WO2010071327A2 - 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법 - Google Patents

칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법 Download PDF

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    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Definitions

  • the present invention relates to a buffer composition for promoting the production of calcitriol or calcifediol and a method for producing calcitriol or calcifediol using the same. More specifically, a metal compound, an organic solvent, a cyclodextrin, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and succinic acid It relates to a buffer composition for promoting the production of calcitriol or calcifediol consisting of sodium chloride, sodium chloride, magnesium chloride and water, and a method for producing calcitriol or calcifediol using the same.
  • Calcitriol is widely used to treat osteoporosis, a representative senile disease, and calcifediol, an active vitamin D3, is used to treat osteomalacia and the like.
  • Calcitriol produced by two hydroxylations of vitamin D3 in the liver and kidney, can be administered simply by oral administration as a biological substance, and physiologically promotes the absorption of calcium and phosphorus from the gastrointestinal tract and kidneys to treat osteoporosis. Is known to be excellent.
  • Calcitriol has also been used to treat rickets, osteomalacia, hypothyroidism, chronic renal failure, nephrotic dystrophy in hemodialysis patients, and skin psoriasis.
  • the separation cost may be excessively calculated due to the difficulty of separation and purification due to impurities. Since only certain substances should be separated and purified throughout the culture, the size of the separated purification should be large and the cost will increase proportionally.
  • the present inventors studied the whole-cell biocatalytic reaction method rather than the fermentation method as a bioconversion method, and the microorganism Pseudonocardia autotrophica ID9302 according to the present invention The present invention was completed by confirming that there is a biocatalyst function of producing calcitriol and calcifediol and significantly increasing calcitriol and calcifediol productivity.
  • an object of the present invention is 0.01 to 0.3% (w / v) of at least one metal compound selected from the group consisting of FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4 , MnCl 2 , and ZnSO 4 , ethanol, methanol, acetone and dimethyl sulfoxide ( 1 to 10% (w / v) of organic solvent selected from the group consisting of Dimethyl Sulfoxide (DMSO), 0.1 to 5% (w / v) of cyclodextrin, Tris (hydroxymethyl) aminomethane ) 0.01 to 1% (w / v), sodium succinate 0.01 to 1% (w / v), sodium chloride 0.01 to 1% (w / v), magnesium chloride It is to provide a buffer composition for promoting the production of calcitriol or calcifediol consisting of 0.001 to 0.5% (w / v) and the residual amount of water.
  • DMSO Dimethyl Sulfoxide
  • Another object of the present invention is the step of culturing Pseudonocardia autotrophica, recovering the cells from the culture medium, and mixing the recovered cells, vitamin D3 and the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition It provides a calcitriol or calcifediol production method comprising a.
  • the present invention is FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4 , MnCl 2 , ZnSO 4
  • One or more metal compounds selected from the group consisting of 0.01 to 0.3% (w / v), ethanol, methanol, 1 to 10% (w / v) of at least one organic solvent selected from the group consisting of acetone and dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.1 to 5% (w / v) of cyclodextrin, tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) 0.01 to 1% (w / v), sodium succinate 0.01 to 1% (w / v), sodium chloride 0.01 to 1% (w / v), It provides a buffer composition for promoting the production of calcitriol or calcifediol consisting of magnesium chloride 0.001 to 0.5% (w / v) and the balance of water.
  • the present invention provides a method for culturing Pseudonocardia autotrophica, recovering cells from the culture medium, and promoting the production of the recovered cells, vitamin D3 and the calcitriol or calcifediol. It provides a method for producing calcitriol or calcifediol comprising the step of mixing the buffer composition for.
  • composition of the present invention is a metal compound, organic solvent, cyclodextrin, tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris (hydroxymethyl) aminomethane), sodium succinate, sodium chloride, magnesium chloride (magnesium chloride) ) And water.
  • the composition of the present invention is based on tris (hydroxymethyl) aminomethane, sodium succinate, sodium chloride and magnesium chloride to create an environment in which cells can be stably survived.
  • Tris (hydroxymethyl) aminomethane, sodium succinate, sodium chloride and magnesium chloride of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the production promoting effect of calcitriol or calcifediol of the composition of the present invention.
  • tris (hydroxymethyl) aminomethane is at a concentration of 0.01 to 1% (w / v), sodium succinate at a concentration of 0.01 to 1% (w / v), and 0.01 to 1 at a concentration of sodium chloride.
  • magnesium chloride may be added at a concentration of 0.001 to 0.5% (w / v) and most preferably tris (hydroxymethyl) aminomethane at a concentration of 0.12 to 0.61% (w / v)
  • Sodium succinate is added at a concentration of 0.16 to 0.8% (w / v)
  • sodium chloride at a concentration of 0.06 to 0.18% (w / v)
  • magnesium chloride at a concentration of 0.006 to 0.05% (w / v).
  • the cyclodextrin of the present invention is a ring-shaped non-reducing sugar in which several glucose molecules are bound to ⁇ -1,4, thereby forming a host-guest inclusion complex due to the lipophilic inside and the hydrophilic outside to stabilize the substrate vitamin D3 in the buffer. Let's do it.
  • the cyclodextrin of the present invention may be ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, or methyl- ⁇ -cyclodextrin, most preferably ⁇ -cyclodextrin.
  • the concentration of the cyclodextrin of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the effect of promoting the production of calcitriol or calcifediol of the composition of the present invention, but preferably 0.1 to 5% (w / v), and more. Preferably 0.25 to 1% (w / v).
  • the organic solvent of the present invention increases the solubility of a substrate that is poorly soluble.
  • the organic solvent of the present invention may be ethanol, methanol, acetone or dimethyl sulfoxide (DMSO), and most preferably methanol.
  • the concentration of the organic solvent of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the production promoting effect of calcitriol or calcifediol of the composition of the present invention, but preferably 1 to 10% (w / v), and more. Preferably from 2.5 to 10% (w / v).
  • the metal compound of the present invention increases the efficiency of converting the substrate into calcitriol or calcifediol by activating electron transfer.
  • the metal compound of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the effect of promoting the production of calcitriol or calcifediol of the composition of the present invention and generates metal ions, but preferably FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4 , MnCl 2 Or ZnSO 4 and most preferably MnCl 2 .
  • the concentration of the metal compound of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the production promoting effect of calcitriol or calcifediol of the composition of the present invention, but preferably 0.01 to 0.3% (w / v) and more Preferably 0.01 to 0.03% (w / v).
  • the buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production of the present invention is excellent in promoting the production of calcitriol or calcifediol.
  • the method for producing calcitriol or calcifediol of the present invention includes the steps of: (a) culturing Pseudonocardia autotrophica, (b) recovering the cells from the culture solution, (c) the recovered cells, vitamin D3, and the present invention. It characterized in that it comprises the step of mixing the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition of the invention.
  • step (a) Pseudonocardia autotrophica is cultured.
  • a microbial inoculation and culturing method that is commonly used may be used. Inoculation is carried out by adding a suitable amount of Pseudonocardia autotrophica precultured to the culture medium so that Pseudonocardia autotrophica can be sufficiently grown under culture conditions.
  • the amount of pseudonocardia autotrophica to be inoculated may be added to the culture medium by about 1 to 5% (v / v) of the precultured pseudonocardia autotrophica culture medium.
  • Cultivation of pseudonocardia autotrophica may be performed according to the culture medium and culture conditions known in the art. This process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Such various methods are disclosed in various documents (eg, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions). Suspension cultures and adherent cultures are classified into batch, fed-batch and continuous cultures according to the culture method.
  • the culture medium may be a medium consisting of a carbon source, nitrogen source, vitamins and minerals.
  • Available as the carbon source in the medium for the production of the culture of the present invention is at least one selected from the group consisting of glucose, sucrose, maltose, fructose, lactose, xylose, galactose, arabinose and combinations thereof, More preferably glucose.
  • the nitrogen source available in the culture medium for producing a culture of the present invention is one selected from the group consisting of yeast extract, soytone, peptone, bee extract, tryptone, cachetone and combinations thereof The above is more preferable, and it is a yeast extract.
  • the pseudonocardia autotrophica of step (a) may be any kind of microorganism of the same kind, and the range includes all subspecies or variants of the pseudonocardia autotrophica species. Preferably, it may be Pseudonocardia autotrophica ID9302.
  • Pseudonocardia autotrophica ID9302 a biocatalyst according to the present invention, has been deposited with the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC) on June 7, 2001 (accession number: KCTC 1029BP).
  • the cells are recovered from the culture solution.
  • the cell recovery method of the present invention can be used without limitation as long as the cell recovery method commonly used to recover the cells in a live state.
  • it may be a centrifugation method.
  • the recovered cells may be washed with a buffer to remove nutrients in the culture medium, and the washing buffer may be preferably a buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production of the present invention.
  • step (c) the recovered cells, vitamin D3, and a buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production of the present invention are mixed.
  • step (c) the recovered cells are released to the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition of the present invention to perform a function of converting the substrate vitamin D3 into calcitriol or calcifediol.
  • step (c) may be carried out by any order or method as long as calcitriol or calcifediol is produced by the production method of the present invention, for example, after dissolving vitamin D3 in a known solvent first, recovering the same.
  • Mixed with the calcitriol or calcifediol production-promoting buffer composition of the present invention, or the substance which promotes the production of the calcitriol or calcifediol of the present invention is first dissolved in a known solvent together with vitamin D3, and then The recovered cells can be mixed with the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition of the present invention.
  • Any solvent may be used as long as it helps dissolution of the known vitamin D3, and may be, for example, methanol, ethanol, acetone, DMSO, or a mixture thereof, and a substance for promoting the production of calcitriol or calcifediol of the present invention may be used.
  • a substance for promoting the production of calcitriol or calcifediol of the present invention may be used.
  • cyclodextrin, cremophore, polyethylene glycol, dipropylene glycol, tween 85, tween 80 or PEG 300 for example cyclodextrin, cremophore, polyethylene glycol, dipropylene glycol, tween 85, tween 80 or PEG 300.
  • the vitamin D3 may be administered in an amount to be reacted all at once, divided into several times, or continuously administered while maintaining a constant concentration of vitamin D3 in the mixture.
  • the mixed state may be sustained in various ways in consideration of the efficiency of converting vitamin D3 to calcitriol or calcifediol of the present invention and the viability of the cells by the recovered cells, preferably 4 days to 10 days.
  • TSSM buffer was used as a basic buffer to increase the productivity of calcitriol and calcifediol.
  • the cyclodextrin was confirmed to increase the yield of calcitriol and calcifediol, in particular, it was confirmed that the production yield is increased when the ⁇ -cyclodextrin is added (see Example 2).
  • calcitriol and calcifediol productivity change was measured by adding various organic solvents by concentration.
