(2) 배지

MEF 의 배양에는 10 ％ 소 태자 혈청 (FBS), 2 mmol/L L-글루타민 (L-Glu), 1 ％ 비필수 아미노산 (NEAA), 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 개변 이글 배지 (DMEM) 를 사용하였다. MEF 의 박리액에는 0.05 ％ 트립신-에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 을, MEF 의 보존액에는 셀 뱅커-1 을 사용하였다. 인간 iPS 세포의 유지 배양에는 20 ％ 녹아웃 혈청 대체물 (KSR), 0.8 ％ NEAA, 2 mmol/L L-Glu, 0.1 mmol/L 2-메르캅토에탄올 (2-MeE), 5 ng/㎖ 선유아세포 증식 인자 (FGF) 2 를 포함하는 DMEM Ham's F-12 (DMEM/F12) 를 사용하였다. 인간 iPS 세포의 박리액에는 1 mg/㎖ 콜라게나아제 IV, 0.25 ％ 트립신, 20 ％ KSR, 1 mmol/L 염화칼슘을 포함하는 둘베코 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 를 사용하였다. 인간 iPS 세포의 보존액에는 영장류 ES/iPS 세포용 동결 보존액을 사용하였다.

(3) 인간 iPS 세포의 배양

인간 iPS 세포는 마이토마이신 C 처리를 실시한 MEF (5 × 10⁵ 세포/100 ㎜ 디쉬) 상에 파종하고, 5 ％ CO₂/95 ％ 공기 조건하 CO₂ 인큐베이터 중 37 ℃ 에서 배양하였다. 인간 iPS 세포의 계대는, 3 ∼ 5 일 배양 후, 1 : 2 ∼ 1 : 3 의 스플릿비로 실시하였다. 인간 iPS 세포는 해동 48 시간 후에 배지를 교환하고, 그 이후에는 매일 교환하였다.

(4) 인간 iPS 세포의 장관 줄기 세포로의 분화

인간 iPS 세포의 장관 줄기 세포로의 분화는, 인간 iPS 세포가 배양 디쉬에 대하여, 미분화 콜로니가 차지하는 비율이 약 70 ％ 가 된 상태에서 개시하였다. 0.5 ％ FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) ＋ 글루타맥스 배지에서 2 일간, 2 ％ FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI ＋ 글루타맥스 배지에서 1 일간 배양함으로써 내배엽으로 분화시켰다. 그 후, 2 ％ FBS, 1 ％ 글루타맥스, 250 ng/㎖ FGF2 를 포함하는 DMEM/F12 에서 4 일간 배양함으로써 장관 줄기 세포로 분화시켰다.

(5) 장관 줄기 세포의 배양과 계대

현재까지의 보고도 고려하여, 줄기 세포성을 유지하는 데 필요하다고 생각되는 인자를 포함한 유지 배지 (10 ％ KSR, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 ％ 글루타맥스, 5 μM Y-27632, 100 ng/㎖ EGF, 100 ng/㎖ 노긴, 100 ng/㎖ R-스폰딘 1, 100 ng/㎖ Wnt 3a, 선유아세포 증식 인자 (5 ng/㎖ FGF2 또는 100 ng/㎖ FGF4 또는 100 ng/㎖ FGF10), 10 μM CHIR 99021, 1 mM 발프로산, 1 mg/㎖ 니코틴아미드, 1.5 μM A-83-01, 10 μM SB202190, 1 mM N-아세틸시스테인을 포함하는 Advanced DMEM/F12) 를 새롭게 고안하고, 본 검토에서 사용하였다.

iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포를 아쿠타아제로 박리하고, 유지 배지에 현탁시키고, 젤라틴 코팅한 세포 배양용 6 또는 10 ㎝ 디쉬에 파종하였다. 이 때를 계대 (Passage) 1 로 하였다. 배지 교환은 유지 배지로부터 Y-27632 를 제외한 배지로 2 ∼ 3 일 간격으로 교환하였다. 계대는, 세포가 배양 디쉬에 대하여 차지하는 비율이 약 80 ％ 가 된 상태에서 개시하였다. 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, D-PBS(-) 5 ㎖/10 ㎝ 디쉬에서 2 회 세정하였다. 아쿠타아제로 박리하고, 세포 현탁액을 15 ㎖ 원침관에 회수하였다. 계대에는 계대 전의 디쉬 1 장당 약 50 ％ 의 세포수를 사용하고, 약 25 ％ 의 세포수는 총 리보 핵산 (RNA) 추출에 사용하였다. 계대하는 세포는, 1,000 rpm (160×g) 으로 3 분간 원심 후, 상청을 가능한 한 흡인 제거하였다. 유지 배지에서 현탁하고, 젤라틴 코팅한 세포 배양용 6 또는 10 ㎝ 디쉬에 파종하였다. 계대 후 24 시간 후에 Y-27632 를 포함하지 않는 배지로 교환하였다.

(6) 장관 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화

장관 상피 세포로의 분화는, 장관 줄기 세포가 배양 디쉬에 대하여, 약 80 ％ 가 된 상태에서 개시하였다. 세포를 아쿠타아제로 박리하고, 미리 인간 iPS 세포용 배지에서 30 배로 희석한, 성장 인자를 제거한 마트리겔로 코트한 세포 배양용 24 웰 플레이트에 파종하였다. 그 후, 2 ％ FBS, 2 mmol/L L-Glu, 1 ％ NEAA, 2 ％ B27 보충물, 1 ％ N2 보충물, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 20 ng/㎖ 상피 성장 인자 (EGF), 10 μmol/L Y-27632 를 포함하는 DMEM/F12 에서 1 일간, 2 ％ FBS, 2 mmol/L L-Glu, 1 ％ NEAA, 2 ％ B27 보충물, 1 ％ N2 보충물, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 20 ng/㎖ EGF 를 포함하는 DMEM/F12 에서 18 일간 배양함으로써 장관 상피 세포로 분화시켰다. 또, 분화시에 이전에 우리가 알아낸 저분자 화합물인 PD98059 (20 μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘 (5 μmol/L), A-83-01 (0.5 μmol/L) 을 첨가하였다.

(7) RNA 추출

장관 줄기 세포의 계대 배양에서의 회수 및 장관 상피 세포로의 분화 후의 회수 종료 후, Agencourt (등록상표) RNAdvance^TMissue Kit 의 첨부 매뉴얼에 따라 추출하였다.

(8) 역전사 반응

상보적 DNA (cDNA) 의 합성은, ReverTra Ace (등록상표) qPCR RT Master Mix 를 사용하고, 첨부 매뉴얼에 따라 실시하였다.

(9) 리얼타임 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (Real-Time RT-PCR)

Real-Time RT-PCR 은 KAPA SYBR Fast qPCR Kit 를 사용하고, cDNA 를 주형으로 하고, 반응은 첨부 매뉴얼에 따라 실시하였다. 결과는 내재성 컨트롤로서 글리세르알데히드-3-인산 탈수소 효소 (GAPDH) 를 사용하여 보정하였다.

또한, 줄기 세포성의 평가에는 LGR5 (류신 리치 리피트를 포함하는 G 단백질 공액형 수용체, 장관 줄기 세포의 마커) 와 SOX9 (장관 전구 세포 마커) 를 이용하고, 장관 상피형 세포로 분화한 것의 평가에는 Villin (빌린 1, 미융모의 주요한 구성 성분), Sucrase-isomaltase (수크라아제-이소말타아제, 장관 상피에 존재하는 이당 분해 효소, 장관 상피 특이적 마커), PEPT1 (SLC (solute carrier) 패밀리 멤버 15A1/펩티드 트랜스포터 1, 소장의 정측 (頂側) 막측에 발현하고 있다), MDR1 (ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/다제 내성 단백 1, P 당 단백질, 배출 트랜스포터) 을 이용하였다.

