WO2020203712A1 - 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞の製造方法およびその応用 - Google Patents

特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞の製造方法およびその応用 Download PDF

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Abstract

本発明の課題は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法を提供することである。本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法が提供される。本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞が提供される。本発明によれば、分化細胞の製造方法および分化細胞が提供される。本発明によれば、多能性幹細胞の品質評価のための方法が提供される。さらに、本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法が提供される。

Description

特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞の製造方法およびその応用
　本発明は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法に関する。本発明は、上記特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により得られる特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞に関する。本発明は、分化細胞の製造方法に関する。本発明は、上記分化細胞の製造方法により得られる分化細胞に関する。また、本発明は、多能性幹細胞の品質評価のための方法に関する。さらに、本発明は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法に関する。
　再生医療分野においては、多能性幹細胞を特定細胞に分化誘導して各種の分化細胞を得るための研究が進められている。
　多能性幹細胞は生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と自己複製能を併せ持つ細胞と定義されている。しかし、実際には、多能性幹細胞が由来するドナー間や樹立された株間において、分化能が一定でなく、分化能が高い細胞と低い細胞が存在することが知られている。
　特許文献１には、血球への高い分化能を有する人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を選別する方法であって、以下の工程：（ｉ）サンプルとしての人工多能性幹細胞において、ＴＲＩＭ５８、ＣＴＳＦ、ＦＡＭ１９Ａ５およびＴＣＥＲＧ１Ｌ遺伝子からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現のレベルを測定する工程、および（ｉｉ）血球への高い分化能を有することが既知であるｉＰＳ細胞もしくは胚性幹（ＥＳ）細胞と比較して上記で測定した遺伝子の発現のレベルが同等もしくはそれ以上の人工多能性幹細胞を選択する工程、および／または血球への低い分化能を有することが既知であるｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞と比較して上記で測定した遺伝子の発現のレベルが高い人工多能性幹細胞を選択する工程を含む、方法が記載されている。
国際公開ＷＯ２０１４／２０００３０号
　分化細胞は、複雑な培養条件を用いて、比較的長期間の培養により段階的に細胞を分化させて得られることから、効率よく分化細胞製品を製造するためには、分化誘導の前に、高い分化能を持つ多能性幹細胞を選択し、細胞材料として用いることが求められている。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、血球への高い分化能を有するｉＰＳ細胞を選別する方法であるため、他の多様な特定細胞への分化能について評価するための方法が求められている。
　本発明は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、上記特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により得られる特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、分化細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、上記分化細胞の製造方法により得られる分化細胞を提供することを解決すべき課題とする。また、本発明は、多能性幹細胞の品質評価のための方法を提供することを解決すべき課題とする。
　上記課題の下、本発明者らは、詳細な検討を行った結果、多能性幹細胞は、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子を低発現する株と高発現する株に分類することができ、高発現株は特定細胞への分化効率が低いことを明らかにした。この結果から、本発明者らは、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを指標として、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法であって、
（ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
を含む、方法。
（２）上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子が、ＣＥＲ１、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＮＯＤＡＬおよびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一種類の遺伝子である、（１）に記載の方法。
（３）上記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）上記特定細胞が心筋細胞または神経細胞である、（１）から（３）のいずれか一に記載の方法。
（５）上記多能性幹細胞がヒト由来細胞である、（１）から（４）のいずれか一に記載の方法。
（６）上記サンプルとしての多能性幹細胞が、多能性幹細胞をクローン培養して増殖させることにより得られたものである、（１）から（５）のいずれか一に記載の方法。
（７）（１）から（６）のいずれか一に記載の方法により得られる、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞。
（８）（１）から（６）のいずれか一に記載の方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
上記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程を含む、分化細胞の製造方法。
（９）上記分化細胞が中胚葉または外胚葉に由来する細胞である、（８）に記載の方法。
（１０）（８）または（９）に記載の方法により得られる分化細胞。
（１１）多能性幹細胞の品質評価のための方法であって、
（ａ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｂ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（ｃ）上記遺伝子の発現レベルが同等、もしくは低いものを、優良であると判断する工程を含む、方法。
（１２）特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程：
（ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｉｉ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択する工程
を含む、方法。
　本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法を提供することができる。本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を提供することができる。本発明によれば、分化細胞の製造方法を提供することができる。本発明によれば、分化細胞を提供することができる。本発明によれば、多能性幹細胞の品質評価のための方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法を提供することができる。
