KR20200056870A

KR20200056870A - 3차원 오가노이드의 2차원 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200056870A
Application number: KR1020180141128A
Authority: KR
Inventors: 유종만; 김미선; 신현수; 한수정
Original assignee: 오가노이드사이언스 주식회사
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2020-05-25
Also published as: KR102416094B1; KR20210119939A; KR102416094B9

Abstract

3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하기 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 3차원으로 배양된 오가노이드의 감소된 줄기세포능을 유지 및/또는 증진시킬 수 있는바, 세포치료제 또는 재생의학 분야에서 활용될 수 있다.

Description

3차원 오가노이드의 2차원 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도{Medium composition for two-dimensional culture of three-dimensional organoids and uses thereof}

3차원 오가노이드의 2차원 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

오가노이드는 다양한 체내 기관에서 유래하며, 그것들 안에 줄기세포가 포함되어 있어 세포체로 분화할 수 있는 집합체를 형성하기 때문에 일반적으로 소형 유사 장기로 불려진다. 또한 체내 각 기관에서 유래한 오가노이드들은 해당 기관과 매우 유사한 구조로 되어 있어, 세포 및 동물실험을 대체할 수 있는 모델로 사용할 수 있다.

한편, 최근에 재생의학이나 세포치료제로써 오가노이드에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, 재생의학 측면에 있어서 오가노이드의 줄기세포능(stemness)은 중요한 조건이 되는데, 3차원으로 배양한 오가노이드의 경우, 줄기세포능을 유지함에 있어 한계가 있다. 따라서, 보다 높은 줄기세포능을 가지는 오가노이드를 개발할 필요가 있다.

일 양상은 3차원 오가노이드의 2차원 배양을 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 3차원 오가노이드를 단세포로 분리(dissociated)하는 단계; 및 상기 배지 조성물이 포함된 배양하는 단계를 포함하는 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제, Pan-HDAC(Pan-Histonediacetylase) 억제제, Rock(Rho associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제 및 TGF-β(Transforming growth factor- beta) 억제제를 포함하는 배지용 조성물을 제공한다.

일반적으로 3차원으로 배양한 오가노이드는 줄기세포능의 유지가 어렵다는 문제점이 있다. 그러나, 상기 조성물은 3차원으로 배양한 오가노이드에서 감소하는 줄기세포능을 유지 및/또는 강화시킬 수 있는 바, 세포치료제 또는 재생의학 분야에 활용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 오가노이드의 줄기세포는(stemness)를 증진시킬 수 있다.

본 명세서 내 용어 "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통해 제조한 조직과 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는바, 상기 오가노이드는 생체 내에서 상호 작용 하고 있는 장기를 유사하게 모사하여 질병의 치료제 개발 등에 이용될 수 있다.

본 명세서 내 "줄기세포능(stemness)"이란, 자가 재생 및 분화능력을 의미하는 것으로 다른 세포의 모태가 되는 근간이 될 수 있다. 상기 줄기세포능은 줄기능 또는 줄기성과 혼용되어 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 MAPK 인산화 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MAPK 인산화 억제제는 MEK1 또는 MEK2 억제제일 수 있다.

상기 GSK3 억제제는 CHIR99021, LiCl, BIO-아세톡심(BIO-아세톡심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론(Kenpaullone), 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A014418, TCS 21311, TWS 119, BIO-아세톡심, 10Z-하이메니알디신(10Z-Hymenialdisine), GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3β 억제제 XXVI, FRATtide 펩티드, Cdk1/5 억제제, 비키닌(Bikinin) 또는 이들의 조합일 수 있다. GSK3는 모든 세포에서 상시 활성 형태로 존재하는 다기능의 단백질 세린/트리오닌 키나제(serine/threonin kinase)이지만, 특히 뇌에서 더 높은 활성을 보인다. GSK-3는 세포 증식, 줄기세포 재생, 세포자멸사 및 세포 발달에 중요한 많은 신호경로를 통해 수많은 세포 과정들(cellular processes)을 조절한다. 따라서 GSK 억제제는 염증매개 물질을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 줄기세포의 미분화성을 유지하도록 할 수 있다. 상기 GSK3 억제제는 0.1 μM 내지 10 nM의 농도로 포함될 수 있다. 예를 들어, 0.1 μM 내지 100 nM, 1 μM 내지 100 nM, 3 μM 내지 50 nM, 5 μM 내지 50 nM, 5 μM 내지 30 nM, 5 μM 내지 20 nM, 10 μM 내지 25 nM, 또는 100 μM 내지 15 nM의 농도 로 포함될 수 있다. 이때 GSK 억제제의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 줄기세포의 미분화성을 유지 효과를 충분히 나타낼 수 없으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 독성 등의 문제가 발생할 수 있다.

또한, 상기 Pan-HDAC 억제제는 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산, SBHA 또는 이들의 조합일 수 있다. HDAC는 암 발병 및 진행에 중요한 역할을 한다. 따라서, pan-HDAC 억제제는 항암 유전자의 발현을 증가시켜 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 상기 Pan-HDAC 억제제는 0.1 mM 내지 4 mM의 농도로 포함될 수 있다. 예를 들어, 0.1 mM 내지 4 mM, 0.5 mM 내지 4 mM, 0.7 mM 내지 4 mM, 1 mM 내지 4 mM,1 mM 내지 3 mM, 0.1 mM 내지 1 mM, 또는 0.1 mM 내지 0.5 mM로 포함될 수 있다. 이때, Pan-HDAC의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 종양 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 없다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 독성 등의 문제가 발생할 수 있다.

