CN111542598A - 多能干细胞聚集抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本申请提供以包含细胞周期阻滞剂为特征的用于多能干细胞的悬浮培养的多能干细胞聚集抑制剂、包括在包含该聚集抑制剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序的多能干细胞聚集体的制备方法、通过该方法得到的多能干细胞聚集体、以及包含多能干细胞的细胞聚集体、培养基及细胞周期阻滞剂的多能干细胞培养组合物,可以通过上述方法以良好的收率制备在多能干细胞的悬浮培养中保持未分化性、抑制聚集、细胞生存率高、且尺寸适度的细胞聚集体。
Description
技术领域
本发明涉及多能干细胞聚集抑制剂、以及抑制多能干细胞聚集的方法。另外,本发明涉及多能干细胞聚集体的制备方法、以及通过该方法制造的多能干细胞聚集体。此外,本发明涉及多能干细胞培养组合物。
背景技术
随着近年来对人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞的研究,再生医学实用化的可能性不断增高。这些细胞具有能够无限增殖的能力、和分化成各种细胞的能力,因此,使用了多能干细胞的再生医学有望从根本上改变对难治性疾病、生活方式病等的治疗方法。已经可以在试验管内由多能干细胞分化诱导神经细胞、心肌细胞、肾细胞、肝细胞、血液细胞、视网膜细胞、它们的祖细胞等多个种类的体细胞。
另一方面,在与使用多能干细胞对各种器官进行再生的再生医学相关的实用化中,强烈要求体内器官或组织的再生所需要的大量多能干细胞的高效率生产方法。例如,肝脏的再生需要约2×1011个细胞,例如,为了通过培养皿表面上的贴壁培养来培养上述个数的细胞,需要106cm2以上的培养皿,这相当于约20,000个通常的10cm培养皿。由于通过培养皿表面上的贴壁培养而得到的细胞数依赖于培养面积,因此难以扩大规模,难以供给再生医学所需要的足够量的多能干细胞。
在这种情况下,正在进行利用悬浮培养等三维培养来代替贴壁培养的多能干细胞的大量生产技术的研究及开发。
例如,非专利文献1中公开了使用旋转瓶作为悬浮培养的细胞培养容器,通过强搅拌力搅拌液体培养基,同时进行人多能干细胞的悬浮培养,制造均匀大小的球状体的方法。
非专利文献2中公开了使用形成了微小微孔的基板在各微孔中制备均匀大小的球状体的方法。
非专利文献3中公开了使用粘性、比重经过调整的培养基作为培养基,在保持多能干细胞的悬浮状态的同时抑制细胞彼此的碰撞并进行培养的方法。
专利文献1中公开了在液体培养基中对细胞进行回转培养来制备细胞的聚集体的技术。
专利文献2中公开了将多能干细胞悬浮培养至细胞团块的平均直径为约200μm以上且300μm以下的方法。
专利文献3中公开了通过在包含溶血磷脂酸(LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)等溶血磷脂的培养基中对细胞进行悬浮培养来抑制细胞的聚集的技术。
专利文献4在视网膜细胞或视网膜组织的制造方法中公开了对人多能干细胞进行悬浮培养而形成细胞的聚集体的技术。
专利文献5中公开了能够使多能干细胞等细胞或组织以悬浮状态均匀分散的具有阴离子性官能团的高分子化合物的结构体(脱酰基化结冷胶)的相关技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2003-304866号公报
专利文献2:国际公开第2013/077423号
专利文献3:国际公开第2016/121737号
专利文献4:国际公开第2016/063986号
专利文献5:国际公开第2014/017513号
非专利文献
非专利文献1:Olmer R.et al.,Tissue Engineering:Part C,Volume 18(10):772-784(2012)
非专利文献2:Ungrin MD et al.,PLoS ONE,3(2),e1565(2008)
非专利文献3:Otsuji GT et al.,Stem Cell Reports,Volume 2:734-745(2014)
发明内容
发明要解决的课题
本发明人等发现,细胞之间膜蛋白、细胞膜的非特异性吸附、细胞表面的钙粘蛋白介导的细胞之间的粘附在对多能干细胞等贴壁细胞进行悬浮培养方面是重要的机制。即,对于悬浮培养技术的要求,存在必须制备适度大小的细胞聚集体而不妨害细胞的膜蛋白、细胞表面的钙粘蛋白等的结合的课题。然而,非专利文献1~3及专利文献1~2、4~5中公开的悬浮培养技术存在以下问题。
非专利文献1的方法存在因剪切应力而容易发生细胞死亡的问题。
非专利文献2的方法存在难以大规模化、难以更换培养基等的问题。
非专利文献3的方法存在因培养时培养基的移动少而难以将氧、营养成分供给至细胞聚集体的问题。
专利文献1中未公开用于将细胞团块的大小控制为适度大小的方式。
专利文献2中记载了在培养基中添加水溶性高分子来提高粘性作为用于防止细胞团块彼此粘附的方式。因此,与非专利文献3同样地存在难以将氧、营养成分供给至细胞聚集体的问题。
专利文献4中未提供控制细胞聚集体的大小的技术。
专利文献5中由于需要将高分子化合物的结构体添加至培养基,因此需要在培养后对细胞和结构体进行分离。
因此,本发明人等为了解决上述课题,开发了一种悬浮培养的技术,其能够通过在专利文献3中包含溶血磷脂的培养基中对细胞进行悬浮培养,从而抑制细胞的聚集,生产适度大小的聚集体而不对细胞造成损害。
但是,专利文献3中仅公开了溶血磷脂作为抑制细胞聚集的成分。本发明人等想到,如果除溶血磷脂以外,还可提供通过在悬浮培养中存在于培养基中而抑制或促进细胞聚集的成分,则能够更适当地控制细胞聚集体的大小而不依赖于机械性/物理性的方式。
解决课题的方法
本发明人等进行了深入研究,结果发现,通过在悬浮培养中使培养基中存在细胞周期阻滞剂,可起到抑制细胞聚集的作用,从而完成了本发明。
因此,本发明包含以下列举的特征。
(1)一种多能干细胞聚集抑制剂,其包含细胞周期阻滞剂,所述多能干细胞聚集抑制剂用于多能干细胞的悬浮培养。
(2)根据(1)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂的浓度为55.0mg/mL以上且1.1g/mL以下、或60mM以上且15M以下。
(3)根据(1)或(2)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂为浓缩形式,其能够在培养时被稀释,使培养基中的浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下、或3nM以上且300mM以下。
(4)根据上述(1)~(3)中任一项所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
(5)根据上述(1)~(4)中任一项所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(CytochalasinD)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、以及它们的盐中的至少1种物质。
(6)根据上述(4)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
(7)根据上述(4)所述的多能干细胞抑制剂,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
(8)根据上述(4)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
(9)根据上述(4)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
(10)根据上述(4)所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
(11)一种多能干细胞聚集体的制备方法,该方法包括:在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。
(12)根据上述(11)所述的制造方法,其中,所述培养基中的所述细胞周期阻滞剂的浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下、或3nM以上且300mM以下。
(13)根据上述(11)或(12)所述的制造方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
(14)根据上述(11)~(13)中任一项所述的制造方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、以及它们的盐中的至少1种物质。
(15)根据上述(13)所述的制造方法,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
(16)根据上述(13)所述的制造方法,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
(17)根据上述(13)所述的制造方法,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
(18)根据上述(13)所述的制造方法,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
(19)根据上述(13)所述的制造方法,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
(20)一种多能干细胞聚集体,其是通过上述(11)~(19)中任一项所述的制造方法得到的。
(21)一种多能干细胞培养组合物,其包含:多能干细胞的细胞聚集体、培养基、以及浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下或3nM以上且300mM以下的细胞周期阻滞剂。
(22)根据上述(21)所述的多能干细胞培养组合物,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
(23)根据上述(21)或(22)所述的多能干细胞培养组合物,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、以及它们的盐中的至少1种物质。
(24)根据上述(21)~(23)中任一项所述的多能干细胞培养组合物,其还包含生长因子。
(25)一种抑制多能干细胞聚集的方法,该方法包括:在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。
(26)根据上述(25)所述的方法,其中,所述培养基中的所述细胞周期阻滞剂的浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下、或3nM以上且300mM以下。
(27)根据上述(25)或(26)所述的方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
(28)根据上述(25)~(27)中任一项所述的方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、以及它们的盐中的至少1种物质。
(29)根据上述(27)所述的方法,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
(30)根据上述(27)所述的方法,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
(31)根据上述(27)所述的方法,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
(32)根据上述(27)所述的方法,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
(33)根据上述(27)所述的方法,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
(34)一种多能干细胞培养培养基,其包含:培养基、和浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下或3nM以上且300mM以下的细胞周期阻滞剂。
(35)根据上述(34)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
(36)根据上述(34)或(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、以及它们的盐中的至少1种物质。
(37)根据上述(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
(38)根据上述(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
(39)根据上述(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
(40)根据上述(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
(41)根据上述(35)所述的多能干细胞培养培养基,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
(42)根据上述(34)~(41)中任一项所述的多能干细胞培养培养基,其还包含生长因子。
(43)根据上述(34)~(42)中任一项所述的多能干细胞培养培养基,其用于制备细胞聚集体。
(44)根据上述(11)~(19)中任一项所述的制造方法、上述(20)所述的多能干细胞聚集体、上述(21)~(24)中任一项所述的多能干细胞培养组合物、或上述(43)所述的多能干细胞培养培养基,其中,在所述细胞聚集体的70%以上(重量基准)中,细胞聚集体的宽度最宽的部分的尺寸为500μm以下,优选为300μm以下。
