WO2020262492A1 - 小腸上皮様細胞の製造方法 - Google Patents

小腸上皮様細胞の製造方法 Download PDF

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WO2020262492A1
WO2020262492A1 PCT/JP2020/024909 JP2020024909W WO2020262492A1 WO 2020262492 A1 WO2020262492 A1 WO 2020262492A1 JP 2020024909 W JP2020024909 W JP 2020024909W WO 2020262492 A1 WO2020262492 A1 WO 2020262492A1
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WO
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cells
small intestinal
intestinal epithelial
medium
drug
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PCT/JP2020/024909
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English (en)
French (fr)
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水口　裕之
和雄 高山
亮介 根来
麻子 初山
亮佑 永田
泰弘 戸坂
榎　竜嗣
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国立大学法人大阪大学
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
タカラバイオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing small intestinal epithelial-like cells, which is expected to be applied in the field of drug discovery. Furthermore, the present invention relates to a method for producing small intestinal epithelial-like cells, which comprises a step of cryopreserving cells in the process of production, thawing and reinducing the cells. The present invention also relates to a drug toxicity evaluation method using small intestinal epithelial-like cells produced by the above-mentioned production method, a drug-drug interaction test method, and a drug-metabolizing enzyme induction test method.
  • a pluripotent stem cell is an undifferentiated cell having pluripotency and self-renewal ability.
  • Cells differentiated from pluripotent stem cells have the function of repairing damaged tissue and are being actively studied for their usefulness in the field of regenerative medicine.
  • pluripotent stem cells iPS cells (induced pluripotent stem cells) are derived from somatic cells such as fibroblasts by introducing genes such as specific transcription factors OCT3 / 4, SOX2, KLF4, and C-MYC. Dedifferentiated, artificially produced pluripotent stem cells.
  • cells with pluripotency can differentiate into all tissues and organs including small intestinal epithelial cells.
  • Non-Patent Document 1 is a document in which small intestinal tissue is prepared from human pluripotent stem cells and reported.
  • Non-Patent Document 1 reports that it has succeeded in producing organoids including epithelial cells of the small intestine, Paneth cells, goblet cells, and intestinal epithelial endocrine cells.
  • Non-Patent Document 2 is a document reporting that small intestinal stem cells capable of self-renewal for a long period of time could be produced from human pluripotent stem cells.
  • the small intestinal stem cells produced in Non-Patent Document 2 can be differentiated into organoids including all cells existing in the small intestine as in Non-Patent Document 1.
  • Non-Patent Document 3 we attempted to differentiate human pluripotent stem cells into small intestinal epithelial-like cells, SI (Suplex Isomaltase), SLC15A1 (solute carrier family 15 member 1) / PEPT1 (peptide transporter1), LPT1 (peptide transporter1), L We succeeded in producing cells expressing small intestinal markers such as connecting G protein-coupled receptor 5). The cells further have the ability to take up the ⁇ -Ala-Lys-AMCA ( ⁇ -Ala-Lys-N-7-amino-4methylcomaline-3-aceticacid) dipeptide.
  • the problem was that the expression of the drug-metabolizing enzyme CYP3A4 (Cytochrome P450 3A4) in the cells was as low as about 1/500 as compared with the human small intestine.
  • Patent Document 1 In addition to the above non-patent documents, as shown in Patent Document 1, there have been reports of attempts to differentiate into small intestinal epithelial cells, but small intestinal epithelium capable of simultaneously evaluating drug metabolism and substance absorption from human pluripotent stem cells. There are no reports that cells were efficiently produced without using gene transfer technology.
  • Caco-2 cells which are cell lines derived from human colon cancer, are currently used as an in vitro absorption evaluation system model for the small intestine.
  • these Caco-2 cells hardly express the drug-metabolizing enzyme CYP3A4, and drug metabolism cannot be evaluated.
  • Caco-2 cells are derived from cancer cells and cannot be said to reflect the metabolic absorption of normal cells. In order to solve these problems, the development of a technique for differentiating pluripotent stem cells into small intestinal epithelial-like cells is being actively promoted.
  • the small intestinal epithelial-like cells differentiated from pluripotent stem cells by the conventional induction method have significantly lower activity of the drug-metabolizing enzyme CYP3A4 than the living small intestine even when matured.
  • An object of the present invention is to provide small intestinal epithelial-like cells having properties closer to those of primary cultured human small intestinal epithelial cells without using gene transfer technology.
  • the present inventors expressed drug-metabolizing enzymes when culturing in the presence of active vitamin D in the process of differentiating small intestinal epithelial progenitor cells into small intestinal epithelial-like cells. He found that he could go up and completed his invention.
  • the present invention provides the following.
  • Method for producing small intestinal epithelial-like cells including the following steps; (I) A step of culturing small intestinal epithelial progenitor cells in a medium containing active vitamin D; and (ii) a step of obtaining small intestinal epithelial-like cells obtained in the above step (i).
  • the method according to [1] further comprising the step of differentiating endoderm cells into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • a drug toxicity evaluation method and / or a pharmacokinetic evaluation method which comprises using small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6].
  • a method for examining drug-drug interactions which comprises using small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6].
  • a drug-metabolizing enzyme induction test method which comprises using small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6].
  • a medium containing a TGF ⁇ receptor inhibitor, a GSK inhibitor, and active vitamin D which comprises using small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6].
  • the Rho-kinase inhibitor is Y27632
  • the vinca alkaloid antitumor agent is vinblastine
  • the MEK inhibitor is PD0325901
  • the cAMP derivative is Br-cAMP.
  • [14] Use of small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6] in the drug toxicity evaluation method and / or the pharmacokinetic evaluation method.
  • [15] Use of small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6] in the method for examining drug-drug interactions.
  • [16] Use of small intestinal epithelial-like cells produced by the method according to any one of [1] to [6] in the drug-metabolizing enzyme induction test method.
  • the present invention it becomes possible to stably provide small intestinal epithelial-like cells capable of evaluating drug metabolism and absorption. Furthermore, according to the method of the present invention, it is possible to easily reshape a monolayer membrane having a tight junction function from frozen small intestinal epithelial-like cells and provide small intestinal epithelial-like cells expressing metabolic enzymes in a short-term culture. ..
  • the small intestinal epithelial-like cells obtained by the present invention can be applied to drug discovery research and metabolic absorption test of food nutrition.
  • the "small intestinal epithelial cell” means a cell contained in the tissue covering the lumen surface of the small intestine, which includes absorptive cells, endocrine cells and crypt cells (mucinous gland cells, serous gland cells) of the small intestine. And stem cells).
  • absorptive cells e.g., adenosar cells
  • endocrine cells e.g., adenosar cells
  • crypt cells mucinous gland cells, serous gland cells of the small intestine.
  • stem cells e.g., stem cells having the properties of small intestinal epithelial cells artificially differentiated and induced in vitro (exovibo, in vitro) are called "small intestinal epithelial-like cells”.
  • Villin 1 Bacillin 1
  • Cdx2 Caudal reserved homeobox gene type2
  • SI saliva-isomaltase
  • Ifabp Isx
  • Lactase Lactase
  • Lactase Enterocytes
  • proteins Zonula (Zona) occludens1 protein, also known as Tight-junction protein-1 (TJP-1)
  • drug-metabolizing enzyme CYP3A4 transporters P-gp, PEPT1, ANPEP, OST ⁇ , BCRP Included are marker genes and their products.
  • the "small intestinal epithelial progenitor cell” is a cell capable of differentiating into a small intestinal epithelial-like cell, and includes a small intestinal epithelial stem cell and an intestinal epithelial stem cell.
  • markers that can be used as indicators of small intestinal epithelial progenitor cells for example, G protein-coupled receptor 5 (LGR5) containing leucine-rich repeat, ephrin B2 receptor (EphB2), Musashi-1, CDX2, ALCAM, ASCL2, ITGB1, OLFM4, Examples thereof include enterocyte marker genes such as SOX9 and their products.
  • the term "embryonic endoderm cell” refers to the entire intestinal tract including the esophagus, stomach, small intestine and large intestine, as well as the lung, liver, thoracic gland, parathyroid gland, thyroid gland, gallbladder, among endoderm cells. And cells that can differentiate into organs derived from the intestinal tract such as the pancreas. Specifically, it refers to cells positive for E-cadherin (ECD) and CXCR4, which are endoderm cell markers, or ECD and CD55.
  • ECD E-cadherin
  • CXCR4 endoderm cell markers
  • pluripotent stem cell refers to a cell that has proliferative ability under artificially constructed conditions (in vitro) such as in vitro and can differentiate into cells of all tissues of a living body.
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • the ES cells used in the present invention may be any mammalian-derived ES cells, and their types are not particularly limited. For example, primates such as humans and chimpanzees, rodent somatic cells such as mice and rats, and so on. Particularly preferably, human ES cells can be used.
  • mouse ES cell lines R1 can be used if they are derived from mice
  • human ES cell lines KhES-1, KhES-2, KhES-3, and H1, H9 can be used if they are derived from humans. it can.
  • IPS cells are pluripotent (pluripotent) and proliferative cells produced by reprogramming somatic cells by introducing reprogramming factors or the like.
  • iPS cells exhibit properties similar to ES cells.
  • the somatic cells used for producing iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. Further, the origin thereof is not particularly limited, but it is preferable to use mammalian somatic cells (for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), and particularly preferably human somatic cells. it can.
  • mammalian somatic cells for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats
  • iPS cells can be produced by various methods reported so far.
  • the cells that have undergone transformation into iPS cells, that is, reprogramming are the pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Crypt. Expression and the like can be selected as an index.
  • the iPS cells can also be provided by, for example, the National University Corporation Kyoto University or the RIKEN BioResource Center.
  • the present invention provides a method for producing small intestinal epithelial-like cell, which comprises the following steps. (I) A step of culturing small intestinal epithelial progenitor cells in a medium containing active vitamin D; and (ii) a step of obtaining small intestinal epithelial-like cells.
  • the method for obtaining the small intestinal epithelial progenitor cells used in the method of the present invention is not particularly limited, and for example, they may be isolated from a living body by a known method, or differentiated from endoderm cells or pluripotent stem cells. May be prepared.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-206510 describes a method for obtaining intestinal stem / progenitor cells from a living intestinal tract.
  • mammalian cells for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats
  • human cells particularly preferably human cells can be used.
  • pluripotent stem cells When differentiating small intestinal epithelial progenitor cells from pluripotent stem cells, for example, pluripotent stem cells can be differentiated into endoderm cells (embryonic germ layer cells), and endoderm cells can be differentiated into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • endoderm cells embryonic germ layer cells
  • endoderm cells can be differentiated into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • known methods can be used as a method for differentiating pluripotent stem cells into endoderm cells.
  • GSK3 inhibitor eg, CHIR99021
  • Activin A Activin A
  • PI3K inhibitor eg, Ly294002
  • DNA methylation inhibitor eg, 5-Aza-2'-deoxycytide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a medium to which a compound such as the above is added can be used, and particularly preferably, a medium to which Activin A is added can be used.
  • the amount of the above compound added is not particularly limited as long as it can differentiate from pluripotent stem cells to endoderm cells.
  • a commercially available kit such as Cellartis (registered trademark) Definitive Endoderm Differentiation Kit (Takara Bio Inc.) can be used.
  • the culture period for differentiation is not particularly limited, but is, for example, 3 to 10 days, preferably 4 to 8 days.
  • a known method can be used as a method for differentiating endoderm cells into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • a medium obtained by adding a compound such as a GSK-3 inhibitor (for example, LY2090314, BIO) or a ⁇ -secretase inhibitor as a Notch signal inhibitor (for example, DAPT) to a basal medium can be used.
  • the amount of the above compound added is not particularly limited as long as it can differentiate from endoderm cells into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • LY2090314 it is added to the medium at a concentration of 1 to 40 nM, preferably 5 to 30 nM.
