CN102482687B - 骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法 - Google Patents

骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102482687B
CN102482687B CN200980150570.6A CN200980150570A CN102482687B CN 102482687 B CN102482687 B CN 102482687B CN 200980150570 A CN200980150570 A CN 200980150570A CN 102482687 B CN102482687 B CN 102482687B
Authority
CN
China
Prior art keywords
calcitriol
production
calcifediol
buffer composition
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980150570.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102482687A (zh
Inventor
姜大中
任种赫
郑铉正
康在勋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IL Dong Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Ildong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ildong Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Ildong Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN102482687A publication Critical patent/CN102482687A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102482687B publication Critical patent/CN102482687B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法，尤其涉及以金属化合物，有机溶剂，环糊精，三(羟基甲基)氨基甲烷，琥珀酸钠，氯化钠，氯化镁及水组成的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法。本发明的制造方法具有如下优点：骨化三醇或骨化二醇的生产率高；因在非微生物培养体系中的酶素反应体系中进行生物转化，所以不需要维持无菌状态，并生物催化反应结束后进行分离精制时也比微生物培养法更干净的状态中进行分离精制，因此分离所需的费用低廉、品质良好。并且，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物具有提供骨化三醇或骨化二醇的优秀生产率的效果。

Description

骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法
技术领域
本申请以2008年12月19日申请的韩国专利申请第10-2008-0130707号为优先，所述说明书的全部内容为本申请的参考文献。
本发明涉及一种骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法，尤其涉及以金属化合物、有机溶剂、环糊精、三(羟基甲基)氨基甲烷、琥珀酸钠、氯化钠、氯化镁(magnesium chloride)及水等组成。
背景技术
骨化三醇通常用于典型的老年疾病-骨质疏松的治疗上，活性维生素D3的骨化二醇用于骨软化症等治疗上。在肝脏和肾脏中维生素D3作为生物体内的物质可以以口服形式投药，其由各两次的羟基失火中生成骨化三醇。在生理学上，促进从胃肠道和肾脏的钙和磷的吸收，从而具有良好的骨质疏松的治疗效果而有名。
并且，骨化三醇也使用于佝偻病、骨软化症、甲状旁腺功能低下症、慢性肾功能衰竭症、血液透析患者的肾性骨营养不良症、皮肤疥疮症等治疗上，并近年来多次报道了前列腺癌或白血病的治疗效果。
众所周知，制造骨化三醇或骨化二醇的现有方法有有机化学合成法和通过微生物发酵的生产方法。有机化学合成法要考虑到化学结构上的立体特异性和区域专一性并在碳素源1号或25号的位置上以选定的导入羟基，因此需要高难度技术和高价的反应过程等缺点，但已开发了改善这些缺点的通过微生物发酵的生物转化生产方法。通过微生物发酵的生物转化反应已被证明有着立体特异性并区域专一性。因此，活性维生素D3的生产方法可以由通过生物转化的有经济效益的方法来代替，其从现有的有机合成法中利用微生物的氢氧化功能。
但是，通过微生物发酵的现有的生物转化方法，发现了如下的几种缺点。
第一，由于通过微生物培养的生产方法，所以有污染的可能性，并随着生产规模的变大而其可能性也变大。特别是，培养时间越长其暴露的污染更加严重，并且这些污染是由于与本培养的同时投入的维生素D3的其后发生，所以污染的同时会损失前体的费用。第二，通过发酵的生物转化可能会出现较大的产率变化幅度。因为这是根据微生物特有的培养敏感度，所以是不可避免的事项，为此培养室的内部需要在一定条件下的恒定性维持。第三，相应的生产设施的总体维持管理费用会增加。第四，由于已经达到了最大值的生产率，所以是没有更多提高的停滞状态，因此不能说拥有最高的竞争力。第五，由于据杂质的分离精制的障碍，因此可能会算出过高的分离费用。由于培养液整个儿中只把特定物质进行分离精制，因此分离精制规模要大并且费用也会按比例增加。
因此，克服这些缺点开发以高产量生产高纯度骨化三醇或骨化二醇的新的生产方法是当务之急。
发明内容
为了克服通过这些发酵的生产方法的缺点，本发明的发明者们研究了作为生物转化方法的非发酵的方法的全细胞生物催化反应方法，并确认了根据本发明的微生物的假诺卡菌属自养小球藻ID9302具有生产骨化三醇和骨化二醇的生物催化功能，并开发了优越增加骨化三醇和骨化二醇的生产力的缓冲组合物，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其以FeCl2、FeCl3、FeSO4、MnCl2、及ZnSO4组成的群中选定的1个以上的金属化合物为0.01至0.3％(w/v)；以乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)组成的群中选定的1个以上的有机溶剂为1至10％(w/v)；环糊精为0.1至5％(w/v)；三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethy 1)aminomethane)为0.01至1％(w/v)；琥珀酸钠(sodium sucιinate)为0.01至1％(w/v)；氯化钠(sodium chloride)为0.01至1％(w/v)；氯化镁(magnesium chloride)为0.001至0.5％(w/v)及剩余的水等组成。
本发明的另一目的在于提供骨化三醇或骨化二醇的制造方法，其包含如下步骤：培养步骤，对假诺卡菌属自养小球藻进行培养；回收步骤，回收所述培养液中的菌体；以及混合步骤，对所述回收的菌体，维生素D3及所述骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物进行混合。
为了实现上述目标，本发明提供了骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其以FeCl2、FeCl3、FeSO4、MnCl2、及ZnSO4组成的群中选定的1个以上的金属化合物为0.01至0.3％(w/v)；以乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)组成的群中选定的1个以上的有机溶剂为1至10％(w/v)；环糊精为0.1至5％(w/v)；三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethy 1)aminomethane)为0.01至1％(w/v)；琥珀酸钠(sodium sucιinate)为0.01至1％(w/v)；氯化钠(sodium chloride)为0.01至1％(w/v)；氯化镁(magnesium chloride)为0.001至0.5％(w/v)及剩余的水等组成。
