KR20200106930A

KR20200106930A - 다능성 줄기 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법

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Publication number: KR20200106930A
Application number: KR1020207022847A
Authority: KR
Inventors: 다미히데 마츠나가; 다카히로 이와오; 도모키 가베야; 신지 미마; 도시히데 미야시타
Original assignee: 고리츠다이가쿠호징 나고야시리츠다이가쿠; 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2019-02-08
Publication date: 2020-09-15
Also published as: US20200370020A1; JP2022075898A; CN111684058B; EP3750985A1; JPWO2019156200A1; JP7317317B2; JP7317323B2; EP3750985A4; WO2019156200A1; KR102446763B1; CA3090473C; CA3090473A1; CN111684058A

Abstract

본 발명은, 생체의 장관 상피 세포에 보다 가까운 기능을 나타내는 세포를 간편하게 또한 효율적으로 조제 가능한 새로운 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의하면, (1) 다능성 줄기 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정과, (2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질을 병용하여, 공정 (1)에서 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정에 의하여, 다능성 줄기 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도한다.

Description

다능성 줄기 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법

본 발명은 다능성 줄기 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

소장에는 많은 약물 대사 효소나 약물 트랜스포터가 존재하는 점에서, 간과 동일하게, 약물의 초회 통과 효과에 관련되는 장기로서 매우 중요하다. 그 때문에, 의약품 개발 조기의 단계부터 소장에 있어서의 의약품의 막 투과성이나 대사를 평가하는 것이, 약물 동태 특성이 우수한 의약품의 개발에 필요하다. 현재, 소장의 모델계로서는 인간 결장암 유래의 Caco-2 세포가 다용되고 있다. 그러나, Caco-2 세포에 있어서의 약물 트랜스포터의 발현 패턴은 인간 소장과는 다르다. 또, Caco-2 세포에는 약물 대사 효소의 발현 및 효소 유도는 거의 인정되지 않는 점에서, 정확하게 소장에서의 약물 동태를 평가하는 것은 어렵다. 따라서, 소장에 있어서의 약물 대사 및 막 투과성을 종합적으로 평가하기 위해서는 초대 소장 상피 세포의 이용이 바람직하지만, 기능의 면이나 공급에 관하여 문제가 있는 점에서, 초대 간 세포와 같이 약물 동태 시험계로서 널리 이용하는 것은 곤란하다.

그런데, 인간 인공 다능성 줄기(induced pluripotent stem: iPS) 세포는 2007년에 야마나카 등에 의하여 수립되었다. 이 인간 iPS 세포는, 1998년에 Thomson 등에 의하여 수립된 인간 배성 줄기(embryonic stem: ES) 세포와 동일한, 다분화능(多分化能)과 거의 무한한 증식능을 갖는 세포이다. 인간 iPS 세포는 인간 ES 세포에 비하여 윤리적인 문제가 적어, 의약품 개발을 위한 안정된 세포 공급원으로서 기대된다.

또한, 약제의 흡수 시험 등에 이용되는 장관 상피 세포를 제공하기 위하여, 장관 유래의 세포로부터 장관의 줄기/전구 세포를 선택적으로 취득하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1). 또, ALK5 저해 인자를 이용한 다능성 세포의 제작 내지 유지 방법이 제안되어 있다(특허문헌 2).

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 2008-206510호 특허문헌 2: 일본 공표특허공보 2012-511935호 특허문헌 3: 국제 공개공보 제2014/132933호 특허문헌 4: 국제 공개공보 제2017/154795호

비특허문헌 1: Ueda T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan 1; 391(1): 38-42. 비특허문헌 2: McCracken KW et al., Nat Protoc. 2011 Nov 10; 6(12): 1920-8 비특허문헌 3: Spence JR, Nature. 2011 Feb 3; 470(7332): 105-109. 비특허문헌 4: Ogaki S et al., Stem Cells. 2013 Jun; 31(6): 1086-1096. 비특허문헌 5: Ozawa T et al., Sci Rep. 2015 Nov 12; 5: 16479. 비특허문헌 6: Ogaki S et al., Sci Rep. 2015 Nov 30; 5: 17297. 비특허문헌 7: Iwao T et al., Drug Metab Pharmacokinet, 29(1), 44-51(2014). 비특허문헌 8: Iwao T et al., Drug Metab Dispos, 43(6), 603-610(2015).

iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도에 관해서는 몇 개의 보고가 있는데(예를 들면, 비특허문헌 1~6을 참조), 이들의 보고에서의 분화 유도법은 번잡하며, 또한 분화 효율이 충분하지 않아, 약물 동태학적인 해석은 상세하게 행해지고 있지 않다. 또한, 당해 분화 유도법은 매우 고가인 증식 인자나 사이토카인류를 대량으로 이용하여 분화를 유도하고 있어, 실용화에 적합하지 않다. 본 발명자들도, 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화에 대하여 연구를 진행하고 있고, 제작한 장관 상피 세포와 같은 세포는 다양한 약물 동태학적 기능을 갖는 것을 보고하고 있다(특허문헌 3, 비특허문헌 7, 8). 또, 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 촉진 및 기능 획득에 유용한 저분자 화합물이나 조건을 발견하고 있다(특허문헌 3, 4, 비특허문헌 8).

이상과 같이, 많은 연구자에 의하여 정력적인 연구가 행해져, 일정한 성과가 얻어지고 있지만, 약물 동태 어세이나 독성 시험 등에 이용 가능한 기능적인 장관 상피 세포를 인 비트로로 조제하는 것에 대한 요구는 여전히 높다. 특히, 기능면의 향상과 조제 효율의 향상이 요망된다. 따라서 본 발명은, 생체의 장관 상피 세포에 보다 가까운 기능을 나타내는 세포(장관 상피 세포와 같은 세포)를 간편하게 또한 효율적으로 조제 가능한 새로운 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제하, 본 발명자들은, 더 효율적인 분화 유도법의 개발을 목표로 하여, 상세한 검토를 행했다. 그 결과, iPS 세포로부터 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도할 때, cAMP 활성화 물질의 존재하에서 세포를 배양하여 세포 내의 cAMP 레벨을 적극적으로 상승시키는 것이, 효율적인 분화 유도 및 성숙화(기능의 획득)에 매우 유효하다는 것이 판명되었다. 또, 분화 유도에 사용하는 저분자 화합물의 조합이나 첨가 시기 등에 대한 유익한 정보도 발견되었다.

검토 끝에 발견된 배양 조건으로 제작된 장관 상피 세포와 같은 세포는, 장관 상피 특이적인 효소(약물 대사 효소)를 고발현하고, 기능적으로 우수한 것이었다. 이하의 발명은, 주로 상기의 성과 및 고찰에 근거한다.

[1] 이하의 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, 다능성 줄기 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도하는 방법:

(1) 다능성 줄기 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정;

(2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질을 병용하여, 공정 (1)에서 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정.

[2] 공정 (1)이 이하의 공정 (1-1) 및 (1-2)로 이루어지는, [1]에 기재된 방법:

(1-1) 다능성 줄기 세포를 내배엽과 같은 세포로 분화시키는 공정;

(1-2) 공정 (1-1)에서 얻어진 내배엽과 같은 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정.

[3] 공정 (2)에 있어서의 배양 기간이 7일간 내지 40일간인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4] 공정 (2)가, 이하의 A~D 중 어느 것의 배양 공정을 포함하는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법,

배양 공정 A: (a-1) EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양과, 상기 배양 후에 행해지는, (a-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함한다,

배양 공정 B: (b-1) EGF의 존재하에서의 배양과, 상기 배양 후에 행해지는, (b-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다,

배양 공정 C: (c-1) EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양과, 상기 배양 후에 행해지는, (c-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다,

배양 공정 D: (d-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다.

[5] (a-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (a-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 29일간이고,

(b-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (b-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 19일간이고,

(c-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (c-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 19일간이고,

(d-1)의 배양의 기간은 15일간 내지 25일간인, [4]에 기재된 방법.

[6] cAMP 활성화 물질이 포스콜린인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[7] 공정 (2)가, cAMP가 세포로 공급되는 조건 및/또는 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건으로 행해지는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] cAMP가 세포로 공급되는 조건이, 배지 중에 8-Br-cAMP가 존재하는 것인, [7]에 기재된 방법.

[9] cAMP 분해 효소 저해제가 IBMX인, [7] 또는 [8]에 기재된 방법.

[10] 배양 공정 B가, (b-2)의 배양 후에 행해지는, (b-3) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하고,

배양 공정 C가, (c-2)의 배양 후에 행해지는, (c-3) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하며,

배양 공정 D가, (d-1)의 배양 후에 행해지는, (d-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하는, [4] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[11] (b-3)의 배양, (c-3)의 배양, 및 (d-2)의 배양의 기간은 1일간 내지 10일간인, [10]에 기재된 방법.

[12] MEK1 저해제가 PD98059이며, DNA 메틸화 저해제가 5-아자-2'-디옥시사이티딘이고, TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01인, [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[13] 공정 (1-1)에 있어서의 분화 유도 인자로서 액티빈 A를 이용하는, [2] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[14] 공정 (1-2)에 있어서의 분화 유도 인자로서 FGF2 또는 GSK-3β 저해제를 이용하는, [2] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[15] 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포인, [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[16] 인공 다능성 줄기 세포가 인간 인공 다능성 줄기 세포인, [15]에 기재된 방법.

[17] [1] 내지 [16] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포와 같은 세포.

[18] [17]에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포를 이용한, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법.

[19] 상기 체내 동태가, 대사, 흡수, 배설, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, [18]에 기재된 방법.

[20] 이하의 공정 (i)~(iii)을 포함하는, [18] 또는 [19]에 기재된 방법:

(i) [17]에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정;

(ii) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정;

(iii) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하여, 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정.

[21] 이하의 공정 (I) 및 (II)를 포함하는, [18] 또는 [19]에 기재된 방법:

(I) [17]에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정;

(II) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정.

[22] [17]에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포를 포함하는, 세포 제제.