図１は、フローサイトメーターによるｃＴｎＴ陽性細胞の解析である。 図２は、高産生クローン群対低産生クローン群のＶｏｌｃａｎｏ　Ｐｌｏｔである。 図３は、ＮＡＮＯＧの発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。 図４は、ＮＯＤＡＬの発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す。 図５は、ＬＥＦＴＹ１の発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す。 図６は、ＬＥＦＴＹ２の発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す。 図７は、ＣＥＲ１の発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す。 図８は、ＣＸＣＲ４の発現量を、高産生クローン群対低産生クローン群で比較したグラフである。＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す。 図９は、外胚葉分化誘導前のＮＯＤＡＬの発現量を示すグラフである。 図１０は、外胚葉分化誘導後のＰＡＸ６の発現量を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
　本明細書における略号は以下の意味を有する。
ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）：塩基性線維芽細胞成長因子
ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　４）：骨形成因子４
ＣＥＲ１（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ　１）：サーベラス１
ｃＴｎＴ（ｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ）：心筋トロポニンＴ
ＣＸＣＲ４（Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　４）：Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４
ＤＭＥＭ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２）：ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２ハム
Ｄ－ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）：エチレンジアミン四酢酸
Ｅｒｋ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｋｉｎａｓｅ）：細胞外シグナル調節キナーゼ
ＥＳＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ）：胚性幹細胞特異的遺伝子
ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）：線維芽細胞増殖因子
ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）：グリコーゲン合成酵素キナーゼ
Ｋｌｆ（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ）：クルッペル様因子
ＬＧＲ５（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）：ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５
ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）：白血病抑制因子
Ｏｃｔ（ｏｃｔａｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）：オクタマー結合性転写因子 
ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ　ｂｏｘ　６）：ペアードボックス６
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ）：Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成キナーゼ
ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）：幹細胞因子
Ｓｏｘ：ＳＲＹ （ｓｅｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　Ｙ）－ｂｏｘ：ＳＲＹ（Ｙ染色体性決定遺伝子）ボックス
Ｓｔａｔ３（Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　３）：シグナル伝達兼転写活性化因子３
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）：血管内皮増殖因子
［１］多能性幹細胞の製造方法および多能性幹細胞
　本発明は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含む。
（ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程。
　本発明によれば、原始内胚葉細胞が発現する少なくとも一種類の遺伝子の発現量を指標として、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選択することができる。特定細胞に分化する能力を有しない細胞やその能力が低い細胞を除外することにより、生産コストを低下させ、生産を安定化させることができる。
　「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。自己複製能は、細胞を継代培養し、細胞が増殖することおよび増殖後の細胞が有する特質が継代培養によって変化しないことにより、評価することができる。
　多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性および自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることが好ましくｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。多能性幹細胞は、哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジー等の霊長類、マウスやラット等のげっ歯類）由来の細胞が好ましく、ヒト由来細胞であることがより好ましい。本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒト由来ｉＰＳ細胞が用いられる。
　ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。なお、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
　ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ ＢＩＯ等から入手可能である。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。
　「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入等により体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジー等の霊長類、マウスやラット等のげっ歯類）の体細胞を用いることが好ましく、ヒトの体細胞を用いることがより好ましい。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　ｉＰＳ細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減等が可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現等を指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
　ｉＰＳ細胞は、例えば、国立大学法人京都大学または独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　多能性幹細胞には、ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞という２つの異なる状態の細胞が知られている。ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞は、分子特徴および細胞特徴により区別することができる。
