WO2022124298A1

WO2022124298A1 - 多能性幹細胞集団を製造する製造方法

Info

Publication number: WO2022124298A1
Application number: PCT/JP2021/044881
Authority: WO
Inventors: 昌神林; 洋平林; 真美 ▲高▼▲崎▼
Original assignee: 株式会社カネカ; 国立研究開発法人理化学研究所
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-06-16
Also published as: US20240035000A1; JPWO2022124298A1; EP4257678A1

Abstract

多能性幹細胞を接着培養から浮遊培養へと移行した場合における細胞の死滅を抑える。ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を接着培養し、その後、多能性幹細胞を浮遊培養する。

Description

多能性幹細胞集団を製造する製造方法

　本発明は、多能性幹細胞を培養対象とし接着培養から浮遊培養を経る多能性幹細胞集団の製造方法に関する。

　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化は、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性がある。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管レベルで分化誘導する技術が既に開発されている。

　一方で、多能性幹細胞を用いた再生医療は、実用化に向けて課題が残されており、その課題の一つは、多能性幹細胞そのものの生産性である。例えば、肝臓の再生には約２×１０^１１個の細胞が必要と言われている。多能性幹細胞の培養方法は、平坦な培養基板（プレート）に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０^６ｃｍ^２以上の培養基板（プレート）が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。このように、培養基板（プレート）表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するため、スケールアップに膨大な面積が必要となり、再生医療に必要な量の細胞を供給することは困難である。一方、浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養することから、得られる細胞数は培地体積に依存するため、浮遊培養はスケールアップが比較的現実的であり、細胞の大量生産に適していると考えられている。例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。特許文献１には単細胞に分散した多能性幹細胞をウェル底部の中心部が凹曲面である容器に分注することで、効率的に浮遊培養のための細胞凝集塊を形成させる方法が開示されている。

　ところで、増殖効率の向上や未分化状態の維持など所望の効果を期待して、多能性幹細胞の浮遊培養や接着培養において種々の物質を培地に添加することが知られている。特許文献２には、多能性幹細胞をＷｎｔシグナル阻害物質の存在下で浮遊培養することが開示されている。また、特許文献３には、ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）阻害剤等を含有し、且つ、かつ増殖因子を含まないか低濃度である幹細胞培養用培地が開示されている。特許文献４には、ヒト多能性幹細胞を培養する方法で、ＰＫＣ阻害剤を培地に添加して培養することで細胞の未分化をより高い確率で維持する方法が開示されている。特許文献５には、プライム型多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら培養する方法で、多能性幹細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤等を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤及び白血病阻止因子を含む培地で培養する方法が開示されている。

Ｏｌｍｅｒ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ　Ｃ，Ｖｏｌｕｍｅ　１８（１０）：７７２－７８４（２０１２）

ＷＯ２０１３／１８３７７７　Ａ１ＷＯ２０２０／０３９７３２　Ａ１ＷＯ２０１８／０４７９４１　Ａ１特開２０１２－１７５９６２号公報ＷＯ２０１９／１５１３８６　Ａ１

　ところで、多能性幹細胞の培養の多くは接着培養法で行われており、浮遊培養法に関する知見は少ない。そのため、接着培養法から浮遊培養法への移行時の効率などの検討は不十分であり、その効率は低いままといった問題があった。すなわち、多能性幹細胞を浮遊培養するためには、接着培養から移行する必要があるが、移行時に多くの細胞が死滅してしまうといった問題があった。接着培養から浮遊培養への移行において、多能性幹細胞の死滅の程度が大きいほど、もとの細胞数まで回復させ、拡大培養を行うために長い時間を要するといった問題に繋がることになる。

　そこで、本発明は、多能性幹細胞を接着培養から浮遊培養へと移行した場合における細胞の死滅を抑え、効率よく培養することができる多能性幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞を接着培養から浮遊培養へと移行して多能性幹細胞集団を製造する方法において、上記接着培養をＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤との存在下で行うことで、浮遊培養へ移行した後の多能性幹細胞の死滅を防止できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

　本発明は以下を包含する。

　（１）ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を接着培養する工程と、接着培養後の多能性幹細胞を浮遊培養する工程とを含む、多能性幹細胞集団の製造方法。

　（２）前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、２５ｎＭ以上１５μＭ以下である（１）記載の方法。

　（３）前記液体培地中のＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、９０ｎＭ以上４０μＭ以下である（１）記載の方法。

　（４）前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率が１６７：１以上１：１６００以下の範囲である（１）記載の方法。

　（５）前記液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する（１）記載の方法。

　（６）前記液体培地が、ＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１を含む（１）記載の方法。

　（７）前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する（１）記載の方法。

　（８）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である（７）記載の方法。

　（９）前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む（１）記載の方法。

　（１０）前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む（１）記載の方法。

　（１１）前記多能性幹細胞集団は、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である（１）記載の方法。

　（１２）前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び/又は人工多能性幹細胞である（１）記載の方法。

　（１３）前記（１）～（１２）の何れかに記載の方法により製造される多能性幹細胞集団。

　（１４）ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（１５）前記ＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、５０ｎＭ以上２００ｍＭ以下である（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（１６）前記ＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、１８０ｎＭ以上１１３ｍＭ以下である（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（１７）前記死滅抑制剤中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率が、１６７：１以上１：１６００以下の範囲である（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（１８）前記（１４）～（１７）の何れかに記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤を含む多能性幹細接着培養用組成物キット。

　（１９）前記ＰＫＣβ阻害剤は、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ　Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ　Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）記載の方法及び（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（２０）前記ＴＮＫＳ阻害剤は、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）記載の方法及び（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（２１）前記多能性幹細胞がプライム型多能性幹細胞である（１）記載の方法及び（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

　（２２）前記液体培地がＬＩＦを含まない（１）記載の方法。

　（２３）ＬＩＦを含まない液体培地組成物を含む（１８）記載の多能性幹細接着培養用組成物キット。

　（２４）前記液体培地がＧＳＫ３阻害剤を含まない（１）記載の方法。

　（２５）ＧＳＫ３阻害剤を含まない液体培地組成物を含む（１８）記載の多能性幹細接着培養用組成物キット。

　（２６）前記液体培地がＧＳＫ３阻害剤とＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない（１）記載の方法。