2. 결과·고찰

(1) 장관 줄기 세포의 배양 방법의 검토

새롭게 고안한 유지 배지의 줄기 세포성 유지에 대한 영향과 그 때에 첨가하는 선유아세포 증식 인자 (FGF2, FGF4, FGF10) 의 영향을 계대 배양함으로써 검토하였다. 그 결과, 줄기 세포성 마커인 LGR5 나 전구 세포 마커인 SOX9 의 mRNA 발현 레벨은 인간 소장과 비교하여 동일한 정도의 발현량이 확인되었다 (도 1 ∼ 3). 또, 그 발현량은 약간의 변동과 감쇠는 확인되었지만, 인간 소장과 비교하여 동일한 정도의 발현량이 유지되고 있었다 (도 1 ∼ 3). 선유아세포 증식 인자에 대해서는 큰 차이는 확인되지 않았다. 이들 결과는, 새롭게 고안한 유지 배지를 사용하면, 장관 줄기 세포의 계대 배양이 가능하게 되는 것을 나타낸다. 또한, 유지 배지에 사용하는 선유아세포 증식 인자 (FGF2, FGF4, FGF10) 의 사이에 큰 차이는 확인되지 않았다.

(2) 장관 줄기 세포의 분화의 검토

iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시키고, 계대 배양하지 않고 그대로 장관 상피 세포로 분화시킨 경우 (컨트롤) 와, iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시키고, 1 회 계대하고, 본 검토에서 확립한 장관 줄기 세포의 배양 방법으로 유지 배양시킨 세포 (FGF2 첨가 유지군, FGF4 첨가 유지군, FGF10 첨가 유지군) 를 장관 상피 세포로 분화시킨 경우의 사이에서, 장관 상피 마커 및 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현량을 비교하였다. 그 결과, 컨트롤과 비교하여 유지 배양한 군에서는 빌린은 4.1 ∼ 15.8 배, 수크라아제-이소말타아제는 53.6 ∼ 86.2 배, PEPT1 은 4.0 ∼ 6.1 배, MDR1 은 23.4 ∼ 28.0 배의 mRNA 발현량의 증가가 확인되었다 (도 4).

이상과 같이, 새롭게 고안한 유지 배지를 사용함으로써, 인간 iPS 세포로부터 분화시킨 장관 줄기 세포를 장관 줄기 세포의 성질을 유지한 채로 배양하는 것이 가능해졌다. 또, 놀랍게도, 유지 배양한 장관 줄기 세포를 장관 상피 세포로 분화시킨 결과, 컨트롤과 비교하여 장관 상피 마커 및 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현량이 크게 상승하였다. 이 결과는, 확립에 성공한, 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포의 유지 배양법이, 장관 줄기 세포를 대량으로 증식시키는 것이나 장기간에 걸쳐서 유지하는 수단으로서뿐만 아니라, 장관 상피 세포로의 분화 촉진 및 기능 향상에도 유용한 것을 나타낸다.

B. 인간 iPS 세포 유래 장관 상피 세포의 특성의 검토

iPS 세포 유래 장관 상피 세포의 유용성을 더욱 검토하기 위해, 장관 점막의 보호에 관련되어 있는 점막질인 무틴 2 와, 스트레스의 지표로서 주목받고 있는 CgA 에 착안하여, iPS 세포 유래 장관 상피 세포에 있어서의 이들 물질의 발현 상태를 조사하였다.

1. 방법

iPS 세포로부터 장관 줄기 세포로 분화시키고, 1 회 계대한 후, 상기 검토에서 확립한 장관 줄기 세포의 배양 방법으로 유지 배양한 세포를 장관 상피 세포로 분화시켰다.

(1) 무틴 2 의 검출

장관 상피 세포로 분화시키는 과정에서, 배지 중에 인도메타신 (50 μM, 200 μM), 레바미피드 (50 μM, 100 μM, 200 μM) 를 6 일간 첨가하고, 무틴 2 의 발현에 대한 영향을 검토하였다.

＜RNA 추출＞

장관 상피 세포로의 분화 후의 회수 종료 후, Agencourt (등록상표) RNAdvance^TMissue Kit 의 첨부 매뉴얼에 따라 추출하였다.

