KR20120003855A - 상피 줄기 세포용 배양 배지 및 상기 줄기 세포를 포함하는 오르가노이드 - Google Patents

상피 줄기 세포용 배양 배지 및 상기 줄기 세포를 포함하는 오르가노이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를 배양하고, 상기 세포 또는 단편을 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제, 분열촉진 성장 인자, 및 상피 줄기 세포 및 단리된 조직 단편을 배양하는 경우 Wnt 작용물질의 존재 하에서 배양하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BMP 억제제, 분열촉진 성장 인자 및 Wnt 작용물질을 포함하는 세포 배양 배지, 상기 배양 배지의 용도, 및 상기 배양 배지에서 형성되는 장샘-융모 오르가노이드, 위 오르가노이드 및 췌장 오르가노이드에 관한 것이다.

Description

상피 줄기 세포용 배양 배지 및 상기 줄기 세포를 포함하는 오르가노이드{CULTURE MEDIUM FOR EPITHELIAL STEM CELLS AND ORGANOIDS COMPRISING SAID STEM CELLS}
본 발명은 상피 줄기 세포, 특히 장 및 결장 상피 줄기 세포의 배양, 및 상기 줄기 세포를 포함하는 오르가노이드의 배양을 위한 신규의 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지를 사용하여 배양한 세포 및 오르가노이드의 자손, 및 독성 분석 또는 재생 의학에서의 상기 자손의 용도에 관한 것이다.
소장의 자가-갱신(self-renewing) 상피는 장샘(crypts) 및 융모(villi)로 정렬된다(Gregorieff and Clevers, 2005. Genes Dev 19, 877-90). 세포는 상기 장샘에서 새로 생성되고 상기 융모의 끝에서 세포사멸에 의해 상실되어, 마우스에서 5일의 상피 턴오버 시간을 생성시킨다. 자가-갱신 줄기 세포는 상기 장샘 기부 부근에 존재하여, 모든 계통으로 분화할 수 있는 빠르게 증식하는 트랜싯 증폭(TA) 세포를 생산하는 것으로 오랫동안 공지되어 왔다. 추정되는 줄기 세포의 수는 장샘 당 4 내지 6 개이다(Bjerknes and Cheng, 1999, Gastroenterology 116, 7-14). 3 개의 분화된 세포 유형인 장세포, 배상세포 및 장내분비 세포는 TA 세포로부터 형성되며 장샘-융모 축을 따라 응집성 띠로 이동을 계속한다. 각각의 융모는 다수의 상이한 장샘으로부터 세포를 받는다. 네 번째 주요 분화 세포 유형인 파네쓰 세포는 장샘 기부에 존재한다.
다섯 번째 세포 유형인 순환하는 장샘 기저 원주(CBC) 세포(상기 파네쓰 세포들 사이에 산재된 작은 세포이다(도 8b에서 검은색 화살표가 가리킴))에서 특이적으로 발현되는 유전자 Lgr5가 최근에 동정되었다(Barker et al., 2007, Nature 449:1003-1007). GFP/타목시펜-유도성 Cre 리콤비나제 카세트를 상기 Lgr5 좌에 통합시킨 마우스를 사용하여, 계통 추적에 의해 상기 Lgr5+ CBC 세포가, Cre 유도 후 14 개월째에 평가할 때조차 상기 상피의 모든 세포 유형들을 생성시키는 다능성 줄기 세포를 구성함을 입증하였다.
또한 Lgr5 이외에, Lgr4가 아닌 Lgr6가 성인 줄기 세포에 대한 유일한 마커임이 최근 발견되었다. Lgr5가 뇌, 신장, 간, 망막, 위, 장, 췌장, 유방, 모낭, 난소, 부신수질 및 피부의 줄기 세포들에서 발현되는 반면, Lgr6는 뇌, 폐, 유방, 모낭 및 피부의 줄기 세포에서 발현된다.
일반적으로 상피 줄기 세포를 고정 및 지지하고 적합하게 양극화된 3 차원 구조를 생성시키기에 필요한 정확한 배향을 제공하기 위해서는 상피 줄기 세포와 상피 하 섬유아세포 간의 긴밀한 접촉이 필요한 것으로 여겨진다.
다양한 배양 시스템들이 장 상피 줄기 세포를 포함한 1차 상피 줄기 세포의 배양을 위해 개시되어 왔지만(Bjerknes and Cheng, 2006, Methods Enzymol 419:337-83), 지금까지 상피 줄기 세포의 다능성을 유지하는 장기적인 배양 시스템은 확립되지 않았다. 더욱 또한, 결장 또는 장으로부터 단리된 장샘의 기본적인 장샘-융모 생리학을 보존하거나, 또는 단리된 췌장 단편 또는 위 조직 단편의 기본적인 생리학을 보존하는 배양 시스템은 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를 배양하고, 상기 세포 또는 단편을 뼈 형성 단백 질(BMP) 억제제, 분열촉진 성장 인자, 및 상피 줄기 세포 및 단리된 조직 단편을 배양하는 경우 Wnt 작용물질의 존재 하에서 배양하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 또한 BMP 억제제, 분열촉진 성장 인자 및 Wnt 작용물질을 포함하는 세포 배양 배지, 상기 배양 배지의 용도, 및 상기 배양 배지에서 형성되는 장샘-융모 오르가노이드, 위 오르가노이드 및 췌장 오르가노이드을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편, 또는 선종 세포의 배양 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 외 기질을 제공하고, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를 상기 세포 외 기질과 함께 배양하고, 상기 줄기 세포, 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를, 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제, 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하의 분열 촉진 성장 인자가 첨가되고 상피 줄기 세포 및 단리된 조직 단편을 배양하는 경우 Wnt 작용물질이 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지의 존재 하에서 배양함을 포함한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 미분화된 표현형 및 자기 유지 능력을 보유하는 줄기 세포의 존재를 보존하면서, 상피 줄기 세포, 상기 줄기 세포를 포함하는 소장, 결장, 위 및 췌장으로부터 단리된 단편, 및 선종 세포의 배양을 허용함을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 배양된 단리된 장샘은 장샘-융모 오르가노이드(융모형 상피로 피복된 중심 관강을 포함한다)로 발달한다. 단리된 장샘의 성장은 상기 장샘 중에 존재하는 줄기 세포들에 의해 연료를 얻었다. 생성되는 오르가노이드는 수 회의 장샘 분열 사건을 겪는다. 훨씬 더 놀라운 것은 본 발명의 방법이 줄기 세포 니치(niche)의 부재 하에서 단일의 단리된 상피 줄기 세포의 장샘-융모 오르가노이드로의 성장을 허용한다는 관찰결과였다. 위의 유문 부위로부터 단리된 위 단편은 장샘 오르가노이드로서 작용하였다. 상기 유닛의 개방된 상부 부분을 밀봉하고 관강을 세포사멸 세포로 충전하였다. 새로 형성된 위 오르가노이드는 중심 관강과 그의 극성을 유지하면서 연속적인 발아 사건(샘 분열의 회고)을 겪었다. 더욱 또한, 췌장 단편의 배양 결과 인슐린을 발현하는 췌장 섬-유사 구조 및 상기 췌장 랑게르한스섬을 닮은 다른 췌장 섬 특이 마커들이 출현하였다.