  • calcitriol and calcifediol productivity changes were measured by adding various metal compounds at different concentrations.
  • the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition of the present invention determined by the above process was mass-produced calcitriol or calcifediol in a 75L fermentor by variously adjusting the organic solvent and the metal compound.
  • the calcitriol or calcifediol production promoting buffer composition of the present invention FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4
  • MnCl 2 showed a yield of calcitriol of 90.12 mg / L and calcifediol of 166.87 mg / L at a concentration of 0.03% (see Example 8).
  • the composition containing FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4 , ZnSO 4 and MnCl 2 of the present invention showed excellent calcitriol or calcifediol production rate.
  • calcitriol and calcifediol according to the calcitriol or calcifediol production method of the present invention in a 75L fermentation tank using the buffer composition for promoting the production of calcitriol or calcifediol of the present invention determined by the above process Produced and purified separately.
  • reaction was recovered to remove the cells and then vitamin D3, calcifediol and calcitriol was separated and purified.
  • the calcitriol or calcifediol-promoting buffer composition or production method of the present invention removes the culture medium and reacts the vitamin D3 with the cells in the buffer state so that other metabolites occurring in the culture environment are less likely to occur, and thus, the desired target.
  • the yield of bioconversion into a substance is high, and the generation of impurities is very low, resulting in high efficiency of separation and purification, resulting in higher quality of raw materials and a lower cost of separation and purification.
  • the present invention provides a buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production and a calcitriol or calcifediol production method using the composition. Since the production method of the present invention has a high yield of calcitriol or calcifediol and proceeds to bioconversion in an enzymatic reaction system rather than a microbial culture system, it is not necessary to maintain sterility and is more clean than the microbial culture method even after separation and purification of the biocatalyst reaction. Since separation purification starts at, the cost of separation and the quality are excellent.
  • the buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production of the present invention has the effect of providing excellent productivity of calcitriol and calcifediol.
  • 1 is a diagram comparing a process of producing calcitriol from organic synthesis from cholesterol and a process of producing calcitriol from vitamin D3 by a biocatalyst.
  • FIG. 2 is a graph of the effect of cyclodextrin on biocatalytic reaction to bioconvert vitamin D3 to produce calcifediol and calcitriol (number d: time period after start of reaction).
  • 3 is a graph in which specific organic solvents affect biocatalytic reactions to bioconvert vitamin D3 to produce calcifediol and calcitriol.
  • FIG. 5 is a graph showing the production of active vitamin D3 derivatives from vitamin D3 through biocatalytic reaction in 75 L fermentation tank (number d: period after start of reaction).
  • FIG. 6 is a graph in which metal compounds affect biocatalytic reactions to bioconvert vitamin D3 to produce calcifediol and calcitriol (D number: days after start of reaction).
  • Figure 7 is a graph showing the productivity of calcifediol and calcitriol when the pH is maintained constant in the biocatalytic reaction (D number: days after the start of the reaction).
  • FIG. 9 is a graph showing the production of active vitamin D3 calcifediol and calcitriol from vitamin D3 through a biocatalytic reaction in a 75L fermentation tank (D number: days after start of reaction).
  • the biocatalyst, GAC growth-arrested cells
  • GAC growth-arrested cells
  • Pseudonocardia autotrophica ID9302 (hereinafter referred to as 'ID9302') strains for use as a biocatalyst for the production of calcifediol and calcitriol of the present invention, medium (dry yeast 0.4%, 1% glucose, 1% starch, 1% fish meal, 0.2% sodium chloride, 0.01% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% beef x 0.1%, 0.01% sodium fluoride and 0.2% calcium carbonate, sterilized liquid medium at pH 7.0) and centrifuged After separating and recovering only the cells, each was washed with a biocatalyst reaction buffer (see Table 1) to be used in the following experiment to completely remove nutrients from the culture and to grow-arrested cells (GAC) for the biocatalyst reaction to be performed in the next step. (Hereinafter referred to as 'ID9302 GAC').
  • various buffers such as [Table 1]
  • 300 ⁇ l of 5% vitamin D3 solution in ethanol
  • TSSM buffer 25mM Trisma base, Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 25mM sodium succinate, 20mM sodium chloride, 4mM magnesium chloride
  • ID9302 was found to have the highest biocatalyst ability to introduce hydroxyl groups into vitamin D3.
  • Maleate buffer was also less than 1.65mg / L calcitriol productivity shown in TSSM buffer, but it was confirmed to be a relatively good buffer for biocatalyst of ID9302.
  • TSSM buffer is composed of trisma base with excellent buffering effect of pH, NaCl with excellent ionic strength, sodium succinate that contributes to metabolic activity, magnesium ion, a cofactor of p450 hydroxylase, etc.
  • TSSM buffer was determined as a buffer for biocatalytic reaction in p450 hydroxylase reaction system.
  • Bioconversion test was carried out under the same conditions as the biocatalyst reaction conditions determined in Example 1. Add ID9302 GAC biocatalyst to 50ml TSSM buffer, add various cyclodextrins at 0.25%, 0.5%, and 1% concentrations, and add 300 ⁇ l of 5% vitamin D3 ethanol solution to the Erlenmeyer flask and shake for 9 days. Bioconversion test was conducted. On 5th, 7th and 9th days, 3 ml of the reaction sample was taken, and extraction, concentration, and HPLC analysis were performed in the same manner as in Example 1-2.
  • M-CD methyl- ⁇ -cyclodextrin
  • Example 1 Based on the biocatalytic reaction conditions determined in Example 1, the effects of the organic solvent on the biocatalytic reaction and the production effects of calcitriol and calcifediol were confirmed.
  • Four organic solvents of [Table 3] were administered to the biocatalyst reaction conditions of Example 1 such that the final concentrations were 2.5%, 5%, 10%, 20%, and 30%, respectively. The experiment was carried out and the reaction was terminated on the 8th day of the biocatalyst reaction and quantitatively analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1-2.
  • Acetone and dimethyl sulfoxide (DMSO) showed a 2 ⁇ 2.5-fold increase in calcitriol and a 5.5-6.5-fold increase in calcifediol compared to the control.
  • the organic solvent was added to the biocatalytic reaction buffer at a concentration of 2.5% to 10%, and the effect on the bioconversion yield according to the mixing of the cyclodextrin and the organic solvent. It was confirmed. GAC preparation, shaking conditions and HPLC analysis were the same as in Example 1.
  • Example 3 In the case of methanol, calcitriol production yield according to cyclodextrin mixing was found to be the highest as in Example 3. In case of methanol, the productivity of calcitriol and calcifediol was increased at 2.5% concentration, and the yield of calcitriol production was increased by 4.76 times compared to the control at 7.5% concentration. In the case of acetone, the yield of calcitriol was increased about 2 times at 10% concentration, and in the case of DMSO, the yield of calcitriol was 2.88 times higher than that of the control at 5%. In addition, in case of ethanol, the production of calcitriol in Example 3 showed no increase in the productivity of 1.4-fold calcitriol and 3.8-fold calcifediol compared to the control at 5% concentration.
  • Example 4 Based on the reaction conditions secured up to Example 4, a calcifediol and calcitriol production test in which hydroxyl groups were introduced into vitamin D3 using a biocatalyst in a 75L fermenter were performed. Culture conditions were the same as in Example 1, the scale-only intermediate culture was increased to 2L liquid culture medium (in 2.5L fermenter) and the culture was used 50L liquid medium (in 75L fermenter). HPLC analysis is the same as in Example 1-2.
  • the biocatalyst ID9302 GAC was prepared, and then 50L TSSMC buffer containing 7.5% methanol at the final concentration was added to a 75L fermenter, and the ID9302 GAC was repeated in the reaction buffer and 300ml of 5% vitamin solution.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC for 3 to 10 days to confirm the productivity of calcitriol and calcifediol.
  • Electron transfer is important for bioconversion from vitamin D3 to calcifediol and calcitriol.
  • the addition of metals to the TSSMC buffer increases the electron transfer to electrons from the metals, which increases the activity of the enzymes and increases the bioconversion rate.
  • TSSMC buffer biocatalytic reaction containing 7.5% of methanol was added to the 9 kinds of metals in Table 5 to 0.01%, 0.03%, 0.06%, and the experiment was carried out under the same conditions as in the shaking reaction of Example 2.
  • HPLC was quantitatively analyzed on the 7th and 9th days of the biocatalyst reaction in the same manner as in Example 1-2.
  • the yield of calcifediol and calcitriol decreased in 0.06% of MnCl 2 , and the yield of calcitriol increased by 1.15 times in 0.01% compared to the control. At 0.03% concentration, the yield of calcitriol increased 1.83 times and that of calcifediol increased 1.52 times. It showed the best increase of production yield among metal materials.
  • the pH of the reaction solution continuously increases.
  • the biocatalyst was reacted using a 5L fermenter to confirm the effect on the biocatalyst reaction.
  • Culture conditions were the same as in Example 1, the intermediate culture was increased to 140ml liquid culture medium and 3.5L liquid medium was used as the main culture. Reaction conditions were based on the conditions until ⁇ Example 6>.
  • ID9302 GAC was prepared as a biocatalyst, and 3.5L of TSSM buffer (pH 7.2) (hereinafter referred to as TSSMM buffer) containing 0.03% of MnCl 2 was added to a 5L fermentation tank. The solution was again dissolved in the reaction buffer, and the equilibrium was maintained at 28 ° C., 500 rpm and 0.5 vvm. Vitamin D3 and ⁇ -cyclodextrin, corresponding to 0.02% and 0.05% of the 3.5L reaction solution, were dissolved in 52.5ml of methanol and continuously administered for 5 days at the beginning of the reaction.
  • TSSMM buffer TSSM buffer
  • the pH was maintained at 6.2, 6.6, 7.0, 7.4, 7.8, 8.0 using 1N NaOH and 0.5N HCl.
  • the reaction solution of the 6, 8 and 10 days of the biocatalyst was analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1-2 to confirm the productivity of calcifediol and calcitriol.
  • the yield of calcifediol and calcitriol could be increased by keeping the pH constant during the biocatalyst reaction, and the pH was preferably maintained between 7.0 and 7.4.
  • Calcifediol and calcitriol production tests were carried out using a biocatalyst in a 75L fermentor, introducing hydroxyl groups into vitamin D3, using the reaction conditions secured up to Example 7 as a basis.
  • Culture conditions were the same as in Example 1, the scale-only intermediate culture was increased to 2L liquid culture medium and the culture was incubated using 50L liquid medium in a 75L fermenter.
  • the biocatalyst ID9302 GAC was prepared, and 50L TSSM buffer was added to a 75L fermentation tank, and the 9 metal compounds of Table 5 were administered to 0.01%, 0.03%, and 0.06%.
