CN111684058B - 从多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够简便且高效率地制备显示出更接近活体的肠上皮细胞的功能的细胞的新的方法。根据本发明，通过(1)将多能干细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序和(2)并用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质而将工序(1)中所获得的肠道干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞的工序，从而将多能干细胞诱导为肠上皮细胞。

Description

从多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导方法
技术领域
本发明涉及一种将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞的方法及其用途。
背景技术
小肠中存在许多药物代谢酶或药物转运体，因此与肝脏同样地，作为与药物的首过效应有关的器官非常重要。因此，在药代动力特性优异的医药品的开发中需要从医药品开发早期阶段开始评价小肠中医药品的膜透过性或代谢。目前，作为小肠的模型系统，常用源自人结肠癌的Caco-2细胞。但是，Caco-2细胞中的药物转运体的表达模式与人的小肠不同。并且，Caco-2细胞几乎观察不到药物代谢酶的表达及酶诱导，因此难以准确地评价在小肠中的药代动力。因此，为了综合评价小肠中的药物代谢及膜透过性，期望利用原代小肠上皮细胞，但关于功能方面或供给存在问题，因此难以像原代肝细胞那样被广泛地用作药代动力试验系统。
人的人工多能干(induced pluripotent stem：iPS)细胞于2007年由山中等人建立。该人iPS细胞为与1998年由Thomson等人建立的人胚胎干(embryon ic stem：ES)细胞相同的、具有多分化能力和几乎无限的增殖能力的细胞。与人ES细胞相比，人iPS细胞的伦理问题少，期待作为用于开发医药品的稳定的细胞供给源。
另外，为了提供药剂的吸收试验等中所利用的肠上皮细胞，报道有从源自肠道的细胞选择性地获取肠道的干/祖细胞的方法(专利文献1)。并且，提出有使用ALK5抑制因子的多能细胞的制作和维持方法(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-206510号公报
专利文献2：日本特表2012-511935号公报
专利文献3：国际公开第2014/132933号小册子
专利文献4：国际公开第2017/154795号小册子
非专利文献
非专利文献1：Ueda T et al.,Biochem Biophys Res Commun.2010 Jan 1；391(1)：38-42.
非专利文献2：McCracken KW et al.,Nat Protoc.2011 Nov 10；6(12)：1920-8
非专利文献3：Spence JR,Nature.2011 Feb 3；470(7332)：105-109.
非专利文献4：Ogaki S et al.,Stem Cells.2013 Jun；31(6)：1086-1096.
非专利文献5：Ozawa T et al.,Sci Rep.2015 Nov 12；5：16479.
非专利文献6：Ogaki S et al.,Sci Rep.2015 Nov 30；5：17297.
非专利文献7：Iwao T et al.,Drug Metab Pharmacokinet,29(1),44-51(2014).
非专利文献8：Iwao T et al.,Drug Metab Dispos,43(6),603-610(2015).
发明内容
发明要解决的技术课题
关于从iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导，有几种报道(例如，参考非专利文献1～6)，这些报道中的分化诱导法繁琐，而且分化效率不充分，并没有详细进行药代动力学分析。另外，该分化诱导法使用大量极其昂贵的生长因子或细胞因子类来诱导分化，不适合实际使用。本发明人等也正在对从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化进行着研究，并且报道了所制作出的肠上皮细胞样细胞具有各种各样的药代动力学功能(专利文献3、非专利文献7、8)。并且，发现了对促进从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化及获得功能有用的低分子化合物和条件(专利文献3、4、非专利文献8)。
如上所述，由许多研究人员进行了积极的研究，虽然获得了一定的成果，但对体外制备在药代动力测定或毒性试验等中能够利用的功能肠上皮细胞的需求依然很高。尤其，期望功能方面的提高和制备效率的提高。因此，本发明的课题在于提供一种能够简便且高效率地制备显示出更接近活体的肠上皮细胞的功能的细胞(肠上皮细胞样细胞)的新的方法。
用于解决技术课题的手段
在上述课题下，本发明人等以进一步高效率的分化诱导法的开发为目标进行了详细的研究。其结果，判明了在将从iPS细胞获得的肠道干细胞样细胞分化诱导为肠上皮细胞时，在cAMP激活物质的存在下培养细胞来积极提高细胞内的cAMP水平，对高效率的分化诱导及成熟化(获得功能)非常有效。并且，还提供了对分化诱导中所使用的低分子化合物的组合和添加时期等的有益的信息。
在研究结束之际发现的培养条件下制作出的肠上皮细胞样细胞高表达肠上皮特异性酶(药物代谢酶)，并且在功能上优异。以下发明主要基于以上的成果及考察。
[1]一种将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞的方法，其包括以下的工序(1)及(2)：
(1)将多能干细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序；及
(2)并用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质而将工序(1)中所获得的肠道干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中，工序(1)包括以下的工序(1-1)及(1-2)：
(1-1)将多能干细胞分化为内胚层样细胞的工序；及
(1-2)将工序(1-1)中所获得的内胚层样细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，工序(2)中的培养期间为7天～40天。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，工序(2)包括以下的A～D中的任一培养工序：
培养工序A：包括(a-1)在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在该培养之后进行的(a-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养；
培养工序B：包括(b-1)在EGF的存在下的培养和在该培养之后进行的(b-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养；
培养工序C：包括(c-1)在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在该培养之后进行的(c-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养；及
培养工序D：包括(d-1)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养。
[5]根据[4]所述的方法，其中，
(a-1)的培养期间为2天～10天，(a-2)的培养期间为9天～29天，
(b-1)的培养期间为2天～10天，(b-2)的培养期间为9天～19天，
(c-1)的培养期间为2天～10天，(c-2)的培养期间为9天～19天，
(d-1)的培养期间为15天～25天。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，cAMP激活物质为毛喉素。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，在向细胞供给cAMP的条件和/或存在cAMP分解酶抑制剂的条件下进行工序(2)。
[8]根据[7]所述的方法，其中，向细胞供给cAMP的条件为培养基中存在8-Br-cAMP。
[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，cAMP分解酶抑制剂为IBMX。
[10]根据[4]～[9]中任一项所述的方法，其中，培养工序B包括在(b-2)的培养之后进行的(b-3)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养，
培养工序C包括在(c-2)的培养之后进行的(c-3)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养，
培养工序D包括在(d-1)的培养之后进行的(d-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养。
[11]根据[10]所述的方法，其中，(b-3)的培养、(c-3)的培养及(d-2)的培养期间为1天～10天。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，MEK1抑制剂为PD98059，DNA甲基化抑制剂为5-氮杂-2-脱氧胞苷，TGFβ受体抑制剂为A-83-01。
[13]根据[2]～[12]中任一项所述的方法，其中，使用重组人激活素A作为工序(1-1)中的分化诱导因子。
[14]根据[2]～[13]中任一项所述的方法，其中，使用FGF2或GSK-3β抑制剂作为工序(1-2)中的分化诱导因子。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人工多能干细胞。
[16]根据[15]所述的方法，其中，人工多能干细胞为人的人工多能干细胞。
[17]一种肠上皮细胞样细胞，其利用[1]～[16]中任一项所述的方法而获得。
[18]一种评价被检物质的体内动态或毒性的方法，其使用[17]所述的肠上皮细胞样细胞。
[19]根据[18]所述的方法，其中，所述体内动态为代谢、吸收、排泄、药物相互作用、药物代谢酶的诱导或药物转运体的诱导。
[20]根据[18]或[19]所述的方法，其包括以下的工序(i)～(iii)：