(45)根据上述(11)~(19)及(44)中任一项所述的制造方法、上述(20)或(44)所述的多能干细胞聚集体、上述(21)~(24)及(44)中任一项所述的多能干细胞培养组合物、或上述(43)或(44)所述的多能干细胞培养培养基,其中,在所述细胞聚集体的70%以上(重量基准)中,细胞聚集体的宽度最宽的部分的尺寸为40μm以上,优选为100μm以上。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请号2017-254829号的公开内容。
发明的效果
本发明的多能干细胞聚集抑制剂(有效成分;至少1种细胞周期阻滞剂)的一个实施方式可以为了抑制悬浮培养时的多能干细胞的聚集而配合在培养基中。
根据本发明的多能干细胞聚集的抑制方法的一个实施方式,在上述多能干细胞聚集抑制剂存在下的悬浮培养中,可以抑制多能干细胞的聚集。
根据本发明的细胞聚集体的制备方法的一个实施方式,可以以高产量制造细胞聚集体。
根据本发明的细胞聚集体的一个实施方式,具有适度尺寸的细胞聚集体,活细胞率高。
本发明的细胞培养组合物的一个实施方式可以用于以高产量制造细胞聚集体。
附图说明
图1A示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在包含图中所示浓度的细胞周期阻滞剂、即秋水仙碱(Colchicine)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)或二甲基亚砜(DMSO)的培养基中对人iPS细胞进行悬浮培养时,培养第1天的相差显微镜的观察图像。对照是在Y-27632(10μM)的存在下,在不包含上述细胞周期阻滞剂的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养时,培养第1天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图1B示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有图中所示的浓度的细胞周期阻滞剂、即Latorunculin A、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)或多西他赛(Docetaxel)的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养时,培养第1天的相差显微镜的观察图像。对照是在Y-27632(10μM)的存在下,在不包含上述细胞周期阻滞剂的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养时,培养第1天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图1C示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在不含有细胞周期阻滞剂的培养基中(阴性对照)、含有鞘氨醇-1-磷酸(S1P)(0.8μg/mL(2.1μM))的培养基中(阳性对照),或在含有细胞松弛素B(1μM)的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养时,培养第1天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为500μm。
图2A示出了在含有Y-27632(10μM)的培养基中对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图2B示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有细胞松弛素D(20nM)的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图2C示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有伽斯利德(20nM)的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图2D示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有脱羰秋水仙碱(10ng/mL(26.9nM))的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图2E示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有DMSO(1%(0.14M))的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。各图像数据上的比例尺为200μm。
图3是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有细胞松弛素D(20nM)、伽斯利德(20nM)、脱羰秋水仙碱(10ng/mL(26.9nM))或DMSO(1%(0.14M))的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制作细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,从培养第1天至第5天的葡萄糖消耗量的图表。对照是在含有Y-27632(10μM)的培养基中进行培养时的葡萄糖消耗量。
图4是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有细胞松弛素D(20nM)、伽斯利德(20nM)、脱羰秋水仙碱(10ng/mL(26.9nM))或DMSO(1%(0.14M))的培养基中,对人iPS细胞(接种细胞数8×105细胞/孔)进行悬浮培养,制备细胞聚集体,然后继续进行悬浮培养时,培养第5天的细胞产量的图表。对照是在含有Y-27632(10μM)的培养基中进行培养时的细胞产量。
图5A示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有细胞松弛素D(20nM)的培养基中,对人iPS细胞(接种细胞数8×105细胞/孔)进行悬浮培养时,培养第5天的细胞的未分化标志物(SOX2、OCT4及Nanog)阳性率的测定结果。
图5B示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有伽斯利德(20nM)的培养基中,对人iPS细胞(接种细胞数8×105细胞/孔)进行悬浮培养时,培养第5天的细胞的未分化标志物(SOX2、OCT4及Nanog)阳性率的测定结果。
图5C示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有脱羰秋水仙碱(10ng/mL(26.9nM))的培养基中,对人iPS细胞(接种细胞数8×105细胞/孔)进行悬浮培养时,培养第5天的细胞的未分化标志物(SOX2、OCT4及Nanog)阳性率的测定结果。
图5D示出了在Y-27632(10μM)的存在下,在含有DMSO(1%(0.14M))的培养基中,对人iPS细胞(接种细胞数8×105细胞/孔)进行悬浮培养时,培养第5天的细胞的未分化标志物(SOX2、OCT4及Nanog)阳性率的测定结果。
图6A是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有细胞松弛素D(20nM)的培养基中对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体时,培养第1天的细胞聚集体的直径分布的图表。
图6B是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有伽斯利德(20nM)的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体时,培养第1天的细胞聚集体的直径分布的图表。
图6C是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有脱羰秋水仙碱(10ng/mL(26.9nM))的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体时,培养第1天的细胞聚集体的直径分布的图表。
图6D是示出在Y-27632(10μM)的存在下,在含有DMSO(1%(0.14M))的培养基中,对人iPS细胞进行悬浮培养,制备细胞聚集体时,培养第1天的细胞聚集体的直径分布的图表。
具体实施方式
以下,使用优选实施方式对本发明进行详细说明。
<1.多能干细胞>
本发明中使用的多能干细胞具有在培养基中形成类胚体(embryoid body)或细胞集合体(以下,总称为“细胞聚集体”)的性质,作为该细胞的具体例子,可以举出动物来源的多能干细胞,优选为哺乳动物来源的多能干细胞,更优选为人来源的多能干细胞。
本说明书中使用的“多能干细胞”是指同时具有多能性(pluripotency)和高自我复制能力的细胞。这里,多能性是分化成全部三胚层(即,内胚层、中胚层及外胚层)的能力,另外,高自我复制能力是无限增殖的能力。
作为多能干细胞的具体例子,可以列举例如:胚胎干细胞(ES细胞)、作为胎儿原始生殖细胞来源的多能干细胞的EG细胞(Shamblott M.J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:13726-13731(1998))、作为睾丸来源的多能干细胞的GS细胞(Conrad S.,Nature 456:344-349(2008))、作为体细胞来源的人工多能干细胞的iPS细胞(induced pluripotent stem cells)等,但并不限定于此。优选的多能干细胞是ES细胞及iPS细胞。
ES细胞是来自被称为胚泡的早期胚胎的多能干细胞。
iPS细胞是通过向体细胞导入重编程因子使体细胞重编程为未分化状态,从而赋予了多能性的人工建立的多能干细胞。作为重编程因子,可以使用例如OCT3/4及KLF4、SOX2及c-Myc(或L-Myc)的组合(Takahashi K,et al.Cell.131:861-872(2007))、OCT3/4、SOX2、LIN28及Nanog的组合(Yu J,et al.Science.318:1917-1920(2007))等。这些因子导入细胞的形态没有特别限定,可以列举例如:使用了病毒、质粒等载体的基因导入、合成RNA的导入、蛋白质的直接导入等。另外,也可以利用通过使用了microRNA、RNA、低分子化合物等的方法制备的iPS细胞。
ES细胞、iPS细胞等多能干细胞可以使用市售品或受让的细胞,也可以使用新制备的细胞。作为iPS细胞,可以使用例如公知的253G1株、201B6株、201B7株、409B2株、454E2株、HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、TkDN4-M株、TkDA3-1株、TkDA3-2株、TkDA3-4株、TkDA3-5株、TkDA3-9株、TkDA3-20株、hiPSC 38-2株、MSC-iPSC1株、BJ-iPSC1株、RPChiPS771-2株等。作为ES细胞,可以使用例如公知的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SEES-1株、SEES-2株、SEES-3株、SEES-4株、SEES-5株、SEES-6株、SEES-7株、HUES8株、CyT49株、H1株、H9株、HS-181株等。还可以使用新制备的临床级的iPS细胞或ES细胞。制备iPS细胞时的细胞的来源没有特别限定,例如可以使用成纤维细胞或淋巴细胞等。
本发明中使用的多能干细胞可以来自于任意动物,例如可以来自于小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类、人、大猩猩、黑猩猩等灵长类、以及来自于犬、猫、兔、牛、马、猪、绵羊、山羊等家畜或宠物等哺乳动物,优选为来自人的细胞。
对于为了供于本发明的悬浮培养而通过在基于公知方法保持了未分化性的状态下的贴壁培养等培养进行增殖所制备的多能干细胞而言,由于细胞相互附着或粘附、以及细胞附着或粘附于容器,因此需要使用例如剥离剂将细胞与容器分离、或者分离为单个的细胞。该分离的方法没有特别限定,作为剥离剂,可以列举例如:胰蛋白酶、胶原酶等酶、该酶与EDTA(乙二胺四乙酸)等螯合剂的混合物等。酶剥离剂的例子有胰蛋白酶、Accutase(注册商标;Thermo Fisher Scientific公司)、TrypLETM Express Enzyme(LifeTechnologies Japan公司)、TrypLETM Select Enzyme(Life Technologies Japan公司)、Dispase(注册商标)、胶原酶等。分离后的多能干细胞、其细胞群(cell population)可以根据需要冷冻保存,在供于本发明的用于细胞增殖的悬浮培养时进行解冻并使用给定量。
<2.细胞聚集体>
本说明书中的“细胞聚集体”是多个细胞三维聚集而形成的块状的细胞群(也被称为“球状体”)。细胞聚集体代表性地具有基本球状的形状。同一细胞的聚集包括由1个细胞的增殖形成聚集块的情况。作为细胞聚集的机制,没有限定,可以列举:细胞之间膜蛋白、细胞膜的非特异性吸附、细胞表面的钙粘蛋白介导的细胞之间的粘附等。
在本发明中,构成细胞聚集体的多能干细胞可以是由单一的细胞株或多个细胞株形成的,优选由单一的细胞株形成。或者,由例如人诱导性多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞构成的细胞聚集体包括表达了多能干细胞标志物的细胞和/或多能干细胞标志物呈阳性的细胞。这里,多能干细胞标志物在iPS细胞和ES细胞中实质上是共通的,例如,可以示例出:Alkaline Phosphatase、NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60、c-Myc、KLF4、LIN28、SSEA-4、SSEA-1等标志物。以这样的多能干细胞标志物作为指标,可以确认该细胞能够保持未分化状态,同时对细胞进行增殖、管理。