　（２７）ＧＳＫ３阻害剤とＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない液体培地組成物を含む（１８）記載の多能性幹細接着培養用組成物キット。

　（２８）ＰＫＣβ阻害剤は下記構造式[式Ｉ]を有する化合物である（１）記載の方法及び（１４）記載の接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤。

で表される化合物又はその塩。
　式Ｉにおいて、
　Ｒ_１は水素原子または炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、　Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Ａは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
　Ｒ_３は、

、

、
又は

で表される基であり、
　Ｒ_Ｂは、水素原子、－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２）により置換された炭素数２～４のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２））、又は

で表される基であり、
　或いは、Ｒ_２とＲ_Ｂとが一体となって下記の二価基

を形成していてもよく、ここで、＃はＲ_２の結合位置への結合を指し、＃＃はＲ_Ｂの結合位置への結合を指し、
　前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、

であり、
　Ｒ_Ｃは、－Ｎ（Ｒ_Ｄ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Ｄは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。
　式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。

（２９）前記多能性幹細胞を浮遊培養する工程では、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＴＮＫＳ阻害剤を含まない液体培地に、接着培養後の多能性幹細胞を接種することを特徴とする（１）に記載の方法。

　本発明によれば、多能性幹細胞を接着培養から浮遊培養に移行したとき多能性幹細胞の死滅を防止し、効率よく多能性幹細胞集団を製造することができる。

実施例１及び比較例１に示す方法で多能性幹細胞を接着培養したときのＯＣＴ４遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子の発現量を示す特性図である。実施例１及び/又は比較例１に示す方法で多能性幹細胞を接着培養したときの抗ＯＣＴ４、抗ＳＯＸ２、及び抗ＮＡＮＯＧ抗体で処理したサンプルについて、フローサイトメトリー解析した結果を示す特性図である。

１．多能性幹細胞集団の製造方法
１－１．概要
　本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法では、先ず、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤を含有する液体培地にて多能性幹細胞を接着培養し、その後、浮遊培養へと移行して多能性幹細胞集団を製造する。本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法により、接着培養から浮遊培養に移行する際に生じる多能性幹細胞の死滅が防止され、効率的に多能性幹細胞集団を製造することができる。

１－２．用語の定義
　本明細書で使用する以下の用語について定義する。
≪細胞≫
　本明細書において発明の対象となる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的に、多能性とは、個体を構成する胚葉（脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉）に分化できる能力を意味する。このような細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ）、生殖系幹細胞（ＧＳ細胞：ｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍｃｅｌｌ)、そして人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）等が挙げられる。「ＥＳ細胞」とは、初期胚より調製された多能性幹細胞である。「ＥＧ細胞」とは、胎児の始原生殖細胞より調製された多能性幹細胞である（ＳｈａｍｂｌｏｔｔＭ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：１３７２６－１３７３１）。「ＧＳ細胞」とは、細胞精巣より調製された多能性幹細胞である（ＣｏｎｒａｄＳ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ,４５６：３４４－３４９）。また、「ｉＰＳ細胞」とは、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって体細胞を未分化状態にするリプログラミングされた多能性幹細胞をいう。

　本明細書における多能性幹細胞は、多細胞生物に由来する細胞であればよい。好ましくは動物由来細胞、より好ましくは哺乳動物由来細胞である。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物、そしてヒト、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。特に好ましくは、ヒト由来細胞である。

　本明細書で使用する多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞及びプライム型多能性幹細胞を含む。ナイーブ型多能性幹細胞は着床前の内部細胞塊でみられる多能性に近い状態であり、プライム型多能性幹細胞は着床後のエピブラスト内でみられる多能性に近い状態と定義される。プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞と比較して、個体発生への寄与が低頻度であり、Ｘ染色体の転写活性が一本のみであり、転写抑制ヒストン修飾が高レベルであるといった特徴がある。また、プライム型多能性幹細胞におけるマーカー遺伝子はＯＴＸ２であり、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカー遺伝子はＲＥＸ１、ＫＬＦファミリーである。さらに、プライム型多能性幹細胞のコロニー形成は扁平であり、ナイーブ型多能性幹細胞のコロニー形成はドーム状である。本明細書で使用する多能性幹細胞は、特にプライム型多能性幹細胞を用いることが好ましい。

　本明細書で使用する多能性幹細胞は、市販の細胞又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製した細胞を用いてもよい。なお、限定はしないが、本明細書の各発明に用いる場合、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞が好ましい。

　本明細書で使用するｉＰＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ　３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２、ＷＴＣ－１１株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、１２１０Ｂ２株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｂ２株等を使用することができる。

　また、本明細書で使用するｉＰＳ細胞が臨床用株の場合、限定はしないが、例えばＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、Ｆｆ－ｌ１４ｓ０３株、Ｆｆ－ｌ１４ｓ０４株、ＹＺＷＩ株等を使用することができる。

　また、本明細書で使用するｉＰＳ細胞が新たに作製された細胞の場合、導入される初期化因子の遺伝子の組み合わせは、限定はしないが、例えばＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせ（ＹｕＪ，ｅｔａｌ．２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ,３１８：１９１７－２０．）、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子及びＮＡＮＯＧ遺伝子の組み合わせ（ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ｅｔａｌ.２００７，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１‐７２．）を使用することができる。これらの遺伝子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入であってもよいしタンパク質として導入してもよい。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。言うまでもなく、新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞を用いてもよい。

　本明細書で使用するＥＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＳＥＥＳ－４株、ＳＥＥＳ－５株、ＳＥＥＳ－６株、ＳＥＥＳ－７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。

≪細胞凝集塊≫
　本明細書において「細胞凝集塊」とは、浮遊培養において細胞凝集によって形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、通常、略球状を呈する。細胞凝集塊を構成する細胞は、１種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している、及び／又は、多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。また、細胞塊はマイクロキャリアを介して形成されたものでもよい。