为了实现本发明的另一目标，本发明提供了骨化三醇或骨化二醇的制造方法，其包含如下步骤：培养步骤，对假诺卡菌属自养小球藻进行培养；回收步骤，回收所述培养液中的菌体；以及混合步骤，对所述回收的菌体，维生素D3及所述骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物进行混合。
以下，对本发明的内容进行更详细的说明。
本发明的组合物的特征在于，以金属化合物、有机溶剂、环糊精、三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethy 1)aminomethane)、琥珀酸钠(sodium sucιinate)、氯化钠(sodiumchloride)、氯化镁(magnesium chloride)及水等组成。
本发明的组合物造成了菌体能够稳定生存的环境，其以三(羟基甲基)氨基甲烷、琥珀酸钠、氯化钠及氯化镁为基本结构。本发明的组合物的三(羟基甲基)氨基甲烷、琥珀酸钠、氯化钠及氯化镁在不影响本发明的组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产促进功效的范围内无特殊限制，但优选的可以为，以三(羟基甲基)氨基甲烷为0.01至1％(w/v)的浓度、琥珀酸钠为0.01至1％(w/v)的浓度、氯化钠为0.01至1％(w/v)的浓度、氯化镁为0.001至0.5％(w/v)的浓度添加，最优选的可以为，以三(羟基甲基)氨基甲烷为0.12至0.61％(w/v)的浓度、琥珀酸钠为0.16至0.8％(w/v)的浓度、氯化钠为0.06至0.18％(w/v)的浓度、氯化镁为0.006至0.05％(w/v)的浓度添加。
本发明的环糊精是多个葡萄糖分子以a-l，4结合的环状的非还原糖，并由于疏水性的内部和亲水性的外部而形成主客体包合物，从而使维生素D3基板稳定于缓冲液内。本发明的环糊精可以为α-环糊精、β-环糊精，γ-环糊精或甲基β-环糊精，最优选的可以为β-环糊精。本发明的环糊精的浓度在不影响本发明的组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产促进功效的范围内无特殊限制，但优选的可以为0.1至5％(w/v)，更优选的可以为0.25至1％(w/v)。
本发明的有机溶剂使不溶性物质的基板的溶解度增加。本发明的有机溶剂可以为乙醇、甲醇、丙酮或二甲基亚砜(DMSO)，最优选的可以为甲醇。本发明的有机溶剂的浓度在不影响本发明的组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产促进功效的范围内无特殊限制，但优选的可以为1至10％(w/v)，更优选的可以为2.5至10％(w/v)。
本发明的金属化合物使电子转移活性化，从而使基板转换为骨化三醇或骨化二醇的效率增加。本发明的金属化合物在不影响本发明的组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产促进功效，同时是发生金属离子的化合物就无特殊限制，但优选的可以为FeCl2、FeCl3、FeSO4、MnCl2、及ZnSO4，最优选的可以为MnCl2。本发明的金属化合物的浓度在不影响本发明的组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产促进功效的范围内无特殊限制，但优选的可以为0.01至0.3％(w/v)，更优选的可以为0.01至0.03％(w/v)。
本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物具有良好的促进骨化三醇或骨化二醇生产的效果。
一方面，本发明的骨化三醇或骨化二醇的制造方法，其特征包含如下步骤：(a)培养步骤，对假诺卡菌属自养小球藻进行培养；(b)回收步骤，回收所述培养液中的菌体；(c)混合步骤，对所述回收的菌体、维生素D3及本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物进行混合。
在所述步骤(a)中培养假诺卡菌属自养小球藻。本发明的假诺卡菌属自养小球藻的培养可以利用通常使用的微生物接种及培养方法。接种在培养条件下以便假诺卡菌属自养小球藻充分的增殖，使所培养的假诺卡菌属自养小球藻适量的添加至培养基而进行。接种的假诺卡菌属自养小球藻的量可以使所培养的假诺卡菌属自养小球藻培养液以1至5％(w/v)左右添加至培养基。假诺卡菌属自养小球藻的培养可以根据该领域中已知的培养基和培养条件形成。上述过程要是本领域的技术人员就可以根据选定的菌株进行轻易的调整而使用。这些各种方法已公开在各种文献中，例如为：詹姆斯等人(James et al.)、生化工程(Biochemical Engineering)、普伦蒂斯霍尔国际版(Prentice-HallInternational Editions)等。根据细胞的成长方式分为悬浮培养和附着培养，根据培养方法分为分批式培养、流加式培养、连续式培养。
培养基可以使用为碳源、氮源、维生素及矿物质组成的培养基。
用于本发明的培养物生产的培养基中可作为所述的碳素源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖及其的组合组成的群中选定的1个以上，更优选的为葡萄糖。用于本发明的培养物生产的培养基中可作为所述的氮素源为酵母提取物、大豆蛋白胨(soytone)、蛋白胨、牛肉提取物、胰胨、酪胨及其的组合组成的群中选定的1个以上，更优选的为酵母提取物。
所述步骤(a)的假诺卡菌属自养小球藻凡是同类的微生物就无论是什么都有可能，并其范围包含着假诺卡菌属自养小球藻种的所有亚种或变种。优选的可以为假诺卡菌属自养小球藻ID9302(Pseudonocardia autotrophica ID9302)。
根据本发明的生物催化剂的假诺卡菌属自养小球藻ID9302于2001年6月7日寄托给韩国生物科学研究院的生物资源中心(KCTC)(寄托号：KCTC 1029BP)。
在所述步骤(b)中回收所述培养液中的菌体。本发明的菌体回收方法如果是通常使用的菌体回收方法就可以无限制使用，其为了使菌体以生存状态回收。优选的可以为离心分离方法。优选的可以为用于除去培养液内的营养成分而回收的菌体能够以缓冲清洗，并所述清洗用缓冲液优选的可以为，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物。
在所述步骤(c)中混合所述回收的菌体、维生素D3及本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物。在步骤(c)中所述回收的菌体被本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物松脱，从而执行了使基板维生素D3转换为骨化三醇或骨化二醇的功能。
步骤(c)的混合根据本发明的制造方法，只要在生产骨化三醇或骨化二醇的情况下就能够使用任何顺序或方法，例如先把维生素D3溶解于公知的溶剂后，使其与所述回收的菌体已松脱的本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物中进行混合，或先把促进本发明的骨化三醇或骨化二醇生产的物质与维生素D3一同溶解于公知的溶剂后，使其能够混合于所述回收的菌体被松脱的本发明的骨化三醇或骨化二醇生产促进用缓冲液组合物中。凡是有助于所述公知的维生素D3的溶解就可以使用任何溶剂，例如可以为甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)或其的混合物，并促进所述本发明的骨化三醇或骨化二醇生产的物质，例如可以为环糊精、克列莫佛(cremophor)、聚乙二醇、二丙二醇、双胞胎85、双胞胎80或聚乙二醇300.