多能干细胞标志物可以通过该技术领域中的任意检测方法进行检测。作为检测细胞标志物的方法,没有限定,可以举出例如流式细胞术。作为流式细胞术,在使用荧光标记抗体作为检测试剂的情况下,在检测到比阴性对照(同型对照)发出更强的荧光的细胞时,判定该细胞对该标志物呈“阳性”。对于通过流式细胞术分析的荧光标记抗体呈阳性的细胞的比率有时记为“阳性率”。另外,荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体,可以列举利用例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)等标记的抗体,但并不限定于此。
通过上述检测方法得到的多能干细胞标志物的阳性率可以优选为80%以上、更优选为90%以上、更优选为91%以上、更优选为92%以上、更优选为93%以上、更优选为94%以上、更优选为95%以上、更优选为96%以上、更优选为97%以上、更优选为98%以上、更优选为99%以上、更优选为100%以下。需要说明的是,多能干细胞标志物与未分化标志物含义相同,两者可以互换使用。
在本发明中,悬浮培养时,通过使培养基中存在细胞周期阻滞剂,可以抑制多能干细胞的细胞聚集。
在本说明书中,“细胞聚集抑制”、“抑制细胞聚集”、“抑制细胞的聚集”、或与其等同的用语是指,抑制细胞聚集,并由此抑制细胞聚集体的形成或增大。在本说明书中,“细胞聚集抑制剂”是指具有抑制细胞聚集的效果的物质或药剂,在本发明中,是含有细胞周期阻滞剂、例如控制细胞骨架停止细胞周期的物质或药剂的组合物。
通过本发明的方法制造的细胞聚集体的尺寸(size)没有特别限定,在用显微镜观察时,作为观察图像中宽度最宽的部分的尺寸的上限,例如为900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下。作为下限,例如为40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上。通常,1个人iPS细胞为约10μm的尺寸。这样的尺寸范围的细胞聚集体易于向其内部的细胞供给氧、营养成分,作为细胞的增殖环境是优选的。
对于通过本发明的方法制造的细胞聚集体的集团而言,优选构成该集团的细胞聚集体中以重量基准计例如70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上具有上述范围的尺寸。
<3.培养及培养基>
在本说明书中,“悬浮培养”是细胞培养方法之一,是指在培养基中以悬浮状态使细胞增殖。在利用本发明的方法进行的悬浮培养中,在添加了含有细胞周期阻滞剂的细胞聚集抑制剂的培养液中形成的多能干细胞的细胞聚集体的尺寸被抑制性地调节为给定尺寸。
“悬浮培养法”是对细胞进行悬浮培养的方法,该方法中的细胞以在培养液中聚集而成的细胞团块的形式存在。在本说明书中,可以作为用于三维培养细胞并进行大量生产的方法来使用,但并没有限定。作为相对于悬浮培养法的其它培养方法,有贴壁培养法。“贴壁培养法”是对细胞进行贴壁培养的方法。“贴壁培养”是指,使细胞粘附于培养容器等外部基质等,原则上以单层使其增殖。在本发明中,为了制备细胞聚集体、并调节其大小,作为对象的培养法是悬浮培养法。但是,除维持培养阶段等主要工序以外所使用的培养方法并不限定于此。需要说明的是,上述的贴壁细胞通常不仅可以贴壁培养,而且也可以悬浮培养。
在本说明书中,“培养基”是指用于培养细胞而制备的液体状或固体状的物质。作为原则,包含所需最小限度以上的细胞的增殖和/或保持所不可缺少的成分。除非另有特别说明,否则本说明书的培养基符合动物来源细胞的培养所使用的动物细胞用的液体培养基。
悬浮培养的多能干细胞的种子细胞可以通过上述<1.多能干细胞>中记载的贴壁培养等培养而得到。例如,可以通过对给定的细胞株进行贴壁培养进行增殖,得到给定细胞数的细胞株。这里,“贴壁培养”通常在培养容器表面、聚合物载体上、或饲养细胞(例如,小鼠成纤维细胞)上培养细胞,原则上以单层使其增殖。用于通过悬浮培养使多能干细胞增殖的培养基需要选择适于保持易受培养环境影响的细胞的品质(例如未分化)的培养基。为了保持品质的稳定性、排除病原体等有害物,优选使用无血清培养基,各种无血清合成培养基已有市售、或在文献等记载,可以在本发明的培养中使用这样的培养基(例如,菅三佳和古江美保,生物工学92卷487-490页,2014年(日本生物工学会);R.Ian Freshney,Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(Sixth Ed.),John Wiley&Sons,Inc.,2010)。本发明中使用的培养基优选为适于多能干细胞的悬浮培养的培养基,代表性地为包含动物细胞用的基础培养基和添加剂的液体培养基。
在本说明书中,“基础培养基”是指作为各种动物细胞用培养基的基础的培养基。可以单独进行培养,另外,也可以加入各种培养添加物,根据目的而制成对各种细胞特异性的培养基。作为本说明书中使用的基础培养基,可以使用BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium)、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、Ham’s F10培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、以及它们的混合培养基(例如,DMEM/F12培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham))等培养基,没有特别限定。作为DMEM/F12培养基,特别是使用优选以60/40~40/60的重量比、更优选以55/45~45/55的重量比、最优选以等量(50/50的重量比)将DMEM培养基和Ham’s F12培养基混合而成的培养基。
本发明中使用的培养基优选为不含血清的培养基(无血清培养基)或包含血清代替品(Serum Replacement)的培养基。作为血清代替品的例子,可以举出KnockOutTM SerumReplacement(KSR)(Gibco)。
本发明中使用的培养基中的添加剂没有限定,例如可以包含以下列举的成分。
作为该添加剂,更优选包含选自L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠中的至少1种,更优选包含上述全部。L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒、以及碳酸氢钠可以以溶液、衍生物、盐或混合试剂等的形式添加于培养基。例如,L-抗坏血酸可以以抗坏血酸-2-磷酸酯镁等衍生物的形式添加于培养基。硒可以以亚硒酸盐(亚硒酸钠等)的形式添加于培养基。胰岛素及转铁蛋白可以是从动物(优选为人、小鼠、大鼠、牛、马、山羊等)的组织或血清等中分离出的天然来源的胰岛素及转铁蛋白,也可以是通过基因工程制备的重组蛋白质。胰岛素、转铁蛋白及硒可以以试剂ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)的形式添加于培养基。ITS是包含胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸钠的用于促进细胞增殖的添加剂。
作为包含上述添加剂的培养基,例如可以使用包含选自L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠中的至少1种的市售的培养基。作为添加了胰岛素及转铁蛋白的市售的培养基,可以使用CHO-S-SFM II(Life Technologies Japan公司)、Hybridoma-SFM(LifeTechnologies Japan公司)、eRDF Dry Powdered Media(Life Technologies Japan公司)、UltraCULTURETM(BioWhittaker公司)、UltraDOMATM(BioWhittaker公司)、UltraCHOTM(BioWhittaker公司)、UltraMDCKTM(BioWhittaker公司)等。可以优选使用STEMPROTMhESCSFM(Life Technologies Japan公司)、mTeSR1(Veritas公司)、TeSR2(Veritas公司)等。此外,也优选使用人iPS细胞、人ES细胞的培养中使用的培养基。
本发明中使用的培养基优选进一步包含至少1种生长因子。作为生长因子,没有限定,优选包含选自FGF2(Basic fibroblast growth factor-2)、TGF-β1(Transforminggrowth factor-β1)、Activin A、IGF-1、MCP-1、IL-6、PAI、PEDF、IGFBP-2、LIF(LeukemiaInhibitory Factor)、以及IGFBP-7中的1种以上。LIF具有分化抑制作用,因此优选将其给定量添加于培养基。另外,优选的生长因子为FGF2和/或TGF-β1。
作为本发明中使用的最优选的培养基,是包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠、以及至少1种上述生长因子作为后述的除细胞周期阻滞剂以外的成分的无血清培养基,特别优选为包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠、以及至少1种生长因子(例如LIF、FGF2及TGF-β1)、且不含血清的DMEM/F12培养基。作为这样的培养基,没有限定,可以优选使用添加了ROCK抑制剂(参照<5.Rho-激酶抑制剂>)的Essential 8TM培养基(Life Technologies Japan公司)。Essential 8TM培养基可以将由Life TechnologiesJapan公司市售的DMEM/F12培养基DMEM/F-12(HAM)1∶1与Essential 8TM补充剂(包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒、碳酸氢钠、FGF2及TGF-β1)混合来制备。ROCK抑制剂具有抑制多能干细胞的细胞死亡的效果,因此优选将其给定量添加于培养基。
本发明中使用的培养基还可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如,非必需氨基酸)、维生素、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、抗生素等其它成分。作为抗生素,可以使用青霉素、链霉素、两性霉素B等。
<4.细胞周期阻滞剂>
本发明的特征在于,在对多能干细胞进行悬浮培养时,为了抑制该干细胞的细胞聚集,在培养基中添加至少1种任意的细胞周期阻滞剂、例如控制细胞骨架停止细胞周期的物质或药剂。因细胞聚集而使聚集体尺寸过大时,处于无法向聚集体内部充分供给氧、营养成分等的状态,其结果是,细胞的增殖明显受到抑制。因此,重要的是控制培养条件,使得其为细胞增殖实质上不受妨害或不容易受到妨害的聚集体尺寸。在本发明中,为了抑制这样的细胞聚集,将给定量的细胞周期阻滞剂添加于培养基是有效的。
众所周知,细胞周期包括4个阶段,即,作为DNA复制前的准备期的G1期、作为DNA复制期的S期、作为细胞分裂前的准备期的G2期、以及作为细胞分裂期的M期。根据本发明,能够使细胞周期停止的物质或药剂可以抑制多能干细胞的聚集。
细胞周期阻滞剂包括能够在悬浮培养中抑制多能干细胞聚集的所有的细胞骨架控制剂,换言之,包括控制细胞骨架、停止细胞周期的物质或药剂,可以列举:肌动蛋白聚合抑制剂、肌动蛋白纤维的解聚抑制剂、微管蛋白聚合抑制剂、微管蛋白纤维的解聚抑制剂等作为非限定性例子。作为这些阻滞剂,已知有各种物质(或药剂),它们作用的细胞周期停止时期(G1期、G2期、G1/S期、G2/M期、M期等)取决于物质(或药剂)。因此,根据本发明的一个实施方式,细胞周期阻滞剂是选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种(即,1种以上)物质(或药剂)。
以下,作为非限定性例子,列举本发明中可使用的细胞周期阻滞剂。
秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid;TIBA)、安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3)、细胞松弛素A(Cytochalasin A)、细胞松弛素E(Cytochalasin E)、Indanocine、Latorunculin B、Wiskostatin、钙蛋白酶(Calpain抑制剂;G1/S)、钙蛋白酶抑制剂I(Calpain inhibitor I;G1/S)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿非迪霉素(Aphidicolin)、喜树碱(Camptothecin)、5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑(5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole)、依米丁(Emetine)、依托泊苷(Etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、吲哚-3-甲醇(Indole-3-carbinol)、KN-93、L-含羞草素(L-Mimosine)、冈田软海绵酸(Okadaic Acid)、长春新碱(Vincristine)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cdk Inhibitor)(例如,肯帕罗酮(Kenpaullone)、NSC625987、Fascaplysin、乙基-(6-羟基-4-苯基苯并[4,5]呋喃[2,3-b])吡啶-3-羧酸酯(Ethyl-(6-hydroxy-4-phenylbenzo[4,5]furo[2,3-b])pyridine-3-carboxylate))、c-Myc抑制剂(c-Myc Inhibitor)(例如,10058-F4;(Z,E)-5-(4-乙基次苄基)-2-硫代噻唑烷-4-酮((Z,E)-5-(4-Ethylbenzylidine)-2-thioxothiazolidin-4-one))、环磷酰胺一水物(CyclophosphamideMonohydrate)、MDM2拮抗剂(MDM2 Antagonist)(例如,Nutlin-3、NSC66811、2-苄基-3-(4-氯苯基)-3-(3-羟基丙氧基)-2,3-二氢异吲哚-1-酮(2-Benzyl-3-(4-chlorophenyl)-3-(3-hydroxypropoxy)-2,3-dihydroisoindol-1-one))、p21活化激酶抑制剂(p21-Activated Kinase Inhibitor)(例如,PAK抑制剂(PAK Inhibitor)、PAK18(Zhao,L.etal.,Nat.Neurosci.2006;9:234-242;H2N-RKKRRQRRR-G-PPVIAPRPEHTKSVYTRS-CO2H(序列号1))、Ras/Rac转化阻断剂(Ras/Rac Transformation blockers)(例如,SCH51344;6-甲氧基-4-(2-((2-羟基乙氧基)-乙基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]喹啉(6-Methoxy-4-(2-((2-hydroxyethoxyl)-ethyl)amino)-3-methyl-1H-pyrazolo[3,4-b]q uinoline))、4-苯基丁酸钠(Sodium 4-Phenylbutyrate)、STAT3抑制剂(STAT3 Inhibitor)(例如,Ac-PpYLKTK-OH(序列号2)、PpYLKTK-mts(序列号3、Turkson,J.et al.,J.Biol.Chem.2001;276:45443-45455)、P3-AHNP-STAT3BP(H-YGRKKRRQR-G-FCDGFYACYKDV-PpYL-OH,环状(Cyclic)(序列号4)、Tan,M.et al.Cancer Research 2006:66(7):3764-3771)、6-硝基苯并[b]噻吩-1,1-二氧化物;STAT3阻害性化合物(6-Nitrobenzo[b]thiophene-1,1-dioxide;Stat three inhibitory compound))、细胞周期蛋白D1抑制剂、或者它们的盐或它们的衍生物。