＜역전사 반응＞

＜리얼타임 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (Real-Time RT-PCR)＞

Real-Time RT-PCR 은 KAPA SYBR Fast qPCR Kit 를 사용하고, cDNA 를 주형으로 하고, 반응은 첨부 매뉴얼에 따라 실시하였다. 결과는 내재성 컨트롤로서 하이포크산틴-구아닌포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT) 를 사용하여 보정하였다.

(2) CgA 의 검출

장관 상피 세포로 분화시키는 과정에서, 배지 중에 인도메타신 (50 μM, 200 μM), 레바미피드 (50 μM, 100 μM, 200 μM) 를 6 일간 첨가하고, CgA 의 발현에 대한 영향을 검토하였다.

＜RNA 추출＞

＜역전사 반응＞

2. 결과·고찰

(1) 무틴 2 의 발현 및 그 변화

무틴 2 mRNA 의 검출 결과를 도 5 에 나타낸다. 본 법으로 조제한 장관 상피 세포 (Con) 는, 인간 결장암 유래의 Caco-2 세포 (Caco-2) 에서는 거의 발현하고 있지 않은 무틴 2 를 고발현하고 있었다. 그 발현량은, 시판되는 인간 소장 유래 세포 (SI) 의 발현량의 약 30 ％ 에도 달한다. 이 사실은, 본 법으로 조제한 장관 상피 세포가 소장의 모델계로서 매우 이용 가치가 높은 것을 나타낸다.

인도메타신을 농도 200 μM 로 배지에 첨가하면, 본 법으로 조제한 장관 상피 세포의 무틴 2 의 발현 (mRNA 레벨) 이 저하되었다 (I200). 한편, 레바미피드를 배지에 첨가 (50 μM, 100 μM, 200 μM) 함으로써 무틴 2 의 발현 (mRNA 레벨) 이 상승하였다 (R50, R100, R200). 또한, 레바미피드를 농도 200 μM 로 배지에 첨가한 경우 (R200) 는, 농도가 지나치게 높아 세포 독성이 나온 가능성을 생각할 수 있다. 인도메타신 (200 μM) 과 레바미피드 (100 μM, 200 μM) 를 배지에 첨가한 경우, 무틴 2 의 발현 (mRNA 레벨) 의 저하가 억제되는 경향이 보였다 (I200 ＋ R100, I200 ＋ R200). 이상의 결과는, 본 법으로 조제한 장관 상피 세포가, 무틴 2 의 발현을 지표로 한 어세이 (구체적으로는, 부작용으로서 점막 장해 (궤양) 를 일으키는 약물의 예측 (부작용 리스크의 예측) 및 이와 같은 부작용 혹은 스트레스성의 궤양을 억제하는 작용을 가지는 약물의 스크리닝계) 에 유용한 것을 나타낸다.

(2) CgA 의 발현 및 그 변화

CgA mRNA 의 검출 결과를 도 6 에 나타낸다. 본 법으로 조제한 장관 상피 세포 (Con) 는, 인간 결장암 유래의 Caco-2 세포 (Caco-2) 와는 비교가 되지 않는 레벨로 CgA 를 발현하고 있었다. 이 사실도, 본 법으로 조제한 장관 상피 세포가 소장의 모델계로서 매우 이용 가치가 높은 것을 뒷받침한다.

인도메타신을 배지에 첨가하면 (50 μM, 200 μM), 본 법으로 조제한 장관 상피 세포의 CgA 의 발현 (mRNA 레벨) 이 저하되었다 (I50, I200). 한편, 레바미피드를 배지에 첨가 (50 μM, 100 μM, 200 μM) 해도 CgA 의 발현 (mRNA 레벨) 의 상승은 특별히 확인되지 않았다 (R50, R100, R200). 그러나, 인도메타신 (200 μM) 과 레바미피드 (100 μM, 200 μM) 를 배지에 첨가한 경우, CgA 의 발현 (mRNA 레벨) 의 저하가 억제되는 경향이 보였다 (I200 ＋ R100, I200 ＋ R200). 이상의 결과는, 본 법으로 조제한 장관 상피 세포가, CgA 의 발현을 지표로 한 어세이 (구체적으로는, 부작용으로서 점막 장해 (궤양) 를 일으키는 약물의 예측 (부작용 리스크의 예측) 및 이와 같은 부작용 혹은 스트레스성의 궤양을 억제하는 작용을 가지는 약물의 스크리닝계) 에 유용한 것을 나타낸다.