도 1은 인간 iPS 세포(Windy)를 이용한 실험 1의 프로토콜. 액티빈(Activin A) 존재하에서의 3일간(0일째~3일째)의 배양 및 FGF2 존재하에서의 4일간(3일째~7일째)의 배양에 의하여 장관 줄기 세포로 분화 유도한 후, 18일간(8일째~26일째)의 배양에 의하여 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 장관 상피 세포로의 분화 유도 시의 배지 첨가 성분이 다른 이하의 시험군 1~6을 설정하여, 분화에 대한 영향을 비교했다. 전반(8일째~13일째)에 8-브로모-3',5'-사이클릭아데노신-인산(8-Br-cAMP)을 배지에 추가한 시험군 1 후반(13일째~26일째)에 8-Br-cAMP를 배지에 추가한 시험군 2 전반(8일째~13일째)에 3-아이소뷰틸-1-메틸잔틴(IBMX)을 배지에 추가한 시험군 3 후반(13일째~26일째)에 IBMX를 배지에 추가한 시험군 4 전반(8일째~13일째)에 포스콜린(Forskolin)을 배지에 추가한 시험군 5 후반(13일째~26일째)에 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 6
도 2는 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포와 같은 세포로의 분화에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 1의 결과). 각종 마커 유전자의 발현량을 비교했다. 평균값±S.D.(n=3)으로 나타냈다. *P<0.05 대 컨트롤군, **P<0.01 대 컨트롤군. 컨트롤은 추가 성분(8-Br-cAMP, IBMX, Forskolin) 비첨가군.
도 3은 도 2의 계속.
도 4는 인간 iPS 세포(Windy)를 이용한 실험 2의 프로토콜. Activin A 존재하에서의 3일간(0일째~3일째)의 배양 및 FGF2 존재하에서의 4일간(3일째~7일째)의 배양에 의하여 장관 줄기 세포로 분화 유도한 후, 18일간(8일째~26일째)의 배양에 의하여 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 장관 상피 세포로의 분화 유도 시의 배지 첨가 성분이 다른 이하의 시험군 1, 2를 설정하여, 분화에 대한 영향을 비교했다. 8일째~14일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 14일째~26일째는 IBMX를 배지에 추가한 시험군 1 8일째~26일째에 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 2
도 5는 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 2의 결과). 각종 마커 유전자의 발현량을 비교했다. 평균값±S.D.(n=3)으로 나타냈다. *P<0.05 대 8-Br-cAMP 및 IBMX 첨가군.
도 6은 인간 iPS 세포(FF-1)를 이용한 실험 3의 프로토콜. Activin A 존재하에서의 5일간(0일째~5일째)의 배양 및 FGF2 존재하에서의 4일간(5일째~9일째)의 배양에 의하여 장관 줄기 세포로 분화 유도한 후, 18일간(10일째~28일째)의 배양에 의하여 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 장관 상피 세포로의 분화 유도 시의 배지 첨가 성분이 다른 이하의 시험군 1, 2를 설정하여, 분화에 대한 영향을 비교했다. 10일째~16일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 16일째~28일째는 IBMX를 배지에 추가한 시험군 1 10일째~16일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 16일째~28일째는 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 2
도 7은 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 3의 결과). 각종 마커 유전자의 발현량을 비교했다. 평균값±S.D.(n=3)으로 나타냈다. *P<0.05 대 8-Br-cAMP 및 IBMX 첨가군, **P<0.01 대 8-Br-cAMP 및 IBMX 첨가군.
도 8은 인간 iPS 세포 유래 장관 상피 세포와 같은 세포의 약물 대사 효소 활성에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 3의 결과). 평균값±S.D.(n=4)로 나타냈다. **P<0.01 대 8-Br-cAMP 및 IBMX 첨가군.
도 9는 인간 iPS 세포(FF-1)를 이용한 실험 4의 프로토콜. Activin A 존재하에서의 배양 및 BMP4, VEGF, FGF2 및 EGF 존재하에서의 배양, 합계로 7일간(0일째~7일째)의 배양 및 CHIR99021 존재하에서의 4일간(7일째~11일째)의 배양에 의하여 장관 줄기 세포로 분화 유도한 후, 18일간(12일째~30일째)의 배양에 의하여 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 장관 상피 세포로의 분화 유도 시의 배지 첨가 성분이 다른 이하의 시험군 1~3을 설정하여, 분화에 대한 영향을 비교했다. 12일째~18일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 18일째~30일째는 IBMX를 배지에 추가한 시험군 1 12일째~18일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 18일째~30일째는 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 2 12일째~30일째에 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 3
도 10은 인간 iPS 세포 유래 장관 상피 세포와 같은 세포의 약물 대사 효소 활성에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 4의 결과). 평균값±S.D.(n=4)로 나타냈다. **P<0.01 대 컨트롤군. 컨트롤은 추가 성분(8-Br-cAMP, IBMX, Forskolin) 비첨가군.
도 11은 인간 iPS 세포(FF-1)를 이용한 실험 5의 프로토콜. Activin A 존재하에서의 배양 및 BMP4, VEGF, FGF2 및 EGF 존재하에서의 배양, 합계로 7일간(0일째~7일째)의 배양 및 FGF2 존재하에서의 4일간(7일째~11일째)의 배양에 의하여 장관 줄기 세포로 분화 유도한 후, 18일간(12일째~30일째)의 배양에 의하여 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 장관 상피 세포로의 분화 유도 시의 배지 첨가 성분이 다른 이하의 시험군 1~2를 설정하여, 분화에 대한 영향을 비교했다. 12일째~18일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 18일째~30일째는 IBMX를 배지에 추가한 시험군 1. 12일째~18일째는 8-Br-cAMP를 배지에 추가하고, 18일째~30일째는 Forskolin을 배지에 추가한 시험군 2.
도 12는 인간 iPS 세포 유래 장관 상피 세포와 같은 세포의 약물 대사 효소 활성에 대한 cAMP 활성화제(포스콜린)의 효과(실험 5의 결과). 평균값±S.D.(n=3)으로 나타냈다. 인간 초대 소장 세포 대 시험군 1은 **** P≤0.0001, 인간 초대 소장 세포 대 시험군 2는 ns P>0.05, 시험군 1 대 시험군 2는 *** P≤0.001. 인간 초대 소장 세포는 IVAL사제 인간 초대 소장 세포 Lot No.HE3007을 사용.
도 13은 실험 1~5에 사용한 배지의 조성.
도 14는 16종의 약물의 F_a값 및 P_app의 관계. 분화한 장 세포 (A) 및 Caco-2 세포 (B)를 16종의 약물을 포함하는 트랜스포트 완충액으로 37℃에서 60분간 인큐베이트했다. 상관 곡선을 이하의 식을 이용하여 피팅했다. F_a=1-e^-P(1)×Papp. 분화한 장 세포 (A) 및 Caco-2 세포 (B)의 P(1)값은 각각, 0.531±0.083 및 3.243±0.992였다. 전체 데이터는 평균±표준 편차로 나타낸다(n=3).

본 발명은 다능성 줄기 세포를 장관 상피 세포 계보로 분화 유도하는 방법(이하, "본 발명의 분화 유도 방법"이라고도 부름)에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 생체의 장관 조직을 구성하는 장관 상피 세포와 유사한 특성을 나타내는 세포, 즉 장관 상피 세포와 같은 세포가 얻어진다.

"다능성 줄기 세포"란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력(분화 다능성)과, 세포 분열을 거쳐 자기와 동일한 분화능을 갖는 낭세포를 산출하는 능력(자기 복제능)을 겸비하는 세포를 말한다. 분화 다능성은, 평가 대상의 세포를 누드 마우스에 이식하고, 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 각각의 세포를 포함하는 테라토마 형성의 유무를 시험함으로써, 평가할 수 있다.

다능성 줄기 세포로서, 배성 줄기 세포(ES 세포), 배성 생식 세포(EG 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등을 들 수 있는데, 분화 다능성 및 자기 복제능을 겸비하는 세포인 한, 이것에 한정되지 않는다. 바람직하게는 ES 세포 또는 iPS 세포를 이용한다. 더 바람직하게는 iPS 세포를 이용한다. 다능성 줄기 세포는, 바람직하게는 포유 동물(예를 들면, 인간이나 침팬지 등의 영장류, 마우스나 래트 등의 설치류)의 세포, 특히 바람직하게는 인간의 세포이다. 따라서, 본 발명의 가장 바람직한 양태에서는, 다능성 줄기 세포로서, 인간 iPS 세포가 이용된다.

ES 세포는, 예를 들면 착상 이전의 초기 배아, 당해 초기 배아를 구성하는 내부 세포 덩어리, 단일 할구(割球) 등을 배양함으로써 수립할 수 있다(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147(1998)). 초기 배아로서, 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배아를 이용해도 된다(Wilmut et al.(Nature, 385, 810(1997)), Cibelli et al.(Science, 280, 1256(1998)), 이리야 아키라(단백질 핵산 효소, 44, 892(1999)), Baguisi et al.(Nature Biotechnology, 17, 456(1999)), Wakayama et al.(Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)), Rideout III et al.(Nature Genetics, 24, 109(2000), Tachibana et al.(Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell(2013) in press). 초기 배아로서, 단위 발생 배아를 이용해도 된다(Kim et al. (Science, 315, 482-486(2007)), Nakajima et al.(Stem Cells, 25, 983-985(2007)), Kim et al.(Cell Stem Cell, 1, 346-352(2007)), Revazova et al.(Cloning Stem Cells, 9, 432-449(2007)), Revazova et al.(Cloning Stem Cells, 10, 11-24(2008)). 상기에 게재된 논문 외에, ES 세포의 제작에 대해서는 Strelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9:623-629, 2004; Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol. 365, 2003 등이 참고가 된다. 또한, ES 세포와 체세포의 세포 융합에 의하여 얻어지는 융합 ES 세포도, 본 발명의 방법에 이용되는 배성 줄기 세포에 포함된다.

ES 세포 중에는, 보존 기관으로부터 입수 가능한 것, 혹은 시판되고 있는 것도 있다. 예를 들면, 인간 ES 세포에 대해서는 교토 대학 재생 의과학 연구소(예를 들면 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO 등으로부터 입수 가능하다.

EG 세포는, 원시 생식 세포를, LIF, bFGF, SCF의 존재하에서 배양하는 것 등에 의하여 수립할 수 있다(Matsui et al., Cell, 70, 841-847(1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731(1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).

