CN110382689A

CN110382689A - 来自人工多能性干细胞的肠道干细胞的维持培养

Info

Publication number: CN110382689A
Application number: CN201880012849.7A
Authority: CN
Inventors: 岩尾岳洋; 松永民秀; 近藤聪志; 水野翔太
Original assignee: Fujifilm Corp; Nagoya City University
Current assignee: Fujifilm Corp; Nagoya City University
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2019-10-25
Also published as: JP6949336B2; WO2018151307A1; EP3584313A4; JPWO2018151307A1; KR102323928B1; EP3584313A1; KR20210027532A; US20200002680A1; KR20190105237A; US11725189B2; CA3053893A1

Abstract

本发明的课题在于提供能够在维持肠道干细胞的性质的情况下对来自人工多能性干细胞的肠道干细胞进行维持、培养的培养方法。将来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞在GSK‑3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂及血清替代物的存在下、或在GSK‑3β抑制剂及血清替代物的存在下进行培养。优选在进一步存在选自上皮生长因子、TGFβ受体抑制剂及成纤维细胞生长因子中的一种以上的化合物的条件下进行培养。

Description

来自人工多能性干细胞的肠道干细胞的维持培养

技术领域

本发明涉及培养来自人工多能性干细胞的肠道干细胞的技术及其用途。本申请主张基于2017年2月20日申请的日本专利申请第2017-029448号的优先权，通过参照援用该专利申请的全部内容。

背景技术

小肠中存在大量的药物代谢酶和药物转运蛋白，因此与肝脏同样，作为与药物的初次通过效果相关的脏器非常重要。因此，从药品开发早期阶段起评价药品在小肠中的膜透过性、代谢，需要开发药代动力学特性优异的药品。目前，作为小肠的模型系，多使用来自人结肠癌的Caco-2细胞。但是，Caco-2细胞中的药物转运蛋白的表达模式与人小肠不同。另外，由于在Caco-2细胞中几乎未见药物代谢酶的表达和酶诱导，因此难以准确地评价小肠中的药代动力学。因此，为了综合评价小肠中的药物代谢和膜透过性，希望利用原代小肠上皮细胞，但原代小肠上皮细胞的获得困难。

因此，期待利用由与人胚胎干细胞(embryonic stem cells：ES细胞)同样具有多分化能力和几乎无限的增殖能力的人的人工多能性干细胞(iPS细胞)制作的肠道上皮细胞。

另外，虽然报告了几项从生物体的肠道分离肠道干细胞、在体外培养肠道干细胞、肠道上皮细胞的技术或从人iPS细胞分化诱导肠道上皮细胞的技术(例如参照专利文献1～4、非专利文献1～3)，但没有报告以来自人iPS细胞的肠道干细胞的维持或增殖为目的的培养技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2014/132933号小册子

专利文献2：日本特表2016-512958号公报

专利文献3：日本特表2014-516562号公报

专利文献4：日本再表2012-060315号公报

非专利文献

非专利文献1：Yin X.et al.,Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+)intestinal stem cells and their progeny.Nature Methods,2014.11(1)：p.106-112.

非专利文献2：Wang X.et al.,Cloning and Variation of Ground State Intestinal Stem Cells.Nature,522(7555)：173-178.(2015)

非专利文献3：Sato T.et al.,Long-term expansion of epithelial organoidsfrom human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett’s epithelium.Gastroenterology.2011 Nov；141(5)：1762-72

技术内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于从iPS细胞使其分化为肠道上皮细胞需要大量的时间和费用。另外，为了大量地供给来自人iPS细胞的肠道上皮细胞，开发分化中途的肠道干细胞阶段时的培养技术是必不可少的。因此，本发明的课题在于提供能够在维持肠道干细胞的性质、即未分化性、增殖能力及向肠道上皮细胞分化的能力的情况下对来自iPS细胞的肠道干细胞进行维持、培养的培养技术及其应用、用途。

用于解决课题的手段

根据至此为止的报告，设定了被认为维持未分化性所需或有效的因素的各种组合，并详细研究了在从人iPS细胞诱导的肠道干细胞样细胞的培养中的效果、影响。其结果发现了特别有效的因子的组合，通过使用采用了该组合的培养液，能够在维持其性质的情况下维持来自人iPS的肠道干细胞样细胞并使其增殖。另外，令人惊讶的是，将通过该培养方法维持的肠道干细胞样细胞分化诱导成肠道上皮细胞，结果与未经通过该培养方法培养的情况相比，肠道上皮标记物和药代动力学相关基因的表达大幅上升。即，判明了成功建立的培养方法不仅可大量地制备肠道干细胞样细胞和/或长期维持，而且对于促进向肠道上皮细胞的分化及功能提高也是有用的。以下的发明主要基于以上成果。

〔1〕一种培养来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞的方法，其包含下述工序：将来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞在GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂及血清替代物的存在下、或在GSK-3β抑制剂及血清替代物的存在下进行培养的工序。

〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，GSK-3β抑制剂为CHIR 99021、S B216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、靛玉红(Indi rubin)、Bikinin或1-氮杂坎帕罗酮(1-azakenpaullone)，组蛋白去乙酰化抑制剂为丙戊酸、伏立诺他(Vorinostat)、曲古霉素A(trichostatin A)、tubastatin A、givinostat或pracinostat，血清替代物为基因敲除血清替代物。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自上皮生长因子、TGFβ受体抑制剂及成纤维细胞生长因子中的一种以上的化合物的条件下进行。

〔4〕根据〔3〕所述的方法，其中，TGFβ受体抑制剂为A-83-01，成纤维细胞生长因子为FGF2、FGF4或FGF10。

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自BMP抑制剂、Wnt信号活化剂及Wnt激动剂中的一种以上的化合物的条件下进行。

〔6〕根据〔5〕所述的方法，其中，BMP抑制剂为Noggin，Wnt信号活化剂为R-spondin1，Wnt激动剂为Wnt3a。

〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自烟酰胺、N-乙酰基半胱氨酸、p38抑制剂及ROCK抑制剂中的一种以上的化合物的条件下进行。

〔8〕根据〔7〕所述的方法，其中，p38抑制剂为SB202190，ROCK抑制剂为Y-27632。

〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，人工多能性干细胞为人的人工多能性干细胞。

〔10〕一种制备肠道上皮细胞样细胞的方法，其包含使通过〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法培养的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞的工序。

〔11〕一种肠道上皮细胞样细胞，其是通过〔10〕所述的方法得到的。

〔12〕一种评价受检物质的体内动态或毒性的方法，其使用了〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞。

〔13〕根据〔12〕所述的方法，其中，所述体内动态是代谢、吸收、排泄、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、或药物转运蛋白的诱导。

〔14〕根据〔12〕或〔13〕所述的方法，其包含以下的工序(i)～(iii)：

(i)准备由〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序；

(ii)使受检物质与所述细胞层接触的工序；

(iii)对透过了所述细胞层的受检物质进行定量，对受检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、或毒性进行评价的工序。

〔15〕根据〔12〕或〔13〕所述的方法，其包含以下的工序(I)和(II)：

(I)使受检物质与〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

(II)对受检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、或毒性进行测定、评价的工序。

〔16〕一种评价受检物质的消化道粘膜损伤作用的方法，其包含以下的工序(a)和(b)：

(a)使受检物质与〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

(b)检测所述肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或嗜铬粒蛋白A的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜损伤作用的工序，其中，观察到粘蛋白2或嗜铬粒蛋白A的表达降低为受检物质具有消化道粘膜损伤作用的指标。

〔17〕一种评价受检物质的消化道粘膜保护作用的方法，其包含以下的工序(A)和(B)：

(A)在显示消化道粘膜损伤作用的物质的存在下，使受检物质与〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

(B)检测所述肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或嗜铬粒蛋白A的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜保护作用的工序，其中，观察到由所述物质导致的粘蛋白2或嗜铬粒蛋白A的表达降低的抑制为受检物质具有消化道粘膜保护作用的指标。

〔18〕一种细胞制剂，其包含〔11〕所述的肠道上皮细胞样细胞。

附图说明

图1：从人iPS细胞分化的肠道干细胞的维持培养中的肠道干细胞相关基因的表达。示出了将FGF2添加到培养基中时的结果。对照为从人iPS细胞分化为肠道干细胞的细胞(未传代)。

图2：从人iPS细胞分化的肠道干细胞的维持培养中的肠道干细胞相关基因的表达。示出了将FGF4添加到培养基中时的结果。对照为从人iPS细胞分化为肠道干细胞的细胞(未传代)。

图3：从人iPS细胞分化的肠道干细胞的维持培养中的肠道干细胞相关基因的表达。示出了将FGF10添加到培养基中时的结果。对照为从人iPS细胞分化为肠道干细胞的细胞(未传代)。

图4：从肠道干细胞分化的肠道上皮细胞中的各种标记物基因的mRNA表达量。用平均值±S.D.(n＝3)表示结果。对照为作为肠道干细胞不进行维持培养地进行分化的组。

图5：从肠道干细胞分化的肠道上皮细胞中的粘蛋白2的表达(mRNA水平)及利用了其的分析结果。纵轴是以市售的人小肠细胞(SI)的表达水平为基准(1)的相对值。

Con：对照(在未添加吲哚美辛及瑞巴派特(rebamipide)的培养基中培养的肠道上皮细胞)。

I50：在以浓度50μM添加有吲哚美辛的培养基中培养的肠道上皮细胞。

I200：在以浓度200μM添加有吲哚美辛的培养基中培养的肠道上皮细胞。

R50：在以浓度50μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

R100：在以浓度100μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

R200：在以浓度200μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

I200+R50：在以浓度200μM添加有吲哚美辛、以浓度50μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