　ナイーブ型多能性幹細胞は、典型的には、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４を発現し、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生し、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して分化し、ＸａＸａのＸ染色体状態を呈するという特徴を有する。プライム型多能性幹細胞は、典型的には、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇを発現し、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３に応答せず、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して自己再生し、ＸａＸｉのＸ染色体活性化状態を呈するという特徴を有する（Nichols et al.,(2009)Cell Stem Cell 4(6):487-492）。なお、Ｘａは活性型Ｘ染色体を示し、Ｘｉは不活性型Ｘ染色体を示す。
　本明細書において特定細胞は、外胚葉、内胚葉または中胚葉に由来する、任意の分化細胞である。外胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、神経系細胞（神経細胞、グリア細胞等）、感覚器細胞（水晶体、網膜、内耳等）、皮膚表皮細胞、毛包等が挙げられる。
　内胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、例えば、消化器系細胞（肝細胞、胆管細胞、膵内分泌細胞、腺房細胞、導管細胞、吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、腸管上皮細胞様細胞等）、肺、甲状腺等の組織の細胞が挙げられる。
　中胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、血球・リンパ球系細胞（造血幹細胞、赤血球、血小板、マクロファージ、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂリンパ球等）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨芽細胞、骨細胞，軟骨細胞，腱細胞，脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　本発明の多能性幹細胞を製造する方法における工程（ｉ）は、サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程である。
　「サンプルとしての多能性幹細胞」という記載において「サンプルとしての」は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造するための材料と成り得ることを意味し、「サンプルとしての多能性幹細胞」の中から、後述する工程（ｉｉ）により、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞が取得される。
　原始内胚葉細胞は、胚盤胞の内部細胞塊の胚盤胞腔に面した表層で分化する細胞である。原始内胚葉細胞が発現する遺伝子は、原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子であり得る。原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子とは、胚盤胞の原始内胚葉での発現が検出されるが、胚盤葉上層での発現は検出されない遺伝子を意味する。本発明の好ましい態様では、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子として、ＣＥＲ１、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＮＯＤＡＬおよびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一種類の遺伝子が用いられる。
　特許文献１では、造血幹細胞および／または造血前駆細胞への高い分化効率を示すことが既知であるｉＰＳ細胞等におけるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６などの遺伝子の発現レベルと同等もしくはそれ以上である対象ｉＰＳ細胞を、造血幹細胞および／または造血前駆細胞への高い分化効率を示すｉＰＳ細胞として選別している。一方、本発明の特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法においては、以下に詳細に記載するように、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する点で、特許文献１の記載とは異なる。
　遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現量を意味し、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、またはその翻訳産物の産生量、活性等により解析することができる。発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の測定により行うことができるが、ｍＲＮＡまたはその逆転写産物であるｃＤＮＡの測定により行なうことが好ましい。
　各遺伝子のＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記のＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒに基づいて、各遺伝子の配列情報を取得し、遺伝子の発現レベルを測定することができる。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルの測定方法は特に限定されないが、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定を行うことができる。ＲＴ－ＰＣＲは、測定対象となるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅する方法である。定量的ＲＴ－ＰＣＲとしては、例えば、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素が結合されたプライマーを用いてＰＣＲを行って各サイクル毎に増幅産物量を定量し、検出される蛍光強度が急激に増大するサイクル数から、試料中の鋳型ＤＮＡ量を測定する方法（リアルタイムＰＣＲ）等を挙げることができる。定量的ＲＴ－ＰＣＲの手法は本技術分野において周知であり、市販のキットを使用して実施することもできる。定量的ＲＴ－ＰＣＲによれば、遺伝子の発現量またはコピー数を、対照となるハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子）の発現量またはコピー数に対する相対値として測定することができる。なお、遺伝子のｍＲＮＡの測定は、通常のＲＴ－ＰＣＲ等によりｍＲＮＡの増幅を行うことにより得た増幅産物をゲル電気泳動にかけ、染色後、バンド強度を測定することによっても行うことができる。あるいは、ＤＮＡチップを用いて遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出または定量することもできる。原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルの測定は、次世代シーケンサーを用いて行うこともできる。なお、測定対象となる細胞は培養工程からの一部抜き取りによって得ることができる。
　発現レベルを示す数値としては、例えば、リアルタイムＰＣＲによって発現量を測定する場合、Ｃｔ（Ｃｙｃｌｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を用いることができる。Ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数である。横軸に増幅のサイクル数、縦軸にＰＣＲ産物量をプロットして、増幅曲線を作成し、ＰＣＲ産物量の値に閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定したときに閾値と増幅曲線が交わる点のサイクル数がＣｔ値となる。蛍光標識したプローブを用いて発現量を測定する場合は、蛍光強度を用いることもできる。
　本発明の多能性幹細胞を製造する方法では、先ず、多能性幹細胞の拡大培養を行うことができる。「サンプルとしての多能性幹細胞」は、フィーダー細胞をコートしたプレートまたはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）等の足場をコートしたプレート上で、適当な培地にて拡大培養されることが好ましい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胎児繊維芽細胞（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。拡大培養においては、細胞の未分化性が維持されることが好ましい。