"인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)"란, 초기화 인자의 도입 등에 의하여 체세포를 리프로그래밍함으로써 제작되는, 다능성(다분화능)과 증식능을 갖는 세포이다. 인공 다능성 줄기 세포는 ES 세포에 가까운 성질을 나타낸다. iPS 세포의 제작에 사용하는 체세포는 특별히 한정되지 않으며, 분화한 체세포여도 되고, 미분화의 줄기 세포여도 된다. 또, 그 유래도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유 동물(예를 들면, 인간이나 침팬지 등의 영장류, 마우스나 래트 등의 설치류)의 체세포, 특히 바람직하게는 인간의 체세포를 이용한다. iPS 세포는, 지금까지 보고된 각종 방법에 의하여 제작할 수 있다. 또, 향후 개발되는 iPS 세포 제작법을 적용하는 것도 당연히 상정된다.

iPS 세포 제작법의 가장 기본적인 수법은, 전사 인자인 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 4인자를, 바이러스를 이용하여 세포로 도입하는 방법이다(Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007). 인간 iPS 세포에 대해서는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nonog의 4인자의 도입에 의한 수립의 보고가 있다(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007). c-Myc를 제외한 3인자(Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26(1), 101-106, 2008), Oct3/4 및 Klf4의 2인자(Kim J B, et al: Nature 454(7204), 646-650, 2008), 혹은 Oct3/4만(Kim J B, et al: Cell 136(3), 411-419, 2009)의 도입에 의한 iPS 세포의 수립도 보고되어 있다. 또, 유전자의 발현 산물인 단백질을 세포에 도입하는 수법(Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009)도 보고되어 있다. 한편, 히스톤메틸기 전이 효소 G9a에 대한 저해제 BIX-01294나 히스톤탈아세틸화 효소 저해제 발프로산(VPA) 혹은 BayK8644 등을 사용함으로써 제작 효율의 향상이나 도입하는 인자의 저감 등이 가능하다는 보고도 있다(Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26(7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26(11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6(10), e 253, 2008). 유전자 도입법에 대해서도 검토가 진행되어, 레트로 바이러스 외에, 렌티 바이러스(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007), 아데노 바이러스(Stadtfeld M, et al: Science 322(5903), 945-949, 2008), 플라스미드(Okita K, et al: Science 322(5903), 949-953, 2008), 트랜스포존 벡터(Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), 혹은 에피소말 벡터(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009)를 유전자 도입에 이용한 기술이 개발되어 있다.

iPS 세포로의 형질 전환, 즉 초기화(리프로그래밍)가 발생한 세포는 Fbxo15, Nanog, Oct4, Fgf-4, Esg-1 및 Cript 등의 다능성 줄기 세포 마커(미분화 마커)의 발현 등을 지표로 하여 선택할 수 있다. 선택된 세포를 iPS 세포로서 회수한다.

iPS 세포는, 예를 들면 국립 대학 법인 교토 대학 또는 독립 행정 법인 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 제공을 받을 수도 있다.

본 명세서에 있어서 "분화 유도한다"란, 특정 세포 계보를 따라 분화하도록 작용하는 것을 말한다. 본 발명에서는 iPS 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도한다. 본 발명의 분화 유도 방법은 크게 나누어 2단계의 유도 공정, 즉 iPS 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정(공정 (1))과, 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정(공정 (2))을 포함한다. 이하, 각 공정의 상세를 설명한다.

<공정 (1) 장관 줄기 세포와 같은 세포로의 분화>

이 공정에서는 다능성 줄기 세포를 배양하여, 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시킨다. 환언하면, 장관 줄기 세포와 같은 세포로의 분화를 유도하는 조건하에서 다능성 줄기 세포를 배양한다. 다능성 줄기 세포가 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화하는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로는, 다능성 줄기 세포가 내배엽과 같은 세포를 통하여 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화하도록, 이하에서 설명하는 2단계의 분화 유도, 즉 다능성 줄기 세포의 내배엽과 같은 세포로의 분화(공정 (1-1))와, 내배엽과 같은 세포의 장관 줄기 세포와 같은 세포로의 분화(공정 (1-2))를 행한다.

공정 (1-1) 내배엽과 같은 세포로의 분화

이 공정에서는 다능성 줄기 세포를 배양하여, 내배엽과 같은 세포로 분화시킨다. 환언하면, 내배엽으로의 분화를 유도하는 조건하에서 다능성 줄기 세포를 배양한다. 다능성 줄기 세포가 내배엽과 같은 세포로 분화하는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 통상의 방법에 따라, 액티빈 A를 첨가한 배지에서 배양한다. 이 경우, 배지 중의 액티빈 A의 농도를 예를 들면 10ng/mL~200ng/mL, 바람직하게는 20ng/mL~150ng/mL로 한다. 세포의 증식률이나 유지 등의 관점에서, 배지에 혈청 또는 혈청 대체물(KnockOut^TM Serum Replacement(KSR) 등)을 첨가하는 것이 바람직하다. 혈청은 소태아 혈청에 한정되는 것은 아니고, 인간 혈청이나 양 혈청 등을 이용할 수도 있다. 혈청 또는 혈청 대체물의 첨가량은 예를 들면 0.1%(v/v)~10%(v/v)이다.

Wnt/β-카테닌 시그널 경로의 저해제(예를 들면, 헥사클로로펜, 퀘세틴, Wnt 리간드인 Wnt3a)를 배지에 첨가하여, 내배엽과 같은 세포로의 분화의 촉진을 도모해도 된다.

BMP4, VEGF, 및 FGF2 중 하나 이상을 배지에 첨가하여, 내배엽과 같은 세포로의 분화의 촉진을 도모해도 된다. 이 경우, 배지 중의 BMP4의 농도는 예를 들면 0.1ng/mL~10ng/mL, 바람직하게는 1ng/mL~5ng/mL이며, 배지 중의 VEGF의 농도는 예를 들면 0.5ng/mL~100ng/mL, 바람직하게는 1ng/mL~20ng/mL이고, 배지 중의 FGF2의 농도는 예를 들면 0.2ng/mL~50ng/mL, 바람직하게는 0.5ng/mL~10ng/mL이다.

이 공정은, 국제 공개공보 제2014/165663호에 기재된 방법 또는 그것에 준한 방법으로 행할 수도 있다.

바람직한 일 양태에서는, 공정 (1-1)로서 2단계의 배양을 행한다. 1단계째의 배양에서는 비교적 저농도의 혈청(예를 들면, 0.1%(v/v)~1%(v/v))을 첨가한 배지에서 행하고, 계속되는 2단계째의 배양에서는 1단계째의 배양보다 혈청 농도를 높인 배지(혈청 농도를 예를 들면 1%(v/v)~10%(v/v))에서 행한다. 이와 같이 2단계의 배양을 채용하는 것은, 1단계째의 배양에 의하여 미분화 세포의 증식을 억제하고, 계속되는 2단계째에 의하여 분화한 세포를 증식시키는 점에서 바람직하다.

공정 (1-1)의 기간(배양 기간)은 예를 들면 1일간~10일간, 바람직하게는 2일간~7일간이다. 공정 (1-1)로서 2단계의 배양을 채용하는 경우에는 1단계째의 배양 기간을 예를 들면 1일간~7일간, 바람직하게는 2일간~5일간으로 하고, 2단계째의 배양 기간을 예를 들면 1일간~6일간, 바람직하게는 1일간~4일간으로 한다.

공정 (1-2) 장관 줄기 세포와 같은 세포로의 분화

이 공정에서는, 공정 (1-1)에서 얻어진 내배엽과 같은 세포를 배양하여, 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시킨다. 환언하면, 장관 줄기 세포로의 분화를 유도하는 조건하에서 내배엽과 같은 세포를 배양한다. 내배엽과 같은 세포가 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화하는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, FGF2(선유아 세포 증식 인자2)의 존재하, 또는 GSK-3β 저해제의 존재하에서 배양을 행한다. FGF2로서는 바람직하게는 인간 FGF2(예를 들면 인간 재조합 FGF2)를 이용한다.

전형적으로는, 공정 (1-1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 공정 (1-2)에 제공한다. 한편, 공정 (1-1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 중에서 내배엽과 같은 세포를 선별한 뒤에 공정 (1-2)를 실시하는 것으로 해도 된다. 내배엽과 같은 세포의 선별은 예를 들면, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로 사이토미터(셀 소터)로 행하면 된다.

"FGF2의 존재하"란, FGF2가 배지 중에 첨가된 조건과 동일하다. 따라서, FGF2의 존재하에서의 배양을 행하기 위해서는, FGF2가 첨가된 배지를 이용하면 된다. FGF2의 첨가 농도의 예를 나타내면 100ng/mL~500ng/mL이다.

동일하게, "GSK-3β 저해제의 존재하"란, GSK-3β 저해제가 배지 중에 첨가된 조건과 동일하다. 따라서, GSK-3β 저해제의 존재하에서의 배양을 행하기 위해서는, FGF2가 첨가된 배지를 이용하면 된다. GSK-3β 저해제로서 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, Tideglusib, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, Indirubin, Bikinin, 1-Azakenpaullone을 예시할 수 있다. GSK-3β 저해제의 첨가 농도의 예(CHIR 99021의 경우)를 나타내면 1μM~100μM, 바람직하게는 3μM~30μM이다.

공정 (1-2)의 기간(배양 기간)은 예를 들면 2일간~10일간, 바람직하게는 3일간~7일간이다. 당해 배양 기간이 너무 짧으면, 기대되는 효과(분화 효율의 상승, 장관 줄기 세포로서의 기능의 획득의 촉진)가 충분히 얻어지지 않는다. 다른 한편, 당해 배양 기간이 너무 길면, 분화 효율의 저하를 야기한다.

장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화한 것은, 예를 들면 장관 줄기 세포 마커의 발현을 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다. 장관 줄기 세포 마커의 예를 들면, 고류신 반복을 포함하는 G 단백질 공액 수용체5(LGR5), 에플린 B2 수용체(EphB2)이다.

<공정 (2) 장관 상피 세포와 같은 세포로의 분화>

이 공정에서는, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질을 병용하여, 공정 (1)에서 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포와 같은 세포로 분화시킨다. 본 발명에서는, 이 분화 유도 시, cAMP 활성화 물질을 사용함으로써, 세포 내의 cAMP 레벨을 적극적으로 상승시킨다. "MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질을 병용한다"란, 공정 (2)를 구성하는 1 또는 2 이상의 배양을 행하기 위하여, 이들 모두의 화합물이 필요하게 되는 것을 말하고, 이들 모두의 화합물이 동시에 사용되는 것, 즉 이들 모두의 화합물이 첨가된 배지를 이용한 배양이 행해지는 것을 필수의 조건으로서 요구하는 것은 아니다.

전형적으로는, 공정 (1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 공정 (2)에 제공한다. 한편, 공정 (1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 중에서 장관 줄기 세포와 같은 세포를 선별한 뒤에 공정 (2)를 실시하는 것으로 해도 된다. 장관 줄기 세포와 같은 세포의 선별은 예를 들면, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로 사이토미터(셀 소터)로 행하면 된다.