　多能性幹細胞マーカーは、多能性幹細胞で特異的に又は過剰に発現している遺伝子マーカーで、例えば、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。

　多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール、又はＦＭＯコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

　細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞である場合、多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下である。多能性幹細胞マーカーを発現する、及び／又は、多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。

≪接着培養及び培地≫
　「接着培養」とは、細胞培養方法の一つで、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、典型的には単層で増殖させることをいう。外部マトリクスとは、特に限定されないが、例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｇｅｌａｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎキメラ抗体等を使用することができる。なお、細胞培養法には、接着培養とは異なる他の培養方法として、浮遊培養法がある。「浮遊培養」とは、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養液中で細胞が培養容器等に対して固定されていない、非接着の状態をいう。また、例えば、マイクロキャリアに細胞を付着させ培養液中で浮遊させた状態で培養する培養法は、細胞がマイクロキャリアに接着してはいるが、マイクロキャリアを含む細胞塊としては培養容器に接着することなく浮遊しており、浮遊培養と見なすことができる。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、一般的に、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。なお、前述の細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。

　本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び／又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上含有する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。

　本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ＳＭｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’Ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ＳＭｅｄｉｕｍ／ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒe F－１２Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては、特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地の重量比を好ましくは６０／４０以上４０／６０以下の範囲、例えば５８／４２、５５／４５、５２／４８、５０／５０、４８／５２、４５／５５、又は４２／５８等で混合した培地を用いる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。

　本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。

　本明細書において「培養添加物」とは、培養目的で培地に添加される血清以外の物質である。培養添加物の具体例として、限定はしないが、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及びサイトカインは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。また、増殖因子は、限定するものではないが、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１）、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ、及びＩＧＦＢＰ－７を使用することができる。抗生剤は、限定するものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。本発明で用いる培地の培養添加物として、特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１である。

　また、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤を培地に含有することで、多能性幹細胞の接着培養における細胞死を大幅に抑制することができ、また、細胞塊の強度を増大させ、物理的ダメージへの耐性を向上させることができる。例えば、培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、下限を１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、７μＭ、又は１０μＭとすることができ、上限を５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、又は１０μＭとすることができる。

　さらに、培地は、特に、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＬＩＦを含まない組成とすることが好ましい。さらに、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のいずれか一方、好ましくは両方を含まない培地組成とすることが好ましい。これらＬＩＦ、ＧＳＫ３阻害剤、及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない培地であれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ化することなく、且つ未分化状態を維持して培養することができる。

　本発明で用いる培地は、前記培養添加物を１種以上含むことができる。前記培養添加物を添加する培地としては、限定はしないが、前記基礎培地が一般的である。

　培養添加物は、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸は、２－リン酸アスコルビン酸マグネシウム等の誘導体の形態で培地に添加してもよく、セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウム等）の形態で培地に添加してもよい。また、インスリン、トランスフェリン、及びセレンに関しては、ＩＴＳ試薬（インスリン-トランスフェリン-セレン）の形態で培地に添加することもできる。また、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つが添加された市販の培地を使用することもできる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ II（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦＤｒｙＰｏｗｄｅｒｅｄＭｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８^ＴＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＲｅｐｒｏＭｅｄ（リプロセル社）、及びＳｔｅｍＳｃａｌｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。

　なお、本発明で用いる培地として最も好ましいものは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地である。特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

≪ＰＫＣβ阻害剤≫
　本明細書において「プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤」とは、ＰＫＣβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、Ｃ末端側の触媒領域及びＮ末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ＡＴＰ／Ｍｇ^２＋結合する配列とから構成される。調節領域はＣ１ドメインとＣ２ドメインから構成される。

　ＰＫＣには、在来型（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ及びＰＫＣγがある。また、ＰＫＣには、新型（Ｎｏｖｅｌ）アイソザイムとしてＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηがあり、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣζ、ＰＫＣλ及びＰＫＣμがある。

　本明細書において、ＰＫＣβという場合、これらＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの両者を含む場合、若しくはＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩのうち一方を含む場合を意味する。また、本明細書においてＰＫＣβ阻害剤という場合、これら従来型、新型及び非典型アイソザイムのうち、少なくともＰＫＣβＩ及び/又はＰＫＣβＩＩを阻害する物質を意味する。すなわち、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、ＰＫＣβＩＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、及びＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

　なお、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβの活性のみを特異的に阻害又は抑制する物質でもよいが、ＰＫＣβＩ又はＰＫＣβＩＩ以外に他のアイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質であってもよい。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩを含む、前述した全ての従来型、新型及び非典型アイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質でもよい。また、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に従来型アイソザイムであるＰＫＣα及びＰＫＣγの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。さらに、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に新型アイソザイムであるＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。

　上記のＰＫＣβ阻害剤としては、ＰＫＣβに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＰＫＣβをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

　一例として、ＰＫＣβ阻害剤は、下記構造式［式Ｉ］を有する化合物を挙げることができる。

で表される化合物又はその塩。

　式Ｉにおいて、
　Ｒ_１は水素原子または炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、
　Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Aは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
　Ｒ_３は、

、

、
又は

であり、
　Ｒ_Ｃは、－Ｎ（Ｒ_Ｄ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
　Ｒ_Ｄは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。

　式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。

　上記構造式［式Ｉ］を有するＰＫＣβ阻害剤としては、具体的に、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ　Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ　Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するＰＫＣβ阻害剤の中でも、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＬＹ－３３３５３１からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。

　Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　ＧＦ１０９２０３Ｘ（２－［１－（３－ジメチルアミノプロピル）インドール－３－イル］－３－（インドール－３－イル）マレイミド）の構造式を下記に示す。

　ＬＹ－３３３５３１（（９Ｓ）－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，１０，１１－テトラヒドロ－９Ｈ，１８Ｈ－５，２１：１２，１７－ジメテノジベンゾ　［ｅ，ｋ］ピロロ［３，４－ｈ］［１，４，１３］オキサジアザシクロヘキサデシン－１８，２０（１９Ｈ）－ジオン、モノヒドロキシクロライド）の構造式を下記に示す。

　Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１－メチルインドール－３－イル）－４－［１－［１－（ピリジン－２－イルメチル）ピペリジン－４－イル］インドール－３－イル］ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）キナゾリン－４－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

　Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ（３－［３－［２，５－ジヒドロ－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－３－ｙｌ］－１Ｈ－インドール－１－イル］プロピルカルバムイミドチオ酸エステルメシラート）の構造式を下記に示す。

　Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（３－［（８Ｓ）－８－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，８，９－テトラヒドロピリド［１，２－ａ］インドール－１０－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン塩酸塩）の構造式を下記に示す。

≪ＴＮＫＳ阻害剤≫
　本明細書において「タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース（タンキラーゼと称する場合もある）は、標的タンパク質をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化するポリ（ＡＤＰ－リボシル）化酵素（ＰＡＲＰ）ファミリーに属し、タンキレース１（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－１／ＰＡＲＰ－５ａ）及びタンキレース２（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－２／ＰＡＲＰ－５ｂ）が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質ＴＲＦ１をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。

　本明細書において、ＴＮＫＳという場合、これらタンキレース１及びタンキレース２の両者を含む場合、若しくはタンキレース１及びタンキレース２のうち一方を含む場合を意味する。また、本明細書においてＴＮＫＳ阻害剤という場合、タンキレース１及び/又はタンキレース２を阻害する物質を意味する。すなわち、ＴＮＫＳ阻害剤は、タンキレース１の活性のみを阻害又は抑制する物質、タンキレース２の活性のみを阻害又は抑制する物質及びタンキレース１並びにタンキレース２の活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

　ＴＮＫＳ阻害剤は、ＴＮＫＳに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＴＮＫＳをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

　一例として、ＴＮＫＳ阻害剤としては、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＭＳＣ２５０４８７７及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、ＴＮＫＳ阻害剤の中でも、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及び/又はＸＡＶ９３９を使用することが好ましい。

　ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）の構造式を下記に示す。

　ＸＡＶ９３９（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

　Ｇ００７－ＬＫ（４－［５－［（１Ｅ）－２－［４－（２－クロロフェニル）－５－［５－（メチルスルフォニル）－２－ピリジニル］－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］エテニル］－１，３，４－オキサジアゾ－ル－２－イル］－ベンゾニトリル）の構造式を下記に示す。

　Ｇ２４４－ＬＭ（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－［２－（メチルスルフォニル）フェニル］－１－ピペラジニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

　ＷＩＫＩ４（２－［３－［［４－（４－メトキシフェニル）－５－（４－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］チオ］プロピル］－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）の構造式を下記に示す。

１－３．接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤
　本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法は、先ず、多能性幹細胞集団を接着培養し、その後、浮遊培養に移行する。特に、接着培養に使用する液体培地が上記１－２．で定義したＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を有効成分として含有する。よって、本発明の一態様としては、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を有効成分として含有する、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤となる。

　ここで、当該死滅抑制剤においてＰＫＣβ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。なお、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに所望の範囲（後述）となるように決めることができる。

　一方、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤においてＴＮＫＳ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。なお、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに所望の範囲（後述）となるように決めることができる。

　また、有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤は、担体と組み合わせて培地に添加することもできる。担体には、溶媒及び／又は賦形剤が含まれる。

　溶媒としては、例えば、水、バッファ（ＰＢＳを含む）、生理食塩水、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、キシレン、低級アルコール）等が挙げられる。

　賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等を挙げることができる。抗生剤は、特に限定されないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、例えば、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、ｄｌ－カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、２－ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、ｌ－メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ－ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ及びその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ及びその誘導体、αリポ酸及びその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、及びこれらの混合物などが挙げられる。

　また、接着培養用多能性幹細胞死滅抑制剤は、１種以上の増殖因子を含有してもよい。増殖因子には、例えば、ＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１が挙げられる。

１－４．効果
　本発明の多能性幹細胞集団の製造方法によれば、接着培養によって多能性幹細胞を培養し、その後、多能性幹細胞を浮遊培養したときに多能性幹細胞の死滅を抑制することができる。多能性幹細胞の死滅を抑制するとは、接着培養後の多能性幹細胞を浮遊培養したときの細胞数を高く維持できることと同義である。すなわち、ＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の存在下で接着培養し、その後、浮遊培養したときの細胞数と、ＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤のいずれか一方又は両方の非存在下で接着培養し、その後、同条件で浮遊培養したときの細胞数を比べると、ＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の存在下で接着培養したときの方が高いこととなる。

　本発明の多能性幹細胞集団の製造方法を適用することによって、浮遊培養における細胞の死滅を抑制できることから、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を効率よく製造することができる。すなわち、所望の細胞数からなる多能性幹細胞集団を比較的短期間で製造することができる。これにより、多能性幹細胞集団の製造に係るコストを大幅に抑制することができる。

１－５．培養工程
　本態様の方法は、接着培養工程と、その後の浮遊培養工程を含んでいる。また、本態様の方法は回収工程を含むものでもよい。以下、それぞれの工程について、説明をする。

１－５－１．接着培養工程
　「接着培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団を、未分化状態を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。接着培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってよい。
（細胞）
　本工程で使用する細胞は、接着培養が可能で、かつ後述の浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「１－２．用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、多能性幹細胞であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。本工程で使用する多能性幹細胞は、一つの細胞でも良いし、複数細胞からなる細胞集団（多能性幹細胞集団）でもよい。前記多能性幹細胞が多能性幹細胞集団の場合、前記集団において多能性幹細胞マーカー(例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ)を発現する、及び／または、多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）は、例えば９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。

（培養容器）
　接着培養に用いる培養容器は、特に限定されないが、容器内面にタンパク質の吸着を抑える処理をしていない容器が好ましく、外部マトリクスをコーティングできるものが好ましい。培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。例えば、細胞培養用シャーレ（住友ベークライト株式会社）を培養容器として使用できる。