  • the GAC was again unloaded into the reaction buffer and equilibrated at 28 ° C., 500 rpm, 0.5 vvm.
  • Example 1-2 the pH was maintained at 7.0 using 1N NaOH and 0.5N HCl.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1-2 for 10 days of the biocatalyst to confirm the productivity of calcitriol and calcifediol.
  • composition containing FeCl 2 , FeCl 3 , FeSO 4 , ZnSO 4 and MnCl 2 of the present invention showed excellent calcitriol or calcifediol production rate.
  • Calcifediol and calcitriol production tests were carried out using a biocatalyst in a 75L fermentor, introducing hydroxyl groups into vitamin D3, using the reaction conditions secured up to Example 7 as a basis.
  • the GAC was re-dissolved in the reaction buffer, and 300 ml of 10% vitamin D3 solution was prepared and added to a biocatalytic reaction system in equilibrium to perform bioconversion of vitamin D3 for 10 days under conditions of 28 ° C., 500 rpm, and 0.5 vmv.
  • Example 1-2 the pH was maintained at 7.0 using 1N NaOH and 0.5N HCl.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1-2 for 10 days of the biocatalyst to confirm the productivity of calcitriol and calcifediol.
  • ethanol showed 48.45mg / L calcitriol production yield
  • acetone and DMSO showed 74.87mg / L and 70.85mg / L calcitriol production yield and 156.37mg / L and 141.81mg, respectively. It was confirmed that the yield of calcifediol production of / L.
  • methanol produced 90.12 mg / L of calcitriol and 166.87 mg / L of calcifediol.
  • composition comprising methanol, ethanol, acetone and DMSO of the present invention showed excellent calcitriol or calcifediol production rate.
  • Example 9 Based on the reaction conditions secured up to Example 9, a calcifediol and calcitriol production test were conducted in which a hydroxyl group was introduced into vitamin D3 using a biocatalyst in a 75L fermenter. Culture conditions are the same as in Example 9.
  • ID9302 GAC was prepared as a biocatalyst, and then 50L TSSMM buffer was added to a 75L fermenter, and the GAC was unloaded in the reaction buffer, and the equilibrium was maintained at 28 ° C, 500rpm, and 0.5vvm.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1-2 for 1 to 10 days of the biocatalyst to confirm the productivity of calcitriol and calcifediol.
  • the concentrate was re-dissolved in 2 L of 50% methanol and re-extracted by adding 2 L hexane using a separatory funnel. Extracts (upper phase, calcifediol in hexanes, vitamin D3, fat soluble impurities) were collected. The extract was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. or below, and fractionated with silica gel column. The mobile phase was a mixture of hexane and ethyl acetate 7: 3 ratio and separated under conditions of 10 ml / min. Aliquots were taken in the order of vitamin D3 and calcifediol. Vitamin D3 and calcifediol were more than 90% pure and separated 18g and 7.6g respectively, which could be reused as precursors for calcitriol production.
  • the primary reextract residue (bottom phase, calcitriol in 50% methanol, water soluble impurities) was secondarily reextracted with 2 L dichloromethane to remove the calcitriol extract (bottom phase, calcitriol in dichloromethane) from which the water soluble impurities were removed. .
  • the extract was concentrated under reduced pressure below 40 °C, and calcitriol was fractionated using a C-18 ODS column.
  • the mobile phase is 75% methanol and aliquoted at 10 ml / min.
  • Calcitriol aliquots were concentrated under reduced pressure below 40 ° C, dissolved in methanol, and the ⁇ and ⁇ forms of calcitriol were separated from the YMC J'sphere ODS column.
  • Mobile phase was separated under the conditions of 45% acetonitrile, 230 nm and 15 ml / min to obtain 2.2 g of white crystalline calcitriol having a purity of 99%.
  • the present invention provides a buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production and a calcitriol or calcifediol production method using the composition. Since the production method of the present invention has a high yield of calcitriol or calcifediol and proceeds to bioconversion in an enzymatic reaction system rather than a microbial culture system, it is not necessary to maintain sterility and is more clean than the microbial culture method even after separation and purification of the biocatalyst reaction. Since separation purification starts at, the cost of separation and the quality are excellent.
  • the buffer composition for promoting calcitriol or calcifediol production of the present invention has the effect of providing excellent productivity of calcitriol and calcifediol is highly industrially applicable.

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Abstract

본 발명은 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 금속화합물, 유기용제, 사이클로덱스트린, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 숙신산염 나트륨, 염화 나트륨, 염화 마그네슘(magnesium chloride) 및 물로 이루어진 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산방법은 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산수율이 높으며 미생물 배양 계가 아닌 효소반응 계에서 생물전환을 진행하므로, 무균 유지가 필요 없으며 생물촉매 반응이 종료된 후에 분리정제에도 미생물 배양법보다 더욱 깨끗한 상태에서 분리정제를 시작하기 때문에 분리에 소요되는 비용이 저렴하고 품질은 우수한 장점이 있다. 또한 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물은 칼시트리올 및 칼시페디올의 탁월한 생산성을 제공하는 효과가 있다.

Description

칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법
본 출원은 2008년 12월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2008-0130707호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 금속화합물, 유기용제, 사이클로덱스트린, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 숙신산염 나트륨, 염화 나트륨, 염화 마그네슘(magnesium chloride) 및 물로 이루어진 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물 및 이를 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법에 관한 것이다.
칼시트리올은 대표적인 노인성 질환인 골다공증을 치료하는 데 많이 사용되고 있으며, 활성형 비타민 D3인 칼시페디올은 골연화증 등의 치료에 사용되고 있다. 간과 신장에서 비타민 D3이 각각 두 번의 하이드록실화에 의해 생성되는 칼시트리올은 생체 내 물질로써 경구투여로 간단히 투약이 가능하며, 생리학적으로 위장 기관과 신장으로부터 칼슘과 인의 흡수를 촉진시켜 골다공증의 치료효과가 우수한 것으로 알려져 있다.
칼시트리올은 또한 구루병, 골연화증, 부갑상선 기능저하증, 만성신부전증, 혈액투석환자의 신성골이영양증, 피부 건선증의 치료에도 사용되고 있으며 최근에는 전립선암이나 혈액암 치료 효과도 많이 보고되고 있다.
칼시트리올 또는 칼시페디올을 제조하는 종래의 방법에는 유기화학 합성법과 미생물 발효에 의한 생산방법이 알려져 있다. 유기화학 합성법은 화학구조상의 stereospecificity와 regiospecificity를 고려하고 탄소원 1번 또는 25번 위치에 선택적으로 하이드록시기를 도입해야 하므로 고난이도의 기술과 고가의 반응과정이 요구되는 단점이 있으며, 이러한 단점을 개선한 미생물 발효에 의한 생물전환 생산 방법이 개발되었다. 미생물에 의한 생물전환반응은 stereospecific하고 regiospecific하다는 것이 이미 입증되어 있다. 따라서 활성형 비타민 D3 생산방법을 기존의 유기합성법으로부터 미생물의 수산화 기능을 이용하는 생물전환에 의한 경제적인 방법으로 대체할 수 있다.
그러나 기존의 미생물 발효에 의한 생물전환 방법은 아래와 같은 몇 가지의 단점이 발견되었다.
첫째, 미생물 배양에 의한 생산 방법이기 때문에 오염의 가능성이 있으며 생산 규모가 커질수록 그 가능성은 커진다. 특히 배양기간이 길어질수록 오염의 노출은 심해지고 이러한 오염은 본배양과 동시에 투여하는 비타민 D3의 투여 후에 발생하는 것이기 때문에 오염과 동시에 전구체의 비용이 소실이 되는 것이다. 둘째, 발효에 의한 생물전환은 생산 수율의 변화 폭이 크게 나타날 수 있다. 이는 미생물 특유의 배양 민감도에 따른 것이기 때문에 어쩔 수 없는 사항이기도 하며, 이 때문에 배양실 내부는 어느 정도 일정한 조건의 항상성 유지가 요구된다. 셋째, 이에 따른 생산 시설의 전반적인 유지 관리 비용이 증가한다. 넷째, 이미 최댓값에 도달한 생산성으로 더 이상의 향상이 없는 정체 상태이기 때문에 가장 높은 경쟁력을 보유했다고 보기 어렵다. 다섯째, 불순물에 따른 분리정제의 어려움으로 인하여 분리비용이 과다하게 산출될 수 있다. 배양액 전체에서 특정 물질만을 분리정제해야 하기 때문에 분리정제 규모도 커야 하며 비용도 비례하여 증가할 것이다.
따라서 이러한 단점을 극복하여 순도 높은 칼시트리올 또는 칼시페디올을 높은 수율로 생산할 수 있는 새로운 생산방법의 개발이 시급한 상황이다.