도 1. 장샘 배양물의 성장 인자 요건
a: 500 개의 장샘을 EGF(E; 0 내지 50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(R: 0 내지 500 ng/㎖)과 함께 3 회 중복해서 시딩하고; 장샘 오르가노이드를 시딩 후 7일째에 카운트하였다. b: 500 개의 장샘/장샘 오르가노이드를 지시된 양의 노긴과 함께 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(500 ng/㎖)과 배양한 다음 3 회 계대 배양을 수행하였다. 장샘 오르가노이드를 각 계대 배양에서 카운트하였다. 상기 실험을 필적할만한 결과로 3 회 반복하였다.
도 2. 장 장샘 배양 시스템의 확립
a: 오르가노이드로 성장하는 단리된 단일 장샘의 시간 과정. 차등간섭 대비 영상은 장샘 기부에 과립-함유 파네쓰 세포(화살표)를 나타낸다. b,c: 단일 단리된 장샘은 장샘 오르가노이드를 효율적으로 형성한다. 반복된 장샘 분열을 통해, 상기 구조는 14일째에 다수의 문어형 장샘 오르가노이드를 생성시킨다. d: 3D는 3 주 배양 후 단일 오르가노이드의 공 초점 영상을 재건한다. Lgr5-GFP+ 줄기 세포(밝은 회색)가 장샘 형 도메인의 끝에 집중되어 있다. DNA에 대한 대비염색: ToPro-3(짙은 회색). e: 장샘 오르가노이드의 도식적 표현. 상기 오르가노이드는 융모-형 상피로 피복된 중심 관강 및 다수의 주변 장샘형 도메인들로 이루어진다. 상기 장샘 도메인 끝의 짙은 회색 세포는, 각각의 장샘 도메인 중에 위치한 Lgr5+ 줄기 세포의 위치를 가리킨다. 스케일 바는 50 ㎛를 가리킨다.
도 3. 유전자 발현 프로파일링의 클러스터 분석.
새로 단리된 결장 및 소장 장샘뿐만 아니라 소장 오르가노이드를 사용한 발현 수준의 클러스터 분석은 소장 오르가노이드와 상기가 유도된 조직인 소장 장샘 간의 고도의 유사성을 보였다. 결장 장샘들은 별도의 가지 상에 군락을 형성하였으며, 이는 상기 밀접하게 관련된 조직의 상이한 유전자 발현 패턴을 가리킨다. 중요하게, 발현된 모든 유전자의 단지 1.2%만이 소장 장샘에 비해 오르가노이드에 현저하게 풍부하였으며, 반면에 역으로 2%는 소장 장샘에 풍부하였다. 이들 차별적인 유전자들에 대한 정교한 경로 분석은 새로 단리된 장샘 중의 림프구 징후의 특정한 존재를 밝혔으며, 반면에 오르가노이드 중에 풍부한 소수의 유전자에서는 중요한 경로를 확인할 수 없었다(도시 안 됨). 우리는 후자 그룹이 생물학적 소음을 나타내고, 반면에 상기 림프구 징후는 상피 내 면역 세포의 오염으로부터 유래하며, 배양 시 상실된다는 결론을 내린다.
도 4. 장샘 오르가노이드는 기본적인 장샘-융모 특성을 보존한다.
a-e. Wnt 활성화 코드가 장샘 도메인 중에 보존된다. a: 핵 β-카테닌(짙은 회색, 화살표)은 오직 장샘 도메인에서만 보였다. 도 5에 보다 고해상의 영상. 별표, 매트리겔; Lu, 관강 b: EphB2(밝은 회색)를 CBC 세포 및 TA 세포 상에 구배로 나타낸다. 백색 화살표가 가리키는 Lgr5-GFP+ 줄기 세포가 주목된다. c: 장세포에 의해 피복된 중심 관강 내로 발산된 카스파제-3+ 세포사멸성 세포(짙은 회색, 화살표). d: >3 개월 된 장샘 배양물로부터 발산된 세포 중의 40 염색체. e-g: 시험관 내 Lgr5+ 줄기 세포의 계통 추적. e: Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-lacZ 정보제공 마우스로부터의 장샘을 시험관 내에서 12 시간 동안 타목시펜에 의해 자극하고 지시된 일수로 배양하였다. LacZ 염색(짙은 회색)은 산란된 단일 LacZ+ 세포(1일)가 시험관 내에서 전체 LacZ+ 장샘을 생성시켰음(2 내지 14일)을 보인다. 삽입물은 보다 큰 배율의 염색된 장샘 오르가노이드를 나타낸다. f: 조직학적 분석은 융모 도메인 내로의 전체 LacZ+ 장샘-도메인(짙은 회색/흑색) 공급물을 나타낸다. g: LacZ+ 세포를 갖는 장샘 오르가노이드의 퍼센트는 시간에 따라 불변인 채로 있었으며, 이는 Lgr5+ 세포가 장기적인 줄기 세포 활성을 가짐을 가리킨다. 500 개의 장샘을 3 회 중복하여 시딩하였으며, LacZ+ 장샘 오르가노이드를 카운트하였다. 에러 바는 3 회 중복의 표준 편차이다. 상기 실험을 3 회 반복하였으며 유사한 결과를 얻었다.
도 5. 도 4a, 도 11m 및 11p의 보다 고해상의 영상.
도 6. 장샘 오르가노이드 중에 상피 하 섬유아세포의 증거가 없음.
a: 평활근 액틴(SMA; 짙은 회색, 예들을 흑색 화살표로 나타냈다)에 대한 면역염색은 상기 상피 층 바로 아래 상피 하 섬유아세포의 존재를 입증한다. b: 매트리겔(별표) 중 SMA+ 세포의 부재는 배양 시스템 중 상피 하 섬유아세포의 부재를 가리킨다. 스케일 바: 50 ㎛.
도 7. a-c: Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP 정보제공 마우스로부터의 장샘을 12 시간 동안 시험관 내에서 타목시펜에 의해 자극하고 지시된 일수 동안 영상화하였다. Lgr5+ 세포는 밝은 회색이고 백색 화살표로 나타낸다. d: Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP 장샘으로부터 유래한 7일 된 오르가노이드를 12 시간 동안 시험관 내에서 타목시펜에 의해 자극하고 지시된 일수 동안 배양하고 영상화하였다. YFP 형광(밝은 회색)은 산란된 단일 YFP+ 세포(1일)가 다음 5일에 걸쳐 시험관 내에서 다수의 자손을 생성시켰음을 보인다. 상기 융모 도메인은 1 내지 1.5일 동안 갑자기 나타났고, 이어서 새로운 융모 도메인이 형성되었다(백색 원). YFP+ 세포가 융모 도메인을 향해 이동함이 주목된다.