C. 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 신규 배양 방법의 개발 2

인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 배양 방법의 개량을 목표로 하여, 배지에 첨가하는 인자를 변경하고, 그 영향/효과를 조사하였다. 구체적으로는, 10 ％ KSR, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 ％ 글루타맥스, 2 μM Y-27632, 100 ng/㎖ EGF, 30 ng/㎖ FGF2, 3 μM CHIR 99021, 0.5 μM A-83-01 을 포함하는 Advanced DMEM/F12 를 사용하여, 인간 iPS 세포를 분화시켜 얻어진 장관 줄기 세포를 계대 배양하고, 마커 (LGR5 : 소장 줄기 세포 마커, CDX2 : 후장 마커) 의 발현 레벨을 지표로 하여 줄기 세포성이 유지되고 있는지 평가하였다. 배지 조건 이외에는 상기 A 의 경우와 동일하게 하였다. 또, 사용하는 세포 (인간 iPS 세포, MEF), 인간 iPS 세포의 배양 방법 등도 상기 A 의 경우와 동일하게 하였다. 또한, 본 검토에 사용한 배지는, 상기 A 의 검토에서 사용한 배지에 비하여 첨가하는 인자의 수가 대폭 적고, 특히, 히스톤 탈아세틸화 저해제인 발프로산이 첨가되어 있지 않은 점에 특징이 있다.

실험 결과를 도 7 에 나타낸다. 계대를 거듭해도 (P1 ∼ P11), 줄기 세포성 마커인 LGR5, 후장 마커인 CDX2 의 mRNA 발현 레벨은 인간 소장과 동등 이상이고, 상기 배지가 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 유지 (계대 배양) 에 매우 유효한 것이 밝혀졌다.

계대 전 (P0) 및 계대 후 (P1 ∼ P10) 의 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포로 분화시키고 (방법은 상기 A 의 경우에 준함), 각종 마커 (빌린 : 장관 마커, 수크라아제-이소말타아제 : 장관 마커, ISX : 장관 마커, LGR5 : 장관 줄기 세포 마커, MDR1 : 트랜스포터 유전자, PEPT1 : 트랜스포터 유전자, CYP3A4 : 약물 대사 효소 유전자) 의 발현을 조사하였다. 결과를 도 8 및 9 에 나타낸다. 계대 후에 장관 상피 세포로 분화시킨 경우에도, 장관 상피 마커 및 약물 동태 관련 유전자의 높은 발현이 보였다. 빌린 1, ISX, MDR1 등은, 계대를 거듭하면 발현 레벨이 높아지는 경향을 나타내고, 인간 소장보다 높은 발현이 확인되었다.

이상과 같이, 상기의 배지를 사용한 유지 배양법이, 인간 iPS 세포 유래 장관 줄기 세포형 세포의 유지 (배양), 그리고 장관 상피 세포로의 분화 촉진 및 기능 향상에 매우 유효한 것이 확인되었다.

본 발명의 배양 방법은 iPS 세포 유래의 장관 줄기 세포형 세포를 대량으로 조제하는 것이나, 장기간에 걸쳐서 유지하는 것을 가능하게 한다. 또, 본 발명의 배양 방법을 통하여 iPS 세포 유래의 장관 상피 세포형 세포를 조제함으로써, 보다 성숙한 장관 상피 세포형 세포를 취득할 수 있다. 장관 상피 세포형 세포는 소장의 모델계로서 유용하고, 흡수·대사·막투과성, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성의 평가 등에 이용할 수 있다. 또, 각종 장 질환 치료용의 세포 제제의 유효 성분으로서, 혹은 재생 의료의 재료로서의 이용도 기대된다. 또한, 본 발명에는, 장관 줄기 세포의 기능 해명, 장관의 발생 과정의 해명, 소화관 질환의 원인이나 진전 기구의 해명 등에 대한 공헌도 기대된다.

