KR20230121683A - 3차원 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 화학적 조성이 명확한 2차원 배양법 - Google Patents

3차원 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 화학적 조성이 명확한 2차원 배양법 Download PDF

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손미영
권오만
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 화학적 조성이 명확한 배지에서 장 줄기세포 집합체를 2차원 배양하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이며, 상기 장 줄기세포 집합체를 2.5차원 장 상피세포로 분화시키는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

3차원 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 화학적 조성이 명확한 2차원 배양법 {Chemically defined culture system for intestinal stem cells derived from 3D intestinal organoids}
본 발명은 화학적 조성이 명확한 배지에서 장 줄기세포 집합체를 2차원 배양하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이며, 또한 상기 장 줄기세포 집합체를 2.5차원 장 상피세포로 분화시키는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
장관 오가노이드는 인간 장의 발달과정 및 질환 모델링이 가능한 세포 모델 시스템으로써 장의 생리학/병리학적 기능 연구 및 장 질환 치료를 위한 치료제 개발, 신약 후보물질의 효능 및 독성 평가 등 다양한 분야에 활용이 가능한 우수한 세포 모델로서 각광받고 있다.
뿐만 아니라 장 질환으로 손상되거나 제대로 발달하지 못한 장에 오가노이드를 이식해 환부를 재생시킬 수 있는 재생 치료제로 각광받고 있다. 장관 오가노이드는 재생의 핵심성분인 장 줄기세포를 포함하여 다양한 세포로 구성되어 있으며, 환부에 생착하여 손상된 조직을 효율적으로 재생하는 것으로 확인되어 치료제로 개발 가능성이 계속 커지는 추세이다.
최근 장 조직이 손상된 모델에 사람의 장관 오가노이드를 이식하여 손상된 장 조직이 재생되는 현상을 여러 그룹에서 반복적으로 확인한 바가 있으며, 이식된 장관 오가노이드는 실제 장 조직의 구조와 기능을 높은 수준으로 재생할 수 있는 것으로 확인되었다.
하지만, 장관 오가노이드가 다양한 목적을 위한 세포 모델시스템 또는 손상된 장 조직 재생을 위한 세포치료제로 활용되기 위해서는 형태와 기능이 일정한 범위에서 조절가능한 균질한 상태의 장관 오가노이드를 대량 배양할 수 있어야 하고, 장기배양 및 동결보관이 용이한 배양시스템의 개발이 필요하다.
현재 장관 오가노이드는 동물에게 이식된 육종으로부터 생산된 세포외 기질을 분리하여 생산한 마트리젤(Matrigel)을 이용한 3차원 배양법을 통해 배양되고 있다. 그러나, 이러한 배양법은 배치간 장관 오가노이드의 형태와 기능의 차이가 심해 균질성이 낮고, 대량 배양이 어려우며, 장기배양 및 동결보관이 불가능하며, 배양 비용이 높다는 단점들이 있다.
이에 따라, 균질한 상태의 장관 오가노이드를 장기배양 및 동결보관할 수 있으며, 대량 배양을 통해 안정적인 세포공급이 가능하여 배치간 차이가 거의 없는 세포 모델시스템 또는 세포치료제로 개발이 가능한 새로운 장관 오가노이드 배양 방법의 개발이 필요한 상황이다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 인간 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포만 분리 후 화학적 조성이 명확한 배양 배지에서 배양하여 쉽고 빠른 세포배양이 가능하고 장기간 안정적인 계대 배양을 통한 대량 배양과 동결보관 및 해동이 가능한 세포의 배양 방법을 개발하였다. 이를 통해, 균질한 상태의 장 줄기세포 및 다양한 활용 용도를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드로부터 분리한 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 화학적 조성이 명확한 배양 배지에서 2차원 배양하는 장 줄기세포 집합체의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 장 줄기세포 집합체를 화학적 조성이 명확한 분화 배지에서 기체-액체 계면배양법으로 배양하는 장 상피세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급된 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포의 용도를 제공하는 것이다.
하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 한다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위 또는 바람직한 상한 값 및 바람직한 하한 값의 열거로 주어지는 경우, 범위가 별도로 개시되는지에 상관없이 임의의 한 쌍의 임의의 위쪽 범위 한계치 또는 바람직한 값 및 임의의 아래쪽 범위 한계치 또는 바람직한 값으로 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
수치 값의 범위가 본 명세서에서 언급될 경우, 달리 기술되지 않는다면, 그 범위는 그 종점 및 그 범위 내의 본 발명의 범주는 범위를 정의할 때 언급되는 특정 값으로 한정되지 않는 것으로 의도된다.
전분화능 줄기세포
본원에서 사용되는 용어 "줄기세포"는 미분화 상태의 세포로 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력을 가지고 있으며, 조직 또는 장기를 구성하는 다양한 타입의 특정 세포로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "전분화능 줄기세포(PSC: pluripotent stem cell)"는, 또한 통상 PS 세포로도 알려져 있는데, 거의 모든 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포, 즉, 내배엽(내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽(상피 조직 및 신경계)을 포함한 3개의 배엽(생식 상피) 중 어느 것으로부터 유래된 세포를 포함한다. PSC는 배아 줄기세포(배아 생식세포 포함)로부터 유래되거나, 특정 유전자의 발현을 강제함으로써 비-만능 세포, 예컨대 성체 체세포를 유도하여 얻은 전능성 세포의 후손일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)"는, 또한 통상 iPS 세포로도 약칭되는데, 특정 유전자의 "강제된" 발현을 유도함으로써 정상적으로 비만능성 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 인공적으로 유도된 만능성 줄기세포의 타입을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "배아 줄기세포(ESC: embryonic stem cell)"는 또한 통상 ES 세포로도 약칭되는데, 만능성이며 초기-단계 배아인 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "ESC"는 또한 때때로 넓게 사용되어, 배아 생식 세포도 포함한다.
기본 배지
본 발명의 방법에 사용되는 배지는 본 명세서에 제공된 제한이 가해진, 동물 또는 인간 세포에 적합한 임의의 기본 배지이다.
동물 또는 인간 세포 배양을 위한 기본 배지는 전형적으로, 배양된 세포의 유지를 지지하는데 필요한 다수의 성분들을 함유한다. 적합한 성분들의 조합은 하기의 내용을 고려하여 숙련가에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 기본 배지는 일반적으로 문헌 및 상기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 비타민, 지질 보충제, 무기염, 탄소 에너지원, 및 완충제를 포함하는 영양 용액을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 배양 배지는, 예를 들어 아미노산, 비타민, 액체 보충제, 무기염, 탄소 에너지원 및 완충제 중에서 선택된 하나 이상의 표준 세포 배양 성분이 추가로 보충된다.
숙련가는 본 발명의 분화 배지 중에 기본 배지로서 사용될 수도 있는 배양 배지의 유형을 통상적인 일반적인 지식으로부터 이해할 것이다. 잠재적으로 적합한 세포 배양 배지는 상업적으로 입수될 수 있으며, 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 글래스고우 최소 필수 배지(G-MEM), 기본 이글 배지 (BME), DMEM/햄스 F12, 어드밴스드 DMEM/햄스 F12, 아이스코베의 변형된 둘베코의 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Media) 및 최소 필수 배지 (MEM), 햄스 F-10, 햄스 F-12, 배지 199, RPMI 1640 배지, 및 KnockOut Serum replacement XenoFree medium를 포함한다.
보다 구체적으로, RPMI 1640, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), Ham's F12, DMEM/F12, DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 기본 배지는 DMEM/F12, Advanced DMEM/F12 및/또는 RPMI 1640일 수 있다. 필요에 따라, 무혈청 배양에 대해 최적화되고 이미 인슐린을 포함하는 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI가 사용된다.
장 줄기세포 집합체의 배양 방법
본 발명은 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드로부터 분리한 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 화학적 조성이 명확한 배양 배지에서 2차원 배양하는 장 줄기세포 집합체의 배양 방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계; 및
(b) 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하는 단계;를 포함하는 장 줄기세포 집합체의 배양 방법을 제공한다.
본 발명에서 "오가노이드"란, 조직 또는 기관의 표면적 외관 또는 실제 구조 또는 기능을 모방하는 하나 이상의 세포 유형의 3차원 집합체를 지칭한다.
본 발명의 3차원 장관 오가노이드는 전분화능 줄기세포에서 유래한 것으로서,
(a) 전분화능 줄기세포를 Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, CHIR99021, Wnt3a 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 definitive endoderm으로 분화시키는 단계;
(b) definitive endoderm를 BIO (6-브로모인디루'-3'-옥심), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), GSK-3β 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), L803-mts(Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 CHIR99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 GSK3 억제제; 및 섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF)를 포함한 배지에서 배양하여 3차원 Hindgut 스페로이드로 분화시키는 단계; 및
(c) 3차원 Hindgut 스페로이드를 BMP 억제제; WNT/R-스폰딘 활성제; 수용체 타이로신 키나제 리간드; 및 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1β, IL-11, EGF, OSM, NRG-1, IL-10 및 콜리베린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 3차원 장관 오가노이드를 제조하는 단계; 를 거쳐 제조될 수 있다.
전분화능 줄기 세포로부터의 장관 오가노이드의 분화는 1) 전분화능 줄기세포로부터 Definitive endoderm(DE) 세포로의 분화 과정, 2) Definitive endoderm(DE) 세포로부터 Hindgut(HG)의 분화 과정 및 3) Hindgut(HG)으로부터 (성숙) 장관 오가노이드로의 분화 과정을 거친다.
1) 전분화능 줄기세포로부터 완전 내배엽 (Definitive endoderm; DE) 세포로 분화하는 단계
전분화능 줄기 세포에서 Definitive endoderm(DE) 세포로의 분화 과정에 하나 이상의 성장 인자가 사용된다.
구체적으로, Activin A/Nodal signaling activation 또는 Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) signaling inhibition에 영향을 미칠 수 있는 성장인자 등을 사용할 수 있다.
예를 들어, 분화 과정에서 사용되는 하나 이상의 성장 인자에는 TGF-β 수퍼 패밀리에서의 성장 인자가 포함될 수 있다. 하나 이상의 성장 인자는 TGF-베타 수퍼 패밀리에서의 성장 인자 중 Nodal/Activin 및/또는 BMP 서브 그룹을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 상기 하나 이상의 성장 인자는 Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, CHIR99021, Wnt3a, bFGF 또는 임의의 이들 성장 인자의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 측면에서, 전분화능 줄기 세포는 하나 이상의 성장 인자로 6 시간 이상; 12 시간 이상; 18 시간 이상; 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180시간 이상; 또는 240 시간 이상 처리된다. 일부 측면에서, 배아 줄기 세포 또는 iPSC는 10ng/ml 이상; 20ng/ml 이상; 50ng/ml 이상; 75ng/ml 이상; 100ng/ml 또는 그 이상; 120ng/ml 또는 그 이상; 150ng/ml 이상; 200ng/ml 이상; 500ng/ml 이상; 1,000ng/ml 이상; 1,200ng/ml 이상; 1,500ng/ml 이상; 2,000ng/ml 이상; 5,000ng/ml 이상; 7,000ng/ml 이상; 10,000ng/ml 또는 그 이상; 또는 15,000ng/ml 이상의 농도로 상기 하나 이상의 성장 인자로 처리된다. 일부 측면에서, 성장 인자의 농도는 처리 과정 중에 일정한 수준으로 유지된다. 성장 인자의 농도는 처리 과정 동안 변경될 수 있다.
즉, Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, CHIR99021, bFGF 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 전분화능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계; 를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, Activin A, BMP4, CHIR99021, bFGF 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, Activin A를 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계를 포함할 수 있다.
이에 한정되지 않으나, 상기 인자들은 예를 들어, 1 ng/ml 내지 1,000 ng/ml, 바람직하게 10 ng/ml 내지 500 ng/ml로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 전분화능 줄기세포로부터 Definitive endoderm(DE) 세포로 분화는 Activin A를 사용할 수 있다. 이러한 분화에 있어서, 이에 한정되지 않으나 예를 들어, 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 Activin A가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 ng/ml의 Activin A가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이에 한정되지 않으나 6 시간 내지 120 시간, 12 시간 내지 100시간으로 배양될 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 필요에 따라 성장 인자는 다양한 농도를 갖는 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 배지에 현탁된다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 % 와 같이 성장에 적합한 임의의 소 태아 혈청(FBS 또는 FCS)을 포함할 수 있다.
필요에 따라, 세포외 기질과 접촉하여 배양시킬 수 있다. 세포외 기질은 본 명세서 내 기재된 사항을 모두 포함하여, 본 분화 방법에 적용시킬 수 있다.
2) Definitive endoderm(DE) 세포로부터 3차원 Hindgut(HG) 스페로이드로 분화하는 단계
상기 언급된 인자로 유도되는 완전 내배엽 제조 과정을 거친, 바람직하게 Activin, 보다 바람직하게 Activin A에 의해 유도되는 완전 내배엽(DE)은 FGF/Wnt 신호에 의해 Hindgut(HG)으로 분화 단계를 거칠 수 있다.
FGF 및 Wnt 리간드는 iPSC 또는 ESC에서 발달된 DE를 직접 분화를 통해 후장(Hindgut)으로 분화할 수 있다.
후장(Hindgut) 또는 Mid-hindgut으로 분화는 필요에 따라 3차원 배양, 스페로이드 배양 등을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 후장(Hindgut) 또는 Mid-hindgut으로 분화는 micropatterned substrate/plate (예를 들어, Aggrewell, EZSPHERE) 위에서 수행되어 Aggregation(예를 들어, 스페로이드) 형태로 제작되거나 bioreactor 내에서 3차원 배양 (예를 들어, Suspension)을 통해 수행될 수도 있다. Serum-free 분화의 경우, 태아 소 혈청 (FBS 또는 FCS) 대신, B-27이 첨가될 수 있다. 또한, 배양 배지는 이에 제한되지 않으나, 추가적으로 Activin A, FGF, bFGF, BMP-4, LY294002(PI3K inhibitor), CHIR99021(GSK3 inhibitor) 및 Retinoic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 FGF 리간드와 조합하여 임의의 Wnt 신호 전달 단백질의 발현을 변경하면 본원에 기술된 바와 같은 직접 분화를 일으킬 수 있다.
Wnt 신호전달경로의 조절제/활성화제에는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16이 포함된다. 일부 측면에서, 경로의 조절은 전술한 경로를 활성화시키는 소분자 조절제 또는 단백질 조절제 또는 상기 경로를 활성화시키는 단백질의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Wnt 경로의 소형 분자 조절제에는, 비제한적으로, 염화 리튬; 2-아미노-4,6-이중 치환된 피리미딘(헤테로) 아릴피리미딘; IQ1; QS11; NSC668036; DCA 베타 카테닌; 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)-벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘이 포함된다. Wnt 신호 전달의 예시적인 천연 억제제에는, 비제한적으로, Dkk1, SFRP 단백질 및 FrzB이 포함된다. 일부 측면에서, 외인성 분자에는, 비제한적으로, WAY-316606과 같은 소형 분자; SB-216763; 또는 BIO(6-브로모 인디루빈-3'-옥심)이 포함된다.
또한, Wnt 신호전달경로를 활성화시키는, GSK3를 억제하는 분자 또는 단백질이 포함된다. 예시적인 GSK3 억제제에는, 비제한적으로, LY2090314, BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), GSK-3β 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), L803-mts(Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 CHIR99021을 들 수 있다.
구체적으로, GSK3를 억제하는 Chiron/CHIR99021이 포함된다. GSK3 억제제는 약 0.1uM 내지 약 100uM, 또는 약 0.2uM 내지 약 50uM, 또는 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 처리될 수 있다.
섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF)는 혈관 신생, 상처 치유 및 배아 발육과 관련된 성장인자군이다. 일부 측면에서, 임의의 FGF가 Wnt 신호 경로에서 유래된 단백질과 함께 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
일부 구현예에서, FGF 신호전달경로는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 및 FGF23로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분자와 세포를 접촉시킴으로써 활성화된다.
즉, definitive endoderm를 BIO (6-브로모인디루'-3'-옥심), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), GSK-3β 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), L803-mts(Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 CHIR99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 GSK3 억제제; 및 섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF)를 포함한 배지에서 배양하여 3차원 Hindgut 스페로이드로 분화시키는 단계를 거칠 수 있다.
일부 측면에서, DE 세포는 본원에 기재된 신호전달경로의 하나 이상의 조절제로 6 시간 이상; 12 시간 이상; 18 시간 이상; 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180 시간 이상; 200 시간 이상, 240 시간 이상; 270 시간 이상; 300 시간 이상; 350 시간 이상; 400 시간 이상; 500 시간 이상; 600 시간 이상; 700 시간 이상; 800 시간 이상; 900 시간 이상; 1,000 시간 이상; 1,200 시간 이상; 또는 1,500 시간 이상 동안 처리된다.
일부 측면에서, DE 세포는 10ng/ml 이상; 20ng/ml 이상; 50ng/ml 이상; 75ng/ml 이상; 100ng/ml 또는 그 이상; 120ng/ml 또는 그 이상; 150ng/ml 이상; 200ng/ml 이상; 500ng/ml 이상; 1,000ng/ml 이상; 1,200ng/ml 이상; 1,500ng/ml 이상; 2,000ng/ml 이상; 5,000ng/ml 이상; 7,000ng/ml 이상; 10,000ng/ml 또는 그 이상; 또는 15,000ng/ml 이상의 농도로 본원에 기재된 FGF 신호전달경로의 하나 이상의 분자로 처리된다.
일부 측면에서, 신호 전달 분자의 농도는 처리 과정 중에 일정하게 유지된다. 다른 측면에서, 신호전달경로의 분자의 농도는 처리 과정 동안 변화된다.
일부 측면에서, 본 발명에 따른 신호 전달 분자는 DMEM 배지에 현탁된다.
일부 측면에서, 본 발명에 따른 신호 전달 분자는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS 또는 FCS)을 포함하는 배지에 현탁된다.
Wnt 및 FGF 신호전달경로의 임의의 분자를 포함하는, 본원에 기재된 신호 경로의 임의의 공지된 분자에, 단독으로 또는 조합하여 적용 가능하다.
즉, FGF 및 Wnt 리간드를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계; 를 포함한다. 보다 구체적으로, FGF 및 CHIR99021를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, Definitive endoderm(DE)로부터 후장으로 분화는 GSK3 억제제 및 섬유 아세포 성장 인자를 통해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CHIR99021 및 FGF4를 처리하여 3차원 배양을 통해 후장으로 분화를 진행할 수 있다.
이러한 분화에 있어서, 이에 한정되지 않으나 예를 들어, 100ng/ml, 120ng/ml, 150ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml, 1,000ng/ml; 1,200ng/ml의 FGF4가 사용될 수 있다. 구체적으로, 100ng/ml 내지 1,200ng/ml, 보다 구체적으로 120 내지 1,000ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.
또한, CHIR99021가 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 사용될 수 있다. 필요에 따라, 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 배지에 현탁된다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 % 와 같이 성장에 적합한 임의의 소 태아 혈청(FBS 또는 FCS)을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 이에 한정되지 않으나 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180 시간 이상으로 배양될 수 있다. 바람직하게 24 시간 내지 360 시간, 보다 바람직하게 36 시간 내지 240 시간 배양될 수 있다.
필요에 따라, BMP 신호 조절을 위해 BMP 활성제를 추가하여 배양시킬 수 있다. 상기 BMP 활성제는 BMP2, BMP4 또는 이들 모두, BMP 경로를 활성화시키는 소분자, 및/또는 BMP 경로를 활성화시키는 단백질 중 하나일 수 있다.
필요에 따라, 세포외 기질과 접촉하여 배양시킬 수 있다. 세포외 기질은 본 명세서 내 기재된 사항을 모두 포함하여, 본 분화 방법에 적용시킬 수 있다.
3) 3차원 Hindgut(HG) 스페로이드로부터 3차원 장관 오가노이드로 분화하는 단계
본 발명의 3차원 장관 오가노이드는 성숙화된 장관 오가노이드로서, 성체의 소장이 갖추고 있는 소화기능, 수송시스템, 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자가 발현된 장관 오가노이드를 의미한다. 구체적으로, 성체의 소장은 소장 줄기세포 마커 유전자, 소화기능, 수송시스템, 광범위한 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자의 발현증진을 포함한 독특한 특징을 가지고 있다. 특히, 생리학적 및 약동학적 역할에 관여하는 수송체의 적절한 발현 및 활성은 약물의 흡수, 분배 및 배설과 같은 정상적인 소장 기능의 전제 조건이다.
특히, 본 발명에 따른 3차원 장관 오가노이드는 생착 측면에서 개선된 효능을 가진다. 보다 구체적으로, 상기 오가노이드를 구성하는 장 상피 세포층 주변에 존재하는 기질 세포층이 가지고 있는 혈관 내피 관련 인자의 발현이 높은 특성과 기질 세포의 특성인 다양한 분비 인자에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 오가노이드는 장관 오가노이드 상에 존재하는 budding structure가 발달한 특징을 나타낼 수 있다. 또한, Goblet cell의 더 높은 발달을 나타내어 장 줄기세포의 분화능 측면에서 높은 효율을 나타낸다.
3차원 Hindgut(HG) 스페로이드로부터 3차원 장관 오가노이드로의 분화에 있어서는 BMP 억제제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 수용체 타이로신 키나제 리간드가 필수적으로 포함된다.
이에 추가적으로, ROCK 억제제, B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC), N2, 니코틴아미드 및, 가스트린, IGF-1, heregulin-1β, bFGF, A-83-01 및/또는, SB202190 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
BMP 억제제는 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제이다. 상기 억제제는 BMP 수용체에 결합하고 BMP 리간드의 수용체에의 결합을 방지하는 작용제, 예를 들어 상기 수용체에 결합하는 항체일 수 있다. BMP 억제제는 단백질 또는 소분자일 수 있으며 천연, 변형 및/또는 부분적으로 또는 전적으로 합성일 수 있다. BMP 억제제는 노긴(Noggin), DAN, 또는 써베루스 및 그렘린(R&D systems)을 포함하는 DAN-유사 단백질일 수 있다. 바람직한 BMP 억제제는 노긴이다. 노긴을 임의의 적합한 농도로 사용할 수 있다. 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 약 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖ 이상의 노긴을 포함할 수 있다. 바람직하게 대략 10 내지 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다.
WNT/R-스폰딘 활성제는 바람직하게 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4일 수 있다. 상기 배양 배지에 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 700 ng/㎖, 800 ng/㎖, 900 ng/㎖, 1 ug/㎖, 1.5 ug/㎖ 또는 2 ug/㎖ 이상의 농도로 포함될 수 있다. 바람직하게 대략 50 내지 800 ng/㎖의 R-스폰딘 1을 포함할 수 있다.
수용체 타이로신 키나제 리간드는 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 성장 인자 중에서 선택된 분열촉진성 성장 인자이다.
바람직하게 EGF이다. EGF는 다양한 배양된 외배엽 및 중배엽 세포에 대한 효능 있는 분열촉진인자이며 생체 내 및 시험관 내에서 특정한 세포 및 세포 배양물 중의 일부 섬유아세포의 분화에 충분한 효과를 갖는다. 바람직한 농도는 10, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 700 ng/㎖ 이상이다. 보다 바람직한 농도는 50 ng/㎖ 이상 300 ng/㎖ 이하이다.
위와 같은 BMP 억제제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 수용체 타이로신 키나제 리간드의 필수적 조성 이외에 추가되는 인자들은 장관 오가노이드의 알려진 임의의 인자의 추가를 더 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
바람직하게 분화를 목적하는 형태에 따라, ROCK 억제제, B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC), N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1β, bFGF, A-83-01 및 SB202190 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
ROCK 억제제는 바람직하게는 R-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632), 5-(1,4-다이아제판-1-일설포닐)아이소퀴놀린(파수딜 또는 HA1077), 및 (S)-(+)-2-메틸 1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀다이하이드로클로라이드(H-1 152) 중에서 선택된다.
N-Acetyl-L-cysteine(NAC), N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1β, bFGF, A-83-01 및/또는 SB202190은 예를 들어, 오가노이드의 배양 효율 및 수명을 개선시키고 세포의 증식을 조절하며 DNA의 안정성 등을 돕기 위해 필요에 따라 추가될 수도 있다.
바람직하게, B27이 추가로 더 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, B27 보충제는 'B27 보충제 마이너스 비타민 A'(또한 본 명세서에서 "비타민 A가 없는 B27" 또는 "B27 wo VitA"로서 지칭되며; 인비트로젠(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 12587010으로부터; 및 PAA 레보라토리즈(PAA Laboratories) GmbH(오스트리아 파싱 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; 문헌[Brewer et al. (1993) J Neurosci Res.35(5):567-76]]으로부터 입수할 수 있다)이다.
일부 실시양태에서, 상기 B27 보충제는 하기 목록 중에서 선택된 성분들 중 하나 이상을 포함하는 제네릭 제형으로 대체될 수 있다: 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린.
필요에 따라, 3차원 Hindgut(HG) 스페로이드로부터 3차원 장관 오가노이드로의 분화시에 세포외 기질과 접촉하여 배양시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 세포외 기질은 3차원 기질이다. 일부 실시양태에서, 상기 후장은 세포외 기질 중에 포매된다. 본 발명의 배양 배지는 3차원 세포외 기질 내로 확산될 수 있다.
Polymer Hydrogels to Guide Organotypic and Organoid Cultures (Adv Funct Mater, 2020, Valentina Magno et al.) 및 Engineering the Extracellular Matrix for Organoid Culture (Int J Stem Cells. 2022 Feb 28;15(1):60-69)에 개시된 세포외 기질에 관한 사항은 본 발명의 참조로 포함된다.
세포외 기질은 이에 한정되지 않으나, 예를 들어 피브린, 라미닌, 콜라겐 및/또는 알지네이트를 포함한다. 세포외 기질-생성 세포의 예는 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생성시키는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 생성시키는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III, 및 V형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생성시키는 결장 근섬유아세포이다. 이들은 "자연적으로 생성된 세포외 기질"이다. 자연적으로 생성된 세포외 기질은 상업적으로 제공될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(인비트로젠) 및 엔젤브레쓰-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 컬트렉스(Cultrex)(등록상표) 기저막 추출물(트레비젠 인코포레이티드(Trevigen, Inc.), I형 콜라겐(인비트로젠), 비트로젤(Vitrogel)(등록상표)(TheWell Bioscience Inc.), Geltrex(ThermoFisher) 또는 마트리젤(Matrigel)(상표)(BD 바이오사이언시즈))를 포함한다.
3차원 Hindgut(HG) 스페로이드로부터 3차원 장관 오가노이드로의 분화는, 상기 오가노이드로의 분화 인자로 언급된 사항 이외에 in vivo 장내 환경을 모방하기 위해 공배양에 사용되거나, T-림프구 공배양에서 분비되는 사이토카인 처리(즉, T-림프구 분비되는 사이토카인 처리) 및/또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제 처리를 필수적으로 포함한다.
보다 구체적으로, T-림프구에 의해 분비되는 사이토카인은 IL-2(interleukin-2), IL-22(interleukin-22), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β), IL-11(interleukin-11), EGF(epidermal growth factor), OSM(oncostatin M) 및 IL-10(interleukin-10)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 IL-2일 수 있다.
또한, 상기 오가노이드로의 분화 인자로 언급된 사항 이외에 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제를 처리하여 장관 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 콜리베린(colivelin)을 처리하여 장관 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다.
또한, NRG-1(Neuregulin-1)를 처리하여 장관 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다.
즉, 3차원 Hindgut 스페로이드를 BMP 억제제; WNT/R-스폰딘 활성제; 수용체 타이로신 키나제 리간드; 및 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1β, IL-11, EGF, OSM, NRG-1, IL-10 및 콜리베린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 3차원 장관 오가노이드를 제조하는 단계; 를 거쳐 제조될 수 있다.
즉, Hindgut에 바로 장 성숙화를 위한 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1β, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 콜리베린(colivelin)이 배지 구성요소를 처리함으로써 오가노이드의 성숙 정도를 크게 증진시킨다.
즉, IL-2, IL-22, IL-6, IL-1β, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 콜리베린(colivelin)이 배지 구성요소로 포함된 것일 수 있다. 바람직한 농도는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0 ng/ml 이상이다. 보다 바람직하게, 0.3 내지 2.0 ng/ml일 수 있다.
전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계
본 발명에서 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계는 EDTA, 트립신 또는 이들 모두를 처리함으로써 장관 오가노이드를 분리하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 3차원 장관 오가노이드에 잔류되어 있는 세포외 기질을 최대한 제거한 상태에서 EDTA, 트립신 또는 이들 모두를 처리하여 분리된 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리를 순수하게 하는 것이 바람직하다.
이러한 과정에서 필요에 따라 파이펫팅 등을 통해 3차원 장관 오가노이드를 세밀하게 분리할 수 있으며, 보다 바람직하게 단일 세포로 가깝게 분리한다.
이렇게 분리된 세포 단일세포 또는 작은 세포 덩어리는 필요에 따라 기본 배지 하에서 잠시 배양되거나 워싱되고 본 발명에 따른 장 줄기세포 배양 배지하에 배양될 수 있다.
WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하는 단계
본 발명에 사용되는 장 줄기세포 집합체 제조를 위한 배양 배지는 장 줄기세포 집합체를 2차원 배양하기 위해 제공되는 것으로서, WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 필수적으로 포함한다.
상기 WNT/R-스폰딘 활성제는 WNT 신호 전달 체계의 활성화를 통해 2차원 장 줄기세포의 줄기세포능(stemness)과 분열능(proliferation)을 조절하는 역할을 하며, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 및 R-스폰딘 모방물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 R-스폰딘 1일 수 있다.
상기 배양 배지에 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 700 ng/㎖, 800 ng/㎖, 900 ng/㎖, 1 ug/㎖, 1.5 ug/㎖ 또는 2 ug/㎖ 이상의 농도로 포함될 수 있다. 바람직하게 대략 50 내지 800 ng/㎖의 R-스폰딘 1을 포함할 수 있다.
상기 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제는 프로스타글란딘 신호전달 체계의 활성화를 통하여 장 줄기세포 집합체의 분열능(proliferation)을 조절하는 역할을 하며, 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2) 및 프로스타글란딘 D2(PGD2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 프로스타글란딘 E2(PGE2)일 수 있다.
프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제로 바람직하게 프로스타글란딘 E2는 약 0.1uM 내지 약 100uM, 또는 약 0.2uM 내지 약 50uM, 또는 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 처리될 수 있다.
상기 수용체 타이로신 키나제 리간드는 장 줄기세포 집합체의 세포 사멸을 막고, 분열능(proliferation)을 조절하는 역할을 하며, 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상피 성장 인자(EGF)일 수 있다.
수용체 타이로신 키나제 리간드는 예를 들어 10ng/ml 이상; 20ng/ml 이상; 50ng/ml 이상; 75ng/ml 이상; 100ng/ml 또는 그 이상; 120ng/ml 또는 그 이상; 150ng/ml 이상; 200ng/ml 이상; 500ng/ml 이상; 1,000ng/ml 이상; 1,200ng/ml 이상; 1,500ng/ml 이상; 2,000ng/ml 이상; 5,000ng/ml 이상; 7,000ng/ml 이상; 10,000ng/ml 또는 그 이상; 또는 15,000ng/ml 이상의 농도로 처리될 수 있다.