本说明书中的“盐”是显示出抑制多能干细胞的聚集的效果的盐,是由酸或碱(包含无机酸或无机碱、或者有机酸或有机碱)形成的盐,在上述的物质或化合物为碱性的情况下,可以由无机酸或有机酸形成盐,或者在上述物质或化合物为酸性的情况下,可以由无机碱或有机碱形成盐。无机酸及有机酸的例子非限定性地包括盐酸、磷酸、硫酸、硼酸、碳酸等无机酸、乙酸、琥珀酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲磺酸、酒石酸、马来酸等有机酸等。另外,无机碱及有机碱的例子非限定性地包括钠、钾等碱金属、二乙醇胺、乙二胺等胺、赖氨酸、精氨酸等氨基酸等。
将上述细胞周期阻滞剂中、G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂及M期阻滞剂的非限定性例子示于以下。
G1期阻滞剂例如包括秋水仙碱(Colchicine)或二甲基亚砜(DMSO)。
G1/S期阻滞剂例如包括细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
G2期阻滞剂例如包括细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、或多西他赛(Docetaxel)。
G2/M期阻滞剂例如包括鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、或诺考达唑(Nocodazole)。
M期阻滞剂例如包括伽斯利德(Jasplakinolide)。
<5.Rho-激酶抑制剂>
为了抑制多能干细胞的悬浮培养中该细胞的细胞死亡,优选在培养基中添加抑制Rho-激酶(ROCK,Rho-associated protein kinase)的激酶活性的物质(称为“ROCK抑制剂”)。
作为ROCK抑制剂,可以列举例如:Y-27632(4-[(1R)-1-氨乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺或其盐(例如二盐酸盐))(例如,参照Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57:976-983(2000);Narumiya et al.,Methods Enzymol.325:273-284(2000))、H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂或其盐(例如二盐酸盐))(例如,参照Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.93:225-232(2002))、Fasudil/HA1077(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪或其盐(例如二盐酸盐))(例如,参照Uenata et al.,Nature389:990-994(1997))、Wf-536((+)-(R)-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)苯甲酰胺单盐酸盐)(例如,参照Nakajima et al.,CancerChemother.Pharmacol.52(4):319-324(2003))及它们的衍生物、以及对于ROCK的反义核酸、诱导RNA干扰的核酸(例如,siRNA)、显性负性突变体、以及它们的表达载体。另外,作为ROCK抑制剂,已知其它低分子化合物,在本发明中,这样的化合物或它们的衍生物也可以作为ROCK抑制剂使用(例如,参照美国专利申请公开第2005/0209261号、美国专利申请公开第2005/0192304号、美国专利申请公开第2004/0014755号、美国专利申请公开第2004/0002508号、美国专利申请公开第2004/0002507号、美国专利申请公开第2003/0125344号、美国专利申请公开第2003/0087919号、以及国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。作为ROCK抑制剂,可以使用1种或2种以上的ROCK抑制剂。
ROCK抑制剂特别优选为选自Y-27632及H-1152中的1种以上,最优选为Y-27632。Y-27632及H-1152分别可以以二盐酸盐的形式使用。
上述的Y-27632、即4-[(1R)-1-氨乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺的结构式如下所述。
[化学式1]
上述的H-1152、即(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂卓的结构式如下所述。
[化学式2]
<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>
本发明的另一方式是一种抑制多能干细胞的聚集的方法,该方法包括:在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。
以下,对于在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序的具体实施方式进行说明。为了防止污染,以下的操作需要使用无菌的环境、灭菌后的装置、器具等来进行。
在实施悬浮培养之前,需要准备给定细胞数(例如104~106个)的多能干细胞。为此,悬浮培养所用的多能干细胞可以通过利用通常方法在保持未分化性的状态下进行维持培养,从而得到给定细胞数。本说明书中的上述维持培养的工序是为了在保持了未分化性的状态下使细胞增殖而对悬浮培养工序前的细胞群、或者悬浮培养工序后或随后的回收工序后得到的细胞聚集体进行培养的工序。
作为维持培养,可以使用使细胞粘附于培养容器表面、聚合物载体等培养基材并进行培养的贴壁培养。进行了维持培养的细胞用例如已知的剥离剂(例如,胰蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶、AcutaseTM等)从培养基材上剥离或使细胞彼此剥离,充分分散后用于悬浮培养。为了使细胞分散,可以使其通过过滤器分散至单细胞。
通过上述的维持培养收集的给定数量的多能干细胞如下所述进行本发明的悬浮培养工序、以及根据需要进行该细胞的回收工序。
细胞周期阻滞剂、培养基及细胞是具体实施方式如以上所述。
上述工序中的培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度可以根据细胞的种类、细胞数、培养基的种类等各条件适当调整为能够抑制细胞的聚集。上述工序中的培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度根据该抑制剂的种类而不同,可以适当选择在悬浮培养中多能干细胞的聚集受到抑制的浓度范围。该浓度没有限定,下限可以设为例如3ng/mL以上、5ng/mL以上、7ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上、50ng/mL以上、100ng/mL以上、200ng/mL以上、300ng/mL以上、500ng/mL以上、1μg/mL以上、5μg/mL以上、10μg/mL以上、15μg/mL以上、20μg/mL以上、50μg/mL以上、70μg/mL以上、100μg/mL以上等,以及上限可以设为例如50mg/mL以下、40mg/mL以下、35mg/mL以下、30mg/mL以下、25mg/mL以下、20mg/mL以下、15mg/mL以下、10mg/mL以下等,可以设为例如3ng/mL以上且30mg/mL以下的范围。或者下限可以设为例如3nM以上、5nM以上、10nM以上、15nM以上、20nM以上、25nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、80nM以上、100nM以上、300nM以上、500nM以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、30μM以上、50μM以上、60μM以上、70μM以上、80μM以上、100μM以上等,以及上限可以设为例如800mM以下、600mM以下、400mM以下、200mM以下、150mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、40mM以下等,可以设为例如3nM以上且300mM以下。
为了抑制多能干细胞的细胞死亡,优选在上述工序中的培养基中添加上述ROCK抑制剂。培养基中的ROCK抑制剂的浓度优选为不对多能干细胞的聚集抑制造成影响的水平,作为下限,没有限定,例如为3.3ng/mL以上、33ng/mL以上、330ng/mL以上、800ng/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、或10μg/mL以上,另一方面,作为上限,只要是细胞不死亡的浓度即可,没有限定,例如为3.4mg/mL以下、340μg/mL以下、34μg/mL以下、14μg/mL以下等。或着,上述浓度的下限没有限定,例如为10nM以上、100nM以上、1μM以上、2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上等,作为上限,没有限定,例如为10mM以下、1mM以下、100μM以下、50μM以下、40μM以下等。或着,在ROCK抑制剂为Y-27632二盐酸盐、H-1152二盐酸盐、HA10777二盐酸盐及Wf-536单盐酸盐中的任一种时,下限例如为270ng/mL以上且400ng/mL以下的范围、1.3μg/mL以上且2.0μg/mL以下的范围、2.2μg/mL以上且3.2μg/mL以下的范围等,以及上限例如为2.8μg/mL以上且4.0μg/mL以下的范围、3.4μg/mL以上且4.7μg/mL以下的范围,4.2μg/mL以上且5.9μg/mL以下的范围、14μg/mL以上且20μg/mL以下的范围等。
因此,在本发明中,作为判定多能干细胞的聚集受到了抑制的基准,可以将除不含细胞周期阻滞剂且含ROCK抑制剂以外、其它成分相同的培养基中的悬浮培养的细胞聚集程度(例如通过显微镜观察)作为比较对照。
上述工序中使用的培养容器优选为细胞对容器内的粘附性低的容器。为了得到这样的细胞粘附性低的容器,可以用例如生物相容性物质、聚合物等对容器的内表面进行亲水性表面处理。例如,可以使用NunclonTMSphera(Thermo Fisher Scientific公司)作为培养容器,但没有特别限定。
培养容器的形状没有特别限定,可以列举例如:孔状、盘状、烧瓶状(例如旋转瓶)、瓶状(例如滚瓶)、多层状(例如细胞工厂(cell factory))等形状的培养容器、径向反应器、中空纤维型反应器(原料材的例子为涂敷有乙烯-乙烯醇共聚物的聚乙烯、乙酸纤维素等)、塑料袋型反应器(例如,以乙烯-乙酸乙烯酯作为材料的CultiLifeTM Spin袋(TAKARA)、以TFE-HFP共聚物(FEP)作为材料的VueLife FEP Bag 32-C(American FluorosealCorporation)、培养袋A-1000NL(Nipro公司)等)等生物反应器,优选举出适合大量培养的生物反应器等。任何生物反应器或容器均优选为能够尽量降低或抑制对多能干细胞的剪切应力、能够尽量减少细胞死亡的方式。
悬浮培养可以是静置培养,也可以是在培养基流动的条件下的培养,优选为培养基流动的条件下的培养。作为在培养基流动的条件下的培养,优选为以抑制细胞聚集的方式使培养基流动的条件下的培养。作为以抑制细胞聚集的方式使培养基流动的条件下的培养,可以举出例如,以利用回转流、摇摆流等流动引起的应力(离心力、向心力)将细胞聚集于一点的方式使培养基流动的条件下的培养、通过直线往复运动使培养基流动的条件下的培养,特别优选为利用了回转流和/或摇摆流的培养。