  • the culture period for differentiation is not particularly limited, but is, for example, 2 to 8 days, preferably 3 to 5 days.
  • active vitamin D used in the step (i) of the present invention for example, active vitamin D2 or active vitamin D3 (calcitriol) can be used.
  • concentration of active vitamin D is such that the final concentration in the medium is, for example, 1 nM to 10 ⁇ M, preferably 10 nM to 1 ⁇ M, and particularly preferably 50 to 500 nM.
  • the medium used in step (i) is not particularly limited as long as it is a medium that differentiates small intestinal epidermal precursor cells into small intestinal epidermal-like cells.
  • a GSK-3 inhibitor LY2090314, BIO, SB216763, SB415286, etc.
  • a medium supplemented with a ⁇ -secretase inhibitor can be used.
  • a medium obtained by adding a GSK-3 inhibitor (preferably LY2090314) and a TGF ⁇ receptor inhibitor (preferably SB431542) to the basal medium can be used.
  • a medium supplemented with a GSK-3 inhibitor preferably LY2090314), a TGF ⁇ receptor inhibitor (preferably SB431542) and EGF (preferably human EGF) can be used.
  • the amount of the above compound added is not particularly limited as long as it can differentiate from small intestinal epithelial progenitor cells to small intestinal epithelial-like cells. Active vitamin D is added to the above medium for use.
  • the culture period for differentiation is not particularly limited, but is, for example, 5 to 30 days, preferably 10 to 25 days. During the culture period, passage and / or medium exchange can be carried out as appropriate.
  • the basal medium used in the preparation of small intestinal epithelial precursor cells and step (i) is not particularly limited, but for example, MEM (Eagle's Salt), Iskov modified Dalveco medium (IMDM), modified Dalveco method.
  • IMDM Iskov modified Dalveco medium
  • D-MEM Eagle's medium
  • Ham's F-12 medium RPMI1640 medium
  • Grasgo basic medium and the like can be used.
  • the culture conditions (culture temperature, etc.) may be the conditions generally adopted in the culture of animal cells. That is, for example, the cells may be cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium used for the preparation of small intestinal epithelial progenitor cells and step (i) includes serum, plasma or serum replacement (KSR), from the viewpoint of maintaining cell proliferation rate and survival rate. It is preferable to add B-27 (Supplement, etc.).
  • KSR serum replacement
  • B-27 Supplemental, etc.
  • serum fetal bovine serum, human serum, sheep serum and the like can be used.
  • the amount of serum or serum substitute added is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • feeder cells can be used for the preparation of small intestinal epithelial progenitor cells and the culture of step (i).
  • mitomycin C-treated mouse embryo fibroblasts MEFs
  • ECM extracellular matrix secreted by connective tissue cells
  • ECM consists of, for example, polysaccharides, water, elastin, and glycoproteins (matrix proteins). Matrix proteins include collagen, entactin (nidegen), fibronectin, and laminin.
  • the ECM can be provided by culturing ECM-producing cells, such as fibroblasts, and then removing these cells.
  • ECM-producing cells include chondrocytes that produce collagen and proteoglycans, type IV collagen, laminin, interstitial procollagen, and fibronectin-producing fibronectin, and collagen (types I, III, and V), chondroitin sulfate. Collagen myofibroblasts that produce proteoglycans, hyaluronic acid, fibronectin, and tenesin-C can be used.
  • ECMs are commercially available, such as basement membrane preparations derived from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells (eg, Matrigel TM (BD Biosciences)), human recombinant laminin fragments (eg iMatrix).
  • the above-mentioned culture can be carried out in the coexistence of an isolated matrix protein or a fragment thereof.
  • an isolated matrix protein or a fragment thereof For example, collagen, fibronectin, vitrotin, laminin and fragments thereof can be used for culturing.
  • the matrix protein and its fragment for example, an isolate or a recombinant prepared by a gene recombination technique can be used.
  • cell culture may be carried out using an appropriate container selected in consideration of the number of cells and other conditions.
  • Any form of cell culture container such as a plate, petri dish, flask or bag, can be used.
  • a carrier for using as a scaffold for cells for example, beads, a membrane, a hollow fiber, or the like may be used.
  • the step (i) of the present invention may further include a step of freezing the small intestinal epithelial progenitor cells and a step of thawing the frozen small intestinal epithelial progenitor cells. Prolonged storage of cells by interrupting culture and freezing is useful in supplying small intestinal epithelial-like cells at the appropriate time.
  • the step of freezing the cells is carried out 5 to 15 days after the start of culturing the small intestinal epithelial progenitor cells, preferably 7 to 13 days.
  • the step of freezing the cells can be carried out by freezing the cells in the medium as they are, or by replacing the medium with a cryoprotectant and freezing.
  • the cell freezing method is generally roughly classified into a slow freezing method and a quick freezing method (vitrification method). Either freezing method may be used in the present invention.
  • the slow freezing method cells are suspended in a cryopreservation solution containing glycerin, DMSO, keratin hydrolyzate, hydrolyzed gelatin, serum, serum albumin, etc. as a cryoprotectant, and the temperature is lowered by about 1 ° C. per minute. This is a method of gradually freezing.
  • the vitrification method is a method of freezing cells into a glass shape by rapid cooling in order to suppress the formation of ice crystals inside and outside the cells due to freezing.
  • a vitrification method a method using a vitrification preservative solution containing a cryoprotectant composed of high-concentration DMSO, acetamide, propylene glycol, and polyethylene glycol is known.
  • Freezing protective agents are commercially available, and are STEM-CELLBANKER (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), CryoDefend-Stem Cell (R & D System Co., Ltd.), bun bunker (Nippon Genetics Co., Ltd.), and Lab bunker (registered trademark). 2 (Juji Field Co., Ltd.) and the like can be used, and cells can be frozen according to the respective instructions.
  • Frozen cells can be stored in a low temperature freezer or ultra-low temperature freezer (usually in the range of -20 ° C to -150 ° C) or in liquid nitrogen (usually in the range of -150 ° C to -196 ° C).
  • the cells to be frozen are adhered to the container wall or the like, they can be released (peeled) from there, collected, and suspended in a cryoprotectant.
  • Cell detachment can be performed, for example, by enzymatic treatment with a proteolytic enzyme (eg trypsin, etc.) and / or mechanical / physical treatment with pipetting, scraper, or the like.
  • a proteolytic enzyme eg trypsin, etc.
  • the cell exfoliating agent include Accutase (registered trademark, Innovative Cell Technologies), TrypLE (registered trademark) Express (Thermo Fisher Scientific), and TrypLE (registered trademark) Cel, which do not contain mammalian and bacterial components. , And TrypZean (Sigma) and the like can be used.
  • the step of thawing frozen cells can be performed by any cell thawing technique, for example, contacting frozen cells with a solid, liquid or gaseous medium (eg, water, gas phase) at a temperature higher than the thawing temperature.
  • a solid, liquid or gaseous medium eg, water, gas phase
  • frozen cells can be thawed by immersing them in a medium having a temperature higher than the freezing temperature (for example, a culture solution).
  • the temperature of the thawing means or the immersion medium is not particularly limited as long as the cells can be thawed within a desired time, but is, for example, 4 to 50 ° C., preferably 30 ° C.
  • the thawing time is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after thawing, but is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 2 to 5 minutes.
  • the small intestinal epithelial progenitor cells are re-seeded in a medium, for example, the medium used before freezing.
  • the culture period after thawing is appropriately set according to the entire culture period of the small intestinal epithelial progenitor cells and the culture period before freezing, but the total culture period may be set to about 5 to 30 days, for example. 2 to 10 days, preferably 4 to 8 days.
  • thawed small intestinal epithelial progenitor cells are selected from the group consisting of MEK inhibitor, cAMP and its derivatives, Rho kinase inhibitor and vinca alkaloid antitumor agent in addition to active vitamin D. Can be cultured in a medium further containing one or more substances.
  • thawed small intestinal epithelial precursor cells contain active vitamin D, TGF ⁇ receptor inhibitor and GSK inhibitor, MEK inhibitor, cAMP and derivatives thereof, Rho kinase inhibitor and vinca alkaloid system. It can be cultured in a medium further containing one or more substances selected from the group consisting of antitumor agents.
  • Rho-kinase (ROCK) inhibitors can use, but are not limited to, for example, Y27632, HA1100, HA1077, thiazobibin, and GSK492286.
  • Rho-kinase inhibitors can be added to the medium during the entire or partial period of culture after thawing of small intestinal epithelial progenitor cells, 1-5 days after thawing of cells, preferably 1-3 days after thawing. , Particularly preferably added to the medium for 1 day after thawing.
  • the concentration of the Rho-kinase inhibitor may be appropriately set. For example, when Y27632 is used, it is added to the medium at a final concentration of, for example, 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 10 nM.
  • the vinca alkaloid antitumor drug is an anticancer activity isolated from the plant Catharanthus roseus (L.) G. Don of the Apocynaceae family, and the yellow catharanthus roseus (L.) G. Don cv Flavus. It is a bisindole alkaloid having.
  • vinblastine VLB
  • vincristine VCR
  • vindesine VDS
  • vinorelbine NVB
  • Vinca alkaloid antitumor agents are cell cycle-specific agents that act primarily in the G2 phase of cells (late stage of DNA synthesis).
  • Vinca alkaloid antitumor agents can be added to the medium during the entire period of culture after thawing of small intestinal epithelial progenitor cells, preferably 1 to 6 days after thawing of the cells, particularly preferably 2 to 4 after thawing. Add to medium daily. When vinblastine is used, it is added to the medium at a final concentration of, for example, 0.1 to 1000 nM, preferably 1 to 100 nM.
  • MEK inhibitor known MEK inhibitors can be used, and for example, trametinib, cobimetinib, selmetinib, refametinib, Refametinib, Refametinib, Pimaseltib, Pimacertib, Pimaseltib, Pimaseltib AZD8330 / ARRY-424704, GDC-0973 / RG7420, GDC-0623 / RG7421 / XL518, CIF / RG7167 / RO4987655, CK127 / RG7304 / RO5126766, E6201, TAK-733, PD-0325901, AS7039588 / C Examples thereof include CI-1040 / PD184352, AS703026, PD318888, PD98059, and SL327.
  • the concentration of the MEK inhibitor may be appropriately set. For example, when PD-0325901 is used, it is
  • the cAMP derivative is a compound in which a substituent is modified to cyclic AMP, for example, 8-bromocyclic adenosine monophosphate (8-Br-cAMP, also simply referred to as Br-cAMP), 8-chlorocyclic adenosine monophosphorus. Examples thereof include acid (8-Cl-cAMP), 8- (4-chlorophenylthio) cyclic adenosine monophosphate (8-CPT-cAMP), and dibutyryl cyclic adenosine monophosphate (DB-cAMP).
  • the concentration of cAMP or cAMP derivative may be appropriately set.
  • the final concentration in the medium is, for example, 0.1 to 1000 ⁇ M, preferably 0.5 to 500 nM, and more preferably 1 to 1. Add at 300 nM.
  • the step of acquiring small intestinal epithelial-like cells is a step of acquiring cells differentiated into small intestinal epithelium obtained in step (i) or a subsequent step.
  • the cells contained in the cell population obtained in step (i) or the subsequent steps may be obtained as small intestinal epithelial-like cells as they are, and small intestinal epithelial-like cells are isolated, isolated, and used using markers of small intestinal epithelial cells. It may be purified and obtained as small intestinal epithelial-like cells.
  • the small intestinal epithelial-like cells obtained by the production method of the present invention are cells obtained by artificially differentiating from small intestinal epithelial progenitor cells, and are characterized by expressing a drug-metabolizing enzyme or a drug transporter. ..
  • the small intestinal epithelial-like cells express the small intestinal epithelial markers Villin and CDX2.