공정 (2)는 1 또는 2 이상의 배양에 의하여 구성된다(상세는 후술한다). 공정 (2)를 구성하는 각 배양에서는, 예를 들면 EGF 및 cAMP 활성화 물질이 필수의 성분으로서 첨가된 배지, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF가 필수의 성분으로서 첨가된 배지, EGF가 필수의 성분으로서 첨가된 배지, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질이 필수의 성분으로서 첨가된 배지 등이 이용된다.

MEK1 저해제로서, PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEK inhibitor I, MEK inhibitor II, MEK1/2 inhibitor II, SL327을 들 수 있다. 동일하게, DNA 메틸화 저해제로서 5-아자-2'-디옥시사이티딘, 5-아자사이티딘, RG108, 제불래린을 들 수 있다. TGFβ 수용체 저해제에 대해서는, 후술의 실시예에 사용한 A-83-01이 TGF-β 수용체 ALK4, ALK5, ALK7에 저해 활성을 나타내는 것을 고려하면, 바람직하게는 TGF-β 수용체 ALK4, ALK5, ALK7 중 하나 이상에 대하여 저해 활성을 나타내는 것을 이용하면 된다. 예를 들면, A-83-01, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5 inhibitor, LY2157299, LY364947, GW788388, RepSox가 당해 조건을 충족시킨다. cAMP 활성화 물질로서는, 포스콜린, 인도메타신, NKH477(콜포신 다로페이트), 세포 유래 독소 단백질(백일해 독소, 콜레라 독소), PACAP-27, PACAP-38, SKF83822 등을 이용할 수 있다. 포스콜린은 아데닐산 사이클라제 활성화 작용을 나타내고, 세포 내 cAMP의 합성을 촉진한다.

MEK1 저해제의 첨가 농도의 예(PD98059의 경우)를 나타내면 4μM~100μM, 바람직하게는 10~40μM이다. 동일하게 DNA 메틸화 저해제의 첨가 농도의 예(5-아자-2'-디옥시사이티딘의 경우)를 나타내면, 1μM~25μM, 바람직하게는 2.5μM~10μM이며, TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도의 예(A-83-01의 경우)를 나타내면 0.1μM~2.5μM, 바람직하게는 0.2μM~1μM이다. EGF의 첨가 농도의 예는, 5ng/mL~100ng/mL, 바람직하게는 10ng/mL~50ng/mL이다. 또, cAMP 활성화 물질의 첨가 농도의 예(포스콜린의 경우)를 나타내면, 1μM~200μM, 바람직하게는 5μM~100μM이다. 또한, 예시한 화합물, 즉 PD98059, 5-아자-2'-디옥시사이티딘, A-83-01 및 포스콜린과는 다른 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물(PD98059, 5-아자-2'-디옥시사이티딘, A-83-01, 포스콜린)의 특성의 상위(특히 활성의 상위)를 고려하면, 당업자라면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 후술의 실시예에 준한 예비 실험에 의하여 확인할 수 있다.

공정 (2)를 상기의 조건에 더하여, cAMP가 세포로 공급되는 조건("추가 조건 1"이라고 부름) 및 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건("추가 조건 2"라고 부름), 혹은 이들 중 어느 하나의 조건하에서 행하는 것으로 해도 된다. 추가 조건 1(cAMP가 세포로 공급되는 조건)이란, 세포 내로 흡수 가능한 화합물로서, 세포 내에 흡수되면 cAMP로서 작용하는 화합물이 존재하는 조건과 동일하다. 따라서, 추가 조건 1을 충족시키기 위해서는, 예를 들면 세포 내로 흡수 가능한 cAMP 유도체가 첨가된 배지를 이용하면 된다. 추가 조건 1을 채용하면, 세포 내 cAMP 농도의 저하가 억제되어, 장관 상피로의 분화 유도, 특히 장관 상피 세포로서의 기능의 획득이 촉진되는 것을 기대할 수 있다. 즉, 당해 조건은, 보다 기능적인 장관 상피 세포와 같은 세포의 조제를 가능하게 할 수 있다. cAMP 유도체로서 PKA 활성제(예를 들면, 8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number: 76939-46-3), 6-Bnz-cAMP(N6-Benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number: 1135306-29-4), cAMPS-Rp((R)-Adenosine, cyclic3',5'-(hydrogenphosphorothioate)triethylammonium salt, CAS Number: 151837-09-1), cAMPS-Sp((S)-Adenosine, cyclic3',5'-(hydrogenphosphorothioate)triethylammonium salt, CAS Number: 93602-66-5), Dibutyryl-cAMP(N6,O2'-Dibutyryl adenosine3',5'-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number: 16980-89-5), 8-Cl-cAMP(8-Chloroadenosine-3',5'- cyclic monophosphate salt, CAS Number: 124705-03-9)), Epac 활성제(Rp-8-Br-cAMPS(8-Bromoadenosine3',5'-cyclic monophosphothioate, Rp-Isomer. sodium salt, CAS Number: 129735-00-8), 8-CPT-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine3',5'-cyclic monophosphate, CAS Number: 93882-12-3), 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine3',5'-cyclic monophosphate monosodium, CAS Number: 634207-53-7) 등)를 채용할 수 있다. cAMP 유도체의 첨가 농도의 예(8-Br-cAMP의 경우)를 나타내면, 0.1mM~10mM, 바람직하게는 0.2mM~5mM, 더 바람직하게는 0.5mM~2mM이다. 또한, 예시한 화합물, 즉 8-Br-cAMP와는 다른 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물(8-Br-cAMP)의 특성의 상위(특히 활성의 상위)를 고려하면, 당업자라면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 후술의 실시예에 준한 예비 실험에 의하여 확인할 수 있다.

추가 조건 2(cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건)는, cAMP 분해 효소 저해제가 배지 중에 첨가된 조건과 동일하다. 추가 조건 2를 채용하면, cAMP의 분해 저해에 의하여 세포 내 cAMP 농도의 저하가 억제되어, 장관 상피로의 분화 유도, 특히 장관 상피 세포로서의 기능의 획득이 촉진되는 것을 기대할 수 있다. 즉, 당해 조건은, 보다 기능적인 장관 상피 세포와 같은 세포의 조제를 가능하게 할 수 있다. 또한, 추가 조건 1과 추가 조건 2를 병용하면, cAMP를 세포로 공급하면서, 세포 내 cAMP 농도의 저하를 억제할 수 있다. 따라서, 세포 내 cAMP를 고레벨로 유지하기 위한 유효한 조건이 되어, 장관 상피 세포로의 효율적인 분화 유도가 촉진되는 것을 기대할 수 있다.

cAMP 분해 효소 저해제로서, IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)(MIX), Theophylline, Papaverine, Pentoxifylline(Trental), KS-505, 8-Methoxymethyl-IBMX, Vinpocetine(TCV-3B), EHNA, Trequinsin(HL-725), Lixazinone(RS-82856), (LY-186126), Cilostamide(OPC3689), Bemoradan(RWJ-22867), Anergrelide(BL4162A), Indolidan(LY195115), Cilostazol(OPC-13013), Milrinone(WIN47203), Siguazodan(SKF-94836), 5-Methyl-imazodan(CI 930), SKF-95654, Pirilobendan(UD-CG 115BS), Enoximone(MDL 17043), Imazodan(CL 914), SKF-94120, Vesnarinone(OPC 8212), Rolipram(Ro-20-1724), (ZK-62711), Denbufyll'ine, Zaprinast(M&B-22, 948), Dipyridamole, Zaprinast(M&B-22, 948), Dipyridamole, Zardaverine, AH-21-132, Sulmazol(AR-L 115 BS)을 예시할 수 있다. cAMP 분해 효소 저해제의 첨가 농도의 예(IBMX의 경우)를 나타내면, 0.05mM~5mM, 바람직하게는 0.1mM~3mM, 더 바람직하게는 0.2mM~1mM이다. 또한, 예시한 화합물, 즉 IBMX와는 다른 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물(IBMX)의 특성의 상위(특히 활성의 상위)를 고려하면, 당업자라면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또, 설정한 농도 범위가 적절한지 여부는, 후술의 실시예에 준한 예비 실험에 의하여 확인할 수 있다.

공정 (2)의 기간(배양 기간)은 예를 들면 7일간~40일간, 바람직하게는 10일간~30일간이다. 당해 배양 기간이 너무 짧으면, 기대되는 효과(분화 효율의 상승, 장관 상피 세포로서의 기능의 획득의 촉진)가 충분히 얻어지지 않는다. 다른 한편, 당해 배양 기간이 너무 길면, 분화 효율의 저하를 일으킨다.

장관 상피 세포와 같은 세포로 분화한 것은, 예를 들면 장관 상피 세포 마커의 발현이나 펩타이드의 흡수, 혹은 비타민 D 수용체를 통한 약물 대사 효소의 발현 유도를 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다. 장관 상피 세포 마커의 예를 들면, ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/다제내성 단백1(ABCB1/MDR1), ATP 결합 카세트 트랜스포터G2/유방암 내성 단백(ABCG2/BCRP), 사이토크롬 P450 3A4(CYP3A4), 지방산 결합 단백2(FABP2), 프레그난X 수용체(PXR), SLC(solute carrier) 패밀리 멤버 5A1/나트륨 공액형 글루코스 트랜스포터1(SLC5A1/SGLT1), SLC(solute carrier) 패밀리 멤버 15A1/펩타이드 트랜스포터1(SLC15A1/PEPT1), SLC(solute carrier) 유기 음이온 트랜스포터 2B1(SLCO2B1/OATP2B1), 수크라제 이소말타제, 유리딘이인산-글루쿠론산 전이 효소 1A1(UGT1A1), 유리딘이인산-글루쿠론산 전이 효소 1A4(UGT1A4), 빌린1(Villin 1), 카복실에스테라제 2A1(CES2A1)이다. 이 중에서도, 장관 상피에 특이성이 높은 수크라제 이소말타제, 및 빌린1, 소장에서의 주요한 약물 대사 효소인 CYP3A4, 소장에서의 펩타이드의 흡수에 관여하는 SLC15A1/PEPT1, 소장의 정측막 측에 발현하고 있는 글루코스 트랜스포터인 SLC5A1/SGLT1, 소장에서의 유기 음이온의 흡수에 관여하는 SLCO2B1/OATP2B1, 소장에서의 발현이 높은 가수분해 효소인 CES2A1은 특히 유효한 마커이다.

목적의 세포(장관 상피 세포와 같은 세포)만으로 이루어지는 세포 집단 또는 목적의 세포가 고비율(고순도)로 포함된 세포 집단을 얻으려고 생각하면, 목적의 세포에 특징적인 세포 표면 마커를 지표로 하여 배양 후의 세포 집단을 선별·분취(分取)하면 된다.