I200+R100：在以浓度200μM添加有吲哚美辛、以浓度100μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

I200+R200：在以浓度200μM添加有吲哚美辛、以浓度200μM添加有瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞。

SI：市售的人小肠细胞。

Caco-2：来自人结肠癌的细胞。

图6：从肠道干细胞分化的肠道上皮细胞中的嗜铬粒蛋白A(CgA)的表达(mRNA水平)及利用了其的分析结果。纵轴是以市售的人小肠细胞(SI)的表达水平为基准(1)的相对值。

Con：对照(在未添加吲哚美辛及瑞巴派特的培养基中培养的肠道上皮细胞)。

SI：市售的人小肠细胞。

Caco-2：来自人结肠癌的细胞。

图7：从人iPS细胞分化的肠道干细胞的维持培养中的肠道干细胞相关基因的表达。P0为未传代。n＝1、P：＝传代数、SI：人小肠、C：Caco-2细胞。

图8：从肠道干细胞分化的肠道上皮细胞中的各种标记物基因的mRNA表达量。用平均值±S.D.(n＝3)表示结果。P0是作为肠道干细胞不进行维持培养地进行分化的组。P：传代数、SI：人小肠、C：Caco-2细胞。

图9：从肠道干细胞分化的肠道上皮细胞中的各种标记物基因的mRNA表达量。P：传代数、SI：人小肠、C：Caco-2细胞。对于CYP3A4，未检测到Caco-2中的表达(N.D.)。

具体实施方式

本发明涉及培养来自人工多能性干细胞(iPS细胞)的肠道干细胞样细胞的方法。根据本发明，能够在维持肠道干细胞的性质、即未分化性、增殖能力及向上皮细胞分化的能力的情况下、维持来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞并使其增殖。

1.用语

对本发明中重要的用语的一部分进行说明。“来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞”是通过将iPS细胞分化诱导为肠道上皮细胞系谱而得到的、显示与生物体中的肠道干细胞类似的特征的细胞。当在适当的条件下进一步分化诱导来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞时，可得到与生物体中的肠道上皮细胞类似的细胞(肠道上皮细胞样细胞)。另外，在本说明书中，“分化诱导”是指发挥作用以使其沿着特定的细胞系谱分化。

“人工多能性干细胞(iPS细胞)”是指通过导入初始化因子等对体细胞进行重编程而制作的、具有多能性(多分化能力)和增殖能力的细胞。人工多能性干细胞显示与ES细胞接近的性质。iPS细胞的制作中使用的体细胞没有特别限定，可以是分化的体细胞，也可以是未分化的干细胞。另外，对其来源也没有特别限定，优选使用哺乳动物(例如人或黑猩猩等灵长类、小鼠、大鼠等啮齿类)的体细胞，特别优选使用人的体细胞。iPS细胞可以通过至此为止报告的各种方法来制作。另外，当然可以设想也可以应用今后开发的iPS细胞制作方法。

iPS细胞制作方法的最基本的方法是利用病毒向细胞导入转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc这4个因子的方法(Takahashi K，Yamanaka S：Cell 126(4)，663-676，2006；Takahashi，K，et al：Cell 131(5)，861-72，2007)。对于人iPS细胞，有通过导入Oct4、Sox2、Lin28及Nonog这4个因子而建立的报告(Yu J，et al：Science 318(5858)，1917-1920，2007)。还报告了通过导入除c-Myc以外的3个因子(Nakagawa M，et al：Nat.Biotechnol.26(1)，101-106，2008)、导入Oct 3/4及Klf4这2个因子(Kim J B，et al：Nature 454(7204)，646-650，2008)、或仅导入Oct 3/4(Kim J B，et al：Cell 136(3)，411-419，2009)而建立了iPS细胞。另外，还报告了将基因的表达产物即蛋白导入细胞的方法(Zhou H，Wu S，Joo JY，et al：Cell Stem Cell 4，381-384，2009；Kim D，Kim CH，Moon JI，et al：Cell Stem Cell4，472-476，2009)。另一方面，还存在如下报告：通过使用针对组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294、组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等，能够提高制作效率、降低所导入的因子等(Huangfu D，et al：Nat.Biotechn ol.26(7)，795-797，2008；HuangfuD，et al：Nat.Biotechnol.26(11)，1269-1275，2008；Silva J，et al：PLoS.Biol.6(10)，e253，2008)。关于基因导入方法也进行了研究，除了逆转录病毒以外，还开发了将慢病毒(YuJ，et al：Science 318(5858)，1917-1920，2007)、腺病毒(Stadtfeld M，et al：Science322(5903)，945-949，2008)、质粒(Okita K，et al：Science 322(5903)，949-953，2008)、转座载体(Transposon Vector)(Woltjen K，Michael IP，Mohseni P，et al：Nature 458，766-770，2009；Kaji K，Norrby K，Pac a A，et al：Nature 458，771-775，2009；Yusa K，RadR，Takeda J，et al：Nat Methods 6，363-369，2009)、或附加型载体(Episomal Vector)(YuJ，Hu K，Smuga-Otto K，Tian S，et al：Science 324，797-801，2009)用于基因导入的技术。

发生了向iPS细胞的转化、即初始化(重编程)的细胞可以以Fbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及Cript等多功能性干细胞标记物(未分化标记物)的表达等为指标进行选择。将所选择的细胞作为iPS细胞进行回收。

iPS细胞例如也可以由国立大学法人京都大学或国立研究开发法人理化学研究所生物资源中心提供。

2.来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞的培养

本发明的培养方法的一个方式(以下的说明中有时称为“第1培养方法”)的特征在于，将分化诱导iPS细胞得到的来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞在GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂、以及血清替代物的存在下进行培养。换言之，在本发明中，进行将来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞在GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂和血清替代物的存在下进行培养的工序。

“GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂、以及血清替代物的存在下”与培养基中添加有这些化合物的条件的含义相同。因此，使用添加有这些化合物的培养基来实施培养即可。通过并用这3种成分，可期待维持肠道干细胞的性质、即未分化性、增殖能力及向上皮细胞分化的能力的效果。其中，为了便于说明，将GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂及血清替代物统称为“第1组成分”。

在本发明的另一方式(以下的说明中有时称为“第2培养方法”)中，在省略第1组成分中的组蛋白去乙酰化抑制剂。换言之，其特征在于，在GSK-3β抑制剂和血清替代物的存在下进行培养，成为简化的培养方法。

作为GSK-3β抑制剂，可例示出CHIR 99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、靛玉红(Indirubin)、Bikinin、1-氮杂坎帕罗酮(1-azakenpaullone)。同样地，作为组蛋白去乙酰化抑制剂，可例示出丙戊酸、伏立诺他(Vorinostat)、曲古霉素A(trichostatin A)、tubastatin A、givinostat、pracinostat。另一方面，血清替代物是为了将iPS细胞、ES细胞等在维持其未分化状态的情况下进行培养，作为含有分化诱导因子的血清的替代物而使用的组合物。优选使用基因敲除血清替代物(Knockout serum replacement(KSR))。

若示出GSK-3β抑制剂的添加浓度的例子(CHIR 99021的情况下)，为1μM～100μM，优选为3μM～30μM。在第2培养方法的情况下，2μM～20μM也为优选的添加浓度范围。同样地，若示出组蛋白去乙酰化抑制剂的添加浓度的例子(丙戊酸的情况下)，为0.1mM～10mM，优选为0.5mM～3mM，若示出血清替代物的添加浓度的例子(KSR的情况下)，为5％(v/v)～20％(v/v)、优选为5％(v/v)～10％(v/v)。

从防止活性、增殖率降低等理由出发，根据需要进行培养基更换。例如，可以以24小时～3日1次的频率进行培养基更换。另外，也可以在达到融合或次融合的阶段进行传代。

在优选的一个方式中，在除了上述第1组成分以外、还进一步存在选自上皮生长因子(EGF)、TGFβ受体抑制剂及成纤维细胞生长因子中的一种以上的化合物的条件下实施培养。其中，为了便于说明，将上皮生长因子(EGF)、TGFβ受体抑制剂及成纤维细胞生长因子统称为“第2组成分”。

通过使用上皮生长因子，可以期待促进细胞增殖的效果。同样地，对于TGFβ受体抑制剂，可期待抑制向间质细胞转换和分化诱导因子的效果；对于成纤维细胞生长因子，可期待促进细胞增殖的效果和抑制分化的效果。优选将这些第2组的全部成分并用(与第1组成分一起、合计并用6种成分)。

作为TGFβ受体抑制剂，例如可以使用A-83-01。另外，作为成纤维细胞生长因子，可以采用FGF2、FGF4或FGF10。也可以将这些FGF家族中的2个或3个组合使用。

若示出上皮生长因子的添加浓度的例子，为10ng/mL～500ng/mL，优选为50ng/mL～200ng/mL。同样地，若示出TGFβ受体抑制剂的添加浓度的例子(A-83-01的情况下)，为0.3μM～5μM，优选为0.5μM～3μM，若示出成纤维细胞生长因子的添加浓度的例子(FGF2的情况下)，为5ng/mL～200ng/mL，优选为20ng/mL～50ng/mL。关于第2培养方法时的TGFβ受体抑制剂的添加浓度，0.3μM～3μM(A-83-01的情况下)也为优选的添加浓度范围。

在进一步优选的一个方式中，在进一步存在选自BMP抑制剂、Wnt信号活化剂及Wnt激动剂中的一种以上的化合物的条件下实施培养。其中，为了便于说明，将BMP抑制剂、Wnt信号活化剂及Wnt激动剂统称为“第3组成分”。