  • the expression levels of the drug-metabolizing enzyme CYP3A4 and the transporters PEPT1, P-gp, etc. in the small intestinal epithelial-like cells are equal to or higher than those of Caco-2 cells, which are widely used as an intestinal epithelial cell model. Shown.
  • small intestinal epithelial-like cells form strong tight junctions between cells characteristically found in small intestinal epithelial cells, and TEER and ZO-1 proteins (Zonula (Zona) occludens1 protein, also known as: Tight-junction protein-). 1 (TJP-1)) is highly expressed.
  • TEER and ZO-1 proteins Zonula (Zona) occludens1 protein, also known as: Tight-junction protein-). 1 (TJP-1)
  • TJP-1 TJP-1
  • the small intestinal epithelial-like cells obtained by the production method of the present invention are a cell population having a positive rate of Villin1 of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, and at least 95%. Small intestinal epithelial-like cells may be further isolated, isolated, and purified from this cell population using markers of small intestinal epithelial cells.
  • the present invention provides a medium containing a TGF ⁇ receptor inhibitor, a GSK inhibitor and active vitamin D.
  • This medium is prepared by adding a TGF ⁇ receptor inhibitor, a GSK inhibitor and active vitamin D to the basal medium described in (1).
  • the medium of the present invention may further contain EGF, such as human EGF.
  • the medium of the present invention may further contain one or more substances selected from the group consisting of MEK inhibitors, cAMP and its derivatives, Rho kinase inhibitors and vinca alkaloid antitumor agents.
  • the concentration of each component contained in the medium of the present invention can be set to a concentration suitable for producing small intestinal epithelial-like cells.
  • the medium of the present invention can be used for producing small intestinal epithelial-like cells.
  • Each component contained in the medium of the present invention is as described in (1).
  • the present invention provides a drug toxicity evaluation method and a pharmacokinetic evaluation method, which are characterized by using the small intestinal epithelial-like cells obtained by the above production method. Further, a method for examining an interaction between drugs and a method for inducing a drug-metabolizing enzyme, which are characterized by using the small intestinal epithelial-like cells, are provided.
  • evaluation of drug toxicity / pharmacokinetics of drug candidate compounds and research on drug-drug interactions which have been conventionally performed using primary cultured human small intestinal epithelial cells. , Evaluation of drug-metabolizing enzyme-inducing ability, etc. can be performed with higher accuracy and reproducibility.
  • Example 1 Preparation of small intestinal epithelial-like cells expressing CYP3A4 The following mediums 1 to 3 were prepared. "Medium 1" Human iPS cells were cultured in DEF-CS (Takara Bio Inc.) supplemented with bFGF so as to have a final concentration of 30 ng / mL, and maintained in an undifferentiated state.
  • Endodermal cells were prepared using human iPS cells, which are pluripotent stem cells.
  • ChiPSC18 (Takara Bio Inc.) was used as a human iPS cell line.
  • the human iPS cells 1.5 ⁇ 10 6 cells were seeded on a fibronectin-coated T75 flask, and precultured according to the manual attached to the product under feeder-free conditions using medium 1.
  • the human iPS strain obtained by pre-culture was induced to differentiate into endoderm cells by culturing for 6 days according to the manual attached to the product using Medium 2 and Cellartis (registered trademark) Definitive Endoderm Differentiation Kit.
  • Endoderm cells were seeded onto 1 ⁇ 10 6 /well(2.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2) Matrigel coated with the 12-well plates (3.8 cm 2), using the medium 3 containing 20 nM LY2090314 The cells were cultured for 4 days to induce differentiation into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • Small intestinal epithelial progenitor cells were cultured for 20 to 25 days using medium 3 containing 3 nM LY2090314, 100 nM active vitamin D3, 10 ⁇ M SB431542, 50 ng / mL human EGF (hereinafter referred to as “medium 3-A”). Induced differentiation into small intestinal epithelial-like cells. Medium exchange was performed every other day.
  • endometrial cells are induced to differentiate into small intestinal epithelial progenitor cells using a medium 3 containing 5 ⁇ M BIO and 10 ⁇ M DAPT, and these small intestinal epithelial progenitor cells are 1 ⁇ M BIO, 2 ⁇ M DAPT, 10 ⁇ M SB431542, 50 ng. / ML Differentiation was induced into small intestinal epithelial-like cells using medium 3 containing human EGF.
  • the method for producing small intestinal epithelial-like cells and the existing method of the present invention are shown in FIG.
  • Example 2 Gene expression of drug-metabolizing enzyme CYP3A4 Each small intestinal epithelial-like cell was collected 20 days after the start of culturing of the small intestinal epithelial progenitor cells in Example 1.
  • FIG. 2 shows a relative value with gene expression in human adult small intestinal tissue as 1.
  • the result of the existing method is "(1)”
  • the result of the method of the present invention is "(2)”
  • the result of RNA of human adult small intestinal tissue is "Small intestine”
  • the result of Caco-2 cells is shown. Shown as "Caco2”.
  • FIG. 2 it was confirmed that the cells obtained by the production method of the present invention had higher expression of drug-metabolizing enzyme than the cells obtained by the existing method and Caco-2 cells.
  • Example 3 Time-dependent changes in gene expression of small intestinal epithelial-like cells
  • Three types of human iPS cell lines, ChiPSC18 (C18), ChiPSC12 (C12), and ChiPSC22 (C22) (above, Takara Bio) were prepared and used as Example 1.
  • Differentiation of small intestinal epithelial-like cells was induced by the same method.
  • C18 cells were collected on days 10, 15, and 21 from the start of culture of small intestinal epithelial progenitor cells.
  • C12 cells and C22 cells were collected on the 15th and 21st days after the start of culturing the small intestinal epithelial progenitor cells.
  • the gene expression of each of the small intestine markers (Villin, CDX-2, SI), drug-metabolizing enzyme (CYP3A4), and transporter (P-gp) was measured by the same method as shown in Example 2.
  • Human adult small intestinal tissue-derived Total RNA was used as a control.
  • the relative value with the gene expression of human adult small intestinal tissue as 1 is shown in FIG.
  • gene expression of Villin, CYP3A4, and P-gp tended to increase with time in cells derived from all human iPS cell lines.
  • the expression of SI, CYP3A4, and P-gp was confirmed on the 10th day from the start of culturing the small intestinal epithelial progenitor cells.
  • Example 4 Gene expression of small intestinal epithelial-like cells prepared by exfoliation and re-seed
  • small intestinal epithelial-like cells prepared by exfoliation and reseed of small intestinal epithelial precursor cells gene expression was performed to confirm the effects of exfoliation and re-seed. It was confirmed.
  • Small intestinal epithelial progenitor cells were prepared in the same manner as in Example 1. Small intestinal epithelial progenitor cells were cultured in medium 3-A, and the medium was removed 10 days after the start of culture. The cells were washed once with phosphate buffered saline (PBS (-)) containing no calcium and magnesium, and then the cells were detached using the release agent Accumax (Innovative Cell Technologies) to remove the dispersed cells. It was recovered. The cells were washed with medium 3-A, resuspended and stained with 0.4% trypan blue solution (GIBCO) to calculate the total number of living cells.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • Accumax Innovative Cell Technologies
  • Example 5 Cryopreservation of small intestinal epithelial progenitor cells
  • exfoliation and re-seed of small intestinal epithelial progenitor cells had no significant effect. Therefore, the detached cells were frozen, thawed, and then reseeded. Was evaluated.
  • Small intestinal epithelial progenitor cells were prepared in the same manner as in Example 1. Small intestinal epithelial progenitor cells were cultured in medium 3-A, and the medium was removed 10 days after the start of culture. After washing the cells once with PBS ( ⁇ ), the cells were detached using the release agent Accumax, and the dispersed cells were collected. Cells were washed with medium 3-A, resuspended, stained with 0.4% trypan blue, and cells were counted to confirm 80-90% viability.
  • Example 6 Thaw and culture of small intestinal epithelial progenitor cells The following medium 6 was prepared. "Medium 6" Concentrations below in 10% KSR + DMEM (10% KSR, 100 unit / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin sulfate, 2 mmol / mL alanyl-L glutamine, 1% MEM essential amino acid solution (x100) in Dalbecco modified Eagle's medium) 4 kinds of inducers were added so as to prepare medium 6; 3 nM LY2090314, 100 nM active vitamin D3 (calcitriol), 10 ⁇ M SB431542, 50 ng / mL human EGF.
  • a Matrigel solution prepared by diluting Matrigel (registered trademark) 48 times with DMEM was prepared and dispensed at 200 ⁇ L / cm 2 into a culture vessel (12-well plate) while cooling on ice.
  • the culture vessel was held in a cell culture incubator at 37 ° C. for 30 minutes or more to coat the culture vessel with Matrigel, and the Matrigel solution was removed from the culture vessel.
  • the cryopreserved cells prepared in Example 5 were thawed in a 37 ° C. water bath and centrifuged at 200 ⁇ G for 5 minutes at room temperature to remove the supernatant containing the cryoprotectant.
  • the total RNA derived from human adult small intestinal tissue is "small instance"
  • the small intestinal epithelial-like cells of Example 1 are “continuously cultured”
  • the small intestinal epithelial-like cells of Example 4 are "Day 10 Seeding”, frozen and of this example.
  • the thawed cells are shown as "Day 10 Freeze & Thaw”.
  • the frozen and thawed cells did not show a significant effect on gene expression as compared with the continuously cultured cells and the exfoliated and reseeded cells.
  • Example 7 Freezing and thawing of small intestinal epithelial progenitor cells and small intestinal epithelial-like cells
  • a comparative test was conducted on small intestinal epithelial-like cells prepared by freezing and thawing on the 11th and 20th days from the start of culture of small intestinal epithelial progenitor cells. ..
  • the small intestinal epithelial-like cells prepared by the method of Example 5 were collected on the 11th day except for culturing the small intestinal epithelial progenitor cells from the start of culturing to the 11th day, frozen by the method of Example 5, and the cells of Example 6 Defrosted by the method.
  • the small intestinal epithelial-like cells prepared by the method of Example 1 were collected 20 days after the start of culture, frozen by the method of Example 5, and thawed by the method of Example 6.
  • FIG. 5 shows a microscopic image of the cells after culturing. No morphological abnormalities were observed in cells frozen on the 11th day from the start of culture of small intestinal epithelial progenitor cells (Day 11 cryopreservation), whereas morphological abnormalities were observed in cells frozen on the 20th day (Day 20 cryopreservation). Was confirmed.
  • TEER epidermal electrical resistance
  • Millicell ERS-2 resistance value measurement system 1.5 mL was added to the apical side (cell insert) and 2.7 mL of 10% KSR + DMEM was added to the lateral bottom side (companion plate), and the cells were not seeded as wells and blanks in which the cells were seeded. Wells were measured.
  • the TEER of the cells frozen on the 20th day from the start of culture of the small intestinal epithelial progenitor cells was the same as that of the blank, and the formation of tight junctions was not confirmed. On the other hand, the formation of tight junctions was confirmed in the cells frozen on the 11th day (Day11 cryopreservation).
  • Lucifer Yellow is a substance that permeates the intercellular spaces of cells, but cannot permeate the intercellular spaces of cells that form tight junctions such as the epithelium of the small intestine.
  • 10 ⁇ M Lucifer Yellow (1.5 mL) was added to the apical side, a buffer (2.7 mL) was added to the bottom side, and the transmission to the bottom side was measured and confirmed by the fluorescence wavelength.
  • a standard solution was prepared by serially diluting a known concentration of lucifer yellow, a standard curve was created, and the permeation amount and permeability coefficient (Papp) of lucifer yellow were calculated.
  • As the buffer HBSS_Ca (+) and Mg (+) supplemented with 25 mM glucose and 10 mM HEPES pH 7.4 were used. The results are shown in Table 2.