(i)准备由[17]所述的肠上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序；
(ii)使被检物质与所述细胞层接触的工序；及
(iii)对透过了所述细胞层的被检物质进行定量，并评价被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性。
[21]根据[18]或[19]所述的方法，其包括以下的工序(I)及(II)：
(I)使被检物质与[17]所述的肠上皮细胞样细胞接触的工序；及
(II)测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。
[22]一种细胞制剂，其包含[17]所述的肠上皮细胞样细胞。
附图说明
图1是使用人iPS细胞(Windy)的实验1的方案(protocol)。通过在重组人激活素A(Activin A)存在下的3天(第0天～第3天)的培养及在FGF2存在下的4天(第3天～第7天)的培养分化诱导为肠道干细胞之后，通过18天(第8天～第26天)的培养分化诱导为肠上皮细胞。设定分化诱导为肠上皮细胞时的培养基添加成分不同的以下试验组1～6，并比较了对分化的影响。在前半期(第8天～第13天)，将8-溴-3’,5’-环状腺苷一磷酸(8-Br-cAMP)追加到培养基中的试验组1在后半期(第13天～第26天)将8-Br-cAMP追加到培养基中的试验组2在前半期(第8天～第13天)将3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)追加到培养基中的试验组3在后半期(第13天～第26天)将IBMX追加到培养基中的试验组4在前半期(第8天～第13天)将毛喉素(Forskolin)追加到培养基中的试验组5在后半期(第13天～第26天)将毛喉素追加到培养基中的试验组6
图2是cAMP激活剂(毛喉素)对从人iPS细胞向肠上皮细胞样细胞的分化的效果(实验1的结果)。比较了各种标志物基因的表达量。由平均值±S.D.(n＝3)表示。*P＜0.05相对于对照组，**P＜0.01相对于对照组。对照为追加成分(8-Br-cAMP、IBMX、毛喉素)未添加组。
图3是图2的延续。
图4是使用人iPS细胞(Windy)的实验2的方案。通过在重组人激活素A存在下的3天(第0天～第3天)的培养及在FGF2存在下的4天(第3天～第7天)的培养分化诱导为肠道干细胞之后，通过18天(第8天～第26天)的培养分化诱导为肠上皮细胞。设定分化诱导为肠上皮细胞时的培养基添加成分不同的以下试验组1、2，并比较了对分化的影响。第8天～第14天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第14天～第26天将IBMX追加到培养基中的试验组1第8天～第26天将毛喉素追加到培养基中的试验组2
图5是cAMP激活剂(毛喉素)对从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导的效果(实验2的结果)。比较了各种标志物基因的表达量。由平均值±S.D.(n＝3)表示。*P＜0.05相对于8-Br-cAMP及IBMX添加组。
图6是使用人iPS细胞(FF-1)的实验3的方案。通过在重组人激活素A存在下的5天(第0天～第5天)的培养及在FGF2存在下的4天(第5天～第9天)的培养分化诱导为肠道干细胞之后，通过18天(第10天～第28天)的培养分化诱导为肠上皮细胞。设定分化诱导为肠上皮细胞时的培养基添加成分不同的以下试验组1、2，并比较了对分化的影响。第10天～第16天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第16天～第28天将IBMX追加到培养基中的试验组1第10天～第16天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第16天～第28天将毛喉素追加到培养基中的试验组2
图7是cAMP激活剂(毛喉素)对从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导的效果(实验3的结果)。比较了各种标志物基因的表达量。由平均值±S.D.(n＝3)表示。*P＜0.05相对于8-Br-cAMP及IBMX添加组，**P＜0.01相对于8-Br-cAMP及IBMX添加组。
图8是cAMP激活剂(毛喉素)对源自人iPS细胞的肠上皮细胞样细胞的药物代谢酶活性的效果(实验3的结果)。由平均值±S.D.(n＝4)表示。**P＜0.01相对于8-Br-cAMP及IBMX添加组。
图9是使用人iPS细胞(FF-1)的实验4的方案。通过在重组人激活素A存在下的培养及在BMP4、VEGF、FGF2及EGF存在下的培养合计7天(第0天～第7天)的培养及在CHIR99021存在下的4天(第7天～第11天)的培养分化诱导为肠道干细胞之后，通过18天(第12天～第30天)的培养分化诱导为肠上皮细胞。设定分化诱导为肠上皮细胞时的培养基添加成分不同的以下试验组1～3，并比较了对分化的影响。第12天～第18天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第18天～第30天将IBMX追加到培养基中的试验组1第12天～第18天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第18天～第30天将毛喉素追加到培养基中的试验组2第12天～第30天将毛喉素追加到培养基中的试验组3
图10是cAMP激活剂(毛喉素)对源自人iPS细胞的肠上皮细胞样细胞的药物代谢酶活性的效果(实验4的结果)。由平均值±S.D.(n＝4)表示。**P＜0.01相对于对照组。对照为追加成分(8-Br-cAMP、IBMX、毛喉素)未添加组。
图11是使用人iPS细胞(FF-1)的实验5的方案。通过在重组人激活素A存在下的培养及在BMP4、VEGF、FGF2及EGF存在下的培养合计7天(第0天～第7天)的培养及在FGF2存在下的4天(第7天～第11天)的培养分化诱导为肠道干细胞之后，通过18天(第12天～第30天)的培养分化诱导为肠上皮细胞。设定分化诱导为肠上皮细胞时的培养基添加成分不同的以下试验组1～2，并比较了对分化的影响。第12天～第18天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第18天～第30天将IBMX追加到培养基中的试验组1。第12天～第18天将8-Br-cAMP追加到培养基中，第18天～第30天将毛喉素追加到培养基中的试验组2。
图12是cAMP激活剂(毛喉素)对源自人iPS细胞的肠上皮细胞样细胞的药物代谢酶活性的效果(实验5的结果)。由平均值±S.D.(n＝3)表示。人原代小肠细胞相对于试验组1为****P≤0.0001、人原代小肠细胞相对于试验组2为ns P＞0.05，试验组1相对于试验组2为***P≤0.001。人原代小肠细胞使用IVAL公司制造的人原代小肠细胞Lot No.HE3007。
图13是实验1～5中所使用的培养基的组成。
图14是16种药物的Fa值与Papp的关系。将分化的小肠细胞(A)及Caco-2细胞(B)在包含16种药物的运输缓冲液中在37℃下孵育了60分钟。使用以下式拟合了相关曲线。Fa＝1-e-P(1)×Papp。分化的小肠细胞(A)及Caco-2细胞(B)的P(1)值分别为0.531±0.083及3.243±0.992。由平均±标准偏差表示所有数据(n＝3)。
具体实施方式
本发明涉及一种将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞谱系的方法(以下，也称为“本发明的分化诱导方法”。)。根据本发明，可获得显示出与构成活体的肠道组织的肠上皮细胞类似的特性的细胞即肠上皮细胞样细胞。
“多能干细胞”是指兼备能够分化为构成活体的所有细胞的能力(分化多能性)和经过细胞分裂产生具有与自身相同的分化能力的子细胞的能力(自我复制能力)的细胞。分化多能性能够通过将评价对象的细胞移植到裸鼠中并试验有无形成包含三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的各自的细胞的畸胎瘤来评价。
作为多能干细胞，能够举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等，只要是兼备分化多能性及自我复制能力的细胞，则并不限定于此。优选使用ES细胞或iPS细胞。进一步优选使用iPS细胞。多能干细胞优选为哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的细胞，尤其优选为人的细胞。因此，在本发明的最优选的方式中，使用人iPS细胞作为多能干细胞。
ES细胞例如能够通过培养植入前的早期胚胎、构成该早期胚胎的内部细胞团、单个卵裂球等来建立(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Thomson,J.A.et al.,Science,282,1145-1147(1998))。作为早期胚胎，可以使用通过核移植体细胞核而制作出的早期胚胎(Wilmut et al.(Nature,385,810(1997))、Cibelli et al.(Science,280,1256(1998))、入谷明等人(Protein,nucleic acid and enzyme，44,892(1999))、Baguisi etal.(Nature Biot echnology,17,456(1999))、Wakayama et al.(Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))、RideoutIII et al.(Nature Genetics,24,109(2000)、Tachibana et al.(Human Embryonic StemCells Derived by Somatic Cell Nu clear Transfer,Cell(2013)in press)。作为早期胚胎，可以使用孤雌发育胚(Kim et al.(Science,315,482-486(2007))、Nakajima et al.(Stem Cells,25,983-985(2007))、Kim et al.(Cell Stem Cell,1,346-352(2007))、Revazova et al.(Cloning Stem Cells,9,432-449(2007))、Revazova et al.(CloningStem Cells,10,11-24(2008))。除了上述掲示的论文以外，关于ES细胞的制作，可参考Strelchenko N.,et al.Reprod Biomed Online.9：623-629,2004；Klimanskaya I.,etal.Nature 444：481-485,2006；Chung Y.,et al.Cell Stem Cell 2：113-117,2008；ZhangX.,et al Stem Cells 24：2669-2676,2006；Wassarman,P.M.et al.Methods inEnzymology,Vol.365,2003等。另外，通过ES细胞与体细胞的细胞融合而获得的融合ES细胞也包含于本发明的方法中所使用的胚胎干细胞中。