위 언급된 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드의 조합은 바람직하게 R-스폰딘 1, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 상피 성장 인자(EGF)이다.
이러한 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드의 조합은 줄기세포능 유지 및 세포 성장과 분열의 측면에서 필수적이며, 줄기세포 농축 배양 및 장기 배양의 효능을 가진다.
이에 한정되는 것은 아니나, WNT/R-spondin 활성제를 통해 줄기세포능(stemness) 및/또는 세포분열(proliferation)에 개선된 효과를 나타낼 수 있으며, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제를 통해 줄기세포능 (stemness) 및/또는 세포성장(Growth)에 개선된 효능을 나타낼 수 있으며, 수용체 타이로신 키나제 리간드를 통해 세포 생존(survival) 및/또는 세포 분열(proliferation)에 개선된 효능을 나타낼 수 있다.
상술한 필수적 조성 이외에도, 본 발명의 배양 배지는 안정적인 장기 계대 배양을 위해 B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC), 니코틴아미드, Gastrin, TGF-베타 억제제, Wnt 신호전달경로 활성화제, BMP 억제제 및 p38 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC) 및 니코틴아미드는 기본 배지의 성분으로서 추가될 수 있으며, 특히 B27은 하기 목록 중에서 선택된 성분들 중 하나 이상을 포함하는 제네릭 제형으로 대체될 수 있다: 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린.
상기 TGF-베타 억제제는 A-83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 및 SJN-251로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 A-83-01일 수 있다.
상기 Wnt 신호전달경로 활성화제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 Wnt3a일 수 있다.
상기 BMP 억제제는 노긴(Noggin), Dorsomorphin, DMH1, 또는 LDN-193189일 수 있으며, 바람직하게는 노긴(Noggin)일 수 있다.
상기 p38 저해제는 SB202190, SB203580, SB239063, SB706504, BIR796, JX401, EO1428, RWJ67657, SCIO469, VX745, TAK715, ML3403, DBM1285 및 PH797804로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 SB202190일 수 있다.
이들 각각의 추가 성분들은 배양 배지에 통상적으로 사용되는 일반적 범주 내에서 농도 조절이 적절히 수행될 수 있다.
또한, 계대 배양시 세포의 손실을 막기 위해, 배양 초기, 예를 들어 배양을 시작한 직후, 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일 동안 ROCK 억제제, Notch 활성제 또는 이들 모두를 배양 배지에 추가로 포함시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하는 단계의 초기에 ROCK 억제제, Notch 활성제 또는 이들 모두를 배양 배지에 추가로 포함시킬 수 있다. 이는 배양을 시작한 직후, 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일일 수 있다.
상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho(Rho A, Rho B 및 Rho C)에 대한 표적 단백질로서 작용을 하는 세린/트레오닌 키나제의 활성을 억제하는 역할을 하며, R-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632), 5-(1,4-다이아제판-1-일설포닐)아이소퀴놀린(파수딜 또는 HA1077), 및 (S)-(+)-2-메틸 1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀다이하이드로클로라이드(H-1 152)일 수 있다. 보다 바람직하게는 R-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632)일 수 있다.
이러한 Y-27632는 예를 들어 약 0.1uM 내지 약 100uM, 또는 약 0.1uM 내지 약 50uM의 양으로 처리될 수 있다.
상기 Notch 활성제는 Notch 경로 기능을 활성화하는 단백질 또는 소분자 화합물을 의미하며, 바람직하게는 Jagged-1 (JAG 1)일 수 있다.
이러한 Jagged-1 (JAG 1)는 예를 들어 약 0.1uM 내지 약 100uM, 또는 약 0.2uM 내지 약 50uM, 또는 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 장 줄기세포 집합체의 배양은 필요에 따라 feeder-세포 위 또는 세포외 기질이 코팅된 접시 위에서 이루어질 수 있다. 상기 세포외 기질은 앞서 언급된 바와 같다.
본 발명에 따른 장 줄기세포 집합체의 배양은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일, 2주, 3주 또는 그 이상으로 진행될 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 필요에 따라 계대 배양을 수행할 수 있다.
본 발명에서 "장 줄기세포"는 장 상피조직으로부터 유래된 미분화세포로 자기복제능력을 가지고 있으며, 장 상피에 존재하는 다양한 타입의 특정 세포로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 의미한다. 상기 장 줄기세포는, 예를 들어, 장 줄기세포, 장 전구체 세포, 장 상피세포, 장 배상세포, 장 내분비세포, 파네스 세포 등으로의 분화가 가능하다.
본 발명에서 "장 줄기세포 집합체"란, 장 줄기세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 세포 클러스터 (cell cluster)일 수도 있으며, 단일세포 상태일 수도 있다.
본 발명의 장 줄기세포 집합체는 LGR5, CD44, SOX9, LRIG1, LYZ, AXIN2, CTNNB 및 MKI67으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커에 대하여 증진된 발현 수준을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, LDHB, EIF3E, SOX9 및 SHH로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커가 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 장 줄기세포 집합체는, WNT/R-스폰딘 활성제가 포함되지 않은 배양 배지에서 배양한 대조군과 비교하여 LGR5, CD44, SOX9, LRIG1, LYZ, AXIN2, CTNNB 또는 MKI67에 대하여 증진된 발현 수준이 나타날 수 있다. 상기 LGR5, CD44, SOX9, LRIG1, LYZ, AXIN2, CTNNB 또는 MKI67는 장 줄기세포 마커로서, 증진된 발현 수준이 나타날수록 줄기세포능(stemness) 및 자가증식(self-renewal) 유지 기능이 뛰어남을 의미한다.
또는, 상기 장 줄기세포는 Single cell RNA 시퀀싱으로 유전자 발현 패턴을 분석하여 장 줄기세포 및 전구체 세포의 특이적 마커인 LDHB, EIF3E, SOX9 또는 SHH가 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 장 줄기세포 집합체는 해당 집합체를 이루고 있는 세포의 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 88, 89, 또는 90% 이상이 장 줄기세포 또는 전구체(progenitor) 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 장 줄기세포 집합체는 집합체 총 세포에 대하여 S phase 세포, LGR5+ 줄기세포 및 초기 Enterocyte를 포함한 세포가 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 88, 89, 또는 90% 이상일 수 있다.
상기 S phase 세포는 세포 주기(cell cycle)에 따라 분열을 진행하는 세포들 중에서도 DNA가 복제되는 단계인 S phase에 놓여있는 세포를 지칭한다.
상기 LGR5+ 줄기세포는 성체 줄기세포의 활성도를 나타내는 지표인 LGR5를 발현하는 줄기세포를 지칭하며, 상기 LGR5는 Wnt 신호의 표적 유전자이자 Wnt 신호를 증폭시키는 R-스폰딘의 수용체로 작동하는 인자를 의미한다.
상기 초기 Enterocyte는 소장과 대장을 둘러싸고 있는 상피세포의 전구체 세포로서, 초기 Enterocyte 1 및 초기 Enterocyte 2를 포함한다.
또한, 필요에 따라 동결 조건 하에서 세포를 동결하거나 해동하여 사용할 수 있다. 이러한 장기의 계대 배양 조건 및/또는 동결과 해동 조건 하에서도 세포의 특성이 유지되며 배양이 진행될 수 있다.
이에 본 발명은 (a) 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계; 및
(b) 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하여 장 줄기세포 집합체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조된 장 줄기세포 집합체를 동결하는 단계를 포함하는 장 줄기세포 집합체의 동결 보존 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계를 통해 제조된 장 줄기세포 집합체는 필요에 따라 세포를 원심분리하고 미리 결정된 농도(세포/mL)로 재현탁될 수 있다.
동결 배지는, 예를 들어, 디메틸 술폭시드(DMSO); 글루코스; 1,2-프로판 디올; 에틸렌 글리콜; 글리세롤; 포라마미드 (foramamide); 에탄디올 또는 부탄-2,3 디올; 하이드록시에틸 전분(HES), 덱스트란(Dextran), 자당, 트레할로스, 유당, 라피노스, 리보톨(Ribotol), 매니톨(Mannitol) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
바람직하게 세포는 상업적으로 판매되거나 세포의 동결 해동에 적합한 동결 배지에서 현탁된다. 이러한 동결 배지는 Recovery™ Cell Culture Freezing Medium(Gibco) 배지일 수 있다.
경우에 따라, 동결을 위한 세포 현탁 배지는 CHB 배지, CS10 배지 또는 CS5 배지 중에서 선택된다. CHB 배지는 50%(v/v) 태아 소 혈청(FBS), 40%(v/v) RPMI 세포 배양 배지 및 10%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 세포 현탁 배지이다. CS10 배지(BioLife Solutions, Inc., 워싱턴주 보셀)는 10%(v/v) DMSO를 포함하는 세포 배양 배지이며 본질적으로 동물 성분 또는 혈청이 없다. CS5(BioLife Solutions, Inc.) 배지는 5%(v/v) DMSO를 포함하는 세포 배양 배지이며 본질적으로 동물 성분 또는 혈청이 없다.이러한 세포는 세포를 바이알에 넣고 극저온 동결시킬 수 있다. 조성물을 동결시키기에 충분한 온도는 약 -80℃ 내지 약 -190℃이다.
이러한 동결 보존된 세포들은 필요에 따라 통상의 알려진 해동 방법을 통해 해동되고 장 줄기세포 집합체로 활용 가능하다. 또한, 필요에 따라 계대 배양 등을 통해 세포 수를 증가시킬 수도 있다.
본 발명은 상기 배양 방법들에 따라 제조된 장 줄기세포 집합체를 또한 제공한다.
장 상피세포의 제조 방법
본 발명은 상기 장 줄기세포 집합체를 화학적 조성이 명확한 분화 배지에서 기체-액체 계면배양법으로 배양하는 장 상피세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체를 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 저해제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 배지에서 기체-액체 계면배양법으로 배양하는 단계를 포함하는 장 상피세포의 제조 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, (a) 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계;
(b) 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하여 장 줄기세포 집합체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 장 줄기세포 집합체를 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 저해제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 배지에서 기체-액체 계면배양법으로 배양하는 단계를 포함하는 장 상피세포의 제조 방법을 제공한다.
앞서 언급한 전분화능 줄기세포, 오가노이드 및 장 줄기세포에 대한 사항은 위 언급된 기재를 포함하여, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 (b) 단계의 배양 배지는 상술한 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드에 대한 기재를 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 "분화 배지"란, 분화되지 않은 줄기세포를 배지 중에서 배양하였을 때 분화된 세포의 특징들 중 일부 또는 모두를 가지는 세포로 발생되도록 하는 세포 성장 배지를 의미하며, 기본 배지를 포함한다.
본 발명에서 장 상피세포의 제조에 최적화된 분화 배지는 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 저해제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 니코틴아미드를 포함한다.
본 발명에서 "기체-액체 계면배양법"이란, 부분적으로 개방된 배양 용기 또는 배지로 부분적으로 충전된 배양 용기에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대 세포 또는 오가노이드의 표면을 공기에 노출시키는 것일 수 있다. 상기 기체는 공기일 수 있으며, 주위 환경에서 발견되는 조성 및 기체의 혼합물로 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명은 주위 환경과 다른 조성을 갖는, 예를 들어, 특정 성분에 대해 농축된 혼합물 또는 특정 성분이 고갈되거나 제거된 혼합물을 포함하는 기체 혼합물을 고려하고 포함한다.
세포를 기체-액체 계면에서 배양하는 경우, 세포가 다공성 기재의 상부 측에서 공기와 접촉하고, 바닥 측에서 세포 배양 배지와 접촉하도록 하여 세포를 다공성 기재 상에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 충분한 용적의 배지를, 이 배지가 다공성 기재 상에 존재하는 세포의 바닥면과 접촉하지만 이 세포를 봉입하거나 액침시키지 않도록 다공성 기재(예를 들어, 필터 인서트(filter insert))를 함유하는 배양 용기의 바닥에 첨가할 수 있다. 적합한 다공성 기재는 세포의 성장 및 분화에 악영향을 주지 않는 임의의 물질로 형성시킬 수 있다. 예시적 다공성 기재는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에스테르 또는 폴리카보네이트와 같은 중합체로 제조된다. 적합한 다공성 기재는 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다. 상업적으로 입수가능한 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(인비트로젠) 및 엔젤브레쓰-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 컬트렉스(Cultrex)(등록상표) 기저막 추출물(트레비젠 인코포레이티드(Trevigen, Inc.), I형 콜라겐(인비트로젠), 비트로젤(Vitrogel)(등록상표)(TheWell Bioscience Inc.) 또는 마트리젤(Matrigel)(상표)(BD 바이오사이언시즈)) 등으로 코팅될 수 있다.
즉, 세포외 기질이 코팅된 트랜스웰 하에 장 줄기세포를 배양하는 것일 수 있다. 세포외 기질은 앞서 언급된 임의의 세포외 기질이 사용될 수 있다.
바람직하게 상기 세포외 기질은 마트리젤일 수 있다. 기재의 공극률은 세포 생존성을 유지시키고 세포의 분화를 촉진하기에 충분해야 한다.
적합한 기재는 약 0.3 내지 약 3.0 μm, 약 0.3 내지 약 2.0 μm, 약 0.3 내지 약 1.0 μm, 약 0.3 내지 약 0.8 μm, 약 0.3 내지 약 0.6 μm, 약 0.3 내지 약 0.5 μm, 약 0.5 내지 약 3.0 μm, 약 0.6 내지 약3.0 μm, 약 0.8 내지 약 3.0 μm, 약 1.0 내지 약 3.0 μm, 약 2.0 μ m 내지 약 3.0 μm, 바람직하게는 약 0.4 μm의 기공 크기 및 약 5천만개 내지 약 1억 2천만개 기공/㎠, 약 6천만개 내지 약 1억 1천만개 기공/㎠, 약 7천만개 내지 약 1억개 기공/㎠, 바람직하게는 약 8천만개 내지 약 1억 개 기공/㎠, 약 9천만개 내지 약 1억개 기공/㎠, 보다 바람직하게는 약 1억개 기공/㎠의 기공 밀도를 갖는 필터 인서트를 포함한다.
배지는 매일 또는 격일로 교체하거나 재생시키는 것이 유리할 수 있다. 다공성 기재의 상부에서 성장한 세포는 일반적으로 단일세포가 아니며, 오히려 이 세포들은 시트(sheet)의 형태이거나 세포의 응집체 클러스터(aggregate cluster)로서 존재한다. 기체-액체 계면에서 배양된 세포는 배지에 액침된 세포에 비해서 훨씬 더 높은 산소 분압(oxygen tension)을 경험할 수 있다.
본 발명의 장 상피세포는 VIL1, ECAD, FABP1, KRT20, LCT, LYZ 및 MUC2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커에 대하여 증진된 발현 수준을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 장 상피세포는 장 줄기세포 마커인 LGR5, CD44, MKI67, SOX9, ASCL2, OLFM4, AXIN2 또는 CTNNB 중 적어도 어느 하나 이상의 마커 유전자의 발현은 감소하는 반면에, 장 상피세포 마커인 VIL1, ECAD, FABP1, KRT20, LCT, LYZ 또는 MUC2의 발현은 증진되는 특징을 가질 수 있다.
또한, 상기 장 상피세포는 장 줄기세포와 비교하여 AKR1B15, DHRS11, GALNT4, GALNT5, DHRS3, RDH10, AADAC, NR1I2, SULTE1, DOUX2, FABP1, SLC6A20, SLC43A1 및/또는 CLDN3에 대하여 증진된 발현 수준이 나타날 수 있다.
상기 장 상피세포에는 소장세포, 점액 분비세포, 호르몬 분비세포 및 파네스 세포가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 장 상피세포의 제조는 이에 한정되지 않으나, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일, 2주, 3주 또는 그 이상으로 진행될 수 있다.