  • the permeability coefficient of Lucifer Yellow From the measurement results of the permeability coefficient of Lucifer Yellow, the permeability coefficient of the cells frozen on the 20th day from the start of culture of the small intestinal epithelial progenitor cells (Day20 cryopreservation) was high, and the formation of tight junctions was not confirmed. On the other hand, the formation of tight junctions was confirmed in the cells frozen on the 11th day (Day11 cryopreservation).
  • Example 8 Addition of vinca alkaloid antitumor agent
  • the following medium 5 containing vinblastine as the vinca alkaloid antitumor agent was prepared.
  • "Medium 5" 10% KSR + DMEM containing 3 nM LY2090314, 100 nM active vitamin D3, 10 ⁇ M SB431542, 50 ng / mL human EGF, 10 nM vinblastine.
  • the cryopreserved cells prepared in Example 5 were thawed in a 37 ° C. water bath and centrifuged at 200 ⁇ G for 5 minutes at room temperature to remove the supernatant containing the cryoprotectant.
  • the cells were suspended in 1 mL of medium 5, the total number of living cells was calculated in 0.4% trypan blue solution, and the total amount was reseeded on a 12-well plate coated with Matrigel at 4.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2. did.
  • the culture after thawing was carried out for 10 days by exchanging the medium 5 every other day.
  • FIG. 6 shows a microscopic image of the 10th day of culture after re-seed using the medium 5. It was confirmed that by using a medium containing 10 nM vinblastine, the small intestinal epithelial-like cells were uniformly arranged as compared with the case where a medium containing no vinblastine (0 nM) was used.
  • the concentration of vinblastine contained in the medium 5 was changed to 0 nM, 3 nM, and 10 nM to induce differentiation of small intestinal epithelial-like cells, and small intestinal markers (Villin, CDX-2) and drug-metabolizing enzymes were used in the same manner as in Example 3.
  • CYP3A4 transporter (PEPT1, ANPEP, OST ⁇ ) gene expression was measured.
  • total RNA (Clontech) derived from human adult small intestinal tissue was prepared. The results are shown in FIG. In FIG. 7, the total RNA derived from human adult small intestinal tissue is shown as “small intestine”. As shown in FIG. 7, it was shown that the addition of vinblastine increased the expression of marker genes in small intestinal epithelial cells.
  • Example 9 Addition of Rho-kinase inhibitor
  • a method of using a medium containing Y27632 as a Rho-kinase inhibitor as a medium for reseeding thawed cells was examined.
  • the following medium 4 was prepared.
  • Example 6 the thawed cells were reseeded in medium 6 and cultured for 10 days (Y27632-, Vinblastine-), and the thawed cells were reseeded in medium 4 and cultured for 1 day, and then medium 5 Cells (Y27632 +, Vinblastine +) cultured in medium 6 for 7 days, thawed cells were re-seeded in medium 4 and cultured for 1 day, and then cells cultured in medium 6 for 9 days (Y27632 +, Vinblastine-).
  • the thawed cells were re-seeded in medium 6 and cultured for 1 day, then cultured in medium 5 for 2 days, and then cultured in medium 6 for 7 days (Y27632-, Vinblastine +). did. After 2 hours and 30 minutes after reseeding the cells, the adhesion and morphology of the cultured cells were confirmed with a microscope on the 2nd and 5th days, and morphological images were obtained over time (FIG. 8). It was shown that the addition of Y27632 increased the adhesion efficiency, and the addition of 10 nM vinblastine gave a uniform morphology.
  • Example 10 Examination of re-seed density Y27632 + and Vinblastine + cells of Example 9 (that is, thawed cells were re-seeded in medium 4 and cultured for 1 day, then cultured in medium 5 for 2 days, and then cultured in medium 6 for 7 days.
  • Small intestinal epithelial-like cells were prepared in the same medium and the number of days of culture except that the cells were cultured in medium 6 for 8 days.
  • small intestinal epithelial progenitor cells were induced and cultured on a 24-well plate (1.9 cm 2 ) at 5 ⁇ 10 6 cells / well (2.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ), and 5 days after reseeding (re-seed).
  • RNA (Clontech) derived from human adult small intestinal tissue was prepared. The results are shown in FIG. In FIG. 9, cells in which human adult small intestinal tissue-derived total RNA was reseeded at “small instance” and 3.75 ⁇ 10 5 cells / cm 2 were reseeded at “375 K” and cells were reseeded at 5 ⁇ 10 5 cells / cm 2. Shown as "500K”. In FIG. 9,
  • Example 11 Examination of additive drug 1 Small intestinal epithelial progenitor cells were frozen in the same manner as in Example 5. However, a solution in which KSR: DMSO was mixed at a ratio of 9: 1 was used as a cryoprotectant. Various agents were added to the medium 6 for reseeding the thawed cells.
  • the thawed cells were reseeded in the medium 6 to which the drug was added according to the conditions 1 to 7 in Table 3 in the same manner as in Example 6, and the cells were collected by culturing for 8 days.
  • the expression of drug-metabolizing enzyme (CYP3A4) and transporter (P-gp) genes was measured by the same method as in Example 3.
  • As a control total RNA (Clontech) derived from human adult small intestinal tissue was prepared. The results are shown in FIG. In FIG. 10, the total RNA derived from human adult small intestinal tissue is shown as "small intestine". From FIG. 10, it was confirmed that the expression of CYP3A4 was improved by adding all the drugs as compared with the case where all the drugs were not included.
  • Example 12 Examination of additive drug 2
  • the endodermal cells were prepared in the same manner as in Example 1, were plated on 9.375 ⁇ 10 6 /Flask(1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2) in Matrigel-coated T75 flasks (75 cm 2), The medium 3 containing 30 nM LY2090314 was cultured for 4 days to induce differentiation into small intestinal epithelial progenitor cells.
  • the thawed cells were reseeded in medium 4 in the same manner as in Example 6 (Day 0).
  • the cells were collected by exchanging with medium 5 on Day 1, then exchanging on Day 3, Day 5, and Day 7 with medium 6 to which the reagent was added under the conditions shown in Table 4, and culturing for 7 days.
  • the expression of drug-metabolizing enzyme (CYP3A4) and transporter (P-gp) genes was measured by the same method as in Example 3.
  • As a control total RNA (Clontech) derived from human adult small intestinal tissue was prepared. The results are shown in FIG. In FIG. 11, the total RNA derived from human adult small intestinal tissue is shown as "small intestine". From FIG. 11, it was shown that it is effective to add PD0325901 and Br-cAMP.
  • the cells obtained by the production method of the present invention are confirmed to have gene expression of each marker expressed by the small intestinal epithelium, drug-metabolizing enzyme and transporter, and have a tight junction function. It can be called an epithelial-like cell.
  • the expression level of drug-metabolizing enzyme is superior to that of Caco-2 cells, which is an existing technique.
  • we have established a method for producing these small intestinal intestinal epithelial-like cells by cryopreserving small intestinal epithelial progenitor cells and inducing and culturing them from thawing and reseeding by a simple operation of adding a drug.
  • small intestinal intestinal epithelial-like cells can be produced on a large scale and stably supplied, and a simple and short culture period can be used to perform a metabolic absorption test of drugs and nutrients. Therefore, according to the present invention, small intestinal epithelial-like cells that are more versatile and convenient than primary cultured small intestinal epithelial cells, which are difficult to obtain and have variations in performance, can be obtained. It is expected that the small intestinal epithelial-like cells obtained by the method of the present invention can greatly contribute to the development of drug metabolism and absorption tests for pharmaceutical products and food analysis.