이러한 발효에 의한 생산방법의 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 생물전환 방법으로써 발효적 방법이 아닌 whole-cell 생물촉매 반응 방법을 연구하였고 본 발명에 따른 미생물인 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302가 칼시트리올과 칼시페디올을 생산하는 생물촉매 기능이 있음을 확인하고 칼시트리올과 칼시페디올 생산력을 월등히 증가시키는 버퍼 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 FeCl2, FeCl3, FeSO4, MnCl2, 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속화합물 0.01 내지 0.3%(w/v), 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용제 1 내지 10%(w/v), 사이클로덱스트린 0.1 내지 5%(w/v), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 0.01 내지 1%(w/v), 숙신산염 나트륨(sodium succinate) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 나트륨(sodium chloride) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 마그네슘(magnesium chloride) 0.001 내지 0.5%(w/v) 및 잔량의 물로 이루어진 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양하는 단계, 상기 배양액에서 균체를 회수하는 단계, 및 상기 회수된 균체, 비타민 D3 및 상기 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FeCl2, FeCl3, FeSO4, MnCl2, 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속화합물 0.01 내지 0.3%(w/v), 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용제 1 내지 10%(w/v), 사이클로덱스트린 0.1 내지 5%(w/v), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 0.01 내지 1%(w/v), 숙신산염 나트륨(sodium succinate) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 나트륨(sodium chloride) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 마그네슘(magnesium chloride) 0.001 내지 0.5%(w/v) 및 잔량의 물로 이루어진 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양하는 단계, 상기 배양액에서 균체를 회수하는 단계, 및 상기 회수된 균체, 비타민 D3 및 상기 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 조성물은 금속화합물, 유기용제, 사이클로덱스트린, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane), 숙신산염 나트륨(sodium succinate), 염화 나트륨(sodium chloride), 염화 마그네슘(magnesium chloride) 및 물로 이루어져 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 숙신산염 나트륨, 염화 나트륨 및 염화 마그네슘을 기본 구성으로 하여 균체가 안정적으로 생존 가능한 환경을 조성한다. 본 발명의 조성물의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 숙신산염 나트륨, 염화 나트륨 및 염화 마그네슘은 본 발명의 조성물의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진 효능을 저해하지 아니하는 범위라면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄은 0.01 내지 1%(w/v)의 농도로, 숙신산염 나트륨은 0.01 내지 1%(w/v)의 농도로, 염화 나트륨의 농도로 0.01 내지 1%(w/v), 염화 마그네슘은 0.001 내지 0.5%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있으며 가장 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄은 0.12 내지 0.61%(w/v)의 농도로, 숙신산염 나트륨은 0.16 내지 0.8%(w/v)의 농도로, 염화 나트륨은 0.06 내지 0.18%(w/v)의 농도로 염화 마그네슘은 0.006 내지 0.05%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 사이클로덱스트린은 여러 개의 글루코오스 분자가 α-1,4로 결합된 고리 모양의 비환원당으로 친유성인 내부와 친수성인 외부로 인해 host-guest inclusion complex를 형성해 기질인 비타민 D3을 버퍼 내에 안정화시킨다. 본 발명의 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 또는 메틸-β-사이클로덱스트린일 수 있으며 가장 바람직하게는 β-사이클로덱스트린일 수 있다. 본 발명의 사이클로덱스트린의 농도는 본 발명의 조성물의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진 효능을 저해하지 아니하는 범위라면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 0.1 내지 5%(w/v)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 0.25 내지 1%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 유기용제는 난용성 물질인 기질의 용해도를 증가시킨다. 본 발명의 유기용제는 에탄올, 메탄올, 아세톤 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)일 수 있으며 가장 바람직하게는 메탄올 일 수 있다. 본 발명의 유기용제의 농도는 본 발명의 조성물의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진 효능을 저해하지 아니하는 범위라면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 1 내지 10%(w/v)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 2.5 내지 10%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 금속화합물은 전자전달을 활성화시켜 기질을 칼시트리올 또는 칼시페디올로 전환하는 효율을 높인다. 본 발명의 금속화합물은 본 발명의 조성물의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진 효능을 저해하지 아니하며 금속이온을 발생시키는 화합물이면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 FeCl2, FeCl3, FeSO4, MnCl2, 또는 ZnSO4일 수 있으며 가장 바람직하게는 MnCl2일 수 있다. 본 발명의 금속화합물의 농도는 본 발명의 조성물의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산 촉진 효능을 저해하지 아니하는 범위라면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 0.01 내지 0.3%(w/v)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.03%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물은 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산을 촉진하는 효과가 우수하다.
한편 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법은 (a) 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양하는 단계, (b) 상기 배양액에서 균체를 회수하는 단계, (c) 상기 회수된 균체, 비타민 D3 및 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서는 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양한다. 본 발명의 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양은 통상적으로 사용되는 미생물 접종 및 배양방법을 이용할 수 있다. 접종은 배양 조건하에서 슈도노카르디아 아우토트로피카가 충분히 증식할 수 있도록 전배양된 슈도노카르디아 아우토트로피카를 적당한 양으로 배양배지에 첨가함으로써 수행된다. 접종하는 슈도노카르디아 아우토트로피카의 양은 전배양된 슈도노카르디아 아우토트로피카 배양액을 배양배지에 1 내지 5%(v/v)정도로 첨가할 수 있다. 슈도노카르디아 아우토트로피카의 배양은 당업계에 알려진 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.
배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코오스, 수크로스, 말토스, 프럭토스, 락토스, 자일로스, 갈락토오스, 아라비노스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 글루코오스이다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프 추출물(beef extract), 트립톤, 카시톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 효모 추출물이다.
상기 (a) 단계의 슈도노카르디아 아우토트로피카는 동종의 미생물은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 슈도노카르디아 아우토트로피카 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302(Pseudonocardia autotrophica ID9302)일 수 있다.
본 발명에 따른 생물촉매인 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2001. 6. 7 자로 기탁되어 있다(기탁번호 : KCTC 1029BP).
상기 (b) 단계에서는 상기 배양액에서 균체를 회수한다. 본 발명의 균체 회수 방법은 균체를 살아있는 상태로 회수하기 위하여 통상적으로 사용되는 균체 회수 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 원심분리방법일 수 있다. 바람직하게는 배양액 내의 영양성분을 제거하기 위하여 회수된 균체를 버퍼로 세척 할 수 있으며 상기 세척용 버퍼는 바람직하게는 본 발명의 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물일 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 상기 회수된 균체, 비타민 D3 및 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 혼합한다. (c) 단계에서는 상기 회수된 균체가 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물에 풀어져서 기질인 비타민 D3을 칼시트리올 또는 칼시페디올로 변환하는 기능을 수행한다.
(c) 단계의 혼합은 본 발명의 생산방법에 의하여 칼시트리올 또는 칼시페디올이 생산되는 한 어떠한 순서나 방법에 의하여도 가능하며, 예를 들어 비타민 D3을 공지의 용매에 먼저 용해 한 후 이를 상기 회수된 균체가 풀어져 있는 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물에 혼합하거나 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산을 촉진하는 물질을 비타민 D3과 함께 공지의 용매에 먼저 용해 한 후 이를 상기 회수된 균체가 풀어져 있는 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물에 혼합할 수 있다. 상기 공지의 비타민 D3의 용해를 돕는 것이면 어떠한 용매도 가능하며, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤, DMSO 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 상기 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산을 촉진하는 물질은 예를 들어 사이클로덱스트린, cremophore, 폴리에틸렌글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트윈 85, 트윈 80 또는 PEG 300일 수 있다.
또한 상기 비타민 D3은 한 번에 반응시키고자 하는 양을 모두 투여하거나, 수회에 나누어 투여하거나, 혼합물 내의 비타민 D3의 농도를 일정하게 유지시키면서 연속적으로 투여할 수 있다. 혼합 상태는 상기 회수된 균체에 의하여 비타민 D3이 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올로 변환하는 효율과 균체의 생존율 등을 고려하여 다양하게 지속 시킬 수 있으며 바람직하게는 4일 내지 10일 일 수 있다. 혼합 상태 유지 기간 중 효율적인 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산, 또는 균체의 생존유지를 위하여 적절한 pH, 교반상태 및 통기량을 유지할 수 있으며, 이러한 과정은 당업자라면 용이하게 조정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302를 배양하고 원심분리를 통해 균체만을 회수하여 GAC(growth-arrested cells)을 제작하였다. 이를 이용하여 다양한 종류의 버퍼 조성에서 비타민 D3을 이용한 칼시트리올 및 칼시페디올 각각의 생산성을 측정하였다.
그 결과 25mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 25mM 숙신산염 나트륨, 20mM 염화 나트륨, 4mM 염화 마그네슘으로 구성된 TSSM 버퍼에서 칼시트리올 및 칼시페디올 각각의 생산성이 가장 우수한 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
TSSM 버퍼를 기본 버퍼 구성으로 하여 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산성을 높이기 위하여 다양한 물질을 추가하는 실험을 진행 하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 사이클로덱스트린을 농도별로 추가하여 칼시트리올 및 칼시페디올 생산성 변화를 측정하였다.
그 결과 사이클로덱스트린은 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율을 증가시키는 것을 확인하였으며, 특히 β-사이클로덱스트린을 추가하는 경우 생산수율이 높아지는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 다양한 유기용제를 농도별로 추가하여 칼시트리올 및 칼시페디올 생산성 변화를 측정하였다.
그 결과 유기용제의 투여에 의하여 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율이 증가되는 것을 확인하였으며, 특히 메탄올을 추가하는 경우 생산수율이 높아지는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한 사이클로덱스트린과 유기용제를 동시에 추가한 경우 생산수율이 사이클로덱스트린 또는 유기용제를 단독으로 투여한 경우보다 월등히 높아지는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 다양한 금속화합물을 농도별로 추가하여 칼시트리올 및 칼시페디올 생산성 변화를 측정하였다.
그 결과 CuCl2, CuSO4, CoCl2, CoSO4의 경우 농도에 상관없이 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율이 감소하거나 이루어지지 않았으나 FeCl2, FeCl3, FeSO4, ZnSO4 또는 MnCl2를 투여하는 경우 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율이 증가되는 것을 확인하였다. 특히 ZnSO4 또는 MnCl2를 투여하는 경우 생산수율의 증가가 월등한 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 pH 변화에 따른 칼시트리올 및 칼시페디올 생산성 변화를 측정하였다.
그 결과 pH에 따라 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율이 변화하였으며, pH7.0 내지 pH7.4에서 높은 칼시트리올 및 칼시페디올 생산수율이 나타남을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 과정에 의해 결정된 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 유기용제와 금속화합물을 다양하게 조절하여 75L 발효조에서 칼시트리올 또는 칼시페디올을 대량생산하였다.
그 결과 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물은 FeCl2, FeCl3, FeSO4는 0.01% 농도에서 각각 53.12mg/L, 60.8mg/L, 62.42mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였으며, ZnSO4는 0.01% 농도에서 77.18mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였다. 특히 MnCl2는 0.03% 농도에서 90.12mg/L의 칼시트리올 생산수율 및 166.87mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보였다(실시예 8 참조). 이로서 본 발명의 FeCl2, FeCl3, FeSO4, ZnSO4 및 MnCl2를 포함하는 조성물은 우수한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산율을 보이는 것을 확인하였다.
또한 유기용제의 종류를 달리하여 대량생산을 한 결과 에탄올은 48.45mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였으며, 아세톤과 DMSO는 각각 74.87mg/L 및 70.85mg/L의 칼시트리올 생산수율과 156.37mg/L 및 141.81mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보이는 것을 확인하였다. 특히 메탄올의 경우 90.12mg/L의 칼시트리올 생산수율과 166.87mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보였다(실시예 9 참조). 이로서 본 발명의 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 DMSO를 포함하는 조성물은 우수한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산율을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 과정에 의해 결정된 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 이용하여 75L 발효조에서 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법에 따라 칼시트리올 및 칼시페디올을 생산하고 이를 분리 정제하였다.
본 발명의 방법에 의해 칼시트리올 및 칼시페디올을 생산한 결과 7일째에 가장 높은 91.23㎎/L의 칼시트리올 생산성과 168.24㎎/L의 칼시페디올의 생산성을 나타냄을 확인하였다(실시예 10 참조).
또한 상기 반응물을 회수하여 균체를 제거한 후 비타민D3, 칼시페디올 및 칼시트리올을 분리 정제 하였다.
그 결과 순도 90% 이상의 칼시페디올 7.6g과 순도 99%의 칼시트리올 2.2g을 수득하였다(실시예 11 참조).