또한, 상기 Rock 억제제는 Y-27632, 티아조비빈(Thiazovivin), 파수딜(Fasudil) (HA-1077), HCl 또는 GSK429286A일 수 있다. ROCK은 자가면역 및 염증에 관여하는 몇몇 신호 경로에서 작용하며, TNF 및 기타 염증성 사이토카인의 생성을 야기하는 중요한 분자인 NK-κB의 활성화에서 부분적인 역할을 한다. 따라서, ROCK 억제제는 지질다당류(LPS)-자극 THP-1 대식세포에서 TNF-α 및 IL-6 생성에 관여한다. 상기 Rock 억제제는 5 μM 내지 350 nM, 10 μM 내지 320 nM, 50 μM 내지 300 nM, 100 μM 내지 250 nM, 150 μM 내지 200 nM, 또는 140 nM 내지 300 nM의 농도로 포함될 수 있다. 이때, Rock 억제제가 상기 범위 미만인 경우, TNF-α 및 IL-6를 충분히 생성할 수 없다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 독성 등의 문제가 발생할 수 있다.

또한, 상기 TGF-

억제제는 A83-01, SD-208, GW788388, 랩삭스(RepSox), LY2109761, SB505124, 갈루니서팁(Galunisertib), 백토서팁(Vactosertib), LY364947 또는 SB525334일 수 있다. TGF-

는 상피세포, 혈관내피세포, 림프구, 혈구세포 등의 증식을 억제하여 세포 자살을 유도한다. 따라서, TGF-

억제제는 TGF-

매개된 효과를 억제하여 세포의 신호전달 및 다른 면역 세포에 대한 활성을 억제할 수 있다. 상기 TGF-

억제제는 10 nM 내지 10μM, 10 nM 내지 8 μM, 20 nM 내지 6 μM, 30 nM 내지 5 μM, 50 nM 내지 5 μM, 또는 45 nM의 농도로 포함될 수 있다. 이때, TGF-

억제제의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 신호전달 및 면역 세포 활성 억제 효과를 충분히 나타낼 수 없다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 독성 등의 문제가 발생할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 GSK3 억제제, pan-HDAC 억제제, Rock 억제제 및 TGF-β 억제제를 각각 10 nM, 0.4 mM, 140 nM 내지 300 nM 및 45 nM의 농도로 포함할 수 있다.

다른 양상은 3차원 오가노이드를 단세포로 해리(dissociation)하는 단계; 및 상기 조성물이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법을 제공한다.

일 구체예에 따른 방법은 3차원 오가노이드를 단세포로 해리하는 단계를 포함한다. 상기 3차원 오가노이드는 개체에서 유래한 다양한 조직을 3차원으로 배양한 것일 수 있다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 포유동물인 것일 수 있고, 예를 들어 예를 들면 인간 (Homo sapiens)일 수 있다. 또한, 상기 조직은 오가노이드를 제조하기 위하여 개체의 다양한 기관으로부터 유래된 것일 수 있으며 예를 들어, 대장, 간, 소장, 췌장 등일 수 있다.

일 구체예에 따른 방법은 상기 조성물이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법을 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 배지는 PBS 및 마트리겔 혼합물이 코팅된 것일 수 있다. 상기 마트리겔은 오가노이드 배양에서 세포외기질의 역할을 하는 콜라겐, 라미닌, 앤탁틴(entactin) 등이 포함되어 있다. 상기 PBS 및 마트리겔은 1:99 내지 99:1의 비율로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 1:99 내지 99:1, 1:80 내지 80:1, 1:70 내지 70:1, 1:50 내지 50:1, 1:30 내지 30:1, 1:20 내지 20:1, 또는 1:10의 비율로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 방법으로 배양된 오가노이드를 3차원 형상이 되도록 추가로 배양하는 방법을 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 배지 조성물은 3차원 오가노이드의 줄기세포능을 유지 및/또는 강화할 수 있도록 하였는바, 상기 배지에서 배양한 3차원 오가노이드를 재생의학이나 세포치료제로 활용할 수 있다. 또한, 상기 조성물을 이용한 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법은 일반적인 방법에 의해 배양된 오가노이드의 줄기세포능을 유지하기 위해 소요되는 비용을 감소시킬 수 있으므로 임상적 측면에 보다 효과적인 접근이 용이하다. 또한, 오가노이드 배양에서 세포외기질의 역할을 하는 마트리겔의 사용을 1/10로 감소시킬 수 있으므로 비용 절감이 가능하다.

도 1은 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2a~도 2f는 마우스 장 유래 오가노이드를 CV- 및 4개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3a~도 3d는 마우스 관 유래 간 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4a~도4 d는 인체 관 유래 췌장 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5a~도 5d는 인체 소장 유래 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6a~도 6e는 4개의 화합물이 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 미치는 영향을 전형적인 배양 배지를 사용하여 2D 배양 시스템에서 시험한 결과를 나타낸다.
도 7a~도 7e는 CVYA 4개 화합물 외에 추가로 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 영향을 미치는 화합물을 규명하기 위하여 2D 배양 시스템에서 배양한 결과를 나타낸다.
도 8a~도 8g는 3D 배양 시스템에서 5개의 화합물이 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 미치는 영향을 확인하기 위하여 2D 배양 시스템에서 배양한 콜로니를 3D 배양 시스템에 적용하여 배양한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험동물 및 오가노이드의 준비

1-1. 실험동물의 준비

CHA 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 승인되었으며, 동물의 고통을 최소화하고 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 노력하였다. Jackson 연구소 (BarHarbor, ME)에서 Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 마우스를 얻었고 Orient Bio Inc. (성남, 한국)에서 C57Bl 수컷 마우스 6 마리를 얻었다. 동물은 CHA 대학의 동물 시설에서 12시간의 명암주기 동안 유지되었으며, 음식과 물은 자유롭게 사용 하도록 하였다.