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Abstract

本発明によれば、以下の工程を含む小腸上皮様細胞の製造方法； （ｉ）小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤを含む培地で培養する工程；及び （ｉｉ）小腸上皮様細胞を取得する工程 が提供される。

Description

小腸上皮様細胞の製造方法
　本発明は、創薬分野への応用が期待される小腸上皮様細胞の製造方法に関する。さらに、製造途中の細胞を凍結保存し、解凍後再誘導する工程を含む小腸上皮様細胞の製造方法に関する。また、前記製造方法で製造された小腸上皮様細胞を用いる薬物毒性評価方法、薬物間相互作用の検査方法及び薬物代謝酵素誘導試験方法に関する。
　多能性幹細胞とは、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞である。多能性幹細胞から分化した細胞には、損傷組織を修復する機能があり、再生医療分野での有用性から盛んに研究されている。多能性幹細胞の中でもｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）は、線維芽細胞のような体細胞由来に特定の転写因子ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ等の遺伝子を導入することにより脱分化させた、人工的に作製された多能性幹細胞である。分化多能性を持った細胞は理論上、小腸上皮細胞を含む全ての組織や臓器に分化可能である。
　非特許文献１は、ヒト多能性幹細胞から小腸組織を作製し報告した文献である。非特許文献１は、小腸の上皮細胞、パネート細胞、ゴブレット細胞、腸管上皮内分泌細胞を含むオルガノイドの作製に成功したことを報告するものである。非特許文献２はヒト多能性幹細胞から長期間自己複製可能な小腸幹細胞を作製できたことを報告した文献である。非特許文献２で作製された小腸幹細胞は、非特許文献１と同様に小腸に存在する全ての細胞を含むオルガノイドに分化することができる。非特許文献３では、ヒト多能性幹細胞から小腸上皮様細胞への分化を試み、ＳＩ（Ｓｕｃｒａｓｅ　Ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ）、ＳＬＣ１５Ａ１（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１５　ｍｅｍｂｅｒ　１）／ＰＥＰＴ１（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｒ１）、ＬＧＲ５（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）等の小腸マーカーを発現する細胞の作製に成功した。該細胞は、さらに、β－Ａｌａ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ（β－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｎ－７－ａｍｉｎｏ－４ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ－３－ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）ジペプチドを取り込むことができる性能を有している。しかし、該細胞における薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　３Ａ４）の発現はヒト小腸と比べて約１／５００と低いことが課題とされた。
　以上の非特許文献の他、特許文献１に示す通り、小腸上皮細胞への分化を試みた報告はなされているが、ヒト多能性幹細胞から薬物代謝と物質の吸収を同時に評価可能な小腸上皮細胞を、遺伝子導入技術を用いずに効率よく作製したという報告は未だにない。
国際公開第２０１６／１４７９７５号
Ｎａｔｕｒｅ、２０１１　Ｆｅｂ　３；４７０（７３３２）：１０５－９ Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２０１４　ｊｕｎ　３；２（６）：８３８－５２ Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，　２０１４；２９（１）：４４－５１
　生体分離細胞の直接培養物である初代培養のヒト小腸上皮細胞は入手困難かつ個体差がある。このため、現在小腸のｉｎ　ｖｉｔｒｏ吸収評価系モデルはヒト結腸癌由来細胞株のＣａｃｏ－２細胞が使用されている。しかし、このＣａｃｏ－２細胞はヒト小腸上皮細胞と異なり薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４をほとんど発現しておらず薬物代謝を評価することはできない。また、Ｃａｃｏ－２細胞は癌細胞由来であり、正常細胞の代謝吸収を反映しているとは言い難い。これらの課題を解決すべく、多能性幹細胞を小腸上皮様細胞へ分化させる技術の開発が盛んに進められている。
　従来の誘導法で多能性幹細胞から分化した小腸上皮様細胞は、成熟化しても薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性が生体の小腸に比べ著しく低い。本発明は遺伝子導入技術を用いずに、初代培養のヒト小腸上皮細胞により近い性質を有する小腸上皮様細胞を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、小腸上皮前駆細胞を小腸上皮様細胞に分化させる過程で、活性型ビタミンＤ存在下で培養を行うと薬物代謝酵素の発現が上がることを見出し、発明を完成させた。
　即ち本発明は以下を提供する。
［１］以下の工程を含む小腸上皮様細胞の製造方法；
（ｉ）小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤを含む培地で培養する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた小腸上皮様細胞を取得する工程。
［２］内胚葉細胞を小腸上皮前駆細胞に分化させる工程をさらに含む、［１］記載の方法。
［３］多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させる工程をさらに含む、［２］記載の方法。
［４］前記工程（ｉ）において、小腸上皮前駆細胞を凍結する工程及び凍結された小腸上皮前駆細胞を解凍する工程をさらに含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］凍結する工程が、前記工程（ｉ）開始から５～１５日後に行われる、［４］記載の方法。
［６］解凍した小腸上皮前駆細胞を、さらにＲｈｏキナーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ及びその誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する、［４］または［５］記載の方法。
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物毒性評価方法及び／又は薬物動態評価方法。
［８］［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物間相互作用の検査方法。
［９］［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物代謝酵素誘導試験方法。
［１０］ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ阻害剤及び活性型ビタミンＤを含む培地。
［１１］ＴＧＦβ受容体阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＧＳＫ阻害剤がＬＹ２０９０３１４である［１０］記載の培地。
［１２］さらに、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ及びその誘導体から選択される１以上の物質を含む［１０］または［１１］記載の培地。
［１３］Ｒｈｏキナーゼ阻害剤がＹ２７６３２、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬がビンブラスチン、ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ｃＡＭＰの誘導体がＢｒ－ｃＡＭＰである［１２］記載の培地。
［１４］薬物毒性評価方法及び／又は薬物動態評価方法における、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞の使用。
［１５］薬物間相互作用の検査方法における、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞の使用。
［１６］薬物代謝酵素誘導試験方法における、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞の使用。
　本発明により、薬物代謝吸収を評価できる小腸上皮様細胞を安定的に提供することが可能となる。さらに、本発明の方法によって、凍結した小腸上皮様細胞から簡便にタイトジャンクション機能を有する単層膜を再形成させ、短期間の培養で代謝酵素を発現する小腸上皮様細胞を提供することができる。本発明により得られる小腸上皮様細胞は、創薬研究や食品栄養の代謝吸収試験に応用が可能である。
本発明の方法を示す図である。 本発明の方法により得られる細胞の薬物代謝酵素の遺伝子発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞の検鏡の図である。 本発明の方法により得られる細胞の検鏡の図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞の検鏡の図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。 本発明の方法により得られる細胞のマーカー遺伝子の発現を相対値で示す図である。
　本発明において「小腸上皮細胞」とは、小腸の内腔表面を覆っている組織内に含まれる細胞を意味し、これらには小腸の吸収細胞、内分泌細胞及び陰窩細胞（粘液腺細胞、漿液腺細胞及び幹細胞を含む）が含まれる。生体内の細胞及び生体より直接取得した細胞と区別するため、生体外（エキソビボ、インビトロ）で人為的に分化・誘導させた小腸上皮細胞の性質を有する細胞を「小腸上皮様細胞」と呼ぶ。小腸上皮様細胞の指標となるマーカーとして、例えば、Ｖｉｌｌｉｎ　１（ビリン１）、Ｃｄｘ２（Ｃａｕｄａｌ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｇｅｎｅ　ｔｙｐｅ２）、ＳＩ（ｓｕｃｒａｓｅ－ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ）、Ｉｆａｂｐ、Ｉｓｘ、ラクターゼ（Ｌａｃｔａｓｅ）、Ｇｌｕｔ２、ＺＯ－１タンパク質（Ｚｏｎｕｌａ（Ｚｏｎａ）　ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１　ｐｒｏｔｅｉｎ、別名：Ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＴＪＰ－１））、薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４、トランスポーターであるＰ－ｇｐ、ＰＥＰＴ１、ＡＮＰＥＰ、ＯＳＴα、ＢＣＲＰなどの腸細胞マーカー遺伝子及びその産物が挙げられる。
　本発明において「小腸上皮前駆細胞」とは、小腸上皮様細胞に分化することが可能な細胞であり、小腸上皮幹細胞、腸管上皮幹細胞を包含する。小腸上皮前駆細胞の指標となるマーカーとして、例えば、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、エフリンＢ２受容体（ＥｐｈＢ２）、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、ＣＤＸ２、ＡＬＣＡＭ、ＡＳＣＬ２、ＩＴＧＢ１、ＯＬＦＭ４、ＳＯＸ９などの腸細胞マーカー遺伝子及びその産物が挙げられる。
　本発明において「胚性内胚葉細胞」（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ　Ｅｎｄｏｄｅｒｍ）とは、内胚葉細胞の中でも特に、食道、胃、小腸及び大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、及び膵臓などの腸管に由来する器官に分化し得る細胞を意味する。具体的には、内胚葉細胞マーカーとなるＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ；ＥＣＤ）及びＣＸＣＲ４、あるいはＥＣＤ及びＣＤ５５が陽性である細胞を言う。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、試験管内などの人工的に構成された条件下（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖能を持ち、生体の全ての組織の細胞に分化が可能な細胞を言う。本発明では、多能性幹細胞として、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を用いることができる。
　本発明で用いるＥＳ細胞は、哺乳動物由来のＥＳ細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類の体細胞、特に好ましくはヒトＥＳ細胞を使用することができる。本発明では、マウス由来のものであればマウスＥＳ細胞株Ｒ１、ヒト由来のものであればヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２、ＫｈＥＳ－３、及びＨ１、Ｈ９を用いることができる。
　ｉＰＳ細胞は、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を使用することができる。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞は、Ｆｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１及びＣｒｙｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。ｉＰＳ細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　以下に本発明について詳細に説明する。
（１）小腸上皮様細胞の製造方法
　本発明は以下の工程を含む小腸上皮様細胞の製造方法を提供する。
（ｉ）小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤを含む培地で培養する工程；及び
（ｉｉ）小腸上皮様細胞を取得する工程。
　本発明の方法で使用する小腸上皮前駆細胞において、その取得方法は特に限定されず、例えば、公知の方法で生体から単離してもよいし、また、内胚葉細胞や多能性幹細胞から分化させて調製してもよい。例えば、特開２００８－２０６５１０号公報に、生体腸管より腸管幹／前駆細胞を取得する方法が記載されている。その由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞を使用することができる。
　多能性幹細胞より小腸上皮前駆細胞を分化させる場合は、例えば、多能性幹細胞を内胚葉細胞（胚体内胚葉細胞）に分化させ、内胚葉細胞を小腸上皮前駆細胞に分化させることができる。多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させる方法は、公知の方法を使用することができる。例えば、基本培地にＧＳＫ３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、Ｌｙ２９４００２）、ＤＮＡメチル化阻害剤（例えば、５－Ａｚａ－２’－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、又はＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｅ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの化合物を添加した培地を用いることができ、特に好適にはＡｃｔｉｖｉｎ　Ａを添加した培地を用いることができる。上記化合物の添加量は多能性幹細胞から内胚葉細胞に分化可能な量であればよく、特に限定されない。また、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ　Ｅｎｄｏｄｅｒｍ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）のような、市販のキットを使用することができる。分化のための培養期間は特に限定はないが、例えば、３～１０日間、好適には４～８日間である。