ES细胞中也有能够从保存机构获得的细胞或市售的细胞。例如，关于人ES细胞，能够从京都大学再生医科学研究所(例如KhES-1、KhES-2及KhES-3)、WiCell ResearchInstitute、ESI BIO等获得。
EG细胞能够通过在LIF、bFGF、SCF的存在下培养原始生殖细胞等来建立(Matsuiet al.,Cell,70,841-847(1992)、Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(23),13726-13731(1998)、Turnpenny et al.,Stem Cells,21(5),598-609,(2003))。
“人工多能干细胞(iPS细胞)”是指通过初始化因子的导入等重编程体细胞来制作的具有多能性(多分化能力)和增殖能力的细胞。人工多能干细胞显示出与ES细胞接近的性质。iPS细胞的制作中所使用的体细胞并不受特别限定，可以为分化的体细胞，也可以为未分化的干细胞。并且，其来源也不受特别限定，但优选使用哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的体细胞，尤其优选使用人的体细胞。iPS细胞能够通过至今为止报道的各种方法来制作。并且，当然也可设想适用今后开发的iPS细胞制作法。
iPS细胞制作法的最基本的方法为利用病毒将作为转录因子的Oct3/4、Sox 2、Klf4及c-Myc这4种因子导入细胞的方法(Takahashi K,Yamanaka S：Cell 126(4),663-676,2006；Takahashi,K,et al：Cell 131(5),861-72,2007)。关于人iPS细胞，有通过导入Oct4、Sox2、Lin28及Nonog这4种因子来建立的报道(Yu J,et al：Science 318(5858),1917-1920,2007)。还报道有通过导入除c-Myc以外的3种因子(Nakagawa M,et al：Nat.Biote chnol.26(1),101-106,2008)、导入Oct3/4及Klf4这2种因子(Kim J B,et al：Nature 454(7204),646-650,2008)或仅导入Oct3/4(Kim J B,et al：Cell 136(3),411-419,2009)来建立iPS细胞。并且，还报道有将作为基因的表达产物的蛋白质导入细胞的方法(Zhou H,Wu S,Joo JY,et al：Cell Stem Cell 4,381-384,2009；Kim D,Kim CH,MoonJI,et al：Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，还报道有通过使用对组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294或组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等来提高制作效率或减少所导入的因子等(Huangfu D,et al：Nat.Biotechnol.26(7),795-797,2008；Huangfu D,et al：Nat.Biotechnol.26(11),1269-1275,2008；Silva J,et al：PLoS.Biol.6(10),e 253,2008)。关于基因导入法也进行了研究，除了将逆转录病毒利用于基因导入的技术以外，还开发出将慢病毒(Yu J,et al：Science 318(5858),1917-1920,2007)、腺病毒(Stadtfeld M,et al：Science 322(5903),945-949,2008)、质粒(Okita K,et al：Science 322(5903),949-953,2008)、转座子载体(Woltjen K,Michael IP,MohseniP,et al：Nature 458,766-770,2009；Kaji K,Norrby K,Pac a A,et al：Nature 458,771-775,2009；Yusa K,Rad R,Takeda J,et al：Nat Methods 6,363-369,2009)或附加体型载体(Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,Tian S,et al：Science 324,797-801,2009)利用于基因导入的技术。
能够以Fbxo15、Nanog、Oct4、Fgf-4、Esg-1及Cript等多能干细胞标志物(未分化标志物)的表达等为指标而选择发生了向iPS细胞的转化即初始化(重编程)的细胞。将所选择的细胞作为iPS细胞而回收。
例如，也能够从国立大学法人京都大学或独立行政法人理化学研究所生物资源中心提供iPS细胞。
在本说明书中，“分化诱导”是指促使按照特定的细胞谱系分化。在本发明中，将iPS细胞分化诱导为肠上皮细胞。本发明的分化诱导方法大体包括2个阶段的诱导工序，即，将iPS细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序(工序(1))和将所获得的肠道干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞的工序(工序(2))。以下，对各工序的详细内容进行说明。
＜工序(1)向肠道干细胞样细胞的分化＞
在该工序中，培养多能干细胞，并将其分化为肠道干细胞样细胞。换言之，在诱导向肠道干细胞样细胞的分化的条件下培养多能干细胞。多能干细胞只要分化为肠道干细胞样细胞，则培养条件并不受特别限定。典型地，进行以下说明的2个阶段的分化诱导，即，多能干细胞向内胚层样细胞的分化(工序(1-1))和内胚层样细胞向肠道干细胞样细胞的分化(工序(1-2))，以使多能干细胞经由内胚层样细胞分化为肠道干细胞样细胞。
工序(1-1)向内胚层样细胞的分化
在该工序中，培养多能干细胞，并将其分化为内胚层样细胞。换言之，在诱导向内胚层的分化的条件下培养多能干细胞。多能干细胞只要分化为内胚层样细胞，则培养条件并不受特别限定。例如，按照常规方法在添加了重组人激活素A的培养基中培养。在该情况下，将培养基中的重组人激活素A的浓度例如设为10ng/mL～200ng/mL，优选设为20ng/mL～150ng/mL。从细胞的增殖率或维持等观点考虑，优选在培养基中添加血清或血清替代物(KnockOutTM Serum Replacement(KSR)等)。血清并不限于胎牛血清，也能够使用人血清或绵羊血清等。血清或血清替代物的添加量例如为0.1％(v/v)～10％(v/v)。
也可以将Wnt/β-连环蛋白信号通路的抑制剂(例如，六氯酚、槲皮素、作为Wnt配体的Wnt3a)添加到培养基中来谋求促进向内胚层样细胞的分化。
也可以将BMP4、VEGF及FGF2中的一种以上添加到培养基中来谋求促进向内胚层样细胞的分化。在该情况下，培养基中的BMP4的浓度例如为0.1ng/mL～10ng/mL，优选为1ng/mL～5ng/mL，培养基中的VEGF的浓度例如为0.5ng/mL～100ng/mL，优选为1ng/mL～20ng/mL，培养基中的FGF2的浓度例如为0.2ng/mL～50ng/mL，优选为0.5ng/mL～10ng/mL。
该工序也能够利用国际公开第2014/165663号小册子中所记载的方法或依照该方法的方法来进行。
在优选的一方式中，作为工序(1-1)，进行2个阶段的培养。在第1阶段的培养中，在添加有较低浓度的血清(例如，0.1％(v/v)～1％(v/v))的培养基中进行，在接下来的第2阶段的培养中，在比第1阶段的培养提高了血清浓度的培养基(血清浓度例如为1％(v/v)～10％(v/v))中进行。如此采用2个阶段的培养在通过第1阶段的培养抑制未分化细胞的增殖，通过接下来的第2阶段使分化的细胞增殖的方面优选。
工序(1-1)的期间(培养期间)例如为1天～10天，优选为2天～7天。当采用2个阶段的培养作为工序(1-1)时，将第1阶段的培养期间例如设为1天～7天，优选设为2天～5天，将第2阶段的培养期间例如设为1天～6天，优选设为1天～4天。
工序(1-2)向肠道干细胞样细胞的分化
在该工序中，培养工序(1-1)中所获得的内胚层样细胞，并将其分化为肠道干细胞样细胞。换言之，在诱导向肠道干细胞样细胞的分化的条件下培养内胚层样细胞。内胚层样细胞只要分化为肠道干细胞样细胞，则培养条件并不受特别限定。优选在FGF2(成纤维细胞生长因子2)的存在下或GSK-3β抑制剂的存在下进行培养。作为FGF2，优选使用人FGF2(例如人重组FGF2)。
典型地，将经过工序(1-1)而获得的细胞群或其一部分不进行挑选而供于工序(1-2)。另一方面，也可以从经过工序(1-1)而获得的细胞群中挑选内胚层样细胞之后实施工序(1-2)。内胚层样细胞的挑选例如以细胞表面标志物为指标用流式细胞仪(细胞分选仪)进行即可。
“在FGF2的存在下”的含义与在培养基中添加有FGF2的条件相同。因此，为了进行在FGF2的存在下的培养，使用添加有FGF2的培养基即可。若示出FGF2的添加浓度的例子，则为100ng/mL～500ng/mL。
同样地，“在GSK-3β抑制剂的存在下”的含义与在培养基中添加有GSK-3β抑制剂的条件相同。因此，为了进行在GSK-3β抑制剂的存在下的培养，使用添加有GSK-3β抑制剂的培养基即可。作为GSK-3β抑制剂，能够例示出CHIR99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、靛玉红(Indirubin)、Bikinin、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)。若示出GSK-3β抑制剂的添加浓度的例子(CHIR 99021的情况)，则为1μM～100μM，优选为3μM～30μM。
工序(1-2)的期间(培养期间)例如为2天～10天，优选为3天～7天。若该培养期间过短，则无法充分获得所期待的效果(提高分化效率、促进获得作为肠道干细胞的功能)。另一方面，若该培养期间过长，则引起分化效率的降低。