바람직하게는, 공정 (2)로서, 이하의 A~D 중 어느 것의 배양 공정을 행한다.

<배양 공정 A>

배양 공정 A에서는, (a-1) EGF 및 세포 내 cAMP 합성 촉진제의 존재하에서의 배양과, 당해 배양 후에 행해지는, (a-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 행한다. 이와 같이 2단계의 배양을 행하면, 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다. (a-1)의 배양의 기간은 예를 들면 2일간~10일간, 바람직하게는 4일간~8일간이며, (a-2)의 배양의 기간은 예를 들면 9일간~29일간, 바람직하게는 7일간~27일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항(각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등)에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(a-1)의 배양을 cAMP가 세포로 공급되는 조건("추가 조건 1"이라고 부름) 및 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건("추가 조건 2"라고 부름), 혹은 이들 중 어느 하나의 조건으로 행하는 것으로 해도 된다. (a-2)의 배양도 동일하다. 추가 조건 1 및 추가 조건 2의 상세는 상기한 바와 같다.

<배양 공정 B>

배양 공정 B에서는, (b-1) EGF의 존재하에서의 배양과, 당해 배양 후에 행해지는, (b-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 세포 내 cAMP 합성 촉진제의 존재하에서의 배양을 행한다. 이와 같이 2단계의 배양을 행하면, 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다. (b-1)의 배양의 기간은 예를 들면 2일간~10일간, 바람직하게는 4일간~8일간이며, (b-2)의 배양의 기간은 예를 들면 9일간~19일간, 바람직하게는 7일간~17일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항(각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등)에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(b-1)의 배양을 cAMP가 세포로 공급되는 조건(추가 조건 1) 및 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건(추가 조건 2), 혹은 이들 중 어느 하나의 조건으로 행하는 것으로 해도 된다. (b-2)의 배양도 동일하다. 추가 조건 1 및 추가 조건 2의 상세는 상기한 바와 같다.

(b-2)의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양((b-3)의 배양)을 행하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들면 1일간~10일간으로 한다. 이 배양을 행하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다.

<배양 공정 C>

배양 공정 C에서는, (c-1) EGF 및 세포 내 cAMP 합성 촉진제의 존재하에서의 배양과, 당해 배양 후에 행해지는, (c-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 세포 내 cAMP 합성 촉진제의 존재하에서의 배양을 행한다. 이와 같이 2단계의 배양을 행하면, 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다. (c-1)의 배양의 기간은 예를 들면 2일간~10일간, 바람직하게는 4일간~8일간이며, (c-2)의 배양의 기간은 예를 들면 9일간~19일간, 바람직하게는 7일간~17일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항(각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등)에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(c-1)의 배양을 cAMP가 세포로 공급되는 조건(추가 조건 1) 및 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건(추가 조건 2), 혹은 이들 중 어느 하나의 조건으로 행하는 것으로 해도 된다. (c-2)의 배양도 동일하다. 추가 조건 1 및 추가 조건 2의 상세는 상기한 바와 같다.

(c-2)의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양((c-3)의 배양)을 행하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들면 1일간~10일간으로 한다. 이 배양을 행하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다.

<배양 공정 D>

배양 공정 D에서는, (d-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 세포 내 cAMP 합성 촉진제의 존재하에서의 배양을 행한다. 이 배양 공정은, 배양 조작이 간편한 것, 장관 상피 세포로의 분화에 대하여 보다 효과적인 것, 화합물이기 때문에 안정된 효과를 기대할 수 있는 것 등의 점에서 특히 유리하다. (d-1)의 배양의 기간은 예를 들면 15일간~25일간, 바람직하게는 17일간~23일간이다. 또한, 특별히 설명하지 않는 사항(각 배양에 사용 가능한 화합물, 각 화합물의 첨가 농도 등)에 대해서는, 상기의 대응하는 설명이 원용된다.

(d-1)의 배양을 cAMP가 세포로 공급되는 조건(추가 조건 1) 및 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건(추가 조건 2), 혹은 이들 중 어느 하나의 조건으로 행하는 것으로 해도 된다. 추가 조건 1 및 추가 조건 2의 상세는 상기한 바와 같다.

(d-1)의 배양 후에, MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양((d-2)의 배양)을 행하는 것으로 해도 된다. 이 배양의 기간은 예를 들면 1일간~10일간으로 한다. 이 배양을 행하면 장관 상피 세포로의 분화 촉진, 성숙화, 기능 획득의 효과를 기대할 수 있다.

본 발명을 구성할 수 있는 각 공정 ((1), (1-1), (1-2), (2), (a-1), (a-2), (b-1), (b-2), (b-3), (c-1), (c-2), (c-3), (d-1), (d-2))에 있어서, 도중에 계대(繼代) 배양을 행해도 된다. 예를 들면 컨플루언트 또는 서브 컨플루언트가 되었을 때에 세포의 일부를 채취하여 다른 배양 용기로 옮기고, 배양을 계속한다. 분화를 촉진하기 위하여 세포 밀도를 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들면 1×10⁴개/cm²~1×10⁶개/cm² 정도의 세포 밀도로 세포를 파종하면 된다.

배지 교환이나 계대 배양 등에 따르는, 세포의 회수 시에는, 세포사(死)를 억제하기 위하여 Y-27632 등의 ROCK 저해제(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho 결합 키나제)로 미리 세포를 처리하여 두면 된다.

본 발명을 구성하는 각 공정에 있어서의, 그 외의 배양 조건(배양 온도 등)은, 동물 세포의 배양에 있어서 일반적으로 채용되고 있는 조건으로 하면 된다. 즉, 예를 들면 37℃, 5% CO₂의 환경 하에서 배양하면 된다. 또, 기본 배지로서, 이스코프 개변 둘베코 배지(IMDM)(GIBCO사 등), 햄 F12 배지(HamF12)(SIGMA사, Gibco사 등), 둘베코 변법 이글 배지(D-MEM)(나카라이테스크 주식회사, 시그마사, Gibco사 등), 글래스고 기본 배지(Gibco사 등), RPMI1640 배지 등을 이용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 해도 된다. 공정 (1-2), 공정 (2), 공정 (2)를 구성하는 배양 공정 A, 배양 공정 B, 배양 공정 C, 배양 공정 D에 있어서는, 상피 세포의 배양에 적합한 기본 배지(예를 들면 D-MEM과 햄 F12 배지의 혼합 배지, D-MEM)를 이용하는 것이 바람직하다. 배지에 첨가 가능한 성분의 예로서 소 혈청 알부민(BSA), 항생 물질, 2-머캅토에탄올, PVA, 비필수 아미노산(NEAA), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 들 수 있다. 전형적으로는 배양 접시 등을 이용하여 2차원적으로 세포를 배양한다. 본 발명의 방법에 의하면, 2차원 배양에 의하여 다능성 줄기 세포로부터 장관 상피 세포와 같은 세포를 얻는 것이 가능해진다. 단, 젤상의 배양 기재 혹은 3차원 배양 플레이트 등을 이용한 3차원 배양을 실시하는 것으로 해도 된다.

본 발명의 제2 국면은 본 발명의 분화 유도 방법으로 조제한 장관 상피 세포와 같은 세포의 용도에 관한 것이다. 제1 용도로서 각종 어세이가 제공된다. 본 발명의 장관 상피 세포와 같은 세포는 장관, 특히 소장의 모델계에 이용 가능하며, 장관, 특히 소장에서의 약물 동태(흡수, 대사 등)의 평가나 독성의 평가에 유용하다. 환언하면, 본 발명의 장관 상피 세포와 같은 세포는, 화합물의 체내 동태의 평가나 독성의 평가에 그 이용이 도모된다.

구체적으로는, 본 발명의 장관 상피 세포와 같은 세포를 이용하여 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 시험할 수 있다. 즉, 본 발명은 장관 상피 세포와 같은 세포의 용도 중 하나로서, 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 평가하는 방법(제1 양태)을 제공한다. 당해 방법에서는, (i) 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포와 같은 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정과, (ii) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (iii) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하여, 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정을 행한다. 또한, 피검 물질의 흡수성에 대해서는, 후술의 방법(제2 양태)으로도 평가할 수 있다.

공정 (i)에서는, 전형적으로는 반투과성막(다공성막)의 상에서 장관 상피 세포와 같은 세포를 배양하여, 세포층을 형성시킨다. 구체적으로는, 예를 들면 컬쳐 인서트를 구비한 배양 용기(예를 들면, 코닝사가 제공하는 트랜스 웰(등록 상표))를 사용하여, 컬쳐 인서트 내에 세포를 파종하여 배양함으로써, 장관 상피 세포와 같은 세포로 구성된 세포층을 얻는다.

공정 (ii)에서의 "접촉"은, 전형적으로는 배지에 피검 물질을 첨가함으로써 행해진다. 피검 물질의 첨가의 타이밍은 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 피검 물질을 포함하지 않은 배지에서 배양을 개시한 후, 어떠한 시점에 피검 물질을 첨가하는 것으로 해도 되고, 미리 피검 물질을 포함하는 배지에서 배양을 개시하는 것으로 해도 된다.

피검 물질에는 다양한 분자 사이즈의 유기 화합물 또는 무기 화합물을 이용할 수 있다. 유기 화합물의 예로서 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질(단순 지질, 복합 지질(포스포글리세라이드, 스핑고지질, 글라이코실글리세라이드, 세레브로사이드 등), 프로스타글란딘, 아이소프레노이드, 터펜, 스테로이드, 폴리페놀, 카테킨, 비타민(B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E 등)을 예시할 수 있다. 의약품, 영양 식품, 식품 첨가물, 농약, 향장품(화장품) 등의 기존 성분 혹은 후보 성분도 바람직한 피검 물질 중 하나이다. 식물 추출액, 세포 추출액, 배양 상등 등을 피검 물질로서 이용해도 된다. 2종류 이상의 피검 물질을 동시에 첨가함으로써, 피검 물질 간의 상호 작용, 상승 작용 등을 조사하는 것으로 해도 된다. 피검 물질은 천연물 유래여도 되고, 혹은 합성에 의한 것이어도 된다. 후자의 경우에는 예를 들면 콤비너토리얼 합성의 수법을 이용하여 효율적인 어세이계를 구축할 수 있다.

피검 물질을 접촉시키는 기간은 임의로 설정 가능하다. 접촉 기간은 예를 들면 10분간~3일간, 바람직하게는 1시간~1일간이다. 접촉을 복수 회로 나누어 행하는 것으로 해도 된다.