通过使用BMP抑制剂，可期待抑制干细胞的分化、维持干细胞性的效果。同样地，对于Wnt信号活化剂，可期待维持干细胞的增殖和干细胞性的效果；对于Wnt激动剂，可期待通过活化Wnt信号维持干细胞的增殖和干细胞性的效果。优选将上述第2组的全部成分和这些第3组的全部成分并用(第1培养方法的情况下，与第1组的成分一起、合计并用9种成分)。

作为BMP抑制剂，例如可以使用Noggin。另外，作为Wnt信号活化剂，例如可以使用R-spondin 1。作为Wnt激动剂，例如可以使用Wnt3a。

若示出BMP抑制剂的添加浓度的例子(Noggin的情况下)，为10ng/mL～500ng/mL，优选为50ng/mL～200ng/mL。同样地，若示出Wnt信号活化剂的添加浓度的例子(R-spondin1的情况下)，为10ng/mL～1000ng/mL，优选为50ng/mL～500ng/mL，若示出Wnt激动剂的添加浓度的例子(Wnt3a的情况下)，为10ng/mL～500ng/mL，优选为50ng/mL～200ng/mL。

在更进一步优选的一个方式中，在进一步存在选自烟酰胺、N-乙酰基半胱氨酸、p38抑制剂及ROCK抑制剂中的一种以上的化合物的条件下实施培养。其中，为了便于说明，将烟酰胺、N-乙酰基半胱氨酸、p38抑制剂及ROCK抑制剂统称为“第4组成分”。

通过使用烟酰胺，可期待维持干细胞性的效果。同样地，对于N-乙酰基半胱氨酸，可期待抑制细胞死亡的效果；对于p38抑制剂，可期待抑制细胞应激、炎症的效果及抑制分化的效果；对于ROCK抑制剂，可期待抑制细胞死亡的效果。在第1培养方法中，优选将上述第2组的全部成分、上述第3组的全部成分和上述第4组的全部成分并用(与第1组成分一起、合计并用13种成分)。在第2培养方法中，优选省略第3组成分，仅将第2组的全部成分和第4组成分中的ROCK抑制剂并用(与第1组的成分(GSK-3β抑制剂和血清替代物)一起、合计并用6种成分)。

作为p38抑制剂，例如可以使用SB202190。另外，作为ROCK抑制剂，例如可以使用Y-27632。

若示出烟酰胺的添加浓度的例子，为0.1mg/mL～5mg/mL，优选为0.5mg/mL～2mg/mL。同样地，若示出N-乙酰基半胱氨酸的添加浓度的例子，为0.1mM～5mM，优选为0.5mM～2mM，若示出p38抑制剂的添加浓度的例子(SB202190的情况下)，为1μM～50mM，优选为5μM～20mM，若示出ROCK抑制剂的添加浓度的例子(Y-27632的情况下)，为1μM～50μM，优选为3μM～30μM。关于第2培养方法时的ROCK抑制剂的添加浓度，1μM～10μM(Y-27632的情况下)也为优选的添加浓度范围。需要说明的是，对于ROCK抑制剂，优选不包含在培养基更换中使用的培养液中。但是，在第2培养方法的情况下，也可以采用在培养基中始终添加有ROCK抑制剂的条件。

其他培养条件(培养温度等)只要是动物细胞的培养中通常采用的条件即可。即，例如可以在37℃、5％CO₂的环境下培养。另外，基础培养基只要能够维持、增殖肠道干细胞样细胞，就没有特别限定。优选使用适于上皮细胞培养的基础培养基(例如D-MEM与HamF12培养基的混合培养基、D-MEM)。作为可添加到培养基中的成分的例子，可举出牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、2-巯基乙醇、PVA、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、转铁蛋白、硒。典型地，使用培养皿等二维地培养细胞。根据本发明的方法，能够通过二维培养从iPS细胞得到肠道上皮细胞样细胞。但是，也可以实施使用了凝胶状的培养基材或三维培养平板等的三维培养。

需要说明的是，培养中或培养后的细胞是否维持所期望的性质，例如可以将肠道干细胞标记物包含富含亮氨酸的重复区的G蛋白共轭受体5(LGR5)、肠道前体细胞标记物SOX9、后肠标记物CDX2的表达为指标来进行判定或评价。

3.来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞的制备

本发明的培养工序中使用的来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞的制备方法没有特别限定。例如，可以按照过去的报告对iPS细胞进行分化诱导，由此制备来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞。以下说明来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞的制备方法的具体例子。该例子的制备方法包含下述工序：使iPS细胞分化为内胚层样细胞的工序(工序(1))、和使得到的内胚层样细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序(工序(2))。需要说明的是，没有特别提及的培养条件只要是动物细胞的培养中通常采用的条件即可。例如，在37℃、5％CO₂的环境下进行培养。另外，作为基础培养基，可以使用Iscove’s Modified Dubecco’s Medium(IMDM)(GIBCO公司等)、HamF12培养基(HamF12)(SIGMA公司、Gibco公司等)、Dubecco’s modifiedEagle medium(D-MEM)(Nacalai Tesque公司、Sigma公司、Gibco公司等)、Glasgow's基础培养基(Gibco公司等)、RPMI1640培养基等。也可以将两种以上的基础培养基并用。在工序(2)中，优选使用适于上皮细胞培养的基础培养基(例如D-MEM与HamF12培养基的混合培养基、D-MEM)。另外，作为可添加到培养基中的成分的例子，可举出牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、2-巯基乙醇、PVA、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、转铁蛋白、硒。

＜工序(1)向内胚层样细胞的分化＞

在该工序中，对iPS细胞进行培养，使其分化为内胚层样细胞。换言之，在诱导向内胚层样细胞分化的条件下对iPS细胞进行培养。只要iPS细胞可分化为内胚层样细胞，则培养条件没有特别限定。例如，按照常规方法，用添加有激活素A的培养基进行培养。此时，使培养基中的激活素A的浓度例如为10ng/mL～200ng/mL，优选为20ng/mL～150ng/mL。从细胞的增殖率和维持等观点出发，优选在培养基中添加血清或血清替代物(Knockout serumreplacement(KSR)等)。血清不限于胎牛血清，也可以使用人血清、羊血清等。血清或血清替代物的添加量例如为0.1％(v/v)～10％(v/v)。

也可以向培养基中添加Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂(例如六氯酚、槲皮素(quercetin)、Wnt配体Wnt3a)，谋求向内胚层样细胞分化的促进。

在优选的一个方式中，作为工序(1)，进行2阶段的培养。在第1阶段的培养中，用添加有较低浓度的血清(例如0.1％(v/v)～1％(v/v))的培养基进行，在接下来的第2阶段的培养中，用与第一阶段的培养相比提高了血清浓度的培养基(血清浓度例如为1％(v/v)～10％(v/v))进行。这样采用2阶段的培养从通过第1阶段的培养抑制未分化细胞的增殖、通过接下来的第2阶段使分化的细胞增殖的角度出发是优选的。

工序(1)的期间(培养期间)例如为1天～10天，优选为2天～7天。在作为工序(1)采用2阶段的培养的情况下，将第1阶段的培养期间设为例如1天～7天，优选设为2天～5天，将第2阶段的培养期间设为例如1天～6天，优选设为1天～4天。

＜工序(2)向肠道干细胞样细胞的分化＞

在该工序中，对工序(1)中得到的内胚层样细胞进行培养，使其分化为肠道干细胞样细胞。换言之，在诱导向肠道干细胞样细胞分化的条件下对内胚层细胞进行培养。只要内胚层样细胞可分化为肠道干细胞样细胞，则培养条件没有特别限定。优选在FGF2(成纤维细胞生长因子2)的存在下进行培养。优选使用人FGF2(例如人重组FGF2)。

典型地，将经过工序(1)得到的细胞团或其一部分不进行筛选地供于工序(2)。另一方面，也可以在从经过工序(1)得到的细胞团中筛选内胚层样细胞之后实施工序(2)。内胚层样细胞的筛选例如可以以细胞表面标志物为指标、用流式细胞仪(细胞筛选仪)进行。

“FGF2的存在下”与培养基中添加有FGF2的条件的含义相同。因此，为了在FGF2的存在下进行培养，可以使用添加有FGF2的培养基。若示出FGF2的添加浓度的例子，为100ng/mL～500ng/mL。

工序(2)的期间(培养期间)例如为2天～10天，优选为3天～7天。若该培养期间过短，则无法充分得到所期待的效果(分化效率的上升、促进获得作为肠道干细胞的功能)。另一方面，若该培养期间过长，则会引起分化效率的降低。

分化为肠道干细胞样细胞例如可通过以肠道干细胞标记物的表达为指标进行判定或评价。若举出肠道干细胞标记物的例子，为包含富含亮氨酸的重复区的G蛋白共轭受体5(LGR5)、Ephrin-B2受体(EphB2)。

4.肠道上皮细胞样细胞的制备

本发明的第2方面涉及由通过本发明的培养方法培养的肠道干细胞样细胞制备肠道上皮细胞样细胞的方法。本发明的制备方法的特征在于，使通过本发明的培养方法培养的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞。换言之，在本发明的制备方法中，进行使通过本发明的培养方法培养的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞的工序(分化工序)。只要能够使肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞，就不特别限定该工序的操作、条件等。以下，示出优选的分化工序的具体例子(例子1、例子2)。在以下的例子1和例子2中，没有特别提及的培养条件为在动物细胞的培养中通常采用的条件即可。例如，在37℃、5％CO₂的环境下进行培养，基础培养基优选使用适于上皮细胞培养的基础培养基(例如D-MEM与HamF12培养基的混合培养基、D-MEM)。另外，作为可添加到培养基中的成分的例子，可举出牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、2-巯基乙醇、PVA、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、转铁蛋白、硒。