본 발명은 상기 장 상피세포의 제조 방법에 따라 제조된 장 상피세포를 제공한다.
용도
1) 의약 용도
본 발명은 상기 장 줄기세포 또는 장 상피세포는 세포치료제로 활용하여 장 질환을 앓고 있거나 장 질환의 발병 위험에 처한 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포를 포함하는 조직 치료제를 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포를 포함하는 장 이식 보조용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포; 및 소장 오가노이드를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
장 줄기세포 집합체 및/또는 장 상피세포는 세포 또는 조직의 기능을 복원시키기 위한 생체공학 기술로서 치료 목적으로 활용 가능하다.
예를 들어, 상기 치료제 혹은 약학 조성물은 이식 재료로 활용 가능하며 각종 장 질환의 치료에 적용할 수 있다. 특히, 장애를 입은 (기능부전을 포함함) 장관 조직의 재생·재건용의 재료로서 이용이 고려될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 조직 치료제일 수 있다.
바람직하게 상기 세포는 장 줄기세포 집합체일 수 있다.
본 발명에서 상기 장 질환은 장누수 증후군, 단장 증후군, 과민성 장증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 장 질환일 수 있다.
본 발명은 장 줄기세포 집합체는 소장 오가노이드의 장 이식을 위한 장 이식 보조용 약학 조성물로 이용될 수 있다.
이식 효율과 재생치료 효율을 위한 선결 조건은 이식된 부위에 빠르게 생착하여 혈관 생성을 통해 이식된 세포나 조직에 혈액을 공급하는 것이다. 통상의 소장 오가노이드 또는 장 줄기세포는 장 이식시 생착률이 떨어지고 혈관 형성 등이 충분하지 않아 초기 이식 효율이 매우 낮은 편이다. 본 발명에 따른 장 줄기세포 집합체는 이러한 장이식시 생착률 및 혈관 형성 효율을 개선하여 장 이식의 효능을 개선하는 보조제로 활용 가능하다.
또한, 장 줄기세포 집합체; 및 소장 오가노이드; 를 포함하여 장 질환 치료용 조성물로 활용 가능하다.
이러한 이식에 있어서는 피브린, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lacticcoglycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생분해성 지지체와 함께 이식에 활용될 수 있다.
즉, 위 이식 재료의 대상이 되는 세포는 그대로, 혹은 앞서 언급된 지지체에 포매되어 이식에 활용될 수 있다.
또한, 세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭시드(DMSO) 등을 추가할 수 있고, 세균의 혼입을 저지하는 것을 목적으로 하여 항생 물질 등을 추가할 수 있고, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 하여 각종 성분(비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등)을 본 발명의 이식 재료에 추가할 수도 있다.
본 발명의 이식 재료는 in vivo 실험계의 구축에도 이용 가능하다. 예를 들면, 상기 언급된 이식 재료를 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 게잡이원숭이, 붉은털 원숭이, 침팬지 등의 실험 동물에 이식하여, 인간화 동물(인간 장관 모델)을 제작할 수 있다. 이와 같은 인간화 동물은 약물 동태나 독성 시험 등의 실험에 특히 유용하며, 경구약에 대한 초회 통과 효과의 영향이나 약제성 장염 등의 연구에 대한 공헌이 기대된다.
본 발명에서 예방은 상기 조성물의 투여로 장 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 상기 조성물의 투여로 장 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 1 ml 당 1.0×105개 내지 1.0×1010개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×109개의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제, 이식제 등이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 장 줄기세포 집합체 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 5 x 105~108/60kg 성인 또는, 5 x 105~108/1회 로 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 장 줄기세포 집합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 장 줄기세포 집합체의 용도를 제공한다.
장 줄기세포 집합체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환의 치료 방법을 제공한다.
대상체란 장 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 장 줄기세포 집합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 약제의 제조에 장 줄기세포 집합체의 용도를 제공한다.
장 줄기세포 집합체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장 이식 보조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 장 줄기세포 집합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 장 줄기세포 집합체의 용도를 제공한다.
장 줄기세포 집합체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장 이식 보조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 장 줄기세포 집합체; 및 소장 오가노이드; 를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 장 줄기세포 집합체; 및 소장 오가노이드; 의 용도를 제공한다.
장 줄기세포 집합체; 및 소장 오가노이드; 를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환의 치료 방법을 제공한다.
2) 모델
본 발명은 또한 장 줄기세포 및/또는 장 상피세포 모델을 제공한다.
구체적으로, 장 줄기세포를 직접 이용하거나, 상기 장 줄기세포로부터 분화된 장 상피세포를 이용하여 모델로 활용 가능하다.
본 발명에 따른 장 줄기세포는 손상된 장 조직의 재생치료를 위한 세포 치료제로서 활용이 가능하며, 조직 재생에 대한 연구 및 임상 적용에 대하여 보다 우수한 결과를 제공하는 데 도움을 줄 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 장 줄기세포는 조직에 생착하여 조직 재생에 핵심 역할을 수행하는 줄기세포 집합체로 구성되어 있기 때문에, 손상된 조직에 생착될 확률이 높을 뿐만 아니라 직접 재생을 통해 손상된 조직을 빠르게 복구시킬 수 있다.
뿐만 아니라, 줄기세포의 재생능, 분열능 조절에 중요한 치료제 발굴을 위한 스크리닝 및 약물 독성 평가 등 다양한 평가를 위해 활용 가능하다.
필요에 따라, 본 발명에 따른 장 줄기세포는 장 줄기세포주, 예를 들어, 유전자 편집을 통한 줄기세포주(stem cell line) 개발을 위한 시스템 모델로도 활용할 수 있다.
상기 줄기세포주는 완전히 분화되어 특정의 특수화된 기능을 갖는 타 세포 유형 또는 미분화 상태로 유지될 수 있는 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명에 따른 장 줄기세포는, 예를 들어, 렌티바이러스(Lentivirus)나 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 적용하여 형질 전환된 세포주 생산이 가능하며, 형질전환된 세포주는 대용량 약물 스크리닝 및 효능 평가, 실시간 세포 기능 추적 등 다양한 연구 방법을 제공한다.
또한, 형광단백질로 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(DsRed)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지되거나 또는 이를 형질전환 하여 목적하는 세포의 특성 분석 등에 활용 가능하다.
특히, 형광 단백 등으로의 형질 전환을 통하여 실시간 모니터링 가능한 신규 세포주의 제공이 또한 가능하다.
본 발명은 상기 장 상피 세포를 포함하는 장 상피세포 모델을 제공한다. 바람직하게, 상기 장 상피 모델은 소장 상피모델일 수 있다.
본 발명의 장 줄기세포 집합체로부터 분화한 장 상피세포를 포함하는 장 상피세포 모델에서, 상기 장 상피세포는 crypt-villus 구조를 가지는 장 상피세포일 수 있다. 보다 바람직하게는 소장 상피세포일 수 있다. 즉, 상기 장 상피세포 모델은 crypt-villus 구조를 가지는 것인 장 상피세포 모델일 수 있다.
상기 장 상피세포 모델은 박테리아 또는 바이러스 감염, 장관 약물 대사 반응에 대한 연구 및 임상을 적용하는 것에 있어 보다 정확한 결과를 제공하는 데 도움을 줄 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 조직의 형태 및 기능적 특성을 지니고 있을 뿐만 아니라 안정성과 재현성이 높아 약물 대사 반응, 박테리아 또는 바이러스 감염, 미생물 감염 등에 대한 평가를 위한 활용 가능성이 높다.
즉, 박테리아 또는 바이러스 감염, 미생물 감염, 약물 대사반응 등의 플랫폼으로 활용할 수 있어 박테리아 또는 바이러스, 미생물 감염에 대한 증상 연구, 약물 부작용, 안전성 및 상호작용을 정확하게 예측할 수 있는 제공하게 한다.
본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 장 상피세포 또는 이를 포함하는 장 상피세포 모델은 감염병 모델로 이용될 수 있다.
예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염병 질환 모델 또는 미생물 감염병 질환 모델로 활용 가능하다. 이러한 박테리아 또는 바이러스, 미생물에 대해서는 알려진 박테리아 또는 바이러스, 미생물이라면 어떠한 것이라도 활용 가능하다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 virus 감염병 질환 모델로서 활용될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 장 상피세포 모델을 이용하여 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
이에 본 발명은 (a) 장 상피세포 모델에 박테리아 또는 바이러스를 감염시키는 단계; (b) 감염된 장 상피세포 모델에 약물을 처리하는 단계; 및 (c) 약물 처리에 따른 반응을 확인하는 단계; 를 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, (a) 장 상피세포 모델에 약물을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 장 상피세포 모델에서 약물의 흡수도 또는 생체 이용률을 평가하는 단계를 포함하는 약물 평가 방법을 제공한다.
또한, 장 상피세포 모델에 박테리아 또는 바이러스를 감염시키는 단계를 포함하는, 질환 모델링을 위한 장 상피세포 모델 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서는 상기 장 상피세포 모델에 피검 물질을 처리하는 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에서 상기 피검 물질은 장 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 것으로 예측되는 물질로, 예를 들면, 약물 후보 물질, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 상기 피검 물질의 처리 후 질환의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현이 처리 전과 비교하여 증가 또는 감소되는 경우, 상기 피검 물질을 질환의 치료제로 선별하는 단계를 수행할 수 있다.
이러한 질환은 예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염성 질환, 미생물 감염성 질환 또는 장 관련 질환이다.
박테리아 또는 바이러스 감염성 질환 또는 미생물 감염성 질환은 병원성을 가지는 박테리아 또는 바이러스, 미생물의 감염에 의해 발생 가능한 임의의 질환을 칭한다.
본 발명에서 상기 장 관련 질환은 염증성 장 질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(UC), 단장 증후군(short bowel syndrome), 장염 (enterocolitis), 유전적 장질환인 히르슈슈프 룽 병 (hirschsprung's disease), 셀리악 병(Celiac disease) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명에 따른 장 줄기세포 배양 방법을 통해 쉽고 빠르게 균질한 장 줄기세포를 배양할 수 있다. 또한, 장기의 계대 배양 및 동결 보존/해동 과정을 통해 안정적인 대량 배양이 가능하고, 세포 특성을 유지한 상태로 배양 가능하기 때문에 재현성이 높은 장 줄기세포 배양시스템을 구축할 수 있다.
상기 배양시스템을 통해 제조된 장 줄기세포 모델은 인간 장 줄기세포 연구를 위한 새로운 연구 모델로 활용될 수 있으며, 특히 환자 맞춤형 유도만능 줄기세포로부터 만들어진 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포는 환자 맞춤형 세포 소스이므로, 장 질환 재생치료제 개발 및 인공 장기 제작을 위한 세포원 및 연구 모델로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 장 상피세포 제조 방법을 통해 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포를 장 상피세포로 분화시킴으로써 장 세포의 다양성 및 장 조직과 유사한 구조를 가지는 2.5 차원의 장 상피세포 모델을 확보할 수 있다.
상기 장 상피세포 모델은 영양 및 물질 대사의 효소가 증가된 모델로서 다양한 물질의 흡수 대사 평가가 가능하며, 신체의 외부와 내부를 나눠주는 장벽으로서 역할을 수행할 수 있다. 뿐만 아니라 감염병을 포함한 다양한 질환 모델링에 활용될 수 있으며, 나아가 질환 치료를 위한 치료제 스크리닝과 신약 후보물질의 효능 및 독성평가 등 다양한 분야에 활용이 가능하다.
도 1은 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포 집합체를 분리하여 2차원 배양하는 방법의 모식도이다.
도 2는 기저세포(feeder)와 마트리젤(Matrigel) 위에서 2차원 장 줄기세포 집합체 배양시 세포의 형태를 보여주는 도이다.
도 3은 배아줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드 (hESC-hIO)로부터 유래된 장 줄기세포 집합체를 기저세포(feeder)와 마트리젤(Matrigel) 위에서 2차원 배양시 세포의 형태를 보여주는 도이다.
도 4는 2차원 장 줄기세포 집합체 생착능을 최대화하기 위해 다양한 종류의 세포외 기질(extracellular matrix) 코팅 조건을 스크리닝한 결과를 나타내는 도이다.
(a) 2차원 장 줄기세포를 각각 0.2% Gelatin, 10 μg/ml Col Type I, 50 μg/ml Col Type I, 1% Matrigel, 5% Matrigel이 코팅된 배양 용기 위에서 배양하였을 때 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 형태를 보여주는 도이다.
(b) (a)에서 확인한 세포 콜로니의 면적을 Image J 프로그램을 이용하여 표면적을 계산한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 2차원 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 최적의 배양 배지 조성을 찾기 위한 스크리닝 결과를 나타내는 도이다.
(a) 배양 배지 구성요소에서 단일인자를 제거하였을 때 장 줄기세포 집합체의 콜로니의 사이즈를 Crystal violet (CV) 염색을 통해 확인한 도이다.
(b) (a)에서 Crystal violet (CV) 염색을 통해 확인한 콜로니의 사이즈를 Image J 프로그램을 이용하여 표면적을 계산한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 2차원 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 배양 배지에서 필수인자(R-스폰딘 1, EGF, PGE2)를 각각 제거한 배양 배지에서 배양하였을 때 장 줄기세포 집합체의 형태를 보여주는 도이다.
도 7은 배양 배지의 구성인자 중 WNT3A와 R-스폰딘 1이 WNT 신호 전달 체계 활성화를 통하여 2차원 장 줄기세포 집합체의 줄기세포능(stemness) 및 자가증식(self-renewal) 유지에 중요한 기능을 한다는 것을 나타내는 결과이다.
(a) WNT3A와 R-스폰딘 1의 제거로 인한 WNT 신호 전달 체계 억제 시 2차원 장 줄기세포 집합체의 줄기세포능(stemness) 및 자가증식(self-renewal) 관련 마커 유전자의 발현이 감소하는 것을 qPCR을 통해 확인한 그래프이다.
(b) WNT3A와 R-스폰딘 1의 제거로 인한 WNT 신호 전달 체계 억제 시 2차원 장 줄기세포 집합체의 생장능(proliferation)이 감소하는 것을 EdU와 KI67 마커 단백질의 면역형광염색을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 WNT 리간드(WNT3A 또는 R-스폰딘 1) 제거 또는 WNT 저해제(inhibitor; WNT-C59 또는 XAV939) 처리에 의한 WNT 신호 전달 체계 억제 시 성장이 저해된 2차원 장 줄기세포 집합체의 형태를 보여주는 도이다.
도 9는 EGF 리간드 제거 또는 EGF 저해제(PD0325901) 처리에 의한 EGFR 신호 전달 체계 억제 시 세포 증식이 저해된 2차원 장 줄기세포 집합체의 형태 및 세포 생존/사멸(Calcein-AM (live)/Etidium homodimer1(dead)) assay 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 PGE2 리간드 제거 또는 PGE2 저해제(EP2i 또는 EP4i) 처리에 의한 PGE2 신호 전달 체계 억제 시 2차원 장 줄기세포 집합체의 생장이 저해되는 것을 보여주는 결과이다.
(a) PGE2 리간드 제거 또는 PGE2 저해제(EP2i 또는 EP4i) 처리에 의한 PGE2 신호 전달 체계 억제 시 생장이 저해된 2차원 장 줄기세포 집합체의 형태를 나타내는 도이다.
(b) PGE2의 수용체 (PTGER1 내지 PTGER4)와 PGE2 합성 효소 (PTGES) 중 PTGER2와 PTGER4가 2차원 장 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 2차원 장 줄기세포 집합체의 계대 배양을 통해 안정적인 장기배양이 가능하다는 것을 보여주는 결과이다.
(a) P0, P1, P3, P5, P10, P20, P30의 2차원 장 줄기세포 집합체의 형태를 나타내는 도이다.