　内胚葉細胞から小腸上皮前駆細胞に分化させる方法は、公知の方法を使用することができる。例えば、基本培地にＧＳＫ－３阻害剤（例えば、ＬＹ２０９０３１４、ＢＩＯ）やＮｏｔｃｈシグナル阻害剤としてのγ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ）などの化合物を添加した培地を用いることができる。上記化合物の添加量は内胚葉細胞から小腸上皮前駆細胞に分化可能な量であればよく、特に限定されない。例えば、ＬＹ２０９０３１４を使用する場合は、培地に１～４０ｎＭ、好適には５～３０ｎＭの濃度で添加される。また、分化のための培養期間は特に限定はないが、例えば、２～８日間、好適には３～５日間である。
　本発明の工程（ｉ）で使用する活性型ビタミンＤとしては、例えば、活性型ビタミンＤ２又は活性型ビタミンＤ３（カルシトリオール）を使用することができる。活性型ビタミンＤの濃度は、培地での最終濃度が例えば１ｎＭ～１０μＭ、好適には１０ｎＭ～１μＭ、特に好適には５０～５００ｎＭで使用する。工程（ｉ）で使用する培地は、小腸上皮前駆細胞を小腸上皮様細胞に分化させる培地であれば特に限定はなく、例えば、基本培地にＧＳＫ－３阻害剤（ＬＹ２０９０３１４、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ９９０２１など）、Ｗｎｔシグナル作動剤（Ｗｎｔ３ａなど）、ＴＧＦβ受容体阻害剤（例えば、ＳｍａｄシグナルをブロックするＡＬＫ５阻害剤（ＳＢ４３１５４２など））、上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、ヒトＥＧＦ）、及び／又はγ－セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ）を添加した培地を使用できる。好適には、基本培地にＧＳＫ－３阻害剤（好適にはＬＹ２０９０３１４）及びＴＧＦβ受容体阻害剤（好適にはＳＢ４３１５４２）を添加した培地を使用できる。さらに好適には、基本培地にＧＳＫ－３阻害剤（好適にはＬＹ２０９０３１４）、ＴＧＦβ受容体阻害剤（好適にはＳＢ４３１５４２）及びＥＧＦ（好適にはヒトＥＧＦ）を添加した培地を使用できる。上記化合物の添加量は小腸上皮前駆細胞から小腸上皮様細胞に分化可能な量であればよく、特に限定されない。上記培地に活性型ビタミンＤを加えて使用する。分化のための培養期間は特に限定はないが、例えば、５～３０日間、好適には１０～２５日間である。培養期間中、適宜、継代及び／又は培地交換を行うことができる。
　本発明において、小腸上皮前駆細胞の調製及び工程（ｉ）に使用する基本培地としては、特に限定はされないが、例えば、ＭＥＭ（Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｓａｌｔ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、グラスゴー基本培地などが使用できる。培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば３７℃、５％　ＣＯ２の環境下で培養すればよい。
　本発明において、小腸上皮前駆細胞の調製及び工程（ｉ）に使用する培地には、細胞の増殖率や生存率を維持する観点から、血清、血漿又は血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔなど）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清、ヒト血清や羊血清等を用いることができる。血清又は血清代替物の添加量は例えば０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）である。
　本発明において、小腸上皮前駆細胞の調製及び工程（ｉ）の培養には、フィーダー細胞を使用することができる。例えば、マイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用することができる。また、結合組織細胞によって分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使用することができる。ＥＣＭは例えば、多糖、水、エラスチン、及び糖タンパク質（マトリックスタンパク質）からなる。マトリックスタンパク質には、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、及びラミニンが含まれる。前記ＥＣＭはＥＣＭ産生細胞、例えば、線維芽細胞を培養した後に、これらの細胞を除去することによって提供することができる。ＥＣＭ産生細胞として、コラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、及びフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、並びにコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン－Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞を使用することができる。さらに、ＥＣＭは市販されており、例えばＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ヒト組換型ラミニンフラグメント（例えばｉＭａｔｒｉｘ－５１１）を使用することができる。また、単離されたマトリックスタンパク質やそのフラグメントの共存下に前記の培養を実施することもできる。例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロクチン、ラミニンやそれらのフラグメントを培養に使用することができる。マトリックスタンパク質及びそのフラグメントとしては、例えば単離物又は遺伝子組換え技術により作成された組換え体を使用することができる。
　本発明において細胞の培養は、細胞の数やその他の条件を考慮して選択した適切な容器を使用して実施すればよい。例えばプレート、シャーレ、フラスコ又はバッグ等、任意の形態の細胞培養用の容器を使用することができる。また、細胞の足場とするための担体、例えばビーズ、メンブレン、中空糸等を使用してもよい。
　本発明の工程（ｉ）において、さらに小腸上皮前駆細胞を凍結する工程及び凍結された小腸上皮前駆細胞を解凍する工程を含み得る。培養を中断して凍結することにより細胞を長期に保存することは、小腸上皮様細胞を適切な時期に供給する上で有用である。細胞を凍結する工程は、小腸上皮前駆細胞の培養を開始してから５～１５日後、好ましくは７～１３日後に実施される。
　細胞を凍結する工程は、培地中の細胞をそのまま凍結する、又は培地を凍結保護剤に置換して凍結することで実施できる。細胞の凍結方法は、一般に緩慢凍結法と急速凍結法（ガラス化法）に大別される。本発明においてはどちらの凍結方法を用いてもよい。緩慢凍結法は、グリセリン、ＤＭＳＯ、ケラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、血清、血清アルブミン等を凍結保護剤として含む凍結保存液中に細胞を懸濁し、１分あたりに１℃程度温度を下げて徐々に凍結する方法である。緩慢に冷却することにより細胞内の水分子が凍結保護剤と置換し、脱水され、細胞内や細胞周辺部の氷結晶の成長が抑えられ、細胞膜及び細胞内構造の損傷や、タンパク質の変性及び切断を防ぐ。プログラムフリーザーを用いて温度調節を厳密に制御しなくても、発砲スチロール容器や市販の細胞凍結ボックスを用いて緩慢に凍結する簡易緩慢凍結法でもよい。
　一方、ガラス化法は、凍結による細胞内外の氷結晶生成を抑制するため、急速な冷却により細胞をガラス状に凍結させる方法である。ガラス化法は、高濃度のＤＭＳＯ、アセトアミド、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる凍結保護剤を含むガラス化保存液を用いる方法が知られている。
　なお、凍結保護剤は市販されており、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ－Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）、バンバンカー（日本ジェネティクス株式会社）、及びラボバンカー（登録商標）２（十慈フィールド株式会社）等が使用可能であり、それぞれの指示書に従い細胞を凍結させることができる。
　凍結した細胞は、低温フリーザーや超低温フリーザー（通常－２０℃～－１５０℃の範囲内）中で、又は液体窒素（通常－１５０℃～－１９６℃の範囲内）中で保存することができる。
　凍結させる細胞は、容器壁などに接着している場合にはそこから遊離（剥離）させて回収し、凍結保護剤に懸濁させることができる。細胞の剥離は、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理及び／又はピペッティングやスクレイパーなどによる機械的・物理的処理によって行うことができる。細胞剥離剤としては、哺乳動物及びバクテリア成分を含まないＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及びＴｒｙｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ社）等が使用可能である。
　凍結した細胞を解凍する工程は、任意の細胞解凍手法により行うことができ、例えば、凍結した細胞を融解温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水、気相）に接触させるため、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などを使用することができる。また、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより解凍することができる。解凍手段又は浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、例えば４～５０℃、好ましくは３０℃～４０℃、より好ましくは３６～３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、例えば１～１０分、好適には２～５分である。
　解凍後の小腸上皮前駆細胞は培地、例えば凍結前に使用されていた培地に再度播種される。解凍後の培養期間は、小腸上皮前駆細胞の全体の培養期間及び凍結前の培養期間に応じて適宜設定されるが、総培養期間が５～３０日間程度となるように設定すればよく、例えば２～１０日間、好適には４～８日間である。本発明の一態様として、解凍後の小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤのほかに、ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ及びその誘導体、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤及びビンカアルカロイド系抗腫瘍薬からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む培地で培養することができる。本発明の好ましい態様において、解凍後の小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤ、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＧＳＫ阻害剤を含み、ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ及びその誘導体、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤及びビンカアルカロイド系抗腫瘍薬からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む培地で培養することができる。
　Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤は、例えば、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００、ＨＡ１０７７、チアゾビビン、及びＧＳＫ４２９２８６を使用することができるが、これらに限定されない。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、小腸上皮前駆細胞の解凍後の培養の全期間又は一部の期間に培地に添加することができ、細胞の解凍後１～５日間、好適には解凍後１～３日間、特に好適には解凍後１日間培地に添加する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の濃度は適宜設定すればよく、例えばＹ２７６３２を使用する場合は、培地に最終濃度で例えば０．１～１００μＭ、好適には１～１０ｎＭで添加する。
　ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬は、キョウチクトウ科ニチニチソウ属の植物ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ（Ｌ．）Ｇ．Ｄｏｎ）と黄色ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　（Ｌ．）Ｇ．Ｄｏｎ　ｃｖ．Ｆｌａｖｕｓ）から分離された抗癌活性を有するビスインドールアルカロイドである。現在臨床に用いられているニチニチソウのアルカロイド及びその誘導体としては、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ：ＶＬＢ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ：ＶＣＲ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ：ＶＤＳ）とビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ：ＮＶＢ）の４種類がある。ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬は、細胞周期特異的薬であり、主に細胞のＧ２期（ＤＮＡ合成の後期）に作用する。その作用メカニズムとして、チューブリンと結合し、チューブリンのダブルマイニュートが重合により微小管になることを阻害し、また微小管の脱重合を誘導して、紡錘体の形成を阻害して、腫瘍細胞の分裂増殖を有糸分裂の中期に停止させることにより、抗腫瘍作用を発揮することが報告されている。ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬は、小腸上皮前駆細胞の解凍後の培養の全期間に培地に添加することができ、好適には細胞の解凍後１～６日間、特に好適には解凍後２～４日間培地に添加する。ビンブラスチンを使用する場合は、培地に最終濃度で例えば０．１～１０００ｎＭ、好適には１～１００ｎＭで添加する。
　ＭＥＫ阻害剤は、公知のＭＥＫ阻害剤が使用できるが、例えば、トラメチニブ（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）、セルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）、レファメティニブ（Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）、ピマセルチブ（Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）、Ｕ０１２６、ＭＥＫ１６２／ＡＲＲＹ－１６２、ＡＺＤ８３３０／ＡＲＲＹ－４２４７０４、ＧＤＣ－０９７３／ＲＧ７４２０、ＧＤＣ－０６２３／ＲＧ７４２１／ＸＬ５１８、ＣＩＦ／ＲＧ７１６７／ＲＯ４９８７６５５、ＣＫ１２７／ＲＧ７３０４／ＲＯ５１２６７６６、Ｅ６２０１、ＴＡＫ－７３３、ＰＤ－０３２５９０１、ＡＳ７０３９８８／ＭＳＣ２０１５１０３Ｂ、ＷＸ－５５４、ＣＩ－１０４０／ＰＤ１８４３５２、ＡＳ７０３０２６、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ＳＬ３２７が挙げられる。ＭＥＫ阻害剤の濃度は適宜設定すればよく、例えばＰＤ－０３２５９０１を使用する場合は、培地に最終濃度で例えば０．１～１００μＭ、好適には０．５～５０ｎＭで添加する。
　ｃＡＭＰ誘導体は、ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰへ置換基が修飾された化合物であり、例えば、８－ブロモ環状アデノシン一リン酸（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、単にＢｒ－ｃＡＭＰとも記載する）、８－クロロ環状アデノシン一リン酸（８－Ｃｌ－ｃＡＭＰ）、８－（４－クロロフェニルチオ）環状アデノシン一リン酸（８－ＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、及びジブチリル環状アデノシン一リン酸（ＤＢ－ｃＡＭＰ）が例示される。ｃＡＭＰ又はｃＡＭＰ誘導体の濃度は適宜設定すればよく、例えばＢｒ－ｃＡＭＰを使用する場合は、培地に最終濃度で例えば０．１～１０００μＭ、好適には０．５～５００ｎＭ、より好適には１～３００ｎＭで添加する。
　小腸上皮様細胞を取得する工程は、工程（ｉ）又はそれに続く工程で得られた小腸上皮様に分化した細胞を取得する工程である。工程（ｉ）又はそれに続く工程で得られた細胞集団に含まれる細胞をそのまま小腸上皮様細胞として取得してもよく、小腸上皮細胞のマーカーを使用して小腸上皮様細胞を単離・分離・精製して小腸上皮様細胞として取得してもよい。