　拡大培養の際の培地としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）等の市販の培地を使用することができる。あるいはまた、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｄ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が挙げられ、代替血清（ＫＳＲ；ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン、ゲンタマイシン）、ｂＦＧＦ等の添加成分を任意に組み合わせて、上記いずれかの基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
　拡大培養の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下等が好ましいが、特に限定されない。
　拡大培養により、培養液中の細胞濃度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで、細胞を培養することができる。
　拡大培養の途中で、継代を行ってもよい。例えばコンフルエントまたはサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続することができる。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２程度の細胞密度で細胞を播種することができる。
　サンプルとしての多能性幹細胞は、拡大培養により、多能性幹細胞をクローン培養して増殖させることにより得られたものであってもよい。クローン培養は、培養によって１個の細胞が分裂して増殖した細胞の集団を得ることを意味し、クローン培養により得られた細胞集団をクローン集団または単にクローンという。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルの測定は、ナイーブ型多能性幹細胞またはプライム型多能性幹細胞について行うことができるが、プライム型多能性幹細胞について行うことが好ましい。多能性幹細胞における原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現を検出するためには、プライム型多能性幹細胞が適しているためである。
　本発明の多能性幹細胞を製造する方法における工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で測定された原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程である。また、工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）で測定された原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、高い細胞は選択されない。
　「特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞」は、特定細胞への分化能が相対的に高いことが、文献等刊行物に報告されることにより、または前もって行う特定細胞への分化能の評価実験により明らかになっている多能性幹細胞を意味する。
　「特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞」としては、例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の０１４３４株（McNamara et al., 2018, Cell Systems 7, 359-370）を挙げることができる。
　「特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞」の選択は、例えば、分化誘導開始時の多能性幹細胞の細胞数に対する特定細胞への分化誘導後の特定細胞の細胞数の割合（特定細胞の生産率）を決定し、特定細胞の生産率が相対的に高い細胞を選択することにより行うことができる。特定細胞の生産率は、特定細胞の種類や分化誘導方法により変化しうるため、特定細胞の種類や分化誘導方法ごとに、「特定細胞への高い分化能を有する多能性幹細胞」の選択の基準となる特定細胞の生産率の値を設定することができる。当業者であれば、「特定細胞への高い分化能を有する」細胞とそうでない細胞を線引きするための特定細胞の生産率を適宜設定することができる。
　「特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞」は、例えば中胚葉、内胚葉または外胚葉に由来する分化細胞もしくはその前駆細胞、好ましくは中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞もしくはその前駆細胞の生産率を評価し選択することができる。より具体的には、多能性幹細胞の特定細胞への分化能は、例えば、心筋細胞、血球、骨格筋細胞、神経細胞、肝実質細胞、膵β細胞、腸管上皮細胞、またはそれらの前駆細胞への分化誘導を行うことにより評価することができる。これらの分化細胞またはそれらの前駆細胞への分化誘導には、確立された実験系が存在しているためである。
　特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞の一例としては、心筋細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞を挙げることができる。心筋細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞としては、好ましくは心筋細胞の生産率が５０％以上である多能性幹細胞を挙げることができ、より好ましくは心筋細胞の生産率が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、または１３０％以上である多能性幹細胞を挙げることができる。また、心筋細胞の生産率が、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上である多能性幹細胞を使用してもよい。
　心筋細胞の生産率（％）とは、（分化誘導後の総心筋細胞数÷分化誘導開始時の多能性幹細胞数）×１００を意味する。
　心筋細胞への分化誘導は、後述のように、細胞を、１日目は、ＲＯＣＫ阻害剤及びｂＦＧＦを添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１中で培養し、２日目は、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａおよびウシ胎児血清を含む×０．５　ｍＴｅＳＲ（登録商標）１および×０．５　ＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養し、３日目～８日目はｂＦＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、ＢＭＰ４、およびウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養し、９日目はＷｎｔ阻害剤およびウシ胎児血清を含む同培地で培養し、１０日目～１４日目はＷｎｔ阻害剤を除いた同培地にて培養することにより、実施することができる。
　心筋細胞は、心筋細胞マーカーであるｃＴｎＴを発現する細胞を、例えば蛍光色素で標識した抗ｃＴｎＴ抗体等を使用して検出することにより同定することができる。心筋細胞の細胞数は抗ｃＴｎＴ抗体等を用いて、蛍光色素による標識を介して、フローサイトメトリー法により、ｃＴｎＴを発現する細胞の割合（ｃＴｎＴ陽性細胞率）を測定することにより、算出することができる。ｃＴｎＴ陽性細胞率は、実施例２に記載の方法に準じてフローサイトメトリー法により、測定することができる。
　心筋細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞としては、好ましくは、分化誘導後のｃＴｎＴ陽性細胞率が２５％以上である多能性幹細胞を挙げることができ、より好ましくはｃＴｎＴ陽性細胞率が、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、または６０％以上である多能性幹細胞を挙げることができる。
　本発明においては、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、発現レベルが同等であるか、または低い、多能性幹細胞を選択する。
　「同等」とは、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルの１倍以上であり、かつ２倍未満であることを意味し、好ましくは１．９倍以下、１．８倍以下、１．７倍以下、１．６倍以下、１．５倍以下、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、または１．１倍以下である。