1-2. 마우스 소장 오가노이드의 준비

7~9 주령의 생쥐를 대상으로 마우스 소장 오가노이드를 제조한 후 공지된 방법으로 처치(treatment) 하였다. 먼저, 마우스 소장 조직을 상등액이 깨끗해질 때까지 세척하였다. 이후, 상기 조직을 근위부에서 원위부까지 5㎜ 길이의 조각으로 절단하고 가로로 절단하여 개봉한 후 Gentle Cell Dissociation Reagent (StemCell Technologies, Cambridge, MA)로 소장 창자를 분리하였다. 고립된 크립트를 70 ㎛ 세포 여과기로 여과한 후 마트리겔 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)과 1:1의 비율로 혼합하고 48-웰 플레이트에 접종하였다. 마우스의 소장 조직을 하기의 조성을 갖는 배지에서 배양하여 오가노이드를 제조하였다:

Advanced DMEM/F-12 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), HEPES 완충액 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 글루타맥스-Ⅰ보충제(Glutamax-I supplement) (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 페니실린-스트랩토마이신 용액(Penicillin-Streptomycin Solutions) (JBI, Daejeon, Korea), N-아세틸-L-시스테인(N-Acetyl-L-cysteine) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), B-27 무혈청 보충제(B-27 Serum-Free Supplement) (Life Technologies, Gaithersburg, MD), N-2 보충제(N-2 Supplement) (Life Technologies, Gaithersburg, MD), Animal-Free Recombinant Murine EGF (PeproTech, Rocky Hill, NJ), Recombinant Murine Noggin (PeproTech) 및 HA-R-Spondin 1-Fc 293T 세포에서 유래된 R-Spondin-1 조정 배지(conditioned medium) (Cultrex®).

1-3. 마우스 간 관(liver duct)의 준비

공지된 방법에 따라 마우스 간 조직을 5㎜ 조각으로 절단한 후 세척 완충액(FBS (v/v) 1 % 및 페니실린-스트렙토마이신 (v/v) 1 %가 첨가된 DMEM 고-글루코스)으로 세척하였다. 상층액을 제거한 후, 조각을 소화 완충액(콜라게나제 및 디스페아제 II에 0.1㎎/㎖의 DNase I을 함유한 세척 완충액)으로 옮기고 37 ℃ 조건에서 최대 60분 동안 배양하였다. 조직으로부터 관 구조(ductal structure)를 수득한 후, 50ng/㎕ HGF(PeproTech Inc., NJ, USA)가 첨가된 상기 실시예 1-2의 소장 오가노이드 배지에서 배양하여 마우스 관-유래 간 오가노이드를 제조하였다.

1-4. 인간 췌장 관(pancreas duct)의 준비

강남 세브란스 병원에서 62세의 남자 환자를 수술한 후, 수술한 조직 부위 중 완전히 정상적인 영역의 췌장 조직을 수득하였다. 췌장 도관은 공지된 방법으로 처리한 후, 격리시켰다. 3㎝ Х 3㎝ 크기의 조직을 세척 완충액(FBS의 1 % (V/V) 및 페니실린-스트렙토마이신 1 %로 보충된 DMEM 고-글루코스 (V/V))으로 완벽하게 세척 하였다. 조직을 날카로운 외과용 집게 및 가위로 자르고 1 x HEPES, 1 x 글루타맥스, N-아세틸-L-시스테인, 1 x 페니실린/스트렙토마이신, 1 x B-27 보충제, 1 x N-2 보충제를 보충한 Advanced DMEM/F12 배지에 첨가된 1 ㎎/㎖ soybean trypsin inhibitor 및 5 ㎎/㎖ 콜라게나제 II(Sigma, MO, USA)에서 37℃ 중탕냄비에서 1시간 동안 소화시켰다. 소화 후, 총 상등액을 조심스럽게 제거하여 10㎖ 세척 완충제가 들어있는 새로운 50㎖ 튜브로 옮겼다. 관 펠렛을 200 Хg 에서 10분 동안 원심분리한 후 수집하였다. 이후, 펠렛이 손상되지 않도록 주의하면서 상등액을 완전히 제거하였다. 1x HEPES, 1x 글루타맥스, N-아세틸-L-시스테인, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1 B-27 보충제, 30 % Wnt-3a 조정 배지, 5% R-spondin 조정 배지, 100 ng/㎖ Noggin (Prospec, Israel), 50 ng/㎖ EGF (Peprotech, NJ, USA), 10 nM Human-gastrin I (Sigma, MO, USA), 100 ng/㎖ 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor 10, FGF10), 0.5uM A83-01 (Tocris, Bristol, UK), 10 mM Nicotinamide (Sigma, MO, USA), 및 1 μM PGE2 (Tocris, Bristol, UK)을 함유하는 인간 췌장 오가노이드 성장 배지에서 펠렛을 재현탁시켰다. 배지의 펠렛을 GFR 마트리겔 (Corning, NY, USA)과 혼합하고 37 ℃ 배양기에서 10분간 중합시켰다. 인간 췌장 조직을 성장 배지에서 매 2일 마다 배지를 교체하면서 배양하여 오가노이드를 제조하였다.