도 8. 단일 분류된 Lgr5+ 줄기 세포는 전체 장샘-융모 구조를 생성시킨다.
a: Lgr5-GFP+ 세포는 야생형 한배 새끼(상부)에 비해 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 장(기부)으로부터 제조되었다. GFP+ 세포를 2 개의 집단으로 분류하였다: GFPhi 및 GFPlow. b: 새로 단리된 장샘의 공 초점 현미경 분석은 CBC 세포 중의 GFPhi(흑색 화살표 머리) 및 CBC 위의 GFPlow(백색 화살표 머리)를 나타낸다. c: 분류된 GFPhi 세포. d: 14일 배양 후 1000 분류된 GFPhi 세포(좌측) 및 GFPlow 세포(우측). e-f: 분류 후 14일째, 단일 GFPhi 세포는 장샘 오르가노이드를 형성하며, 이때 Lgr5-GFP+ 세포(밝은 회색 세포) 및 파네쓰 세포(백색 화살표)는 장샘 기부에 위치한다. 스케일 바: 50 ㎛. f: e의 장샘 기부의 더 높은 배율. g: 증식하는 세포를 가시화하기 위해서, 상기 오르가노이드를 1 시간 동안 티미딘 동족체 EdU(밝은 회색, 예를 백색 화살표로 나타낸다)와 함께 배양하고, 그 후에 고정시켰다. 오직 장샘 도메인만이 EdU와 결합하였음이 주목된다. 대비 염색: DAPI(짙은 회색).
도 9. a: 개별적인 웰 중에 분류된 단세포의 콜로니-형성 효율. 4 회의 개별적인 실험에 대한 평균을 제공하고, 이들 실험 중 각각의 실험에서 100 개의 세포가 가시적으로 확인되었으며 이어서 성장을 추적하였다. b: 성공적으로 성장하는 단일 GFPhi 세포의 예. c: 단일 오르가노이드당 세포의 수를 5 개의 성장하는 오르가노이드에 대해 평균하였다. d: 단세포-유래한 오르가노이드로부터 유도된 단세포 현탁액을 재도말하고 2주간 증식시켰다.
도 10. 개별적인 웰 중에 분류된 단세포의 콜로니-형성 효능. 성공적으로 성장하는 단일 GFPhi 세포의 예. 화살표는 랜드마크로서 분진 입자를 가리킨다. 스케일 바: 50 ㎛.
도 11. 단일 줄기 세포-유래한 오르가노이드의 조성. a-d: a: 비닐린(밝은 회색, 중심 관강을 피복하는 장세포의 정점) b: Muc2 염색(백색 화살표로 가리킴, 배상 세포), c: 리소자임(밝은 회색, 파네쓰 세포), d: 크로모그라닌 A(밝은 회색, 장내분비세포)에 대한 3 차원 재건된 공 초점 영상. 핵을 DAPI로 대비 염색하였다. e-g: e: 알칼리성 포스파타제(흑색, 중심 관강을 피복하는 장세포의 정점) f: PAS(짙은 회색, 배상 세포), g: 리소자임(짙은 회색, 파네쓰 세포), h: 시냅토피신(짙은 회색, 장내분비세포)을 염색하는 파라핀 절편. i-p: 장샘 오르가노이드의 전자 현미경검사 절편은 장세포(i), 배상세포(j), 파네쓰 세포(k) 및 장내분비 세포(l)의 존재를 입증한다. m/o: 저 배율 장샘 영상은 기질 세포의 부재를 예시한다. n-o: 보다 고 배율의 m. n: 상기 오르가노이드의 관강 구획을 향한 브러시 보더의 성숙(미세융모(흑색 화살표)의 길이 차에 의해 나타남). p: 융모 도메인의 저 배율 영상. Lu, 세포사멸성 세포체로 충전되고 양극화된 장세포에 의해 피복된 장샘 오르가노이드의 관강. G, 배상 세포; EC, 장내분비 세포; P, 파네쓰 세포; 별표, 매트리겔, 스케일 바: 5 ㎛(m,p), 1 ㎛(n,o).
도 12. 생체 내 장샘과 시험관 내 배양된 장샘 간의 전자 현미경 영상의 비교. a,b: 바로 아래에 결합 조직을 갖는 장샘 기부의 정상적인 장(화살표). 비교를 위해서 장샘의 기부에서 또한 취한 오르가노이드의 c-g를 참조하시오. d: 상기 정상 막으로부터의 고 배율 영상; 2 개의 인접한 세포들의 세포막 사이에 세포 간 틈(화살표)이 존재한다. 데스모솜(화살표 머리)에 이어서 세포 간 틈이 주목된다. e: 2 개의 인접한 세포들의 세포 막에 이어서 세포 내 틈이 있을 수 있는 기부 부위로부터 고 배율. 이들 영상은 정상 마우스의 장으로부터의 a 및 b에 필적할만하다. 이들 세포 간 틈의 원인은 알데하이드 고정 중 삼투 쇼크일 수도 있다. f,g: 상기 오르가노이드를 구성하는 모든 세포들은 건강한 상태에 있으며 큰 액포나 다른 스트레스 징후는 없다. 유사분열 도면(c) 및 각 세포에서 많은 핵 기공들(f, 화살표) 및 완전한 미토콘드리아를 관찰할 수 있다. ER 및 골지체(g)를 어떠한 팽창의 증거도 없이 볼 수 있다. 핵 붕괴, 핵 분해 또는 핵 농축의 징후는 없다. 따라서, 세포 용해 또는 세포사멸의 징후는 관찰되지 않는다. 상기 오르가노이드의 관강 중의 세포는 정상 마우스의 장에서 관찰할 수 있는 바와 같은 예상된 세포사멸성 특징들을 나타낸다. f는 장내분비 세포의 또 다른 예를 나타낸다. Mi: 유사분열 세포, Lu: 관강, EC: 장내분비 세포, G: 골지체.
도 13. 결장 유래한 장샘을 또한 배양물 중에 유지시킬 수 있다. 결장으로부터 유래한 단일 단리된 장샘은 소장 장샘에 대해 사용된 바와 동일한 배양 조건을 사용하여 장샘 오르가노이드를 효율적으로 형성한다. 반복된 장샘 분열을 통해, 상기 구조는 14일째에 다수의 문어형 장샘 오르가노이드를 생성시킨다.
도 14. BDNF의 첨가는 배양 효율성을 증가시킨다. 단일 단리된 결장 장샘을 EGF, 노긴, R-스폰딘 및 BDNF의 존재 하에서 배양하였다. 결장 장샘 오르가노이드의 영상들을 상기 배양 시작 후 0, 4 및 14일째에 취하였다.
도 15. Wnt3a의 첨가는 결장 장샘 오르가노이드의 배양 효율성을 추가로 증가시킨다. 단일 단리된 결장 장샘을 EGF, 노긴, R-스폰딘의 존재 하에서 배양하였다. Wnt3a 처리된 배지(+Wnt3a)의 사용은 배양 효율성을 대조용 배지(-Wnt3a)에서의 결장 오르가노이드의 배양에 비해 30%까지 증가시켰다.
도 16. APC-/- 마우스로부터 단리된 선종을 시험관 내에서 증식시킬 수 있다. APC-/- 마우스로부터 단일 단리된 선종을 해리시키고, R-스폰딘을 배양 배지에 포함시키지 않음을 제외하고 상술한 바와 같은 조건을 사용하여 배양하였다. a: 4일째에 여기에 나타낸 바와 같은 선종 오르가노이드는 일반적으로 세포사멸성 세포를 함유하는 하나의 중심 관강을 함유하는 단순한 장샘으로서 증식한다. b: 보다 큰 배율의 하나의 선종 오르가노이드. c: 하나의 선종 오르가노이드를 β-카테닌(짙은 회색) 및 헤마톡실린(관강 중 밝은 회색)으로 염색하였다. 상기 오르가노이드의 외부 층은 핵 β-카테닌 염색이 있는 상피 세포로 이루어진다. 내부 관강은 헤마톡실린을 흡수하여 짙은 회색으로 염색된 죽은 세포를 함유한다. d: 분명한 핵 β-카테닌을 보이는 보다 고 배율의 상피 세포 외부 층.