　使用する培養容器の容量は、適宜選択することができ特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、０．３２ｃｍ^２以上、０．６５ｃｍ^２以上、１．９ｃｍ^２以上、３．０ｃｍ^２以上、３．５ｃｍ^２以上、９．０ｃｍ^２以上、又は９．６ｃｍ^２以上で、上限が、１０００ｃｍ^２以下、５００ｃｍ^２以下、３００ｃｍ^２以下、１５０ｃｍ^２以下、７５ｃｍ^２以下、５５ｃｍ^２以下、２５ｃｍ^２以下、２１ｃｍ^２以下、１０ｃｍ^２以下、又は３．５ｃｍ^２以下であることが好ましい。

　また使用する培養容器の容量は、適宜選択することができ、特に限定されないが、培地を収容し培養可能な体積の下限が、１ｍＬ、２ｍＬ、４ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、３Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、又は２０Ｌで、上限が、１００Ｌ、５０Ｌ、２０Ｌ、１０Ｌ、５Ｌ、３Ｌ、１Ｌ、５００ｍＬ、２００ｍＬ、１００ｍＬ、５０ｍＬ、又は３０ｍＬであることが好ましい。

（培地）
　接着培養に使用する培地は、上記「１－２．用語の定義」で説明した基礎培地にＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地である。ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含み、かつ多能性幹細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。特に、白血病阻止因子を含まない培地を使用することが好ましい。ＰＫＣβ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。ＰＫＣβ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、細胞死を生じさせない範囲で選択することができる。

　例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として２５ｎＭ以上とすることができ、３０ｎＭ以上とすることができ、５０ｎＭ以上とすることができ、８０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができる。

　ＰＫＣβ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、細胞死を生じさせない範囲や、多能性幹細胞に対して毒性を呈しない範囲、ＰＫＣβ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

　例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができる。

　一方、ＴＮＫＳ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。ＴＮＫＳ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、細胞死を生じさせない範囲に応じて決定することができる。

　例えば、ＴＮＫＳ阻害剤は、液体培地中の終濃度として９０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、９００ｎＭ以上とすることができる。

　ＴＮＫＳ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、細胞死を生じさせない範囲や、多能性幹細胞に対して毒性を呈しない範囲、ＴＮＫＳ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

　例えば、ＴＮＫＳ阻害剤は、液体培地中の終濃度として４０μＭ以下とすることができ、３５μＭ以下とすることができ、３０μＭ以下とすることができ、１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１．５μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができる。

　また、液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率の下限は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上、１１１：１以上、５６：１以上、３３：１以上、１１：１以上、７．８：１以上、５．６：１以上、２．２：１以上、１．７：１以上、又は１．１：１以上とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率の上限は、特に限定されないが、例えば、１：１６００以下、１：１４００以下、１：１２００以下、１：６００以下、１：４００以下、１：２００以下、１：１２０以下、１：６０以下、１：４０以下、１：３６以下、１：３２以下、１：２８以下、１：２４以下、１：２０以下、１：１６以下、１：１２以下、１：８以下、１：６以下、又は１：４以下とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、特に限定されないが、例えば、１６７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。また、液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、好ましくは、１１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、３３：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、７．８：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５．６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、２．２：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ１．７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ１．１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。さらに液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度（モル濃度）の比率は、１６７：１以上１：１４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２４以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４以下の範囲とすることができる。

　本工程開始時における培地中のＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の濃度が前記範囲内にあればＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の添加方法については特に限定はしない。例えば、培地に１種以上のＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を総量で前記濃度範囲となるように直接投与して調製してもよい。

　接着培養において、培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。好ましくは、容器底面からの液面の高さが２ｍｍとすることが望ましい。例えば１５ｃｍディッシュ（平面視でのディッシュ底面の面積が１５０ｃｍ^２）を使用する場合は、３０ｍＬとすることができる。

（播種密度）
　接着培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度（播種密度）は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は、例えば、０．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、又は２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、そして、上限は、例えば、２０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、又は１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲である。

（培養条件）
　培養温度、時間、ＣＯ_２濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば、培養温度は下限が２０℃以上、又は３５℃以上、そして上限が４５℃以下、又は４０℃以下であればよく、好ましくは３７℃である。また、培養時間は、例えば、１継代期間あたり下限が０．５時間以上又は６時間以上、そして上限が８日間以下、１２０時間以下、９６時間以下、７２時間以下、又は４８時間以下の範囲である。培養時のＣＯ_２濃度は、例えば、下限が０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は４．５％以上、そして上限が１０％以下、又は５．５％以下とすることができ、５％とすることがより好ましい。なお、培養時のＣＯ_２濃度は一定である必要はなく、培養途中で変更・変化してもよい。培養時のＯ_２濃度は、例えば、下限が３％以上、又は５％以上、そして上限が２１％以下、又は２０％以下とすることができ、２１％とすることがより好ましい。また、接着培養においては、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は、培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上、又は１日に２回以上とすることができる。また、灌流方式で常に連続して培地交換を行ってもよい。培地交換は、後述する回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。灌流方式で培地交換を行う場合は、培養系中に細胞を留めるためにフィルターで細胞と培地を分離し培地交換すればよい。または、培養を継続しつつ容器内から細胞をフィルター等で分離した培養液を連続的に吸引し、かつ新しい培地を連続的に流加すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。

（培養方法）
　接着培養において、培養中の培地の流動状態は問わない。すなわち、接着培養は、静置培養でもよいし、流動培養でもよい。

　「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。「流動培養」とは、培地を流動させた状態で培養することをいい、接着培養では、マイクロキャリア等に細胞を接着させて培地流動下で培養する方法などがある。

　本接着培養工程では、増殖により得られる細胞数を任意に設定することができる。目的とする細胞数や細胞の状態は、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜決めることができる。例えば、細胞増殖の程度は、培養容器の培養面積に対する占有率として、特に限定されないが、下限が１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上であればよい。一方、その上限は１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下にすることができる。特に、培養容器の培養面積に対する占有率として、下限が７０％以上、上限が８０％以下になるように細胞を増殖することが好ましい。