另外，分化为肠道上皮细胞样细胞例如可以将肠道上皮细胞标记物、药代动力学相关基因的表达、肽的摄入、或者经由维生素D受体的药物代谢酶的表达诱导作为指标来进行判定或评价。若举出肠道上皮细胞标记物以及药代动力学相关基因的例子，为Villin 1、蔗糖酶-异麦芽糖酶、SLC(solute carrier，可溶性载体)有机阴离子转运蛋白2B1(SLCO2B1/OATP2B1)，SLC(solute carrier)家族成员15A1/肽转运蛋白1(SLC15A1/PEPT1)，SLC(solute carrier)家族成员46A1/质子共轭叶酸转运蛋白(SLC46A1/PCFT)、ATP结合盒转运蛋白B1/多药抗性蛋白1(ABCB1/MDR1)，ATP结合盒转运蛋白G2/乳腺癌耐受蛋白(ABCG2/BCRP)、尾侧型同源盒转录因子2(CDX2)、二肽基肽酶4(DPP4)、孕烷X受体(PXR)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A4(UGT1A4)。其中，肠道上皮特异性高的蔗糖酶-异麦芽糖酶及Villin 1、与小肠中的肽的吸收相关的SLC5A1/PEPT1、与小肠中的有机阴离子的吸收相关的SLCO2B1/OATP2B1是特别有效的标志物。

4-1.分化工序的例子1

在该例子中，在选自MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂中的一种以上的化合物(以下也称为“第1诱导因子”)和EGF(以下也称为“第2诱导因子”)的存在下进行培养，使肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞。典型地，将通过应用本发明的培养方法得到的细胞团或其一部分不进行筛选地供于分化工序。另一方面，也可以在从通过应用本发明的培养方法得到的细胞团中筛选肠道干细胞样细胞之后实施分化工序。肠道干细胞样细胞的筛选可以例如以细胞表面标志物为指标、用流式细胞仪(细胞筛选仪)进行。

在选自MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂中的一种以上的化合物(第1诱导因子)与EGF(第2诱导因子)的存在下与培养基中添加有第1诱导因子和第2诱导因子的条件的含义相同。因此，为了在第1诱导因子和第2诱导因子的存在下进行培养，可以使用添加有第1诱导因子和第2诱导因子的培养基。

作为MEK1抑制剂，可举出PD98059、PD184352、PD184161、PD0325901、U0126、MEK抑制剂I、MEK抑制剂II、MEK1/2抑制剂II、SL327。同样地，作为DNA甲基化抑制剂，可举出5-氮杂-2’-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、RG108、泽布拉林(Zebularine)。关于TGFβ受体抑制剂，若考虑A-83-01显示出对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7的抑制活性的实验结果，优选使用对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7中的一个以上显示抑制活性的物质。例如A-83-01、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5抑制剂、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSox满足该条件。

若示出MEK1抑制剂的添加浓度的例子(PD98059的情况下)，为4μM～100μM，优选为10～40μM。同样地，若示出甲基化抑制剂的添加浓度的例子(5-氮杂-2’-脱氧胞苷的情况下)，为1μM～25μM，优选为2.5μM～10μM，若示出TGFβ受体抑制剂的添加浓度的例子(A-83-01的情况下)，为0.1μM～2.5μM、优选为0.2μM～1μM。

在一个优选方式中，作为第1诱导因子，将MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂中的两种以上并用。通过并用不同的两种以上的第1诱导因子，可获得相加或协同的效果，可促进向肠道上皮的分化。最优选将全部(即3种)的第1诱导因子并用。

该工序的期间(培养期间)例如为7天～30天，优选为10天～20天。若该培养期间过短，则无法充分得到所期待的效果(分化效率的上升、促进获得作为肠道上皮细胞的功能)。另一方面，若该培养期间过长，则会引起分化效率的降低。

在优选的一个方式中，作为该工序，将通过应用2阶段的培养、即本发明的培养方法得到的肠道干细胞样细胞在GSK抑制剂(例如GSK3iXV)和/或BMP抑制剂(例如Dorsomorphin)和EGF的存在下进行培养的工序(分化工序1)、和随之的在选自MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂中的一种以上的化合物(第1诱导因子)和EGF(第2诱导因子)的存在下进行培养的工序(分化工序2)。因此，在该方式中，在使用第1诱导因子和第2诱导因子进行培养前，在GSK抑制剂和/或BMP抑制剂的存在下进行培养。在GSK抑制剂和/或BMP抑制剂的存在下进行培养的主要目的是为了促进肠道干细胞的增殖。

在进行分化工序1和分化工序2的情况下，分化工序1的培养期间例如为3天～14天，优选为4天～10天，分化工序2的培养期间例如为3天～21天，优选为5天～15天。

在各工序中，也可以在中途进行传代培养。例如，在达到融合或次融合时采集细胞的一部分并转移到另一培养容器中，继续培养。为了促进分化，优选将细胞密度设定得较低。例如可以以1×10⁴个/cm²～1×10⁶个/cm²左右的细胞密度接种细胞。

在伴有培养基更换或传代培养等的细胞的回收时，为了抑制细胞死亡，可以用Y-27632等ROCK抑制剂(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coilforming kinase)/Rho结合激酶)预先对细胞进行处理。

当想要得到仅由目标细胞(肠道上皮细胞样细胞)构成的细胞团或以高比率(高纯度)含有目标细胞的细胞团时，可以将目标细胞特征性的细胞表面标记物作为指标来筛选、分取培养后的细胞团。

4-2.分化工序的例子2

在该例子中，在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下(以下将该条件称为“第1条件”)、且在cAMP被供给至细胞的条件下(以下将该条件称为“第2条件”)进行培养，使通过应用本发明的培养方法得到的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞。典型地，将通过应用本发明的培养方法得到的细胞团或其一部分不进行筛选地供于分化工序。另一方面，也可以在从通过应用本发明的培养方法得到的细胞团中筛选肠道干细胞样细胞之后实施分化工序。肠道干细胞样细胞的筛选例如可以以细胞表面标志物为指标、用流式细胞仪(细胞筛选仪)进行。

第1条件、即在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下与培养基中添加有这些化合物的条件的含义相同。因此，为了满足第1条件，可以使用添加有这些化合物的培养基。

若示出MEK1抑制剂的添加浓度的例子(PD98059的情况下)，为4μM～100μM，优选为10～40μM。同样地，若示出甲基化抑制剂的添加浓度的例子(5-氮杂-2’-脱氧胞苷的情况下)，为1μM～25μM，优选为2.5μM～10μM，若示出TGFβ受体抑制剂的添加浓度的例子(A-83-01的情况下)，为0.1μM～2.5μM、优选为0.2μM～1μM。需要说明的是，对于使用与例示的化合物、即PD98059、5-氮杂-2’-脱氧胞苷和A-83-01不同的化合物时的添加浓度，只要考虑所使用的化合物的特性与例示的化合物(PD98059、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、A-83-01)的特性的差异(特别是活性的差异)，本领域技术人员即可根据上述浓度范围进行设定。另外，所设定的浓度范围是否适当可通过预备实验来确认。

第2条件、即cAMP被供给至细胞的条件的条件与能够摄入到细胞内的化合物、即当被摄入到细胞内时作为cAMP发挥作用的化合物存在的条件的含义相同。因此，为了满足第2条件，例如可以使用添加有能够摄入到细胞内的cAMP衍生物的培养基。作为cAMP衍生物，可以采用PKA活性剂(例如8-Br-cAMP((8-溴腺苷-3′,5′-环单磷酸腺苷钠盐，CAS Number：76939-46-3))、6-Bnz-cAMP(N6-苯甲酰腺苷-3',5'-环单磷酸钠盐，CAS Number：1135306-29-4)、cAMPS-Rp((R)-腺苷,环3',5'-(氢化硫代磷酸酯)三乙基铵盐，CAS Number：151837-09-1)、cAMPS-Sp(((S)-腺苷,环3',5'-(氢化硫代磷酸酯)三乙基铵盐，CAS Number：93602-66-5)、cAMPS-cAMP((N6，O2'-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐，CAS Number：16980-89-5)、8-Cl-cAMP(8-氯代腺苷-3',5'-环单磷酸盐，CAS Number：124705-03-9))、Epac活性剂(8-pCPT-2'-O-Me-cAMP((8-溴代腺苷3',5'-环单硫代磷酸，Rp-同分异构体钠盐，CAS Number：129735-00-8)、8-CPT-cAMP(8-(4-氯代苯硫基)腺苷3',5'-环单磷酸，CAS Number：93882-12-3)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-氯代苯硫基)-2'-O-甲基腺苷3'，5'-环单磷酸单钠盐，CAS Number：634207-53-7)等)。若示出cAMP衍生物的添加浓度的例子(8-Br-cAMP的情况下)，为0.1mM～10mM、优选为0.2mM～5mM、进一步优选为0.5mM～2mM。另外，对于使用与例示的化合物、即8-Br-cAMP不同的化合物时的添加浓度，只要考虑所使用的化合物的特性与例示的化合物(8-Br-cAMP)的特性的差异(特别是活性的差异)，本领域技术人员即可根据上述浓度范围进行设定。另外，所设定的浓度范围是否适当可通过预备实验来确认。

该工序的期间(培养期间)例如为7天～40天，优选为10天～30天。若该培养期间过短，则无法充分得到所期待的效果(分化效率的上升、促进获得作为肠道上皮细胞的功能)。另一方面，若该培养期间过长，则会引起分化效率的降低。