공정 (iii)에서는, 세포층을 투과한 피검 물질을 정량한다. 예를 들면, 트랜스 웰(등록 상표)과 같은 컬쳐 인서트를 구비한 배양 용기를 사용한 경우에는, 컬쳐 인서트를 투과한 피검 물질, 즉 세포층을 통하여 상부 혹은 하부 용기 내로 이동한 피검 물질을, 피검 물질에 따라, 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법(예를 들면 형광 면역 측정법(FIA법), 효소 면역 측정법(EIA법)) 등의 측정 방법으로 정량한다. 정량 결과(세포층을 투과한 피검 물질의 양)와 피검 물질의 사용량(전형적으로는 배지에 대한 첨가량)에 근거하여, 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 판정·평가한다.

본 발명은 다른 양태(제2 양태)로서, 피검 물질의 대사 또는 흡수를 평가하는 방법도 제공한다. 당해 방법에서는, (I) 본 발명의 분화 유도 방법으로 얻어진 장관 상피 세포와 같은 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정과, (II) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정을 행한다.

공정 (I), 즉 장관 상피 세포와 같은 세포와 피검 물질의 접촉은, 상기 공정 (ii)와 동일하게 실시할 수 있다. 단, 미리 세포층을 형성시키는 것은 필수는 아니다.

공정 (I)의 후, 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가한다(공정 (II)). 공정 (I)의 직후, 즉 피검 물질의 접촉 후, 실질적인 시간 간격을 두지 않고 대사 등을 측정·평가해도 되고, 혹은 일정한 시간(예를 들면 10분~5시간)을 경과한 후에 대사 등을 측정·평가하는 것으로 해도 된다. 대사의 측정은, 예를 들면 대사 산물의 검출에 의하여 행할 수 있다. 이 경우에는, 통상, 공정 (I) 후의 배양액을 샘플로 하여, 예상되는 대사 산물을 정성(定性)적 또는 정량적으로 측정한다. 측정 방법은 대사 산물에 따라 적절한 것을 선택하면 되지만, 예를 들면 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법(예를 들면 형광 면역 측정법(FIA법), 효소 면역 측정법(EIA법)) 등을 채용 가능하다.

전형적으로는, 피검 물질의 대사 산물이 검출되었을 때, "피검 물질이 대사되었다"고 판정 내지 평가한다. 또, 대사 산물의 양에 따라 피검 물질의 대사량을 평가할 수 있다. 대사 산물의 검출 결과와 피검 물질의 사용량(전형적으로는 배지에 대한 첨가량)에 근거하여, 피검 물질의 대사 효율을 산출하는 것으로 해도 된다.

장관 상피 세포와 같은 세포에 있어서의 약물 대사 효소(사이토크롬 P450(특히 CYP3A4), 유리딘이인산글루쿠론산 전이 효소(특히 UGT1A8, UGT1A10), 황산 전이 효소(특히 SULT1A3 등))의 발현을 지표로 하여 피검 물질의 대사를 측정하는 것도 가능하다. 약물 대사 효소의 발현은 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨로 평가할 수 있다. 예를 들면, 약물 대사 효소의 mRNA 레벨에서 상승을 인정했을 때, "피검 물질이 대사되었다"고 판정할 수 있다. 동일하게, 약물 대사 효소의 활성에서 상승을 인정했을 때, "피검 물질이 대사되었다"고 판정할 수 있다. 대사 산물을 지표로 하여 판정하는 경우와 동일하게, 약물 대사 효소의 발현량에 근거하여 정량적인 판정·평가를 행하는 것으로 해도 된다.

피검 물질의 흡수를 평가하기 위해서는, 예를 들면 배양액 중의 피검 물질의 잔존량을 측정한다. 통상, 공정 (I) 후의 배양액을 샘플로 하여 피검 물질을 정량한다. 측정 방법은 피검 물질에 따라 적절한 것을 선택하면 된다. 예를 들면, 질량 분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 수법(예를 들면 형광 면역 측정법(FIA법), 효소 면역 측정법(EIA법)) 등을 채용 가능하다. 전형적으로는, 배양액 중의 피검 물질의 함유량의 저하를 인정했을 때, "피검 물질이 흡수되었다"고 판정·평가한다. 또, 저하의 정도에 따라 피검 물질의 흡수량 내지 흡수 효율을 판정·평가할 수 있다. 또한, 세포 내에 흡수된 피검 물질의 양을 측정함으로써도, 흡수의 평가는 가능하다.

또한, 대사의 측정·평가와 흡수의 측정·평가를 동시에 또는 병행하여 행하는 것으로 해도 된다.

본 발명의 분화 유도 방법으로 조제한 장관 상피 세포와 같은 세포의 제2 용도로서 장관 상피 세포와 같은 세포를 함유하는 세포 제제가 제공된다. 본 발명의 세포 제제는 각종 장 질환의 치료에 적용 가능하다. 특히, 장애가 있는(기능 부전을 포함함) 장관 상피 조직의 재생·재건용의 재료로서의 이용이 상정된다. 즉, 재생 의료에 대한 공헌을 기대할 수 있다. 본 발명의 세포 제제는, 예를 들면 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 장관 상피 세포와 같은 세포를 생리 식염수나 완충액(예를 들면 인산계 완충액) 등에 현탁하는 것, 혹은 당해 세포를 이용하여 3차원 조직체(오가노이드나 스페로이드)를 제작함으로써 조제할 수 있다. 치료상 유효량의 세포를 투여할 수 있도록, 1회 투여분의 양으로서 예를 들면 1×10⁵개~1×10¹⁰개의 세포를 함유시키면 된다. 세포의 함유량은, 사용 목적, 대상 질환, 적용 대상(레시피언트)의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 세포의 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다.

세포의 보호를 목적으로 하여 다이메틸설폭사이드(DMSO)나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입을 저지하는 것을 목적으로 하여 항생 물질 등을, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 하여 각종 성분(비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등)을 본 발명의 세포 제제에 함유시켜도 된다. 또한, 제제상 허용되는 다른 성분(예를 들면, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등)을 본 발명의 세포 제제에 함유시켜도 된다.

실시예

인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 촉진/기능 획득에 유용한 저분자 화합물의 탐색

생체의 장관 상피 세포에 보다 가까운 기능을 나타내는 세포(장관 상피 세포와 같은 세포)를 간편하게 또한 효율적으로 조제하는 방법의 확립을 목표로 하여, 이하의 검토를 행했다.

<실시예 1>

1. 방법

(1) 세포

인간 iPS 세포는 Windy(iPS-51) 및 FF-1주를 이용했다. Windy는, 인간 태아 폐 선유아 세포 MRC-5에 octamer binding protein 3/4(OCT3/4), sex determining region Y-box 2(SOX2), kruppel-like factor 4(KLF4), v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)를, 팬트로픽 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 도입 후, 인간 ES 세포와 같은 콜로니를 클론화한 것이며, 일본 국립 성육 의료 연구 센터 우메자와 아키히로 박사로부터 공여되었다. 피더 세포는 쥐태아 선유아 세포(MEF)를 사용했다. FF-1주는 후지필름 주식회사로부터 공여되었다.

(2) 배지

MEF의 배양에는 10% 소태아 혈청(FBS), 2mmol/L L-글루타민(L-Glu), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 개변 이글 배지(DMEM)를 이용했다. MEF의 박리액에는 0.05% 트립신-에틸렌다이아민 사아세트산(EDTA)을, MEF의 보존액에는 셀 뱅커 1을 이용했다. Windy의 유지 배양에는 20% 녹아웃 혈청 대체물(KSR), 0.8% NEAA, 2mmol/L L-Glu, 0.1mmol/L 2-머캅토에탄올(2-MeE), 5ng/mL 선유아 세포 증식 인자2(FGF2)를 포함하는 DMEM Ham's F-12(DMEM/F12)를 이용했다. 박리액에는 1mg/mL 콜라제나제 IV, 0.25% 트립신, 20% KSR, 1mmol/L 염화 칼슘을 포함하는 둘베코 인산 완충 생리 식염수(PBS)를, 보존액에는 영장류 ES/iPS 세포용 동결 보존액을 이용했다. FF-1주의 유지 배양에는 mTesR1을 이용했다.

(3) 인간 iPS 세포의 배양

Windy는 마이토마이신 C 처리를 실시한 MEF(6×10⁵cells/100mm디쉬) 상에 파종하고, 5% CO₂/95% air 조건하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 배양했다. FF-1주는 매트리젤 코팅한 디쉬 상에서 배양을 행했다. 인간 iPS 세포의 계대는, 3~5일 배양 후, 1:2~1:3의 스플릿비로 행했다. 인간 iPS 세포는 해동 48시간 후에 배지를 교환하고, 그 이후는 매일 교환했다.

(4) 인간 iPS 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도

인간 iPS 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도는, 인간 iPS 세포가 배양 디쉬에 대하여, 미분화 콜로니가 차지하는 비율이 약 70%가 된 상태에서 개시했다. Windy는 0.5% FBS, 100ng/mL 액티빈 A, 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 로즈웰 파크 기념 연구소(RPMI)+Glutamax 배지에서 2일간, 2% FBS, 100ng/mL 액티빈 A, 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI+Glutamax 배지에서 1일간 배양함으로써 내배엽으로 분화 유도했다. 그 후, 2% FBS, 1% Glutamax, 250ng/mL FGF2를 포함하는 DMEM/F12에서 4일간 배양함으로써 장관 줄기 세포로 분화 유도했다. 이 처리 후, Y-27632(Rho 결합 키나제 저해제)를 10μmol/L가 되도록 첨가하고, 5% CO₂/95% air 조건하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 60분간 처리한 세포를 아큐타제로 박리하며, 미리 인간 iPS 세포용 배지에서 30배로 희석한, 성장 인자를 제거한 매트리젤로 코팅한 세포 배양용 24 웰 플레이트에 파종했다. 그 후, 2% FBS, 1% Glutamax, 1% NEAA, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 20ng/mL 상피 세포 증식 인자(EGF), 10μmol/L Y-27632를 포함하는 DMEM/F12에서 1일간, 2% FBS, 1% Glutamax, 1% NEAA, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 20ng/mL 상피 세포 증식 인자(EGF)를 포함하는 DMEM/F12에서 18일간 배양함으로써 장관 상피 세포로 분화 유도했다. 또, 분화 유도 시에 이전 본 발명자들이 발견한 저분자 화합물인 PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-디옥시사이티딘(5μmol/L), A-83-01(0.5μmol/L)에 더하여, 1mmol/L 8-브로모-3',5'-사이클릭아데노신-인산(8-Br-cAMP), 0.1 혹은 0.5mmol/L 3-아이소뷰틸-1-메틸잔틴(IBMX), 10 혹은 30μmol/L 포스콜린을 첨가하고, 장관 줄기 세포 및 장관 상피 세포로의 분화 유도에 미치는 영향에 대하여 검토했다.