실시예 2. 3차원 배양 시스템을 기반으로 한 2차원 배양 시스템의 준비

2-1. 배양 배지 조성물의 제조

HEPES buffer, 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Advanced DMEM/F12 배양배지에 5% R-spondin 조정 배지, 100 ng/㎖ Noggin (Prospec, Israel), 50 ng/㎖ EGF (Peprotech, NJ, USA), 3 μM CHIR99021 (C), 2 mM Valproic acid (V), 10 μM Y-27632 (Y) 및 5 μM A83-01 (A)를 혼합하여 CVYA-ENR 배양 배지를 제조하였다. 이후, 10 μM PD98059를 추가로 첨가하여 5 factor 배양 배지를 제조하였다.

2-2. 2차원 배양 시스템의 준비

5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 5~10분간 TrypLE ? (Stemcell Tech., Canada)를 사용하여 상기 실시예 1-2 내지 1-4에서 준비한 3 차원 오가노이드를 단세포 단위까지 분리(dissociated)하였다. 해리된 단일 세포를 마트리겔이 코팅된 플레이트 상에 분주 하였다. 이후, Dulbecco 's phosphate-buffered saline (DPBS, Welgen, Korea)에 10:1의 비율로 희석된 마트리겔로 플레이트를 코팅하였다. 플레이트의 표면을 덮은 후, 2 시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하여 플레이트를 반고체화 하였다. 그런 다음 응고된 웰의 마트리겔을 제거하고 표면을 DPBS로 세척하여 불필요한 잔류 마트리겔 층을 제거하였다. 이후, 상기 단일 세포를 상기 실시예 2-1에서 제조한 배지의 표면에 분주하여 4일 동안 배양하였다.

실시예 3. 2차원 배양 배지 조성물이 오가노이드의 생성에 미치는 효과 확인

상기 실시예 2-2에서 단세포로 해리한 2차원 오가노이드의 2차원 배양 배지 조성물에서의 줄기세포능 증가 효과를 확인하였다. 구체적으로, 중합효소 연쇄반응 및 면역형광법을 사용하여 줄기세포능을 나타내는 유전자의 발현도를 확인하였다. 대조군으로는 상기 실시예 2-1의 화합물이 모두 보충된 ENR-함유 배지를 사용하였다.

3-1. 역전사 효소-중합 효소 연쇄 반응

실시예 3-1에서 준비한 오가노이드에 Cell Recovery Solution (Corning, NY, USA)을 처리하여 마트리겔을 제거하였다. 제조사의 지시에 따라 MagListo ? 5M Cell Total RNA 추출 키트 (Bioneer, 대전, 한국)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이후, PrimeScript ? RT Master Mix (TaKaRa, Japan)를 사용하여 RNA를 cDNA로 합성하였다. SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, Japan)와 cDNA를 혼합하여 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하였다. Thermal Cycler Dice® Real Time System III (Takara, Japan)을 사용하여 mRNA 발현 수준을 측정하였고, MRQ 시스템 (Takara, Japan)을 이용하여 상기 측정된 발현 수준 데이터를 엑스퍼트(export)하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머쌍은 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같다.

서열번호	유전자	프라이머
서열번호 1	mouse Lgr5	정방향	5'- GACGCTGGGTTATTTCAAGTTCAA -3'
서열번호 2	mouse Lgr5	역방향	5'- CAGCCAGCTACCAAATAGGTGCTC -3'
서열번호 3	mouse E-cadherin	정방향	5'- ACCACTGCCCTCGTAATCGAA -3'
서열번호 4	mouse E-cadherin	역방향	5'- CGTCCTGCCAATCCTGATGAA -3'
서열번호 5	mouse Mucin-2	정방향	5'- ATGCCCACCTCCTCAAAGAC -3'
서열번호 6	mouse Mucin-2	역방향	5'- GTAGTTTCCGTTGGAACAGTGAA -3'
서열번호 7	mouse Lysozyme	정방향	5'- GAGACCGAAGCACCGACTATG -3'
서열번호 8	mouse Lysozyme	역방향	5'- CGGTTTTGACATTGTGTTCGC -3'
서열번호 9	mouse Villin-1	정방향	5'- GACGTTTTCACTGCCAATACCA -3'
서열번호 10	mouse Villin-1	역방향	5'- CCCAAGGCCCTAGTGAAGTCTT -3'
서열번호 11	mouse Chromogranin A	정방향	5'- AAGGTGATGAAGTGCGTCCT -3'
서열번호 12	mouse Chromogranin A	역방향	5'- GGTGTCGCAGGATAGAGAGG -3'
서열번호 13	mouse GAPDH	정방향	5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG -3'
서열번호 14	mouse GAPDH	역방향	5'- ACACATTGGGGGTAGGAACA -3'
서열번호 15	mouse Pdx1	정방향	5'- CCCGGACCTTTCCCGAATGG-3'
서열번호 16	mouse Pdx1	역방향	5'- CTCGGGTTCCGCTGTGTAAGC-3'
서열번호 17	mouse Sox9	정방향	5'- CTCCTAATGCTATCTTCAAG-3'
서열번호 18	mouse Sox9	역방향	5'- GCTTCAGATCAACTTTGC-3'
서열번호 19	mouse HNF4	정방향	5'- GCTAAGGCGTGGGTAGGG-3'
서열번호 20	mouse HNF4	역방향	5'- AGGCTGTTGGATGAATTGAGG-3'
서열번호 21	mouse Alb	정방향	5'- GCGCAGATGACAGGGCGGAA-3'
서열번호 22	mouse Alb	역방향	5'- GTGCCGTAGCATGCGGGAGG-3'
서열번호 23	mouse CYP3a11	정방향	5'- TGGTCAAACGCCTCTCCTTGCTG-3'
서열번호 24	mouse CYP3a11	역방향	5'- ACTGGGCCAAAATCCCGCCG-3'