　「低い」とは、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における発現レベルの１倍未満であることを意味し、好ましくは０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下である。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子がＮＯＤＡＬ遺伝子の場合、選択される多能性幹細胞におけるＮＯＤＡＬ遺伝子の発現レベルは、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞におけるＮＯＤＡＬ遺伝子の発現レベルの１．９倍以下であることが好ましく、１．８倍以下、１．７倍以下、１．６倍以下、１．５倍以下、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下でもよい。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子がＬＥＦＴＹ１遺伝子の場合、選択される多能性幹細胞におけるＬＥＦＴＹ１遺伝子の発現レベルは、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞におけるＬＥＦＴＹ１遺伝子の発現レベルの１．９倍以下であることが好ましく、１．８倍以下、１．７倍以下、１．６倍以下、１．５倍以下、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下でもよい。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子がＬＥＦＴＹ２遺伝子の場合、選択される多能性幹細胞におけるＬＥＦＴＹ２遺伝子の発現レベルは、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞におけるＬＥＦＴＹ２遺伝子の発現レベルの１．５倍以下であることが好ましく、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下でもよい。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子がＣＥＲ１遺伝子の場合、選択される多能性幹細胞におけるＣＥＲ１遺伝子の発現レベルは、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞におけるＣＥＲ１遺伝子の発現レベルの１．７倍以下であることが好ましく、１．６倍以下、１．５倍以下、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下でもよい。
　原始内胚葉細胞が発現する遺伝子がＣＸＣＲ４遺伝子の場合、選択される多能性幹細胞におけるＣＸＣＲ４遺伝子の発現レベルは、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞におけるＣＸＣＲ４遺伝子の発現レベルの１．９倍以下であることが好ましく、１．８倍以下、１．７倍以下、１．６倍以下、１．５倍以下、１．４倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、または０．６倍以下でもよい。
　当業者であれば、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における各遺伝子の発現レベルに基づいて、特定細胞への分化能を有する多能性幹細胞を選択するための基準値を適宜設定することができる。例えば、「特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞」として選択した２以上のクローンにおける、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルの値の平均値を基準値として設定し、この基準値と比較して、上記遺伝子の発現レベルが同等であるか、または低い多能性幹細胞を、特定細胞への分化能を有する多能性幹細胞として選択することもできる。基準値は、遺伝子ごとに設定することができる。
　特定細胞への分化能を有する多能性幹細胞の選択は、サンプルとしての原始内胚葉細胞が発現する２種類以上の遺伝子の発現レベルを測定し、判別分析を適用することによりスコア化し、サンプルとしての原始内胚葉細胞が特定細胞への分化能を有する多能性幹細胞であるか、そうでないかを決定することができる。判別分析としては、例えば、フィッシャーの線形判別、マハラノビス距離に基づく判別、ユークリッド距離に基づく判別、多群判別、変数選択および正準判別等が挙げられる。これらの判別分析は、各種統計解析ソフトを使用することにより実施できる。
　本発明には、上記の製造方法により得られる、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞も含まれる。上記の製造方法により得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導することにより、効率的に分化細胞を製造することができる。
　本発明の別の局面は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法であって、
（ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
を含む、方法に関する。
本発明のさらに別の局面は、多能性幹細胞の品質評価のための方法であって、
（ａ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｂ）測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（ｃ）前記遺伝子の発現レベルが同等、もしくは低いものを、優良であると判断する工程
を含む、方法に関する。
　本発明の品質評価は、サンプルとしての多能性幹細胞が、特定細胞への高い分化能を有するか、そうでないかについて、分化誘導前に予測することを意味する。原始内胚葉細胞が発現する少なくとも一種類の遺伝子の発現レベルを指標として、特定細胞への高い分化能を有すると予測されるサンプルとしての多能性幹細胞を優良な株と評価し、特定細胞への高い分化能を有しないと予測されるサンプルとしての多能性幹細胞を不良な株と評価することができる。
　本発明の品質評価のための方法によれば、品質評価により不良な株を除外することにより、生産コストを低下させることができ、生産を安定化させることができる。また、クローン培養過程の複数時点において、細胞を一部サンプリングし、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現量の経過をモニタリングすることで、クローン培養過程での細胞品質の悪化を検出し、これを生産プロセスにフィードバックすることもできる。ｉＰＳ細胞の樹立、拡大、分化の各工程において、ｉＰＳ細胞の新たな品質基準として原始内胚葉遺伝子の発現量を測定・モニタリングすることができる。
　本発明における工程（ａ）は、上記［１］製造方法に記載の、工程（ｉ）と同様に実施することができる。本発明における工程（ｂ）は、上記［１］製造方法に記載の、工程（ｉｉ）と同様に実施することができる。工程（ｂ）では、工程（ａ）で測定された原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を、特定細胞に分化する能力を有すると評価することができる。特定細胞に分化する能力を有すると評価された多能性幹細胞については分化誘導の対象とすることが好ましい。それにより、分化細胞製品を効率的に生産することができるためである。
［２］分化細胞の製造方法および分化細胞
　本発明は、分化細胞の製造方法に関し、以下の工程を含む。
　上記特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
　上記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程。
　本発明の特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞に対して、分化誘導を行うことにより、効率的に分化細胞を製造することができる。
　上記特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程は、上記［１］製造方法の記載に基づいて実施することができる。
　「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する方法は、特に限定されない。例えば、市販のＳｔｅｍＤｉｆｆ(登録商標)Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、内胚葉、中胚葉および外胚葉のそれぞれに分化誘導することができる。
　内胚葉細胞への分化誘導は、例えば、細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｅｎｄｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて手順書に従い、内胚葉細胞に分化誘導することができる。