Windy를 이용한 실험 1(도 1) 및 실험 2(도 4)와 FF-1주를 이용한 실험 3(도 6), 실험 4(도 9) 및 실험 5(도 11)를 설정했다. 또한, FF-1주에 대해서는, 실험 3에서는 내배엽으로의 분화 유도에 5일간(0일째~5일째)의 배양, 장관 줄기 세포로의 분화 유도에 4일간(5일째~9일째)의 배양, 장관 상피 세포로의 분화 유도에 18일간(10일째~28일째)의 배양을 행하고, 실험 4에서는 내배엽으로의 분화 유도에 7일간(0일째~7일째)의 배양, 장관 줄기 세포로의 분화 유도에 4일간(7일째~11일째)의 배양, 장관 상피 세포로의 분화 유도에 18일간(12일째~30일째), 실험 5에서는 내배엽으로의 분화 유도에 7일간(0일째~7일째)의 배양, 장관 줄기 세포로의 분화 유도에 4일간(7일째~11일째)의 배양, 장관 상피 세포로의 분화 유도에 18일간(12일째~30일째)의 배양을 행했다. 또한, 실험 4 및 실험 5에 있어서의 내배엽으로의 분화 유도는, 국제 공개공보 제2014/165663호에 기재된 방법(구체적으로는, 실시예 1 및 5)에 준하여 행했다.

(5) 총리보 핵산(RNA) 추출

총RNA는 인간 iPS 세포의 분화 유도 종료 후, RNeasy(등록 상표) Mini Kit(Qiagen)의 첨부 매뉴얼에 따라 추출했다.

(6) 역전사 반응

상보적 DNA(cDNA)의 합성은, ReverTra Ace(등록 상표) qPCR RT Kit(도요보 주식회사)를 사용했다. 조작은 첨부 매뉴얼에 따랐다.

(7) 리얼타임 역전사 폴리메라제 연쇄 반응(Real-Time RT-PCR)

KAPA SYBR Fast qPCR Kit(일본 제네틱스 주식회사)를 이용하여, cDNA를 주형(鑄型)으로 하여 Real-Time RT-PCR를 행했다. 조작은 첨부 매뉴얼에 따랐다. 내재성 컨트롤로서 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)를 이용하여 측정 결과를 보정했다.

(8) 약물 대사 실험

분화 유도 종료 후, 5μmol/L 미다졸람 및 10μmol/L 7-하이드록시쿠마린을 포함하는 배지(1% Glutamax, 1% NEAA, 1% N2 supplement, 100유닛/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 20ng/mL EGF를 포함하는 DMEM/F12)에서 37℃에서 인큐베이션하고, 24시간(실험 3 및 4) 또는 2시간(실험 5) 경과 후, 배지를 샘플링했다. 대사 활성은, 액체 크로마토그래피-매스 스펙트로미터(LC-MS/MS)를 이용하여 측정한 배지 중의 1-수산화 미다졸람 혹은 7-하이드록시쿠마린글루쿠로니드의 양으로 산출했다. 대사 실험 종료 후, 단백 정량을 행하여, 대사 활성을 단백량으로 보정했다.

본 검토에서 사용한 마커 유전자의 특징을 이하에 나타낸다.

ABCB1/MDR1(ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/다제내성 단백1): P당 단백질이며, 배출 트랜스포터로서 기능한다.

CYP3A4(사이토크롬 P450 3A4): 소장에 있어서 주요한 약물 대사 효소이다.

FABP(지방산 결합 단백2): 다양한 서브 타입이 있고, FABP2는 장형.

PXR(프레그난X 수용체): CYP3A4의 발현이나 유도에 관여한다.

SLC5A1/SGLT1(SLC(solute carrier) 패밀리 멤버 5A1/나트륨 공액형 글루코스 트랜스포터1): 소장의 정측막 측에 발현하고 있는 글루코스 트랜스포터.

SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier) 패밀리 멤버 15A1/펩타이드 트랜스포터1): 소장의 정측막 측에 발현하고 있다.

Villin 1(빌린1): 미융모의 주요한 구성 성분이다.

CES2A1: 카복실에스테라제 2A1. 가수분해 효소인 CES에는 1A와 2A1의 아이소폼이 있고, 간에서는 CES1A의 발현이, 소장에서는 CES2A1의 발현이 높다.

2. 결과

(1) 장관 상피 세포로의 분화 유도에 대한 효과의 검토

분화 개시 후 8일째 이후에 포스콜린을 첨가함으로써, 각종 장관 마커의 유전자 발현 레벨의 유의한 상승이 인정되었다(도 2, 3). 포스콜린의 장관 마커 발현에 대한 효과는, 지금까지 발명자들이 발견한 8-Br-cAMP와 유사한 경향을 나타냈지만, 주요한 약물 대사 효소인 CYP3A4나, 배출 트랜스포터로서 중요한 ABCB1/MDR1의 발현에 대한 포스콜린의 효과는 8-Br-cAMP의 효과를 훨씬 능가했다. 또, 지금까지 발명자들이 개발한 8-Br-cAMP와 IBMX를 병용한 분화 유도법과 비교하여, 포스콜린 단독으로 분화함으로써, 장관 상피 세포 마커로서 특히 중요한 CYP3A4 및 SGLT1의 발현 레벨이 유의하게 상승했다(도 5). 따라서, 포스콜린은 인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 촉진에 매우 유효하다는 것이 시사되었다.

(2) iPS 세포 유래 장관 상피 세포와 같은 세포에 있어서의 약물 대사 효소 활성에 대한 효과

8-Br-cAMP 및 IBMX를 이용하여 분화시킨 경우와 비교하여, 8-Br-cAMP 및 포스콜린을 이용하여 분화시킴으로써, 각종 장관 마커의 유전자 발현 레벨이 유의하게 상승함과 함께(도 7), CYP3A4 및 UGT 활성이 유의하게 상승했다(도 8). 또, 8-Br-cAMP 대신에, 포스콜린을 분화 유도 개시 후 12일째부터 장기간 이용함으로써, 더 유의한 CYP3A4 활성의 상승이 인정되었다(도 10). UGT 활성에 있어서는, 8-Br-cAMP 및 포스콜린을 이용하여 분화시킨 군에서 가장 높은 대사 활성을 나타냈다(도 10). 또한, FGF2를 이용하여 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시켜, 8-Br-cAMP 및 포스콜린을 이용하여 장관 상피와 같은 세포로 분화시킨 군에서, 인간 초대 소장 세포와 동일한 정도의 CYP3A4 활성이 관찰되었다(도 11, 도 12). 이 점에서, 포스콜린은 장관 마커의 유전자 발현뿐만 아니라, 약물 대사 효소 활성 등의 약물 동태학적 기능의 향상에도 기여하고 있을 가능성이 생각되었다.

인간 iPS 세포로부터 장관 상피 세포로의 분화 유도 시에 포스콜린을 이용함으로써, 특히 중요한 장관 상피 세포 마커의 발현 레벨의 상승에 더하여, 소장에 발현하는 약물 대사 효소 중에서 특히 중요한 CYP3A4에 의한 대사 활성을 큰 폭으로 상승시켰다. 또, 이번 방법은 지금까지 발명자들이 찾아낸 방법보다 대사 효소 활성에 대한 효과는 높다. 이 세포를 창약 연구에 응용함에 있어서, 기능의 면에 있어서 이와 같은 효과가 얻어지는 분화 유도법은, 매우 유용한 방법이라고 생각된다.

3. 통계

상기의 결과로부터, 지금까지 이상으로, 보다 성숙한 장관 상피 세포와 같은 세포를 인간 iPS 세포로 제작하는 방법을 확립했다. 또, 이 세포는 CYP3A4 등에 의한 약물 대사 활성을 충분히 갖고 있고, 인간 초대 소장 세포와 동일한 정도의 CYP3A4 활성을 갖고 있는 것도 발견되었다. 약물의 소화관 흡수 시험계로서 현재 범용되고 있는 Caco-2 세포는 낮은 약물 대사 활성이 문제가 되고 있는 점에서, 본 발명에 의하여, 보다 인간 소장에 가까운 기능을 갖는 세포의 제작이 가능하게 될 것이라고 생각된다.

<실시예 2>

1. 방법

(1) 인간 iPS 세포로부터 소장 상피 세포로의 분화

인간 iPS 세포(FF-1)에 100ng/mL 액티빈 A를 포함하는 무혈청 배지를 24시간 처리하여 분화를 개시했다. 그 후, 100ng/mL 액티빈 A, 2.5ng/mL BMP4, 10ng/mL VEGF 및 5ng/mL FGF2를 포함하는 무혈청 배지 중에서 144시간 처리하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 후 2% FBS, 1% Glutamax, 100units/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염, 250ng/mL FGF2를 포함하는 Advanced DMEM/F-12에서 96시간 배양함으로써 소장 줄기 세포로 분화시켰다. 액티빈 A 및 FGF2 처리 후의 소장 줄기 세포와 같은 세포를 Accutase로 박리하고, 미리 인간 iPS 배지로 30배로 희석한 GFR Matrigel 상에 파종했다. 파종 후는 2% FBS, 0.1mM NEAA, 2mM L-Glu, 100units/mL 페니실린 G, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 1% HepExtend supplement, 20ng/mL EGF 및 30μM 포스콜린을 포함하는 Advanced DMEM/F-12에서 19-23일간 배양했다. 분화 종료 12-16일 전부터 PD98059를 20μM, 5-아자-2'-디옥시사이티딘(5-aza-2'-dC)을 5μM, A-83-01을 0.5μM가 되도록 첨가하여 소장 상피 세포로 분화시켰다.