并且，使1次要反映的上述维生素D3的量全部投入或分批投入或适当的维持混合物内的维生素D3的浓度的同时能够不断地投入。混合状态根据所述回收的菌体而考虑维生素D3转换为本发明的骨化三醇或骨化二醇的效率和菌体的生产率等，从而能够多种多样的持续下去，并优选的可以为4日至10日。在维持混合状态的过程中，为了高效率的骨化三醇或骨化二醇生产或维持菌体的生存，可以维持适当的Ph、搅拌状态及气流量，这些过程如果是本领域的技术人员就能够轻易的进行调整。
在本发明的一实施例中培养了假诺卡菌属自养小球藻ID9302，并通过离心分离至回收了菌体从而制造了GAC(生长-停止细胞growth-arrested cells)。用此在各种种类的缓冲组成中测定了利用维生素D3的骨化三醇或骨化二醇各个的生产率。
结果，以三(羟基甲基)氨基甲烷为25mM、琥珀酸钠为25mM、氯化钠为20mM、氯化镁为4mM组成的TSSM缓冲液中确认了骨化三醇或骨化二醇各个的生产率为最良好(参照实施例1)。
使TSSM缓冲液为基本缓冲液组成，从而为了提高骨化三醇或骨化二醇的生产率进行了添加各种物质的实验。
在本发明的另一实施例中，添加了不同浓度的环糊精，从而测定了骨化三醇或骨化二醇的生产率变化。
结果，确认了环糊精使骨化三醇或骨化二醇生产量增加，特别是，确认了在添加β-环糊精时生产量升高(参照实施例2)。
在本发明的另一实施例中，添加了各种有机溶剂，从而测定了骨化三醇或骨化二醇的生产率变化。
结果，确认了根据有机溶剂的投入而使骨化三醇及骨化二醇的生产量增加，特别是，确认了在添加甲醇时生产量升高(参照实施例3)。
并且，确认了在同时添加环糊精和有机溶剂时的生产量比单独添加环糊精或有机溶剂时的生产量明显升高(参照实施例4)。
在本发明的另一实施例中，添加了各种不同浓度的金顺化合物，从而测定了骨化三醇或骨化二醇的生产率变化。
结果，确认了在与浓度无关投入CuCl2、CuSO4、CoCl2、CoSO4时骨化三醇及骨化二醇的生产量为减少或者没有形成，但是，在投入FeCl2、FeCl3、FeSO4、ZnSO4或MnCl2时使骨化三醇或骨化二醇的生产量升高。特别是，确认了在投入ZnSO4或MnCl2时生产量的增加为明显(参照实施例6)。
在本发明的另一实施例中，测定了根据pH变化的骨化三醇及骨化二醇的生产率变化。
结果，确认了根据pH而骨化三醇或骨化二醇的生产量有了变化，并且当pH为7.0至7.4时显示为骨化三醇及骨化二醇的高生产量(参照实施例7)。
在本发明的另一实施例中，把根据上述过程而决定的本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物与有机溶剂和金属化合物进行各种调节后在75L的发酵槽中大量生产了骨化三醇或骨化二醇。
结果，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，在FeCl2、FeCl3、FeSO4的浓度为0.01％时，各个显示为53.12mg/L，60.8mg/L，62.42mg/L的骨化三醇的生产量，并在ZnSO4的浓度为0.01％时，显示为77.18mg/L的骨化三醇的生产量。特别是，在MnCl2的浓度为0.03％时，显示为90.12mg/L的骨化三醇的生产量以及166.87mg/L的骨化二醇的生产量(参照实施例8)。由此，确认了包含FeCl2、FeCl3、FeSO4、ZnSO4或MnCl2的本发明的组合物显示为良好的骨化三醇或骨化二醇的生产量。
并且，区别于有机溶剂的种类后大量生产的结果确认了乙醇为48.45mg/L的骨化三醇的生产量，丙酮和DMSO各个为74.87mgIL及70.85mg/L的骨化三醇的生产量和156.37mg/L及141.81mg/L的骨化二醇的生产量。特别是，甲醇为90.12mg/L的骨化三醇的生产量和166.87mg/L的骨化二醇的生产量(参照实施例9)。由此，确认了包含甲醇、乙醇、丙酮及二甲基亚砜的本发明的组合物显示为良好的骨化三醇或骨化二醇的生产率。
在本发明的另一实施例中，利用了根据上述组成而决定的本发明的骨化三醇或骨化二醇生产促进用缓冲液组合物，在75L的发酵槽中根据本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产方法生产骨化三醇及骨化二醇后，使其进行了分离精制。
根据本发明的方法生产骨化三醇或骨化二醇的结果确认了在第7天显示为91.23mg/L的骨化三醇的生产率和168.24mg/L的骨化二醇的生产率(参照实施例10)。
并且，回收上述反应物并除去菌体后，使维生素D3、骨化二醇及骨化三醇进行了分离精制。
结果，获得了纯度为90％以上的骨化二醇7.6g和纯度为99％的骨化三醇2.2g(参照实施例11)。
如上所述，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物或制造方法，因除去培养液并在缓冲液状态下使维生素D3和菌体进行反应，所以在培养环境中发生的其他代谢产物的发生少，因此以所需的目标材料进行生物转化的产量升高同时生成的杂质量少，从而进行分离精制的效率性非常高，最终，具有使原料的品质升高并减少进行分离精制的费用等效果。并且，通过高浓度反应，可以增大骨化三醇的总生产量，因此有效于骨化三醇或骨化二醇的生产。
因此，本发明提供一种骨化三醇或骨化二醇的制造方法，其利用了骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物和所述组合物。本发明的制造方法具有如下优点：骨化三醇或骨化二醇的生产率高；因在非微生物培养体系中的酶素反应体系中进行生物转化，所以不需要维持无菌状态，并生物催化反应结束后进行分离精制时也比微生物培养法更干净的状态中进行分离精制，因此分离所需的费用低廉、品质良好。并且，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物具有提供骨化三醇或骨化二醇的优秀生产率的效果。
附图说明
图1是表示在胆固醇中进行有机合成而生产骨化三醇的工序与通过生物催化剂而在维生素D3中生产骨化三醇的工序相比较的图。
图2是表示环糊精影响于生物催化剂反应而生物转化为维生素D3，从而生产骨化三醇和骨化二醇的曲线图(数字d：开始反应后的时间(日))。
图3是表示特定有机溶剂影响于生物催化剂反应而生物转化为维生素D3，从而生产骨化三醇或骨化二醇的曲线图。
图4是表示β-环糊精和特定有机溶剂的混合条件影响于生物催化剂反应的曲线图，其为了使维生素D3生物转化而高生产骨化三醇和骨化二醇(数字d：开始反应后的时间(日))。
图5是表示在75L的发酵槽中通过生物催化剂反应而在维生素D3中生产活性维生素D3诱导体的曲线图(数字d：开始反应后的时间(日))。
图6是表示金属化合物影响于生物催化剂反应而生物转化为维生素D3，从而生产骨化二醇和骨化三醇的曲线图(D数字：开始反应后的时间(日))。
图7是表示在生物催化剂反应中适当的维持pH时骨化二醇和骨化三醇的生产率的曲线图(D数字：开始反应后的时间(日))。
图8是表示在75L的发酵槽中金属化合物影响于生物催化剂反应而生物转化为维生素D3，从而生产骨化二醇和骨化三醇的曲线图(D数字：开始反应后的时间(日))。
图9是表示在75L的发酵槽中通过生物催化剂反应而在维生素D3中生产活性维生素D3的骨化二醇和骨化三醇的曲线图(D数字：开始反应后的时间(日))。
具体实施方式
以下，根据实施例对本发明进行详细说明。