도 17. Wnt3a의 첨가는 오르가노이드 형성의 효율성을 증가시킨다. a: Lgr5-GFPhi 세포를 분류하고 통상적인 단 세포 배양 조건(EGF, 노긴, R-스폰딘, 노치 리간드 및 Y-27632, 단 세포에 대해 상술한 바와 같음) 이외에 Wnt3a(100 ng/㎖)와 함께 또는 상기 없이 배양하였다. Wnt3a의 존재 및 부재 하에서 배양된 오르가노이드가 있는 디쉬들의 영상은 전형적이다. b: 100 세포/웰을 시딩하고 오르가노이드의 수는 시딩 후 14일이었다. 상기 오르가노이드/디쉬의 수를 이 그래프에 나타낸다.
도 18. R-스폰딘1 작용에 대한 모델
표준적인 Wnt 리간드의 프리즐드에의 결합 및 LRP/6 수용체와의 회합 시 Wnt/β-카테닌 신호전달이 개시된다. R-스폰딘1의 부재 하에서, Wnt 신호전달은 상기 세포 표면상의 LRP6의 양에 의해 제한되며, 상기 량은 DKK1/크레멘1-매개된 내면화에 의해 낮게 유지된다. R-스폰딘1은 DKK1/크레멘1-매개된 LRP6 턴오버를 길항함으로써 Wnt 신호전달을 향상시키고, 그 결과 LRP6의 세포 표면 수준이 증가한다. 본 도면을 PNAS 104:14700, 2007로부터 취하였다.
도 19. 파네쓰 세포는 소장에서 Lgr5+ 줄기 세포에 인접하여 위치한다. 장샘을 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 녹-인 마우스의 소장으로부터 단리하였다. 전형적인 장샘들의 예를 여기에 제공한다. GFP+ 세포는 Lgr5+(밝은 회색, 흑색 화살표로 나타냄)이고 이들은 일반적으로 파네쓰 세포(*로 나타냄)에 인접하여 위치한다.
도 20. 생육성 파네쓰 세포의 부재 하에서, 오르가노이드 형성의 효율성이 감소한다.
단리된 장샘을 실온에서 3 분간 PBS+ 0.1% 플루로닉 127(Sigma) 중에서 1 uM 뉴포트(Newport) 그린-DCF(Molecular probe)와 배양한 다음 PBS 세척하였다. 이 후에, 장샘을 매트리겔 중에 매몰시키고 상술한 바와 같은 표준 조건을 사용하여 배양하였다.
도 21. 위 오르가노이드 배양물의 효율. (a) Lgr5-GFP 마우스의 위의 유문 부위로부터 단리된 위샘의 GFP(화살표, GFP 양성 세포를 가리킴) 및 DIC 영상. 핵을 DAPI로 염색한다. 배율 63x (b) 100 위샘/웰을 EGF(E), R-스폰딘1(R), 노긴(N), EGF+R-스폰딘1(ER), EGF+노긴(EN), EGF+R-스폰딘1+노긴(ERN), EGF+R-스폰딘1+노긴+Wnt3A(ERNW) 또는 EGF+R-스폰딘1+노긴+Wnt3A+KGF(ERNWK)와 함께 중복 시딩하였다. 위 오르가노이드의 수를 2, 5 및 7일 후에 카운트하였다. 결과를 2 회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. (b) 100 위샘/웰을 a에 개시된 다른 성장 인자들이 보충된 Wnt3A 재조합 단백질(ENRWK) 또는 Wnt3A 처리된 배지(ENRWCMK)와 함께 중복 시딩하였다. 발아 오르가노이드의 수를 시딩 후 7일째 및 제 1 계대 배양 후 2일째에 카운트하였다.
도 22. 시험관 내 위 오르가노이드의 형성. (a) 오르가노이드로 증식하는 단리된 위샘. 시딩 후 1, 2, 5 및 7일째로부터의 차등 간섭 대비 영상. 배율 10x(1, 2, 5일). 7일째 배율 4x, 삽입물 10x. (b) 배양물을 기계적 해리에 의해 매 4 내지 7일마다 계대 배양하였다. 배양물을 적어도 1 개월 동안 증식시켰다. 상이한 계대 배양에서 상기 오르가노이드로부터 나온 발아 구조물들을 나타내는 전형적인 영상. 계대 배양 1(P1), 계대 배양 2(P2) 및 계대 배양 4(P4)는 각각 8, 11, 20일째를 나타낸다.
도 23. 위샘의 마커들 (a) Lgr5-LacZ 마우스로부터의 위 배양물. LacZ 발현을 시딩 후 5일째에 위 발아에서 검출하였으며(화살표 참조, LacZ 양성(짙은 회색) 세포를 가리킨다), 이는 Lgr5 양성 세포의 존재를 가리킨다. 배율 20x. (b) Ki67 염색(흑색)은 상기 샘과 같은 구조의 기부에서 양성 증식하는 세포를 나타낸다. (c) 카스파제-3(짙은 회색) 세포사멸성 세포가 상기 오르가노이드의 관강 내부에 존재한다. (d) 위 뮤신 5AC(짙은 회색) 양성 세포가 상기 위 오르가노이드 중에 존재한다. Lu, 오르가노이드 관강, 배율 20x.
도 24. 췌장 관은 시험관 내에서 췌장형 오르가노이드를 형성할 수 있다. 새로 단리된 췌장 관을 EGF, 노긴, R-스폰딘-1 및 KGF의 존재 하에서 배양하였다. 시딩 후 0, 4 및 14일째 차등 간섭 대비 영상들.
도 25. 췌장 섬과 같은 구조가 대략 3 주의 시험관 내 배양 후에 형성된다. 시딩 후 21일째로부터 차등 간섭 대비 영상들.
도 26.
액신-LacZ 마우스에게 비히클 단독(A) 또는 R-스폰딘(B)을 주사하였다. 2일 후에, 췌장을 단리하고 LacZ 발현의 존재를 X-gal에 의한 염색에 의해 측정하였다. B의 중간 패널은 LacZ에 대해 양성 염색을 나타내는 보다 큰 배율의 도관을 나타내며, 이는 췌장 관의 내면을 따라 존재하는 액신-LacZ의 발현을 가리킨다. 좌측 패널은 샘꽈리중심 중의 작은 도관 세포 또는 개재도관 세포가 액신2-LacZ(이의 예를 흑색 화살표로 나타낸다)를 발현하였음을 보인다. 배율을 각 영상의 구석에 나타낸다. 야생형 마우스에서 췌장 관 결찰을 수행하였다. PDL 후 상이한 시간들에서, 췌장을 단리하고 상기 PDL 및 비-PDL 영역으로부터 수득한 조직 절편들을 H&E로 염색하였다. 배율을 각 시점(C)에 대해 나타낸다. 췌장 관 결찰을 wt 및 액신2-LacZ 마우스에서 수행하였다. PDL 후 7 일째에, 췌장을 단리하고 액신2-LacZ 발현을 고정된 조직 절편(D) 또는 전체 기관 단편(E)의 X-gal에 의한 염색에 의해 측정하였다. 백색 원은 췌장의 결찰된 부분을 가리킨다. PDL 후 5일째 췌장 조직 절편 중 Ki67(예를 화살표로 나타냄)의 발현. 배율을 나타낸다(F). R-스폰딘에 의한 생체 내 처리 후 2일째에 췌장 조직 중 BrdU(예를 화살표로 나타냄)의 결합. 배율을 나타낸다(G). Lgr5 mRNA 발현을 PDL을 겪거나 모의 수술한 마우스로부터 수득한 췌장 조직 중에서 Q-PCR에 의해 측정하였다. 상기 PDL 췌장에서, 상기 PDL 영역 및 비-PDL 영역에 Q-PCR을 수행하였다. TATA 박스 결합 단백질(tbp), 항존 유전자에 대한 Lgr5 발현의 증가 배수를 나타낸다(H). PDL 후 13일째에, 췌장을 단리하고 Lgr5-LacZ 발현을 고정된 조직 절편들의 X-gal에 의한 염색에 의해 측정하였다. 염색된 세포들의 예를 흑색 화살표(I)로 나타낸다.