例如，能够以肠道干细胞标志物的表达为指标来判定或评价分化为肠道干细胞样细胞。若举出肠道干细胞标志物的例子，则为包含富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5(LGR5)、肝配蛋白B2受体(EphB2)。
＜工序(2)向肠上皮细胞样细胞的分化＞
在该工序中，并用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质而将工序(1)中所获得的肠道干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞。在本发明中，在该分化诱导时，通过使用cAMP激活物质来积极提高细胞内的cAMP水平。“并用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质”是指为了进行构成工序(2)的1或2个以上的培养，需要这些所有的化合物，并不要求将同时使用这些所有的化合物即使用添加有这些所有的化合物的培养基进行培养作为必须的条件。
典型地，将经过工序(1)而获得的细胞群或其一部分不进行挑选而供于工序(2)。另一方面，也可以从经过工序(1)而获得的细胞群中挑选肠道干细胞样细胞之后实施工序(2)。肠道干细胞样细胞的挑选例如以细胞表面标志物为指标进行流式细胞仪(细胞分选仪)即可。
工序(2)由1或2个以上的培养构成(详细内容后述)。在构成工序(2)的各培养中，例如使用添加有EGF及cAMP激活物质作为必须成分的培养基、添加有MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF作为必须成分的培养基、添加有EGF作为必须成分的培养基、添加有MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质作为必须成分的培养基等。
作为MEK1抑制剂，能够举出PD98059、PD184352、PD184161、PD0325901、U0126、MEKinhibitor I、MEK inhibitor II、MEK1/2inhibitor II、SL327。同样地，作为DNA甲基化抑制剂，能够举出5-氮杂-2-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、RG108、泽布拉林(Zebularine)。关于TGFβ受体抑制剂，若考虑后述的实施例中所使用的A-83-01对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7显示出抑制活性，则优选使用对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7中的一种以上显示出抑制活性的受体抑制剂。例如，A-83-01、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5inhibitor、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSox满足该条件。作为cAMP激活物质，能够使用毛喉素、吲哚美辛、NKH477(考福新达普酸盐)、源自细胞的毒素蛋白(百日咳毒素、霍乱毒素)、PACAP-27、PACAP-38、SKF83822等。毛喉素显示出腺苷酸环化酶激活作用，促进细胞内cAMP的合成。
若示出MEK1抑制剂的添加浓度的例子(PD98059的情况)，则为4μM～100μM，优选为10～40μM。同样地，若示出DNA甲基化抑制剂的添加浓度的例子(5-氮杂-2-脱氧胞苷的情况)，则为1μM～25μM，优选为2.5μM～10μM，若示出TGFβ受体抑制剂的添加浓度的例子(A-83-01的情况)，则为0.1μM～2.5μM，优选为0.2μM～1μM。EGF的添加浓度的例子为5ng/mL～100ng/mL，优选为10ng/mL～50ng/mL。并且，若示出cAMP激活物质的添加浓度的例子(毛喉素的情况)，则为1μM～200μM，优选为5μM～100μM。另外，关于使用与所例示出的化合物即PD98059、5-氮杂-2-脱氧胞苷、A-83-01及毛喉素不同的化合物时的添加浓度，若考虑所使用的化合物的特性与所例示出的化合物(PD98059、5-氮杂-2-脱氧胞苷、A-83-01、毛喉素)的特性的差异(尤其是活性的差异)，只要是本领域技术人员，则能够依据上述浓度范围进行设定。并且，能够通过依据后述的实施例的预备实验来确认所设定的浓度范围是否适当。
除了上述条件以外，可以在向细胞供给cAMP的条件(称为“追加条件1”)及存在cAMP分解酶抑制剂的条件(称为“追加条件2”)或这些中的任一条件下进行工序(2)。追加条件1(向细胞供给cAMP的条件)的含义与存在能够被吸入细胞内且若被吸入细胞内则作为cAMP起作用的化合物的条件相同。因此，为了满足追加条件1，例如使用添加有能够被吸入细胞内的cAMP衍生物的培养基即可。若采用追加条件1，则能够期待抑制细胞内cAMP浓度的降低，促进向肠上皮细胞的分化诱导、尤其获得作为肠上皮细胞的功能。即，该条件能够使得可制备具备更多功能的肠上皮细胞样细胞。作为cAMP衍生物，能够采用PKA激活剂(例如，8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine-3′,5′-cyclic monophos phate sodium salt：8-溴腺苷-3',5'-环单磷酸钠盐)，CAS号：76939-46-3)、6-Bnz-cAMP(N6-Benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt：N6-苯甲酰腺苷-3',5'-环单磷酸酯钠盐，CAS号：1135306-29-4)、cAMPS-Rp((R)-Adenosine,cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate)triethylammoniu m salt：(R)-腺苷环3',5'-(硫代磷酸氢酯)三乙基铵盐，CAS号：151837-09-1)、cAMPS-Sp((S)-Adenosine,cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate)triethylammonium salt((S)-Adenosine,cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioat e)triethylammonium salt：(S)-腺苷环3',5'-(硫代磷酸氢酯)三乙基铵盐(S)-腺苷环3',5'-(硫代磷酸氢酯)三乙基铵盐)，CAS号：93602-66-5)、Dibutyryl-cAMP(N6,O2'-Dibutyryl adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodiu m salt：N6,O2'-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸酯钠盐)，CAS号：16980-89-5)、8-Cl-cAMP(8-Chloroadenosine-3',5'-cyclic monophosphate salt：8-氯腺苷-3',5'-环单磷酸酯盐)，CAS号：124705-03-9))、Epac激活剂(Rp-8-Br-cAMP S(8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic monophosphothioate,Rp-Isomer.sodium salt：8-溴腺苷3',5'-环单硫代磷酸酯,Rp-异构体.钠盐)，CAS号：129735-00-8)、8-CPT-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclicmonophosphate：8-(4-氯苯基硫代)腺苷3',5'-环单磷酸酯)，CAS号：93882-12-3)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium：8-(4-氯苯基硫代)-2'-O-甲基腺苷3',5'-环单磷酸酯单钠)，CAS号：634207-53-7)等)。若示出cAMP衍生物的添加浓度的例子(8-Br-cAMP的情况)，则为0.1mM～10mM，优选为0.2mM～5mM，进一步优选为0.5mM～2mM。另外，关于使用所例示出的化合物即与8-Br-cAMP不同的化合物时的添加浓度，若考虑所使用的化合物的特性与所例示出的化合物(8-Br-cAMP)的特性的差异(尤其是活性的差异)，只要是本领域技术人员，则能够依据上述浓度范围进行设定。并且，能够通过依据后述的实施例的预备实验来确认所设定的浓度范围是否适当。
追加条件2(存在cAMP分解酶抑制剂的条件)的含义与在培养基中添加有cAMP分解酶抑制剂的条件相同。若采用追加条件2，则能够期待通过cAMP的分解抑制来抑制细胞内cAMP浓度的降低，促进获得向肠上皮细胞的分化诱导、尤其作为肠上皮细胞的功能。即，该条件能够使得可制备具备更多功能的肠上皮细胞样细胞。另外，若并用追加条件1和追加条件2，则能够向细胞供给cAMP，同时抑制细胞内cAMP浓度的降低。因此，成为用于将细胞内cAMP维持为高水平的有效的条件，能够期待促进向肠上皮细胞的高效率的分化诱导。
作为cAMP分解酶抑制剂，能够例示出IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)(MIX)、茶碱(Theophylline)、罂粟碱(Papaverine)、己酮可可碱(循能泰)(Pentoxifylline(Trental))、KS-505、8-甲氧基甲基-IBMX(8-Methoxymethyl-IBMX)、长春西汀(Vinpocetine)(TCV-3B)、EHNA、曲喹辛(Trequinsin)(HL-725)、利沙齐农(Lixazinone)(RS-82856)、(LY-186126)、西洛酰胺(Cilostamide)(OPC3689)、贝莫拉旦(Bemoradan)(RWJ-22867)、Anergrelide(BL4162A)、吲哚利旦(Indolidan)(LY195115)、西洛他唑(Cilostazol)(OPC-13013)、米力农(Milrinone)(WIN47203)、氰胍佐旦(Siguazodan)(SKF-94836)、5-甲基-伊马唑旦(5-Methyl-imazodan)(CI 930)、SKF-95654、Pirilobendan(UD-CG 115 BS)、依诺昔酮(Enoximone)(MDL 17043)、伊马唑旦(Imazodan)(CL914)、SKF-94120、维司力农(Vesnarinone)(OPC 8212)、咯利普兰(Rolipram)(Ro-20-1724)、(ZK-62711)、登布茶碱(Denbufyll'ine)、扎普司特(Zaprinast)(M&B-22,948)、双嘧达莫(Dipyridamole)、扎达维林(Zardaverine)、AH-21-132、硫马唑(Sulmazol)(AR-L115BS)。若示出cAMP分解酶抑制剂的添加浓度的例子(IBMX的情况)，则为0.05mM～5mM，优选为0.1mM～3mM，进一步优选为0.2mM～1mM。另外，关于使用所例示出的化合物即与IBMX不同的化合物时的添加浓度，若考虑所使用的化合物的特性与所例示出的化合物(IBMX)的特性的差异(尤其是活性的差异)，只要是本领域技术人员，则能够依据上述浓度范围进行设定。并且，能够通过依据后述的实施例的预备实验来确认所设定的浓度范围是否适当。