　中胚葉細胞への分化誘導は、例えば、細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｍｅｓｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて手順書に従い、中胚葉細胞に分化誘導することができる。
　外胚葉細胞への分化誘導は、例えば、後記する実施例５に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｅｃｔｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて手順書に従い、外胚葉細胞に分化誘導することができる。
　内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞への分化誘導の確認は、各胚葉特異的遺伝子の発現により確認することができる。各胚葉特異的遺伝子の発現の測定方法は特に限定されないが、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法により測定を行うことができる。
　内胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２等を挙げることができる。中胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＴおよびＰＤＧＦＲＡ等を挙げることができる。外胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＰＡＸ６およびＭＡＰ２等を挙げることができる。
　心筋細胞への分化誘導は、例えば、後記する実施例１に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞を、１日目は、ＲＯＣＫ阻害剤及びｂＦＧＦを添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１中で培養し、２日目は、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａおよびウシ胎児血清を含む×０．５　ｍＴｅＳＲ（登録商標）１および×０．５　ＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養し、３日目～８日目はｂＦＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、ＢＭＰ４、およびウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養し、９日目はＷｎｔ阻害剤およびウシ胎児血清を含む同培地で培養し、１０日目～１４日目はＷｎｔ阻害剤を除いた同培地にて培養することにより、心筋細胞に分化誘導することができる。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えばＨ１１５２、Ｙ２７６３４などを用いることができる。Ｗｎｔ阻害剤としては、例えばＸＡＶ９３９を用いることができる。あるいは、ＰＳＣ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い、心筋細胞に分化誘導することもできる。心筋細胞への分化誘導は、心筋細胞マーカーであるｃＴｎＴの発現をフローサイトメトリーで測定することにより確認することができる。
　また、血液細胞への分化誘導は、ＷＯ２０１９／１５１３８６に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、１日目は、ＢＭＰ４およびＹ２７６３４（ＲＯＣＫ阻害剤）を含む培地で培養し、２日目にｂＦＧＦおよびＢＭＰ４を添加し、３日目に細胞がスフェロイド状のコロニーを形成していることを確認して、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ-β受容体阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４を含む培地で培養し（３日目および４日目）、５日目～６日目は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培地で培養し、７日目～１０日目はＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１およびＳＣＦを含む培地で培養することにより、血液細胞に分化誘導することができる。なお、血液細胞への分化誘導は、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＫＤＲの発現をフローサイトメーターにて解析することにより確認することができる。
　神経幹細胞への分化誘導は、例えば、ＷＯ２０１９／１５１３８６に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞をＰＳＣ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い、神経幹細胞に分化誘導することができる。神経幹細胞への分化誘導は、例えば、神経幹細胞のマーカーであるＳＯＸ１蛋白質を免疫染色することにより確認することができる。
　腸管幹細胞様細胞への分化誘導は、例えば、ＷＯ２０１９／１５６２００に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には細胞を、ＦＧＦ２、またはＧＳＫ－３β阻害剤を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養し、腸管幹細胞様細胞に分化誘導することができる。腸管幹細胞様細胞への分化誘導は、例えば、腸管幹細胞マーカーであるＬＧＲ５を免疫染色することにより確認することができる。
　腸管上皮細胞様細胞への分化誘導は、例えば、ＷＯ２０１９／１５６２００に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞をＥＧＦおよびフォルスコリンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２で培養し、腸管上皮細胞様細胞に分化誘導することができる。腸管上皮細胞様細胞への分化誘導は、例えば、腸管上皮細胞マーカーの発現やペプチドの取り込み、或いはビタミンＤ受容体を介した薬物代謝酵素の発現誘導を指標にして判定ないし評価することができる。
　本発明の分化細胞の製造方法により、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を、上記以外の中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、中胚葉に由来する細胞へ分化することができる。中胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、血球・リンパ球系細胞（造血幹細胞、赤血球、血小板、マクロファージ、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂリンパ球等）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨芽細胞、骨細胞，軟骨細胞，腱細胞，脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　本発明の分化細胞の製造方法により、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を、上記以外の外胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、外胚葉に由来する細胞へ分化することができる。外胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、神経系細胞（神経細胞、グリア細胞等）、感覚器細胞（水晶体、網膜、内耳等）、皮膚表皮細胞、毛包等が挙げられる。
　本発明の分化細胞の製造方法により、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉に由来する細胞へ分化することができる。内胚葉に由来する分化細胞としては、特に限定されないが、例えば、消化器系細胞（肝細胞、胆管細胞、膵内分泌細胞、腺房細胞、導管細胞、吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、腸管上皮細胞等）、肺、甲状腺等の組織の細胞が挙げられる。
　本発明には、上記の分化細胞の製造方法により得られる、分化細胞も含まれる。本発明の分化細胞の製造方法により分化誘導した細胞は、各種疾患の治療用医薬品候補化合物のスクリーニングに用いることができる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品候補化合物を、分化誘導した細胞に添加することによって、細胞の形態または機能的な変化、各種因子の増減、遺伝子発現プロファイリング等を検出することにより、評価を行うことができる。