도 27.
야생형 마우스로부터 단리 후 상이한 시점에서 취한 EM에서 시험관 내 증식된 췌장 관 단편의 영상(A, 상부 패널). 샘꽈리 중심 세포는 7일을 초과하는 기간 동안 증식하지 않았으며, 그 후 분해되었다(A, 기부 패널). 췌장 단편들을 EGF(50 ng/㎖), R-스폰딘(1 ㎍/㎖), FGF100(100 ng/㎖) 또는 노긴(100 ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 증식시켰다. 상기 배양물들의 영상을 새로 단리한 췌장 단편과 함께 배양을 시작한 후 7 및 14일째에 취하였다. EGF 부재 하의 배양물은 10일을 넘게 생존하지 못했다(B). 액신2-LacZ 마우스로부터 단리된 췌장 단편을 3일간 R-스폰딘(1 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. X-gal 염색은 오직 R-스폰딘의 존재 하에서만 3 및 14일 후에 상기 도관 세포에서 Wnt-반응성 액신-LacZ의 발현을 나타내었다(예를 백색 화살표로 나타낸다). 샘꽈리 또는 섬 세포에서 X-gal 염색은 검출되지 않았다(C). 도관 단편을 Lgr5-LacZ 마우스로부터 단리하고 R-스폰딘의 존재 또는 부재 하에서 3일간 배양하였다. X-gal 염색에 의해 가리키는 바와 같이, Lgr5-LacZ의 발현은 PDL 후 그의 발현과 유사하게(D), 상기 발아 돌기의 끝에서 Lgr5+ 세포를 나타낸다. Wnt 작용물질, R-스폰딘의 존재 하에서 배양한 췌장 단편으로부터 수득한 세포의 FACS 염색. 세포를 EpCAM, 범-상피 세포 마커, 및 LacZ(플루오레세인-다이-갈락토피라노사이드, FDG)에 대해 염색하였다. Lgr5+ 세포의 퍼센트는 췌장 단편을 Wnt 신호의 존재 하에서 배양할 때 현저하게 증가한다(E).
도 28.
췌장을 PDL 처리 후 7일째에 마우스로부터 단리하고 췌장 세포를 LacZ에 대해 EpCAM-APC 및 형광 기질로 염색하고(FluoroReporter 키트), 분류하고 50% Wnt3A 처리된 배지 및 10 mM Y-27632를 포함하는 EM에서 4일간 배양하였다. 배양 배지를 4일 후에 Wnt 및 Y-27632가 없는 EM 배지로 바꾸었다. 지시된 날짜들에 사진을 촬영하고 40x 배율로 나타낸다.
도 29.
췌장 오르가노이드를 EM에서 DM으로 옮겼다. 상기 확장 배지로부터 FGF10의 제거(DM을 생성시킨다) 효과는 섬으로의 분화를 유도하였다. 췌장 오르가노이드를 DM에서 10일간 배양하고 그 후에 섬형 구조들이 시험관 내에서 검출될 수 있었다. FGF10의 존재 및 부재 하의 배양물들의 사진을 나타내고(A) 이는 PCR에 의해 측정된 바와 같이 몇몇 분화 마커, Ngn3 및 소마토스타틴의 증가된 발현을 나타낸다. Hprt는 항존 유전자이다(B). DM으로 옮긴 후 여러 시점에서, 다수의 마커들의 발현을 PCR에 의해 평가하였다(C). 췌장 장샘에서부터 β 세포형 구조로의 형태 변화(D)는 몇몇 β 세포 마커, 예를 들어 면역형광에 의해 검출된 바와 같은 인슐린 및 C-펩타이드의 출현을 동반하였다(E). DM에서 R-스폰딘의 존재는 Ngn3에 대한 양성 면역형광 염색이 가리키는 바와 같이(예를 백색 화살표로 나타낸다)(F), β 세포 전구세포들의 재생에 필수적이다.
도 30.
인간 췌장 단편을 새로 단리하고 EM에서 배양하였다. 상기 배양의 시작 후 지시된 시점들에서 상기 배양물에 대한 사진을 촬영하였다.
도 31.
시험관 내 장샘 배양물은 Wnt 리간드(들)를 생성시킨다.
(A) Wnt 경로의 도식적인 표현. Wnt 리간드가 분비될 때 상기는 자가분비 또는 주변분비되어 상기 Wnt 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 포큐파인은 적합한 Wnt 리간드 분비에 중요하다. IWP 억제제는 Wnt 리간드 분비를 억제한다.
(B) 마우스 오르가노이드를 실시예 1에 나타낸 바와 같이 통상적인 조건 하에서 배양하였다.
(C) 1 μM IWP와 마우스 오르가노이드 배양물을 배양한 결과 오르가노이드 배양물의 세포사가 발생한다.
(D) Wnt3a 처리된 배지의 첨가는 마우스 오르가노이드 배양물을 증대시킨다.
(E) IWP 유도된 오르가노이드 사망을 Wnt3a 처리된 배지의 첨가에 의해 구제한다.
10x의 배율을 나타낸다(B-E).
도 32. 인간 장 장샘 배양물의 확립
EGF, 노긴 및 R 스폰딘이 보충된 배지에서 Wnt3a 처리된 배지의 존재(A,B,E,F) 및 부재(C,D,G,H) 하에 3일(A,C,E,G) 및 5일(B,D,F,H) 후 소장(A-D) 및 결장(E-H)으로부터 배양된 인간 오르가노이드.
도 33. 위 오르가노이드 배양물의 확립
(A) 총 100 개의 위샘/웰을 EGF(E), R-스폰딘1(R), 노긴(N), EGF+R-스폰딘1(ER), EGF+노긴(EN), EGF+R-스폰딘1+노긴(ERN), EGF+R-스폰딘1+노긴+Wnt3A(ERNW), EGF+R-스폰딘1+노긴+Wnt3A+FGF10(ERNWF), EGF+R-스폰딘1+노긴+대조군 처리된 배지+FGF10(ERNCCMF) 또는 EGF+R-스폰딘1+노긴+Wnt3A 처리된 배지+FGF10(ERNWCMF)와 함께 중복 시딩하였다. 위 오르가노이드의 수를 2, 5 및 7일 후에 카운트하였다. 결과를 2 회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다.