对于回转培养而言,可以通过将容纳有包含培养基、细胞、以及细胞周期阻滞剂的细胞培养组合物的培养容器基本沿水平面以画出圆、椭圆、扁平的圆、扁平的椭圆、8字等闭合轨道的方式回转来进行,或者可以通过将回转与摇动、或回转与振荡组合来进行。回转速度没有特别限定,上限优选为200rpm以下,例如可以为150rpm以下、120rpm以下、115rpm以下、110rpm以下、105rpm以下、100rpm以下、95rpm以下、90rpm以下等。下限优选为1rpm以上,例如可以为10rpm以上、50rpm以上、60rpm以上、70rpm以上、80rpm以上、90rpm以上等。回转培养时的回转宽度没有特别限定,下限例如可以为1mm以上、10mm以上、20mm以上、25mm以上等。另外,回转培养时的回转宽度没有特别限定,回转宽度的上限例如可以为200mm以下、100mm以下、50mm以下、30mm以下、25mm以下等。另外,回转培养时的旋转半径也没有特别限定,优选设定为回转宽度为上述范围。旋转半径的下限例如可以为5mm以上、10mm以上等,并且上限例如可以为100mm以下、50mm以下等。通过将回转培养的条件设为该范围,可以制造适当尺寸的细胞聚集体。
摇动培养是在通过摇动(摇摆)搅拌使液体培养基流动的同时进行的培养。摇动培养通过使容纳有包含培养基、细胞、以及细胞周期阻滞剂的细胞培养组合物的培养容器在基本上与水平面垂直的平面内摇动来进行。摇动速度没有特别限定,例如在以1次往返作为1次的情况下,下限可以为以1分钟例如2次以上、4次以上、6次以上、8次以上、或10次以上进行摇动,另一方面,上限可以为以1分钟例如15次以下、20次以下、25次以下、或50次以下进行摇动。摇动时,优选相对于垂直面对培养容器赋予一定角度、即引导角度。摇动角度没有特别限定,下限例如可以为0°以上、1°以上、2°以上、4°以上、6°以上、8°以上等,另一方面,上限例如可以为10°以下、12°以下、15°以下、18°以下、20°以下等。通过将摇动培养的条件设为该范围,可以制备适当尺寸的细胞聚集体,因此是优选的。
另外,也可以通过上述这样的回转与摇动组合而成的运动,一边搅拌,一边进行培养。
使用了旋转瓶状的培养容器的培养是在培养容器中使用搅拌叶片在搅拌液体培养基的同时进行的培养。转速、培养基量没有特别限定。在市售的旋转瓶状的培养容器的情况下,作为细胞培养组合物的量,可以优选使用制造商推荐的量。转速例如可以设为10rpm以上且100rpm以下,但没有特别限定。
优选生物反应器包含装备有振荡、摇动、旋转等搅拌系统的罐、柱、袋等形状的容器,进一步包含培养基供给/排出系统、氧/二氧化碳供给系统、具备温度、培养基成分、气体成分等的测量传感器的监视系统、细胞回收系统等,整体是自动的。另外,培养的方式可以是间歇式、半连续式或连续式中的任一种。
悬浮培养中细胞在培养基中的接种密度(悬浮培养开始时的细胞密度)可以适当调整,作为下限,例如为0.01×105个细胞/mL以上、0.1×105个细胞/mL以上、1×105个细胞/mL以上等,但并不限定于此。作为接种密度的上限,例如为20×105个细胞/mL以下、10×105个细胞/mL以下等。接种密度为该范围时,容易形成适当大小的细胞聚集体。例如可以为0.1×105个细胞/mL、0.2×105个细胞/mL、0.3×105个细胞/mL、0.4×105个细胞/mL、0.5×105个细胞/mL、0.6×105个细胞/mL、0.7×105个细胞/mL、0.8×105个细胞/mL、0.9×105个细胞/mL、1×105个细胞/mL、1.5×105个细胞/mL、2×105个细胞/mL、3×105个细胞/mL、4×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、6×105个细胞/mL、7×105个细胞/mL、8×105个细胞/mL、9×105个细胞/mL、10×106个细胞/mL。
悬浮培养时的细胞培养组合物的量可以根据使用的培养容器或生物反应器的内容量而适当调整,例如非限定地为1mL以上且100L以下。或者,在孔板、锥形烧瓶及培养袋的情况下,非限定地,例如在使用12孔板(俯视每1个孔时的孔底面的面积为3.5cm2)时,例如可以为0.5ml/孔以上、且1.5ml/孔以下,例如可以为1.3ml/孔。例如在使用6孔板(俯视每1个孔时的孔底面的面积为9.6cm2)时,例如可以为1.5mL/孔以上、2mL/孔以上、3mL/孔以上等,例如可以为6.0mL/孔以下、5mL/孔以下、4mL/孔以下等。例如在使用125mL锥形烧瓶(容量为125mL的锥形烧瓶)时,例如可以为10mL/容器以上、15mL/容器以上、20mL/容器以上、25mL/容器以上、20mL/容器以上、25mL/容器以上、30mL/容器以上等,例如可以为50mL/容器以下、45mL/容器以下、40mL/容器以下等。例如在使用500mL锥形烧瓶(容量为500mL的锥形烧瓶)时,例如可以为100mL/容器以上、105mL/容器以上、110mL/容器以上、115mL/容器以上、120mL/容器以上等,例如可以为150mL/容器以下、145mL/容器以下、140mL/容器以下、135mL/容器以下、130mL/容器以下、125mL/容器以下等。例如在使用1000mL锥形烧瓶(容量为1000mL的锥形烧瓶)时,例如可以为250mL/容器以上、260mL/容器以上、270mL/容器以上、280mL/容器以上、290mL/容器以上等,例如可以为350mL/容器以下、340mL/容器以下、330mL/容器以下、320mL/容器以下、310mL/容器以下等。例如在使用2000mL锥形烧瓶(容量为2000mL的锥形烧瓶)时,例如可以为500mL/容器以上、550mL/容器以上、600mL/容器以上等,例如可以为1000mL/容器以下、900mL/容器以下、800mL/容器以下、700mL/容器以下等。例如在3000mL锥形烧瓶(容量为3000mL的锥形烧瓶)的情况下,例如可以为1000mL/容器以上、1100mL/容器以上、1200mL/容器以上、1300mL/容器以上、1400mL/容器以上、1500mL/容器以上等,例如可以为2000mL/容器以下、1900mL/容器以下、1800mL/容器以下、1700mL/容器以下、1600mL/容器以下等。例如在2L培养袋(容量为2L的一次性培养袋)的情况下,例如可以为100mL/袋以上、200mL/袋以上、300mL/袋以上、400mL/袋以上、500mL/袋以上、600mL/袋以上、700mL/袋以上、800mL/袋以上、900mL/袋以上、1000mL/袋以上等,例如可以为2000mL/袋以下、1900mL/袋以下、1800mL/袋以下、1700mL/袋以下、1600mL/袋以下、1500mL/袋以下、1400mL/袋以下、1300mL/袋以下、1200mL/袋以下、1100mL/袋以下等。例如在10L培养袋(容量为10L的一次性培养袋)的情况下,例如可以为500mL/袋以上、1L/袋以上、2L/袋以上、3L/袋以上、4L/袋以上、5L/袋以上等,例如可以为10L/袋以下、9L/袋以下、8L/袋以下、7L/袋以下、6L/袋以下等。例如在20L培养袋(容量为20L的一次性培养袋)的情况下,例如可以为1L/袋以上、2L/袋以上、3L/袋以上、4L/袋以上、5L/袋以上、6L/袋以上、7L/袋以上、8L/袋以上、9L/袋以上、10L/袋以上等,例如可以为20L/袋以下、19L/袋以下、18L/袋以下、17L/袋以下、16L/袋以下、15L/袋以下、14L/袋以下、13L/袋以下、12L/袋以下、11L/袋以下等。例如在50L培养袋(容量为50L的一次性培养袋)的情况下,例如可以为1L/袋以上、2L/袋以上、5L/袋以上、10L/袋以上、15L/袋以上、20L/袋以上、25L/袋以上等,例如可以为50L/袋以下、45L/袋以下、40L/袋以下、35L/袋以下、30L/袋以下等。细胞培养组合物的量为该范围时,容易形成适当大小的细胞聚集体。或者,在使用其它更大容量的生物反应器时,可以为比以上示例出的上限的细胞培养组合物的量更多的量,其大小可随生物反应器的容量而变化。
使用的培养容器的容量可以适当选择,没有特别限定,例如为2mL以上且200L以下,或者,作为俯视容纳液体培养基的部分的底面时的面积,下限可以使用例如0.32cm2以上、0.65cm2以上、0.65cm2以上、1.9cm2以上、3.0cm2以上、3.5cm2以上、9.0cm2以上、9.6cm2以上的培养容器,作为上限,可以使用例如1000cm2以下、500cm2以下、300cm2以下、150cm2以下、75cm2以下、55cm2以下、25cm2以下、21cm2以下、9.6cm2以下、3.5cm2以下等的培养容器。或者,在使用其它更大容量的生物反应器时,可以为比以上示例出的上限的底面积更大的底面积,其大小可随生物反应器的形状而变化。
上述脂质存在下的细胞的悬浮培养的温度、时间、CO2浓度等条件没有特别限定。培养温度没有限定,作为下限,例如为20℃以上、25℃以上、30℃以上、35℃以上等,另外,作为上限,例如为45℃以下、40℃以下等,优选为37℃。培养时间没有限定,作为下限,例如为0.5小时以上、12小时以上、1天以上、2天以上等,另外,作为上限,例如为7天以下、6天以下、5天以下、4天以下、3天以下等。培养时的CO2浓度没有限定,作为下限,例如为4%以上、4.3%以上、或4.5%以上,另外,作为上限,例如为10%以下、8%以下、7%以下、或6%以下,优选为5%。悬浮培养可以伴有传代。培养条件为该范围时,容易形成适当大小的细胞聚集体。培养条件为该范围时,容易形成适当大小的细胞聚集体。
另外,可以以适当的频率进行培养基更换。培养基更换的频率根据培养的细胞种而不同,例如,可以以5天1次以上、4天1次以上、3天1次以上、2天1次以上、或1天1次以上来进行。培养基更换的优选频率例如为1天1次以上。对于培养基更换而言,可以在用与后述的回收工序相同的方法将细胞回收后,添加新鲜的培养基,平稳地使细胞聚集体分散后,进行再次培养。对于在悬浮培养工序中将细胞的数量增加至何种程度、另外将细胞的状态调整至何种程度,可以根据培养的细胞的种类、细胞聚集的目的、培养基的种类、培养条件而适当确定。或者,在使用使培养基流动的培养装置时,可以连续地或定期地进行培养基更换。该频率的培养基更换在培养多能干细胞的细胞聚集体时是特别优选的。培养基更换的方法没有特别限定,有通过多孔膜将细胞与培养基分离并补充新鲜培养基的方法、在使培养基流动的情况下将旧培养基从循环系统中排出并连续地或以一定时间间隔补充新鲜培养基的方法等。也有通过离心分离将细胞与培养基分离的方法,但需要抑制细胞死亡。
悬浮培养工序中使用的细胞优选为预先通过维持培养工序进行培养,通过回收工序进行回收,并根据需要进行了单细胞化的细胞。对于维持培养工序、回收工序、单细胞化,如后所述。
悬浮培养工序之后,通过通常方法废弃培养液,将细胞回收。此时,优选细胞通过剥离或分散处理而以单一的细胞的形式进行回收。对于具体的方法,在后述的回收工序中详细说明。回收的细胞可以直接供于下一工序,或者在根据需要用缓冲液(包括PBS缓冲液)、生理盐水或培养基(优选为下一工序中使用的培养基或基础培养基)清洗之后供于下一工序。
(维持培养工序)
“维持培养工序”是为了在保持了未分化性的状态下使细胞增殖而对悬浮培养工序前的细胞群、或者悬浮培养工序后或随后的回收工序后得到的细胞聚集体进行培养的工序。维持培养可以是使细胞粘附于容器、载体等培养基材并进行培养的贴壁培养,也可以是在培养基中使细胞悬浮并进行培养的悬浮培养。
在维持培养工序中,只要通过该领域中已知的动物细胞培养方法对作为对象的细胞进行培养即可。可以是贴壁培养或悬浮培养。
维持培养工序中使用的培养基、细胞的具体实施方式如上所述。
维持培养工序中使用的培养容器、细胞的接种密度、培养条件如以上关于悬浮培养工序所述的内容。
维持培养工序中的培养基的流动状态不受限制。可以是静置培养,也可以是流动培养。
“静置培养”是指在培养容器内将培养基静置的状态下进行培养。在贴壁培养中,通常采用该静置培养。
“流动培养”是指在使培养基流动的条件下进行培养。流动培养的具体实施方式如以上关于悬浮培养工序所述的内容。
对于在维持培养工序中将细胞的数量增加至何种程度、另外将细胞的状态调整至何种程度,可以根据培养的细胞的种类、细胞聚集的目的、培养基的种类、培养条件而适当确定。
维持培养工序的优选的一个方式是将细胞聚集体进一步进行培养的维持培养工序,所述细胞聚集体是通过含有上述细胞周期阻滞剂的细胞聚集抑制剂的存在下的悬浮培养工序而形成的。该方式的维持培养工序中的培养方法没有特别限定,可以举出例如在不包含含有上述细胞周期阻滞剂的细胞聚集抑制剂的培养基中对细胞聚集体进行悬浮培养的工序。作为该维持培养中使用的培养基,除不包含含有上述细胞周期阻滞剂的细胞聚集抑制剂以外,可以使用与上述相同的培养基,作为培养的条件,可以使用与悬浮培养工序相同的条件。在该方式的维持培养工序中,优选以适当的频率进行培养基更换。培养基更换的频率根据细胞种而不同,例如可以包括以5天1次以上、4天1次以上、3天1次以上、2天1次以上、或1天1次以上的频率、优选以1天1次以上的频率进行培养基更换操作。在对干细胞的细胞聚集体进行培养时,该频率的培养基更换是特别合适的。培养基更换的方法没有特别限定,例如将包含细胞聚集体的细胞培养组合物全部回收至离心管,离心分离或以静置状态放置5分钟左右,留下沉淀的细胞聚集体,去除上清,然后添加新鲜的培养基,在平稳地使细胞聚集体分散后,再次将细胞聚集体分散培养基返回至板等培养容器,由此可以继续培养细胞聚集体。该方式的维持培养工序的培养时间没有特别限定,例如为3天以上且7天以下的时间。通过在不包含含有上述细胞周期阻滞剂的细胞聚集抑制剂的培养基中于上述条件下进一步对细胞聚集体进行悬浮培养,可以得到适当尺寸的细胞聚集体。
在维持培养工序之后,通过通常方法废弃培养液,回收细胞。此时,优选细胞通过剥离或分散处理以单一细胞的形式回收。对于具体的方法,在后述的回收工序中详细说明。回收的细胞可以直接供于下一工序,或者在根据需要用缓冲液(例如PBS缓冲液等)、生理盐水或培养基(优选为下一工序中使用的培养基或基础培养基)清洗之后供于下一工序。
(回收工序)
“回收工序”是从维持培养工序或悬浮培养工序后的培养液中回收培养后的细胞的工序,是对本发明方法的目标细胞聚集体进行回收的工序。
在本说明书中,“细胞的回收”或简称为“回收”是指将培养液与细胞分离,获得细胞。细胞的回收方法只要是按照该领域的细胞培养方法使用的通常方法即可,没有特别限定。细胞培养方法通常可大致分为悬浮培养法和贴壁培养法。以下,对于各培养方法后的细胞的回收方法进行说明。
(悬浮培养方法后的回收方法)
在通过悬浮培养法对细胞进行了培养的情况下,细胞以悬浮在培养液中的状态存在。因此,细胞的回收可以通过利用静置状态或离心分离去除上清的液体成分来实现。另外,作为细胞的回收方法,也可以选择使用过滤器、中空纤维分离膜等。