이와 같이 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물 또는 생산방법은 배양액을 제거하고 버퍼 상태에서 비타민 D3과 균체를 반응시키기 때문에 배양환경에서 발생하는 여타 대사산물의 발생이 적고, 따라서 원하는 타깃 물질로 생물전환되는 수율이 높아지며, 불순물의 생성이 적기 때문에 분리 정제의 효율성이 매우 높아지며 결국 원료의 품질이 높아지고 분리 정제의 비용은 줄이는 효과가 있다. 또한 고농도 반응을 통해서 칼시트리올 총 생산량을 증대시킬 수 있어 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산에 효과적이다.
따라서 본 발명은 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물과 상기 조성물을 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법을 제공한다. 본 발명의 생산방법은 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산수율이 높으며 미생물 배양 계가 아닌 효소반응 계에서 생물전환을 진행하므로, 무균 유지가 필요 없으며 생물촉매 반응이 종료된 후에 분리정제에도 미생물 배양법보다 더욱 깨끗한 상태에서 분리정제를 시작하기 때문에 분리에 소요되는 비용이 저렴하고 품질은 우수한 장점이 있다. 또한 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물은 칼시트리올 및 칼시페디올의 탁월한 생산성을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 콜레스테롤에서 유기합성하여 칼시트리올을 생산하는 공정과 생물촉매에 의해 비타민 D3에서 칼시트리올을 생산하는 공정을 비교하는 그림이다.
도 2는 사이클로덱스트린이 생물촉매 반응에 미치는 영향을 미쳐서 비타민 D3을 생물전환시켜 칼시페디올과 칼시트리올을 생산하는 그래프이다(숫자d: 반응 시작 후 기간(일)).
도 3은 특정 유기 용제가 생물촉매 반응에 영향을 미쳐서 비타민 D3을 생물전환시켜 칼시페디올과 칼시트리올을 생산하는 그래프이다.
도 4는 비타민 D3을 생물전환하여 칼시페디올과 칼시트리올을 고생산하기 위해서 β-사이클로덱스트린과 특정 유기 용제의 혼합 조건이 생물촉매 반응에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다(숫자d: 반응 시작 후 기간(일)).
도 5는 75ℓ 발효조에서 생물촉매 반응을 통해서 비타민 D3에서 활성형 비타민 D3 유도체가 생산되는 그래프이다(숫자d: 반응 시작 후 기간(일)).
도 6은 금속화합물이 생물촉매 반응에 영향을 미쳐서 비타민 D3을 생물전환시켜 칼시페디올과 칼시트리올을 생산하는 그래프이다(D숫자: 반응 시작 후 기간(일)).
도 7은 생물 촉매 반응에서 pH를 일정하게 유지해 주었을 경우 칼시페디올과 칼시트리올의 생산성을 나타낸 그래프이다(D숫자: 반응 시작 후 기간(일)).
도 8은 75L 발효조에서 금속화합물이 생물촉매 반응에 영향을 미쳐서 비타민 D3을 생물전환시켜 칼시페디올과 칼시트리올을 생산하는 그래프이다(D숫자: 반응 시작 후 기간(일)).
도 9는 75L 발효조에서 생물촉매 반응을 통해서 비타민 D3에서 활성형 비타민 D3인 칼시페디올과 칼시트리올을 생산하는 그래프이다(D숫자: 반응 시작 후 기간(일)).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
칼시트리올 생산을 위한 생물 촉매 반응 버퍼 결정
생물 촉매인 GAC(growth-arrested cells)가 생물 촉매 반응으로 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 능력을 갖추게 하기 위해서 다양한 종류의 버퍼에서 칼시트리올의 생산성을 확인하였다.
<1-1> 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302의 GAC 제작
본 발명의 칼시페디올과 칼시트리올 생산을 위한 생물촉매로 사용하기 위하여 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302(Pseudonocardia autotrophica ID9302, 이하 ‘ID9302’라 함.) 균주를 적정 조건의 배지(건조 이스트 0.4%, 포도당 1%, 전분 1%, 어분 1%, 염화나트륨 0.2%, 인산이수소칼륨 0.01%, 소고기 엑스 0.1%, 불화나트륨 0.01% 및 칼슘카보네이트 0.2%, pH 7.0의 멸균 액체 배지)에서 배양하고 이를 원심분리하여 균체만을 회수한 후, 이하 실험에 사용될 생물촉매 반응 버퍼(표 1 참조)로 각각 세척하여 배양액 내의 영양 성분을 완전 제거하고 다음 단계에서 진행될 생물촉매 반응을 위한 GAC(growth-arrested cells)을 제작하였다(이하 ‘ID9302 GAC’라 함).
<1-2> 버퍼 조성에 따른 ID9302 GAC의 칼시트리올 및 칼시페디올 생산성 측정
본 배양 50㎖로 준비한 생물촉매인 GAC를 50㎖의 [표 1]과 같은 다양한 버퍼에 되풀어서 250㎖ 삼각플라스크에 넣고 5% 비타민 D3 용액(in ethanol) 300㎕를 동일한 삼각플라스크에 넣고 9일 동안 동일한 조건으로 진탕 반응하였다. 7일과 9일에 배양액 3㎖을 취해서 추출 용매(methylene chloride/methanol=1/1) 6㎖을 가하여 30분 동안 혼합하고 유기 용매 층을 취하여 농축하고 HPLC로 분석하여 생물촉매 반응의 수율과 칼시트리올 및 칼시페디올 각각의 생산성을 측정하였다.
칼시트리올 및 칼시페디올 순품과 일치하는 UV 패턴과 RT를 나타내는 피크를 비교 분석하여 생산성을 확인하였다. HPLC 분석 조건은 칼럼은 J'sphere ODS-H80(150×4.6㎜ I.D.), 이동상은 인산으로 pH 7.2~7.3으로 조정한 0.1% 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl) aminomethane, THAM) 450㎖와 아세토니트릴 550㎖의 혼합 용매를 사용하고 이동 속도는 1㎖/min, 검출은 photodiode array detector를 사용하였다.
표 1 다양한 종류의 버퍼가 생물촉매 반응에 미치는 영향
버퍼종류 칼시트리올 생산량(㎎/L)
배양 7일째 배양 9일째
생리 식염수(Saline) 0.50 0.00
PBS buffer, pH7.2 0.26 0.00
20mM Maleate buffer, pH6.5 0.67 0.76
15mM Acetate buffer, pH5.0 0.05 0.09
TSSM buffer, pH7.2 1.65 1.41
* TSSM buffer : 25mM 트리즈마 베이스(Trizma base, Tris(hydroxymethyl)aminomethane), 25mM 숙신산염 나트륨(sodium succinate), 20mM 염화 나트륨, 4mM 염화 마그네슘
그 결과 [표 1]에서 보는 바와 같이 TSSM 버퍼를 사용한 경우 ID9302가 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 생물촉매 능력이 가장 높은 것을 확인하였다.
말레이트 버퍼(Maleate buffer)도 TSSM 버퍼에서 보여준 1.65㎎/L의 칼시트리올 생산성에는 미치지 못하였으나 ID9302의 생물촉매를 위한 비교적 우수한 버퍼임을 확인하였다.
TSSM 버퍼는 pH의 buffering 효과가 우수한 트리즈마 베이스, 이온강도(ionic strength)가 뛰어난 NaCl, 대사 활동에 기여하는 숙신산염 나트륨, p450 수산화효소(hydroxylase)의 보조인자(cofactor)인 마그네슘이온 등으로 구성된 버퍼로서, 각각 10~50mM 트리즈마 베이스, 10~50mM 숙신산염 나트륨, 10~30mM 염화 나트륨, 1~8mM 염화 마그네슘의 농도(pH7.0~7.4)에서 특히 우수한 생산성을 발현하였다. 이에 TSSM 버퍼를 p450 수산화 효소 반응계에서 생물촉매 반응의 버퍼로 결정하였다.
<실시예 2>
사이클로덱스트린이 생물촉매 반응에 미치는 영향
실시예 1에서 결정된 생물촉매 반응 조건과 동등한 조건으로 생물전환 시험을 진행하였다. 50㎖ TSSM 버퍼에 ID9302 GAC 생물촉매를 넣고 각종 사이클로덱스트린을 0.25%, 0.5%, 1%의 농도로 투입시키고 또한 5% 비타민 D3 에탄올 용액 300㎕를 삼각플라스크에 넣고 진탕 반응을 9일 동안 진행하는 생물전환 시험을 진행하였다. 5일, 7일, 9일째에 반응 시료 3㎖을 취해서 실시예 1-2와 같은 방법으로 추출, 농축 및 HPLC 분석을 실시하였다.
최종 HPLC 분석 결과 사이클로덱스트린이 TSSM 버퍼의 환경을 변화시켜 생물촉매인 ID9302 GAC가 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 수율을 증가시키는 것을 확인하였다(도 2 참조). 사이클로덱스트린의 종류, 농도 및 배양시간에 따른 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산성은 하기 [표 2]에 요약하였다.
표 2 각 종 사이클로덱스트린의 적정 농도가 생물전환에 미치는 영향
농도 0% 0.25% 0.5% 1%
반응시간 5d 7d 9d 5d 7d 9d 5d 7d 9d 5d 7d 9d
칼시트리올㎎/L α-CD 1.03 1.64 1.45 1.86 3.00 2.05 1.44 2.30 1.47 1.69 1.99 1.36
β-CD 1.03 1.64 1.45 5.50 6.22 6.00 3.69 3.25 3.22 1.13 2.49 2.26
γ-CD 1.03 1.64 1.45 2.83 2.79 1.66 3.43 3.57 2.69 4.09 3.71 1.91
M-CD 1.03 1.64 1.45 3.46 4.71 5.16 1.89 2.59 2.86 0.74 1.42 1.09
칼시페디올㎎/L α-CD 4.52 4.69 1.94 4.60 5.53 1.77 7.62 5.69 2.09 9.36 8.55 2.11
β-CD 4.52 4.69 1.94 18.62 20.50 21.63 12.80 16.24 6.00 8.96 14.68 4.89
γ-CD 4.52 4.69 1.94 11.91 8.79 2.19 15.83 12.13 4.62 14.72 11.97 4.73
M-CD 4.52 4.69 1.94 12.88 14.28 12.29 13.39 15.36 15.13 8.90 12.23 12.23
α-사이클로덱스트린을 TSSM 버퍼에 투입한 경우에는 0.25% 농도에서 칼시트리올 생산 수율이 대조군(사이클로덱스트린을 첨가하지 아니한 TSSM 버퍼에서의 생산율, [표 1] 참조) 대비 1.83배 증가한 것으로 나타났다. 또한 칼시트리올의 전구물질인 칼시페디올의 경우도 α-사이클로덱스트린의 농도 증가와 더불어서 증가하는 양상을 보이며 1% 농도에서 1.82배의 생산성 증가를 나타냈다.