　本発明の分化細胞の製造方法により分化誘導した細胞を用いて分化誘導した細胞から組織を作製して、再生医療の分野で使用することができる。作製した組織の患者への移植方法としては、当業者であれば自明である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
心筋細胞への分化誘導
　異なるドナー由来を含む末梢血単核球細胞から特許５９８４２１７号に記載の方法に準じてｉＰＳ細胞クローンＡ～Ｎを作成した。ｉＰＳ細胞の培養にはｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を使用し、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって７分間処理することで細胞を回収し継代した。上記の条件でＴ２２５フラスコ２枚分までｉＰＳ細胞を拡大培養した。これにより得られるｉＰＳ細胞は、プライム型である。
　上記条件でコンフルエンシーが８０％程度になるまでｉＰＳ細胞を増殖させたのち、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）にて細胞を単細胞剥離して回収し、終濃度１μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ１１５２（富士フイルム和光純薬社）、２５μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）、および１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬社）を添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１中に３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を調整した。同細胞懸濁液を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）中に１５ｍＬ添加し、回転速度４０ｒｐｍで撹拌培養した。培養開始から２～４時間後、同一の培地にて最終液量３０ｍＬ、細胞数４．５×１０７ｃｅｌｌｓとなるようにメスアップし、そのまま撹拌培養を継続した。
　撹拌培養開始１日後、終濃度１μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ１１５２、２５μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン、　１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、　２４ｎｇ／ｍＬ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ社）、５％　ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア社）、×０．５　ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、および×０．５　ＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）からなる培地に置換し、撹拌培養を継続した。
　撹拌培養開始２日後、培養液を一部サンプリングして細胞数を計測し、終濃度２５μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、２４ｎｇ／ｍＬ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、４０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ社）、１０％　ウシ胎児血清、およびＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅからなる培地中に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、撹拌培養を継続した。撹拌培養開始３日～７日は同培地にて毎日培地交換し、撹拌培養を継続した。
　撹拌培養開始８日後、培養液を一部サンプリングして細胞数を計測し、終濃度２５μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍａｉｃｉｎ、　１６．２５μｇ／ｍＬ　ＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０％　ウシ胎児血清、およびＤＭＥＭ　ｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅからなる培地中に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、撹拌培養を継続した。撹拌培養９日～１３日はＸＡＶ９３９を除いた同培地にて２日毎に培地交換し、撹拌培養を継続した。
　撹拌培養開始１４日後、クローンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮ由来の細胞塊は一部が自律拍動していることが確認された。一方でクローンＣおよびＨ由来の細胞塊は拍動が観察されなかった。培養液の一部をサンプリングして細胞数を計測した。最終的に得られた細胞数を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例２＞
ｉＰＳ細胞由来心筋細胞塊のフローサイトメーターによる解析
　撹拌培養開始後１４日の細胞塊をＴｒｙｐＬＥ（登録商標）　Ｓｅｌｅｃｔで単一細胞まで分離し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｇｒｅｅｎ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて死細胞を染色した。Ｄ－ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）にて洗浄後、終濃度４％　ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理して細胞を固定した。得られた固定細胞０．５×１０６ｃｅｌｌｓに対して、終濃度０．１％　Ｓａｐｏｎｉｎ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、２％　ウシ胎児血清を含むＤ－ＰＢＳ中に、抗－ｃＴｎＴ抗体（Ａｂｃａｍ社　ａｂ８２９５）を１／２５０に希釈して添加し、室温で１時間処置した。同時にＩｓｏｔｙｐｅコントロールとしてＩｇＧ１　ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｔｒｏｌ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｍｙｅｌｏｍａ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社　Ｍ５２８４）を１／２５に希釈して添加したサンプルを並列させた。続いてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社　Ａ２１２４０）を１／５００に希釈して添加し、室温で３０分間処置した。得られた標識細胞をフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社　Ａｔｔｕｎｅ　Ｎｘｔ）を用いて解析した。前方光散乱、側方光散乱、および生細胞をゲーティングしたのち、Ｉｓｏｔｙｐｅサンプルとの比較からｃＴｎＴ陽性細胞率を算出した。クローンＡで得られたフローサイトメーター、およびゲーティング例を図１に示す。心筋細胞誘導後の各クローンのｃＴｎＴ陽性細胞率、および分化誘導後の総細胞数とｃＴｎＴ陽性細胞率とから算出した総心筋細胞数（ｃＴｎＴ陽性細胞数）、および分化誘導開始時の多能性幹細胞数を基準とした心筋細胞の生産率（％）（分化誘導後の総心筋細胞数÷分化誘導開始時の多能性幹細胞数）×１００）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例３＞
ｉＰＳ細胞の遺伝子発現解析
　実施例１のｉＰＳ細胞拡大培養時点で一部の細胞をサンプリングし、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出した。同ＲＮＡをマイクロアレイ解析Ｃｌａｒｉｏｍ　Ｓ，　Ｈｕｍａｎ　Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用いて解析し、各ｉＰＳ細胞クローンの遺伝子発現量マトリクスを得た。データ解析はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）に従って実施した。
＜実施例４＞
ｉＰＳ細胞の遺伝子発現と心筋細胞生産率の相関解析