　なお、本接着培養工程では、培養途中の多能性幹細胞の一部を取り出し、未分化状態を維持しているか確認することができる。例えば、培養中に取り出した多能性幹細胞に発現する多能性幹細胞マーカーの発現度合いを測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。これら多能性幹細胞マーカーの検出方法も、上述したように、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。

　培養中に取り出した多能性幹細胞のなかで多能性幹細胞マーカーの陽性率が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の場合、未分化を維持していると判断することができる。

　また、本工程において、培養途中で取り出した多能性幹細胞における三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現度合いを測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。すなわち、これら内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、より好ましくは７％以下、より好ましくは６％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは検出限界以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

　内胚葉系細胞マーカーとは、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する。

　中胚葉系細胞マーカーとは、中胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＴＢＸＴ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。なお、中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。

　外胚葉系細胞マーカーとは、外胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＦＧＦ５、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６等を挙げることができる。なお外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）、水晶体、末梢神経系などを形成する。また、外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。

　これら三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現度合いは、当該技術分野において任意の検出方法により測定することができる。三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定する方法としては、限定はしないが、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法、ノーザンハイブリダイゼーション、又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等が挙げられる。定量的リアルタイムＰＣＲ解析においては、測定対象のマーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対する相対発現量に換算し、当該相対発現量に基づいてマーカー遺伝子の発現量を評価できる。内部標準遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子やβ-アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子を挙げることができる。

（接着培養工程の後の処理）
　上述した接着培養工程の後、多能性幹細胞を回収する工程を行っても良い。本工程は任意である。多能性幹細胞を回収する工程では、常法により培養液と多能性幹細胞とを分離し、分離した多能性幹細胞を回収する。この時、多能性幹細胞は、外部マトリックスや隣接する多能性幹細胞から剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。

１－５－２．接着培養工程に続く浮遊培養工程
　上述した接着培養工程の後に行う「浮遊培養工程」は、接着培養工程後に得られる多能性幹細胞集団を浮遊培養する工程であり、未分化を維持し増殖させてもよく、また未分化を維持せず分化誘導を行ってもよい。ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地で接着培養した多能性幹細胞を浮遊培養することによって、本工程開始時の細胞数維持率を高く保つことができ、その後の生産効率を向上することができる。

　本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「１－５－１．接着培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは接着培養工程に既述の方法と共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。

（細胞）
　本工程で使用する細胞は、接着培養工程後に調製された細胞である。細胞の種類も、接着培養工程に記載のように、多能性幹細胞であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。

（細胞容器）
　浮遊培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できる。

（培地）
　本浮遊培養工程では、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤のいずれか一方又は両方を含まない培地で培養を開始しても良いし、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地で培養を開始しても良い。また、本浮遊培養工程をＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤のいずれか一方又は両方を含まない培地で培養を開始し、途中でＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地に切り替えて培養しても良い。なお、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤のいずれか一方又は両方を含まない培地で培養を開始するとは、接着培養の培養液から多能性幹細胞を分離する際に当該培養液に含まれていたＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤が持ち込まれることはあっても、浮遊培養に際してはＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤のいずれか一方又は両方を含まない培地を使用するという意味である。

　また、培地の種類は、上記「１－２．用語の定義」で説明した細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば特に限定されない。また、本工程に使用する培地には、特定の添加剤と併せて細胞を維持せず分化させる培地でよい。

　浮遊培養において、培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。特に限定されないが、例えば、１２ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり３．５ｃｍ^２）を使用する場合は、１ウェルあたりの量を０．５ｍＬ以上、１．５ｍＬ以下とすることができ、好ましくは約１．３ｍＬとすることができる。また、６ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり９．６ｃｍ^２）を使用する場合には、１ウェルあたりの量を１．５ｍＬ以上、２ｍＬ以上、又は３ｍＬ以上とすることができ、また６ｍＬ以下、５ｍＬ以下、４ｍＬ以下とすることができる。さらに、１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、容器当たりの量を下限は１０ｍＬ以上、１５ｍＬ以上、２０ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、又は３０ｍＬ以上とすることができ、また上限は５０ｍＬ以下、４５ｍＬ以下、又は４０ｍＬ以下とすることができる。また、容量が５００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、１０５ｍＬ以上、１１０ｍＬ以上、１１５ｍＬ以上、又は１２０ｍＬ以上とすることができ、また、上限は１５０ｍＬ以下、１４５ｍＬ以下、１４０ｍＬ以下、１３５ｍＬ以下、１３０ｍＬ以下、又は１２５ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は２５０ｍＬ以上、２６０ｍＬ以上、２７０ｍＬ以上、２８０ｍＬ以上、又は２９０ｍＬ以上とすることができ、また上限は３５０ｍＬ以下、３４０ｍＬ以下、３３０ｍＬ以下、３２０ｍＬ以下、又は３１０ｍＬ以下とすることができる。さらに、例えば、容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、３００ｍＬ以上、４００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、６００ｍＬ以上、７００ｍＬ以上、８００ｍＬ以上、９００ｍＬ以上、又は１０００ｍＬ以上とすることができ、上限は２０００ｍＬ以下、１９００ｍＬ以下、１８００ｍＬ以下、１７００ｍＬ以下、１６００ｍＬ以下、１５００ｍＬ以下、１４００ｍＬ以下、１３００ｍＬ以下、１２００ｍＬ以下、又は１１００ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、又は５Ｌ以上とすることができ、上限は１０Ｌ以下、９Ｌ以下、８Ｌ以下、７Ｌ以下、又は６Ｌ以下とすることができる。また、任意の容量の攪拌翼型リアクターを使用する場合は、各メーカー指定のワーキングボリュームの範囲内とすることができる。

（播種密度）
　浮遊培養に際して、接着培養した多能性幹細胞を新たな培地に播種する際、細胞の密度（播種密度）は、特に限定されず、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は、例えば、０．０１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、０．１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、そして、上限は、例えば、２０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、又は１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲とすることができる。特に好ましくは、播種密度の下限は２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、上限は４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲である。

