JP6937036B2 - 人工多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程(1)〜(3)を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法:
(1)人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程。
[2]工程(3)の前記培養の期間が7日間〜40日間である、[1]に記載の方法。
[3]工程(3)が、以下のA〜Cのいずれかの培養工程を含む、[1]に記載の方法、
培養工程A:(a−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、該培養に続く、(a−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む、
培養工程B:(b−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、該培養に続く、(b−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を含む、
培養工程C:(c−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む。
[4](a−1)の培養の期間は1日間〜5日間であり、(a−2)の培養の期間は3日間〜15日間であり、
(b−1)の培養の期間は3日間〜15日間であり、(b−2)の培養の期間は3日間〜15日間であり、
(c−1)の培養の期間は3日間〜15日間である、[3]に記載の方法。
[5](a−2)の培養、(b−1)の培養、及び(c−1)の培養が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行われる、[3]又は[4]に記載の方法。
[6]培養工程Aが、(a−2)の培養に続く、(a−3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Bが、(b−2)の培養に続く、(b−3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Cが、(c−1)の培養に続く、(c−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含む、[2]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7](a−3)の培養、(b−3)の培養、及び(c−2)の培養の期間は1日間〜10日間である、[6]に記載の方法。
[8]cAMPが細胞へ供給される条件が、培地中に8-Br-cAMPが存在することである、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]cAMP分解酵素阻害剤がIBMXである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]工程(1)における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]工程(2)における分化誘導因子としてFGF2を用いる、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13]人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14][1]〜[13]のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
[15][14]に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[16]前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、[15]に記載の方法。
[17]以下の工程(i)〜(iii)を含む、[15]又は[16]に記載の方法:
(i)[14]に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
(ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。
[18]以下の工程(I)及び(II)を含む、[15]又は[16]に記載の方法:
(I)[14]に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。
[19]以下の工程(a)及び(b)を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法:
(a)[14]に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(b)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。
[20]以下の工程(A)及び(B)を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法:
(A)[14]に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(B)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
[21][14]に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
この工程ではiPS細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下でiPS細胞を培養する。iPS細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/mL〜200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL〜150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)〜10%(v/v)である。
この工程では、工程(1)で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、後述の実施例に示した実験結果を踏まえ、FGF2(線維芽細胞増殖因子2)の存在下で培養を行う。好ましくはヒトFGF2(例えばヒト組換えFGF2)を用いる。
この工程では、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下(以下、この条件を「第1条件」と呼ぶ)、且つcAMPが細胞へ供給される条件下(以下、この条件を「第2条件」と呼ぶ)で培養し、工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる。典型的には、工程(2)を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程(3)に供する。一方で、工程(2)を経て得られた細胞集団の中から腸管幹細胞様細胞を選別した上で工程(3)を実施することにしてもよい。腸管幹細胞様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター(セルソーター)で行えばよい。
<培養工程A>
培養工程Aでは、(a−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、当該培養に続く、(a−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。即ち、cAMPが細胞へ供給される条件の有無で異なる2段階の培養を行う。このようにすれば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。(a−1)の培養の期間は例えば1日間〜5日間である。同様に、(a−2)の培養の期間は例えば3日間〜15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Bでは、(b−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、当該培養に続く、(b−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を行う。このように、cAMPが細胞へ供給される条件で培養した後、cAMP分解酵素阻害剤が存在する条件で培養すると、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。(b−1)の培養の期間は例えば3日間〜15日間である。同様に、(b−2)の培養の期間は例えば3日間〜15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Cでは、(c−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。(c−1)の培養の期間は例えば3日間〜15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