(2) 막 투과 시험

Cell culture insert 상에 파종한 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포 및 Caco-2 세포의 apical 측의 chamber에 HBSS(pH 6.5)를, basal 측의 chamber에 HBSS(pH 7.4)를 첨가하고, 37℃에서 60분간 프리인큐베이트했다. 그 후, 파라셀룰러로 투과하는 화합물인 acebutolol, metformin, hydrochlorothiazide, sulpiride 및 lucifer yellow, 트랜스포터로 투과하는 화합물인 cephalexin, lisinopril, ribavirin 및 enalapril, 트랜스셀룰러로 투과하는 화합물인 antipyrine 및 caffeine, CYP3A4의 기질인 erythromycin, indinavir, midazolam, tacrolimus 및 verapamil를 포함하는 HBSS(pH 6.5)를 apical 측의 챔버에 첨가하고, 37℃에서 60분간 인큐베이트했다. 각 화합물의 종농도는 lisinopril 및 caffeine은 50μM, lucifer yellow는 50μg/mL, 그 외의 화합물은 10μM가 되도록 첨가했다. 또 basal 측의 챔버에는 HBSS(pH 7.4)를 첨가했다. 15분마다 샘플을 리시버 챔버 측으로부터 회수했다. 미변화체를, UPLC-MS/MS를 이용하여 측정했다. 인간에 있어서의 F_a·F_g는 기존의 보고로부터 참조했다(하기 문헌 1~6).

문헌 1: Takenaka T, Harada N, Kuze J, Chiba M, Iwao T, Matsunaga T. Human small intestinal epithelial cells differentiated from adult intestinal stem cells as a novel system for predicting oral drug absorption in humans. Drug Metab Dispos. 42: 1947-54(2014).

문헌 2: Takenaka T, Harada N, Kuze J, Chiba M, Iwao T, Matsunaga T. Application of a Human Intestinal Epithelial Cell Monolayer to the Prediction of Oral Drug Absorption in Humans as a Superior Alternative to the Caco-2 Cell Monolayer. J Pharm Sci. 105: 915-924(2016).

문헌 3: Tachibana T, Kato M, Sugiyama Y. Prediction of nonlinear intestinal absorption of CYP3A4 and P-glycoprotein substrates from their in vitro Km values. Pharm Res. 29: 651-68(2012).

문헌 4: Chong S, Dando SA, Soucek KM, Morrison RA. In vitro permeability through caco-2 cells is not quantitatively predictive of in vivo absorption for peptide-like drugs absorbed via the dipeptide transporter system. Pharm Res. 13: 120-3(1996).

문헌 5: Zhu C, Jiang L, Chen TM, Hwang KK. A comparative study of artificial membrane permeability assay for high throughput profiling of drug absorption potential. Eur J Med Chem. 37: 399-407(2002).

문헌 6: Cheng KC, Li C, Uss AS. Prediction of oral drug absorption in humans-from cultured cell lines and experimental animals. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4: 581-90(2008).

CYP3A4의 기질을 제외한 11 화합물의 P_app 및 인간 F_a·F_g의 상관성을, 이하의 식을 이용하여 비선형 최소 이승법으로 해석했다. 해석 방법은 기존의 보고를 참고로 했다(상기 문헌 2).

[수학식 1]

여기에서, P(1)은 스케일링 팩터로 했다. 비선형 회귀 분석에는 WinNonlin(Certara, 미국)을 이용했다. 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포 및 Caco-2 세포에 있어서의 P_app와, 인간 F_a·F_g의 상관을 평가하기 위하여 상관 계수(R값)를 산출했다.

2. 결과

(1) 인간 iPS 세포주 유래 소장 상피 세포의 막 투과 특성

인간에 있어서의 F_a·F_g가 인간 iPS 세포주 유래 소장 상피 세포의 막 투과 시험 결과의 P_app로부터 예측 가능한지 여부를 검증하기 위하여, 16개의 화합물의 P_app와 F_a·F_g를 비교했다(표 1). 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포 및 Caco-2 세포에 있어서의 CYP3A4의 기질을 제외한 11 화합물의 P_app와 F_a·F_g의 상관을 비선형 최소 이승법으로 해석한 결과, 도 14에 나타내는 회귀 곡선이 얻어졌다. 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포 및 Caco-2 세포에 있어서의 스케일링 팩터는, 각각 0.531±0.083, 3.243±0.992가 되었다. 세포 간격 경로를 통과하는 화합물이나 트랜스포터로 수송되는 화합물의 P_app는, 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포에서는 F_a·F_g의 값이 커짐에 따라, 점차 큰 값이 되었다. 그러나, Caco-2 세포에서는 다른 F_a·F_g를 갖는 화합물에서도 P_app는 대략 동일한 값을 나타냈다(도 14). CYP3A4의 기질을 제외한 11 화합물에서의 P_app와 F_a·F_g의 상관 계수는 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포가 0.9, Caco-2 세포가 0.56으로, 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포 쪽이 인간의 F_a·F_g와 높은 상관을 갖고 있었다.

[표 1]

표 1: 분화한 장 세포와 Caco-2 세포의 P_app값. 세포를 복수의 약물을 포함하는 트랜스포터 완충액으로 37℃에서 60분간 인큐베이트했다. 전체 데이터는 평균±표준 편차로 나타낸다(n=3).

3. 고찰

막 투과 시험의 결과로부터 Caco-2 세포에서는 세포 간격 경로나 트랜스포터로 수송되는 F_a·F_g가 다른 다양한 화합물이 동일한 정도의 속도로 투과되고 있지만, 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포는 화합물의 F_a·F_g의 크기에 따라 다른 속도로 투과하고 있었다(도 14). 그 때문에, Caco-2 세포보다 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포에서의 P_app가 F_a·F_g와 높은 상관을 나타냈다. 이 이유로서, Caco-2 세포는 강고한 타이트 정션을 갖기 때문에, 세포 간격 경로를 통과하는 약물의 투과성이 낮은 것이나, 트랜스포터의 발현이 낮은 것이 원인이라고 생각된다. 이들의 결과로부터, 인간 iPS 세포 유래 소장 상피 세포는, Caco-2 세포보다 세포 간격 경로를 통과하는 기질 및 트랜스포터에 수송되는 기질의 막 투과의 예측이 우수한 것이 시사되었다.

산업상 이용가능성

본원 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터, 보다 기능적인 장관 상피 세포와 같은 세포를 간편하게 또한 보다 효율적으로 조제할 수 있다. 장관 상피 세포와 같은 세포는 소장의 모델계로서 유용하며, 흡수·대사·막 투과성, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성의 평가 등에 이용할 수 있다. 또, 각종 장 질환 치료용의 세포 제제의 유효 성분으로서, 혹은 재생 의료의 재료로서의 이용도 기대된다.

이 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 결코 한정되는 것은 아니다. 특허청구의 범위의 기재를 벗어나지 않고, 당업자가 용이하게 상도할 수 있는 범위에서 다양한 변형 양태도 이 발명에 포함된다. 본 명세서 중에서 명시한 논문, 공개특허공보, 및 특허공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의하여 인용하는 것으로 한다.

Claims

이하의 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, 다능성 줄기 세포를 장관 상피 세포로 분화 유도하는 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정;
(2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질을 병용하여, 공정 (1)에서 얻어진 장관 줄기 세포와 같은 세포를 장관 상피 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정.
청구항 1에 있어서,
공정 (1)이 이하의 공정 (1-1) 및 (1-2)로 이루어지는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법:
(1-1) 인공 다능성 줄기 세포를 내배엽과 같은 세포로 분화시키는 공정;
(1-2) 공정 (1-1)에서 얻어진 내배엽과 같은 세포를 장관 줄기 세포와 같은 세포로 분화시키는 공정.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
공정 (2)에 있어서의 배양 기간이 7일간 내지 40일간인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
공정 (2)가, 이하의 A~D 중 어느 것의 배양 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법,
배양 공정 A: (a-1) EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양과 상기 배양 후에 행해지는, (a-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함한다,
배양 공정 B: (b-1) EGF의 존재하에서의 배양과, 상기 배양 후에 행해지는, (b-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다,
배양 공정 C: (c-1) EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양과, 상기 배양 후에 행해지는, (c-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다,
배양 공정 D: (d-1) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제, EGF 및 cAMP 활성화 물질의 존재하에서의 배양을 포함한다.
청구항 4에 있어서,
(a-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (a-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 29일간이고,
(b-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (b-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 19일간이고,
(c-1)의 배양의 기간은 2일간 내지 10일간이며, (c-2)의 배양의 기간은 9일간 내지 19일간이고,
(d-1)의 배양의 기간은 15일간 내지 25일간인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
cAMP 활성화 물질이 포스콜린인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
공정 (2)가, cAMP가 세포로 공급되는 조건 및/또는 cAMP 분해 효소 저해제가 존재하는 조건으로 행해지는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 7에 있어서,
cAMP가 세포로 공급되는 조건이, 배지 중에 8-Br-cAMP가 존재하는 것인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
cAMP 분해 효소 저해제가 IBMX인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 4 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
배양 공정 B가, (b-2)의 배양 후에 행해지는, (b-3) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하며,
배양 공정 C가, (c-2)의 배양 후에 행해지는, (c-3) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하고,
배양 공정 D가, (d-1)의 배양 후에 행해지는, (d-2) MEK1 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 EGF의 존재하에서의 배양을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 10에 있어서,
(b-3)의 배양, (c-3)의 배양, 및 (d-2)의 배양의 기간은 1일간~10일간인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
MEK1 저해제가 PD98059이며, DNA 메틸화 저해제가 5-아자-2'-디옥시사이티딘이고, TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 2 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
공정 (1-1)에 있어서의 분화 유도 인자로서 액티빈 A를 이용하는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 2 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
공정 (1-2)에 있어서의 분화 유도 인자로서 FGF2 또는 GSK-3β 저해제를 이용하는, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 15에 있어서,
인공 다능성 줄기 세포가 인간 인공 다능성 줄기 세포인, 다능성 줄기 세포의 장관 상피 세포로의 분화 유도 방법.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진 장관 상피 세포와 같은 세포.
청구항 17에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포를 이용한, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법.
청구항 18에 있어서,
상기 체내 동태가, 대사, 흡수, 배설, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성 평가 방법.
청구항 18 또는 청구항 19에 있어서,
이하의 공정 (i)~(iii)을 포함하는, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성 평가 방법:
(i) 청구항 17에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포로 구성된 세포층을 준비하는 공정;
(ii) 상기 세포층에 피검 물질을 접촉시키는 공정;
(iii) 상기 세포층을 투과한 피검 물질을 정량하여, 피검 물질의 흡수성 내지 막 투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 평가하는 공정.
청구항 18 또는 청구항 19에 있어서,
이하의 공정 (I) 및 (II)를 포함하는, 피검 물질의 체내 동태 또는 독성 평가 방법:
(I) 청구항 17에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포에 피검 물질을 접촉시키는 공정;
(II) 피검 물질의 대사 혹은 흡수, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 또는 독성을 측정·평가하는 공정.
청구항 17에 기재된 장관 상피 세포와 같은 세포를 포함하는, 세포 제제.