(b) 계대 배양 과정 중 총 세포 수의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 12는 도 6의 배양 배지 필수구성인자(R-스폰딘 1, EGF, PGE2)를 제외한 나머지 인자들을 배양 배지에서 각각 제거할 경우 P0의 2차원 장 줄기세포의 성장에는 영향을 미치지 않지만 계대 배양시 세포 생착 및 증식능이 감소되는 것을 확인한 도이다.
도 13은 2차원 장 줄기세포 계대 배양시 NOTCH 활성제(Jagged-1 또는 Valproic acid) 또는 ROCK 저해제(Y-27632) 처리에 의해 세포 생착능이 증가하는 것을 나타내는 도이다.
(a) NOTCH 활성제와 ROCK 저해제를 단독으로 처리하거나 또는 동시에 처리하였을 때 생착된 2차원 장 줄기세포 집합체의 형태를 나타내는 도이다.
(b) (a)에서 생착된 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 수를 Countess III cell counter를 이용하여 세포 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 최적화된 배양 조건에서 2차원 장 줄기세포 집합체 배양시 세포의 형태적 특성을 나타내는 도이다.
(a) 최적화된 배양 조건에서 배양된 2차원 장 줄기세포 집합체는 단층으로 구성되어 있음을 나타내는 도이다.
(b) 최적화된 배양 조건에서 배양된 2차원 장 줄기세포 집합체의 100% 생존율을 나타내는 도이다.
도 15는 최적화된 배양 조건에서 2차원 장 줄기세포의 동결 보관 및 해동이 가능하고 배치간 차이가 거의 없는 재현성 높은 배양이 가능함을 나타내는 도이다.
(a) 동결보관 후 해동한 2차원 장 줄기세포 집합체를 배양 후 2일, 4일, 8일 차 세포의 형태를 나타내는 도이다.
(b) 2차원 장 줄기세포 집합체는 배치간 차이가 거의 없이 장기배양이 가능함을 나타내는 도이다.
도 16은 단일세포 전사체 시퀀싱(single cell RNA sequencing; scRNA-seq)을 통해 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 구성 및 특징을 분석하기 위한 분석 과정 모식도이다.
도 17은 상피세포와 기질세포의 마커 유전자 발현 분석을 통해 2차원 장 줄기세포 집합체가 기질세포 대비 상피세포의 특성을 나타내는 세포를 다량 포함하고 있음을 나타내는 도이다.
도 18은 2차원 장 줄기세포 집합체의 유전체를 분석한 결과 6-8주차 태아의 장 상피세포와 유사한 특성을 보이는 것을 나타내는 도이다.
(a) 2차원 장 줄기세포 집합체와 태아부터 성인에 이르는 사람의 장 상피세포의 마커 유전자의 발현을 비교한 결과를 heatmap으로 나타내는 도이다.
(b) (a)의 결과를 마커 유전자 발현 패턴 유사도에 따라 hierarchical clustering한 결과를 dendrogram으로 나타낸 그래프이다.
도 19는 단일세포 전사체 분석 결과를 기반으로 2차원 장 줄기세포 집합체를 구성하고 있는 세포의 종류 및 조성을 나타내는 도이다.
(a) 단일세포 전사체 분석 결과를 기반으로 2차원 장 줄기세포 집합체를 구성하는 세포의 종류와 분포를 UMAP 상에 나타내는 도이다.
(b) (a)의 결과를 바탕으로 2차원 장 줄기세포 집합체를 구성하는 세포의 비율을 계산하여 나타낸 도표이다.
도 20은 2차원 장 줄기세포 집합체의 단일세포 전사체 분석 결과를 참고문헌(reference)의 인간 장 상피의 단일세포 전사체 분석 결과와 비교 분석한 결과를 나타내는 도이다.
(a) 참고문헌에서 보고한 단일세포 전사체 분석을 통해 인간 장 상피를 구성하는 세포의 종류와 분포를 UMAP 상에 나타내는 도이다.
(b) (a)의 결과와 2차원 장 줄기세포 집합체의 단일세포 전사체 분석 결과를 동일 UMAP 상에 함께 나타내어 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 조성이 대부분 장 상피의 줄기세포 및 전구체 세포로 구성되어 있음을 나타내는 도이다.
(c) 단일세포 전사체 분석을 통해 인간 장 상피를 구성하는 세포 종류별 특이적으로 발현하는 마커 유전자 종류와 발현 패턴을 나타내는 도이다.
도 21은 줄기세포 특이적으로 발현하는 마커 유전자의 발현 패턴 분석을 통해 2차원 장 줄기세포 집합체가 줄기세포 또는 전구체 세포의 특성을 나타내는 세포를 다수 포함함을 나타내는 도이다.
도 22는 2차원 장 줄기세포 집합체가 줄기세포와 전구체 세포의 특성을 나타내는 세포들로 주로 구성되어 있음을 확인하기 위해 면역형광염색을 통해 검증한 결과를 나타내는 도이다.
(a) 줄기세포 특이적 마커 단백질인 LDHB, EIF3E, SOX9, KI67의 면역형광염색을 통해 2차원 장 줄기세포 집합체의 대부분의 세포가 줄기세포 또는 전구체 세포임을 확인함 결과를 나타내는 도이다.
(b) 장 상피를 구성하는 분화세포들 중 분비세포(secretory cell)의 마커 단백질인 MUC2와 CHGA의 발현이 전혀 관측되지 않음을 통해 2차원 장 줄기세포 집합체는 분비 세포로 분화되지 않음을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 23은 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법(Air-liquid interface culture)을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화하는 방법의 모식도이다.
도 24는 2차원 장 줄기세포 집합체를 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화에 중요한 필수인자를 찾기 위해 배양배지에서 단일인자를 제거한 후 분화시켰을 때 세포의 형태를 나타내는 도이다.
도 25는 필수인자들로 구성된 최소배지(minimal medium)에서 2차원 장 줄기세포 집합체가 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 정상적으로 분화되는 것을 확인한 도이다.
(a) 2차원 장 줄기세포 집합체 배양용 배지(Full M)와 필수인자들로 구성된 최소배지(minimal M)에서 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화시켰을 때 모두 정상적으로 분화되는 것을 나타내는 도이다.
(b) 최소배지에서 다양한 종류의 전분화능 줄기세포 유래 2차원 장 줄기세포 집합체들이 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화되는 것을 나타내는 도이다.
(c) 기체-액체 계면배양법을 통해 분화된 2.5차원 장 상피세포는 배치간 차이가 거의 없이 재현성 높게 배양할 수 있음 나타내는 도이다.
도 26은 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화시킬시 분화가 진행됨에 따라 분화세포 마커 유전자의 발현이 점차 높아지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 27은 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화 시 융모와 유사한 구조(villus-like structure)가 형성되며, 분화세포 마커 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인한 도이다
(a) 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화 후 4일, 8일, 12일 차에 H&E 염색을 통해 세포의 단면을 확인하고, 면역형광염색을 통해 마커 단백질의 발현량을 확인한 도이다.
(b) (a)에서 H&E 염색을 통해 확인한 세포 단면의 두께를 Image J 프로그램을 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
(c) 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화 후 4일, 8일, 12일 차에 장 상피세포의 장벽 기능성(Barrier function)을 상피통과 전기저항성(Transepithelial electrical resistance; TEER) 측정을 통해 확인한 그래프이다.
도 28은 2차원 장 줄기세포 집합체와 기체-액체 계면배양법을 통해 분화된 2.5차원 장 상피세포를, 전분화능 줄기세포(hPSC), 미성숙 3차원 장관 오가노이드(Control hIO), 성숙 3차원 장관 오가노이드(Mature hIO), 기능성 장 상피세포(hIEC), 인간 장 상피 조직(hSI)과의 비교 분석을 위해 전사체 발현 양상을 이용해 주성분 분석(Principle component analysis; PCA)을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 29는 2차원 장 줄기세포 집합체와 기체-액체 계면배양법을 통해 분화된 2.5차원 장 상피세포의 전사체 분석을 통해 장 상피세포로 분화 시 발현 양상에 차이가 나타나는 유전자 클러스터와 대표 유전자를 나타내는 도이다.
(a) 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화 시 발현 패턴이 증가 또는 감소하는 유전자 클러스터들의 종류를 나타내는 도표이다.
(b) (a)에서 발굴된 유전자 클러스터들의 대표 유전자들의 발현 양상을 qPCR 실험법을 통해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 30은 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용한 유전자 운송(Gene delivery)을 통해 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주를 제작하는 과정에 대한 모식도이다.
도 31은 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주의 제작 단계별 세포의 형태 및 형광단백질 발현 양상을 보여주는 도이다.
(a) 렌티바이러스를 이용해 형광유전자를 운송하고 난 직후(After spin infection), 항생제를 이용한 클론 선별(After selection and expansion)하고, 선별된 후 단일세포 유래 세포주 제작을 위해 트립신(Trypsin-EDTA)을 이용하여 단일세포로 분리한 후 계대 배양한 직후(After cell seeding)와 일정한 크기 이상이 되도록 배양한 후(After expansion) 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주의 형태와 형광단백질 발현 양상을 나타내는 도이다.
(b) (a)에서 제작한 단일세포 유래 형광단백질 발현 클론을 콜라게네이즈와 디스파아제(Collagenase type IV+Dispase)를 처리하여 분리한 후, 단일 클론만 분리하여 배양한 세포의 형태와 형광단백질 발현 양상을 날짜별로 보여주는 도이다.
도 32는 도 31에서 제작한 장 줄기세포주를 이용하여 3차원 장관 오가노이드와 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화시킨 후 세포의 형태와 형광단백질 발현 양상을 확인한 도이다.
(a) 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주를 마트리젤 돔(Matrigel dome) 내부에서 3차원 장관 오가노이드로 분화시킨 후 6일, 14일, 20일 차의 세포의 형태와 형광단백질 발현양상을 나타내는 도이다.
(b) 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 2.5차원 장 상피세포로 분화시킨 후 8일차 장 상피세포의 형태와 형광단백질 발현양상을 나타내는 도이다.
도 33은 2차원 장 줄기세포 집합체의 재생치료효과 및 세포치료제로서의 활용가능성을 확인하기 위한 장 질환 모델링 및 장 줄기세포 이식실험 과정에 대한 모식도이다.
도 34는 2차원 장 줄기세포 집합체를 마우스용 대장내시경(Murine colonscopy)을 이용해 이식하는 과정과 이식 후 마우스의 상태를 촬영한 모습을 나타내는 도이다.
(a) 세포를 주입할 수 있는 마우스용 대장내시경 사진(좌)과 마우스용 대장내시경을 이용해 2차원 장 줄기세포를 이식하고 있는 모습(우)을 촬영한 모습을 나타내는 도이다.
(b) 2차원 장 줄기세포 집합체가 이식된 마우스의 이식 직후 상태를 촬영한 모습을 나타내는 도이다.
도 35는 마트리젤 또는 2차원 장 줄기세포가 이식된 마우스의 이식 후 날짜별 몸무게의 변화 양상의 추이를 나타내는 도이다.
도 36은 마트리젤 또는 2차원 장 줄기세포가 이식된 마우스의 이식 후 생존율을 나타내는 도표와 그래프이다.
도 37은 Hot-EDTA를 이용한 장 상피 손상 모델링 전과 후, 장 손상이 유발된 마우스에 마트리젤 또는 2차원 장 줄기세포를 이식한 직후 3일, 14일 후 마우스용 대장내시경을 이용하여 장 상피의 재생효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 38은 손상된 장 상피에 2차원 장 줄기세포 집합체가 생착되어 있는 것을 확인한 도이다.
(a) IVIS 장비를 이용하여 DiR 형광 염료로 표지된 2차원 장 줄기세포 집합체가 이식한 14일 후에도 장 손상 부위에 생착되어 있는 것을 확인한 도이다.
(b) 형광단백질(Green fluorescence protein; GFP)을 발현하는 장 줄기세포주를 손상된 장 상피에 이식하고 14일 후에 장을 분리하여 형광단백질 발현을 확인함으로써 장 줄기세포가 손상된 장 상피에 정상적으로 생착된 것을 확인한 도이다.
도 39는 장 상피가 손상된 부위에 생착한 2차원 장 줄기세포 집합체에 의해 손상된 장 상피가 정상적으로 재생된 것을 확인함으로써 2차원 장 줄기세포 집합체의 재생능을 나타내는 도이다.
(a) 장 상피가 손상된 부위에 마트리젤 또는 2차원 장 줄기세포 집합체를 이식하고 14일 후 장 조직을 분리하여 H&E와 AB-PAS 염색을 통해 장 상피 조직의 형태를 분석하였을 때, 2차원 장 줄기세포 집합체를 이식해 주었을 때만 장 상피 조직의 재생이 일어난 것을 나타내는 도이다.
(b) 장 상피가 손상된 부위에 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주를 이식하고 14일 후 장을 분리하여 형광단백질 발현을 확인한 결과 크립트-융모(crypt-villus)구조 전체에서 형광단백질이 발현되는 것을 통해 장 줄기세포주에 의한 장 재생이 일어난 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 40은 미성숙 또는 성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 분화된 2.5차원 장 상피세포에 SARS-CoV-2 바이러스를 감염시켜 질환 모델링을 수행한 전체 과정에 대한 모식도이다.
도 41은 미성숙 또는 성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기체-액체 계면배양법을 통해 분화된 2.5차원 장 상피세포의 형태를 분화 시작 후 2일, 4일, 6일, 8일, 10일에 관측한 결과를 나타내는 도이다.
도 42는 성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포가 미성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포에 비해 장 성숙도를 나타내는 마커 유전자의 발현이 상대적으로 더 높은 것을 나타내는 그래프이다.
도 43은 성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포에서 미성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포에 비해 SARS-CoV-2 감염에 중요한 수용체의 발현이 상대적으로 더 높은 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
(a) 성숙 또는 미성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포의 전사체를 분석한 결과에서 SARS-CoV-2 감염에 중요한 수용체의 발현만 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
(b) 성숙 또는 미성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포에서 SARS-CoV-2 감염에 중요한 수용체 중 (a)에서 발현이 증가한 것으로 확인된 ACE2 단백질의 발현량을 면역형광염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 44는 성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포가 미성숙 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 분화된 장 상피세포에 비해 SARS-CoV-2 감염이 더 높은 수준으로 일어난다는 것을 장 상피세포에서 바이러스의 전사체를 qPCR을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 세포 배양 및 iPSC 제조
hESC(human embryonic stem cells), hiPSC(human induced pluripotent stem cells)를 포함하는 hPSC(human pluripotent stem cells)를 공지된 방법(Molecular carcinogenesis 55, 387-396 (2016), Proteomics 15, 2220-2229 (2015))으로 배양하였다. 비삽입형-hiPSC를 공지된 방법에 따라 Episomal iPSC 리프로그래밍 벡터(Cat. No. A14703. Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 전기천공법(electroporation)으로 트랜스팩션시켜서 리프로그래밍 하였다.
전기천공 5일 후, 섬유아세포를 마트리젤(Matrigel)(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)-코팅된 6-웰 플레이트에 1 x 105개/웰로 플레이팅하고, E8 배지(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)로 배양하였다. 3주 후, hiPSC 콜로니를 선택하고, 계대 배양 및 추후 특징 설정을 위해 세포 수를 증대시켰다.