但是，下列实施例只是对本发明举例说明的，本发明的内容不局限于下列实施例。
<实施例1>
确定用于骨化三醇生产的生物催化剂反应缓冲
生物催化剂的GAC(生长-停止细胞(growth-arrested cells))为了具有通过生物催化反应使羟基导入维生素D3的能力，在各种各样的缓冲中确认了骨化三醇的生产率。
<1-1>假诺卡菌属自养小球藻ID9302的GAC制造
为了使用用于本发明的骨化二醇和骨化三醇生产的生物催化剂，使假诺卡菌属自养小球藻ID9302(Pseudonocardia autotrophicaID9302，以下称为‘ID9302’)菌体在适当条件的培养基(干酵母为0.4％、葡萄糖为1％、淀粉为1％、鱼粉为1％、氯化钠为0.2％、磷酸二氢钾为0.01％、牛肉提取物0.1％、氟化钠为0.01％及碳酸钙为0.2％、pH为7.0％的灭菌液体培养基)中培养，并使其进行圆心分离只回收菌体后，以使用于以下实验的生物催化反应缓冲(参照表1)各自清洗，从而除去培养液内的营养成分并制造了在下一步步骤中用于要进行生物催化反应的GAC(生长-停止细胞(growth-arrested cells))(以下称为‘ID9302GAC’)。
<1-2>测定根据缓冲组合的ID9302GAC的骨化三醇及骨化二醇的生产率
把以本培养基50ml准备的生物催化剂的GAC溶解于50ml的与[表1]一样的各种缓冲液中，其后放进250ml的三角瓶中维生素D3为5％的溶液(in ethanol)300μl放进同样的三角瓶中，在同样的条件下进行了9天的振荡反应。在第7天和第9天采取了培养液3ml，添加了抽取溶剂(二氯甲烷/甲醇＝1/1(methylene chloride/methanol＝1/1))6ml，混合30分钟后采取有机溶剂层进行浓缩并以HPLC分析，从而测定了生物催化反应的产量和骨化三醇及骨化二醇各个的生产率。
比较分析了与骨化三醇及骨化二醇纯品一致的表示UV模式和RT的顶点，从而确认了其生产率。HPLC分析条件是色谱柱为J’sphereODS-H80(内径为150x4.6mm)，流动相为使用了以磷酸pH调整为7.2～7.3的1％三(羟基甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane，THAM)450ml与乙腈550ml的混合溶剂并其移动速度为1ml/min，检测为使用了光电二极管阵列检测器。
表1
各种种类的缓冲液对生物催化反应涉及的影响
*TSSM缓冲液：25mM棱镜树基地(Trizma base，三(羟甲基)氨基甲烷)，25mM琥珀酸钠(sodium succinate)，25mM氯化钠，4mM氯化镁。
结果，如表1所述，确认了当使用TSSM缓冲液时ID9302使羟基导入维生素D3的生物催化功能为最高。
马来酸缓冲液(Maleate buffer)也达不到在TSSM缓冲液中表示的1.65mg/L的骨化三醇的生产率，但是确认了用于ID9302的生物催化的比较良好的缓冲液。
TSSM缓冲液是以pH的缓冲效果良好的棱镜树基地、离子强度(ionicstrength)优秀的氯化钠、有助于代谢活动的琥珀酸钠、p450羟化酶(hydroxylase)的辅酶(cofactor)的镁离子等组成的缓冲液，特别是在10～50mM的琥珀酸钠、10～30mM的氯化钠、1～8mM的氯化镁的浓度为(Ph7.0～7.4)中发现了各个良好的生产率。于是，p450氢氧化镁反应体系中使TSSM缓冲液决定为生物催化反应的缓冲液。
<实施例2>
环糊精对生物催化反应涉及的影响
与实施例1中决定的生物催化反应条件同等的条件进行了生物转化试验。TSSM缓冲液50ml中放进ID9302GAC生物催化剂，再投入浓度为0.25％、0.5％、1％的各种环糊精，并且5％维生素D3乙醇溶液300μl放进三角瓶中，进行了9天的生物转化试验。在第5天，第7天，第9天中采取反应样品3ml后与实施例1-2一样的方法进行了提取、浓缩及HPLC分析。
最终HPLC分析结果确认了环糊精使TSSM缓冲的环境变化，从而生物催化剂的ID9302GAC使羟基导入维生素D3的产量增加(参照图2)。下列表2中总结了根据环糊精的种类、浓度及培养时间的骨化三醇及骨化二醇的生产率。
表2
各种环糊精的适当浓度对生物转化涉及的影响
使α-环糊精投入到TSSM缓冲液时，在0.25％浓度中骨化三醇的生产量与对照组(在非添加环糊精的TSSM缓冲液中的生产率，参照表1)对比，显示为增加了1.83倍。并且，骨化三醇的前体物质的骨化二醇的情况也显示随着α-环糊精浓度的增加而增加的模式，并在1％浓度中显示为1.82倍的生产率增加。
使β-环糊精(β-CD)投入到TSSM缓冲液时，在0.25％中显示为最良好的生物转化结果，但是在与对照组对比中可知骨化三醇的生产量上升了3.79倍。并且，可以确认了骨化二醇的生产率也在0.25％的β-环糊精中增加了4.37倍。
在γ-环糊精(γ-CD)的情况下确认了，与投入浓度以0.25％、0.5％、1％增加的成正比，从而骨化三醇的生产量也增加了1.7倍、2.18倍、2.26倍，并骨化二醇的生产量也大大的增加了。
在β-环糊精的诱导体的甲基β-环糊精(M-CD)的情况下确认了，在0.25％中与控制对比时以2.87倍显示为最高的骨化三醇的生产率，同时在以后的浓度中显示为骨化三醇生产率的快速下降，并骨化二醇的生产率是高高的维持着。
通过以上的结果确认了，根据本发明与非投入环糊精的对照组(TSSM缓冲液)比较，在TSSM缓冲液中以适当浓度投入环糊精的缓冲液(以下称为“TSSMC缓冲液”)的情况下，维生素D3的生物转化产量升高，并因此骨化三醇和骨化二醇的生产量会增加。
<实施例3>
特定有机溶剂对生物催化反应涉及的影响
在实施例1中决定的生物催化反应为基本确认了有机溶剂对生物催化反应的影响和骨化三醇及骨化二醇的生产效果。实施例1的生物催化反应条件下投入表3的有机溶剂4种，使其的最终浓度各个为2.5％、5％、10％、20％、30％，并进行了与实施例2的振荡反应同等条件的实验，同时在生物催化反应的第8天结束反应后用HPL与实施例1-2同样的方法进行了定量分析。
表3
特定有机溶剂对生物催化反应涉及的影响
分析结果，在乙醇的情况下与非投入的对照组相比，投入乙醇的浓度越高，目标物质的骨化三醇的生物转化却完全没有形成。但是，在乙醇2.5％、5％中确认了骨化三醇的生产量与对照组对比各个上升为6.57倍、5.54倍。
在甲醇的情况下确认了，20％以上的投入浓度中生物转化活动完全没有出现，当甲醇投入到2.5％至10％时与对照组对比使骨化三醇的生产量增加至3.52倍。在骨化二醇的生产量的情况下，也显示为增加了6倍以上。
在丙酮和二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的情况下显示为与对照组对比骨化三醇为2～2.5倍、骨化二醇为5.5～6.5倍的生产量增加的现象。
总结以上的结果可以确认了，由于使一定浓度的有机溶剂投入到生物催化反应中，因而增加了难溶性物质的维生素D3的溶解度，从而升高了骨化三醇的生产量(参照图3)。
<实施例4>
环糊精和有机溶剂的混合条件对生物催化反应涉及的影响
在实施例2中，使TSSMC缓冲液应用为基本生物催化反应的缓冲液，其显示最良好的生物转化效果的0.25％β-环糊精投入至TSSM缓冲液中。考虑到在实施例3中确认的有机溶剂对生物转化涉及的有效效果，使有机溶剂以2.5％至10％浓度投入至生物催化反应的缓冲液中，从而确认了对根据环糊精和有机溶剂的混合的生物转化产量涉及的影响。GAS制作，振荡反应的条件及HPLC分析与实施例1相同。