β-사이클로덱스트린(β-CD)을 TSSM 버퍼에 투입한 경우에 0.25%에서 가장 우수한 생물전환 결과를 나타내었는데 대조군 대비 칼시트리올의 생산 수율이 3.79배 상승한 것을 알 수 있었다. 또한 칼시페디올의 생산율도 β-사이클로덱스트린 0.25% 농도에서 4.37배 증가하는 것을 확인하였다.
γ-사이클로덱스트린(γ-CD)의 경우에는 0.25%, 0.5%, 1%로 투여 농도가 증가하는 것과 비례하여 칼시트리올의 생산 수율도 1.7배, 2.18배, 2.26배로 증가하였고 칼시페디올의 생산 수율도 크게 증가하는 것을 확인하였다.
β-사이클로덱스트린의 유도체인 메틸-β-사이클로덱스트린(M-CD)의 경우에는 0.25%에서 control 대비 2.87배로 가장 높은 칼시트리올 생산 수율을 나타내었으며 이후의 농도에서 급격한 칼시트리올 생산성 하락을 보여 주었고 칼시페디올의 생산 수율은 높게 유지되었다.
이상의 결과를 통해서 보는 바와 같이, 본 발명에 있어서 사이클로덱스트린이 투여되지 않은 대조군(TSSM 버퍼)과 비교하여 TSSM 버퍼에 사이클로덱스트린이 적정 농도로 투여된 버퍼(이하, 'TSSMC 버퍼'라 함)의 경우에 비타민 D3의 생물전환 수율이 높아지고 그에 따라 칼시트리올과 칼시페디올의 생산 수율이 증가하는 것을 확인하였다.
<실시예 3>
특정 유기 용제가 생물촉매 반응에 미치는 영향
실시예 1에서 결정된 생물촉매 반응 조건을 기본으로 하여 유기 용제가 생물촉매 반응에 미치는 영향과 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산 효과를 확인 하였다. 실시예 1의 생물촉매 반응 조건에 [표 3]의 유기용제 4 종을 각각 최종 농도가 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%로 되도록 투여하고 실시예 2의 진탕 반응과 동일한 조건으로 실험을 진행하였으며 생물촉매 반응 8일째에 반응을 종료하고 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HPLC로 정량 분석하였다.
표 3 특정 유기 용제가 생물촉매 반응에 미치는 영향
유기용제 농도(%) 칼시트리올 생산량 (㎎/L) 칼시페디올 생산량 (㎎/L)
에탄올 메탄올 아세톤 DMSO 에탄올 메탄올 아세톤 DMSO
0 1.66 1.66 1.66 1.66 5.53 5.53 5.53 5.53
2.5 0.74 4.45 3.54 3.39 36.34 25.91 30.24 28.32
5 0.30 4.77 3.91 3.87 30.66 28.48 31.05 25.83
10 0.02 5.84 4.14 4.03 1.97 33.90 36.44 25.36
20 0.00 0.00 0.66 1.66 1.03 1.36 4.05 0.90
30 0.00 0.00 0.04 0.08 0.49 0.00 2.04 0.23
분석 결과, 에탄올의 경우에는 투여하지 않은 대조군에 비해 에탄올 투여 농도가 높아질수록 타깃 물질인 칼시트리올의 생물전환이 전혀 이루어지지 않았다. 그러나 에탄올 2.5%, 5%에서 칼시페디올의 생산수율이 대조군 대비 각각 6.57배, 5.54배 상승한 것을 확인하였다.
메탄올의 경우에는 투여 농도 20% 이상에서는 생물 전환 활동이 전혀 나타나지 않았으며 2.5%에서 10%까지 메탄올을 투여했을 때 대조군 대비 3.52배까지 칼시트리올 생산 수율이 증가하는 것을 확인하였다. 칼시페디올 생산 수율의 경우에도 6배 이상 증가한 것으로 나타났다.
아세톤과 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)의 경우에는 대조군 대비 칼시트리올은 2~2.5배, 칼시페디올은 5.5~6.5배의 생산 수율 증가 현상을 보여 주었다.
이상의 결과를 보아 일정농도의 유기 용제를 생물촉매 반응에 투입함으로써 난용성 물질인 비타민 D3의 용해도를 증가시켜서 칼시트리올의 생산 수율을 높이는 것을 확인하였다(도 3 참조).
<실시예 4>
사이클로덱스트린과 유기 용제의 혼합 조건이 생물촉매 반응에 미치는 영향
실시예 2에서 가장 우수한 생물 전환 효과를 보인 0.25% β-사이클로덱스트린을 TSSM 버퍼에 투입시킨 TSSMC 버퍼를 기본적인 생물촉매 반응 버퍼로 활용하였다. 실시예 3에서 확인된 유기 용제가 생물전환에 미치는 유효한 효과를 감안하여 유기 용제를 2.5%에서 10% 농도로 생물촉매 반응 버퍼에 투입하여 사이클로덱스트린과 유기 용제의 혼합에 따른 생물전환 수율에 미치는 영향을 확인하였다. GAC 제작, 진탕반응 조건 및 HPLC 분석은 실시예 1과 동일하다.
그 결과 β-사이클로덱스트린과 유기 용제와의 혼합은 생물촉매 반응에 긍정적인 반응을 보였으며, 칼시트리올의 생산 수율의 증가와 함께 칼시트리올의 생합성 전구물질인 칼시페디올의 생산성은 메탄올을 추가했을 경우 대조군 대비 약 4배인 89.14㎎/L까지 달하는 것으로 확인되었다(도 4 참조).
표 4 β-사이클로덱스트린과 각종 유기 용매의 혼합에 의한 8일째 생물전환 결과
유기용제(%) 0 2.5 5 7.5 10
칼시트리올생산량(㎎/L) 에탄올 6.37 6.78 8.67 3.53 1.39
메탄올 6.37 10.91 11.77 30.32 14.32
아세톤 6.37 10.03 11.01 11.74 13.08
DMSO 6.37 11.42 18.32 10.65 9.32
칼시페디올생산량(㎎/L) 에탄올 22.53 39.00 86.36 30.29 6.78
메탄올 22.53 61.46 89.14 71.03 79.94
아세톤 22.53 62.79 77.66 86.15 71.51
DMSO 22.53 66.44 74.48 76.48 80.25
메탄올의 경우에 실시예 3과 마찬가지로 사이클로덱스트린 혼합에 따른 칼시트리올 생산 수율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 메탄올의 경우에 2.5% 농도에서 칼시트리올과 칼시페디올의 생산성이 증가하다가 7.5% 농도에서는 대조군 대비 4.76배의 칼시트리올 생산 수율 증가를 나타내었다. 아세톤의 경우에는 10% 농도에서 약 2배의 칼시트리올 생산 수율 증가를 나타내었고 DMSO의 경우에는 5% 농도에서 대조군 대비 2.88배가 높은 칼시트리올 생산 수율을 보여 주었다. 또한 에탄올의 경우에는 실시예 3에서 칼시트리올의 생산이 전혀 이뤄지지 않은 것과는 달리 5% 농도에서 대조군 대비 1.4배의 칼시트리올 생산성과 3.8배의 칼시페디올의 생산성 증가를 보여 주었다.
이상의 결과에 따르면 사이클로덱스트린과 유기 용제의 혼합은 사이클로덱스트린의 난용성 비타민 D3에 미치는 용해도 증가와 더불어 유기 용제가 버퍼 환경의 지용성질을 증가시켜 생물촉매 반응의 시너지 효과가 나타난 것을 알 수 있었다. 시너지 효과는 칼시트리올과 칼시페디올의 생산 수율의 급격한 증가를 보여 주었으며, 특히 메탄올 7.5%의 경우에는 대조군 대비 약 4.76배 증가인 30.32㎎/L의 가장 우수한 칼시트리올 생산 수율을 보여 주었고 메탄올 5%의 경우에는 대조군 대비 약 4배인 89.14㎎/L의 칼시페디올 생산 증가를 보여 주었다.
<실시예 5>
75L 발효조에서 생물촉매 반응을 통해 활성형 비타민 D3인 칼시페디올과 칼시트리올의 생산
실시예 4까지 확보된 반응 조건을 기본으로 사용하여 75L 발효조에서 생물촉매를 이용하여 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 칼시페디올과 칼시트리올 생산시험을 실시하였다. 배양 조건은 실시예 1과 동일하며 스케일만 중간 배양이 2L 액체 배양액(in 2.5L 발효조)으로 증가하였고 본 배양은 50L 액체배지(in 75L 발효조)를 사용하였다. HPLC 분석은 실시예 1-2와 동일하다.
5일 동안 ID9302의 본 배양 종료 후 생물촉매인 ID9302 GAC를 조제한 후 반응조인 75L 발효조에 7.5% 메탄올을 최종 농도로 포함하는 50L TSSMC 버퍼를 넣고 ID9302 GAC를 반응 버퍼에 되풀고 5% 비타민 용액 300㎖을 조제하여 평형을 유지하고 있는 생물촉매 반응계에 투입하여 28℃, 500rpm, 1vvm의 조건으로 10일 동안 비타민 D3의 생물전환을 실시하였다. 3일부터 10일 동안 반응액을 HPLC로 분석하여 칼시트리올과 칼시페디올의 생산성을 확인하였다.
생산성 확인 결과 생물촉매 반응 3일째부터 칼시트리올의 전구물질인 칼시페디올이 생산되기 시작하였으며 반응 4-5일째에 칼시페디올의 급격한 증가가 나타났으며 동시에 칼시트리올의 생성이 본격적으로 시작되었다. 생물촉매 반응 7일째에 칼시트리올과 칼시페디올의 생산이 급격하게 증가하기 시작하였으며 생물촉매 반응 8일째에는 가장 높은 38.1㎎/L의 칼시트리올 생산성과 반응 9 일째에는 109㎎/L의 칼시페디올의 생산성을 보여 주었다. 이는 반응 3일째와 비교했을 때 칼시트리올의 경우에는 38배의 생산성 증가율을 보여주었고, 칼시페디올의 경우에는 15배의 생산성 증가율을 나타내었다. 최대 생산 이 후로 생물촉매 반응 12일째까지 두 물질이 함께 완만하게 감소하는 패턴을 나타내는 것을 보여 주었다(도 5 참조).
따라서 ID9302를 이용한 생물촉매를 조제하여 75L의 발효조를 통한 반응 용기에서도 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 능력이 검증 되었으며 동시에 우수한 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산 능력을 제공하는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 6>
금속물질이 생물촉매 반응에 미치는 영향
비타민 D3에서 칼시페디올과 칼시트리올로 생물전환을 위해서는 전자전달이 중요하다. TSSMC 버퍼에 금속물질을 추가한다면 금속물질에서 나온 전자로 전자전달이 많아지고, 이로 인해 효소의 활성이 증가되어 생물전환율이 증가할 것으로 보인다.