　実施例２に従って得た各ｉＰＳ細胞クローン由来の心筋細胞生産率、および実施例３に従って得た遺伝子発現量を比較するため、クローンＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍを心筋細胞高産生クローン群として、クローンＣ、Ｄ、Ｈ、Ｎを低産生クローン群として定義し、Ｖｏｌｃａｎｏ　Ｐｌｏｔ（ｔ－検定とｆｏｌｄ解析を組み合わせた２群間比較）を作成した。結果を図２に示す。図２では、縦軸にｔ－検定の有意水準であるＰ－ｖａｌｕｅ（－ｌｏｇ　１０）、横軸に平均値の比のＦｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅを示している。
また心筋細胞高産生クローン群と低産生クローン群との間で発現量差絶対値が２倍以上、発現有意差（Ｐ－ｖａｌｕｅ）が０．０１未満の遺伝子を抽出しリストアップした（リストは非掲載）。得られた遺伝子リストから、低産生クローン群のｉＰＳ細胞は原始内胚葉に発現するとされる遺伝子群、例えばＮＯＤＡＬ、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４等の発現が有意に高い傾向にあることがわかった。また、原始内胚葉に発現するとされる遺伝子群のうちＬＥＦＴＹ１およびＬＥＦＴＹ２の発現量を確認したところ、低産生クローン群のｉＰＳ細胞での発現量が、高産生クローン群のｉＰＳ細胞での発現量よりも高い傾向にあることもわかった。ＮＯＤＡＬ、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＬＥＦＴＹ１およびＬＥＦＴＹ２のＦｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ（Ｌｏｗ　Ａｖｇ／Ｈｉｇｈ　Ａｖｇ）及びＰ－ｖａｌｕｅを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記をより詳細に確認するため、ｉＰＳ細胞拡大培養時点でサンプリングし一部の細胞から得られたＲＮＡの一部をＨｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて各遺伝子発現量を、クローンＡ由来ｃＤＮＡを基準としてΔΔＣＴ法により定量した。使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＰｒｏｂｅのＩＤを表５に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｐｒｏｂｅによる各遺伝子発現量評価で得られた結果を表６に示す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｐｒｏｂｅによる各遺伝子発現量評価の結果を高産生クローン群、低産生クローン群とに分割し、箱ひげ図（ｂｏｘ　ｐｌｏｔ）にまとめた結果を図３～８に示す。多能性マーカーであるＮＡＮＯＧは両群の発現量に大きな差がない一方で、原始内胚葉で発現するとされる遺伝子（ＮＯＤＡＬ、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４）は低産生クローンにて有意に発現が高いことが確認された（図中＊はＰ－ｖａｌｕｅ＜０．０１を示す）。
　以上から、心筋細胞の生産性が相対的に低いｉＰＳ細胞クローンは共通して原始内胚葉遺伝子（原始内胚葉が発現する遺伝子）系列の発現量が高い傾向にあることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実施例５＞
　外胚葉細胞への分化誘導
　ｉＰＳ細胞クローン１４株のうち、クローンＢ、Ｈ、Ｉ、Ｎを選択し、実施例１と同様の方法で拡大培養した。コンフルエンシーが８０％程度になるまでｉＰＳ細胞を増殖させたのち、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）　Ｓｅｌｅｃｔにて細胞を単細胞剥離して回収し、終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を含むＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｅｃｔｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をコートした６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。翌日以降、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｅｃｔｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍに毎日交換し、播種後７日間培養した。
＜実施例６＞
ｉＰＳ細胞の遺伝子発現と外胚葉細胞分化率の相関解析
　実施例５に記載の方法に従って播種後７日間、細胞を培養した後、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを回収した。実施例４と同様の方法でｃＤＮＡに逆転写し、外胚葉マーカー遺伝子であるＰＡＸ６の遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（ＩＤ：Ｈｓ０１０８８１１４＿ｍ１）を用いて解析した。また、各ｉＰＳクローンの拡大培養後（播種０日）のＲＮＡも同様に回収し、原始内胚葉遺伝子であるＮＯＤＡＬの発現量を測定した（ＩＤ：Ｈｓ００４１５４４３＿ｍ１）。発現量はクローンＢを基準として、ΔΔＣＴ法により定量した。結果を表７、および図９、１０に示す。原始内胚葉遺伝子の発現が高いｉＰＳクローン（クローンＨ、Ｎ）はいずれも外胚葉誘導後のＰＡＸ６発現量が相対的に低い、すなわち外胚葉分化効率が低いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (12)

  1. 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法であって、
    （ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
    （ｉｉ）測定された前記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、前記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
    を含む、方法。
  2. 前記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子が、ＣＥＲ１、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＮＯＤＡＬおよびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一種類の遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記特定細胞が心筋細胞または神経細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記多能性幹細胞がヒト由来細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記サンプルとしての多能性幹細胞が、多能性幹細胞をクローン培養して増殖させることにより得られたものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の方法により得られる、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞。
  8. 請求項１から６のいずれか一項に記載の方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
    前記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程を含む、分化細胞の製造方法。
  9. 前記分化細胞が中胚葉または外胚葉に由来する細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 請求項８または９に記載の方法により得られる分化細胞。
  11. 多能性幹細胞の品質評価のための方法であって、
    （ａ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
    （ｂ）測定された前記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
    （ｃ）前記遺伝子の発現レベルが同等、もしくは低いものを、優良であると判断する工程
    を含む、方法。
  12. 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
    （ｉｉ）測定された前記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、前記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択する工程
    を含む、方法。
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