优选作为分化工序，进行以下的A～C中的任一个培养工序。

＜培养工序A＞

在培养工序A中，进行(a-1)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养、和后续于该培养的(a-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下、且在cAMP被供给至细胞的条件下的培养。即，进行有无cAMP被供给至细胞的条件不同的2个阶段的培养。这样，可得到促进向肠道上皮细胞分化、成熟化、功能获得的效果。(a-1)的培养期间例如为1天～5天。同样地，(a-2)的培养期间例如为3天～15天。其中，对于没有特别说明的事项(各培养中可使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，可援用上述对应的说明。

(a-2)的培养也可以在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF之外还存在cAMP分解酶抑制剂的条件下进行。当采用该条件时，可期待通过cAMP的分解抑制，抑制细胞内cAMP浓度的降低，促进向肠道上皮的分化诱导、特别是获得作为肠道上皮细胞的功能。即，该条件有利于进一步制备功能性的肠道上皮细胞样细胞。作为cAMP分解酶抑制剂，可例示出IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)(MIX)、茶碱(Theophylline)、罂粟碱(Papaverine)、己酮可可碱(Pentoxifylline)(Trental)、KS-505、8-甲氧基甲基-IBMX、长春西汀(Vinpocetine，TCV-3B)、EHNA、曲喹辛(Trequinsin，HL-725)、利沙齐农(Lixazinone，RS-82856)、(LY-186126)、西洛酰胺(Cilostamide，OPC3689)、贝莫拉旦(Bemoradan，RWJ-22867)、Anergrelide(BL4162A)、吲哚利旦(Indolidan，LY195115)、西洛他唑(Cilostazol，OPC-13013)、米力农(Milrinone，WIN47203)、氰胍佐旦(Siguazodan，SKF-94836)、5-甲基-咪苯嗪酮(CI 930)、SKF-95654、Pirilobendan(UD-CG 115BS)、依诺昔酮(Enoximone，MDL 17043)、咪苯嗪酮(Imazodan，CL 914)、SKF-94120、维司力农(Vesnarinone，OPC 8212)、咯利普兰(Rolipram，Ro-20-1724)、(ZK-62711)、登布茶碱(Denbufylline)、敏喘宁(Zaprinast，M&B-22，948)、双嘧达莫(Dipyridamole)、敏喘宁(Zaprinast，M&B-22，948)、双嘧达莫(Dipyridamole)、扎达维林(Zardaverine)、AH-21-132、苏马佐(Sulmazol，AR-L 115BS)。若示出cAMP分解酶抑制剂的添加浓度的例子(IBMX的情况下)，为0.05mM～5mM，优选为0.1mM～3mM，进一步优选为0.2mM～1mM。另外，对于使用与例示的化合物、即IBMX不同的化合物时的添加浓度，只要考虑所使用的化合物的特性与例示的化合物(IBMX)的特性的差异(特别是活性的差异)，本领域技术人员即可根据上述浓度范围进行设定。另外，所设定的浓度范围是否适当可通过预备实验来确认。

(a-2)的培养后，还可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((a-3)的培养)。该培养的期间例如为1天～10天。当进行该培养时，可得到促进向肠道上皮细胞的分化、成熟化、功能获得的效果。

＜培养工序B＞

在培养工序B中，进行(b-1)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下、且在cAMP被供给至细胞的条件下的培养、和继该培养之后的(b-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF以及cAMP分解酶抑制剂的存在下的培养。这样，在cAMP被供给至细胞的条件下进行培养后，如果在cAMP分解酶抑制剂存在的条件下进行培养，则可得到促进向肠道上皮细胞的分化、成熟化、功能获得的效果。(b-1)的培养期间例如为3天～15天。同样地，(b-2)的培养期间例如为3天～15天。另外，对于没有特别说明的事项(各培养中可使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，可援用上述对应的说明。

(b-1)的培养也可以在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF之外还存在cAMP分解酶抑制剂的条件下进行。当采用该条件时，可期待从早期阶段抑制细胞内cAMP浓度的降低、促进向肠道上皮的分化诱导、特别是获得作为肠道上皮细胞的功能。即，该条件有利于进一步制备功能性的肠道上皮细胞样细胞。

(b-2)的培养后，还可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((b-3)的培养)。该培养的期间例如为1天～10天。当进行该培养时，可得到促进向肠道上皮细胞的分化、成熟化、功能获得的效果。

＜培养工序C＞

在培养工序C中，进行(c-1)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下、且在cAMP被供给至细胞的条件下的培养。(c-1)的培养期间例如为3天～15天。其中，对于没有特别说明的事项(各培养中可使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，可援用上述对应的说明。

(c-1)的培养也可以在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF之外还存在cAMP分解酶抑制剂的条件(也并用cAMP被供给至细胞的条件)下进行。当采用该条件时，可期待能够在将cAMP供给至细胞的同时抑制细胞内cAMP浓度的降低。因此，是为了将细胞内cAMP维持在高水平的有效条件，可期待促进向肠道上皮细胞的高效的分化诱导。

(c-1)的培养后，还可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((c-2)的培养)。该培养的期间例如为1天～10天。当进行该培养时，可得到促进向肠道上皮细胞的分化、成熟化、功能获得的效果。

在构成本发明的各工序中，也可以在中途进行传代培养。例如，在达到融合或次融合时采集细胞的一部分并转移到另一培养容器中，继续培养。为了促进分化，优选将细胞密度设定得较低。例如可以以1×10⁴个/cm²～1×10⁶个/cm²左右的细胞密度接种细胞。

5.肠道上皮细胞样细胞的用途

本发明的又一方面涉及肠道上皮细胞样细胞的用途。作为第1用途，提供各种分析。本发明的肠道上皮细胞样细胞可用于肠道、特别是小肠的模型系，对肠道、特别是小肠中的药代动力学(吸收、代谢等)的评价、毒性的评价是有用的。换言之，本发明的肠道上皮细胞样细胞可用于化合物的体内动态的评价、毒性的评价。

具体而言，可以使用本发明的肠道上皮细胞样细胞对受检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、毒性等进行试验。即，本发明作为肠道上皮细胞样细胞的用途之一，提供对受检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、毒性等进行评价的方法(第1方式)。在该方法中，进行下述工序：(i)准备由通过本发明的分化诱导方法得到的肠道上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序、(ii)使受检物质与所述细胞层接触的工序、和(iii)对透过了所述细胞层的受检物质进行定量，对受检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、或毒性进行评价的工序。另外，关于受检物质的吸收性，也可以通过后述的方法(第2方式)进行评价。

在工序(i)中，典型地，在半透过性膜(多孔性膜)上培养肠道上皮细胞样细胞，使其形成细胞层。具体而言，例如，通过使用具备插入式培养器的培养容器(例如Corning公司所提供的Transwell(注册商标))，将细胞接种到插入式培养器内进行培养，得到由肠道上皮细胞样细胞构成的细胞层。

工序(ii)中的“接触”典型的是通过向培养基中添加受检物质来进行。受检物质的添加时机没有特别限定。因此，可以在不含受检物质的培养基中开始培养后，在某一时刻添加受检物质，也可以在预先含有受检物质的培养基中开始培养。

受检物质可以使用各种分子尺寸的有机化合物或无机化合物。作为有机化合物的例子，可举出核酸、肽、蛋白、脂质(单纯脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、鞘脂、糖基甘油酯、脑苷酯等)、前列腺素、类异戊二烯、萜烯、类固醇、多酚、儿茶素、维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等)。药品、营养食品、食品添加物、农药、香妆品(化妆品)等现有成分或候选成分也是优选的受检物质之一。也可以将植物提取液、细胞提取液、培养上清液等用作受检物质。通过同时添加2种以上的受检物质，可以研究受检物质间的相互作用、协同作用等。受检物质可以来自天然物，或者也可以是通过合成得到的物质。在后者的情况下，例如可以利用组合合成的方法来构建高效的分析系统。

使受检物质接触的期间可以任意地设定。接触期间例如为10分钟～3天，优选为1小时～1天。也可以分多次进行接触。

在工序(iii)中，对透过细胞层的受检物质进行定量。例如，在使用具备如Transwell(注册商标)那样的插入式培养器的培养容器的情况下，将透过了插入式培养器的受检物质、即经由细胞层移动到上部或下部容器内的受检物质根据受检物质通过质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等测定方法进行定量。基于定量结果(透过细胞层的受检物质的量)和受检物质的使用量(典型的是向培养基的添加量)，对受检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导或毒性进行判定、评价。

本发明作为另一方式(第2方式)，还提供一种评价受检物质的代谢或吸收的方法。在该方法中，进行下述工序：(I)使受检物质与通过本发明的分化诱导方法得到的肠道上皮细胞样细胞接触的工序、和(II)对受检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、或毒性进行测定、评价的工序。

工序(I)、即肠道上皮细胞样细胞与受检物质的接触可以与上述工序(ii)同样地实施。但是，不需要预先形成细胞层。

工序(I)后，对受检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导或毒性进行测定、评价(工序(II))。也可以在紧接着工序(I)之后、即受检物质接触之后，不隔着实质性的时间间隔地对代谢等进行测定、评价，或者，也可以在经过一定时间(例如10分钟～5小时)后对代谢等进行测定、评价。代谢的测定例如可以通过代谢产物的检测来进行。此时，通常将工序(I)后的培养液作为样品，定性或定量地测定预想的代谢产物。测定方法可以根据代谢产物选择适当的方法，例如可以采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。

典型地，在检测到受检物质的代谢产物时，判定或评价为“受检物质被代谢”。另外，可以根据代谢产物的量来评价受检物质的代谢量。基于代谢产物的检测结果和受检物质的使用量(典型的是向培养基的添加量)，也可以计算受检物质的代谢效率。