서열번호	유전자	프라이머
서열번호 25	human CK19	정방향	5'- GTCACAGCTGAGCATGAAAG-3'
서열번호 26	human CK19	역방향	5'- TCACTATCAGCTCGCACATC-3'
서열번호 27	human PTF1A	정방향	5'- CCCGGGGGCCTAGACGCCTTTCC-3'
서열번호 28	human PTF1A	역방향	5'- CCGCCAGCAGCTCATCGCCGT-3'
서열번호 29	human Lgr5	정방향	5'-CAGCGTCTTCACCTCCTACC-3'
서열번호 30	human Lgr5	역방향	5'- TGGGAATGTATGTCAGAGCG-3'
서열번호 31	human GAPDH	정방향	5'- GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3'
서열번호 32	human GAPDH	역방향	5'- ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'
서열번호 33	human villin1	정방향	5'- GCAGCATTACCTGCTCTACGTT-3'
서열번호 34	human villin1	역방향	5'- GCTTGATAAGCTGATGCTGTAATTT-3'
서열번호 35	human chromogranin B	정방향	5'- CAGCCAACGCTGCTTCTC-3'
서열번호 36	human chromogranin B	역방향	5'- TGGCATGGAATTGACAGC-3'
서열번호 37	human lysozyme	정방향	5'-CCGCTACTGGTGTAATGATGG-3'
서열번호 38	human lysozyme	역방향	5'- CATCAGCGATGTTATCTTGCAG-3'
서열번호 39	human Muc5AC	정방향	5'- CTTCTCAACGTTTGACGGGAAGC-3'
서열번호 40	human Muc5AC	역방향	5'- CTTGATCACCACCACCGTCTG-3'
서열번호 41	human Muc2	정방향	5'- TGTAGGCATCGCTCTTCTCA-3'
서열번호 42	human Muc2	역방향	5'- GACACCATCTACCTCACCCG-3'

3-2. 면역형광법

4% 파라 포름 알데히드로 상기 실시예 3-1에서 준비한 오가노이드를 고정하여 마트리겔을 분리하였다. PBS 완충액 중 0.1 % Tween-20 및 0.2 % Triton-X100으로 투과를 수행한 후, DPBS 중 5% BSA를 사용하여 비특이적 결합을 감소시켰다. 1차 항체로 샘플을 4℃에서 하룻밤 동안 덮어주고(cover) 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 삽입하였다. 염색에 사용된 1차 항체 및 2차 항체는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

항체	종류
1차	Mucin 2 (Santa Cruz, CA, USA), Ki67 antibody (Abcam, MA, USA), Lgr5 (Abgent, CA, USA), E-cadherin (Santa Cruz, CA, USA), Chromogranin A (Santa Cruz, CA, USA), Lysozyme (Diagnostic Biosystems, Fremont, CA), Sox 9, HNF4, Alb (Santa Cruz, CA, USA), β-catenin (BD Biosciences, NJ, USA), Villin (Santa Cruz, CA, USA)
2차	Alexa Flour 488 conjugated anti-rabbit IgG 및 Alexa Flour 594 conjugated anti-mouse IgG (Life Technologies, Gaithersburg, MD)

3-3. 통계적 분석

분석을 위해 두 그룹 간의 차이점을 Students 't-test로 평가 하였다. 3가지 이상의 실험 그룹을 one-way ANOVA와 Student-Bonferroni post hoc test로 비교 하였다. 그룹 간의 차이는 p <0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

도 2는 마우스 장 유래 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 현미경 추적(microscope tracking)을 통해 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.

도 1에 나타난 바와 같이, CV- 및 CVYA-함유 배지에서 배양한 단리된 소장 세포는 오가노이드와 같이 성장하였다. 또한, 상기 소장 오가노이드의 형태는 ENR-함유 배지에서보다 더 긴 형태를 나타냈다(도 2a). Lgr5+ 오가노이드의 GFP 신호 강도를 Lgr5 발현에 대한 4가지 화합물의 확인 효과와 비교한 결과, CVYA-함유 배지에서의 Lgr5-GFP 강도는 ENR-함유 배지에서보다 더 컸음을 보여 주었다(도 2b 및 도 2c). Lgr5와 lysozyme (Lyz)의 mRNA 발현은 각각 4일(도 2d)과 8일째(도 2e)에 ENR-함유 배지에서와 비교하여 CV- 및 CVYA-함유 배지에서 배양한 소장 오가노이드에서 유의하게 증가하였다. 그러나 CV- 및 CVYA-함유 배지에서 배양한 소장 오가노이드는 ENR-함유 배지에서 배양한 소장 오가노이드와 비교하여 mucin-2 (Muc2), villin (Vill) 및 chromogranin A (ChgA)의 mRNA 발현은 감소하였다(도 2d 및 도 2e). 또한, 면역 세포 화학 염색에 의해 크립트 유래 오가노이드에서 소장 세포에 대한 여러 마커가 발현되었다. CVYA-함유 배지에서 배양한 오가노이드는 ENR-함유 배지에서의 콜로니와 비교하여 Lgr5-GFP, Ki67 및 Lyz의 발현 수준이 유의적으로 증가하였다(도 2f).