　本発明の製造方法により得られる小腸上皮様細胞は、小腸上皮前駆細胞から人為的に分化を行うことによって得られた細胞で、薬物代謝酵素又は薬物トランスポーターを発現していることを特徴とする。また、前記小腸上皮様細胞は小腸上皮マーカーであるＶｉｌｌｉｎ及びＣＤＸ２を発現している。さらに、前記小腸上皮様細胞における薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４やトランスポーターのＰＥＰＴ１、Ｐ－ｇｐ等の発現量は、腸管上皮細胞モデルとして汎用されているＣａｃｏ－２細胞と比較しても同等以上の値を示す。また、前記小腸上皮様細胞は、小腸上皮細胞に特徴的にみられる細胞間の強固なタイトジャンクションを形成し、ＴＥＥＲやＺＯ－１タンパク質（Ｚｏｎｕｌａ（Ｚｏｎａ）　ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１　ｐｒｏｔｅｉｎ、別名：Ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＴＪＰ－１））を高発現している。本発明により、入手困難かつ個体差が課題である初代培養ヒト小腸上皮細胞に変わり安定的に優れた小腸上皮様細胞が提供可能となる。
　本発明の製造方法により得られる小腸上皮様細胞は、Ｖｉｌｌｉｎ１の陽性率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の細胞集団である。この細胞集団から、さらに小腸上皮細胞のマーカーを使用して小腸上皮様細胞を単離・分離・精製してもよい。
（２）小腸上皮様細胞を製造するための培地
　本発明は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ阻害剤及び活性型ビタミンＤを含む培地を提供する。この培地は（１）に記載する基本培地に、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ阻害剤及び活性型ビタミンＤを添加して調製される。本発明の培地は、さらに、ＥＧＦ、例えばヒトＥＧＦを含んでもよい。本発明の培地は、さらに、ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ及びその誘導体、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤及びビンカアルカロイド系抗腫瘍薬からなる群から選択される１以上の物質を含んでもよい。本発明の培地に含まれる各成分の濃度は、小腸上皮様細胞を製造に適する濃度を設定することができる。本発明の培地は（１）に記載の通り、小腸上皮様細胞を製造するために使用することができる。本発明の培地に含まれる各成分については（１）に記載のとおりである。
（３）小腸上皮様細胞を使用する、薬物の評価方法
　本発明は、上記製造法により得られる小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物毒性評価方法、薬物動態評価方法を提供する。さらに、当該小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物間の相互作用の検査方法や薬物代謝酵素誘導試験方法を提供する。本発明により得られた小腸上皮様細胞を使用することにより、従来は初代培養のヒト小腸上皮細胞を用いて行われてきた医薬品候補化合物の薬物毒性／薬物動態の評価、薬物間相互作用の研究、薬物代謝酵素誘導能の評価等をより高い精度、再現性で実施することが可能になる。
　以下、本発明の理解を深めるために実施例及び実験例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
　実施例１　ＣＹＰ３Ａ４を発現する小腸上皮様細胞の作製
　以下の培地１～培地３を調製した。
「培地１」
　ヒトｉＰＳ細胞は、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるようにｂＦＧＦを添加したＤＥＦ－ＣＳ（タカラバイオ社）中で培養し、未分化維持状態を維持した。
「培地２」
　内胚葉細胞への分化誘導は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ　ＤＥＦ－ＣＳ　５００　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社）を用いて行った。培養法は添付のプロトコルの通りに行った。
「培地３」
　内胚葉細胞以降の分化誘導には、１０％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ　ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン硫酸塩、２ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ、１％　Ｎｏｎ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地を使用した。
　内胚葉細胞は多能性幹細胞であるヒトｉＰＳ細胞を用いて作製した。ヒトｉＰＳ細胞株としてＣｈｉＰＳＣ１８（タカラバイオ社）を用いた。前記ヒトｉＰＳ細胞１．５×１０６ｃｅｌｌｓをフィブロネクチンコートしたＴ７５フラスコ上に播種し、培地１を用いるフィーダーフリー条件で、製品添付のマニュアルに従って前培養を行った。
　前培養によって得られたヒトｉＰＳ株を、培地２とＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ　Ｅｎｄｏｄｅｒｍ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用して、製品添付のマニュアルに従い６日間の培養により内胚葉細胞に分化誘導した。
　内胚葉細胞を、１×１０６／ｗｅｌｌ（２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）でマトリゲルコートした１２ウェルプレート（３．８ｃｍ２）上に播種し、２０ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４を含む培地３を使用して４日間培養し、小腸上皮前駆細胞に分化誘導した。
　小腸上皮前駆細胞を、３ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４、１００ｎＭ　活性型ビタミンＤ３、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍＬ　ヒトＥＧＦを含む培地３（以後、「培地３－Ａ」という）を使用して、２０～２５日間培養して小腸上皮様細胞に分化誘導した。培地交換は１日おきに行った。
　対照となる既存の方法として、内胚葉細胞を５μＭ　ＢＩＯ、１０μＭ　ＤＡＰＴを含む培地３を使用して小腸上皮前駆細胞に分化誘導し、この小腸上皮前駆細胞を１μＭ　ＢＩＯ、２μＭ　ＤＡＰＴ、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍＬ　ヒトＥＧＦを含む培地３を使用して小腸上皮様細胞に分化誘導した。前記本発明の小腸上皮様細胞の製造方法と既存の方法を図１に図示する。
　実施例２　薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現
　実施例１における小腸上皮前駆細胞の培養開始から２０日目に各小腸上皮様細胞を回収した。
　これらの細胞から、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　ＲＮＡ　ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ用のＴｏｔａｌ　ＲＮＡサンプルを取得した。さらに、別の対照として、ヒト成人小腸組織のＴｏｔａｌ　ＲＮＡ（５ドナー分、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びヒト結腸癌由来Ｃａｃｏ－２細胞のＴｏｔａｌ　ＲＮＡを準備した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして、リアルタイムＰＣＲ法により薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）の遺伝子発現を評価した。ヒト成人小腸組織での遺伝子発現を１とした相対値を図２に示す。図２中、既存の方法の結果を「（１）」、本発明の方法の結果を「（２）」、ヒト成人小腸組織のＲＮＡの結果を「Ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」、Ｃａｃｏ－２細胞の結果を「Ｃａｃｏ２」として示す。図２に示す通り、本発明の製造方法で得られる細胞では、既存の方法で得られる細胞やＣａｃｏ－２細胞より高い薬物代謝酵素の発現が確認された。
　実施例３　小腸上皮様細胞の遺伝子発現の経時変化
　３種類のヒトｉＰＳ細胞株、ＣｈｉＰＳＣ１８（Ｃ１８）、ＣｈｉＰＳＣ１２（Ｃ１２）、ＣｈｉＰＳＣ２２（Ｃ２２）（以上、タカラバイオ社）を用意し、実施例１と同様の方法により小腸上皮様細胞の分化誘導を行った。Ｃ１８細胞は、小腸上皮前駆細胞の培養開始から１０、１５、２１日目に細胞を回収した。Ｃ１２細胞及びＣ２２細胞は、小腸上皮前駆細胞の培養開始から１５、２１日目に細胞を回収した。実施例２で示した方法と同様の方法で、小腸マーカー（Ｖｉｌｌｉｎ、ＣＤＸ－２、ＳＩ）、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ）のそれぞれの遺伝子発現を測定した。対照にはヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを使用した。ヒト成人小腸組織の遺伝子発現を１とした相対値を図３に示す。図３の通り、全てのヒトｉＰＳ細胞株由来の細胞でＶｉｌｌｉｎ、ＣＹＰ３Ａ４、Ｐ－ｇｐの遺伝子発現が経時的に増加する傾向が認められた。また、ＣｈｉＰＳＣ１８において、ＳＩ、ＣＹＰ３Ａ４、Ｐ－ｇｐの発現が小腸上皮前駆細胞の培養開始から１０日目に確認できた。
　実施例４　剥離・再播種して調製した小腸上皮様細胞の遺伝子発現
　小腸上皮前駆細胞を剥離及び再播種させて調製した小腸上皮様細胞において、剥離及び再播種の影響を確認するため、遺伝子発現を確認した。
　小腸上皮前駆細胞は実施例１と同様の方法で調製した。小腸上皮前駆細胞を培地３－Ａで培養し、培養開始から１０日目に培地を除去した。細胞をカルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））で１回洗浄を行った後、剥離剤Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使って細胞を剥離させ、分散した細胞を回収した。細胞を培地３－Ａで洗浄して再懸濁し、０．４％トリパンブルー溶液（ＧＩＢＣＯ社）で染色し、生細胞の総細胞数を算出した。細胞を２．５×１０５／ｃｍ２（１×１０６／ｗｅｌｌ）となるように、マトリゲルコートした１２ウェルプレートに再播種し、培地３－Ａを使用して１０日間培養した。対照として、剥離及び再播種を行わずに実施例１と同様の方法で小腸上皮様細胞を調製した。
　小腸上皮前駆細胞の培養開始から２０日目となる各細胞を回収した。実施例３と同様の方法で、小腸型マーカー（Ｖｉｌｌｉｎ、ＣＤＸ－２、ＳＩ）、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ、ＰＥＰＴ１、ＡＮＰＥＰ、ＯＳＴα）遺伝子の発現を測定した。さらに、対照としてヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。測定の結果、剥離・再播種した誘導細胞は、ＳＩ、Ｐ－ｇｐ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＮＰＥＰの遺伝子発現において、剥離・再播種を行わなかった細胞と大きな差は認められなかった。
　実施例５　小腸上皮前駆細胞の凍結保存
　実施例４で小腸上皮前駆細胞を剥離及び再播種しても大きな影響がないことが確認されたので、剥離した細胞を凍結し、解凍後に再播種した細胞の評価を行った。
　小腸上皮前駆細胞は実施例１と同様の方法で調製した。小腸上皮前駆細胞を培地３－Ａで培養し、培養開始から１０日目に培地を除去した。細胞をＰＢＳ（－）で１回洗浄を行った後、剥離剤Ａｃｃｕｍａｘを使って細胞を剥離させ、分散した細胞を回収した。細胞を培地３－Ａで洗浄して再懸濁し、０．４％トリパンブルーで染色し、細胞をカウントして８０－９０％の生存率を確認した。懸濁した細胞を遠心分離により回収し、凍結保護剤ＣｅｌｌＢａｎｋｅｒ（登録商標）１ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）１ｍＬに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して－８０℃で凍結させた。凍結後、液体窒素保管を開始した。
　実施例６　小腸上皮前駆細胞の解凍と培養
　以下の培地６を調製した。
「培地６」
　１０％ＫＳＲ＋ＤＭＥＭ（１０％ＫＳＲ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、２ｍｍｏｌ／ｍＬ　アラニル－Ｌグルタミン、１％　ＭＥＭ必須アミノ酸溶液（×１００）を含むダルベッコ改変イーグル培地）に以下の濃度になるように４種の誘導剤を添加し、培地６を作製した；３ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４、１００ｎＭ　活性型ビタミンＤ３（カルシトリオール）、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ。
　マトリゲル（登録商標）をＤＭＥＭで４８倍に希釈したマトリゲル溶液を用意し、氷上で冷却しながら培養容器（１２ウェルプレート）に２００μＬ／ｃｍ２で分注した。培養容器を３７℃の細胞培養用インキュベーターで３０分以上保持してマトリゲルを培養容器にコーティングさせ、培養容器からマトリゲル溶液を除去した。実施例５で調製した凍結保存細胞を３７℃ウォーターバスで解凍し、２００×Ｇ、５分、室温で遠心分離して凍結保護剤を含む上清を除去した。１ｍＬの培地６に細胞を懸濁し、０．４％トリパンブルー溶液で生細胞の総細胞数を算出し、全量をマトリゲルコートした１２ウェルプレートに４．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再播種した。解凍後の培養は培地６を１日おきに交換して１０日間行った。
　解凍後の培養１０日目に細胞を回収した。実施例３と同様の方法で、小腸型マーカー（Ｖｉｌｌｉｎ）、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ）遺伝子の発現を測定した。対照として、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、並びにＣａｃｏ２細胞、実施例１の小腸上皮様細胞（小腸上皮前駆細胞の培養開始から２０日間培養した細胞）、実施例４の小腸上皮様細胞（小腸上皮前駆細胞の培養開始から１０日目に剥離及び再播種して、その後１０日間培養した細胞）のそれぞれについてマーカー遺伝子の発現を測定した。結果を図４に示す。図４中、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを「ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」、実施例１の小腸上皮様細胞を「継続培養」、実施例４の小腸上皮様細胞を「Ｄａｙ１０　Ｓｅｅｄｉｎｇ」、本実施例の凍結及び解凍した細胞を「Ｄａｙ１０　Ｆｒｅｅｚｅ　＆　Ｔｈａｗ」として示す。図４の通り、凍結及び解凍した細胞は、遺伝子発現において継続培養した細胞や剥離及び再播種した細胞と比較して大きな影響は認められなかった。
　実施例７　小腸上皮前駆細胞と小腸上皮様細胞の凍結・解凍
　小腸上皮前駆細胞の培養開始から１１日目と２０日目に凍結・解凍して調製した小腸上皮様細胞について、比較試験を行った。
　小腸上皮前駆細胞の培養開始から１１日目まで培養すること以外は実施例５の方法で調製した小腸上皮様細胞を１１日目に回収し、実施例５の方法で凍結させ、実施例６の方法で解凍した。また、実施例１の方法で調製した小腸上皮様細胞を培養開始から２０日目に回収し、実施例５の方法で凍結させ、実施例６の方法で解凍した。
　小腸上皮細胞は細胞間が強固に接着しており、タイトジャンクションを形成しバリア機能を有することが知られている。タイトジャンクション形成の確認のため、前記の解凍したそれぞれの細胞について、全量をマトリゲルコートした６ウェルプレートのセルインサートに再播種した。誘導培養の培地交換は培地６で１日おきに実施しながら、８日間培養した。
　培養後の細胞の顕微鏡画像を図５に示す。小腸上皮前駆細胞の培養開始から１１日目に凍結した細胞（Ｄａｙ１１凍結保存）では形態に異常は認められなかったに対し、２０日目に凍結した細胞（Ｄａｙ２０凍結保存）は解凍後の形態異常が確認された。
　さらに、培養後の細胞について、ミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）ＥＲＳ－２抵抗値測定システムを用いてＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）を測定し、タイトジャンクション機能の確認を行った。頂端（Ａｐｉｃａｌ）側（セルインサート）に１．５ｍＬ、側底（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）側（コンパニオンプレート）に２．７ｍＬの１０％ＫＳＲ＋ＤＭＥＭを添加し、細胞を播種したウェルとブランクとして細胞を播種していないウェルを測定した。下記の計算式より、単位面積抵抗値を算出した。
抵抗値（Ω）＝検体（Ω）－ブランク（Ω）
単位面積抵抗＝抵抗値（Ω）×膜の有効面積（ｃｍ２）（６ウェル：４．２ｃｍ２）
その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＴＥＥＲの測定結果より、小腸上皮前駆細胞の培養開始から２０日目に凍結した細胞（Ｄａｙ２０凍結保存）のＴＥＥＲはブランクと変わらず、タイトジャンクションの形成は確認されなかった。一方、１１日目に凍結した細胞（Ｄａｙ１１凍結保存）ではタイトジャンクションの形成が確認された。