也可以将肠道上皮细胞样细胞中的药物代谢酶(细胞色素P450(特别是CYP3A4)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(特别是UGT1A8、UGT1A10)、硫酸转移酶(特别是SULT1A3等))的表达作为指标来测定受检物质的代谢。药物代谢酶的表达可以在mRNA水平或蛋白水平进行评价。例如，在药物代谢酶的mRNA水平确认到上升时，可以判定为“受检物质被代谢”。同样地，在确认到药物代谢酶的活性上升时，可以判定为“受检物质被代谢”。与将代谢产物作为指标进行判定的情况同样地，可以基于药物代谢酶的表达量进行定量的判定、评价。

为了评价受检物质的吸收，例如测定培养液中的受检物质的残留量。通常，将工序(I)后的培养液作为样品，对受检物质进行定量。测定方法可以根据受检物质选择适当的方法。例如，可以采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。典型地，在确认到培养液中的受检物质的含量降低时，判定、评价为“受检物质被吸收”。另外，可以根据降低的程度来判定、评价受检物质的吸收量或吸收效率。另外，通过测定被摄入到细胞内的受检物质的量，还可以进行吸收的评价。

另外，可以同时或并行地进行代谢的测定、评价和吸收的测定、评价。

如后述的实施例所示，判明：在通过本发明的方法制备的来自人工多能性干细胞的肠道上皮细胞样细胞中，在人小肠上皮细胞中可见高表达的粘蛋白2及嗜铬粒蛋白A(CgA)以作为小肠的模型系而经常使用的Caco-2细胞(来自人结肠癌的细胞)无法相比的水平高表达。该事实证实了，该细胞作为小肠的模型系的利用价值极高，并且作为使用了该细胞的分析的指标，粘蛋白2和CgA的表达是有用的。因此，本发明作为使用了肠道上皮细胞样细胞的分析的另一方式(第3方式)，提供以粘蛋白2或CgA的表达为指标的两个评价方法、即对受检物质的消化道粘膜损伤作用进行评价的方法(第3方式。以下，有时简称为“损伤作用评价法”)和对受检物质的消化道粘膜保护作用进行评价的方法(第4方式。以下，有时简称为“保护作用评价法”)。其中，本发明的损伤作用评价法对于作为副作用有可能引起粘膜损伤(溃疡)的药物的预测(副作用风险的预测)特别有用，本发明的保护作用评价法对于具有抑制这样的副作用或应激性溃疡的作用的新型药物的筛选特别有用。

在本发明的损伤作用评价法(第3方式)中，进行下述工序：(a)使受检物质与通过本发明的分化诱导方法得到的肠道上皮细胞样细胞接触的工序，和(b)检测所述肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或CgA的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜损伤作用的工序，其中，确认到粘蛋白2或CgA的表达降低为受检物质具有消化道粘膜损伤作用的指标。

工序(a)、即肠道上皮细胞样细胞与受检物质的接触可以与上述方式(第1方式、第2方式)同样地实施。但是，不需要预先形成细胞层。关于可使用的受检物质，也与上述的方式(第1方式及第2方式)相同，因此省略其说明。

在接着工序(a)的工序(b)中，检测肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或CgA的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜损伤作用。即，在本发明中，利用粘蛋白2或CgA的表达来判定受检物质的消化道粘膜损伤作用。更具体而言，确认到粘蛋白2或CgA的表达降低作为受检物质具有消化道粘膜损伤作用的指标使用。因此，确认到粘蛋白2或CgA的表达降低时，判定为受检物质具有消化道粘膜损伤作用，未确认到粘蛋白2或CgA的表达降低时，判定为受检物质不具有消化道粘膜损伤作用。也可以基于粘蛋白2或CgA的表达降低的程度(水平)来确定消化道粘膜损伤作用的强弱(程度)。另外，在使用了多个受检物质的情况下，也可以基于粘蛋白2或CgA的表达降低的程度(水平)，对各受检物质的消化道粘膜损伤作用的强弱进行比较评价。

粘蛋白2和CgA都是分泌蛋白。已知粘蛋白2是与肠道粘膜的保护相关的粘膜质，粘蛋白2的质量或量的降低诱发溃疡性结肠炎或癌症。另一方面，CgA是通过自主神经兴趣而分泌的物质，已知血中浓度在临床化学上作为肿瘤标志物之一而被熟知，另外，近年来，唾液的CgA浓度作为应激的指标受到关注(豊田中央研究所R&DレビューVol.34No.3，17-22(1999.9)、高知女子大学看護学会誌VOL.40，NO.1，pp24-30 2014等)。

粘蛋白2及CgA的表达例如可以根据常规方法进行检测。作为粘蛋白2及CgA的检测方法，可例示出RT-PCR法、实时PCR法(mRNA的测定/定量)、荧光免疫测定法(FIA法)或酶免疫测定法(EIA法)等免疫学方法、质谱分析法等。关于CgA，也有检测用试剂或试剂盒(例如株式会社失内原研究所提供的YK070Human Chromogranin A)，也可以利用它们。

通常，作为比较对照，准备不与受检物质接触的肠道上皮细胞样细胞(其他条件相同)(以下称为“对照”)，也检测其粘蛋白2或CgA的表达。然后，通过与该对照的表达水平进行比较，判断受检物质是否使粘蛋白2或CgA的表达降低。如果像这样通过与对照的比较来判定受检物质的消化道粘膜损伤作用，则能够得到可靠性更高的判定结果。

在本发明的保护作用评价法(第4方式)中，进行下述工序：(A)在显示消化道粘膜损伤作用的物质的存在下，使受检物质与通过本发明的分化诱导方法得到的肠道上皮细胞样细胞接触的工序，和(B)检测所述肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或CgA的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜保护作用的工序，其中，确认到由上述物质引起的粘蛋白2或CgA的表达降低的抑制为受检物质具有消化道粘膜保护作用的指标。

在工序(A)中，在显示消化道粘膜损伤作用的物质(以下称为“粘膜损伤剂”)的存在下，进行肠道上皮细胞样细胞与受检物质的接触。肠道上皮细胞样细胞与受检物质的接触可以与上述方式(第3方式)同样地实施，典型地，在粘膜损伤剂和受检物质的存在下(即，在培养基中添加有这两者的状态)下对肠道上皮细胞样细胞进行培养。对粘膜损伤剂和受检物质的添加时机没有特别限定。因此，例如可以在不含粘膜损伤物和受检物质的培养基中开始培养后，在某一时刻添加粘膜损伤物和受检物质，也可以在预先含有粘膜损伤剂和受检物质的培养基中开始培养。另外，粘膜损伤剂和受检物质的添加顺序没有特别限定。即，可以是先添加前者、先添加后者、同时添加两者中的任一种。

可以采用通过降低粘蛋白2和/或CgA的表达来损伤消化道粘膜的各种物质作为本发明中的粘膜损伤剂。若举出可用作粘膜损伤剂的物质的例子，为吲哚美辛、阿司匹林、酮洛芬、布洛芬等。粘膜损伤剂的使用量(添加浓度)可以参考与所使用的粘膜损伤剂的作用相关的过去的报告等，或者通过预备实验来设定。也可以并用两种以上的物质。另外，关于可使用的受检物质，与上述的方式(第1方式以及第2方式)相同，因此省略其说明。

在接着工序(A)的工序(B)中，检测肠道上皮细胞样细胞中的粘蛋白2或CgA的表达，基于检测结果判定受检物质的消化道粘膜保护作用。即，在本发明中，利用粘蛋白2或CgA的表达来判定受检物质的消化道粘膜保护作用。更具体而言，确认到由粘膜损伤剂导致的粘蛋白2或CgA的表达降低的抑制作为受检物质具有消化道粘膜保护作用的指标使用。因此，在抑制了由粘膜损伤剂导致的粘蛋白2或CgA的表达降低的情况下，判定为受检物质具有消化道粘膜保护作用，在不抑制由粘膜损伤剂导致的粘蛋白2或CgA的表达降低的情况下，判定为受检物质不具有消化道粘膜保护作用。基于抑制了粘蛋白2或CgA的表达降低的程度(水平)，可以确定消化道粘膜保护作用的强弱(程度)。另外，在使用了多个受检物质的情况下，基于抑制了粘蛋白2或CgA的表达降低的程度(水平)，也可以对各受检物质的消化道粘膜保护作用的强弱进行比较评价。

与上述方式(第3方式)同样，为了得到可靠性更高的判定结果，优选设置比较对照(对照)，通过与对照比较来判定受检物质的消化道粘膜保护作用。作为该情况下的对照，可以使用在不存在粘膜损伤剂的条件下接触了受检物质的肠道上皮细胞样细胞和/或不与受检物质接触的肠道上皮细胞样细胞(粘膜损伤剂存在下)。

如上所述，该方式(第4方式)的评价法对于具有抑制作为药物的副作用的粘膜损伤或应激性溃疡的作用的新型药物的筛选特别有用。在将本发明的评价法用于筛选的情况下，基于工序(B)中的判定结果选择有效的受检物质。在所选择的物质具有充分的药效的情况下，可以将该物质直接用作肠道粘膜保护药的有效成分。另一方面，在不具有充分的药效的情况下，可以在实施化学修饰等改性来提高其药效后，作为肠道粘膜保护药的有效成分使用。当然，即使在具有充分的药效的情况下，也可以为了进一步增大药效而实施同样的改性。