在以静置状态去除液体成分时,只要将放入培养液的容器以静置状态放置5分钟左右,留下沉淀的细胞、细胞聚集体,去除上清即可。另外,离心分离只要以细胞不会因离心力而受到损伤的旋转速度和处理时间来进行即可。例如,旋转速度的下限只要能够将细胞沉淀即可,没有特别限定,例如可以为500rpm以上、800rpm以上、或1000rpm以上。另一方面,上限只要是细胞不会受到或不容易受到离心力造成的损伤的速度即可,例如可以为1400rpm以下、1500rpm以下、或1600rpm以下。另外,处理时间的下限只要是能够通过上述旋转速度将细胞沉淀的时间即可,没有特别限定,例如可以为30秒钟以上、1分钟以上、3分钟以上、或5分钟以上。另外,上限只要是细胞不会或不容易因上述旋转而受到伤害的时间即可,例如可以为6分钟以下、8分钟以下、或10分钟以下。回收后的细胞可以根据需要进行清洗。清洗方法没有限定。例如,可以与上述的维持培养工序中的工序后的清洗方法同样地进行。清洗液可以使用缓冲液(例如PBS缓冲液等)、生理盐水、或培养基(例如基础培养基)。
(贴壁培养后的回收方法)
在通过贴壁培养法对细胞进行了培养的情况下,在培养后,大量细胞以粘附于培养容器、培养载体等外部基质的状态存在。因此,为了从培养容器中去除培养液,只要将培养后的容器平稳地倾斜,使液体成分流出即可。粘附于外部基质的细胞残留在培养容器内,因此可以容易地将培养液与细胞分离。
然后,也可以根据需要对粘附于外部基质的细胞表面进行清洗。清洗液可以使用缓冲液(例如PBS缓冲液等)、生理盐水、或培养基(例如基础培养基)。但并不限定于此。清洗后的清洗液可以通过与培养液相同的操作去除。该清洗工序可以反复进行数次。
接着,将粘附于外部基质的细胞群从外部基质上剥离。剥离方法只要按照该领域中公知的方法进行即可。通常使用刮削、以蛋白水解酶作为有效成分的剥离剂、EDTA等螯合剂、或剥离剂与螯合剂的混合物等。
刮削是使用刮刀等通过机械性方式剥取附着于外部基质的细胞的方法。但是,细胞容易因机械性操作而受到损伤,因此,在回收后的细胞供于进一步培养的情况下,优选是将粘固于外部基质的细胞的支架(scaffold)部分化学性破坏或分解而消除对外部基质的粘附的剥离方法。
在剥离方法中使用剥离剂和/或螯合剂。剥离剂没有限定,例如,除了胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶、透明质酸酶以外,还可以利用市售的Accutase(注册商标)、TrypLETMExpress Enzyme(Life Technologies Japan公司)、TrypLETM Select Enzyme(Life Technologies Japan公司)、Dispase(注册商标)等。各剥离剂的浓度及处理时间只要在细胞的剥离或分散所用的通常方法的范围内使用即可。例如,在胰蛋白酶的情况下,溶液中的浓度的下限只要是能够剥离细胞的浓度即可,没有特别限定,例如可以为0.01%以上、0.02%以上、0.03%以上、0.04%以上、0.05%以上、0.08%以上、或0.10%以上。另一方面,溶液中的浓度的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的浓度即可,没有特别限定,例如可以为0.15%以下、0.20%以下、0.25%以下、或0.30%以下。另外,处理时间尽管取决于胰蛋白酶的浓度,但其下限只要是可利用胰蛋白酶的作用将细胞从外部基质上充分剥离的时间即可,没有特别限定,例如可以为1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、4分钟以上或5分钟以上。另一方面,处理时间的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的时间即可,没有特别限定,例如可以为8分钟以下、10分钟以下、12分钟以下、15分钟以下、18分钟以下、或20分钟以下。在其它剥离剂或螯合剂的情况下,可以基本相同地进行。需要说明的是,在使用市售的剥离剂时,可以按照附带的实验方案中记载的浓度及处理时间来进行。
从外部基质上剥离的细胞通过离心分离去除包含剥离剂的上清。离心条件可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”相同。回收后的细胞可以根据需要进行清洗。清洗方法也可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”同样地进行。
本工序后得到的细胞可以部分包含单层细胞片、细胞聚集体等细胞集合体。另一方面,回收的细胞也可以根据需要进行单一细胞化。
(单一细胞化)
在本说明书中,“单一细胞化”是指,使单层细胞片、细胞聚集体等那样多个细胞相互粘附或聚集而成的细胞集合体分散,形成单一的游离的细胞状态。
单一细胞化可以提高上述的剥离方法所使用的剥离剂和/或螯合剂的浓度、和/或延长剥离剂和/或螯合剂的处理时间。例如,在胰蛋白酶的情况下,溶液中的浓度的下限只要是能够将细胞集合体分散的浓度即可,没有特别限定,例如可以为0.15%以上、0.18%以上、0.20%以上、或0.24%以上。另一方面,溶液中的浓度的上限只要是细胞本身不会受到溶解等的影响的浓度即可,没有特别限定,例如可以为0.25%以下、0.28%以下、或0.30%以下。另外,尽管处理时间取决于胰蛋白酶的浓度,但其下限只要是通过胰蛋白酶的作用将细胞集合体充分分散的时间即可,没有特别限定,例如可以为5分钟以上、8分钟以上、10分钟以上、12分钟以上、或15分钟以上。另一方面,处理时间的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的时间即可,没有特别限定,例如可以为18分钟以下、20分钟以下、22分钟以下、25分钟以下、28分钟以下、或30分钟以下。需要说明的是,在使用市售的剥离剂时,可以按照附带的实验方案中记载的能够使细胞分散为单一状态的浓度来使用。通过在基于上述剥离剂和/或螯合剂的处理后温和地进行物理性处理,可以促进单一细胞化。该物理性处理没有限定,可以举出例如,将细胞与溶液一起多次进行移液的方法。另外,可以根据需要使细胞通过过滤器、筛网。
单一细胞化后的细胞可以通过静置或离心分离将包含剥离剂的上清去除而回收。回收的细胞可以根据需要进行清洗。对于离心分离的条件、清洗方法,可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”同样地进行。
<7.多能干细胞聚集抑制剂>
本发明的另一个方式是一种多能干细胞聚集抑制剂,其包含细胞周期阻滞剂,所述多能干细胞聚集抑制剂用于多能干细胞的悬浮培养。
本发明的多能干细胞聚集抑制剂可以用于在悬浮培养体系中适度抑制细胞的聚集,形成基本均匀大小的细胞聚集体。在使用了本发明的多能干细胞聚集抑制剂的干细胞的悬浮培养中,可以保持干细胞的未分化性。
本发明的多能干细胞聚集抑制剂的形态没有特别限定,可以是细胞周期阻滞剂本身,也可以是细胞周期阻滞剂与其它成分组合而成的组合物。
其它成分的种类没有特别限定,可以举出例如溶剂、赋形剂、和/或其它具有药理效果、作用效果的化合物等。它们可以是天然产物、或非天然产物。另外,上述组合的结果而得到的组合物可以是自然界中存在的天然组合物,也可以是人工组合物。对于人工组合物而言,只要构成成分中的至少1种为非天然产物即可。作为非天然产物的例子,可以举出合成化合物。作为可以包含在细胞聚集抑制剂中的合成化合物的具体例子,可以举出后述的实施例中用于抑制细胞死亡用途的ROCK抑制剂(例如Y-27632等)等。
上述组合物的形态没有特别限定。上述组合物例如可以是用于悬浮培养的培养基的形态,也可以是制备培养基时配合的添加用组合物的形态。
本发明中的多能干细胞聚集抑制剂的优选的实施方式是含有细胞周期阻滞剂的培养基或磷酸缓冲液等缓冲液。作为培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度,可以示例出<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>一栏中关于悬浮培养所记载的培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度。
本发明中的多能干细胞聚集抑制剂的另一个实施方式是在液体状或固体状介质中含有细胞周期阻滞剂的液体状或固体状组合物。上述液体状或固体状组合物是制备悬浮培养用的培养基时添加的添加物。该实施方式的多能干细胞聚集抑制剂优选以浓缩(或富集)形态制备,使得制备的培养基中的细胞周期阻滞剂的最终浓度为<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>一栏中关于悬浮培养所记载的培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度。该实施方式的多能干细胞聚集抑制剂中的细胞周期阻滞剂的浓度没有特别限定,例如为细胞周期阻滞剂的作为悬浮培养时培养基中的优选浓度而列举的上述浓度的例如1倍以上、2倍以上、10倍以上、100倍以上、1000倍以上、10000倍以上等,其依赖于对于溶剂多能干细胞聚集抑制剂所用的溶剂(例如DMSO、EtOH、缓冲液等)的溶解度,非限定性地可以示例出例如55.0mg/mL以上且1.1g/mL以下。一个实施方式中的上述细胞周期阻滞剂的浓度的下限可以为能够获得细胞聚集抑制效果的浓度,没有特别限定,例如可以为60mg/mL以上、70mg/mL以上、80mg/mL以上、100mg/mL以上、110mg/mL以上、130mg/mL以上、140mg/mL以上、150mg/mL以上、160mg/mL以上、180mg/mL以上、200mg/mL以上、300mg/mL以上、500mg/mL以上等,并且上限例如可以为600mg/mL以下、700mg/mL以下、800mg/mL以下、900mg/mL以下、1g/mL以下等。或者,例如为60mM以上、70mM以上、80mM以上、100mM以上、110mM以上、130mM以上、140mM以上、150mM以上、160mM以上、180mM以上、200mM以上、300mM以上、500mM以上、700mM以上等,并且作为上限,只要是细胞不死亡的浓度即可,没有特别限定,例如可以为15M以下、10M以下、5M以下、1M以下等,例如可以为60mM以上且15M以下的范围。
多能干细胞聚集抑制剂除细胞周期阻滞剂以外,还可以含有抗生素、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂、保藏剂、抗氧化剂等作为添加剂。抗生素没有特别限定,可以使用例如青霉素、链霉素、两性霉素B等。作为缓冲剂,可以列举:磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液等。作为增稠剂,可以列举:明胶、多糖类等。作为着色剂,可以举出酚红等。作为稳定剂,可以列举:白蛋白、葡聚糖、甲基纤维素、明胶等。作为表面活性剂,可以列举:胆固醇、烷基糖苷、烷基多糖苷、烷基单甘油酯醚、葡糖苷、麦芽糖苷、新戊二醇类、聚氧乙二醇类、硫代葡糖苷、硫代麦芽糖苷、肽、皂苷、磷脂、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇酰胺等。作为乳化剂,可以列举:甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。作为防腐剂,可以列举:氨基乙磺酸、苯甲酸、苯甲酸钠、乙醇、乙二胺四乙酸钠、琼脂、dl-樟脑、柠檬酸、柠檬酸钠、水杨酸、水杨酸钠、水杨酸苯酯、二丁基羟基甲苯、山梨酸、山梨酸钾、氮、脱氢乙酸、脱氢乙酸钠、2-萘酚、白糖、蜂蜜、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、l-薄荷醇、桉树油等。作为保藏剂,可以列举:苯甲酸、苯甲酸钠、乙醇、乙二胺四乙酸钠、干燥亚硫酸钠、柠檬酸、甘油、水杨酸、水杨酸钠、二丁基羟基甲苯、D-山梨糖醇、山梨酸、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、丙二醇、磷酸等。作为抗氧化剂,可以列举:柠檬酸、柠檬酸衍生物、维生素C及其衍生物、番茄红素、维生素A、类胡萝卜素类、维生素B及其衍生物、类黄酮类、多酚类、谷胱甘肽、硒、硫代硫酸钠、维生素E及其衍生物、α硫辛酸及其衍生物、碧萝芷、Flavangenol、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、及它们的混合物等。
多能干细胞聚集抑制剂可以含有生长因子,例如可以含有FGF2及TGF-β1中的1种以上的生长因子。
<8.细胞聚集体的制备方法、以及通过该方法制备的细胞聚集体>
本发明的另一个方式是一种细胞聚集体的制备方法,该方法例如包括:在包含以下所示的浓度的细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序,但并不限定于此。
上述培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度的下限例如可以为3ng/mL以上、5ng/mL以上、7ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上、50ng/mL以上、100ng/mL以上、200ng/mL以上、300ng/mL以上、500ng/mL以上、1μg/mL以上、5μg/mL以上、10μg/mL以上、15μg/mL以上、20μg/mL以上、50μg/mL以上、70μg/mL以上、或100μg/mL以上,并且上限例如可以为50mg/mL以下、40mg/mL以下、35mg/mL以下、30mg/mL以下、25mg/mL以下、20mg/mL以下、15mg/mL以下、或10mg/mL以下,例如可以为3ng/mL以上且30mg/mL以下的范围。或者,下限例如可以为3nM以上、5nM以上、10nM以上、15nM以上、20nM以上、25nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、80nM以上、100nM以上、300nM以上、500nM以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、30μM以上、50μM以上、60μM以上、70μM以上、80μM以上、或100μM以上,并且上限例如可以为800mM以下、600mM以下、400mM以下、200mM以下、150mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、或40mM以下,例如可以为3nM以上且300mM以下。