（培養方法）
　浮遊培養において、培養中の培地の流動状態は問わない。すなわち、浮遊培養は、静置培養でもよいし、流動培養でもよい。ただし、典型的に浮遊培養では流動培養が採用される。

　「流動培養」とは、上述のように培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の場合、細胞の凝集を促進するように培地を流動させる方法が好ましい。そのような培養方法として、例えば、旋回培養法、揺動培養法、撹拌培養、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

　「旋回培養法」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。

　旋回速度は特に限定されないが、下限は、例えば、１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、８３ｒｐｍ以上、８５ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば、２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下とすることができる。旋回培養に使用するシェーカーの振幅は、特に限定されないが、下限は、例えば、１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、又は２０ｍｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、又は３０ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径も特に限定されないが、好ましくは振幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上又は１０ｍｍ以上であり、上限は、例えば、１００ｍｍ以下又は５０ｍｍ以下とすることができる。特に、後述する細胞凝集塊の製造方法等では、旋回条件を前記範囲にすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。

　「揺動培養法」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に５０回以下、２５回以下、２０回以下、、又は１５回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち揺動角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０．１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は２０°以下、１８°以下、１５°以下、１２°以下又は１０°以下とすることができる。後述する細胞凝集塊の製造方法等では、揺動条件を前記範囲とすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。

　さらに、上記旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

　「撹拌培養法」とは、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌手段を用いて容器内の培地を撹拌する条件で培養する方法をいう。例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで撹拌培養を達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。上記撹拌手段による撹拌速度は特に限定されないが、下限は１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、又は７０ｒｐｍ以上、９０ｒｐｍ以上、１１０ｒｐｍ以上、１３０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は２００ｒｐｍ以下、又は１５０ｒｐｍ以下とすることができる。

　本浮遊培養工程では、増殖により得られる細胞数を任意に設定することができる。目的とする細胞数や細胞の状態は、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜決めることができる。例えば、浮遊培養の場合、増殖により得られる細胞数（密度）を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができる。製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上であればよい。一方、その上限は１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ、又は２００μｍ以下であればよい。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。細胞凝集塊のサイズは、特に好ましくは、下限が５０μｍ以上、上限が３００μｍ以下である。

　本浮遊培養工程で製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。

　本浮遊培養工程で製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。

１－５－３．回収工程
　「回収工程」は、接着培養工程または浮遊培養工程後の培養液から培養した多能性幹細胞を回収する工程を意味する。本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法において回収工程は任意である。すなわち、上述した接着培養工程の後に回収工程を行い、その後、浮遊培養工程を行っても良いし、接着培養工程の後に直ちに浮遊培養工程を行っても良い。また、上述した浮遊培養工程の後に回収工程を行っても良いし、回収工程を行わなくても良い。「（細胞の）回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。

　浮遊培養の工程の後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また、遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば、１００×ｇ以上、３００×ｇ以上、８００×ｇ以上、又は１０００×ｇ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば、１６００×ｇ以下、１５００×ｇ以下、又は１４００×ｇ以下であればよい。また、処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば１０分以下、８分以下、６分以下、又は３０秒以下であればよい。フィルトレーションで液体成分を除去する場合、例えば、不織布やメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム（カネカ社）のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。

　回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の接着培養工程における「工程後処理」に記載の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（例えば、ＰＢＳバッファ）、生理食塩水、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。

（単一細胞化）
　また、接着培養工程又は浮遊培養工程の後に回収した多能性幹細胞は、「単一細胞化」することができる。単一細胞化とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。なお、単一の遊離した細胞状態とは、単層細胞片や細胞凝集塊等から遊離した単一の細胞が存在する状態とすればよく、単層細胞片や細胞凝集塊等を構成する全ての細胞が単一の遊離した状態となる必要は無い。

　単一細胞化には、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤としては、特に限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＥｘｐｒｅｓｓＥｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。例えば、単一細胞化にトリプシンを使用する場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５体積％以上、０．１８体積％以上、０．２０体積％以上、又は０．２４体積％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされず、０．３０体積％以下、０．２８体積％以下、又は０．２５体積％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば、５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば３０分以下、２８分以下、２５分以下、２２分以下、２０分以下、又は１８分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に、単層細胞片や細胞凝集塊等に対して軽度の応力を加えることで単一細胞化を促進することができる。この応力を加える処理としては、特に限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法を挙げることができる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。

　単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記と同様に行えばよい。

　以下、実施例により、本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
（比較例１：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の接着培養）
　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を０．５μｇ／ｃｍ^２でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）を１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養４日目に継代のためＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で細胞を５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞に分散した。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。その後同様に細胞を播種し接着培養を継続した。

（実施例１：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の接着培養）
　培地に２０μＭのＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ（富士フイルム和光純薬社）と１μＭのＬＹ－３３３５３１（ケイマンケミカル社）を添加した以外は、比較例１と同様の手順で接着培養した。

（実施例２：定量的リアルタイムPCR解析）
　以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。比較例１及び実施例１の培養０日目の細胞、比較例１の培養８日目、１６日目、２０日目の細胞、実施例１の培養８日目、１６日目、２０日目の細胞をＴＲＩｚｏｌ^ＴＭＲｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ　Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた溶液からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを単離及び精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、５００ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲｎａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ_２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍に希釈し、３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ　ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレートに添加して混合した。プライマーはＡＣＴＢ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＯＴＸ２、ＫＬＦ４、ＰＡＸ６、ＢＲＣＨＹＵＲＹ、ＳＯＸ１７を用いた。３８４ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　７　Ｆｌｅｘ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。

　定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示した。
ＡＣＴＢ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＯＣＴ４（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
ＯＣＴ４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
ＳＯＸ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
ＳＯＸ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
ＮＡＮＯＧ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
ＮＡＮＯＧ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）

