JPWO2014132933A1 - 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の工程(1)〜(3)を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法:
(1)人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とEGFの存在下での培養を含む工程。
[2]工程(3)の前記培養を、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下で行う、[1]に記載の方法。
[3]工程(3)の前記培養の期間が7日間〜30日間である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]工程(1)における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]工程(2)における分化誘導因子としてFGF2を用いる、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]工程(3)が、以下の工程(3−1)及び(3−2)からなる、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の方法:
(3−1)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞をGSK阻害剤及び/又はBMP阻害剤とEGFの存在下で培養する工程;
(3−2)工程(3−1)に続いて、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とEGFの存在下で培養する工程。
[8]工程(3−1)の培養期間は3日間〜14日間であり、工程(3−2)の培養期間は3日間〜21日間である、[7]に記載の方法。
[9]GSK阻害剤がGSK3iXVであり、BMP阻害剤がドルソモルフィンである、[7]又は[8]に記載の方法。
[10]人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11][1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
[12][11]に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態を評価する方法。
[13]以下の工程(i)〜(iii)を含む、[12]に記載の方法:
(i)[11]に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
(ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性を評価する工程。
[14]以下の工程(I)及び(II)を含む、[12]に記載の方法:
(I)[11]に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝又は吸収を測定・評価する工程。
[15][11]に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
この工程ではiPS細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下でiPS細胞を培養する。iPS細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/ml〜200 ng/ml、好ましくは20 ng/ml〜150 ng/mlとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)〜10%(v/v)である。
この工程では、工程(1)で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、後述の実施例に示した実験結果を踏まえ、FGF2(線維芽細胞増殖因子2)の存在下で培養を行う。好ましくはヒトFGF2(例えばヒト組換えFGF2)を用いる。
この工程では、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物(以下、「第1誘導因子」とも呼ぶ)とEGF(以下、「第2誘導因子」とも呼ぶ)の存在下で培養を行い、工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる。典型的には、工程(2)を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程(3)に供する。一方で、工程(2)を経て得られた細胞集団の中から腸管幹細胞様細胞を選別した上で工程(3)を実施することにしてもよい。腸管幹細胞様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター(セルソーター)で行えばよい。
薬物動態試験に有用な小腸のモデル系の構築を目指し、ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞を分化誘導する条件を検討した。以下の検討では、分化誘導因子としての低分子化合物の可能性に注目し、薬物動態試験の評価系に利用可能な細胞をより簡便な方法で作製することを目的とした。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3〜5日培養後、1:2〜1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒトiPS細胞の腸管上皮細胞への分化は、ヒトiPS細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約70%になった状態で開始した。0.5% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)+グルタマックス培地で2日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、1%グルタマックス、250 ng/mL FGF2を含むDMEM/F12で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。この処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用24ウェルプレートに播種した。その後、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)、10 μmol/L Y-27632を含むDMEM/F12で1日間、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)を含むDMEM/F12で18日間培養することで腸管上皮細胞へ分化させた。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL 上皮細胞増殖因子(EGF)を含むDMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を10 nmol/Lもしくはリファンピシンを40 μmol/Lとなるよう添加し、回収前48時間培養することで行った。