실험예 2. 3차원 장관 오가노이드 제조를 위한 hPSCs의 장관 오가노이드(hIO)로의 분화
인간 장관 오가노이드(hIOs)를 공지된 방법(Nature 470, 105-109 (2011))을 이용하여 제조하였다. 완전한 내배엽을 유도하기 위해, hPSC를 마트리젤 또는 ECMatrix™-511로 코팅된 디쉬에 플레이팅하고, 0%, 0.2% 및 2% 농도의 정제된 태아 소 혈청(dFBS, HyClone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 갖는 RPMI 1640 배지에서 3일 동안 100ng/ml Activin A(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 처리하였다. 또한, 3D 후장(hindgut) 스페로이드로 분화시키기 위해, 500ng/ml FGF4(R&D Systems) 및 3μM CHIR99021(TOCRIS)를 2% dFBS가 포함된 RPMI 1640 배지와 함께 4~6일 동안 처리하였다. 후장으로 유도한 4일부터, 스페로이드는 마트리젤(Matrigel, BD Biosciences)에 삽입하고, 1X B27(Invitrogen), 200~250ng/ml R-스폰딘 1(R&D Systems), 100ng/ml EGF (R&D Systems) 및 40~50ng/ml Noggin(R&D Systems)이 포함된 hIO 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, 및 15 mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)에서 배양하고, 10~14일에 한 번씩 계대 배양하였다. 장관 오가노이드의 성숙화를 위하여 약 2 passage 동안 hIO 배지에 1 ng/ml의 interleukin 2(IL-2, R&D Systems) 넣어 배양해 주었다.
실험예 3. 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포 분리 배양법
3차원 장관 오가노이드를 마트리젤 돔으로부터 분리하고 파이펫팅을 통해 남아있는 마트리젤을 최대한 제거해주었다. 분리된 오가노이드를 1 ml의 0.25% trypsin-EDTA(TE, Invitrogen)에 넣고 37℃ water bath에서 대략 5분 정도 인큐베이션해주었다. 이 후 약하게 5회 미만의 파이펫팅을 해주어 오가노이드가 단일세포 및 작은 덩어리로 분리될 수 있게 한 뒤 basal media를 넣어 총 부피가 10 ml가 되도록 해주었다. 원심분리기로 수급한 세포를 feeder 세포 또는 1% Matrigel(Corning)이 코팅된 배양 접시 위에 두었다. 그리고 나서, 200ng/ml R-스폰딘 1(R&D Systems), 100ng/ml EGF (R&D Systems), 2.5μM Prostaglandin E2(Sigma-aldrich)을 주성분으로 하고, 1X B27(Invitrogen), 80ng/ml Noggin(R&D Systems), 10nM [Leu15]-Gastrin I(Sigma-aldrich), 100ng/ml human recombinant WNT3A(R&D Systems), 500nM A-83-01(Tocris), 10uM SB202190(Sigma-aldrich), 1mM N-acetylcysteine(Sigma-aldrich), 및 10mM 니코틴아미드(Sigma-aldrich)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 보조적 성분으로 포함하는 장 줄기세포 배양 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, 및 15 mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)에서 배양하고, 7~10일에 한 번씩 계대 배양하였다. 계대 배양시 처음 2일 동안은 장 줄기세포 배양 배지에 1μM Jagged-1(Anaspec) 및/또는 2.5μM Y-27632(Tocirs)를 추가하여 주었다.
실험예 4. 장 줄기세포의 동결 및 해동
장 줄기세포 동결을 위해, 계대 배양 후, 3~5일이 되는 시기에 PBS를 이용하여 1~2회 세척하고, 계대 배양과정과 동일하게 TE를 37℃에서 5분가량 처리하여 단일 세포 또는 작은 세포덩어리로 분리한 후, hIO 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, and 15 mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)로 1회 워싱하였다. 이후, 동결배지(Recovery™ Cell Culture Freezing Medium, Gibco)를 넣어 세포를 잘 풀어준 뒤 현탁액을 만들어 동결하고, LN2 Tank에 장기 보관하였다.
동결한 장 줄기세포의 해동을 위해 미리 따뜻한 37℃배지를 준비하였다. 동결 세포를 빠르게 해동 후, 장 줄기세포 배양 배지로 1회 워싱하고, 미리 마트리젤 코팅된 배양접시에 WNT/R-spondin 활성제, 프로스타글란딘 신호전달 활성제, 수용체 타이로신 키나아제 리간드가 포함된 장 줄기세포 배양배지에서 배양하였다. 장 줄기세포는 2일에 한번 배양 배지를 갈아주었고, 처음 해동시 세포의 상태에 따라 3~7일간 배양 후 동일한 방법으로 계대 배양을 진행하였다.
실험예 5. 기체-액체 계면(Air-Liquid Interface) 배양법을 이용한 장 상피세포 분화법
70-80%의 밀집도로 증식한 장 줄기세포를 PBS를 이용하여 1-2회 세척해준 후 TE를 37℃ 인큐베이터에서 5-7분가량 처리하였다. 단일세포로 분리된 장 줄기세포를 수거한 후 hIO 배지를 이용하여 희석하였다. 원심분리를 이용해 세포를 모아준 후 상층액을 제거하고, 장 줄기세포 배양 배지를 추가하여 충분히 섞은 후 Countess III cell counter(Thermo Scientific. Inc.)를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 1% Matrigel로 코팅된 12-Transwell plate (Corning)의 insert에 2.5-3.5X105개의 세포를 넣어준 후 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 밀집도가 100%에 도달한 후 상층부의 배양배지를 모두 제거하고, 하층부의 배지를 200ng/ml R-스폰딘 1(R&D Systems), 100ng/ml EGF (R&D Systems), 2.5μM Prostaglandin E2(Sigma-aldrich), 10μM SB202190(Sigma-aldrich), 10mM 니코틴아미드(Sigma-aldrich)이 포함된 분화 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, and 15 mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)로 교체하였다. 이후 2일에 한 번씩 상층부의 표면을 PBS 또는 hIO 배지를 이용해 세척하고, 하층부를 새로운 분화 배지로 교체해주며 8-12일가량 배양하였다.
실험예 6. 세포 생존율 측정법
1% Matrigel이 코팅된 배양 접시에서 배양된 2차원 장 줄기세포 집합체의 생존율을 측정하기 위해 생존한 세포와 죽은 세포를 구별하여 염색할 수 있는 kit(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, Invitrogen)를 사용하였다. 생존한 세포를 calcein-AM으로 염색하고, 죽은 세포를 ethidium homodimer-1으로 염색하였다. 염색된 세포를 형광 현미경(Olympus)을 통해 관찰하였다.
실험예 7. 세포 생장률 측정법
1% Matrigel이 코팅된 배양 접시에 2차원 장 줄기세포 집합체를 플레이팅한 후 2-7일간 배양하였다. 이후 배양 배지를 제거하고 PBS(Sigma-aldrich)로 1-2회 세척한 후 TE(Invitrogen)를 넣어 세포를 떼어주었다. 원심분리 후 media를 넣어 단일세포로 분리해준 후 CountessIII cell counter(Thermo Scientific. Inc.)를 이용하여 세포의 수를 측정하였다.
실험예 8. Crystal Violet (CV) 염색법
장 줄기세포 집합체를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 0.02%의 crystal violet solution(Sigma-aldrich)으로 상온에서 10분 간 염색해주었다. 이후 멸균수로 3회 세척 후 이미지를 획득하였다. 장 줄기세포 집합체의 콜로니 크기는 Image J software(National Institute of Health)를 이용하여 분석하였다.
실험예 9. 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)
전체 RNA는 RNeasy 키트 (Qiagen)를 이용해 세포로부터 추출하였고 Superscript III cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용해 역전사 시켰다. qRT-PCR은 7500 Fast Real-time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 공지된 방법으로 수행하였다 (Cho et al., Oncotarget 6, 23837-23844, 2015). 모든 실험들은 3번 반복했고, 각 타겟 유전자의 CT 값은 제조사가 제공한 소프트웨어를 이용해 계산하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 표 1과 같다.
Target gene Primer (Forward) Primer (Reverse)
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (서열번호 1) GAAGATGGTGATGGGATTTC (서열번호 2)
LGR5 TGCTCTTCACCAACTGCATC (서열번호 3) CTCAGGCTCACCAGATCCTC (서열번호 4)
CD44 CCAGAAGGAACAGTGGTTTGGC (서열번호 5) ACTGTCCTCTGGGCTTGGTGTT (서열번호 6)
SOX9 GTACCCGCACTTGCACAAC (서열번호 7) TCTCGCTCTCGTTCAGAAGTC (서열번호 8)
LRIG1 GACCCTTTCTGACCGACAA (서열번호 9) CGCTTTCCACGGCTCTTT (서열번호 10)
LYZ AAAACCCCAGGAGCAGTTAAT (서열번호 11) CAACCCTCTTTGCACAAGCT (서열번호 12)
MKI67 TGACCCTGATGAGAAAGCTCAA (서열번호 13) CCCTGAGCAACACTGTCTTTT (서열번호 14)
AXIN2 GAGTGGACTTGTGCCGACTTCA (서열번호 15) GGTGGCTGGTGCAAAGACATAG (서열번호 16)
CTNNB TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA (서열번호 17) TGGGCACCAATATCAAGTCCAA (서열번호 18)
ASCL2 CGTGAAGCTGGTGAACTTGG (서열번호 19) GGATGTACTCCACGGCTGAG (서열번호 20)
OLFM4 ACCTTTCCCGTGGACAGAGT (서열번호 21) TGGACATATTCCCTCACTTTGGA (서열번호 22)
VIL1 AGCCAGATCACTGCTGAGGT (서열번호 23) TGGACAGGTGTTCCTCCTTC (서열번호 24)
ECAD GTCACTGACACCAACGATAATCCT (서열번호 25) TTTCAGTGTGGTGATTACGACGTTA (서열번호 26)
FABP1 GGAGGAATGTGAGCTGGAGACA (서열번호 27) TATGTCGCCGTTGAGTTCGGTC (서열번호 28)
KRT20 TGGCCTACACAAGCATCTGG (서열번호 29) TAACTGGCTGCTGTAACGGG (서열번호 30)
LCT GGCAGTCTGGGAGTTTTAGG (서열번호 31) ATGCCAAAATGAGGCAAGTC (서열번호 32)
MUC2 TGTAGGCATCGCTCTTCTCA (서열번호 33) GACACCATCTACCTCACCCG (서열번호 34)
CHGA TGACCTCAACGATGCATTTC (서열번호 35) CTGTCCTGGCTCTTCTGCTC (서열번호 36)
AKR1B15 GAGGACCTGTTCATCGTCAGCA (서열번호 37) CGTCCAGATAGCTCAGCTTCAG (서열번호 38)
DHRS11 CACCAGTGGTTGGAAGGACATG (서열번호 39) CATCGTCCACATTCCGCTCCTT (서열번호 40)
GALNT4 GTCAAGAAGGCTCTCAGACCTC (서열번호 41) GTTCATCCTCGTTGAGCTGGAG (서열번호 42)
GALNT5 CCAGTGGATAGAGCCATTGAAGA (서열번호 43) TCTCAGGAGAGTGGACCACACT (서열번호 44)
DHRS3 GGGCACTGAGTGCCATTACTTC (서열번호 45) CGGCATTGTTCACCAGGATGGT (서열번호 46)
RDH10 GGCATCACCTTCTGGAATGTCC (서열번호 47) CCAGCATCGTAGGAAGAAAAGCC (서열번호 48)
AADAC CGGTATTTCTGGAGATAGTGCAG (서열번호 49) TCAAGAGGCTGAAGGGCAGGAT (서열번호 50)
NR1I2 GCTGTCCTACTGCTTGGAAGAC (서열번호 51) CTGCATCAGCACATACTCCTCC (서열번호 52)
SULTE1 CTGCATCAGCACATACTCCTCC (서열번호 53) CCAGGATTTGGATGACCAGCCA (서열번호 54)
DUOX2 CCAGGATTTGGATGACCAGCCA (서열번호 55) GTCCTTGGAGAGGAAGCCATTC (서열번호 56)
SLC6A20 CAGCGAGATGTTCCCGCAAATC (서열번호 57) GCCTCTGTGTAGACGATGAATGC (서열번호 58)
SLC43A1 GATGCTGGAGTACCTTGTGACTG (서열번호 59) CAGGTGAGAAGGCACAACAGCT (서열번호 60)
DPP4 CAAATTGAAGCAGCCAGACA (서열번호 61) GGAGTTGGGAGACCCATGTA (서열번호 62)
DEFA5 CCTTTGCAGGAAATGGACTC (서열번호 63) GGACTCACGGGTAGCACAAC (서열번호 64)
ZO-1 TGTGAGTCCTTCAGCTGTGGAA (서열번호 65) GGAACTCAACACACCATTG (서열번호 66)
OCLD CATTGCCATCTTTGCCTGTG (서열번호 67) AGCCATAACCATAGCCATAGC (서열번호 68)
CLDN1 CCCAGTCAATGCCAGGTACG (서열번호 69) GGGCCTTGGTGTTGGGTAAG (서열번호 70)
CLDN3 CAGGCTACGACCGCAAGGAC (서열번호 71) GGTGGTGGTGGTGGTGTTGG (서열번호 72)
CLDN5 GCAGCCCCTGTGAAGATTGA (서열번호 73) GTCTCTGGCAAAAAGCGGTG (서열번호 74)
ACE2 TCCATTGGTCTTCTGTCACCCG (서열번호 75) AGACCATCCACCTCCACTTCTC (서열번호 76)
PTGES GAGGATGCCCTGAGACACGGA (서열번호 77) CCAGAAAGGAGTAGACGAAGCC (서열번호 78)
PTGER1 ATGGTGGTGTCGTGCATCT (서열번호 79) CGCTGCAGGGAGGTAGAG (서열번호 80)
PTGER2 CCACCTCATTCTCCTGGCTA (서열번호 81) AGGTCCCATTTTTCCTTTCG (서열번호 82)
PTGER3 ATCATGTGCGTGCTGTCG (서열번호 83) TGCAGTGCTCAACTGATGTCT (서열번호 84)
PTGER4 CTCCCTGGTGGTGCTCAT (서열번호 85) GGCTGATATAACTGGTTGACGA (서열번호 86)
N gene GACCCCAAA ATCAGCGAAAT (서열번호 87) TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG (서열번호 88)
E gene AGCAGTACGCACACAATCG (서열번호 89) TTCGGAAGAGACAGGTACGTTA (서열번호 90)
RdRP CTCCTCTAGTGGCGGCTATT (서열번호 91) AGAATAGAGCTCGCACCGTA (서열번호 92)
실험예 10. 세포 및 조직 면역형광검사
공지된 방법에 따라 면역형광검사를 수행하였다 (Kwak et al., Biochemical and biophysical research communications 457, 554-560, 2015). 구체적으로, 2차원 장 줄기세포 집합체와 분화된 장 상피세포 또는 장 조직을 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다.
분화된 장 상피세포 또는 장 조직을 수크로오스로 동결 보호한 뒤, Insert well의 membrane을 절단하여 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Sakura Finetek, Tokyo, Japan)에 수직으로 넣은 후 동결시켰다. 이후, -20℃에서 크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 냉동 절편을 10μm로 절단하고, 면역형광검사를 위해 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다.