结果已确认了，β-环糊精和有机溶剂的混合对生物催化反应表示积极的反应，与骨化三醇的生产量的增加一同添加了甲醇时，骨化三醇的生物合成的前体物质的骨化三醇的生产率与对照组对比达到了约4倍的89.14mg/L(参照图4)。
表4
根据β-环糊精和各种有机溶剂的混合的第8天的生物转化结果
在甲醇的情况下已确认了，与实施例3一样根据环糊精混合的骨化三醇的生产量为最高。在甲醇的情况下显示为，在2.5％浓度中骨化三醇和骨化二醇的生产率开始增加，在7.5％浓度中与对照组对比增加了4.76倍的骨化三醇的生存量。在丙酮的情况下显示为，在10％浓度中增加了约2倍的骨化三醇的生产量；在二甲基亚砜的情况下显示为，在5％浓度中与对照组对比增加了比2.88倍高的骨化三醇的生产量。并且，在乙醇的情况下显示为，与在实施例3中一概没有发生骨化三醇的生产相反，在5％浓度中与对照组对比增加了1.4倍的骨化三醇的生产率和3.8倍的骨化二醇的生产率。
根据以上的结果可知，环糊精和有机溶剂的混合对环糊精的难溶性维生素D涉及的溶解度增加一起，使有机溶剂增加了缓冲环境的可溶性质，从而出现了生物催化反应的综合效应。综合效应显示为骨化三醇和骨化二醇生产量的快速增长，特别是在7.5％甲醇的情况下显示为，与对照组对比增加了约4.76倍的30.32mg/L的最良好的骨化三醇的生产量，并在5％甲醇的情况下显示为，与对照组对比增加了约4倍的89.14mg/L的骨化二醇的生产量。
<实施例5>
在75L发酵槽中通过生物催化反应进行了活件维生素D3的骨化二醇和骨化三醇的生产
直到实施例4获得的反应条件为基本使用，并在75L发酵槽中进行了利用生物催化剂使羟基导入到维生素D3的骨化二醇和骨化三醇的生产试验。培养条件与实施例1相同，只有在规模上中间培养增加为2L液体培养液(在2.5L发酵槽内)，本培养使用了50L液体培养基(在75L发酵槽内)。HPLC分析与实施例1-2相同。
5天的ID9302的本培养结束后，配制生物催化剂的ID9302GAC后，在反应罐的75L发酵槽中放进包含7.5％甲醇为最终浓度的TSSMC缓冲液50L，其后使ID9302GAC溶解于反应缓冲液中，其后配制5％维生素溶液300ml后导入到维持平衡的生物催化反应体系中，然后以28℃、500rpm、1vvm的条件进行了10天的维生素D3的生物转化。从第3天开始10天之间，以HPLC分析了反应液，从而确认了骨化三醇和骨化二醇的生产率。
确认生产率结果，从生物催化反应第3天开始，骨化三醇的前体物质的骨化二醇开始了生产，在反应第4-5天中出现了骨化二醇的快速增长，同时正规的开始了骨化三醇的生成。在生物催化反应第7天中显示为，骨化三醇和骨化二醇的生产开始了快速增长，在生物催化反应第8天中显示为，38.1mg/L的骨化三醇的最高生产率，在反应第9天中显示为，109mg/L的骨化二醇的生产率。其与反应第3天相比时，在骨化三醇的情况下显示为38倍的生产率增长，在骨化二醇的情况下显示为，15倍的生产率增长。从最大生产往后的生物催化反应的第12天为止显示为，表示两个物质一同逐渐减少的模式(参照图5)。
因此，配制了利用ID9302的生物催化剂，从而在通过75L发酵槽的反应容器中使羟基导入到维生素D3的功能也被验证，同时可以确认提供良好的骨化三醇及骨化二醇的生产能力。
<实施例6>
金属物质对生物催化反应涉及的影响
在维生素D3中为了以骨化二醇和骨化三醇为生物转化，电子转移是重要的。如果在TSSM缓冲液中添加金属物质，由于从金属物质中出来的电子从而电子转移变多，因此酶的活性被增加，由此被视为生物转化率会增加。
以在实施例4中决定的生物催化反应条件为基本确认了，金属物质对生物催化反应涉及的影响和骨化二醇及骨化三醇的生产效果。
7.5％的甲醇追加包含的TSSM缓冲液生物催化反应条件中使表5的金属物质9种以0.01％、0.03％、0.06％导入进去，与实施例2的振荡反应相同的条件进行了实验，并在生物催化反应的第7天和第9天以与实施例1-2相同的方法进行了HPLC定量分析。
定量分析结果，在CuCl2，CuSO4，CoCl2，CoSO4的情况下与浓度无关生物催化反应不会容易形成，因此骨化三醇和骨化二醇的生产量显示为下降。在FeCl2和FeCl3中也没有骨化二醇和骨化三醇的生产量的增加。FeSO4在0.06％中与对照组对比增加了1.14倍的骨化三醇。
在MnCl2的情况下显示为，骨化二醇和骨化三醇的生产量在0.06％中被减少，骨化三醇的生产量在0.01％中与对照组对比增加了1.15倍的生产量。
在ZnSO4情况下，骨化三醇显示为在0.01％中与对照组类似的生产量，但是骨化二醇却显示为1.34倍的增加。骨化三醇的生产量显示为在0.06％中与对照组对比增加了1.3倍的效果(参照图6)。
通过上述结果，使几个金属物质导入生物催化反应中，从而显示增加了生物转化的效果，因此确认为增加骨化二醇和骨化三醇的生产量。
表5
金属物质对生物催化反应涉及的影响
<实施例7>
pH调节对生物催化反应涉及的影响
随着进行生物催化反应，反应液的pH则会不断地上升。使反应液的pH适当维持的情况下，为了确认对生物催化反应涉及的影响，利用5L发酵槽进行了生物催化反应。培养条件与实施例1相同，同时中间培养增加为140ml液体培养液，并在本培养中使用了3.5L液体培养基。反应条件以直到<实施例6>的条件为基本。
5天的ID9302的本培养结束后，配制生物催化剂的ID9302GAC后，在反应罐的5L发酵槽中放进0.03％的MnCl2导入的TSSM缓冲液(pH7.2)(以下称为TSSMM缓冲液)3.5L，其后使ID9302GAC再次溶解于反应缓冲中，并于28℃、500rpm、0.5vvm的条件维持了平衡状态。使3.5L反应液的0.02％和0.05％对应的维生素D3和β-环糊精溶解于52.5ml的甲醇中，并在反应起点中不断地导入了5天。此时，利用1N氢氧化钠和0.5N盐酸使pH维持在6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.0。生物催化剂的第6天，第8天，第10天的反应液以实施例1-2相同的方法进行了HPLC分析，从而确认了骨化二醇和骨化三醇的生产率。
结果，在pH为6.2中生物转化一概没有形成，从而骨化三醇及骨化二醇几乎没有生产。并且，在pH为6.6中也显示为非常低的骨化三醇和骨化二醇的生产量。在pH为7和7.4中显示为骨化三醇和骨化二醇的高生产量，在pH为7.0的情况下与对照组对比显示为1.15倍和1.16倍的骨化三醇和骨化二醇的生产率提高，并在pH为7.4的情况下显示为1.12倍和1.03倍的提高。在pH为7.8和pH为8.2中确认为骨化二醇和骨化三醇的生产量快速减少(参照图7及表6)。
通过以上的结果，在生物催化反应时适当的维持pH，从而可以看出骨化二醇和骨化三醇的生产量的增加，此时，使pH维持在7.0至7.4之间为好。
表6
pH调节对生产催化反应涉及的影响
<实施例8>
在75L发酵槽中根据金属化合物种类的骨化二醇和骨化三醇的生产率比较
以直到实施例7获得的反应条件为基本使用，在75L发酵槽中进行了利用生物催化剂使羟基导入维生素D3中的骨化二醇和骨化三醇的生产试验。培养条件与实施例1相同，只有规模上中间培养增加为2L液体培养液(在2.5L发酵槽内)，本培养在75L发酵槽中使用了50L液体培养基。
5天的ID9302的本培养结束后，配制生物催化剂的ID9302GAC后，在反应罐的75L发酵槽中放进TSSM缓冲液50L，其后使表5的金属化合物9种以0.01％、0.03％、0.06％导入进去。
