JP7273141B2 - 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞の製造方法およびその応用 - Google Patents
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Description
(1)特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法であって、
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(ii)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
を含む、方法。
(2)上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子が、CER1、LEFTY1、LEFTY2、NODALおよびCXCR4からなる群から選択される少なくとも一種類の遺伝子である、(1)に記載の方法。
(3)上記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞である、(1)または(2)に記載の方法。
(4)上記特定細胞が心筋細胞または神経細胞である、(1)から(3)のいずれか一に記載の方法。
(5)上記多能性幹細胞がヒト由来細胞である、(1)から(4)のいずれか一に記載の方法。
(6)上記サンプルとしての多能性幹細胞が、多能性幹細胞をクローン培養して増殖させることにより得られたものである、(1)から(5)のいずれか一に記載の方法。
(7)(1)から(6)のいずれか一に記載の方法により得られる、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞。
(8)(1)から(6)のいずれか一に記載の方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
上記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程を含む、分化細胞の製造方法。
(9)上記分化細胞が中胚葉または外胚葉に由来する細胞である、(8)に記載の方法。
(10)(8)または(9)に記載の方法により得られる分化細胞。
(11)多能性幹細胞の品質評価のための方法であって、
(a)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(b)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
(c)上記遺伝子の発現レベルが同等、もしくは低いものを、優良であると判断する工程を含む、方法。
(12)特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程:
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(ii)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択する工程
を含む、方法。
本明細書における略号は以下の意味を有する。
bFGF(basic Fibroblast Growth Factor):塩基性線維芽細胞成長因子
BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4):骨形成因子4
CER1(Cerberus 1):サーベラス1
cTnT(cardiac Troponin T):心筋トロポニンT
CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4):C-X-Cケモカイン受容体タイプ4
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium):ダルベッコ改変イーグル培地
DMEM/F12(DMEM Ham’s F-12):ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12ハム
D-PBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline):ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid):エチレンジアミン四酢酸
Erk(Extracellular Signal-regulated Kinase):細胞外シグナル調節キナーゼ
ESG(Embryonal stem cell-specific gene):胚性幹細胞特異的遺伝子
GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase):グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
GSK(Glycogen Synthase Kinase):グリコーゲン合成酵素キナーゼ
Klf(Kruppel-like factor):クルッペル様因子
LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5):ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役受容体5
LIF(Leukemia inhibitory factor):白血病抑制因子
Oct(octamer-binding transcription factor):オクタマー結合性転写因子
PAX6(paired box 6):ペアードボックス6
PCR(polymerase chain reaction):ポリメラーゼ連鎖反応
ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase):Rho結合コイルドコイル形成キナーゼ
RT-PCR(Reverse Transcription polymerase chain reaction):逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SCF(Stem cell factor):幹細胞因子
Sox:SRY (sex determining region Y)-box:SRY(Y染色体性決定遺伝子)ボックス
Stat3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3):シグナル伝達兼転写活性化因子3
VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor):血管内皮増殖因子
本発明は、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含む。
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(ii)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程。
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(ii)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルが、上記特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較して、同等であるか、または低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
を含む、方法に関する。
(a)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(b)測定された上記原始内胚葉細胞が発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞への高い分化能を有することが既知である多能性幹細胞における上記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
(c)前記遺伝子の発現レベルが同等、もしくは低いものを、優良であると判断する工程
を含む、方法に関する。
本発明は、分化細胞の製造方法に関し、以下の工程を含む。
上記特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
上記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程。
心筋細胞への分化誘導
異なるドナー由来を含む末梢血単核球細胞から特許5984217号に記載の方法に準じてiPS細胞クローンA~Nを作成した。iPS細胞の培養にはmTeSR(登録商標)1(Stem Cell Technologies社)、およびMatrigel(登録商標)(Corning社)を使用し、0.5mmol/L EDTA溶液(Invitrogen社)によって7分間処理することで細胞を回収し継代した。上記の条件でT225フラスコ2枚分までiPS細胞を拡大培養した。これにより得られるiPS細胞は、プライム型である。