作为通过本发明的分化诱导方法制备的肠道上皮细胞样细胞的第2用途，提供含有肠道上皮细胞样细胞的细胞制剂。本发明的细胞制剂可应用于各种肠疾病的治疗。特别是，设想作为受损伤的(包含功能不全的)肠道上皮组织的再生、重建用的材料的用途。即，可期待对再生医疗的贡献。本发明的细胞制剂例如可以通过如下来制备：将通过本发明的方法得到的肠道上皮细胞样细胞悬浮在生理盐水或缓冲液(例如磷酸系缓冲液)等中，或者使用该细胞制作三维组织体(类器官(organoid)或球形聚集体(sphe roid))。为了能够给药治疗上有效量的细胞，作为一次给药量的量，例如可以含有1×10⁵个～1×10¹⁰个细胞。细胞的含量可以考虑使用目的、对象疾病、适用对象(受体)的性别、年龄、体重、患部的状态、细胞的状态等来适当调整。

为了保护细胞，本发明的细胞制剂中可以含有二甲基亚砜(DMSO)、血清白蛋白等，为了阻止细菌的混入，本发明的细胞制剂中可以含有抗生素等，为了细胞的活化、增殖或分化诱导等，本发明的细胞制剂中可以含有各种成分(维生素类、细胞因子、生长因子、类固醇等)。此外，本发明的细胞制剂中还可以含有制剂上容许的其他成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。

实施例

A.来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞的新型培养方法的开发

以建立能够在维持肠道干细胞的性质的情况下维持来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞并使其增殖的培养方法为目标，进行了以下的研究。

1.方法

(1)细胞

人iPS细胞(iPS-51：Windy)是通过使用泛嗜性逆转录病毒载体将八聚体结合蛋白(octamer binding protein 3/4，OCT3/4)、性别决定区Y-盒2(sex determining regionY-box 2，SOX2)、kruppel样因子4(kruppel-like factor 4，KLF4)、v-myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(avian)(v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-MYC)导入人胎儿肺成纤维细胞MRC-5后，对人ES细胞样集落进行克隆化而得到的，其由国立成育医疗研究中心梅泽明弘博士提供。饲养细胞使用了小鼠胎鼠成纤维细胞(MEF)。

(2)培养基

MEF的培养使用含有10％的胎牛血清(FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-Glu)、1％非必需氨基酸(NEAA)、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的Dubecco’s modified Eaglemedium(DMEM)。MEF的剥离液使用0.05％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)，MEF的保存液使用CELLBANKER-1。人iPS细胞的维持培养使用含有20％的基因敲除血清替代物(KSR)、0.8％NEAA、2mmol/L L-Glu、0.1mmol/L 2-巯基乙醇(2-MeE)、5ng/mL成纤维细胞生长因子(FGF)2的DMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)。人iPS细胞的剥离液使用含有1mg/mL胶原酶IV、0.25％胰蛋白酶、20％KSR、1mmol/L氯化钙的Dubecco’s磷酸缓冲生理盐水(PBS)。人iPS细胞的保存液使用灵长类ES/iPS细胞用冷冻保存液。

(3)人iPS细胞的培养

将人iPS细胞接种于实施了丝裂霉素C处理的MEF(5×10⁵cells/100mm培养皿)上，在5％CO₂/95％air条件下、在CO₂培养箱内以37℃培养。人iPS细胞的传代在3～5天培养后、以1∶2～1∶3的分流比进行。人iPS细胞在解冻48小时后更换培养基，之后每天更换。

(4)人iPS细胞向肠道干细胞的分化

人iPS细胞向肠道干细胞的分化是在人iPS细胞的未分化集落在培养皿中所占的比例达到约70％的状态时开始的。通过用含有0.5％FBS、100ng/mL激活素A、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的Roswell Park纪念研究所(RPMI)+GlutaMAX培养基培养2天，用含有2％FBS、100ng/mL激活素A、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的RPMI+GlutaMAX培养基培养1天，使其分化为内胚层。然后，通过用含有2％FBS、1％GlutaMAX、250ng/mL FGF2的EMEM/F12培养4天，使其分化为肠道干细胞。

(5)肠道干细胞的培养和传代

考虑到至此为止的报告，也新设计了含有认为对于维持干细胞性所需的因子的维持培养基(含有10％KSR、100units/mL青霉素G，100μg/mL链霉素、1％GlutaMAX、5μM Y-27632、100ng/mL EGF，100ng/mL Noggin、100ng/mL R-spondin 1、100ng/mL Wnt3a、成纤维细胞生长因子(5ng/mL FGF2或100ng/mL FGF4或100ng/mL FGF10)、10μM CHIR 99021、1mM丙戊酸、1mg/mL烟酰胺、1.5μM A-83-01、10μM SB202190、1mM N-乙酰基半胱氨酸的Advanced DMEM/F12)，用于本研究。

将从iPS细胞分化的肠道干细胞用Accutase剥离，使其悬浮于维持培养基中，然后接种到进行了明胶涂布的细胞培养用6或10cm培养皿中。将此时记为Passage 1。培养基更换使用从维持培养基中除去Y-27632后的培养基、每隔2～3天进行更换。传代在细胞在培养皿中所占的比例达到约80％的状态时开始。从培养皿中吸引除去培养液，用D-PBS(-)5mL/10cm培养皿洗涤2次。用Accutase剥离，将细胞悬浮液回收到15mL离心管中。对于传代，每1个传代前的培养皿使用约50％的细胞数，约25％的细胞数用于提取总核糖核酸(RNA)。传代的细胞以1000rpm(160×g)离心3分钟后，尽可能地吸引除去上清。在维持培养基中悬浮，接种到进行了明胶涂布的细胞培养用6或10cm培养皿中。传代后24小时后更换为不含Y-27632的培养基。

(6)肠道干细胞向肠道上皮细胞的分化

向肠道上皮细胞的分化是在肠道干细胞在培养皿中达到约80％的状态时开始的。将细胞用Accutase剥离，接种于预先用人iPS细胞用培养基稀释至30倍的、用除去了生长因子的基质胶涂布的细胞培养用24孔平板。其后，通过用含有2％FBS、2mmol/L L-Glu、1％NEAA、2％B27supplement，1％N2supplement、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮生长因子(EGF)、10μmol/L Y-27632的DMEM/F12培养1天，用含有2％FBS、2mmol/L L-Glu、1％NEAA、2％B27supplement、1％N2supplement、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL EGF的DMEM/F12培养18天，使其分化成肠道上皮细胞。另外，分化时添加我们以前发现的低分子化合物PD98059(20μmol/L)、5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5μmol/L)、A-83-01(0.5μmol/L)。

(7)RNA提取

在肠道干细胞的传代培养中的回收及分化为肠道上皮细胞后的回收结束后，按照Agencourt(注册商标)RNAdvance^TMissue Kit随附手册进行提取。

(8)逆转录反应

互补DNA(cDNA)的合成使用ReverTra Ace(注册商标)qPCR RT Master Mix，按照随附手册进行。

(9)实时逆转录聚合酶链式反应(Real-Time RT-PCR)

Real-Time RT-PCR使用KAPA SYBR Fast qPCR Kit，以cDNA为模板，反应按照随附手册进行。结果使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内源性对照进行了校正。

另外，干细胞性的评价利用LGR5(包含富含亮氨酸重复区的G蛋白共轭型受体、肠道干细胞的标志物)和SOX9(肠道前体细胞标记物)，分化为肠道上皮样细胞的评价利用Villin(Villin 1、微绒毛的主要构成成分)、Sucrase-isomaltase(蔗糖酶-异麦芽糖酶、肠道上皮中存在的二糖分解酶、肠道上皮特异性标记物)、PEPT1(SLC(可溶性载体)家族成员15A1/肽转运蛋白1、在小肠的顶侧膜侧表达)、MDR1(ATP结合盒转运蛋白B1/多药抗性蛋白1、P糖蛋白、排出转运蛋白)。

2.结果、考察

(1)肠道干细胞的培养方法的研究

通过传代培养对新设计的维持培养基对维持干细胞性的影响和此时添加的成纤维细胞生长因子(FGF2、FGF4、FGF10)的影响进行了研究。其结果，确认到干细胞性标志物LGR5、前体细胞标志物SOX9的mRNA表达水平与人小肠相比为相同程度的表达量(图1～3)。另外，虽然发现其表达量有些许变动和衰减，但与人小肠相比，维持了相同程度的表达量(图1～3)。对于成纤维细胞生长因子未见大的差异。这些结果表明，使用新设计的维持培养基，能够进行肠道干细胞的传代培养。另外，维持培养基中使用的成纤维细胞生长因子(FGF2、FGF4、FGF10)之间未见大的差异。

(2)肠道干细胞的分化研究

比较从iPS细胞使其分化为肠道干细胞、不进行传代培养地直接分化为肠道上皮细胞的情况(对照)与从iPS细胞使其分化为肠道干细胞、进行1次继代、并通过本研究建立的肠道干细胞的培养方法进行了维持培养的细胞(FGF2添加维持组、FGF4添加维持组、FGF10添加维持组)分化成肠道上皮细胞的情况之间的肠道上皮标记物和药代动力学相关基因的mRNA表达量。其结果，与对照相比，经维持培养的组中可见Villin为4.1～15.8倍、Sucrase-isomaltase为53.6～86.2倍、PEPT1为4.0～6.1倍、MDR1为23.4～28.0倍(图4)的mRNA表达量的增加。

如上所述，通过使用新设计的维持培养基，能够在维持肠道干细胞的性质的情况下对从人iPS细胞分化的肠道干细胞进行培养。另外，令人惊讶的是，使经维持培养的肠道干细胞分化成肠道上皮细胞，结果与对照相比，肠道上皮标记物和药代动力学相关基因的mRNA表达量大幅上升。该结果显示，成功建立的来自人iPS细胞的肠道干细胞的维持培养法不仅作为使肠道干细胞大量增殖和/或长期维持的方法是有用的，而且对于促进向肠道上皮细胞的分化和功能提高也是有用的。