이 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 전혀 한정되는 것은 아니다. 특허 청구의 범위의 기재를 벗어나지 않고, 당업자가 용이하게 상도할 수 있는 범위에서 여러 가지 변형 양태도 이 발명에 포함된다. 본 명세서 중에서 명시한 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의해 인용하는 것으로 한다.

Claims

인공 다능성 줄기 세포 유래의 장관 줄기 세포형 세포를 GSK-3β 저해제, 혈청 대체물, 상피 성장 인자, 선유아세포 증식 인자 및 TGFβ 수용체 저해제의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는,
인공 다능성 줄기 세포 유래의 장관 줄기 세포형 세포를, 장관 줄기 세포의 성질을 유지시킨 채로 배양하는 방법.
제 1 항에 있어서,
GSK-3β 저해제가 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, 인디루빈, 비키닌 또는 1-아자켄파울론이고, 혈청 대체물이 녹아웃 혈청 대체물인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01 이고, 선유아세포 증식 인자가 FGF2, FGF4 또는 FGF10 인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양이, BMP 저해제, Wnt 시그널 활성화제 및 Wnt 아고니스트로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 실시되는, 방법.
제 4 항에 있어서,
BMP 저해제가 노긴 (Noggin) 이고, Wnt 시그널 활성화제가 R-스폰딘 (spondin) 1 이고, Wnt 아고니스트가 Wnt3a 인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양이, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, p38 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물이 추가로 존재하는 조건하에서 실시되는, 방법.
제 6 항에 있어서,
p38 저해제가 SB202190 이고, ROCK 저해제가 Y-27632 인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
인공 다능성 줄기 세포가 인간 인공 다능성 줄기 세포인, 방법.
제 1 항에 기재된 방법으로 배양한 장관 줄기 세포형 세포를 장관 상피 세포형 세포로 분화시키는 공정을 포함하는, 장관 상피 세포형 세포를 조제하는 방법.
삭제
이하의 공정을 포함하는, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법 :
제 9 항에 기재된 방법으로 장관 상피 세포형 세포를 얻는 공정 ;
상기 장관 상피 세포형 세포를 사용하여 피검 물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 공정.
제 11 항에 있어서,
상기 체내 동태가, 대사, 흡수, 배설, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, 방법.
제 11 항에 있어서,
이하의 공정 (ⅰ) ∼ (ⅳ) 을 포함하는, 방법 :
(ⅰ) 제 9 항에 기재된 방법으로 장관 상피 세포형 세포를 얻는 공정 ;
(ⅱ) 상기 장관 상피 세포형 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정 ;
(ⅲ) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;
(ⅳ) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하고, 피검 물질의 흡수성 내지 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정.
제 11 항에 있어서,
이하의 공정 (Ⅰ) ~ (Ⅲ) 를 포함하는, 방법 :
(Ⅰ) 제 9 항에 기재된 방법으로 장관 상피 세포형 세포를 얻는 공정 ;
(Ⅱ) 상기 기재된 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;
(Ⅲ) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정.
이하의 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는, 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 평가하는 방법 :
(a) 제 9 항에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;
(b) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 장해 작용을 판정하는 공정으로서, 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현 저하가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 장해 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정.
이하의 공정 (A) 및 (B) 를 포함하는, 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 평가하는 방법 :
(A) 소화관 점막 장해 작용을 나타내는 물질의 존재하, 제 9 항에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정 ;
(B) 상기 장관 상피 세포형 세포에 있어서의 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현을 검출하고, 검출 결과에 기초하여 피검 물질의 소화관 점막 보호 작용을 판정하는 공정으로서, 상기 물질에 의한 무틴 2 또는 크로모그라닌 A 의 발현 저하의 억제가 확인되는 것이, 피검 물질이 소화관 점막 보호 작용을 갖는 것의 지표가 되는 공정.
제 9 항에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포형 세포를 포함하는, 세포 제제.