iPS細胞由来心筋細胞塊のフローサイトメーターによる解析
撹拌培養開始後14日の細胞塊をTrypLE(登録商標) Selectで単一細胞まで分離し、Live/Dead(登録商標) Fixable Green Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher社)を用いて死細胞を染色した。D-PBS(Thermo Fisher社)にて洗浄後、終濃度4% ホルムアルデヒド(Sigma Aldrich社)で処理して細胞を固定した。得られた固定細胞0.5×106cellsに対して、終濃度0.1% Saponin(Merck Millipore社)、2% ウシ胎児血清を含むD-PBS中に、抗-cTnT抗体(Abcam社 ab8295)を1/250に希釈して添加し、室温で1時間処置した。同時にIsotypeコントロールとしてIgG1 isotype Cotrol Murine Myeloma(Sigma Aldrich社 M5284)を1/25に希釈して添加したサンプルを並列させた。続いてAlexa Fluor(登録商標)647標識Goat anti-mouse IgG1抗体(Thermo Fisher社 A21240)を1/500に希釈して添加し、室温で30分間処置した。得られた標識細胞をフローサイトメーター(Thermo Fisher社 Attune Nxt)を用いて解析した。前方光散乱、側方光散乱、および生細胞をゲーティングしたのち、Isotypeサンプルとの比較からcTnT陽性細胞率を算出した。クローンAで得られたフローサイトメーター、およびゲーティング例を図1に示す。心筋細胞誘導後の各クローンのcTnT陽性細胞率、および分化誘導後の総細胞数とcTnT陽性細胞率とから算出した総心筋細胞数(cTnT陽性細胞数)、および分化誘導開始時の多能性幹細胞数を基準とした心筋細胞の生産率(%)(分化誘導後の総心筋細胞数÷分化誘導開始時の多能性幹細胞数)×100)を表3に示す。
iPS細胞の遺伝子発現解析
iPS細胞の遺伝子発現と心筋細胞生産率の相関解析
また心筋細胞高産生クローン群と低産生クローン群との間で発現量差絶対値が2倍以上、発現有意差(P-value)が0.01未満の遺伝子を抽出しリストアップした(リストは非掲載)。得られた遺伝子リストから、低産生クローン群のiPS細胞は原始内胚葉に発現するとされる遺伝子群、例えばNODAL、CER1、CXCR4等の発現が有意に高い傾向にあることがわかった。また、原始内胚葉に発現するとされる遺伝子群のうちLEFTY1およびLEFTY2の発現量を確認したところ、低産生クローン群のiPS細胞での発現量が、高産生クローン群のiPS細胞での発現量よりも高い傾向にあることもわかった。NODAL、CER1、CXCR4、LEFTY1およびLEFTY2のFold Change(Low Avg/High Avg)及びP-valueを表4に示す。
以上から、心筋細胞の生産性が相対的に低いiPS細胞クローンは共通して原始内胚葉遺伝子(原始内胚葉が発現する遺伝子)系列の発現量が高い傾向にあることが示された。
外胚葉細胞への分化誘導
iPS細胞クローン14株のうち、クローンB、H、I、Nを選択し、実施例1と同様の方法で拡大培養した。コンフルエンシーが80%程度になるまでiPS細胞を増殖させたのち、TrypLE(登録商標) Selectにて細胞を単細胞剥離して回収し、終濃度10μmol/L Y-27632(富士フイルム和光純薬社)を含むSTEMdiff(登録商標) Trilineage Ectoderm Medium(Stem Cell Technologies社)に1×106cells/mLとなるように調整し、Matrigel(登録商標)をコートした6well plateに播種した。翌日以降、STEMdiff(登録商標) Trilineage Ectoderm Mediumに毎日交換し、播種後7日間培養した。
iPS細胞の遺伝子発現と外胚葉細胞分化率の相関解析
実施例5に記載の方法に従って播種後7日間、細胞を培養した後、RNeasy Plus Mini Kitを用いてRNAを回収した。実施例4と同様の方法でcDNAに逆転写し、外胚葉マーカー遺伝子であるPAX6の遺伝子発現量をTaqMan(登録商標) Gene Expression Assay(ID:Hs01088114_m1)を用いて解析した。また、各iPSクローンの拡大培養後(播種0日)のRNAも同様に回収し、原始内胚葉遺伝子であるNODALの発現量を測定した(ID:Hs00415443_m1)。発現量はクローンBを基準として、ΔΔCT法により定量した。結果を表7、および図9、10に示す。原始内胚葉遺伝子の発現が高いiPSクローン(クローンH、N)はいずれも外胚葉誘導後のPAX6発現量が相対的に低い、すなわち外胚葉分化効率が低いことが示された。
Claims (10)
- 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を製造する方法であって、
前記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞であり、
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(ii)測定された前記原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルが、前記特定細胞の生産率が50%以上である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、低い多能性幹細胞を選択して、特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取得する工程
を含む、方法。 - 前記原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子が、CER1、LEFTY1、LEFTY2、NODALおよびCXCR4からなる群から選択される少なくとも一種類の遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記特定細胞が心筋細胞または神経細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト由来細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルとしての多能性幹細胞が、多能性幹細胞をクローン培養して増殖させることにより得られたものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルの測定が、プライム型多能性幹細胞について行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルとしての多能性幹細胞が、プライム型多能性幹細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の方法により特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を得る工程、および
前記工程で得られた特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を分化誘導する工程を含む、分化細胞の製造方法。 - 多能性幹細胞の品質評価のための方法であって、
(a)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(b)測定された前記原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルを、特定細胞の生産率が50%以上である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
(c)前記遺伝子の発現レベルが低いものを、優良であると判断する工程
を含み、前記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞である、方法。 - 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程:
(i)サンプルとしての多能性幹細胞において、原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(ii)測定された前記原始内胚葉細胞が特異的に発現する遺伝子の発現レベルが、前記特定細胞の生産率が50%以上である多能性幹細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して低い多能性幹細胞を選択する工程、
を含み、前記特定細胞が中胚葉または外胚葉に由来する分化細胞である、方法。
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