도 3은 마우스 관 유래 간 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 현미경 추적(microscope tracking)을 통해 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.

도 3에 나타난 바와 같이, ENR-함유 배지에서 CV 및 CVYA는 오가노이드의 성장을 유의적으로 유발하지 않았다(도 3a). CVYA-함유 배지에서 성장한 오가노이드에서 Lgr5와 E-cadherin의 mRNA 발현 수준은 4일(도 3b)과 8일(도 3c)에 ENR-함유 배지에서와 비교하여 유의하게 감소하였다. 또한, CYP311의 mRNA 발현 수준은 4일째에는 ENR-함유 배지에서 성장한 콜로니와 비교하여 CVYA-함유 배지에서 성장한 오가노이드에서 증가한 반면, 8일째에는 감소하였다. HNF4의 mRNA 발현 수준은 4일째에는 ENR-함유 배지에서 성장한 콜로니와 비교하여 CVYA-함유 배지에서 성장한 콜로니에서 감소한 반면, 8일째에는 증가하였다(도 3b 및 도 3c). 또한, 면역 세포 화학 염색으로 CV- 및 CVYA-함유 배지에서 배양한 오가노이드에서 Lgr5-GFP가 발현되었다(도 3d).

도 4는 인체 관 유래 췌장 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 현미경 추적(microscope tracking)을 통해 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.

도 4에 나타난 바와 같이, ENR-함유 배지와 비교하여 CV 및 CVYA-함유 배지에서 췌장 오가노이드의 성장에 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한, 4가지 화합물을 함유한 배양 배지에서 성장한 오가노이드의 크기는 ENR만 있는 배양 배지에서의 오가노이드 크기와 유사하였다(도 4a). Lgr5의 mRNA 발현은 8일째(도 4c)에 CV-함유 배지에서 성장한 오가노이드에 비해 CVYA-함유 배지에서 증가 하였다. Lyz의 mRNA 발현은 CVYA-함유 배지에서 성장한 오가노이드에서 8일째에는 증가하는 반면 4일째(도 4b)에는 감소하였다. CK19와 PTF1A의 mRNA 발현은 CVYA-함유 배지에서 8일 동안 성장한 오가노이드에서 감소하였다(도 4b 및 4c). 또한, 면역 세포 화학 염색 (immunocytochemistry staining)에 의해 CVYA-함유 배지에서 배양된 오가노이드 전반에 걸쳐 Lgr5-GFP가 발현되었다. Lgr5-GFP 강도는 8일째에 ENR- 또는 CV- 함유 배지에서 성장한 오가노이드에 비해 CVYA-함유 배지에서 배양된 췌장 오가노이드에서 증가하였다(도 4d).

도 5는 인체 소장 유래 오가노이드를 CV- 및 4 개의 화합물 함유 배양 배지에서 8일 동안 배양한 후, 현미경 추적(microscope tracking)을 통해 오가노이드를 관찰한 결과를 나타낸다.

도 5에 나타난 바와 같이, CV- 및 CVYA-함유 배지에서 배양된 인간의 소장 오가노이드 수는 ENR-함유 배지에서 성장한 콜로니의 수와 유사하였다(도 5a). 또한, Lgr5의 mRNA 발현 수준은 4일(도 5b) 및 8일(도 5c)에 ENR-함유 배지에서 성장한 오가노이드와 비교하여 CVYA-함유 배지에서 성장한 오가노이드에서 증가하였다. Muc2, Vill, Lyz 및 ChgA의 mRNA 발현 수준은 CVYA-함유 배지에서 성장한 오가노이드에서 4일 및 8일에 ENR-함유 배지에서 성장한 오가노이드 보다 감소하였다(도 5b 및 5c). 또한, 면역 세포 화학 염색으로 관찰한 결과, 인간의 소장 오가노이드에서 상피 세포의 β-catenin, 상피 경계의 villin, 배 세포의 Muc2, paneth 세포의 Lyz, 장의 줄기 세포의 Lgr5 등이 발현되었다(도 5d).

실시예 4. 2차원 배양 배지 조성물이 Lgr+5 콜로니에 미치는 영향 확인

4개의 화합물이 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 미치는 영향을 전형적인 배양 배지를 사용하여 2D 배양 시스템에서 시험하였다. 그 결과, 성인 조직으로부터 유래된 오가노이드 유래의 단리된 Lgr5+ 콜로니는 CVYA-함유 배지에서 팽창되었지만 ENR-함유 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서는 팽창되지 않음을 보였다(도 6a). 또한, CVYA-함유 배지를 사용한 2D 배양 시스템에서 ENR-함유 배지를 사용하는 2D 배양 시스템과 비교하여 콜로니 수가 증가하였다(도 6b). 또한, 소장에서의 Lgr5-GFP 강도는 ENR만 포함된 2D 배양 시스템과 비교하여 CVYA-함유 배지의 2D 배양 시스템에서 증가하였다(도 6c). 2D 배양 시스템에서 Lgr5+ 콜로니의 장내 계통 마커는 CVYA-함유 배지에서 검출되었다. Lgr5의 mRNA 발현 수준은 CVYA-함유 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서 성장한 콜로니에서 증가 하였다. 대조적으로, ChgA의 발현 수준은 CVYA-함유 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서 성장한 콜로니에서 감소되었다(도 6d). 또한, CVYA-함유 배지에서 2D 배양 시스템에서 성장한 콜로니에서 Vill 및 Muc2의 mRNA 발현이 감소되었다(도 6e).