B.来自人iPS细胞的肠道上皮细胞的特性研究

为了进一步研究来自iPS细胞的肠道上皮细胞的有用性，着眼于作为与肠道粘膜的保护相关的粘膜质粘蛋白2和作为应激的指标而受到关注的CgA，研究来自iPS细胞的肠道上皮细胞中的这些物质的表达状态。

1.方法

从iPS细胞使其分化为肠道干细胞，传代1次后，使通过在上述研究中建立的肠道干细胞的培养方法进行了维持培养的细胞分化为肠道上皮细胞。

(1)粘蛋白2的检测

在分化为肠道上皮细胞的过程中，研究了在培养基中添加6天吲哚美辛(50μM、200μM)、瑞巴派特(50μM、100μM、200μM)对粘蛋白2的表达的影响。

＜RNA提取＞

分化为肠道上皮细胞后的回收结束后，按照Agencourt(注册商标)RNAdvance^TMissue Kit的随附手册进行提取。

＜逆转录反应＞

＜实时逆转录聚合酶链反应(Real-Time RT-PCR)＞

Real-Time RT-PCR使用KAPA SYBR Fast qPCR Kit，以cDNA为模板，反应按照随附手册进行。结果使用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HPRT)作为内源性对照进行了校正。

(2)CgA的检测

在分化为肠道上皮细胞的过程中，研究了在培养基中添加6天吲哚美辛(50μM、200μM)、瑞巴派特(50μM、100μM、200μM)对CgA的表达的影响。

＜RNA提取＞

＜逆转录反应＞

＜实时逆转录聚合酶链反应(Real-Time RT-PCR)＞

2.结果、考察

(1)粘蛋白2的表达及其变化

将粘蛋白2mRNA的检测结果示于图5。通过本法制备的肠道上皮细胞(Con)高表达在来自人结肠癌的Caco-2细胞(Caco-2)中几乎未表达的粘蛋白2。其表达量也达到市售的来自人小肠的细胞(SI)的表达量的约30％。该事实显示，通过本法制备的肠道上皮细胞作为小肠的模型系的利用价值极高。

当将吲哚美辛以浓度200μM添加到培养基时，通过本法制备的肠道上皮细胞的粘蛋白2的表达(mRNA水平)降低(I200)。另一方面，通过向培养基中添加瑞巴派特(50μM、100μM、200μM)，粘蛋白2的表达(mRNA水平)上升(R50、R100、R200)。其中，认为在以浓度200μM向培养基中添加了瑞巴派特的情况下(R200)，浓度过高而可能出现细胞毒性。在培养基中添加了吲哚美辛(200μM)和瑞巴派特(100μM、200μM)的情况下，可见粘蛋白2的表达(mRNA水平)的降低得到抑制的趋势(I200+R100、I200+R200)。以上的结果显示，通过本法制备的肠道上皮细胞对于以粘蛋白2的表达为指标的分析(具体而言，作为副作用引起粘膜损伤(溃疡)的药物的预测(副作用风险的预测)以及具有抑制这样的副作用或应激性溃疡的作用的药物的筛选系)是有用的。

(2)CgA的表达及其变化

将CgA mRNA的检测结果示于图6。通过本法制备的肠道上皮细胞(Con)以来自人结肠癌的Caco-2细胞(Caco-2)无法相比的水平表达CgA。该事实也证实了通过本法制备的肠道上皮细胞作为小肠的模型系的利用价值极高。

当在培养基中添加吲哚美辛(50μM、200μM)时，通过本法制备的肠道上皮细胞的CgA的表达(mRNA水平)降低(I50、I200)。另一方面，即使将瑞巴派特添加到培养基中(50μM、100μM、200μM)，也未见CgA的表达(mRNA水平)的特别上升(R50、R100、R200)。但是，在培养基中添加了吲哚美辛(200μM)和瑞巴派特(100μM、200μM)的情况下，可见CgA的表达(mRNA水平)的降低得到抑制的倾向(I200+R100、I200+R200)。以上的结果显示，通过本法制备的肠道上皮细胞对于以CgA的表达为指标的分析(具体而言，作为副作用引起粘膜损伤(溃疡)的药物的预测(副作用风险的预测)以及具有抑制这样的副作用或应激性溃疡的作用的药物的筛选系)是有用的。

C.来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞的新型培养方法的开发2

以改良来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞的培养方法为目标，变更添加到培养基中的因子，研究其影响/效果。具体而言，通过用含有10％KSR、100units/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、1％GlutaMAX、2μM Y-27632、100ng/mL EGF、30ng/mL FGF2，3μM CHIR 99021、0.5μM A-83-01的Advanced DMEM/F12对使人iPS细胞分化而得到的肠道干细胞进行传代培养，以标记物(LGR5：小肠干细胞标志物、CDX2：后肠标志物)的表达水平为指标，评价是否维持了干细胞性。除培养基条件以外与上述A的情况相同。另外，所使用的细胞(人iPS细胞、MEF)、人iPS细胞的培养方法等也与上述A的情况相同。需要说明的是，本研究中使用的培养基的特点在于，与在上述A的研究中使用的培养基相比，所添加的因子的数量大幅减少，特别是未添加有组蛋白去乙酰化抑制剂丙戊酸。

将实验结果示于图7。即使重复传代(P1～P11)，干细胞性标志物LGR5、后肠标志物CDX2的mRNA表达水平也为与人小肠同等以上，上述培养基对于来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞的维持(传代培养)是极其有效的。

使传代前(P0)和传代后(P1～P10)的来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞(方法按照上述A的情况)，研究各种标志物(Villin：肠道标记物，Sucrase-isomaltase：肠道标记物，ISX：肠道标记物，LGR5：肠道干细胞标记物，MDR1：转运蛋白基因，PEPT1：转运蛋白基因，CYP3A4：药物代谢酶基因)的表达。将结果示于图8及9。即使在传代后分化为肠道上皮细胞的情况下，也可见肠道上皮标记物和药代动力学相关基因的高表达。Villin1、ISX、MDR1等显示出当重复传代时表达水平增高的倾向，可见比人小肠高的表达。

如上所述，确认了使用上述培养基的维持培养法对于来自人iPS细胞的肠道干细胞样细胞的维持(培养)、以及促进向肠道上皮细胞的分化及功能提高是极其有效的。

产业上的可利用性

本发明的培养方法能够大量地制备来自iPS细胞的肠道干细胞样细胞和/或长期维持。另外，通过经由本发明的培养方法制备来自iPS细胞的肠道上皮细胞样细胞，能够获得更成熟的肠道上皮细胞样细胞。肠道上皮细胞样细胞作为小肠的模型系是有用的，可以用于吸收-代谢-膜透过性、药物代谢酶的诱导、药物转运蛋白的诱导、毒性的评价等。另外，也期待作为各种肠疾病治疗用的细胞制剂的有效成分，或者作为再生医疗的材料的用途。此外，本发明还可期待对肠道干细胞的功能阐明、肠道的产生过程的阐明、消化道疾病的原因、发展机理的阐明等的贡献。

本发明不受上述发明的实施方式及实施例的说明的任何限定。只要不脱离权利要求书的记载，在本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容通过援用引用其全部的内容。

Claims

1.一种培养来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞的方法，其包含下述工序：将来自人工多能性干细胞的肠道干细胞样细胞在GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂及血清替代物的存在下、或在GSK-3β抑制剂及血清替代物的存在下进行培养的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，GSK-3β抑制剂为CHIR 99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD28 58、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、靛玉红、Bikinin或1-氮杂坎帕罗酮，组蛋白去乙酰化抑制剂为丙戊酸、伏立诺他、曲古霉素A、tubastatin A、givinostat或pracinostat，血清替代物为基因敲除血清替代物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自上皮生长因子、TGFβ受体抑制剂及成纤维细胞生长因子中的一种以上的化合物的条件下进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，TGFβ受体抑制剂为A-83-01，成纤维细胞生长因子为FGF2、FGF4或FGF10。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自BMP抑制剂、Wnt信号活化剂及Wnt激动剂中的一种以上的化合物的条件下进行。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，BMP抑制剂为Noggin，Wnt信号活化剂为R-spondin1，Wnt激动剂为Wnt3a。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述培养在进一步存在选自烟酰胺、N-乙酰基半胱氨酸、p38抑制剂及ROCK抑制剂中的一种以上的化合物的条件下进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，p38抑制剂为SB202190，ROCK抑制剂为Y-27632。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，人工多能性干细胞为人的人工多能性干细胞。

10.一种制备肠道上皮细胞样细胞的方法，其包含使通过权利要求1～9中任一项所述的方法培养的肠道干细胞样细胞分化为肠道上皮细胞样细胞的工序。

11.一种肠道上皮细胞样细胞，其是通过权利要求10所述的方法得到的。

12.一种评价受检物质的体内动态或毒性的方法，其使用了权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述体内动态是代谢、吸收、排泄、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、或药物转运蛋白的诱导。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其包含以下的工序(i)～(iii)：

(i)准备由权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序；

(ii)使受检物质与所述细胞层接触的工序；

15.根据权利要求12或13所述的方法，其包含以下的工序(I)和(II)：

(I)使受检物质与权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

16.一种评价受检物质的消化道粘膜损伤作用的方法，其包含以下的工序(a)和(b)：

(a)使受检物质与权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

17.一种评价受检物质的消化道粘膜保护作用的方法，其包含以下的工序(A)和(B)：

(A)在显示消化道粘膜损伤作用的物质的存在下，使受检物质与权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞接触的工序；

18.一种细胞制剂，其包含权利要求11所述的肠道上皮细胞样细胞。