根据本发明的方法,可以在保持了干细胞的未分化性的状态下以高产量制备适度尺寸的细胞聚集体。具体而言,在后述的实施例的孔内的制造实验中,与不含细胞周期阻滞剂的对照培养基中的培养相比,本发明的制造方法中葡萄糖消耗量在培养第5天高至约1.3倍以上(参照图3),而且,细胞产量也增加至接种细胞数的5倍以上(参照图4)。
细胞周期阻滞剂、培养基及细胞、以及上述工序中的培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度的具体实施方式如上所述。
上述工序的具体实施方式与<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>一栏中说明的、抑制多能干细胞的聚集的方法中的“在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
本发明的另一个方式是一种细胞聚集体,其是通过上述的细胞聚集体的制备方法得到的。
本发明的该方式的细胞聚集体具有适度的尺寸,活细胞率高(参照图1A~1C及图2B~2E)。对于通过本发明的方法可制备的多能干细胞的细胞聚集体的尺寸范围而言,在用显微镜观察时,观察图像中宽度最宽的部分的尺寸的上限的范围例如为400μm以上且500μm以下、300μm以上且400μm以下、或200μm以上且300μm以下。宽度最窄的部分的下限的范围例如为50μm以上且70μm以下、70μm以上且100μm以下、100μm以上且150μm以下、或100μm以上且低于200μm。通过本发明的方法可制备的多能干细胞的细胞聚集体的优选尺寸范围例如为约100μm以上且约300μm以下。这样的尺寸范围的细胞聚集体易于向其内部的细胞供给氧、营养成分,作为细胞的增殖环境是优选的。另外,构成细胞聚集体的细胞保持了未分化性。
本发明的该方式的细胞聚集体具备在包含细胞周期阻滞剂的培养基中通过悬浮培养制备而成的特征,并且优选具备<2.细胞聚集体>一栏中记载的特征。
<9.细胞培养组合物>
本发明的一个实施方式是细胞培养组合物,其包含多能干细胞的细胞聚集体、培养基、以及细胞周期阻滞剂,所述细胞周期阻滞剂例如为以下所示的浓度,但并不限定于此。
上述培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度的下限例如可以为3ng/mL以上、5ng/mL以上、7ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上、50ng/mL以上、100ng/mL以上、200ng/mL以上、300ng/mL以上、500ng/mL以上、1μg/mL以上、5μg/mL以上、10μg/mL以上、15μg/mL以上、20μg/mL以上、50μg/mL以上、70μg/mL以上、或100μg/mL以上,并且上限例如可以为50mg/mL以下、40mg/mL以下、35mg/mL以下、30mg/mL以下、25mg/mL以下、20mg/mL以下、15mg/mL以下、或10mg/mL以下,例如可以为3ng/mL以上且30mg/mL以下的范围。或者,下限例如可以为3nM以上、5nM以上、10nM以上、15nM以上、20nM以上、25nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、80nM以上、100nM以上、300nM以上、500nM以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、30μM以上、50μM以上、60μM以上、70μM以上、80μM以上、或100μM以上,并且上限例如可以为800mM以下、600mM以下、400mM以下、200mM以下、150mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、或40mM以下,例如可以为3nM以上且300mM以下。
本发明的该方式的细胞培养组合物可以用于以高产量制备多能干细胞的细胞聚集体。另外,通过使用该细胞培养组合物,可以用于制备保持了干细胞的未分化性且具有上述的适度尺寸的细胞聚集体。
细胞周期阻滞剂、培养基及多能干细胞的具体实施方式如上所述。
由上述细胞培养组合物制备多能干细胞的细胞聚集体的工序包括:用上述细胞培养组合物中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。该工序的具体实施方式与<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>一栏中说明的、抑制细胞聚集的方法中的“在包含多能干细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
上述细胞培养组合物可以通过在将细胞周期阻滞剂添加于培养基之后添加多能干细胞来制备,也可以通过在将多能干细胞混合于培养基之后添加细胞周期阻滞剂来制备,优选通过在将细胞周期阻滞剂添加于培养基之后添加多能干细胞来制备。在将细胞周期阻滞剂添加于培养基时,也可以添加稳定剂。该稳定剂是有助于细胞周期阻滞剂在液体培养基中的稳定化、活性保持、防止对培养容器等的吸附等的物质,且只要是不妨害多能干细胞聚集抑制的物质即可,没有特别限定。另外,上述细胞培养组合物也可以通过将包含细胞周期阻滞剂的培养基(任选进一步包含上述稳定剂)冷冻保存,然后解冻,添加多能干细胞来制备。
<10.多能干细胞培养培养基>
本发明的一个方式是一种多能干细胞培养培养基,其包含培养基和细胞周期阻滞剂,所述细胞周期阻滞剂例如为以下所示的浓度,但并不限定于此。
上述培养基中的细胞周期阻滞剂的浓度的下限例如可以为3ng/mL以上、5ng/mL以上、7ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上、50ng/mL以上、100ng/mL以上、200ng/mL以上、300ng/mL以上、500ng/mL以上L、1μg/mL以上、5μg/mL以上、10μg/mL以上、15μg/mL以上、20μg/mL以上、50μg/mL以上、70μg/mL以上、或100μg/mL以上,并且上限例如可以为50mg/mL以下、40mg/mL以下、35mg/mL以下、30mg/mL以下、25mg/mL以下、20mg/mL以下、15mg/mL以下、或10mg/mL以下,例如可以为3ng/mL以上且30mg/mL以下的范围。或者,下限例如可以为3nM以上、5nM以上、10nM以上、15nM以上、20nM以上、25nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、80nM以上、100nM以上、300nM以上、500nM以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、30μM以上、50μM以上、60μM以上、70μM以上、80μM以上、或100μM以上,并且上限例如可以为800mM以下、600mM以下、400mM以下、200mM以下、150mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、或40mM以下,例如可以为3nM以上且300mM以下。
本发明的该方式的多能干细胞培养培养基可以作为用于通过悬浮培养由多能干细胞以高产量制备细胞聚集体的培养基来使用。另外,通过使用该细胞培养培养基,可以用于制备保持了干细胞的未分化性且具有上述的适度尺寸的细胞聚集体。
细胞周期阻滞剂、培养基及多能干细胞的具体实施方式如上所述。
作为由上述多能干细胞培养培养基制备多能干细胞的细胞聚集体的工序,可以举出在上述多能干细胞培养培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。该工序的具体实施方式与<6.抑制多能干细胞的聚集的方法>一栏中说明的、抑制多能干细胞聚集的方法中的“在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
在一个实施方式中,上述多能干细胞培养培养基可以冷冻保存至使用前,并在使用时解冻(融化)使用。
实施例
参照以下的实施例对本发明更详细地进行说明,但本发明的范围并不限于该实施例。
[实施例1]人iPS细胞的维持培养
人iPS细胞使用了TkDN4-M株(东京大学医科学研究所、东京、日本)。在涂布有Vitronectin(Thermo Fisher Scientific公司)的细胞培养用培养皿上接种人iPS细胞,培养基使用Essential 8TM(Thermo Fisher Scientific公司)进行了维持培养。作为传代时的细胞剥离剂,使用了AccutaseTM(Thermo Fisher Scientific公司)。另外,仅在细胞接种时在培养基中添加了Y-27632(和光纯药工业株式会社、日本),使其为10μM的浓度。每天进行培养基更换。实验中使用了传代数至50次为止的人iPS细胞。
[实施例2]通过细胞聚集试验确认聚集抑制效果
对于细胞周期阻滞剂添加带来的细胞聚集抑制效果进行了研究。
<方法>
将按照实施例1的步骤培养的人iPS细胞用AccutaseTM处理3~5分钟,进行剥离,分散至单细胞。将该细胞悬浮于包含最终浓度5mg/mL的BSA(和光纯药工业株式会社)的Essential 8TM培养基,对其一部分进行台盼蓝染色,调查了细胞数。制备为每1mL包含2×105个细胞。在该细胞悬浮液中添加Y27632(和光纯药工业株式会社),使其最终浓度为10μM,或者添加最终浓度10μM的Y27632。另行调整细胞聚集抑制剂的浓度,使得秋水仙碱(和光纯药工业株式会社、039-03851)的最终浓度为10mg/mL(25mM)、或使得脱羰秋水仙碱(和光纯药工业株式会社、049-16961)的最终浓度为10mg/mL(26.9mM)、或使得细胞松弛素D(和光纯药工业株式会社、037-17561)的最终浓度为0.51mg/mL(1mM)、或使得细胞松弛素B(和光纯药工业株式会社、030-17551)的最终浓度为2.40mg/mL(5mM)、或使得长春碱(和光纯药工业株式会社、037-17561)的最终浓度为4.55mg/mL(5mM)、或使得灰黄霉素(和光纯药工业株式会社、037-17561)的最终浓度为17.6mg/mL(50mM)、或使得DMSO(和光纯药工业株式会社、041-29351)为原液的浓度、或Latrunculin A(和光纯药工业株式会社、125-04363)的最终浓度为0.42mg/mL(1mM)、或使得鬼臼毒素(和光纯药工业株式会社、161-20901)的最终浓度为20.7mg/mL(50mM)、或使得长春瑞滨(和光纯药工业株式会社、222-01641)的最终浓度为5.4mg/mL(5mM)、或使得诺考达唑(和光纯药工业株式会社、140-08531)的最终浓度为5mg/mL(16.7mM)、或使得伽斯利德(Cayman、11705)的最终浓度为0.14mg/mL(0.2mM)、或使得多西他赛(和光纯药工业株式会社、047-31281)的最终浓度为4.04mg/mL(5mM),将上述调整后的细胞聚集抑制剂添加于上述细胞悬浮液,使得秋水仙碱的最终浓度为10ng/mL、或使得脱羰秋水仙碱的最终浓度为10ng/mL、或使得细胞松弛素D的最终浓度为20nM、或使得细胞松弛素B的最终浓度为1μM、或使得长春碱的最终浓度为2μM、或使得灰黄霉素的最终浓度为50μM、或使得DMSO的最终浓度为0.3%(v/v)、或使得Latrunculin A的最终浓度为80nM、或使得鬼臼毒素的最终浓度为80nM、或使得长春瑞滨的最终浓度为80nM、或使得诺考达唑的最终浓度为40ng/mL、或使得伽斯利德的最终浓度为16nM、或使得多西他赛的最终浓度为80nM,然后,以1.3ml/孔的比例接种于悬浮培养用12孔板(Sumitomo Bakelite公司)。以接种了细胞的板在旋转振荡器(OPTIMA公司)上以90rpm的速度沿水平面画出回转宽度(直径)为25mm的圆的方式进行回转培养,在5%CO2、37℃的环境中进行了悬浮培养。开始培养起第二天(培养第1天)用相差显微镜获得了图像。
<结果>
将上述悬浮培养后(培养第1天)的显微镜观察图像示于图1A、图1B及图1C。观察的结果是,在仅添加了Y27632的条件(对照)下,形成了1mm以上的大的细胞聚集体,与此相对,在添加了细胞周期阻滞剂的条件下,形成了直径500μm以下的细胞聚集体。
[实施例3]细胞周期阻滞剂存在条件对聚集体形成后的细胞增殖能力、以及未分化能力的影响
进行人iPS细胞的悬浮培养,测定葡萄糖消耗量、细胞产量及未分化标志物的阳性率,分析了细胞周期阻滞剂对细胞的影响。
<方法>
与实施例2同样地制备细胞悬浮液,另行调整细胞聚集抑制剂的浓度,使得脱羰秋水仙碱(同上)的最终浓度为10mg/mL(26.9mM)、或使得细胞松弛素D(同上)的最终浓度为0.51mg/mL(1mM)、或使得DMSO(同上)为原液的浓度、或使得伽斯利德(Cayman、11705)的最终浓度为0.14mg/mL(0.2mM),将上述调整后的细胞聚集抑制剂添加于上述细胞悬浮液,使得脱羰秋水仙碱的最终浓度为10ng/mL、或使得细胞松弛素D的最终浓度为20nM、或使得DMSO的最终浓度为1%(v/v)、或使得伽斯利德的最终浓度为20nM,然后,以4ml/孔的比例接种于悬浮培养用6孔板(Sumitomo Bakelite公司、日本)。以接种了细胞的板在旋转振荡器(OPTIMA公司、日本)上以90rpm的速度沿水平面画出回转宽度(直径)为25mm的圆的方式进行回转培养,在5%CO2、37℃的环境中进行了悬浮培养。培养第二天(培养第1天)以后,每天更换为新鲜的培养基(包含最终浓度5mg/mL的BSA(和光纯药工业株式会社)的Essential8TM培养基),持续培养至培养第5天。在培养中,每天利用相差显微镜获得图像。对培养第1天获得的图像中的182~252个细胞聚集体进行观察,与显微镜照片的比例尺进行比较,求出各细胞聚集体的最宽部分的宽度(表示为),调查其分布,计算出平均值±标准偏差。用生物传感器BF-5iD(王子计测机器株式会社)测定培养基更换时回收的培养上清中包含的葡萄糖的浓度,计算出葡萄糖消耗量。