(B) 총 100 개의 위샘/웰을 Wnt3A 처리된 배지(ENRWCM) 또는 FGF10이 보충된 Wnt3A 처리된 배지(ENRWCMF)와 함께 중복 시딩하였다. 발아 오르가노이드의 수를 배양물 중에서 7, 15일(계대 배양 2) 및 60일(계대 배양 10) 후에 카운트하였다.
(C) 총 100 개의 위샘/웰을 FGF7/KGF(K) 또는 FGF10(F)가 보충된 Wnt3A 처리된 배지(WCM)+EGF+노긴 및 R-스폰딘(둘 다 100 및 1000 ng/㎖로 시험됨)에 시딩하였다. 발아 오르가노이드의 수를 배양물 중에서 4일(계대 배양 7) 후에 카운트하였다. 전형적인 실험을 나타내었다.
(D) 오르가노이드로 발달하는 단리된 위샘. 시딩 후 1, 2, 3, 4, 7일째의 차등 간섭 대비 영상들. 1주일 후에, 배양물은 1:5 또는 1:6 분할을 필요로 하였다. 계대 배양 및 유지를 보충 자료 및 방법 섹션에 개시된 바와 같이 수행하였다. 배양물 중에서 15일, 3 개월, 4.5 및 6 개월 후 상기 배양물의 전형적인 영상들; (10x 배율).
(E) 대조군 처리된 배지에서 증식한 5일된 배양물의 예. 상기 배양물은 증식하지 않고 샘 도메인을 형성하는데 실패하였다. 이러한 조건 하에서 상기 배양물은 7일 이하로 생존하였다.
(F) 3 개월된 위 오르가노이드의 전체 E-카데린 염색.
도 34. 단일 Lgr5+ve 세포는 시험관 내에서 오래 사는 위 오르가노이드를 형성한다.
(A) Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 마우스 위로부터 새로 단리한 유문 위 유닛의 공 초점 분석. 화살표들은 GFPhi(회색), GFPlo(흑색) 및 GFP-ve(백색)의 독특한 집단들을 나타낸다.
(B) Lgr5-EGFP-ve 세포는 그의 GFP 발현 수준에 따라 상기 GFPlo 및 GFP-ve 집단으로부터 구분된다. FSC, 전방 산란.
(C) 단일 Lgr5+ve 세포로부터 기원하는 성장하는 오르가노이드의 전형적인 예. 화살표는 7일째에 샘-형 도메인 발아 돌기의 형성을 나타낸다. 원래의 배율: 1 내지 4일; 40x 배율, 5 내지 6일; 20x 배율, 7 내지 8일; 10x 배율 및 9일; 5x 배율.
(D) 단일 Lgr+5ve 세포로부터 유래한 오르가노이드를 해리시키고 매 5 내지 7일마다 분할하였다. 3 개월된 배양물의 전형적인 영상들. 원래의 배율: 좌측 패널; 4x 배율, 우측 패널; 10x 배율.
(E) 단일 GFPhi 세포로부터 증식한 14일된 위 배양물에서 Lgr5 EGFP-발현 세포의 공 초점 분석. Lgr5-GFP+ve 세포가 상기 샘 도메인의 기부에 위치함이 주목된다(백색 화살표: 10x 배율).
(F) 1.5 시간 동안 티미딘 동족체 EdU(적색)와 함께 배양된 오르가노이드. 오직 샘 도메인만이 EdU와 결합한다(백색 화살표; 20x 배율). 대비 염색, 4,6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 핵).
(G) Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP 정보제공 마우스의 단세포 배양물로부터 2 주된 배양물을 20 시간 동안 시험관 내에서 타목시펜으로 자극하고 지시된 날짜에 영상화하였다. YFP 형광(황색)은 산란된 단일 황색 세포(1.5일)가 시험관 내에서 다수의 자손들을 발생시킴을 보인다. YFP+ve 세포가 중심 관강을 향해 이동함이 주목된다(백색 점선 원).
(H) Lgr5+ve 단세포로부터 유래된 2 개월된 배양물로부터의 위-특이적 유전자의 실험 분석. 배양물을 고(좌측 패널) 또는 저(중간 패널) Wnt3A 배지에서 유지시켰다. 위-유래한 배양물이 장 특이적 유전자들에 음성임이 주목된다(우측 패널).
(I) 10일 이상 저 Wnt3A 배지 중에서 유지된 배양물. 상부 패널: ECad 염색(적색, 상피 유래한 오르가노이드)의 공 초점 영상. 대비 염색, 훽스트 33345(청색). 하부 패널: Tff2에 대해 염색된 파라핀 절편(갈색, 목 점액 세포), 과요오드산-쉬프(적색, 피트 세포), MUC5AC(갈색, 피트 세포) 및 크로모그라닌 A(갈색, 장내분비 세포)
소장 및 대장의 유문 부위를 피복하는 상피는 관강 돌출부, 융모 및 함입부, 장샘을 포함한다. 상기 장샘-융모 축을 따라 있는 각각의 세포는 양극화되며, 이때 상기 장 융모의 상단 또는 결장 장샘의 상부 위치에 있는 세포들이 가장 분화되고 상기 관강 내로 계속해서 빠져나간다. 상기 장샘의 기부에 존재하는 줄기 세포의 연속적인 증식 및 상기 장샘의 중간에 존재하는 전구 세포들의 대량 증식은 상기 발산된 세포들의 적합한 대체를 보장한다.
줄기 세포는 성인 인간 및 마우스의 많은 기관들에서 발견된다. 개별적인 조직들에서 성인 줄기 세포의 정확한 특성들의 큰 변화가 있을 수 있지만, 성인 줄기 세포는 하기의 특성들을 공유한다: 상기 세포는 미분화된 표현형을 유지하고; 상기 세포의 자손은 부속 조직 중에 존재하는 모든 계통들을 향해 분화할 수 있으며; 상기 세포는 생애 전체를 통해 자기 유지 능력을 보유하고; 상기 세포는 손상 후 부속 조직을 재생시킬 수 있다. 줄기 세포는 특화된 장소인 줄기 세포 니치(상기 줄기 세포 집단의 유지에 적합한 세포-세포 접촉 및 신호를 공급한다) 중에 존재한다.
상피 줄기 세포는 상기 상피를 구성하는 독특한 세포 유형들을 형성할 수 있다. 일부 상피, 예를 들어 피부 또는 장은 빠른 세포 턴오버를 보이며, 이는 상기 존재하는 줄기 세포들이 연속적으로 증식함에 틀림없음을 가리킨다. 다른 상피들, 예를 들어 간 또는 췌장은 통상적인 조건 하에서 매우 느린 턴오버를 보인다.
장샘을 숙련가에게 공지된 프로토콜에 의해 공장, 회장 및 결장을 비롯한 십이지장, 소장 및 대장, 및 위의 유문 부위로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 장샘을 단리된 조직과, 세포를 상기 세포와 기저막 및 기질 세포 유형과의 칼슘- 및 마그네슘-의존성 상호작용으로부터 떼어놓는 킬레이트제와 함께 배양함으로써 단리할 수 있다. 상기 조직을 세척한 후에, 상기 상피 세포층을 유리 슬라이드에 의해 점막 밑으로부터 긁어내어 다진다. 이어서 이를 트립신 중에서 배양하거나, 보다 바람직하게는 EDTA 및/또는 EGTA, 및 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 단계를 사용한 절단되지 않은 조직 단편 및 단일 세포의 장샘으로부터의 분리를 수행한다. 다른 단백질분해 효소, 예를 들어 콜라게나제 및/또는 디스파제 I을 트립신 대신에 사용할 수 있다. 유사한 방법들을 사용하여 췌장 및 위의 단편들을 단리한다.