使GAC再次溶解于反应缓冲液中，并以28℃、500rpm、0.5vvm维持了平行状态。使与50L反应液的0.02％和0.05％对应的维生素D3和β-环糊精溶解于750ml的甲醇中，其后在反应起点中不断导入了5天。
此时，利用1N氢氧化钠和0.5N盐酸使pH维持在7.0。生物催化10天之间与实施例1-2相同的方法使反应液进行了HPLC分析，从而确认了骨化三醇和骨化二醇的生产率。
结果，如表7所示，在CuCl2、CuSO4、CoCl2、CoSO4情况下与浓度无关生物催化反应不会容易形成，但是FeCl2、FeCl3、FeSO4在0.01％浓度中各个显示为53.12mg/L、60.8mg/L、62.42mg/L的骨化三醇生产量，ZnSO4在0.01％中显示为77.18mg/L的骨化三醇生产量。特别是，MnCl2在0.03％浓度中显示为90.12mg/L的骨化三醇生产量及166.87mg/L的骨化二醇生产量(参照图8)。
由此确认了包含FeCl2、FeCl3、FeSO4、ZnSO4及MnCl2的本发明的组合物显示良好的骨化三醇或骨化二醇生产率。
表7
根据金属化合物种类的骨化二醇及骨化三醇的生产量变化
<实施例9>
在75L发酵槽中根据有机溶剂种类的骨化三醇和骨化二醇的生产率比较
以直到实施例7获得的反应条件为基本使用，在75L发酵槽中进行了利用生物催化剂使羟基导入维生素D3中的骨化二醇和骨化三醇的生产实验。
培养条件与实施例8相同，5天的ID9302的本培养结束后配制了物催化剂的ID9302GAC，其后反应罐的75L发酵槽中放进以0.03％的MnCl2为最终浓度包含的TSSMC缓冲液50L，并使乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亚砜以在实施例4中显示最良好生产率的浓度各自导入了。
使GAC再次溶解于反应缓冲液中后配制10％维生素D3溶液300ml，其后导入维持平衡的生物催化反应体系中，并以28℃、500rpm、0.5vvm的条件进行了10天的维生素D3的生物转化。
此时，利用1N氢氧化钠和0.5N盐酸使pH维持在7.0。生物催化10天之间与实施例1-2相同的方法使反应液进行了HPLC分析，从而确认了骨化三醇和骨化二醇的生产率。
结果，如表8所示确认了，乙醇显示为48.45mg/L的骨化三醇生产量，丙酮和二甲基亚砜各个显示为74.87mg/L及70.85mg/L的骨化三醇生产量和156.37mg/L及141.81mg/L的骨化二醇生产量。特别是，在甲醇的情况下显示为90.12mg/L的骨化三醇生产量和166.87mg/L的骨化二醇生产量。
由此确认了包含甲醇、乙醇、丙酮及二甲基亚砜的本发明的组合物显示良好的骨化三醇或骨化二醇生产率。
表8
根据有机溶剂种类的固化生产及骨化二醇的生产量变化
<实施例10>
在75L发酵槽中通过生物催化反应进行了活性维生素D3的骨化二醇和骨化三醇的生产
以直到实施例9获得的反应条件为基本使用，并在75L发酵槽中进行了利用生物催化剂使羟基导入维生素D3中的骨化二醇和骨化三醇的生产试验。培养条件与实施例9相同。
5天的ID9302的本培养结束后配制生物催化剂的ID9302GAC，其后在反应罐的5L发酵槽中放进TSSMM缓冲液50L并使GAC再次溶解于反应缓冲中，并于28℃、500rpm、0.5vvm的条件维持了平衡状态。使0.02％的反应液50L和相当于0.05％的维生素D3和β-环糊精溶解于750ml甲醇中，并在反应起点中不断导入了5天。此时，利用1N氢氧化钠和0.5N盐酸使pH维持在7.0。从生物催化第1天开始第10天之间与实施例1-2相同的方法使反应液进行了HPLC分析，从而确认了骨化三醇和骨化二醇的生产率。
确认生产率结果，从生物催化反应第1天开始骨化三醇的前体物质的骨化二醇开始了生产，在反应第2-3天中出现了骨化二醇的快速增长同时正式开始了骨化二醇的生产。在生物催化反应第4天骨化二醇和骨化三醇的生产开始了快速增长，并在反应第7天确认了显示为91.23mg/L的骨化三醇的最高生产率和168.24mg/L的骨化二醇生产率。这与反应第1天相比较时，在骨化三醇的情况下显示为90倍的生产率增长，在骨化二醇的情况下显示为3倍的生产率增长。最大生产以后直到生物催化反应第10天显示为出现两个物质一同缓慢减少的模式(参照图9)。
因此，验证了配制利用ID9302的生物催化剂而用于75L的发酵槽的反应容器中也使羟基导入维生素D3中的能力，同时可以确认为提供良好的骨化三醇及骨化二醇的生产能力。
并且，根据本发明的方法以外在不影响生物催化酶的滴定度的范围内，通过增加基质的数量而可以确认增加最终产物的骨化三醇或骨化二醇的生产率的方法。
<实施例11>
从反应液进行活性维生素D3的分离
生物催化反应结束的反应液50L中添加1％的合成吸附剂SepabeadsSP850(三菱化学，日本)后以400rpm搅拌了1小时，从而使在反应液内的维生素D3及活性维生素D3吸附。利用多层过滤装置而筛选的细胞和SP850在25L丙酮中提取并于40℃以下进行了减压浓缩。
使浓缩液再次溶解于50％甲醇2L中后利用分别漏斗添加2L正己烷而进行了1次再提取。收集了提取物(顶部上，正己烷中的骨化二醇，维生素D3，可溶性杂质)。使提取物于40℃以下进行了减压浓缩，并以硅胶色谱柱进行分取。流动相是正己烷和乙酸乙酯为7∶3比例的化合物并以10ml/分的条件进行了分离。以维生素D3和骨化二醇的顺序进行了分取。维生素D3和骨化二醇为纯度90％以上并各自分离为18g和7.6g，从而这可以为用于骨化二醇生产的前体重复使用。
使1次再提取残留物(底部上，50％甲醇中的骨化三醇，水溶性杂质)以2L二氯甲烷进行了2次再提取，从而收集了去除水溶性杂质的骨化三醇提取物(底部上，二氯甲烷中的骨化三醇)。使提取物于40℃以下进行了减压浓缩并利用C-18ODS色谱柱分取了骨化三醇。流动相为75％甲醇并以10ml/分的条件进行了分取。骨化三醇的分取液于40℃以下进行减压浓缩并溶解于甲醇中，从而在YMC J’sphere ODS色谱柱中分离了骨化三醇的α形和β形。流动相以45％乙腈、230nm、15ml/分的条件进行分离，从而得到了纯度99％的白色结晶形的骨化三醇2.2g。
工业中的利用可能性
如上所述，本发明提供一种骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物和利用所述组合物的骨化三醇或骨化二醇的生产方法。本发明的制造方法具有如下优点：骨化三醇或骨化二醇的生产率高；因在非微生物培养体系中的酶素反应体系中进行生物转化，所以不需要维持无菌状态，并生物催化反应结束后进行分离精制时也比微生物培养法更干净的状态中进行分离精制，因此分离所需的费用低廉、品质良好。并且，本发明的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物具有提供骨化三醇或骨化二醇的优秀生产率的效果，因此在工业中利用可能性高。

Claims (7)

1.一种骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其特征在于，包含：
选自由FeCl2、FeCl3、FeSO4、MnCl2、及ZnSO4组成的群中的任一种金属化合物0.01至0.06﹪（w/v）；
选自由乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)组成的群中的任一种有机溶剂2.5至10﹪（w/v）；