另外,在培养第5天回收细胞聚集体,利用AccutaseTM分散后,悬浮于包含5mg/mL的BSA的Essential 8TM培养基。对该细胞悬浮液的一部分进行台盼蓝染色,调查了细胞数。以300g对上述细胞悬浮液进行3分钟离心分离后,去除上清,用PBS(磷酸缓冲生理盐水)清洗细胞。然后,利用4%多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在室温下固定20分钟后,用PBS清洗3次,用300μL的PBS将细胞再悬浮后,一边用旋涡混匀器搅拌,一边添加冷甲醇3mL,在-20℃下进行了一夜以上的透性化处理。在用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后,利用3%FBS(胎牛血清)/PBS将细胞再悬浮,在室温下进行30分钟~1小时的封闭。然后,利用荧光标记的抗SOX2抗体(Cat.No.656110、Biolegend公司)及荧光标记抗OCT4抗体(Cat.No.653703、Biolegend公司)及荧光标记抗Nanog抗体(Cat.No.674010、Biolegend公司)在4℃下进行30分钟~1小时的染色。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后,利用FACSVerseTM流式细胞仪(BDBiosciences)对通过细胞过滤器的细胞进行了分析。
另外,在培养第5天测定了细胞产量。细胞产量的测定按照以下步骤进行。即,用AccutaseTM对形成的细胞聚集体处理5分钟~10分钟,通过用吸管尖进行吸移,使细胞单独分散,进行了台盼蓝染色后,使用血球计数板对细胞数进行计数,测定了细胞产量。
<结果>
图2A~2E是培养第1天~第5天观察到的显微镜照片。与图2A(对照)相比,在图2B~2E中,从接种后至培养第1天形成了细胞聚集体,通过继续进行培养,细胞逐渐增殖,细胞聚集体增大,成为基本均匀且适度的尺寸。
图6A~D是培养第1天的细胞聚集体尺寸(细胞聚集体的直径、或细胞聚集体的宽度最宽部分的尺寸)的分布图。另外,表1~表4示出了培养第1天的按一定尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例。计算出各培养条件下培养第1天的聚集体尺寸的平均值±标准偏差,结果是在添加细胞松弛素D时为132.5±34.8μm,在添加伽斯利德时为162.7±37.2μm,在添加脱羰秋水仙碱时为184.9±44.9μm,在添加DMSO时为164.8±31.8μm。
[表1]
按尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例(添加细胞松弛素D)
在添加细胞松弛素D时,相对于细胞聚集体总个数,细胞聚集体尺寸(直径)为40μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为60μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为96%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为80μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为88.1%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为100μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为80.6%。
[表2]
按尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例(添加伽斯利德)
在添加伽斯利德时,相对于细胞聚集体总个数,细胞聚集体尺寸(直径)为40μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为60μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为98.1%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为80μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为96.2%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为100μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为95.7%。
[表3]
按尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例(添加脱羰秋水仙碱)
在添加脱羰秋水仙碱时,相对于细胞聚集体总个数,细胞聚集体尺寸(直径)为40μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为60μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为97.3%。另外,上述细胞聚集体的尺寸(直径)为80μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为93.5%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为100μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为92.4%。
[表4]
按尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例(添加DMSO)
在添加DMSO时,相对于细胞聚集体总个数,细胞聚集体的尺寸(直径)为40μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100%。另外,上述细胞聚集体的尺寸(直径)为60μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100%。另外,上述细胞聚集体的尺寸(直径)为80μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为98.5%。另外,上述细胞聚集体尺寸(直径)为100μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为96.0%。
将葡萄糖消耗量示于图3,将培养第5天的细胞产量示于图4。对于而言,与未添加细胞周期阻滞剂的条件相比,添加了细胞周期阻滞剂的条件下,消耗量更多,表明细胞发生了增殖。实际上表明,在培养第5天增殖至接种细胞数的5倍以上。
将未分化标志物的阳性率的测定结果示于图5A~5D。在各条件下制备细胞聚集体,然后,在通过悬浮培养增殖后的细胞中,作为标志物的SOX2阳性细胞为99%以上,OCT4阳性细胞为97%以上,Nanog阳性细胞为99%以上,确认了通过添加细胞周期阻滞剂而形成的人iPS细胞的聚集体保持了未分化性。
工业实用性
根据本发明,可以以良好的收率制备在多能干细胞的悬浮培养中保持未分化性、抑制超过1000μm(1mm)尺寸的细胞聚集体的形成、细胞生存率高、且尺寸适度(500μm以下)的细胞聚集体。对于ES细胞、iPS细胞等多能干细胞而言,由于能够将这些细胞分化诱导为各种生物体细胞,因此可以提供用于再生医学。
序列表自由文本
序列号1:合成肽
序列号2:合成肽
序列号3:合成肽
序列号4:合成肽
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过整体引用而引入本说明书。
序列表
<110> 株式会社钟化(KANEKA CORPORATION)
<120> 多能干细胞聚集抑制剂
<130> B170690WO01
<150> JP 2017-254829
<151> 2017-12-28
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Pro Val Ile Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Glu His Thr Lys Ser Val Tyr Thr Arg Ser
20 25
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<400> 2
Pro Tyr Leu Lys Thr Lys
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<400> 3
Pro Tyr Leu Lys Thr Lys
1 5
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (12)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (18)..(18)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 磷酸化
<400> 4
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Gly Phe Cys Asp Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Ala Cys Tyr Lys Asp Val Pro Tyr Leu
20 25
Claims (23)
1.一种多能干细胞聚集抑制剂,其包含细胞周期阻滞剂,所述多能干细胞聚集抑制剂用于多能干细胞的悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂的浓度为55.0mg/mL以上且1.1g/mL以下。
3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、及M期阻滞剂中的至少1种物质。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、以及它们的盐中的至少1种物质。
5.根据权利要求3所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
6.根据权利要求3所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
7.根据权利要求3所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
8.根据权利要求3所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
9.根据权利要求3所述的多能干细胞聚集抑制剂,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
10.一种多能干细胞聚集体的制备方法,该方法包括:在包含细胞周期阻滞剂的培养基中对多能干细胞进行悬浮培养的工序。
11.根据权利要求10所述的制造方法,其中,所述培养基中的所述细胞周期阻滞剂的浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下。
12.根据权利要求10或11所述的制造方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
13.根据权利要求10~12中任一项所述的制造方法,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、以及它们的盐中的至少1种物质。
14.根据权利要求12所述的制造方法,其中,所述G1期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)及二甲基亚砜(DMSO)中的至少1种物质。
15.根据权利要求12所述的制造方法,其中,所述G1/S期阻滞剂为细胞松弛素D(Cytochalasin D)。
16.根据权利要求12所述的制造方法,其中,所述G2期阻滞剂为选自细胞松弛素D(Cytochalasin D)、秋水仙碱(Colchicine)、以及多西他赛(Docetaxel)中的至少1种物质。
17.根据权利要求12所述的制造方法,其中,所述G2/M期阻滞剂为选自鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、Latorunculin A、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、以及诺考达唑(Nocodazole)中的至少1种物质。
18.根据权利要求12所述的制造方法,其中,所述M期阻滞剂为伽斯利德(Jasplakinolide)。
19.一种多能干细胞聚集体,其是通过权利要求10~18中任一项所述的制造方法得到的。
20.一种多能干细胞培养组合物,其包含:多能干细胞的细胞聚集体、培养基、以及浓度为3ng/mL以上且30mg/mL以下的细胞周期阻滞剂。
21.根据权利要求20所述的多能干细胞培养组合物,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自G1期阻滞剂、G1/S期阻滞剂、G2期阻滞剂、G2/M期阻滞剂、以及M期阻滞剂中的至少1种物质。
22.根据权利要求20或21所述的多能干细胞培养组合物,其中,所述细胞周期阻滞剂为选自秋水仙碱(Colchicine)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞松弛素D(Cytochalasin D)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西他赛(Docetaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、诺考达唑(Nocodazole)、伽斯利德(Jasplakinolide)、长春碱(Vinblastine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、长春瑞滨(Vinorelbine)、Latorunculin A、以及它们的盐中的至少1种物质。
23.根据20~22中任一项所述的多能干细胞培养组合物,其还包含生长因子。
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