상피 조직으로부터 세포를 단리하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 방법은 줄기 세포가 그의 표면상에서 큰 G 단백질-결합된 수용체(GPCR) 상과에 속하는 Lgr5 및/또는 Lgr6을 발현한다는 사실에 근거한다. 상기 Lgr 상과는 리간드 결합에 중요한 큰 류신-풍부 엑토도메인을 운반하는데 유일하다. Lgr5 및 Lgr6에 대한 리간드는 아직 문헌에 개시되어 있지 않다. 따라서 바람직한 방법은 상기 상피 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하고, 상기 세포 현탁액을 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물과 접촉시키고, 상기 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물을 단리하고, 상기 결합 화합물로부터 줄기 세포를 단리함을 포함한다. 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을, 상기 단계에서 트립신으로 처리한 상피 줄기 세포가 다소 낮은 생존율을 발생시키는 것으로 밝혀졌으므로, 상기 단리된 장샘으로부터 기계적으로 생성시키는 것이 바람직하다.
바람직한 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물은 항체, 예를 들어 Lgr5 또는 Lgr6의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하고 결합하는 단클론 항체, 예를 들어 마우스 및 래트 단클론 항체를 포함하는 단클론 항체를 포함한다. 상기와 같은 항체를 사용하여, Lgr5 및/또는 Lgr6-발현 줄기 세포를 숙련가에게 명백한 바와 같이, 예를 들어 자기 비드의 도움으로 또는 형광-활성화된 세포 분류를 통해 단리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 상피 줄기 세포를 장샘, 위 단편 또는 췌장 단편으로부터 단리한다. 예를 들어, 상기 상피 줄기 세포를 장으로부터 단리한 장샘으로부터 단리한다. 바람직한 상피 줄기 세포를 십이지장, 공장 및 회장을 포함한 소장, 췌장 또는 위로부터 단리한다.
단리된 줄기 세포를 바람직하게는 상기 줄기 세포가 자연적으로 존재하는 세포 니치를 적어도 부분적으로 모방하는 미세환경에서 배양한다. 상기 세포 니치를, 상기 줄기 세포를 생물 물질, 예를 들어 줄기 세포 운명을 조절하는 핵심 조절 신호를 나타내는 기질, 골격, 및 배양 기질의 존재 하에서 배양함으로써 모방한다. 상기 생물물질은 천연, 반-합성 및 합성 생물물질, 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다. 골격은 2 차원 또는 3 차원 네트워크를 제공한다. 상기 골격에 적합한 합성 물질은 다공성 고체, 나노섬유, 및 하이드로젤 중에서 선택된 중합체, 예를 들어 자기-조립 펩타이드를 포함한 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 퓨마레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리셀룰로스 아세테이트 및/또는 이들의 공중합체로 구성된 하이드로젤을 포함한다(예를 들어 문헌[Saha et al., 2007, Curr Opin Chem Biol. 11(4):381-387]; [Saha et al., 2008, Biophysical Journal 95:4426-4438]; [Little et al., 2008, Chem. Rev 108, 1787-1796]을 참조하시오). 숙련가에게 공지된 바와 같이, 상기 골격의 역학적 성질, 예를 들어 탄성은 줄기 세포의 증식, 분화 및 이동에 영향을 미친다. 바람직한 골격은, 예를 들어 조직 재생 및/또는 상처 치유를 촉진하기 위해 환자에 이식 후 천연 성분들에 의해 대체되는 생분해성 (공)중합체를 포함한다. 더욱 또한 상기 골격은 환자에 이식 후 면역원 반응을 실질적으로 유도하지 않는 것이 바람직하다. 상기 골격에 천연, 반-합성 또는 합성 리간드가 보충되며, 상기 리간드는 줄기 세포의 증식 및/또는 분화, 및/또는 이동에 필요한 신호를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 리간드는 한정된 아미노산 단편을 포함한다. 상기 합성 중합체의 예는 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F127 블록 공중합체 계면활성제(BASF), 및 에티소브(Ethisorb)(등록상표)(Johnson and Johnson)를 포함한다.
세포 니치는 줄기 세포 및 주변 세포, 및 상기 니치 중에서 상기 세포들에 의해 생성되는 세포 외 기질(ECM)에 의해 부분적으로 결정된다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 단리된 장샘 또는 상피 줄기 세포를 ECM에 부착시킨다. ECM은 다양한 다당류, 물, 엘라스틴 및 당단백질들로 구성되며, 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한다. ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비된다. 상이한 유형의 ECM이 공지되어 있으며, 상이한 유형의 당단백질 및/또는 당단백질들의 상이한 조합을 포함하는 상이한 조성을 포함한다. 상기 ECM을, ECM-생산 세포, 예를 들어 섬유아세포를 상기 세포의 제거 및 단리된 장샘 또는 상피 줄기 세포의 첨가 전에, 용기 중에서 배양함으로써 제공할 수 있다. 세포 외 기질-생산 세포의 예는 주로 콜라겐과 프로테오글리칸을 생산하는 연골세포, 주로 IV 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 생산하는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III 및 V형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생산하는 결장 근섬유아세포이다. 한편으로, 상기 ECM을 상업적으로 제공한다. 상업적으로 입수할 수 있는 세포 외 기질의 예는 세포 외 기질 단백질(Invitrogen) 및 매트리겔(Matrigel)TM(BD Biosciences)이다. 줄기 세포 배양을 위한 ECM의 사용은 상기 줄기 세포의 장기 생존 및 미분화된 줄기 세포의 연속된 존재를 향상시켰다. ECM의 부재 하에서, 줄기 세포 배양물을 더 오랜 기간 동안 배양할 수 없었으며 미분화된 줄기 세포의 계속된 존재가 관찰되지 않았다. 또한, ECM의 존재는 3차원 조직 오르가노이드(상기 ECM의 부재 하에서는 배양될 수 없었다)의 배양을 허용하였다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 ECM은 2 개 이상의 독특한 당단백질, 예를 들어 2 가지 상이한 유형의 콜라겐 또는 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. 상기 ECM은 합성 하이드로겔 세포 외 기질 또는 천연 ECM일 수 있다. 가장 바람직한 ECM은, 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함하는 매트리겔TM(BD Biosciences)에 의해 제공된다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 배지를 포함한다. 바람직한 세포 배양 배지는 7.4(바람직하게는 7.2 내지 7.6, 또는 7.2 이상 7.6 이하)의 pH에서 카보네이트-계 완충제로 완충되어 한정된 합성 배지이며, 이때 세포를 5% 내지 10% CO2, 또는 5% 이상 10% 이하의 CO2, 바람직하게는 5% CO2를 포함하는 분위기에서 배양한다. 바람직한 세포 배양 배지를 글루타민, 인슐린, 페니실린/스트렙토마이신 및 트랜스페린이 보충된 DMEM/F12 및 RPMI 1640 중에서 선택한다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 무 혈청 배양을 위해 최적화되고 이미 인슐린을 포함하는 어드밴스드(Advanced) DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI를 사용한다. 이 경우에, 상기 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI 배지를 바람직하게는 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한다. 더욱 또한 상기 세포 배양 배지를 정제된, 천연, 반합성 및/또는 합성 성장 인자로 보충하며 상기 배지는 한정되지 않은 성분, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어 B27(Invitrogen), N-아세틸시스테인(Sigma) 및 N2(Invitrogen) 등의 보충제는 일부 세포의 증식을 자극하며 필요에 따라 상기 보충제를 상기 배지에 추가로 첨가할 수 있다.