이후, 4% BSA로 블로킹 후 세포를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체와 반응시켰다. 그리고 나서, 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 사용된 일차 항체는 표 2와 같다. DAPI는 핵을 시각화하기 위해 추가하였다. 슬라이드는 EVOS FL Auto2 (ThermoFisher)와 Axiovert 200M 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 또는 형광 현미경(IX51, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti-LDHB PA5-96736 Thermo Scientific 1:200 for IF
anti-EIF3E NBP1-84869 NOVUS 1:100 for IF
anti-SOX9 sc-166505 Santa Cruz 1:100 for IF
anti-KI67 556003 BD 1:100 for IF
anti-CD44 ab6124 abcam 1:200 for IF
anti-KRT20 ab76126 abcam 1:100 for IF
anti-Villin1 sc-7672 Santa Cruz 1:50 for IF
anti-Mucin2 sc-7314 Santa Cruz 1:50 for IF
anti-Lysozyme ab76784 abcam 1:200 for IF
anti-Chromogranin A MA5-14536 Thermo Scientific 1:100 for IF
anti-ECAD AF648 R&D systems 1:200 for IF
anti-FABP1 13368 Cell signaling Technology 1:100 for IF
anti-Cytokeratin Pure CAM 5.2 349205 BD Biosciences 25 μg/mL for IF
anti-ACE2 AF933 R&D systems 1:100 for IF
실험예 11. Single cell RNA 시퀀싱
2차원 장 줄기세포 집합체를 PBS(Sigma-aldrich)로 2-3회 세척한 후 0.25% TE(Invitrogen)를 넣고 10분 이상 충분한 시간을 주어 세포를 떼어낸 후 40 μm cell strainer(BD Bioscience)를 이용하여 단일세포로 분리해주었다. 0.04% BSA가 포함된 PBS로 희석해준 후 CountessIII cell counter(Thermo Scientific. Inc.)를 이용하여 세포수와 생존율을 측정해주었다. 전사체 라이브러리 구축을 위해 Chromium Next GEM Single Cell 3' reagent kit v3.1(10X Genomics)를 이용하였다. 간단하게 요약하여, 세포들을 Chromium Next GEM Chip G에 희석하여 약 5,000개의 단일세포의 전사체 라이브러리를 만들어 주었고, 이후 Novaseq 6000 sequencer(Illumina)를 이용하여 대략 세포 당 60,000 개의 염기서열을 분석하였다.
실험예 12. RNA 시퀀싱 및 RNA 정량
RNA 염기순서 결정과 정량을 위해 우선 RNA 샘플은 Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, USA)을 통해 RNA Integrity Number (RIN) 값이 7.5 이상으로 준비되었으며, mRNA 라이브러리는 Illumina TruSeq 키트를 통해 준비되었다. Illumina HiSeq2500 machines (Illumina, San Diego, CA, USA)을 통해 시퀀싱을 수행하였다. FastQC package를 통해 시퀀싱 퀄러티를 결정하고, 트림된 길이(trimmed read length)가 50염기 이하는 제외하였다. 그 후 HISAT2 (v2.0.5)를 통해 맵핑을 수행하였고, 인간 유전체 정보는 hg19를 활용하였다. Cuffquant와 Cuffnorm (Cufflinks v2.2.1)를 통해 샘플간 차별적으로 발현된 유전자 (DEG: differentially expressed gene)를 분석하였다.
실험예 13. 생물정보학적 분석
단일세포 전사체 시퀀싱 결과 분석을 위해 10X Genomics software CellRanger(version 3.1)을 사용하여 초기 데이터를 처리하고 유전자 발현 매트릭스를 구축하였다. 더불어 전사체 비교 분석을 위해 참고문헌(Elmentaite et al. 2020)에 보고된 태아와 성인 장 상피 조직 단일세포 전사체 분석 결과를 사용하였다. 통합 데이터를 Scanpy package v1.8을 이용하여 normalization & feature selection을 진행하였고, 1차 가공된 데이터를 이용하여 clustering 및 cell type annotation을 해주었다. 이후 spearman's correlation을 이용하여 data integration해주었고, 각 세포 별 구성 비율을 계산하였다.
생물정보학적 분석은 IPA 분석 소프트웨어(Ingenuity systems, Redwood City, CA, USA), PANTHER(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, http://www.pantherdb.org) 데이터베이스 및 DAVID 생물정보학 리소스 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 진행하였다. 기능적으로 그룹화된 유전자 온톨로지(GO)/경로는 ClueGO plug-in (Version 2.2.5, http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)와 함께 사이토스케이프 소프트웨어 플랫폼(Cytoscape software platform, version 3.3.0, http://www.cytoscape.org/what_is_cytoscape.html)을 사용하여 분석하였다.
실험예 14. 렌티바이러스 감염(Lentivirus infectin)을 통한 형광단백질 발현 세포주 제작
형광단백질(Green fluorescence protein; eGFP)을 발현하는 장 줄기세포주 제작을 위하여 GeneCopoeia(MD, USA)에서 EF-1α-Gene X-IRES2-EGFP-IRES-Puro를 발현하여 lentivirus를 구입하였다. 대략 2-4X105 개의 2차원 장 줄기세포를 lentivirus와 8 μg/ml의 polybrene이 포함된 배지에 서 2,500 rpm, 90분 간 원심분리해준 후, 추가 배지를 넣고 48시간 동안 배양해 주었다. Clonal selection을 위해 1 μg/ml의 puromycin이 포함된 배양배지에서 형광단백질을 발현하는 콜로니만 남을 때까지 배양해주었다.
단일세포에서 유래된 클론을 확보하기 위해 TE 처리를 통해 단일세포로 분리해준 후, 낮은 밀도로 세포를 플레이팅해주고 콜로니의 사이즈가 일정 사이즈 이상이 될 때까지 배양해 주었다. 콜로니를 통째로 수확하기 위해 Collagenase type IV와 Dispase를 5분 간 혼합처리해 주었고, 파이펫팅을 통해 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 단일 콜로니는 새로운 플레이트로 옮겨 준 뒤 충분한 크기로 자랄 수 있도록 배양해 주었고, 형광 단백질을 발현하는 장 줄기세포주의 분화능을 확인하기 위해 마트리젤 돔 안에서 3차원 오가노이드로 분화시켜주거나 기체-액체 계면배양법을 이용하여 2.5차원 장 상피세포로 분화시켜 주었다.
실험예 15. 대장내시경(Colonoscopy)를 이용한 2차원 장 줄기세포 집합체 이식실험
2차원 장 줄기세포 집합체의 조직재생능 확인을 위해 수컷 NIG 마우스(NOD/SCID deleted IL2Rg gene, 6-12 weeks old; GHBio, Daejeon, Korea)에 hot-EDTA 이용하여 장 상피 손상 모델을 제작하였다. 마우스 1마리 당 1.5X106 개의 2차원 장 줄기세포를 대장내시경 주입기(Image 1 Hub HD H3-Z; D-Light C; Rigid HOPKINS telescope; Karl Storz, Tuttlingen, Germany; and optimised injector; Vetcom, Gwacheon, Korea)를 이용하여 이식해주었다 (마트리젤 이식그룹, n=3; 장 줄기세포 집합체 이식그룹, n=5). 이식 후 Vetbond Tissue Adhesive(3M, MN, USA)를 이용하여 6-12시간 동안 항문을 막아주었다. 이후 0일, 3일, 14일 차에 대장내시경을 이용하여 이식부위를 모니터링하였고, 최종 14일 차에는 재생능 확인을 위해 안락사 된 마우스로부터 장 조직을 분리하였다.
실험예 16. 형광 stereomicroscope를 이용한 조직 분석
손상된 장 상피 조직에 생착한 장 줄기세포를 확인하기 위하여 stereomicroscope(SZX16, Olympus, Japan)을 이용하여 이식 후 14일 된 마우스 장의 bright field 이미지와 형광 이미지를 촬영하였다.
실험예 17. 조직학적(Hematoxylin&Eosin, H&E) 염색 실험
조직병리학적 분석을 위해 장 조직 또는 장 상피세포를 수크로오스로 동결 보호한 뒤, Insert well의 membrane을 절단하여 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Sakura Finetek, Tokyo, Japan)에 수직으로 넣은 후 동결시켰다. 이후, -20℃에서 크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 냉동 절편을 10μm로 절단하고, 슬라이드 글라스에 접착시킨 후, 공고된 방법에 따라 H&E 염색을 진행하였다. 슬라이드는 광학 현미경(BX53F, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
실험예 18. 상피통과 전기저항성(Transepithelial electrical resistance; TEER) 측정 실험
분화된 장 상피세포의 장벽 기능성을 확인하기 위하여 epithelial tissue volt/ohmmeter(EVOM, WPI, FL, USA)를 이용하여 상피통과 전기저항성을 측정하였다. 장 상피세포가 배양되고 있는 트랜스웰의 상/하층부를 모두 PBS로 세척한 후 새롭게 배양배지를 넣어주고 상/하층부에 전극을 하나씩 담가준 후 TEER 값을 측정해 주었다.
실험예 19. SARS-CoV-2 virus 감염 실험
분화된 장 상피세포에 vero 세포에서 생산된 0.01, 0.001 multiplicity of infection(MOI)의 SARS-CoV-2 virus를 1시간 동안 감염시켜주었다. 이후 바이러스를 포함한 배지를 조심스럽게 제거해 준 후 새배양배지를 넣어 72시간 동안 추가배양하였다. 이후 장 상피세포에 감염된 바이러스를 검출하기 위한 RNA 분리 정제를 위해 세포를 수확하였다.
실험예 20. 통계 분석(Statistical analysis)
모든 결과는 평균에 대한 평균±표준오차(s.e.m)로 표현되며, 모든 실험은 최소 3회 반복되었다. P값은 양측 t-검정 또는 단측 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성에 대한 모든 분석은 달리 명시하지 않는 한 대조군과 비교하여 계산하였다.
실시예 1. 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포 집합체 분리 배양
고순도의 장 줄기세포를 쉽고 빠르게 대량 배양할 수 있도록 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포만 분리하여 농축 배양할 수 있는 방법을 새롭게 구축하였다 (도 1). 새롭게 구축한 장 줄기세포 배양 기술은 장 줄기세포 집합체를 feeder 세포 위 또는 1% 마트리젤이 코팅된 접시 위에서 2차원 배양이 가능하며, 다양한 종류의 전분화능 줄기세포주 유래 3차원 장관 오가노이드로부터 장 줄기세포만 분리 배양이 가능하다 (도 2 내지 도 3).
장 줄기세포 집합체의 생착률을 최대화하기 위해 다양한 코팅 재료를 이용하여 코팅 테스트를 진행한 결과 1% 마트리젤을 코팅해 주었을 때 가장 높은 생착률을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 다만, 젤라틴, 콜라겐 등을 사용하는 경우에도 우수한 생착률을 나타내어 이종 성분 없이도 장 줄기세포 집합체의 배양을 쉽게 진행할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 2차원 장 줄기세포 집합체 배양의 최적화된 조성의 배양 배지 개발
2차원 장 줄기세포 집합체의 배치간 성능 차이를 최소화하기 위하여 화학적 조성이 불명확한 인자들의 사용을 배제하고, 조성과 용량이 명확한 인자들로 구성된 배양 배지 조성을 새롭게 발굴하기 위한 스크리닝을 수행하였다.
그 결과, WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드가 장 줄기세포 집합체의 생존에 필수적인 역할을 하는 인자들로 확인되었다. 특히, 이들 신호 전달 체계와 관련하여, R-스폰딘 1, PGE2, 및 EGF의 조합이 2차원 장 줄기세포 집합체의 생존을 위해 가장 적합한 인자들의 조합에 해당함이 확인되었다 (도 5 내지 도 6).
위 필수 인자들의 역할을 구체적으로 확인하고자, 각각 인자의 유무에 따른 효과 차이를 보다 구체적으로 검토하였다.
상기 필수인자 중 R-스폰딘 1은 WNT 신호전달체계의 활성화를 통해 2차원 장 줄기세포의 줄기세포능(stemness)과 분열능(proliferation)을 조절하는 것으로 규명되었다 (도 7 내지 도 8),
또한, EGF의 경우 EGF-EGFR 신호 전달 체계 활성화를 통하여 장 줄기세포 집합체의 세포 사멸을 막고, 분열능(proliferation)을 조절하는 것으로 규명되었다 (도 9).
마지막으로 PGE2의 경우 PGE2-EP2/4 신호 전달 체계 활성화를 통하여 장 줄기세포 집합체의 분열능(proliferation)을 조절하는 것으로 규명되었다 (도 10).
실시예 3. 2차원 장 줄기세포 집합체 대량배양을 위한 계대 배양 및 동결 보관법 구축
2차원 장 줄기세포 집합체의 활용성을 높이기 위하여 안정적인 장기배양 및 대량배양, 그리고 동결보관 및 해동이 가능한지 테스트해보았다. 우선 최적화된 배지에서 30회 이상 안정적으로 계대 배양이 가능한 것을 확인할 수 있었고, 세포 손실없이 대량 증식이 가능하였다 (도 11).
한편, 배양 배지 조성인자들 중 필수인자를 제외한 나머지 인자들은 2차원 장 줄기세포 집합체의 생착 및 초기 증식에는 영향을 미치지 않았다. 다만, 장기 계대 배양을 위해서 B27, Noggin, Gastrin, WNT3A, A-83-01, SB202190, N-acetylcysteine, 니코틴아미드와 같은 인자들이 있어야 보다 효율적으로 장기 배양이 이루어지는 것을 확인하였다 (도 12).
추가로, 계대 배양시 세포의 손실을 막기 위해 계대 배양에 중요한 추가 인자 발굴을 수행하였다. 그 결과 Notch 신호전달체계를 활성화시키는 Jagged-1 또는 valproic acid를 추가하거나 ROCK 활성을 억제할 수 있는 Y-27632를 추가하였을 때 계대 배양 효율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 두 신호를 동시에 조절해주었을 때 계대 배양 효율이 최대화되는 것을 확인할 수 있었다 (도 13). 최적화된 조건에서 2차원 장 줄기세포 집합체는 단층으로 구성되어 있으며 생존율 100%를 보이며 안정적으로 배양이 가능한 것으로 확인되었으며 (도 14), 동결보관 및 해동이 가능하며 (도 15(a)) 또한 배치간 차이 없이 장기 계대 배양이 가능한 것으로 확인되었다 (도 15(b)).
실시예 4. 2차원 장 줄기세포 집합체 특성 분석을 위한 단일세포전사체(scRNA-seq) 분석 방법
3차원 장관 오가노이드로부터 분리 배양한 2차원 장 줄기세포 집합체의 특성 분석을 위하여 단일세포 전사체 염기서열 분석을 실시하였고, 전사체 발현 패턴 분석 및 참고문헌에 보고된 선행 연구 결과와 비교 분석을 위한 분석 방법을 새롭게 설계하였다 (도 16).
실시예 5. 단일세포전사체 분석 결과를 이용한 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 특성 및 조성 검증
단일세포 전사체 분석 결과를 기반으로 2차원 장 줄기세포 집합체의 특성을 분석한 결과, 마커 유전자 발현 분석을 기반으로 2차원 장 줄기세포 집합체는 거의 대부분 장 상피세포의 특성을 나타내고 장 기질세포의 특성을 나타내는 세포는 거의 없는 것으로 확인되었다 (도 17). 이러한 특성을 나타내는 2차원 장 줄기세포 집합체는 참고문헌에 보고된 발달 단계별 인간의 장 상피조직의 단일세포 전사체 분석 결과들과 비교해 보았을 때 인간의 태아의 장 상피와 가장 유사한 특성을 나타내었다 (도 18).
그리고, 2차원 장 줄기세포 집합체를 구성하고 있는 세포들은 장 상피세포의 특성을 나타내는 세포들 중에서도 주로 줄기세포와 전구체 세포로 구성된 것을 확인할 수 있었으며, 전체세포 중 90% 이상의 세포가 줄기세포 및 전구체 세포인 것을 확인하였다 (도 19). 참고문헌의 태아의 장 상피 조직의 단일세포 전사체 분석 결과와 비교 분석을 해 보았을 때도 대부분의 세포가 장 줄기세포 및 전구체 세포가 분포하는 그룹에 분포하는 것을 확인하였다 (도 20).
뿐만 아니라, 장 줄기세포 및 전구체 세포의 마커로 알려진 마커 유전자(LDHB, EIF3E, SOX9, SHH)의 발현 분포를 확인한 결과 거의 대부분의 세포에서 모든 마커의 유전자가 발현되는 것을 확인함으로써 2차원 장 줄기세포 집합체는 대부분 장 줄기세포 또는 전구체 세포의 특성을 나타내는 것을 검증하였다 (도 21).