(a)GSK3iXV(125 nM)、ドルソモルフィン(1μM)を分化開始後8日目から6日間培養液に添加した(その他の培養条件は上記の通り)。
(b)PD98059(20μM)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)、A-83-01(0.5μM)を分化開始後8日目から18日間培養液に添加した(その他の培養条件は上記の通り)。
(c)GSK3iXV(125 nM)、ドルソモルフィン(1μM)を分化開始後8日目から6日間培養液に添加し、PD98059(20μM)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)、A-83-01(0.5μM)を分化開始後14日目から12日間添加した(その他の培養条件は上記の通り)。
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、RNeasy(登録商標) Mini Kit(Qiagen)の添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、PrimeScript(登録商標) RT reagent Kit (Perfect Real Time)(タカラバイオ株式会社)を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)(タカラバイオ株式会社)を用い、cDNAを鋳型にしてReal-Time RT-PCRを行った。操作は添付マニュアルに従った。内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用い、測定結果を補正した。
免疫染色に用いる細胞はカバーガラス上で培養した。培養後、細胞は4%パラホルムアルデヒドを用いて室温にて30分間固定処理し、0.1%Triton Xを用いて室温にて5分間膜透過処理を行い、2%スキムミルクを用いて室温にて20分間ブロッキング処理を行った。その後、一次抗体はウサギ抗ヒトスクラーゼ−イソマルターゼ抗体(Sigma;1:200)を用いて室温にて60分間、二次抗体はAlexa Fluor(登録商標)568ヤギ抗ウサギIgG抗体(Invitrogen;1:500)を用いて遮光下室温にて60分間反応させた。核染色は1μg/mL 4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を遮光下室温にて5分間処理することで行った。
取り込み実験に用いる細胞はカバーガラス上で培養した。培養後、25μM β-Ala-Lys-AMCAを含むDMEM/F12で5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて4時間インキュベーションした。インキュベーション後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。その後、ただちに4%パラホルムアルデヒドを用いて室温にて30分間固定処理した。これ以降、免疫染色を行う場合は0.1% Triton Xを用いて室温にて5分間膜透過処理を行い、2%スキムミルクを用いて室温にて20分間ブロッキング処理を行った。さらに、一次抗体はウサギ抗ヒトスクラーゼ−イソマルターゼ抗体(Sigma;1:200)を用いて室温にて60分間、二次抗体はAlexa Fluor(登録商標)568ヤギ抗ウサギIgG抗体(Invitrogen;1:500)を用いて遮光下室温にて60分間反応させた。
ABCB1/MDR1(ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1):P糖タンパク質であり、排出トランスポーターとして機能する。
CDX2(尾側型ホメオボックス転写因子2):腸管への分化に関わる転写因子である。
CYP3A4(シトクロムP450 3A4):小腸において主要な薬物代謝酵素である。
DPP4(ジペプチジルペプチダーゼ4):セリンプロテアーゼであり、腸管上皮にも多く発現している。
LGR5(ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体):腸管幹細胞のマーカーである。
SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier)ファミリーメンバー15A1/ペプチドトランスポーター1):小腸の頂側膜側に発現している。
SLC46A1/PCFT(SLC(solute carrier)ファミリーメンバー46A1/プロトン共役葉酸トランスポーター):小腸に発現している。
Sucrase-isomaltase(スクラーゼ−イソマルターゼ):腸管上皮に存在する二糖分解酵素であり、腸管上皮特異的マーカーである。
(1)腸管上皮細胞への分化条件の検討
ヒトiPS細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導するにあたって、各種条件(分化誘導因子など)を検討した。まず、FGF2、FGF4、Wnt3aの腸管幹細胞への分化に対する効果を検討したところ、FGF4処理群に比べてFGF2処理群で腸管幹細胞のマーカーであるLGRの発現が高かった。また、その発現はWnt3a処理によって変化しなかった(図1)。
腸管上皮にはペプチドトランスポーターが発現しており、これが腸管からのペプチドの吸収に関与している。ヒトiPS細胞の分化によって得られた腸管上皮細胞様細胞はペプチドトランスポーターであるSLC15A1/PEPT1を発現していたことから、その機能についても確認することにした。その結果、腸管上皮細胞様細胞ではペプチドトランスポーターの基質であるβ-Ala-Lys-AMCAの取り込みが認められた(図6(A))。さらに、β-Ala-Lys-AMCAの取り込みが認められた細胞では腸管上皮細胞特異的なマーカーであるスクラーゼ−イソマルターゼの発現も認められた(図6(B)(C))。このように、ペプチドの輸送機能を有する腸管上皮細胞様細胞へとヒトiPS細胞を分化誘導できたことが示された。
腸管幹細胞の増殖にはWntシグナルの活性化やBMPシグナルの抑制が関与することが知られている。そこで、GSKを阻害することでWntシグナルを活性化させるGSK3iXVとBMP阻害剤あるドルソモルフィンを用い、腸管幹細胞への分化に対するGSK阻害剤とBMP阻害剤の効果を検討した。その結果、これら2つの低分子化合物で分化開始後8日目から14日目まで処理することによって、腸管幹細胞のマーカーであるLGR5やEphB2の発現が上昇した(図7)。このことから、腸管の分化に関わるシグナルを制御することで効率よく腸管幹細胞へ分化できることが示唆された。
以上の通り、ヒトiPS細胞から機能的腸管上皮細胞様細胞(ペプチドの輸送機能や薬物代謝酵素の誘導能を有する)を簡便な方法で作製することに成功するとともに、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGF-β受容体阻害剤、GSK阻害剤及びBMP阻害剤(特に、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の併用、或いはMEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGF-β受容体阻害剤、GSK阻害剤及びBMP阻害剤の併用)が、ヒトiPS細胞を腸管上皮細胞へと分化誘導するための誘導因子として有用であることが明らかとなった。低分子化合物を用いた簡便で安価な分化誘導方法の確立は、大きな成果であると考えられる。
MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の誘導因子として有効性に関し、更なる検討を加えた。具体的には、これらの化合物の添加時期及び組合せについて詳細な検討を行うとともに、同様の作用を有する化合物群を用い、化合物の作用と誘導効果の関係を調べた。
実験方法及び実験条件は、以下の(A)〜(C)の点を除き、上記<腸管上皮細胞を分化誘導する条件の検討1>に記載したものに準じた。
(A)ヒトiPS細胞を腸管上皮細胞へ分化させる際の培養条件(<腸管上皮細胞を分化誘導する条件の検討1>の1.(4)が対応する)として、次の(d)〜(i)を設定し、比較検討した。
(d)GSK3iXV(125 nM)、ドルソモルフィン(1μM)を分化開始後8日目から6日間、その後PD98059(20μM)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)、及びA-83-01(0.5μM)若しくはSB431542(10μM)を分化開始後14日目から12日間培養液に添加した。
(e)PD98059(20μM)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)、及びA-83-01(0.5μM)若しくはSB431542(10μM)を分化開始後14日目から12日間培養液に添加した。
(f)PD98059(20μM)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)、及びA-83-01(0.5μM)若しくはSB431542(10μM)を分化開始後8日目から18日間培養液に添加した。
(g)PD98059の代わりに、同様の作用を示す化合物としてMEK阻害剤II(10μM)、PD0325901(0.1μM)、PD184161(1μM)、PD184352(0.1μM)、SL327(1μM)又はU0126(10μM)を使用した。その他の条件は(f)と同一とした。
(h)5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μM)の代わりに、同様の作用を示す化合物として5-アザシチジン(10μM)、RG108(10μM)又はゼブラリン(10μM)を使用した。その他の条件は(f)と同一とした。
(i)A-83-01(0.5μM)の代わりに、同様の作用を示す化合物としてD4476(10μM)、GW788388(10μM)、LY364947(5μM)、RepSox(10μM)又はSB431542(10μM)を使用した。その他の条件は(f)と同一とした。
腸特異的ホメオボックス(ISX):腸管上皮に発現している転写因子である。
ビリン1:小腸上皮細胞の微絨毛の構成成分であり、吸収上皮細胞の刷子縁に発現している。
ABCG2/BCRP:ATP結合カセットトランスポーターG2/乳がん耐性タンパク、排出トランスポーターである。
CYP1A1/2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6:これらは薬物の代謝(第一相反応)に関わる酵素である。
ウリジン2リン酸−グルクロン酸転移酵素:グルクロン酸抱合反応を行う薬物代謝酵素である。
硫酸転移酵素:硫酸抱合反応を行う薬物代謝酵素である。
ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化の際に、GSK3i XV、ドルソモルフィン、PD98059、5-アザ2’-デオキシシチジン、A-83-01もしくはSB431542を用いることで、腸管のマーカー遺伝子である腸特異的ホメオボックス(ISX)、ビリン1、スクラーゼ−イソマルターゼ及び腸管に発現する薬物トランスポーターであるSLC15A1、ABCB1/MDR1、ABCG2/BCRPの発現が増加した(図12〜14)。腸管特異的なマーカーであるスクラーゼ−イソマルターゼに関しては、PD98059、5-アザ2’-デオキシシチジン、A-83-01を用いて分化させることで、遺伝子発現の増加だけでなく免疫蛍光染色陽性細胞の割合も増加した(図15)。
以上の通り、ペプチドの輸送機能や薬物代謝酵素活性及び誘導能を有する腸管上皮細胞様細胞を簡便な方法にてヒトiPS細胞から作製することに成功した。また、誘導因子に要求される条件の詳細が明らかになった。
Claims (15)
- 以下の工程(1)〜(3)を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法:
(1)人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とEGFの存在下での培養を含む工程。 - 工程(3)の前記培養を、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下で行う、請求項1に記載の方法。
- 工程(3)の前記培養の期間が7日間〜30日間である、請求項1又は2に記載の方法。
- MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における分化誘導因子としてFGF2を用いる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(3)が、以下の工程(3−1)及び(3−2)からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法:
(3−1)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞をGSK阻害剤及び/又はBMP阻害剤とEGFの存在下で培養する工程;
(3−2)工程(3−1)に続いて、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とEGFの存在下で培養する工程。 - 工程(3−1)の培養期間は3日間〜14日間であり、工程(3−2)の培養期間は3日間〜21日間である、請求項7に記載の方法。
- GSK阻害剤がGSK3iXVであり、BMP阻害剤がドルソモルフィンである、請求項7又は8に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
- 請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態を評価する方法。
- 以下の工程(i)〜(iii)を含む、請求項12に記載の方法:
(i)請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
(ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性を評価する工程。 - 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項12に記載の方法:
(I)請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝又は吸収を測定・評価する工程。 - 請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
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