生体の腸管上皮細胞に近い機能を示す細胞(腸管上皮細胞様細胞)を簡便且つ低コストで調製することを目指し、従来報告した低分子化合物とは異なる作用を有する新たな低分子化合物のヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化に対する有用性を検討した。また、有用性が確認された化合物を利用して作製した腸管上皮細胞様細胞の薬物動態学的機能を検討した。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3〜5日培養後、1:2〜1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒトiPS細胞の腸管上皮細胞への分化は、ヒトiPS細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約70%になった状態で開始した。0.5% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)+グルタマックス培地で2日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、1%グルタマックス、250 ng/mL FGF2を含むDMEM/F12で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。この処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用24ウェルプレートに播種した。その後、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)、10 μmol/L Y-27632を含むDMEM/F12で1日間、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)を含むDMEM/F12で18日間培養することで腸管上皮細胞へ分化させた。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL EGFを含むDMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を10 nmol/L又は100 nmol/L、或いはリファンピシンを10、40、100 μmol/Lとなるよう添加し、回収前48時間培養することで行った。また、分化の際に以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059(20 μmol/L)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5 μmol/L)、A-83-01(0.5 μmol/L)に加え、1 mmol/L 8-ブロモ-3’,5’-サイクリックアデノシン一リン酸(8-Br-cAMP)、0.5 mmol/L 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を添加し、腸管幹細胞および腸管上皮細胞への分化に及ぼす影響について検討した。
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、RNeasy(登録商標) Mini Kit(Qiagen)の添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、PrimeScript(登録商標) RT reagent Kit (Perfect Real Time)(タカラバイオ株式会社)を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)(タカラバイオ株式会社)を用い、cDNAを鋳型にしてReal-Time RT-PCRを行った。操作は添付マニュアルに従った。内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用い、測定結果を補正した。
分化誘導終了後、トリチウムラベルされたGly-SarもしくはESを含む取り込み溶液で37°Cもしくは4°Cにてインキュベーションした。Gly-Sarの取り込み実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L MESを含むpH 6.0の取り込み溶液を、ESの取り込み実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4の取り込み溶液を用いた。インキュベーション終了後、氷冷した取り込み溶液で細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。その後、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.2 M水酸化ナトリウム溶液で細胞を可溶化し、シンチレーション溶液を加えた。Gly-SarもしくはESの細胞内取り込み量は、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した放射活性より算出した。
分化誘導終了後、ヘキスト33342もしくはトリチウムラベルされたジゴキシンを含む取り込み溶液をセルカルチャーインサートの頂側膜側もしくは基底膜側に加え、37°Cにてインキュベーションし、溶液を加えた反対側のチャンバーより経時的にサンプリングした。輸送実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4の取り込み溶液を用いた。ヘキスト33342の見かけの膜透過係数は蛍光プレートリーダーを用いて測定した蛍光強度より(励起波長355 nm、蛍光波長460 nm)、ジゴキシンの見かけの膜透過係数は液体シンチレーションカウンターを用いて測定した放射活性より算出した。Efflux ratioは基底膜側から頂側膜側への見かけの膜透過係数を頂側膜側から基底膜側への見かけの膜透過係数で除することで算出した。なお、経上皮電気抵抗(TEER)値はMillicell ERS-2を用いて測定した。
分化誘導終了後、100 μmol/Lミダゾラムを含む培地(2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、1% N2 supplement、100 ユニット/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL EGFを含むDMEM/F12)で37°Cにてインキュベーションし、所定の時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター(LC-MS/MS)を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。
ABCB1/MDR1(ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1):P糖タンパク質であり、排出トランスポーターとして機能する。
ABCG2/BCRP(ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク):排出トランスポーターとして機能する。
CYP3A4(シトクロムP450 3A4):小腸において主要な薬物代謝酵素である。
LGR5(ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体):腸管幹細胞のマーカーである。
PXR(プレグナンX受容体):CYP3A4の発現や誘導に関与する。
SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier)ファミリーメンバー15A1/ペプチドトランスポーター1):小腸の頂側膜側に発現している。
SLCO2B1/OATP2B1(SLC(solute carrier)有機アニオントランスポーター2B1):小腸の頂側膜側に発現している。
Sucrase-isomaltase(スクラーゼ−イソマルターゼ):腸管上皮に存在する二糖分解酵素であり、腸管上皮特異的マーカーである。
UGT1A1(ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A1):薬物のグルクロン酸抱合に関わる。
UGT1A4(ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A4):薬物のグルクロン酸抱合に関わる。
Villin 1(ビリン 1):微絨毛の主要な構成成分である。
(1)腸管上皮細胞への分化条件の検討
ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化誘導の際に添加する8-Br-cAMPおよびIBMXの濃度および期間の検討を行った。その結果、8-Br-cAMPは1 mmol/Lで分化開始後8〜14日の間に、IBMXは0.5 mmol/Lで分化開始後14〜18日目の間に用いることで、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSCL15A1/PEPT1、主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)3A4およびCYP3A4の発現に関与する核内受容体であるプレグナンX受容体(PXR)のmRNA発現レベルが高かった(図1、2)。したがって、8-Br-cAMPの添加は1 mmol/Lの濃度で分化開始後8〜14日に、IBMXの添加は0.5 mmol/Lの濃度で分化開始後14〜23日に添加することとした。
CYP3A4の誘導剤である1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)およびリファンピシンを用いて、CYP3A4の発現誘導について検討を行った。その結果、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞および8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞のいずれにおいても1α,25-ジヒドロキシビタミンD3によるCYP3A4の誘導が認められた(図5)。一方、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞ではリファンピシンによるCYP3A4の発現誘導が認められていなかったが、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導を行うことによって、リファンピシンによる応答性を有するようになった。