실시예 5. 3D 배양 시스템에서 배지 조성물이 Lgr +5 콜로니에 미치는 영향 확인

3D 배양 시스템에서 Lgr5+ 콜로니를 오가노이드로서 확장시키는 5가지 화합물의 효능을 조사하기 위해 2D 배양 시스템에서 배양된 콜로니를 3D 배양 시스템에 적용하였다. 또한, 3D 배양 시스템에서 Lgr5+ 콜로니를 팽창시키는 5 가지 화합물의 영향을 2D 배양 세포를 하기 3가지 배지로 3D 배양 시스템으로 옮겨서 시험하였다: ENR-함유 배지를 이용한 3D 배양 시스템, 5가지 화합물 함유 배지를 포함하는 2D 배양 시스템에서 5가지 화합물 함유 배지가 있는 3D 배양 시스템으로 이동, 5가지 화합물 함유 배지를 포함하는 2D 배양 시스템에서 ENR 함유 배지를 포함하는 3D 배양 시스템으로 이동.

도 7 CVYA 4개 화합물 외에 추가로 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 영향을 미치는 화합물을 규명하기 위하여 2D 배양 시스템에서 배양한 결과를 나타낸다.

그 결과, PD98059를 처리한 그룹의 소장 오가노이드의 Lgr5-GFP 강도는 다른 화합물을 처리한 그룹에 비해 강하게 발현되었고 (도 7a) ENR- 및 5가지 화합물-함유 배양 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서 성장한 소장 오가노이드에서 Lgr5-GFP 가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 7b). 5가지 화합물을 함유한 배양 배지를 갖는 소장 오가노이드의 Lgr5와 Sox9 mRNA 발현이 4가지 화합물-함유 배양 배지의 소장 오가노이드에 비하여 증가한 반면, EphB3, CD44 mRNA 발현은 감소하였다 (도 7c). 또한, 5가지 화합물-함유 배양 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서 성장한 소장 오가노이드에서 Ki67, Muc2, Lyz, Vill과 같은 분화 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 7d). 특히, 소장 오가노이드를 3D 배양 시스템에서 4가지 화합물-과 5가지 화합물-함유 배양 배지를 포함하는 2D 배양 시스템으로 옮겨 7일간 배양하였을 경우 콜로니의 수가 시간 의존적으로 증가하였다 (도 7e).

도 8은 3D 배양 시스템에서 5개의 화합물이 Lgr5+ 콜로니의 팽창에 미치는 영향을 확인하기 위하여 2D 배양 시스템에서 배양한 콜로니를 3D 배양 시스템에 적용하여 배양한 결과를 나타낸다.

그 결과, 결과는 2D 배양 시스템으로부터의 콜로니가 각각의 3가지 배양 조건에서 소장 오가노이드로서 성장하였고(도 8a) ENR- 및 5가지 화합물-함유 배양 배지를 갖는 3D 배양 시스템에서 성장한 오가노이드에서 Lgr5-GFP 강도가 증가함을 보였다. 특히, 5가지 화합물 함유 배지를 사용하여 2D 배양 시스템에서 ENR 함유 배지를 포함하는 3D 배양 시스템으로 옮긴 오가노이드의 Lgr5-GFP 강도는 다른 그룹보다 더 컸다(도 8b). 계통 마커의 측정을 위해, 상피 계통 마커의 mRNA 발현 수준을 3 그룹으로 나누어 측정하였다. 2D 배양 시스템에서 배양된 콜로니를 3D 배양 시스템으로 옮긴 오가노이드의 Lgr5 발현 수준은 3D 배양 시스템에서만 성장된 오가노이드의 Lgr5 발현 수준에 비해 증가하였다. 5개의 화합물 함유 배지를 갖는 2D 배양 시스템에서 배양된 콜로니를 5개의 화합물 함유 배지를 포함하는 3D 배양 시스템으로 옮긴 오가노이드에서 Muc2, Vill 및 ChrgA와 같은 계통 마커의 mRNA 발현 수준은 다른 그룹과 비교하여 감소하였다(도 8c). CVYA와 5가지 화합물이 Lgr5+ 오가노이드의 팽창에 미치는 효과를 비교하기 위해 CVYA를 포함한 2D 배양 시스템과 5가지 화합물 함유 배지의 콜로니를 CVYA-와 5 가지 화합물 함유 배지가 있는 3D 배양 시스템으로 옮겼다. 그 결과, 5가지 화합물 함유 배지를 갖는 3D 배양 시스템에서 오가노이드의 Lgr5-GFP 강도는 CVYA-함유 배지를 갖는 3D 배양 시스템에서 오가노이드의 Lgr5-GFP 강도보다 컸다(도 8d). 또한, CD44, Axin2, Sox9 및 EphB3과 같은 Wnt 표적 유전자의 mRNA 발현 수준은 ENR- 및 CVYA를 갖는 3D 배양 시스템의 오가노이드보다 5개의 화합물 함유 배지를 갖는 3D 배양 시스템의 마우스 소장 오가노이드에서 증가하였다(도 8e). 2차원 배양 시스템에서 3차원 배양 시스템으로 옮겨지는 오가노이드의 장 기능을 시험하기 위해, 오가노이드를 5가지 화합물 함유 배지가 있는 2D 배양 시스템에서 ERN-함유 배지가 있는 3D 배양 시스템으로 옮긴 후, 낭포성 섬유증 막관통 조절제(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 작용제로서 포스콜린(forskolin)을 처리하였다. 결과는 포스콜린에 대한 오가노이드의 반응이 그룹 간에 차이가 없음을 보여 주었다(도 8f). 마찬가지로, 부풀어오르는 오가노이드의 백분율이 그룹 간에 차이가 없었다(도 8g).