실시예 6. 면역형광염색법을 이용한 2차원 장 줄기세포 집합체의 세포 조성 검증
2차원 장 줄기세포 집합체의 특성을 확인하기 위하여 면역형광염색법을 이용하여 세포 조성을 확인해본 결과 대부분의 세포에서 장 줄기세포 및 전구체 세포의 마커 단백질인(LDHB, EIF3E, SOX9)이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 그중 일부 세포들이 활발하게 분열(KI67+ 세포)하고 있는 것을 확인하였다 (도 22(a)). 반면, 일부세포에서 분화세포 중 흡수세포의 마커 단백질(FABP1)이 발현되는 것을 확인할 수 있었지만 분비세포의 마커 단백질(MUC2, CHGA)은 전혀 관측되지 않는 것을 확인하였다 (도 22(a)내지 (b)).
본 결과를 통해 2차원 장 줄기세포 집합체는 다수의 줄기세포 및 전구체 세포로 대부분 구성되고, 극히 일부의 분화세포가 존재하는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 기체-액체 계면배양법을 이용한 2차원 장 줄기세포 집합체의 장 상피세포로의 분화법
2차원 장 줄기세포 집합체로부터 기능성 높은 장 상피세포로 분화시키기 위해 기체-액체 계면배양법을 이용한 분화법을 새롭게 구축하였다 (도 23). 이때 2차원 장 줄기세포 집합체로부터 장 상피세포로의 분화를 최적화하기 위한 최적의 배지를 구성해주기 위한 배지 인자 스크리닝을 실시하였고, 필수구성인자 5종을 발굴하여 최소 배지 조성을 찾을 수 있었다 (도 24).
구체적으로, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 저해제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 니코틴아미드가 장 상피세포로의 분화에 필수 구성인자에 해당함을 확인하였다. 특히, R-스폰딘 1, EGF, PGE2, SB202190 및 니코틴아미드의 처리는 장 상피세포로의 분화에 우수한 효과를 나타내는 필수 인자로 확인되었고 이를 최소 배지 조성으로 사용하였다.
상기 확인된 최소배지에서 장 상피세포로 분화시켰을 때 2차원 장 줄기세포 집합체 배양 배지에서 분화시켰을 때와 유사하게 분화가 일어나는 것을 확인하였다. 구체적으로, 다양한 종류의 전분화능 세포주로부터 유래된 2차원 장 줄기세포 집합체가 모두 성공적으로 장 상피세포로 분화되는 것을 확인하였다 (도 25).
실시예 8. 마커 유전자 발현 분석을 통한 장 상피세포 특성 분석법
기체-액체 계면배양법에 의해 분화된 장 상피세포의 특성 분석을 위해 장 줄기세포와 상피세포 특이적으로 발현되는 마커 유전자의 발현 양상을 확인해보았다. qPCR을 통해 장 상피세포의 유전자 발현을 탐색해 보았을 때, 일부 줄기세포 마커 유전자는 발현이 떨어지고, 대부분의 분화세포 마커 유전자의 발현량은 증가하는 것을 확인하였다 (도 26).
또한, 장 상피세포로 분화 후 4일, 8일, 12일 차에 세포를 회수하여 단면 형태 및 마커 단백질의 발현 양상을 확인한 결과, 시간이 지남에 따라 장 상피세포의 단면에서 크립트-융모(crypt-villus)와 유사한 구조가 발달되며 장 상피의 높이가 높아지는 것을 확인하였다 (도 27(a) 내지 (b)). 동시에, 장 상피세포가 시간이 지나면서 점차 발달함에 따라 분화세포의 마커 단백질의 발현량이 비례하여 점차 증가하는 것을 확인하였다 (도 27(a)). 이렇듯 장 상피세포의 분화도가 시간에 지남에 따라 증가하면서 장 상피세포의 장벽 기능성 또한 지속적으로 증가하는 것을 TEER 값 측정을 통해 확인해주었다 (도 27(c)). 따라서, 기체-액체 계면배양법에 의해 장 줄기세포 집합체가 장 상피세포로 성공적으로 분화되는 것을 확인하였다.
실시예 9. 다양한 장 상피세포들의 전사체 비교 분석을 통한 장 줄기세포 집합체 및 장 상피세포의 특성 분석
전분화능 줄기세포와 그로부터 유래된 3차원 장관 오가노이드, 기능성 장 상피세포, 실제 인간 장 조직의 전사체와 발현패턴을 비교분석해 보았을 때 2차원 장 줄기세포 집합체는 다른 세포들과는 별개로 상이한 특성을 보이는 세포로 분리되는 것을 확인하였다 (도 28). 하지만, 기체-액체 계면배양법을 이용해 장 상피세포로 분화시켜 주었을 때 다른 장 상피세포들과 유사한 쪽으로 전사체 발현양상이 변화하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 기능성 장 상피세포와 가장 가까이 그룹화되는 것을 확인할 수 있었다 (도 28). 이때, 2차원 장 줄기세포 집합체와 장 상피세포 사이에서 발현량의 차이가 가장 큰 유전자 그룹을 확인해 보았을 때 2차원 장 줄기세포 집합체의 경우 세포 분열과 관련된 유전자의 발현이 높고, 장 상피세포는 대사관련 유전자의 발현이 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 29). 이러한 결과를 통해 2차원 장 줄기세포 집합체는 세포 분열을 활발하게 하는 줄기세포의 특성을 나타내며, 장 상피세포가 다양한 영양분이나 물질을 대사하는 기능을 지닌 분화세포로 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 10. 렌티바이러스를 이용하여 형광단백질을 발현하는 장 줄기세포주 개발
2차원 장 줄기세포 집합체의 다양한 활용성을 확인해보기 위해 외부유전자 도입을 통한 유전자 편집된 세포주 제작이 가능한지 확인해보았다 (도 30). 우선 외부유전자 도입을 위해 형광단백질을 포함하고 있는 렌티바이러스를 2차원 장 줄기세포 집합체에 감염시켜 형광단백질을 2차원 장 줄기세포 집합체로 주입해주었다. 이후 형광단백질을 발현하는 세포만 골라내기 위해 항생제를 이용한 positive selection을 수행하였고, 선별된 세포를 이용하여 단일세포에서 유래된 단일 클론도 제작하였다 (도 31). 제작된 단일 클론의 기능성을 검증하기 위해 마트리젤 돔에서 3차원 오가노이드로 분화시키거나 또는 기체-액체 계면배양법을 이용해 장 상피세포로 분화시킬시 정상세포와 동일하게 분화가 되는 것을 확인하였다 (도 32). 본 결과를 통해 2차원 장 줄기세포 집합체를 이용해 유전자 편집된 세포주 제작이 가능하다는 것을 검증할 수 있었다.
실시예 11. 장 상피 조직 손상 마우스 모델을 이용한 2차원 장 줄기세포 집합체의 재생능 검증 실험
2차원 장 줄기세포 집합체의 세포치료제로서 활용가능성을 검증하기 위하여 hot-EDTA를 이용한 장 상피 조직이 손상된 마우스 모델에 2차원 장 줄기세포 집합체를 이식하는 실험을 수행하였다 (도 33). 2차원 장 줄기세포 집합체를 이식하기 위하여 마우스용 대장내시경을 이용하여 장 줄기세포 집합체를 환부에 이식해 주었고 (도 34), 마트리젤만 이식된 대조군 대비 2차원 장 줄기세포 집합체가 이식된 마우스의 경우 몸무게의 회복 속도가 더 빠르고 생존율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 35 내지 도 36). 대장내시경을 이용하여 이식 전 후 환부를 관측한 결과 2차원 장 줄기세포 집합체를 이식해 주었을 때 환부가 더 빠르게 회복되고 면역반응이 낮은 것을 확인할 수 있었다 (도 37). 이러한 효능은 2차원 장 줄기세포 집합체가 환부에 성공적으로 생착했기 때문이며 (도 38), 손상된 장 조직의 재생을 촉진한 결과이다 (도 39). 따라서, 2차원 장 줄기세포 집합체는 손상된 장 상피조직에 이식해 주었을 때 환부를 효과적으로 재생시킬 수 있으므로 장 상피조직 재생치료를 위한 세포치료제로 활용가능한 생체재료임을 확인하였다.
실시예 12. 2.5차원 장 상피세포 모델을 이용한 SARS-CoV-2 감염병 모델링
2차원 장 줄기세포 집합체에서 유래된 2.5차원 장 상피세포의 활용성을 검증하기 위하여 SARS-CoV-2 virus를 이용한 감염병 질환 모델링을 수행하였다 (도 40). 장 상피세포의 성숙도에 따른 SARS-CoV-2 virus 감염 민감성에 차이가 있는지 확인하기 위해 미성숙/성숙 3차원 장관 오가노이드로부터 2차원 장 줄기세포 집합체를 분리하였고, 기체-액체 계면배양법을 이용하여 미성숙/성숙 장 상피세포를 제작하였다. 기체-액체 계면배양법 실시 후 10일 동안 세포의 형태를 모니터링한 결과 미성숙과 성숙 장 상피세포 사이에 차이점을 확인할 수 없었지만 (도 41), 성숙도 관련 마커 유전자의 발현에는 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다 (도 42).
특히, SARS-CoV-2 virus 감염에 중요한 수용체 중 ACE2의 발현량이 성숙 장 상피세포에서 더 높은 것을 확인하였고 (도 43), 이로 인해 SARS-CoV-2의 감염이 성숙 장 상피세포에서 더 민감하게 감염되는 것을 확인할 수 있었다 (도 44).
이러한 결과를 바탕으로 2차원 장 줄기세포 집합체 유래 2.5차원 장 상피세포는 감염병을 포함하는 다양한 질환 모델링을 위한 세포 모델로 활용 가능하다는 것을 확인하였다.

Claims (35)

  1. (a) 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하는 단계; 를 포함하는, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, WNT/R-스폰딘 활성제는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 및 R-스폰딘 모방물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제는 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2) 및 프로스타글란딘 D2(PGD2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수용체 타이로신 키나제 리간드는 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양 배지는 B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC), 니코틴아미드, Gastrin, TGF-베타 억제제, Wnt 신호전달경로 활성화제, BMP 억제제 및 p38 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  6. 제5항에 있어서, TGF-베타 억제제는 A-83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 및 SJN-251로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  7. 제5항에 있어서, Wnt 신호전달경로 활성화제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  8. 제5항에 있어서, BMP 억제제는 노긴(Noggin), Dorsomorphin, DMH1, 또는 LDN-193189인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  9. 제5항에 있어서, p38 저해제는 SB202190, SB203580, SB239063, SB706504, BIR796, JX401, EO1428, RWJ67657, SCIO469, VX745, TAK715, ML3403, DBM1285 및 PH797804로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양 배지는 배양 초기 ROCK 억제제, Notch 활성제 또는 이들 모두를 더 포함하는 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), Ham's F12, DMEM/F12, DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  12. 제1항에 있어서, 장 줄기세포 집합체는 LGR5, CD44, SOX9, LRIG1, LYZ, AXIN2, CTNNB 및 MKI67으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커에 대하여 증진된 발현 수준을 나타내는 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  13. 제1항에 있어서, 장 줄기세포 집합체는 LDHB, EIF3E, SOX9 및 SHH로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커가 발현되는 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  14. 제1항에 있어서, 장 줄기세포 집합체는 집합체 총 세포에 대하여 S phase 세포, LGR5+ 줄기세포 및 초기 Enterocyte를 포함한 세포가 80% 이상인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  15. 제1항에 있어서, 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드는
    (a) 전분화능 줄기세포를 Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, Wnt3a, CHIR99021 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 definitive endoderm으로 분화시키는 단계;
    (b) definitive endoderm를 BIO(6-브로모인디루'-3'-옥심), SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), GSK-3β 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), L803-mts(Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 CHIR99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 GSK3 억제제; 및 섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF)를 포함한 배지에서 배양하여 3차원 Hindgut 스페로이드로 분화시키는 단계; 및
    (c) 3차원 Hindgut 스페로이드를 BMP 억제제; WNT/R-스폰딘 활성제; 수용체 타이로신 키나제 리간드; 및 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1β, IL-11, EGF, OSM, NRG-1, IL-10 및 콜리베린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 3차원 장관 오가노이드를 제조하는 단계; 를 거쳐 제조된 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 배지는 ROCK 억제제, B27, N-Acetyl-L-cysteine(NAC), N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1β, bFGF, A-83-01 및 SB202190로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  17. 제1항에 있어서, 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계는 EDTA, 트립신 또는 이들 모두로 처리되어 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 해리되는 것인, 장 줄기세포 집합체의 배양 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 배양 방법으로 제조된 장 줄기세포 집합체.
  19. (a) 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장관 오가노이드를 단일세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계;
    (b) 상기 단일세포 또는 작은 세포 덩어리를 WNT/R-스폰딘 활성제, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함하는 배양 배지에서 2차원 배양하여 장 줄기세포 집합체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 장 줄기세포 집합체를 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 저해제, WNT/R-스폰딘 활성제 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 배지에서 기체-액체 계면배양법으로 배양하는 단계; 를 포함하는, 장 상피세포의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 기체-액체 계면배양법은 세포외 기질이 코팅된 트랜스웰 하에 장 줄기세포를 배양하는 것인, 장 상피세포의 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서, WNT/R-스폰딘 활성제는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 및 R-스폰딘 모방물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 장 상피세포의 제조 방법.
  22. 제19항에 있어서, 프로스타글란딘 신호전달경로의 활성제는 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2) 및 프로스타글란딘 D2(PGD2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 장 상피세포의 제조 방법.
  23. 제19항에 있어서, 수용체 타이로신 키나제 리간드는 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 상피세포의 제조 방법.
  24. 제19항에 있어서, p38 저해제는 SB202190, SB203580, SB239063, SB706504, BIR796, JX401, EO1428, RWJ67657, SCIO469, VX745, TAK715, ML3403, DBM1285 및 PH797804로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 장 상피세포의 제조 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 장 상피세포는 VIL1, ECAD, FABP1, KRT20, LCT, LYZ 및 MUC2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커에 대하여 증진된 발현 수준을 나타내는 것인, 장 상피세포의 제조 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 장 상피세포는 AKR1B15, DHRS11, GALNT4, GALNT5, DHRS3, RDH10, AADAC, NR1I2, SULTE1, DOUX2, FABP1, SLC6A20, SLC43A1 및 CLDN3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커에 대하여 증진된 발현 수준을 나타내는 것인, 장 상피세포의 제조 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 장 상피세포는 소장세포, 점액 분비세포, 호르몬 분비세포 및 파네스 세포를 포함하는 것인, 장 상피세포의 제조 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법으로 제조된 장 상피세포.
  29. 제28항에 따른 장 상피세포를 포함하는 장 상피세포 모델.
  30. 제29항에 있어서, 상기 장 상피세포 모델은 crypt-villus 구조를 가지는 것인 장 상피세포 모델.
  31. (a) 제29항에 따른 장 상피세포 모델에 박테리아 또는 바이러스를 감염시키는 단계;
    (b) 감염된 장 상피세포 모델에 약물을 처리하는 단계; 및
    (c) 약물 처리에 따른 반응을 확인하는 단계; 를 포함하는 약물 스크리닝 방법.
  32. (a) 제29항에 따른 장 상피세포 모델에 약물을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 장 상피세포 모델에서 약물의 흡수도 또는 생체 이용률을 평가하는 단계를 포함하는 약물 평가 방법.
  33. 제29항에 따른 장 상피세포 모델에 박테리아 또는 바이러스를 감염시키는 단계를 포함하는 질환 모델링을 위한 장 상피세포 모델 제공 방법.
  34. 제18항에 따른 장 줄기세포 집합체를 포함하는 조직 치료제.
  35. 제18항에 따른 장 줄기세포 집합체를 포함하는 장 이식 보조용 약학 조성물.

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