工序(2)的期间(培养期间)例如为7天～40天，优选为10天～30天。若该培养期间过短，则无法充分获得所期待的效果(提高分化效率、促进获得作为肠上皮细胞的功能)。另一方面，若该培养期间过长，则引起分化效率的降低。
例如，能够以肠上皮细胞标志物的表达或肽的吸入或经由维生素D受体的药物代谢酶的表达诱导为指标而判定或评价分化为肠上皮细胞样细胞。若举出肠上皮细胞标志物的例子，则为ATP结合盒转运蛋白B1/多药耐性蛋白1(ABCB1/MDR1)、ATP结合盒转运蛋白G2/乳癌耐性蛋白(ABCG2/BCRP)、细胞色素P450 3A4(CYP3A4)、脂肪酸结合蛋白2(FABP2)、孕烷X受体(PXR)、SLC(溶质载体(solute carrier))家族成员5A1/钠偶联型葡萄糖转运蛋白1(SLC5A1/SGLT1)、SLC(溶质载体(solute carrier))家族成员15A1/肽转运蛋白1(SLC15A1/PEPT1)、SLC(溶质载体(solute carrier))有机阴离子转运蛋白2B1(SLCO2B1/OATP2B1)、蔗糖酶-异麦芽糖酶、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A4(UGT1A4)、绒毛蛋白1(Villin 1)、羧酸酯酶2A1(CES2A1)。其中，对肠上皮的特异性高的蔗糖酶-异麦芽糖酶及绒毛蛋白1、作为小肠中的主要药物代谢酶的CYP3A4、参与在小肠中肽的吸收的SLC15A1/PEPT1、作为在小肠的顶膜侧表达的葡萄糖转运蛋白的SLC5A1/SGLT1、参与在小肠中有机阴离子的吸收的SLCO2B1/OATP2B1、作为在小肠中高表达的水解酶的CES2A1为尤其有效的标志物。
若想要获得仅由目标细胞(肠上皮细胞样细胞)构成的细胞群或以高比率(高纯度)包含目标细胞的细胞群，则以目标细胞的特征性细胞表面标志物为指标而挑选并分取培养后的细胞群即可。
优选进行以下的A～D中的任一培养工序作为工序(2)。
＜培养工序A＞
在培养工序A中，进行(a-1)在EGF及细胞内cAMP合成促进剂的存在下的培养、在该培养之后进行的(a-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养；若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(a-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(a-2)的培养期间例如为9天～29天，优选为7天～27天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。
可以在向细胞供给cAMP的条件(称为“追加条件1”)及存在cAMP分解酶抑制剂的条件(称为“追加条件2”)或这些中的任一条件下进行(a-1)的培养。(a-2)的培养也相同。追加条件1及追加条件2的详细内容如上所述。
＜培养工序B＞
在培养工序B中，进行(b-1)在EGF的存在下的培养和在该培养之后进行的(b-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及细胞内cAMP合成促进剂的存在下的培养。若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(b-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(b-2)的培养期间例如为9天～19天，优选为7天～17天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。
可以在向细胞供给cAMP的条件(“追加条件1”)及存在cAMP分解酶抑制剂的条件(“追加条件2”)或这些中的任一条件下进行(b-1)的培养。(b-2)的培养也相同。追加条件1及追加条件2的详细内容如上所述。
在(b-2)的培养之后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((b-3)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。
＜培养工序C＞
在培养工序C中，进行(c-1)在EGF及细胞内cAMP合成促进剂的存在下的培养和在该培养之后进行的(c-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及细胞内cAMP合成促进剂的存在下的培养。若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(c-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(c-2)的培养期间例如为9天～19天，优选为7天～17天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。
可以在向细胞供给cAMP的条件(“追加条件1”)及存在cAMP分解酶抑制剂的条件(“追加条件2”)或这些中的任一条件下进行(c-1)的培养。(c-2)的培养也相同。追加条件1及追加条件2的详细内容如上所述。
在(c-2)的培养之后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((c-3)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。
＜培养工序D＞
在培养工序D中，进行(d-1)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、T GFβ受体抑制剂、EGF及细胞内cAMP合成促进剂的存在下的培养。该培养工序在培养操作简便、对向肠上皮细胞的分化更有效、由于是化合物而能够期待稳定的效果等方面尤其有利。(d-1)的培养期间例如为15天～25天，优选为17天～23天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。
可以在向细胞供给cAMP的条件(“追加条件1”)及存在cAMP分解酶抑制剂的条件(“追加条件2”)或这些中的任一条件下进行(d-1)的培养。追加条件1及追加条件2的详细内容如上所述。
在(d-1)的培养之后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((d-2)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。
在能够构成本发明的各工序((1)、(1-1)、(1-2)、(2)、(a-1)、(a-2)、(b-1)、(b-2)、(b-3)、(c-1)、(c-2)、(c-3)、(d-1)、(d-2))中，可以在中途进行传代培养。例如，在成为汇合或亚汇合时，采集细胞的一部分，将其移到另一培养容器中，继续培养。为了促进分化，优选将细胞密度设定为较低。例如，以1×104个/cm2～1×106个/cm2左右的细胞密度接种细胞即可。
培养基更换或传代培养等所伴随的细胞的回收时，为了抑制细胞死亡，可以用Y-27632等ROCK抑制剂(Rho-associated coiled-coil forming kinase(Rh o相关的卷曲螺旋形成激酶)/Rho结合激酶)预先处理细胞。
构成本发明的各工序中的其他培养条件(培养温度等)只要设为在动物细胞的培养中一般采用的条件即可。即，例如在37℃、5％CO2的环境下培养即可。并且，作为基本培养基，能够使用伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(IMDM)(GIBCO公司等)、哈姆F12培养基(HamF12)(SIGMA公司、Gibco公司等)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(D-MEM)(nacalaitesque，Inc,、SIGMA公司、Gibco公司等)、格拉斯哥基本培养基(Gibco公司等)、RPMI1640培养基等。也可以并用2种以上的基本培养基。在构成工序(1-2)、工序(2)、工序(2)的培养工序A、培养工序B、培养工序C、培养工序D中，优选使用适合于上皮细胞的培养的基本培养基(例如D-MEM与哈姆F12培养基的混合培养基、D-MEM)。能够添加于培养基中的成分的例子，能够举出牛血清白蛋白(BSA)、抗生物质、2-巯基乙醇、PVA、非必须氨基酸(NEAA)、胰岛素、转铁蛋白、硒。典型地，使用培养皿等二维培养细胞。根据本发明的方法，能够通过二维培养从多能干细胞获得肠上皮细胞样细胞。但是，也可以实施使用凝胶状的培养基材或三维培养板等的三维培养。
本发明的第2方式涉及一种利用本发明的分化诱导方法制备出的肠上皮细胞样细胞的用途。作为第1用途，提供各种测定。本发明的肠上皮细胞样细胞能够利用于肠道、尤其是小肠的模型系统，并且对肠道、尤其是小肠中的药代动力(吸收、代谢等)的评价或毒性的评价有用。换言之，本发明的肠上皮细胞样细胞能够利用于化合物的体内动态的评价或毒性的评价。
具体而言，能够使用本发明的肠上皮细胞样细胞对被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导、毒性等进行试验。即，本发明提供评价被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导、毒性等的方法(第1方式)作为肠上皮细胞样细胞的用途之一。在该方法中，进行如下工序：(i)准备由利用本发明的分化诱导方法而获得的肠上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序、(ii)使被检物质与所述细胞层接触的工序、(iii)对透过了所述细胞层的被检物质进行定量，并评价被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。另外，关于被检物质的吸收性，也能够利用后述的方法(第2方式)进行评价。