실시예 4에서 결정된 생물촉매 반응 조건을 기본으로 하여 금속물질이 생물촉매 반응에 미치는 영향과 칼시페디올 및 칼시트리올의 생산 효과를 확인 하였다.
7.5%의 메탄올이 추가로 함유된 TSSMC 버퍼 생물촉매 반응 조건에 [표 5]의 금속물질 9 종을 0.01%, 0.03%, 0.06%로 되도록 투여하고 실시예 2의 진탕 반응과 동일한 조건으로 실험을 진행하였으며 생물촉매 반응 7일째와 9일째에 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HPLC 정량 분석하였다.
정량분석 결과 CuCl2, CuSO4, CoCl2, CoSO4 경우 농도에 상관없이 생물촉매 반응이 잘 이루어 지지 못하였고, 그 결과 칼시페디올과 칼시트리올 생산 수율의 하락을 보여줬다. FeCl2와 FeCl3에서도 칼시페디올과 칼시트리올의 생산 수율의 증가는 없었다. FeSO4는 0.06% 에서 대조군에 비해서 1.14배의 칼시트리올이 증가하였다.
MnCl2 경우 0.06%에서는 칼시페디올과 칼시트리올의 생산 수율이 하락하였고, 0.01%에서는 칼시트리올의 생산 수율이 대조군에 비해 1.15배의 생산수율의 증가를 보였다. 0.03% 농도에서는 칼시트리올은 1.83배, 칼시페디올은 1.52배의 생산 수율이 증가하는 것을 확인하였고, 금속물질 중 가장 좋은 생산 수율의 증가를 보였다.
ZnSO4 경우 0.01%에서 칼시트리올은 대조군과 비슷한 생산 수율을 보였지만, 칼시페디올은 1.34배의 증가를 보였다. 0.06%에서는 대조군 대비 칼시트리올의 생산 수율이 1.3배 증가하는 효과를 보였다(도 6 참조).
위의 결과를 통해 몇몇 금속물질을 생물촉매 반응에 투입함으로써 생물전환 효과가 증가하는 것을 보았고, 그 결과 칼시페디올과 칼시트리올의 생산 수율이 증가하는 것을 확인하였다.
표 5 금속물질이 생물촉매 반응에 미치는 영향
칼시트리올 생산량(mg/L) 칼시페디올 생산량(mg/L)
금속화합물 농도(%) 0 0.01 0.03 0.06 0 0.01 0.03 0.06
반응시간
FeCl2 D7 21.64 25.14 14.61 0 57.89 32.14 11.10 30.81
D9 28.12 16.56 6.48 12.36 86.23 33.63 10.98 6.38
FeCl3 D7 21.64 30.40 24.32 0 57.89 82.84 54.50 15.01
D9 28.12 29.31 11.02 15.98 86.23 75.41 40.89 15.66
FeSO4 D7 21.64 31.21 3.45 32.12 57.89 47.03 7.62 23.01
D9 28.12 20.63 0 18.23 86.23 38.07 6.77 10.83
CuCl2 D7 21.64 3.24 0 0 57.89 11.69 17.88 0
D9 28.12 3.23 0 0 86.23 10.93 18.58 9.45
CuSO4 D7 21.64 7.28 0 0 57.89 42.34 10.23 0
D9 28.12 7.81 0 0 86.23 30.57 8.09 8.06
CoCl2 D7 21.64 0 0 0 57.89 33.69 27.41 30.63
D9 28.12 0 0 2.68 86.23 40.12 33.18 29.56
CoSO4 D7 21.64 0 0 0 57.89 55.75 71.22 16.72
D9 28.12 0 0 6.66 86.23 39.73 40.23 29.07
MnCl2 D7 21.64 28.12 51.55 19.76 57.89 60.37 101.26 21.41
D9 28.12 32.23 50.57 7.51 86.23 88.01 131.20 9.25
ZnSO4 D7 21.64 28.60 28.01 36.66 57.89 115.54 104.97 54.48
D9 28.12 28.59 20.14 23.57 86.23 113.53 106.29 39.42
<실시예 7>
pH 조절이 생물촉매 반응에 미치는 영향
생물촉매 반응이 진행될수록 반응액의 pH가 계속적으로 상승하게 된다. 반응액의 pH를 일정하게 유지시켜 주었을 경우 생물촉매 반응에 미치는 영향을 확인하기 위해 5L 발효조를 이용하여 생물촉매 반응하였다. 배양조건은 실시예 1과 동일하며 중간 배양이 140ml 액체 배양액으로 증가하였고 본 배양은 3.5L 액체배지를 사용하였다. 반응 조건은 <실시예 6>까지 조건을 기본으로 하였다.
5일 동안 ID9302의 본 배양 종료 후 생물촉매인 ID9302 GAC를 제조한 후 반응조인 5L 발효조에 0.03%의 MnCl2가 투입된 TSSM 버퍼(pH 7.2)(이하 TSSMM 버퍼라 함.) 3.5L를 넣고 ID9302 GAC를 반응 버퍼에 다시 풀고 28℃, 500rpm, 0.5vvm으로 평형상태를 유지하였다. 3.5L 반응액의 0.02%와 0.05%에 해당하는 비타민 D3과 β-사이클로덱스트린을 52.5ml의 메탄올에 녹여 반응 시작시점에서 5일 동안 연속적으로 투여하였다. 이때 pH를 1N NaOH와 0.5N HCl을 이용하여 6.2, 6.6, 7.0, 7.4, 7.8, 8.0으로 유지하였다. 생물촉매 6일, 8일, 10일째의 반응액을 실시예 1-2와 같은 방법으로 HPLC 분석하여 칼시페디올과 칼시트리올의 생산성을 확인하였다.
그 결과 pH 6.2에서는 생물전환이 전혀 이루어지지 않아 칼시트리올 및 칼시페디올이 거의 생산되지 않았다. 또 pH 6.6에서도 매우 낮은 칼시트리올과 칼시페디올의 생산수율을 보였다. pH 7과 7.4에서는 높은 칼시트리올과 칼시페디올 생산수율을 보였는데 pH 7.0 경우 대조군에 비해 1.15배와 1.16배의 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산성 향상을 보였고, pH 7.4 경우 1.12배와 1.03배의 향상을 보였다. pH 7.8과 8.2에서는 칼시페디올과 칼시트리올의 생산수율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 7 및 [표 6] 참조).
이상의 결과를 보면 생물촉매 반응 시 pH를 일정하게 유지 시켜줌으로써 칼시페디올과 칼시트리올의 생산수율의 증가를 볼 수 있었고, 이때 pH는 7.0에서 7.4 사이로 유지 시켜 주는 것이 좋다.
표 6 pH 조절이 생물촉매 반응에 미치는 영향
pH 반응시간 칼시트리올생산량(mg/L) 칼시페디올생산량(mg/L)
대조군 D6 75.32 140.23
D8 80.23 142.54
D10 78.34 141.33
6.2 D6 0 12.53
D8 0 14.65
D10 0 12.32
6.6 D6 20.51 33.57
D8 19.71 32.75
D10 18.36 53.43
7.0 D6 88.4 165.87
D8 91.96 166.05
D10 85.14 163.84
7.4 D6 87.88 150.61
D8 89.98 147.23
D10 83.97 148.08
7.8 D6 64.75 84.04
D8 61.32 67.245
D10 57.11 71.791
8.2 D6 28.63 64.74
D8 25.06 62.13
D10 18.99 41.4
<실시예 8>
75L 발효조에서 금속화합물 종류에 따른 칼시페디올과 칼시트리올의 생산성 비교
실시예 7까지 확보된 반응 조건을 기본으로 사용하여 75L 발효조에서 생물촉매를 이용하여 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 칼시페디올과 칼시트리올 생산시험을 실시하였다. 배양 조건은 실시예 1과 동일하며 스케일만 중간 배양이 2L 액체 배양액으로 증가하였고 본 배양은 75L 발효조에서 50L 액체배지를 사용하여 배양하였다.
5일 동안 ID9302의 본 배양 종료 후 생물촉매인 ID9302 GAC를 제조한 후 반응조인 75L 발효조에 50L TSSM 버퍼를 넣고 표 5의 금속 화합물 9종을 0.01%, 0.03%, 0.06%로 되도록 투여하였다.
GAC를 반응 버퍼에 다시 풀고 28℃, 500rpm, 0.5vvm으로 평형상태를 유지하였다. 50L 반응액의 0.02%와 0.05%에 해당하는 비타민 D3과 β-사이클로덱스트린을 750ml의 메탄올에 녹여 반응 시작시점에서 5일 동안 연속적으로 투여하였다.
이때 pH를 1N NaOH와 0.5N HCl을 이용하여 7.0으로 유지하였다. 생물촉매 10일 동안 반응액을 실시예 1-2와 같은 방법으로 HPLC 분석하여 칼시트리올과 칼시페디올의 생산성을 확인하였다.
그 결과 [표 7]에서 보는 바와 같이, CuCl2, CuSO4, CoCl2, CoSO4 경우 농도에 상관없이 생물촉매 반응이 잘 이루어 지지 못하였으나, FeCl2, FeCl3, FeSO4는 0.01% 농도에서 각각 53.12mg/L, 60.8mg/L, 62.42mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였으며, ZnSO4는 0.01% 농도에서 77.18mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였다. 특히 MnCl2는 0.03% 농도에서 90.12mg/L의 칼시트리올 생산수율 및 166.87mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보였다(도 8 참조).
이로서 본 발명의 FeCl2, FeCl3, FeSO4, ZnSO4 및 MnCl2를 포함하는 조성물은 우수한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산률을 보이는 것을 확인하였다.