环糊精0.25至1﹪（w/v）；
三（羟基甲基）氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)0.01至1﹪（w/v）
琥珀酸钠(sodium succinate)0.01至1﹪（w/v）；
氯化钠(sodium chloride)0.01至1﹪（w/v）；
氯化镁(magnesium chloride)0.001至0.5﹪（w/v）以及
剩余的水。
2.根据权利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其特征在于，所述金属化合物为0.01至0.03﹪（w/v），所述三（羟基甲基）氨基甲烷为0.12至0.61﹪（w/v），所述琥珀酸钠为0.16至0.8﹪（w/v），所述氯化钠为0.06至0.18﹪（w/v）以及所述氯化镁为0.006至0.05﹪（w/v）。
3.根据权利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其特征在于，所述金属化合物为MnCl2。
4.根据权利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物，其特征在于，所述环糊精为β-环糊精。
6.一种骨化三醇或骨化二醇的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）培养步骤，对假诺卡菌属自养小球藻进行培养；
（b）回收步骤，回收所述培养液中的菌体；以及
（c）混合步骤，对所述回收的菌体、维生素D3以及所述权利要求第1项至第5项之一的骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物进行混合。
7.根据权利要求6所述的骨化三醇或骨化二醇的生产方法，其特征在于，所述假诺卡菌属自养小球藻为以寄托号KCTC1029BP寄托给韩国生物科学研究院生物资源中心的假诺卡菌属自养小球藻ID9302。
CN200980150570.6A 2008-12-19 2009-12-10 骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法 Active CN102482687B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2008-0130707 2008-12-19
KR20080130707 2008-12-19
PCT/KR2009/007404 WO2010071327A2 (ko) 2008-12-19 2009-12-10 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102482687A CN102482687A (zh) 2012-05-30
CN102482687B true CN102482687B (zh) 2014-08-27

Family

ID=42269220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980150570.6A Active CN102482687B (zh) 2008-12-19 2009-12-10 骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8530205B2 (zh)
EP (1) EP2377942B1 (zh)
JP (1) JP5624555B2 (zh)
KR (1) KR101131071B1 (zh)
CN (1) CN102482687B (zh)
BR (1) BRPI0922462B8 (zh)
ES (1) ES2446668T3 (zh)
WO (1) WO2010071327A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365805B (zh) * 2017-05-12 2021-08-03 太原市威尔潞威科技发展有限公司 骨化二醇发酵的补料培养基、发酵的补料方法及其发酵方法
WO2019131940A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 多能性幹細胞凝集抑制剤
CN113736680A (zh) * 2020-05-30 2021-12-03 东莞市东阳光仿制药研发有限公司 一种自养假诺卡氏菌及其应用
CN114717271B (zh) * 2021-12-22 2023-07-04 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种氧化酶羟化合成骨化三醇的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100861181B1 (ko) * 2002-03-22 2008-09-30 일동제약주식회사 비타민 디쓰리를 생물전환하는 균주 및 이를 이용한칼시트리올 생산방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3201411B2 (ja) 1990-06-15 2001-08-20 メルシャン株式会社 ビタミンｄ類の生物学的製造方法
JP2000295999A (ja) * 1999-04-14 2000-10-24 Mercian Corp １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法
WO2000061776A1 (fr) * 1999-04-14 2000-10-19 Mercian Corporation Derives de vitamine d et procede de production correspondant
US20080138469A1 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Lallemand Usa, Inc. Novel vitamin D2 yeast preparation, a method for producing the same, and the use thereof
EP2130916B1 (en) * 2007-03-01 2015-09-02 MicroBiopharm Japan Co., Ltd. E. coli capable of expressing cytochrome p-450, and bioconversion method using the same
ES2426640T3 (es) * 2007-03-01 2013-10-24 Microbiopharm Japan Co., Ltd. Cepa transformada derivada de una cepa deficiente en proteína de eflujo multifármaco y método de bioconversión utilizando la misma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100861181B1 (ko) * 2002-03-22 2008-09-30 일동제약주식회사 비타민 디쓰리를 생물전환하는 균주 및 이를 이용한칼시트리올 생산방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