在工序(i)中，典型地，在半透过性膜(多孔性膜)上培养肠上皮细胞样细胞，使其形成细胞层。具体而言，例如使用具备培养插件(culture insert)的培养容器(例如，Corning Incorporated Co.,Ltd.提供的Transwell(注册商标))，在培养插件内接种细胞进行培养，由此获得由肠上皮细胞样细胞构成的细胞层。
工序(ii)中的“接触”典型地通过在培养基中添加被检物质来进行。被检物质的添加定时并不受特别限定。因此，可以在不包含被检物质的培养基中开始培养之后，在某一时间点添加被检物质，也可以在预先包含被检物质的培养基中开始培养。
被检物质中能够使用各种各样的分子大小的有机化合物或无机化合物。作为有机化合物的例子，能够例示出核酸、肽、蛋白质、脂质(简单脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、鞘脂、甘油醇糖脂、脑苷脂等)、前列腺素、类异戊二烯、萜烯、类固醇、多酚、儿茶素、维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等)。医药品、营养食品、食品添加物、农药、美容品(化妆品)等已知成分或候选成分也是优选的被检物质之一。也可以将植物提取液、细胞提取液、培养上清液等用作被检物质。可以通过同时添加2种以上的被检物质来调查被检物质之间的相互作用、相乘作用等。被检物质可以源自天然物，或也可以通过合成进行制造。在后者的情况下，例如能够利用组合合成方法构建高效率的测定系统。
能够任意地设定接触被检物质的期间。接触期间例如为10分钟～3天，优选为1小时～1天。可以分多次进行接触。
在工序(iii)中，对透过了细胞层的被检物质进行定量。例如，当使用如Transwell(注册商标)那样的具备培养插件的培养容器时，根据被检物质，利用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等测定方法将透过了培养插件的被检物质即经由细胞层移动到上部或下部容器内的被检物质进行定量。根据定量结果(透过了细胞层的被检物质的量)和被检物质的使用量(典型地，在培养基中的添加量)，判定并评价被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性。
本发明还提供一种评价被检物质的代谢或吸收的方法作为另一方式(第2方式)。在该方法中，进行(I)使被检物质与利用本发明的分化诱导方法而获得的肠上皮细胞样细胞接触的工序和(II)测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。
工序(I)即肠上皮细胞样细胞与被检物质的接触能够与上述工序(ii)同样地实施。但是，不必预先形成细胞层。
在工序(I)之后，测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序(工序(II))。在紧接工序(I)之后即被检物质的接触之后，可以不隔开实质性的时间间隔而测定并评价代谢等，或者，可以经过一定的时间(例如10分钟～5小时)之后测定并评价代谢等。代谢的测定例如能够通过检查代谢产物来进行。在该情况下，通常将工序(I)后的培养液作为样品而定性或定量测定可预想的代谢产物。测定方法只要根据代谢产物选择适当的方法即可，例如能够采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。
典型地，在检测出被检物质的代谢产物时，判定或评价为“被检物质被代谢”。并且，能够根据代谢产物的量来评价被检物质的代谢量。也可以根据代谢产物的検出结果和被检物质的使用量(典型地，在培养基中的添加量)来计算出被检物质的代谢效率。
也能够以肠上皮细胞样细胞中的药物代谢酶(细胞色素P450(尤其是CYP3A4)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶(尤其是UGT1A8、UGT1A10)、硫酸転移酶(尤其是SULT1A3等))的表达为指标而测定被检物质的代谢。药物代谢酶的表达能够以mRNA水平或蛋白质水平来评价。例如，当发现药物代谢酶的mRNA水平上升时，能够判定为“被检物质被代谢”。同样地，当发现药物代谢酶的活性上升时，能够判定为“被检物质被代谢”。与将代谢产物作为指标而进行判定的情况同样地，可以根据药物代谢酶的表达量进行定量判定和评价。
为了评价被检物质的吸收，例如测定培养液中的被检物质的残留量。通常，将工序(I)后的培养液作为样品而将被检物质进行定量。测定方法只要根据被检物质选择适当的方法即可。例如，能够采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。典型地，当发现培养液中的被检物质的含量降低时，判定并评价为“被检物质被吸收”。并且，能够根据降低程度来判定并评价被检物质的吸收量或吸收效率。另外，也能够通过测定吸入细胞内的被检物质的量来评价吸收。
另外，也可以同时或并行进行代谢的测定和评价及吸收的测定和评价。
作为利用本发明的分化诱导方法而制备出的肠上皮细胞样细胞的第2用途，提供一种含有肠上皮细胞样细胞的细胞制剂。本发明的细胞制剂能够适用于各种肠道疾病的治疗。尤其，可设想作为受损伤的(包括机能障碍)肠上皮组织的再生/重建用材料的利用。即，能够期待对再生医疗的贡献。本发明的细胞制剂例如能够通过将利用本发明的方法而获得的肠上皮细胞样细胞悬浮于生理盐水或缓冲液(例如磷酸类缓冲液)等中或者使用该细胞制作三维组织体(有机体或球体)来制备。作为单剂量，例如含有1×105个～1×1010个的细胞即可，以便能够施用治疗有效量的细胞。细胞的含量能够考虑使用目的、对象疾病、适用对象(接受者)的性别、年龄、体重、患部的状态、细胞的状态等而适当地调整。
本发明的细胞制剂中可以含有以细胞的保护为目的的二甲基亚砜(DMSO)或血清白蛋白等、以防止细菌的混入为目的的抗生物质等、以细胞的活化、增殖或分化诱导等为目的的各种成分(维生素类、细胞因子、成长因子、类固醇等)。另外，本发明的细胞制剂中可以含有制剂上可接受的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。
实施例
对促进从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化/获得功能有用的低分子化合物的探索
以确立简便且高效率地制备显示出更接近活体的肠上皮细胞的功能的细胞(肠上皮细胞样细胞)的方法为目的，进行了以下研究。
＜实施例1＞
1.方法
(1)细胞
人iPS细胞使用了Windy(iPS-51)及FF-1株。Windy为使用全嗜逆转录病毒载体将八聚体结合蛋白3/4(octamer binding protein 3/4)(OCT3/4)、性别决定区Y框蛋白2(sexdetermining region Y-box 2)(SOX2)、克虏伯样因子4(kruppel-like factor 4)(KLF4)、V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(禽类)(v-myc myelocytomatosis viral oncogenehomolog(avian))(c-MYC)导入人胚胎肺成纤维细胞MRC-5之后，克隆了人ES细胞样菌落而获得的，由国立成育医疗研究中心的梅择明弘博士提供。饲养细胞使用了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。FF-1株由FUJIFILM Corporation提供。。
(2)培养基
在MEF的培养中使用了包含10％胎牛血清(FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-Glu)、1％非必须氨基酸(NEAA)、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)。MEF的剥离液使用了0.05％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)，MEF的保存液使用了CELLBANKER-1。在Windy的维持培养中使用了包含20％KnockOut血清替代物(KSR)、0.8％NEAA、2mmol/L L-Glu、0.1mmol/L 2-巯基乙醇(2-MeE)、5ng/mL成纤维细胞生长因子2(FGF2)的DMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)。剥离液使用了包含1mg/mL胶原酶IV、0.25％胰蛋白酶、20％KSR、1mmol/L氯化钙的杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水(PBS)，保存液使用了灵长类ES/iPS细胞用冷冻保存液。FF-1株的维持培养使用了mTesR1。
(3)人iPS细胞的培养
将Windy接种在将实施了丝裂霉素C处理的MEF(6×105cells/100mm培养皿)上，并在5％CO2/95％空气条件下的CO2孵育箱中在37℃下进行了培养。将FF-1株在涂覆有基质胶的培养皿上进行了培养。在培养3～5天之后，以1:2～1:3的扩增倍数进行了人iPS细胞的传代。人iPS细胞在解冻48小时后更换培养基，此后每天进行了更换。
(4)人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导
人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导是在人iPS细胞相对于培养皿中未分化菌落所占的比例成为约70％的状态下开始的。将Windy在包含0.5％FBS、100ng/mL重组人激活素A、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的罗斯维尔公园纪念研究所(RPMI)+Glutamax培养基中培养2天，并在包含2％FBS、100ng/mL重组人激活素A、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的RPMI+Glutamax培养基中培养1天，由此分化诱导为内胚层。然后，在包含2％FBS、1％Glutamax、250ng/mL FGF2的DMEM/F12中培养4天，由此分化诱导为肠道干细胞。在该处理之后，添加Y-27632(Rho结合激酶抑制剂)以成为10μm ol/L，用Accutase剥离在5％CO2/95％空气条件下的CO2孵育箱中在37℃下处理了60分钟的细胞，并将其接种在预先在人iPS细胞用培养基中稀释了30倍并去除了成长因子的用基质胶涂覆的细胞培养用24孔板上。然后，在包含2％FBS、1％Glutamax、1％NEAA、2％B27supplement、1％N2supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)、10μmol/L Y-27632的DMEM/F12中培养1天，并在包含2％FBS、1％Glutamax、1％NEAA、2％B27supplement、1％N2supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)的DMEM/F12中培养18天，由此分化诱导为肠上皮细胞。并且，在分化诱导时，除了本发明人等以前作为分化诱导因子发现的低分子化合物即PD98059(20μmol/L)、5-氮杂-2-脱氧胞苷(5μmol/L)、A-83-01(0.5μmol/L)以外，还添加1mmol/L的8-溴-3’,5’-环状腺苷一磷酸(8-Br-cAMP)、0.1或0.5mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10或30μmol/L的毛喉素，研究了其对向肠道干细胞及肠上皮细胞的分化诱导产生的影响。