　遺伝子発現を測定した結果を表２及び図１に示した。

　表２及び図１に示す通り、接着培養において、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培養液を使用した場合であっても、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含まない通常の培養液で未分化を維持して培養した細胞（比較例１）と比べて未分化マーカーの発現量に有意差はなかった。この結果より、接着培養において、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培養液を使用した場合でも、多能性幹細胞における未分化性が保たれていることが示された。

（実施例３：フローサイトメトリー解析）
　比較例１、実施例１と同様の手順で接着培養した培養２０日目細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。その後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＦｏｘｐ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｔａｉｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｅｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて固定・透過処理・ブロッキングを行った。その後、細胞のサンプルを４つに分けてそれぞれ５０μＬずつにｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＦｏｘｐ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｔａｉｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｅｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）付属のＢｕｆｆｅｒを用いて再懸濁した。１つに蛍光標識済抗ＯＣＴ４、抗ＳＯＸ２、及び抗ＮＡＮＯＧ抗体をそれぞれ加えて混合し、３つにはそれぞれ上記３種の蛍光標識済抗体のうち１種ずつを除いた抗体を混合しＦＭＯコントロールとした。４℃、遮光状態で１時間染色した。使用した抗体とその添加量を表３に示した。

　そして、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＧｕａｖａ　ｅａｓｙＣｙｔｅ　８ＨＴ（ルミックス社）にて解析した。ＦＭＯコントロールサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となるすべての領域を選択した。抗ＯＣＴ４、抗ＳＯＸ２、及び抗ＮＡＮＯＧ抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、前記領域内に含まれる細胞の割合を算出し、これをＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率とした。その結果を表４及び図２に示した。

　表４及び図２に示すように、接着培養において、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培養液を使用した場合であっても、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含まない通常の培養液で未分化を維持して培養した細胞（比較例１）と同様に、未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧについて、陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であった。この結果からも、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を添加して接着培養した場合であっても未分化逸脱集団が現れることなく未分化状態を維持した多能性幹細胞集団が得られることが示された。

（比較例２：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の接着培養から浮遊培養への移行）
　比較例１と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株を培養１２日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で９０ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。

（実施例４：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の接着培養から浮遊培養への移行）
　実施例１と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株を用いて培養１２日目に比較例２と同様の手順で浮遊培養を行った。

（実施例５：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の浮遊培養の細胞数計測）
　比較例２、実施例４の方法で接着培養から浮遊培養に細胞を継代した翌日にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。測定した細胞数を、表５に示す。

　表５に示す通り、実施例４では、比較例２に比べて細胞数が多く、接着培養から浮遊培養への移行したときの死滅を防止することができ、効率が顕著に向上したことが示された。

（比較例３：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の浮遊培養）
　比較例１と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株を培養４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で９０ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。

（実施例６：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の浮遊培養）
　実施例１と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株を用いて培養４日目に比較例２と同様の手順で浮遊培養を行った。

（実施例７：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の浮遊培養の細胞数計測）
　比較例３、実施例６の方法で接着培養から浮遊培養に細胞を継代した翌日にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。測定した細胞数を、表６に示す。

　表６に示す通り、実施例６では比較例３に比べて細胞数が多く、接着培養から浮遊培養への移行したときの死滅を防止することができ、効率が向上したことが示された。

（実施例８：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の接着培養）
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（マトリクソーム社）を０．５μｇ／ｃｍ^２でコーティングした細胞培養用フラスコに、ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）を１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、播種した日を培養０日目として、培養１日目、培養４日目、培養６日目、培養７日目に培地交換を行った。細胞播種時のみＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。培養４日目以降の培地交換では、２０μＭのＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ（富士フイルム和光純薬社）と１μＭのＬＹ－３３３５３１（ケイマンケミカル社）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用した。培養８日目に継代のためＴｒｙｐＬＥ　ＳＥＬＥＣＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で細胞を処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞に分散した。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２と２０μＭのＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ（富士フイルム和光純薬社）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。その後、ＢｉｏＢＬＵ　１ｃ　リアクター（エッペンドルフ社）に液量は３２０ｍＬ、細胞密度は１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２と２０μＭのＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ（富士フイルム和光純薬社）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で７５ｒｐｍの攪拌速度で浮遊攪拌培養を開始した。

（実施例９：ヒトｉＰＳ細胞１３８３Ｄ６株の浮遊培養の細胞数計測）
　実施例８の方法で接着培養から浮遊培養に細胞を継代した翌日にリアクターから培養液３ｍＬを遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。測定した細胞数を、表７に示す。

　表７に示す通り、実施例８では浮遊培養に継代した翌日の細胞数が顕著に多く、播種細胞数より細胞が増加していることが確認できた。通常は浮遊培養に継代した翌日の細胞数は、継代時の酵素処理によるダメージや、凝集塊を形成できずに単細胞状態で細胞死を起こす細胞等に起因して播種細胞数より少なくなるが、本発明の方法により浮遊旋回培養のみではなく浮遊攪拌培養においてもそれらを抑制し、生産性を顕著に改善することができる。

Claims

　ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を接着培養する工程と、
　接着培養後の多能性幹細胞を浮遊培養する工程と
　を含む、多能性幹細胞集団の製造方法。
　前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、２５ｎＭ以上１５μＭ以下である請求項１記載の方法。
　前記液体培地中のＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、９０ｎＭ以上４０μＭ以下である請求項１記載の方法。
　前記液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する請求項１記載の方法。
　前記液体培地が、ＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１を含む請求項１記載の方法。
　前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する請求項１記載の方法。
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である請求項６記載の方法。
　前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む請求項１記載の方法。
　前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む請求項１記載の方法。
　前記多能性幹細胞集団は、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である請求項１記載の方法。
　前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び/又は人工多能性幹細胞である請求項１記載の方法。
　前記多能性幹細胞を浮遊培養する工程では、ＰＫＣβ阻害剤及び／又はＴＮＫＳ阻害剤を含まない液体培地に、接着培養後の多能性幹細胞を接種することを特徴とする請求項１記載の方法。