　さらに、同じ培養後の細胞について、ルシファーイエローの透過性を測定し、タイトジャンクション機能の確認を行った。ルシファーイエローは細胞間隙を透過する物質であるが、小腸上皮のようにタイトジャンクションを形成する細胞の細胞間隙は透過できない。頂端側に１０μＭ　ルシファーイエロー（１．５ｍＬ）を添加し、側底側にはバッファー（２．７ｍＬ）を添加し、側底側への透過を蛍光波長により測定し確認した。既知濃度のルシファーイエローを段階希釈により標準液を作成し、標準曲線を作成して、ルシファーイエローの透過量と透過係数（Ｐａｐｐ）を算出した。バッファーは、ＨＢＳＳ＿Ｃａ（＋）、Ｍｇ（＋）に２５ｍＭグルコースと１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を添加したものを使用した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ルシファーイエローの透過係数の測定結果より、小腸上皮前駆細胞の培養開始から２０日目に凍結した細胞（Ｄａｙ２０凍結保存）の透過係数は高く、タイトジャンクションの形成は確認されなかった。一方、１１日目に凍結した細胞（Ｄａｙ１１凍結保存）ではタイトジャンクションの形成が確認された。
　表１及び表２の結果から、成熟化が進んだ２０日目前後の小腸上皮様細胞の凍結保存は困難になることが示され、１１日目前後の小腸上皮前駆細胞においては凍結保存が可能であることが分かった。
　実施例８　ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬の添加
　ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬としてビンブラスチンを含む、以下の培地５を調製した。
「培地５」
　３ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４、１００ｎＭ　活性型ビタミンＤ３、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ、１０ｎＭのビンブラスチンを含む１０％ＫＳＲ＋ＤＭＥＭ。
　実施例５で調製した凍結保存細胞を３７℃ウォーターバスで解凍し、２００×Ｇ、５分、室温で遠心分離して凍結保護剤を含む上清を除去した。１ｍＬの培地５に細胞を懸濁し、０．４％トリパンブルー溶液で生細胞の総細胞数を算出し、全量をマトリゲルコートした１２ウェルプレートに４．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再播種した。解凍後の培養は培地５を１日おきに交換して１０日間行った。培地５を使用した再播種後の培養１０日目の顕微鏡画像を図６に示す。１０ｎＭのビンブラスチンを含む培地を使用することにより、ビンブラスチンを含まない培地（０ｎＭ）を使用した場合に比べて、小腸上皮様細胞が均一に整うことが確認された。
　さらに、培地５に含まれるビンブラスチンの濃度を０ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭに変えて小腸上皮様細胞を分化誘導させ、実施例３と同様の方法で小腸型マーカー（Ｖｉｌｌｉｎ、ＣＤＸ－２）、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（ＰＥＰＴ１、ＡＮＰＥＰ、ＯＳＴα）遺伝子の発現を測定した。対照として、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用意した。結果を図７に示す。図７中、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを「ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」として示す。図７の通り、ビンブラスチンの添加により小腸上皮細胞のマーカー遺伝子発現が増加することが示された。
　実施例９　Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の添加
　実施例５記載の操作で凍結した小腸上皮前駆細胞について、解凍した細胞を再播種する培地にＲｈｏキナーゼ阻害剤としてＹ２７６３２を含む培地を使用する方法を検討した。以下の培地４を調製した。
「培地４」
　３ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４、１００ｎＭ　活性型ビタミンＤ３、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ、５μＭ　Ｙ２７６３２を含む１０％ＫＳＲ＋ＤＭＥＭの基本培地。
　実施例６と同様の方法で、解凍した細胞を培地６に再播種し１０日間培養した細胞（Ｙ２７６３２－、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ－）、解凍した細胞を培地４に再播種し１日間培養し、その後培地５で２日間培養し、その後培地６で７日間培養した細胞（Ｙ２７６３２＋、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ＋）、解凍した細胞を培地４に再播種し１日間培養し、その後培地６で９日間培養した細胞（Ｙ２７６３２＋、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ－）、解凍した細胞を培地６に再播種し１日間培養し、その後培地５で２日間培養し、その後培地６で７日間培養した細胞（Ｙ２７６３２－、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ＋）の４種類の分化誘導方法を比較した。細胞の再播種後、２時間３０分後、２日目、５日目に培養細胞の接着と形態を検鏡で確認し、経時的に形態像を取得した（図８）。Ｙ２７６３２の添加により接着効率が上がり、さらに１０ｎＭビンブラスチンの添加により均一な形態が得られることが示された。
　実施例１０　再播種密度の検討
　実施例９のＹ２７６３２＋、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ＋細胞（すなわち、解凍した細胞を培地４に再播種し１日間培養し、その後培地５で２日間培養し、その後培地６で７日間培養した細胞）と比べて、培地６で８日間培養すること以外は同様の培地と培養日数で、小腸上皮様細胞を調製した。再播種は、小腸上皮前駆細胞を２４ウェルプレート（１．９ｃｍ２）に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）で誘導培養し、再播種後５日目（Ｄａｙ　１５）、８日目（Ｄａｙ　１８）、１１日目（Ｄａｙ　２１）に細胞を回収した。さらに、再播種の密度を、３．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に変えて誘導培養し、再播種後１１日目（Ｄａｙ　２１）に細胞を回収した。
　実施例３と同様の方法で小腸型マーカー（Ｖｉｌｌｉｎ、ＳＩ）、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ、ＰＥＰＴ１、ＡＮＰＥＰ、ＯＳＴα）、タイトジャンクション（ＺＯ－１）遺伝子の発現を測定した。対照として、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用意した。結果を図９に示す。図９中、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを「ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」、３．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再播種した細胞を「３７５Ｋ」、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再播種した細胞を「５００Ｋ」として示す。図９中、「Ｄａｙ　１５」、「Ｄａｙ　１８」及び「Ｄａｙ　２１（２５０Ｋ／ｃｍ２）」はそれぞれ、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再播種した、再播種後５日目、８日目及び１１日目の細胞を示す。図９から、再播種後の培養は５～８日間（小腸上皮前駆細胞の培養開始から１５～１８日間）、再播種の密度は３．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましいことが分かった。
　実施例１１　添加薬剤の検討１
　実施例５と同様の方法で小腸上皮前駆細胞を凍結した。但し凍結保護剤としてＫＳＲ：ＤＭＳＯを９：１で混合した溶液を使用した。解凍した細胞を再播種する培地６に各種の薬剤を添加した。１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏ　Ｗｅｓｔ社）、ＧＦ［１％　ＤＥＦ－ＣＳ　ＧＦ１（タカラバイオ社）、５０ｎｇ／ｍＬ　インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ　線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）４］、１μＭ　ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）、１０μＭ　Ｂｒ－ｃＡＭＰ、２％　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、表３の条件で培地に添加した。表中、「〇」は添加あり、「×」は添加なし、を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例６と同様の方法で、解凍した細胞を表３の条件１～７の通りに薬剤を添加した培地６に再播種し、８日間培養して細胞を回収した。実施例３と同様の方法で、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ）遺伝子の発現を測定した。対照として、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用意した。結果を図１０に示す。図１０中、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを「ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」として示す。図１０から、全ての薬剤を添加することにより、全ての薬剤を含まない場合に比べてＣＹＰ３Ａ４の発現が向上することが確認された。さらに、ＰＤ０３２５９０１を除くとＣＹＰ３Ａ４の発現が著しく低下し、ＰＤ０３２５９０１及びＢｒ－ｃＡＭＰを除くとＰ－ｇｐの発現が低下することが分かった。以上より、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ又はその誘導体を添加することが有効であることが示された。
　実施例１２　添加薬剤の検討２
　実施例１と同様の方法で調製した内胚葉細胞を、９．３７５×１０６／Ｆｌａｓｋ（１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）でマトリゲルコートしたＴ７５フラスコ（７５ｃｍ２）上に播種し、３０ｎＭ　ＬＹ２０９０３１４を含む培地３を使用して４日間培養し、小腸上皮前駆細胞に分化誘導した。
　小腸上皮前駆細胞を、培地３－Ａを使用して培養し、培養開始から８日目に培地を除去した。細胞をＰＢＳ（－）で２回洗浄を行った後、剥離剤Ａｃｃｕｍａｘを使って細胞を剥離させ、分散した細胞を回収した。細胞を培地３－Ａで洗浄して再懸濁し、０．４％トリパンブルーで染色し、細胞をカウントして８０－９０％の生存率を確認した。懸濁した細胞を遠心分離により回収し、凍結保護剤（ＫＳＲ：ＤＭＳＯ＝９：１溶液）１ｍＬに７．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して－８０℃で凍結させた。凍結後、液体窒素保管を開始した。
　実施例６と同様の方法で、解凍した細胞を培地４に再播種した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ１に培地５に交換し、その後Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、Ｄａｙ７に、表４の条件で試薬を添加した培地６に交換して培養し、７日間培養して細胞を回収した。実施例３と同様の方法で、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ）遺伝子の発現を測定した。対照として、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用意した。結果を図１１に示す。図１１中、ヒト成人小腸組織由来ＴｏｔａｌＲＮＡを「ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」として示す。図１１から、ＰＤ０３２５９０１及びＢｒ－ｃＡＭＰを添加することが有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、ＰＤ０３２５９０１及びＢｒ－ｃＡＭＰの濃度を固定し、培地６の培地交換を行う日をＤａｙ２、５、８に変更する条件、Ｂｒ－ｃＡＭＰをＤａｙ０で細胞を播種する培地４から培養終了まで添加する条件、培地６にさらにＢ－２７（商標）　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａを添加する条件を表５の通り試験した。実施例３と同様の方法で、薬物代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４）、トランスポーター（Ｐ－ｇｐ）遺伝子の発現を測定した。また、実施例７と同様の方法で、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）及び透過係数（Ｐａｐｐ）を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上に詳述したように、本発明の製造法により得られる細胞は、小腸上皮が発現する各マーカー及び薬物代謝酵素とトランスポーターの遺伝子発現が確認され、タイトジャンクション機能を有することから、「小腸上皮様細胞」ということができる。特に薬物代謝酵素の発現量は、既存技術であるＣａｃｏ－２細胞と比べて優れている。さらに、この小腸型腸管上皮様細胞を、小腸上皮前駆細胞を凍結保存し、薬剤添加だけの簡便な操作で解凍・再播種から誘導培養して製造する方法を確立した。これにより小腸型腸管上皮様細胞をラージスケールで製造し安定供給することが可能となり、また簡便かつ短い培養期間で薬剤や栄養の代謝吸収試験をすることが可能となった。したがって、本発明により、入手困難かつ性能のばらつきがある初代培養小腸上皮細胞より汎用性かつ利便性が高い小腸上皮様細胞が得られる。本発明の方法によって得られる小腸上皮様細胞は、医薬品等の薬剤代謝吸収試験や食品分析等の開発に大きく貢献しうることが期待される。

Claims (13)

  1. 　以下の工程を含む小腸上皮様細胞の製造方法；
    （ｉ）小腸上皮前駆細胞を、活性型ビタミンＤを含む培地で培養する工程；及び
    （ｉｉ）小腸上皮様細胞を取得する工程。
  2. 　内胚葉細胞を小腸上皮前駆細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. 　多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
  4. 　前記工程（ｉ）において、小腸上皮前駆細胞を凍結する工程及び凍結された小腸上皮前駆細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　凍結する工程が、前記工程（ｉ）開始から５～１５日後に行われる、請求項４記載の方法。
  6. 　解凍した小腸上皮前駆細胞を、さらにＲｈｏキナーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ及びその誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する、請求項４または５記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物毒性評価方法及び／又は薬物動態評価方法。
  8. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物間相互作用の検査方法。
  9. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で製造された小腸上皮様細胞を用いることを特徴とする、薬物代謝酵素誘導試験方法。
  10. ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ阻害剤及び活性型ビタミンＤを含む培地。
  11. ＴＧＦβ受容体阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＧＳＫ阻害剤がＬＹ２０９０３１４である請求項１０記載の培地。
  12. さらに、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ及びその誘導体から選択される１以上の物質を含む請求項１０または１１記載の培地。
  13. Ｒｈｏキナーゼ阻害剤がＹ２７６３２、ビンカアルカロイド系抗腫瘍薬がビンブラスチン、ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ｃＡＭＰの誘導体がＢｒ－ｃＡＭＰである請求項１２記載の培地。
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