设定了使用Windy的实验1(图1)及实验2(图4)和使用FF-1株的实验3(图6)、实验4(图9)及实验5(图11)。另外，关于FF-1株，在实验3中，向内胚层的分化诱导中进行了5天(第0天～第5天)的培养，向肠道干细胞的分化诱导中进行了4天(第5天～第9天)的培养，向肠上皮细胞的分化诱导中进行18天(第10天～第28天)的培养，在实验4中，向内胚层的分化诱导中进行了7天(第0天～第7天)的培养，向肠道干细胞的分化诱导中进行了4天(第7天～第11天)的培养，向肠上皮细胞的分化诱导中进行了18天(第12天～第30天)的培养，在实验5中，向内胚层的分化诱导中进行了7天(第0天～第7天)的培养，向肠道干细胞的分化诱导中进行了4天(第7天～第11天)的培养，向肠上皮细胞的分化诱导中进行了18天(第12天～第30天)的培养。另外，依据国际公开第2014/165663号小册子中所记载的方法(具体而言，实施例1及实施例5)进行了实验4及实验5中的向内胚层的分化诱导。
(5)总核糖核酸(RNA)的提取
在人iPS细胞的分化诱导结束后，按照RNeasy(注册商标)Mini Kit(Qiagen)所附手册提取了总RNA。
(6)逆转录反应
互补DNA(cDNA)的合成中使用了ReverTra Ace(注册商标)qPCR RT Kit(TOYOBOCO.,LTD.)。操作按照所附手册。
(7)实时逆转录聚合酶链反应(Real-Time RT-PCR)
使用KAPA SYBR Fast qPCR Kit(NIPPON Genetics Co,Ltd.)并将cDNA作为模板进行了实时RT-PCR。操作按照所附手册。使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)作为内源性对照，校正了测定结果。
(8)药物代谢实验
在分化诱导结束后，在包含5μmol/L咪达唑仑及10μmol/L 7-羟基香豆素的培养基(包含1％Glutamax、1％NEAA、1％N2supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL EGF的DMEM/F12)中在37℃下进行孵育，经过24小时(实验3及4)或2小时(实验5)之后，对培养基进行了采样。根据使用液相色谱-质谱仪(LC-MS/MS)测定出的培养基中的1-氢氧化咪达唑仑或7-羟基香豆素葡萄糖醛酸的量计算出代谢活性。在代谢实验结束后进行蛋白质定量，并以蛋白质量校正了代谢活性。
以下示出本研究中所使用的标志物基因的特征。
ABCB1/MDR1(ATP结合盒转运蛋白B1/多药耐性蛋白1)：是P糖蛋白，作为排转运蛋白发挥功能。
CYP3A4(细胞色素P450 3A4)：是在小肠中主要的药物代谢酶。
FABP(脂肪酸结合蛋白2)：有各种亚型，FABP2为肠道型。
PXR(孕烷X受体)：参与CYP3A4的表达或诱导。
SLC5A1/SGLT1(SLC(溶质载体(solute carrier))家族成员5A1/钠偶联型葡萄糖转运蛋白1)：在小肠的顶膜侧表达的葡萄糖转运蛋白。
SLC15A1/PEPT1(SLC(溶质载体(solute carrier))家族成员15A1/肽转运蛋白1)：在小肠的顶膜侧表达。
Villin 1(绒毛蛋白1)：是微絨毛的主要构成成分。
CES2A1：羧酸酯酶2A1。作为水解酶的CES有1A和2A1的同种型(isoform)，在肝臓中CES1A高表达，在小肠中CES2A1高表达。
2.结果
(1)对向肠上皮细胞的分化诱导的效果的研究
在分化开始后第8天以后，通过添加毛喉素，发现各种肠道标志物的基因表达水平的显著上升(图2、3)。毛喉素对肠道标志物表达的效果呈现与至今为止发明人等发现的8-Br-cAMP类似的倾向，但对于作为主要的药物代谢酶的CYP3A4和作为排转运蛋白很重要的ABCB1/MDR1的表达，毛喉素的效果远远高于8-Br-cAMP的效果。并且，与并用了至今为止发明人等开发出的8-Br-cAMP和IBMX的分化诱导法相比，通过毛喉素的单独分化，作为肠上皮细胞标志物尤其重要的CYP3A4及SGLT1的表达水平显著上升(图5)。因此，表明毛喉素对促进从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化非常有效。
(2)对源自iPS细胞的肠上皮细胞样细胞中药物代谢酶活性的效果
与使用8-Br-cAMP及IBMX进行分化的情况相比，通过使用8-Br-cAMP及毛喉素进行分化，各种肠道标志物的基因表达水平显著上升(图7)，并且CYP3A4及UGT活性显著上升(图8)。并且，通过从分化诱导开始后第12天开始长期使用毛喉素来代替8-Br-cAMP，发现CYP3A4活性的更显著的上升(图10)。在UGT活性中，在使用8-Br-cAMP及毛喉素进行分化的组中显示出最高的代谢活性(图10)。另外，在使用FGF2分化为肠道干细胞样细胞且使用8-Br-cAMP及毛喉素分化为肠上皮样细胞的组中，观察到与人原代小肠细胞相同程度的CYP3A4活性(图11、图12)。据此，认为毛喉素不仅有助于肠道标志物的基因表达，还有可能有助于提高药物代谢酶活性等药代动力学功能。
通过在从人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导时使用毛喉素，除了尤其重要的肠上皮细胞标志物的表达水平上升以外，基于在小肠中表达的药物代谢酶中尤其重要的CYP3A4的代谢活性也大幅上升。并且，这次的方法对代谢酶活性的效果比至今为止发明人等发现的方法更高。可以认为在将该细胞应用于药物研发时，在功能方面可获得这种效果的分化诱导法是非常有用的方法。
3.总结
根据以上结果，建立了从人iPS细胞制作比至今为止更成熟的肠上皮细胞样细胞的方法。并且，还发现了该细胞充分具有基于CYP3A4等的药物代谢活性，并且具有与人原代小肠细胞相同程度的CYP3A4活性。目前广泛地用作药物的消化道吸收试验系统的Caco-2细胞具有药物代谢活性低的问题，因此认为通过本发明能够制作具有更接近人的小肠的功能的细胞。
＜实施例2＞
1.方法
(1)从人iPS细胞向小肠上皮细胞的分化
用包含100ng/mL重组人激活素A的无血清培养基对人iPS细胞(FF-1)处理24小时而使其开始分化。然后，在包含100ng/mL重组人激活素A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF及5ng/mL FGF2的无血清培养基中处理144小时而使其分化为内胚层。然后，在包含2％FBS、1％GlutaMax、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素硫酸盐、250ng/mL FGF2的AdvancedDMEM/F-12中培养96小时，由此使其分化为小肠干细胞。用Accutase剥离重组人激活素A及FGF2处理后的小肠干细胞样细胞，并将其接种在预先在人iPS培养基中稀释了30倍的GFRMatrigel上。接种后，在包含2％FBS、0.1mM NEAA、2mM L-Glu、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素硫酸盐、2％B27 supplement、1％N2supplement、1％HepExtend supplement、20ng/mL EGF及30μM毛喉素的Advanced DMEM/F-12中培养了19-23天。在分化结束前的12-16天开始添加PD98059至20μM，5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2'-dC)至5μM，A-83-01至0.5μM，使其分化为小肠上皮细胞。
(2)膜透过试验
在接种在细胞培养插件(Cell culture insert)上的源自人iPS细胞的小肠上皮细胞及Caco-2细胞的顶(apical)室中添加HBSS(pH6.5)，在底(basal)室中添加HBSS(pH7.4)，并在37℃下预孵育了60分钟。然后，将包含通过跨细胞道路透过的化合物即醋丁洛尔(acebutolol)、二甲双胍(metformin)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、舒必利(sulpiride)及荧光黄(lucifer yellow)、通过转运蛋白道路透过的化合物即头孢氨苄(cephalexin)、赖诺普利(lisinopril)、利巴韦林(ribavirin)及依那普利(enalapril)、通过转细胞道路透过的化合物即安替比林(antipyrine)及咖啡因(caffeine)、CYP3A4的基质即红霉素(erythromycin)、茚地那韦(indinavir)、咪达唑仑(midazolam)、他克莫司(tacrolimus)及维拉帕米(verapamil)的HBSS(pH6.5)添加到顶室中，并在37℃下预孵育了60分钟。关于各化合物的终浓度，添加lisinopril及caffeine至50μM，lucifer yellow至50μg/mL，其他化合物至10μM。并且，在底室中添加了HBSS(pH7.4)。每15分钟从接收室侧回收了样品。使用UPLC-MS/MS测定了未变化体。从现有报道参考了人Fa·Fg(下述文献1～6)。
文献1：Takenaka T,Harada N,Kuze J,Chiba M,Iwao T,Matsunaga T.Humansmall intestinal epithelial cells differentiated from adult intestinalstemcells as a novel system for predicting oral drug absorption inhumans.Drug Metab Dispos.42：1947-54(2014).