표 7 금속화합물 종류에 따른 칼시트리올 및 칼시페디올 생산량 변화
칼시트리올 생산량(mg/l) 칼시페디올 생산량(mg/l)
금속화합물 농도(%) 0 0.01 0.03 0.06 0 0.01 0.03 0.06
반응시간
FeCl2 D7 43.27 50.28 50.22 32.17 128.18 64.28 122.21 77.02
D9 48.39 53.12 52.96 30.94 134.76 67.26 121.96 89.13
FeCl3 D7 43.27 60.80 48.64 35.18 128.18 165.68 109.03 37.52
D9 48.39 58.62 42.04 39.95 134.76 150.82 111.78 39.15
FeSO4 D7 43.27 62.42 46.90 40.35 128.18 130.15 120.24 57.52
D9 48.39 61.26 50.84 45.57 134.76 146.14 130.54 57.07
CuCl2 D7 43.27 6.48 0 0 128.18 83.38 35.76 0
D9 48.39 6.46 0 0 134.76 81.86 37.16 23.62
CuSO4 D7 43.27 14.56 0 0 128.18 84.68 20.46 0
D9 48.39 15.62 0 0 134.76 61.14 16.18 20.15
CoCl2 D7 43.27 11.23 0 0 128.18 67.38 54.82 76.57
D9 48.39 13.84 0 6.7 134.76 80.24 66.36 73.90
CoSO4 D7 43.27 8.37 0 0 128.18 111.5 50.44 41.80
D9 48.39 9.79 0 16.65 134.76 79.46 60.46 72.67
MnCl2 D7 43.27 56.24 83.10 49.40 128.18 120.74 150.12 153.52
D9 48.39 64.46 90.12 48.77 134.76 136.02 166.87 153.21
ZnSO4 D7 43.27 57.20 56.02 61.65 128.18 151.08 140.25 136.20
D9 48.39 77.18 50.28 58.92 134.76 167.06 138.67 138.55
<실시예 9>
75L 발효조에서 유기용제 종류에 따른 칼시페디올과 칼시트리올의 생산성 비교
실시예 7까지 확보된 반응 조건을 기본으로 사용하여 75L 발효조에서 생물촉매를 이용하여 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 칼시페디올과 칼시트리올 생산시험을 실시하였다.
배양 조건은 실시예 8과 동일하며 5일 동안 ID9302의 본 배양 종료 후 생물촉매인 ID9302 GAC를 제조하여 반응조인 75L 발효조에 0.03%의 MnCl2를 최종 농도로 포함하는 TSSMC 버퍼 50L를 넣고 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 DMSO를 실시예 4에서 가장 좋은 생산성을 보인 농도로 각각 투여하였다.
GAC를 반응 버퍼에 다시 풀고 10% 비타민 D3 용액 300ml을 조제하여 평형을 유지하고 있는 생물촉매 반응계에 투입하여 28℃, 500rpm, 0.5vvm의 조건으로 10일 동안 비타민 D3의 생물전환을 실시하였다.
이때 pH를 1N NaOH와 0.5N HCl을 이용하여 7.0으로 유지하였다. 생물촉매 10일 동안 반응액을 실시예 1-2와 같은 방법으로 HPLC 분석하여 칼시트리올과 칼시페디올의 생산성을 확인하였다.
그 결과 [표 8]에서 보는 바와 같이 에탄올은 48.45mg/L의 칼시트리올 생산수율을 보였으며, 아세톤과 DMSO는 각각 74.87mg/L 및 70.85mg/L의 칼시트리올 생산수율과 156.37mg/L 및 141.81mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보이는 것을 확인하였다. 특히 메탄올의 경우 90.12mg/L의 칼시트리올 생산수율과 166.87mg/L의 칼시페디올 생산수율을 보였다.
이로서 본 발명의 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 DMSO를 포함하는 조성물은 우수한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산률을 보이는 것을 확인하였다.
표 8 유기용제 종류에 따른 칼시트리올 및 칼시페디올 생산량 변화
유기용제 반응시간 칼시트리올 생산량(mg/l) 칼시페디올 생산량(mg/l)
에탄올(5%) D7 33.24 113.01
D9 48.45 128.96
메탄올(7.5%) D7 83.10 150.12
D9 90.12 166.87
아세톤(10%) D7 63.12 148.28
D9 74.87 156.37
DMSO(5%) D7 62.32 131.87
D9 70.85 141.81
<실시예 10>
75L 발효조에서 생물촉매 반응을 통해 활성형 비타민 D3인 칼시페디올과 칼시트리올의 생산
실시예 9까지 확보된 반응 조건을 기본으로 사용하여 75L 발효조에서 생물촉매를 이용하여 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 칼시페디올과 칼시트리올 생산시험을 실시하였다. 배양 조건은 실시예 9와 동일하다.
5일 동안 ID9302의 본 배양 종료 후 생물촉매인 ID9302 GAC를 제조한 후 반응조인 75L 발효조에 50L TSSMM 버퍼를 넣고 GAC를 반응 버퍼에 다시 풀고 28℃, 500rpm, 0.5vvm으로 평형상태를 유지하였다. 50L 반응액의 0.02%와 0.05%에 해당하는 비타민 D3과 β-사이클로덱스트린을 750ml의 메탄올에 녹여 반응 시작시점에서 5일 동안 연속적으로 투여하였다. 이때 pH를 1N NaOH와 0.5N HCl을 이용하여 7.0으로 유지하였다. 생물촉매 1일부터 10일 동안 반응액을 실시예 1-2와 같은 방법으로 HPLC 분석하여 칼시트리올과 칼시페디올의 생산성을 확인하였다.
생산성 확인 결과, 생물촉매 반응 1일째부터 칼시트리올의 전구물질인 칼시페디올이 생산되기 시작하였으며 반응 2-3일째에 칼시페디올의 급격한 증가가 나타났으며 동시에 칼시트리올의 생성이 본격적으로 시작되었다. 생물촉매 반응 4일째에 칼시트리올과 칼시페디올의 생산이 급격하게 증가하기 시작하였으며 생물촉매 반응 7일째에 가장 높은 91.23㎎/L의 칼시트리올 생산성과 168.24㎎/L의 칼시페디올의 생산성을 나타냄을 확인하였다. 이는 반응 1일째와 비교했을 때 칼시트리올의 경우에는 90배의 생산성 증가율을 보여주었고, 칼시페디올의 경우에는 3배의 생산성 증가율을 나타내었다. 최대 생산 이 후로 생물촉매 반응 10일째까지 두 물질이 함께 완만하게 감소하는 패턴을 나타내는 것을 보여 주었다(도 9 참조).
따라서 ID9302를 이용한 생물촉매를 조제하여 75L의 발효조를 통한 반응 용기에서도 비타민 D3에 하이드록실기를 도입하는 능력이 검증 되었으며 동시에 우수한 칼시트리올 및 칼시페디올의 생산 능력을 제공하는 것을 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 방법 이외에 생물촉매 효소의 역가를 저해하지 않는 농도 범위 내에서 기질의 양을 증가시켜서 최종 산물인 칼시트리올 또는 칼시페디올의 생산성을 증가시키는 방법도 확인할 수 있었다.
<실시예 11>
반응액으로부터 활성형 비타민 D3의 분리
생물촉매 반응이 종료된 반응액 50L에 1%의 합성흡착제 Sepabeads SP850(Mitsubishi chemical, 일본)을 첨가하여 400rpm으로 1시간동안 교반하여 반응액 내에 있는 비타민 D3 및 활성형 비타민 D3을 흡착시킨다. 다층여과장치를 이용하여 걸러진 세포와 SP850은 아세톤 25L에 추출 되었고 40℃ 이하에서 감압농축 하였다.
농축액을 50% 메탄올 2L에 다시 녹인 후 분별 깔때기를 이용하여 2L 헥산을 첨가하여 1차 재추출 하였다. 추출물(위쪽 상, 헥산중의 칼시페디올, 비타민 D3, 지용성 불순물)을 수집하였다. 추출물을 40℃ 이하에서 감압농축 하였고, 실리카겔 컬럼으로 분취하였다. 이동상은 헥산과 에틸아세테이트 7:3 비율의 혼합물이었으며 10ml/분의 조건으로 분리하였다. 비타민 D3과 칼시페디올 순으로 분취하였다. 비타민 D3과 칼시페디올은 순도 90% 이상 이었으며 각각 18g과 7.6g을 분리하였고 이는 칼시트리올 생산을 위한 전구체로 재사용이 가능하였다.
1차 재추출 잔유물(아래쪽 상, 50% 메탄올중의 칼시트리올, 수용성 불순물)을 2L 디클로르메탄으로 2차 재추출 하여 수용성 불순물을 제거한 칼시트리올 추출물(아래쪽 상, 디클로르메탄중의 칼시트리올)을 수집하였다. 추출물을 40℃ 이하에서 감압농축 하였고, C-18 ODS column을 이용하여 칼시트리올을 분취하였다. 이동상은 75% 메탄올이고 10ml/분의 조건으로 분취하였다. 칼시트리올 분취액은 40℃ 이하에서 감압농축 하였고, 메탄올에 녹여 YMC J’sphere ODS column에서 칼시트리올의 α형과 β형을 분리하였다. 이동상 45% 아세트나이트릴, 230nm, 15ml/분의 조건으로 분리하여 순도 99%의 백색 결정형의 칼시트리올 2.2g을 얻었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물과 상기 조성물을 이용한 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법을 제공한다. 본 발명의 생산방법은 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산수율이 높으며 미생물 배양 계가 아닌 효소반응 계에서 생물전환을 진행하므로, 무균 유지가 필요 없으며 생물촉매 반응이 종료된 후에 분리정제에도 미생물 배양법보다 더욱 깨끗한 상태에서 분리정제를 시작하기 때문에 분리에 소요되는 비용이 저렴하고 품질은 우수한 장점이 있다. 또한 본 발명의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물은 칼시트리올 및 칼시페디올의 탁월한 생산성을 제공하는 효과가 있어 산업상 이용가능성이 높다.
Figure PCTKR2009007404-appb-I000001

Claims (7)

  1. FeCl2, FeCl3, FeSO4, MnCl2, 및 ZnSO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속화합물 0.01 내지 0.3%(w/v), 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용제 1 내지 10%(w/v), 사이클로덱스트린 0.1 내지 5%(w/v), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 0.01 내지 1%(w/v), 숙신산염 나트륨(sodium succinate) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 나트륨(sodium chloride) 0.01 내지 1%(w/v), 염화 마그네슘(magnesium chloride) 0.001 내지 0.5%(w/v) 및 잔량의 물로 이루어진 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금속화합물은 0.01 내지 0.03%(w/v), 상기 유기용제는 2.5 내지 10%(w/v), 상기 사이클로덱스트린은 0.25 내지 1%(w/v), 상기 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄은 0.12 내지 0.61%(w/v), 상기 숙신산염 나트륨은 0.16 내지 0.8%(w/v), 상기 염화 나트륨은 0.06 내지 0.18%(w/v) 및 상기 염화 마그네슘은 0.006 내지 0.05%(w/v)인 것을 특징으로 하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속화합물은 MnCl2인 것을 특징으로 하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유기용제는 메탄올인 것을 특징으로 하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물.
  6. (a) 슈도노카르디아 아우토트로피카를 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양액에서 균체를 회수하는 단계; 및
    (c) 상기 회수된 균체, 비타민 D3 및 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산 촉진용 버퍼 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 슈도노카르디아 아우토트로피카는 슈도노카르디아 아우토트로피카 ID9302인 것을 특징으로 하는 칼시트리올 또는 칼시페디올 생산방법.
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