利用微生物转化维生素D3的研究;郑东虎等;《科技通报》;20041231;第20卷(第2期);109-111 *
郑东虎等.利用微生物转化维生素D3的研究.《科技通报》.2004,第20卷(第2期),109-111.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010071327A2 (ko) 2010-06-24
EP2377942A4 (en) 2012-12-05
BRPI0922462B1 (pt) 2020-09-15
KR101131071B1 (ko) 2012-03-30
EP2377942A2 (en) 2011-10-19
BRPI0922462A2 (pt) 2015-08-18
JP5624555B2 (ja) 2014-11-12
EP2377942B1 (en) 2013-11-20
ES2446668T3 (es) 2014-03-10
JP2012512648A (ja) 2012-06-07
US20120064584A1 (en) 2012-03-15
US8530205B2 (en) 2013-09-10
WO2010071327A3 (ko) 2010-09-23
KR20100071908A (ko) 2010-06-29
BRPI0922462B8 (pt) 2021-05-25
CN102482687A (zh) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hummel Large-scale applications of NAD (P)-dependent oxidoreductases: recent developments
Pyser et al. State-of-the-art biocatalysis
Jeya et al. Isolation of a novel high erythritol-producing Pseudozyma tsukubaensis and scale-up of erythritol fermentation to industrial level
WO2009031766A3 (en) Mutants having capability to produce 1,4-butanediol and method for preparing 1,4-butanediol using the same
Gong et al. Bio-resolution of a chiral epoxide using whole cells of Bacillus megaterium ECU1001 in a biphasic system
CN104911224B (zh) 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法
CN102482687B (zh) 骨化三醇或骨化二醇的生产促进用缓冲液组合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的制造方法
CN104893989B (zh) 小孢根霉须状变种zjph1308及在制备西他列汀中间体中的应用
CN105543186B (zh) 一种醇脱氢酶lc3及其基因和应用
CN112126610A (zh) 一种用于生产羟基酪醇的工程菌
CN101535467A (zh) 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法
de Gonzalo et al. Multienzymatic processes involving Baeyer–Villiger monooxygenases
Josa-Culleré et al. Synthetic biomimetic coenzymes and alcohol dehydrogenases for asymmetric catalysis
He et al. High-concentration COD wastewater treatment with simultaneous removal of nitrogen and phosphorus by a novel Candida tropicalis strain: Removal capability and mechanism
CN102321678A (zh) 一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法
Zhou et al. Deep sequencing of the Sanghuangporus vaninii transcriptome reveals dynamic landscapes of candidate genes involved in the biosynthesis of active compounds
Zhang et al. Efficient one-step production of (S)-1-phenyl-1, 2-ethanediol from (R)-enantiomer plus NAD+–NADPH in-situ regeneration using engineered Escherichia coli
CN107586793A (zh) 制备具有多个手性中心的醇化合物的方法
CN110527650A (zh) 一种假诺卡氏菌及其应用
JP2010532992A (ja) ３，４−エポキシ酪酸エチルの微生物速度論的分割
CN108753851A (zh) 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物
Nagaoka Ability of different biomaterials to enantioselectively catalyze oxidation and reduction reactions
Erdélyi et al. Process development of methylenedioxyphenyl-acetone chiral bioreduction
Truppo et al. A novel resolution of a pharmaceutically important bridged bicyclic ketone intermediate via selective enzymatic reduction with a commercially available ketoreductase
Wilson et al. Industrial microbiology

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Seoul, South Korea

Patentee after: Il-Dong Pharm. Co., Ltd.

Address before: Seoul, South Korea

Patentee before: Ildong Pharmaceutical Co., Ltd.