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文献6：Cheng KC,Li C,Uss AS.Prediction of oral drug absorption inhumans--from cultured cell lines and experimental animals.Expert Opin DrugMetab Toxicol.4：581-90(2008).
使用以下式，通过非线性最小二乘法分析了除CYP3A4的基质以外的11种化合物的Papp与人体中的Fa·Fg的相关性。分析方法参考了现有报道(上述文献2)。
[数学式1]
其中，P(1)是比例因子(scaling factor)。非线性回归分析中使用了WinNonlin(Certara，美国)。为了评价源自人iPS细胞的小肠上皮细胞及Caco-2细胞中的Papp与人体中的Fa·Fg的相关性，计算出相关系数(R值)。
2.结果
(1)源自人iPS细胞株的小肠上皮细胞的膜透过特性
为了验证能否根据源自人iPS细胞株的小肠上皮细胞的膜透过试验结果的Papp来预测人体中的Fa·Fg，比较了16种化合物的Papp和Fa·Fg(表1)。通过非线性最小二乘法分析了源自人iPS细胞的小肠上皮细胞及Caco-2细胞中除CYP3A4的基质以外的11种化合物的Papp与Fa·Fg的相关性，其结果，获得了图14所示的回归曲线。源自人iPS细胞的小肠上皮细胞及Caco-2细胞中的比例因子分别为0.531±0.083、3.243±0.992。在源自人iPS细胞的小肠上皮细胞中，通过细胞间隙通路的化合物或通过转运蛋白运输的化合物的Papp随着Fa·Fg的值变大而其值逐渐变大。然而，在Caco-2细胞中，即使是具有不同的Fa·Fg的化合物，Papp也显示出几乎相同的值(图14)。除CYP3A4的基质以外的11种化合物中的Papp与Fa·Fg的相关系数为，源自人iPS细胞的小肠上皮细胞为0.9，Caco-2细胞为0.56，源自人iPS细胞的小肠上皮细胞与人体中的Fa·Fg具有高相关性。[表1]
表1：分化的肠细胞和Caco-2细胞的Papp值。将细胞在包含多种药物的运输缓冲液中在37℃下孵育了60分钟。由平均±标准偏差表示所有数据(n＝3)。
3.考察
根据膜透过试验的结果可看出，在Caco-2细胞中，通过细胞间隙通路或转运蛋白运输的Fa·Fg不同的各种各样的化合物以相同程度的速度透过，但源自人iPS细胞的小肠上皮细胞随着化合物的Fa·Fg的大小而以不同的速度透过(图14)。因此，与Caco-2细胞相比，源自人iPS细胞的小肠上皮细胞中的Papp与Fa·Fg显示出更高相关性。作为其原因，认为是由于Caco-2细胞具有牢固的紧密连接，通过细胞间隙通路的药物的透过性低或转运蛋白低表达。根据这些结果表明，与Caco-2细胞相比，源自人iPS细胞的小肠上皮细胞的通过细胞间隙通路的基质及被转运蛋白运输的基质的膜透过的预测更优异。
产业上的可利用性
根据本申请发明，能够简便且高效率地从多能干细胞制备更加功能性的肠上皮细胞样细胞。肠上皮细胞样细胞作为小肠的模型系统而有用，并且能够利用于吸收/代谢/膜透过性、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导、毒性的评价等。并且，还可以期待作为各种肠道疾病治疗用的细胞制剂的有效成分或作为再生医疗材料的利用。
本发明并不受上述发明的实施方式及实施例的说明的任何限定。在不脱离权利要求书的记载且本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式也包含于本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报及专利公报等的内容通过援用其全部内容而得到引用。

Claims (19)

1.一种将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞的方法，其包括以下的工序（1）及（2）：（1）将多能干细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序；（2）并用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质而将工序（1）中所获得的肠道干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞的工序，所述cAMP激活物质为毛喉素，所述肠上皮细胞中的CYP3A4、ABCB1/MDR1、SLC5A1/SGLT1和UGT的表达水平上升。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，工序（1）包括以下的工序（1-1）及（1-2）：（1-1）将人工多能干细胞分化为内胚层样细胞的工序；（1-2）将工序（1-1）中所获得的内胚层样细胞分化为肠道干细胞样细胞的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，工序（2）中的培养期间为7天～40天。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，工序（2）包括以下的A～D中的任一培养工序：培养工序A：包括（a-1）在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在该培养之后进行的（a-2）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养；培养工序B：包括（b-1）在EGF的存在下的培养和在该培养之后进行的（b-2）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养；培养工序C：包括（c-1）在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在该培养之后进行的（c-2）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养；培养工序D：包括（d-1）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，（a-1）的培养期间为2天～10天，（a-2）的培养期间为9天～29天，（b-1）的培养期间为2天～10天，（b-2）的培养期间为9天～19天，（c-1）的培养期间为2天～10天，（c-2）的培养期间为9天～19天，（d-1）的培养期间为15天～25天。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在向细胞供给cAMP的条件和/或存在cAMP分解酶抑制剂的条件下进行工序（2）。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，向细胞供给cAMP的条件为培养基中存在8-Br-cAMP。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，cAMP分解酶抑制剂为IBMX。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，培养工序B包括在（b-2）的培养之后进行的（b-3）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养，培养工序C包括在（c-2）的培养之后进行的（c-3）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养，培养工序D包括在（d-1）的培养之后进行的（d-2）在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，（b-3）的培养、（c-3）的培养及（d-2）的培养期间为1天～10天。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，MEK1抑制剂为PD98059，DNA甲基化抑制剂为5-氮杂-2-脱氧胞苷，TGFβ受体抑制剂为A-83-01。
12.根据权利要求2所述的方法，其中，使用重组人激活素A作为工序（1-1）中的分化诱导因子。
13.根据权利要求2所述的方法，其中，使用FGF2或GSK-3β抑制剂作为工序（1-2）中的分化诱导因子。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，多能干细胞为人工多能干细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，人工多能干细胞为人的人工多能干细胞。
16.一种评价被检物质的体内动态或毒性的方法，其使用利用权利要求1~15中任一项所述的方法获得的肠上皮细胞样细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述体内动态为代谢、吸收、排泄、药物相互作用、药物代谢酶的诱导或药物转运体的诱导。
18.根据权利要求16所述的方法，其包括以下的工序（i）～（iii）：（i）准备由利用权利要求1~15中任一项所述的方法获得的肠上皮细胞样细胞构成的细胞层的工序；（ii）使被检物质与所述细胞层接触的工序；（iii）对透过了所述细胞层的被检物质进行定量，并评价被检物质的吸收性或膜透过性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性。
19.根据权利要求16所述的方法，其包括以下的工序（I）及（II）：（I）使被检物质与利用权利要求1~15中任一项所述的方法获得的肠上皮细胞样细胞接触的工序；（II）测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。
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