ペプチドの取り込みトランスポーターであるPEPT1の活性を、その基質であるグリシルサルコシン(Gly-Sar)を用いて評価した。また、この取り込みがトランスポーターを介する取り込みでるかどうか評価するため、PEPT1の阻害剤であるイブプロフェン存在下およびトランスポーターの機能が抑制される4℃条件下でも取り込み実験を行った。その結果、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞および8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞のいずれにおいてもイブプロフェン存在下および4℃条件下では、Gly-Sarの取り込みが有意に低下した(図7)。また従来の分化法と比較して、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞では、イブプロフェン未処理群(コントロール群)において、Gly-Sarの取り込みが有意に増加したことから、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導を行うことによって、PEPT1活性の上昇が示された。
8-Br-cAMPとIBMXを用いてセルカルチャーインサート上で分化誘導させた腸管上皮細胞様細胞の経上皮膜抵抗(TEER)値を測定したところ、分化が進むにつれて経時的なTEER値の上昇が認められ、最終的に200-250 Ω×cm2に達した(図9)。
以上の通り、薬物代謝酵素活性及び誘導能に加え、取り込みおよび排出トランスポーターの輸送機能を有する腸管上皮細胞様細胞をヒトiPS細胞から簡便な方法にて作製することに成功した。また、分化促進及び機能獲得に有効な条件を見出すことに成功した。
iPS細胞由来腸管上皮細胞様細胞の更なる有用性を検討するため、腸管粘膜の保護に関わっている粘膜質であるムチン2に着目し、iPS細胞由来腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現状態を調べた。
<粘膜障害作用>
腸管上皮細胞へと分化させる過程で、NSAIDsとして知られ粘膜障害作用を有するメロキシカム(50μM、200μM)、インドメタシン(75μM、300μM)、ケトプロフェン(200μM、800μM)を6日間添加し、培養することでムチン2の発現変動を検討した。
<粘膜保護作用>
腸管上皮細胞へと分化させる過程で、粘膜保護作用を有するイルソグラジン(10μM、40μM)、レバミピド(50μM、100μM、250μM、1000μM)を6日間添加し、培養することでムチン2の発現変動を検討した。
<RNA抽出>
腸管上皮細胞への分化後の回収終了後、Agencourt(登録商標)RNAdvance Tissue Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
<逆転写反応>
相補的DNA(cDNA)の合成は、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
<リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(Real-Time RT-PCR)>
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル トランスフェラーゼ(HPRT)を用いて補正した。
ムチン2 mRNAの検出結果を図12に示す。本法で調製した腸管上皮細胞様細胞(Control)は、ヒト結腸癌由来のCaco-2細胞(Caco-2)では殆ど発現していないムチン2を高発現していた。その発現量は、市販のヒト小腸由来細胞(SI)の発現量の約70%にも達する。この事実は、本法で調製した腸管上皮細胞様細胞が小腸のモデル系として極めて利用価値が高いことを示す。
Claims (19)
- 以下の工程(1)〜(3)を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法:
(1)人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程。 - 工程(3)の前記培養の期間が7日間〜40日間である、請求項1に記載の方法。
- 工程(3)が、以下のA〜Cのいずれかの培養工程を含む、請求項1に記載の方法、
培養工程A:(a−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、該培養に続く、(a−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む、
培養工程B:(b−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、該培養に続く、(b−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を含む、
培養工程C:(c−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む。 - (a−1)の培養の期間は1日間〜5日間であり、(a−2)の培養の期間は3日間〜15日間であり、
(b−1)の培養の期間は3日間〜15日間であり、(b−2)の培養の期間は3日間〜15日間であり、
(c−1)の培養の期間は3日間〜15日間である、請求項3に記載の方法。 - (a−2)の培養、(b−1)の培養、及び(c−1)の培養が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行われる、請求項3又は4に記載の方法。
- 培養工程Aが、(a−2)の培養に続く、(a−3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Bが、(b−2)の培養に続く、(b−3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Cが、(c−1)の培養に続く、(c−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。 - (a−3)の培養、(b−3)の培養、及び(c−2)の培養の期間は1日間〜10日間である、請求項6に記載の方法。
- cAMPが細胞へ供給される条件が、培地中に8-Br-cAMPが存在することである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- cAMP分解酵素阻害剤がIBMXである、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における分化誘導因子としてFGF2を用いる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により腸管上皮細胞様細胞を得る工程、及び前記腸管上皮細胞様細胞を用いて、被検物質の体内動態又は毒性を評価することを含む、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
- 前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項14に記載の方法。
- 以下の工程(i)〜(iii)を含む、請求項14又は15に記載の方法:
(i)請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により腸管上皮細胞様細胞を製造し、前記腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
(ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。 - 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項14又は15に記載の方法:
(I)請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により腸管上皮細胞様細胞を製造し、得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。 - 以下の工程(a)及び(b)を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法:
(a)請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により腸管上皮細胞様細胞を製造し、得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(b)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。 - 以下の工程(A)及び(B)を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法:
(A)請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により腸管上皮細胞様細胞を製造し、得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(B)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
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