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Medium composition for two-dimensional culture of three-dimensional organoids and uses thereof <130> PN122916 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Lgr5 <400> 1 gacgctgggt tatttcaagt tcaa 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Lgr5 <400> 2 cagccagcta ccaaataggt gctc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse E-cadherin <400> 3 accactgccc tcgtaatcga a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse E-cadherin <400> 4 cgtcctgcca atcctgatga a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Mucin-2 <400> 5 atgcccacct cctcaaagac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Mucin-2 <400> 6 gtagtttccg ttggaacagt gaa 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Lysozyme <400> 7 gagaccgaag caccgactat g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Lysozyme <400> 8 cggttttgac attgtgttcg c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Villin-1 <400> 9 gacgttttca ctgccaatac ca 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Villin-1 <400> 10 cccaaggccc tagtgaagtc tt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Chromogranin A <400> 11 aaggtgatga agtgcgtcct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Chromogranin A <400> 12 ggtgtcgcag gatagagagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse GAPDH <400> 13 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse GAPDH <400> 14 acacattggg ggtaggaaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Pdx1 <400> 15 cccggacctt tcccgaatgg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Pdx1 <400> 16 ctcgggttcc gctgtgtaag c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Sox9 <400> 17 ctcctaatgc tatcttcaag 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Sox9 <400> 18 gcttcagatc aactttgc 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse HNF4 <400> 19 gctaaggcgt gggtaggg 18 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse HNF4 <400> 20 aggctgttgg atgaattgag g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Alb <400> 21 gcgcagatga cagggcggaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Alb <400> 22 gtgccgtagc atgcgggagg 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse CYP3a11 <400> 23 tggtcaaacg cctctccttg ctg 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse CYP3a11 <400> 24 actgggccaa aatcccgccg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human CK19 <400> 25 gtcacagctg agcatgaaag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human CK19 <400> 26 tcactatcag ctcgcacatc 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human PTF1A <400> 27 cccgggggcc tagacgcctt tcc 23 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human PTF1A <400> 28 ccgccagcag ctcatcgccg t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human Lgr5 <400> 29 cagcgtcttc acctcctacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human Lgr5 <400> 30 tgggaatgta tgtcagagcg 20 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human GAPDH <400> 31 ggtatcgtgg aaggactcat gac 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human GAPDH <400> 32 atgccagtga gcttcccgtt ca 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human villin1 <400> 33 gcagcattac ctgctctacg tt 22 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human villin1 <400> 34 gcttgataag ctgatgctgt aattt 25 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human chromogranin B <400> 35 cagccaacgc tgcttctc 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human chromogranin B <400> 36 tggcatggaa ttgacagc 18 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human lysozyme <400> 37 ccgctactgg tgtaatgatg g 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human lysozyme <400> 38 catcagcgat gttatcttgc ag 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human Muc5AC <400> 39 cttctcaacg tttgacggga agc 23 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human Muc5AC <400> 40 cttgatcacc accaccgtct g 21 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human Muc2 <400> 41 tgtaggcatc gctcttctc 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human Muc2 <400> 42 gacaccatct acctcacccg 20

Claims

GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제, Pan-HDAC(Pan-Histonediacetylase) 억제제, Rock(Rho associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제 및 TGF-β(Transforming growth factor- beta) 억제제를 포함하는 배지용 조성물.
청구항 1에 있어서, MAPK 인산화 억제제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 억제제는 MEK1 또는 MEK2 억제제인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 GSK3 억제제는 CHIR99021, LiCl, BIO-아세톡심(BIO-아세톡심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론(Kenpaullone), 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A014418, TCS 21311, TWS 119, BIO-아세톡심, 10Z-하이메니알디신(10Z-Hymenialdisine), GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3β 억제제 XXVI, FRATtide 펩티드, Cdk1/5 억제제 및 비키닌(Bikinin)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 Pan-HDAC 억제제는 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 Rock 억제제는 Y-27632, 티아조비빈(Thiazovivin), 파수딜(Fasudil) (HA-1077), HCl 또는 GSK429286A로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 TGF-β 억제제는 A83-01, SD-208, GW788388, 랩삭스(RepSox), LY2109761, SB505124, 갈루니서팁(Galunisertib), 백토서팁(Vactosertib), LY364947 또는 SB525334로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 오가노이드의 줄기세포능(stemness)를 증진시키는 것인 조성물.
3차원 오가노이드를 단세포로 분리하는 단계; 및
상기 청구항 1의 조성물이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 3차원 오가노이드를 2차원으로 배양하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 배지는 PBS 및 마트리겔 혼합물이 코팅된 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 PBS 및 마트리겔은 1:99 내지 99:1의 비율로 혼합된 것인 방법.