상기 기본 배양 배지에 첨가되는 성분은 BMP 억제제이다. BMP는 2 개의 상이한 수용체 세린/쓰레오닌 키나제, I 및 II형 수용체로 이루어진 수용체 복합체에 이량체성 리간드로서 결합한다. 상기 II형 수용체는 상기 I형 수용체를 인산화하여, 상기 수용체 키나제를 활성화시킨다. 상기 I형 수용체는 특정한 수용체 기질(SMAD)를 후속적으로 인산화하여, 신호 전달 경로를 생성시켜 전사 활성을 유도한다.
상기 BMP 억제제는 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제로서 정의되며, 여기에서 상기 BMP 활성은 예를 들어 상기 BMP 분자의 BMP 수용체에의 결합을 방지하거나 억제함으로써 중화된다. 한편으로, 상기 억제제는 길항물질 또는 역 작용물질로서 작용하는 작용제이다. 이러한 유형의 억제제는 BMP 수용체와 결합하여 상기 수용체에 대한 BMP의 결합을 방지한다. 상기 후자의 예는 BMP 수용체와 결합하고 BMP의 항체-결합된 수용체에의 결합을 방지하는 항체이다.
상기 BMP 억제제는 세포에서 BMP-의존 활성을 상기 억제제 부재 하의 BMP 활성 수준에 비해 90% 이하, 보다 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 0%까지 억제한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, BMP 활성을 예를 들어 문헌[Ziberberg et al., 2007. BMC Cell Biol. 8:41]에 예시된 바와 같이, BMP의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
천연 BMP-결합 단백질의 여러 가지 부류들, 예를 들어 노긴(Peprotech), 코딘 및 코딘 도메인을 포함하는 코딘형 단백질(R&D systems), 폴리스타틴 및 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리스타틴-관련된 단백질(R&D systems), DAN 및 DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 DAN형 단백질(R&D systems), 스클레로스틴/SOST(R&D systems), 데코린(R&D systems), 및 알파-2 마크로글로불린(R&D systems)이 공지되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 BMP 억제제를 노긴, DAN, 및 써베루스 및 그렘린을 포함하는 DAN형 단백질(R&D systems) 중에서 선택한다. 이들 확산성 단백질은 BMP 리간드와 다양한 정도의 친화성으로 결합할 수 있고 신호전달 수용체에 대한 이들의 접근을 억제할 수 있다. 기본 배양 배지에의 상기 BMP 억제제들 중 어느 하나의 첨가는 줄기 세포의 상실을 방지한다(그렇지 않으면 약 2 내지 3 주 배양 후에 상실이 발생한다).
가장 바람직한 BMP 억제제는 노긴이다. 노긴을 바람직하게는 기본 배양 배지에 10 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 20 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 50 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 100 ng/㎖ 이상의 농도로 첨가한다. 가장 바람직한 농도는 대략 100 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖이다. 줄기 세포의 배양 중에, 상기 BMP 억제제를 바람직하게는 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가하며, 이러는 동안 상기 배양 배지는 바람직하게는 4일마다 새로 공급된다.
상기 기본 배양 배지에 첨가되는 추가의 성분은 Wnt 작용물질이다. Wnt 신호전달 경로는 Wnt 단백질이 프리즐드(Frizzled) 수용체 패밀리 구성원의 세포-표면 수용체에 결합할 때 발생하는 일련의 사건들에 의해 한정된다. 상기 결과 액신, GSK-3, 및 세포 내 β-카테닌을 분해하는 단백질 APC를 포함하는 단백질들의 복합체를 억제하는 디셰블드(Dishevelled) 패밀리 단백질이 활성화된다. 생성되는 농축된 핵 β-카테닌은 TCF/LEF 패밀리 전사 인자들에 의한 전사를 향상시킨다.
Wnt 작용물질은 세포에서 TCF/LEF-매개된 전사를 활성화하는 작용제로서 정의된다. 따라서 Wnt 작용물질은 상기 Wnt 패밀리 단백질 중 어느 하나 및 전부를 포함하는 프리즐드 수용체 패밀리 구성원과 결합하여 이를 활성화하는 진정한 Wnt 작용물질, 세포 내 β-카테닌 분해의 억제제, 및 TCF/LEF의 활성화제 중에서 선택된다. 상기 Wnt 작용물질은 상기 분자 부재 하에서의 상기 Wnt 활성 수준에 비해, 세포 중에서 Wnt 활성을 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상까지 자극한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, Wnt 활성을 예를 들어 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 정보제공 인자 구조물에 의해 Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다(Korinek et al., 1997, Science 275:1784-1787).
Wnt 작용물질은 Wnt-1/Int-1; Wnt-2/Irp(Int-1 관련 단백질); Wnt-2b/13; Wnt-3/Int-4; Wnt-3a(R&D sytems); Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6(Kirikoshi H et al. 2001. Biochem Biophys Res Com 283: 798-805); Wnt-7a(R&D sytems); Wnt-7b; Wnt8a/8d; Wnt-8b; Wnt-9a/14; Wnt-9b/14b/15; Wnt-10a; Wnt-10b/12; Wnt-11; 및 Wnt-16을 포함하는 분비 당단백질을 포함한다. 인간 Wnt 단백질들에 대한 개요가 문헌["THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS", R&D Systems Catalog, 2004]에 제공되어 있다. 추가의 Wnt 작용물질로는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 및 조절에 관련되고 4 개의 구성원(R-스폰딘 1(NU206, Nuvelo, San Carlos, CA), R-스폰딘 2(R&D sytems), R-스폰딘 3 및 R-스폰딘-4)을 포함하는 분비 단백질의 R-스폰딘 패밀리; 및 노린(또한 노리병 단백질 또는 NDP라고도 칭함)(R&D sytems)(상기 프리즐드-4 수용체에 높은 친화성으로 결합하고 상기 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 유도한다는 점에서 Wnt 단백질과 같은 기능을 하는 분비 조절 단백질이다)(Kestutis Planutis et al.(2007) BMC Cell Biol. 8:12)이 있다. 상기 Wnt 신호전달 경로의 소-분자 작용물질인 아미노피리미딘 유도체가 최근에 동정되었으며, 이는 또한 Wnt 작용물질로서 명백히 포함된다(Liu et al.(2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44, 1987-90).
공지된 GSK-억제제는 작은-간섭 RNA(siRNA; 세포 신호전달), 리튬(Sigma), 켄파울론(Biomol International; Leost, M. et al.(2000) Eur. J. Biochem. 267, 5983-5994), 6-브로모인디루빈-30-아세톡심(Meijer, L. et al.(2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266), SB 216763 및 SB 415286(Sigma-Aldrich), 및 GSK-3과 액신과의 상호작용을 방지하는 FRAT-패밀리 구성원 및 FRAT-유도된 펩타이드를 포함한다. 개요가 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Meijer et al.,(2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471-480]에 제공되어 있다. GSK-3 억제의 수준을 측정하기 위한 방법 및 분석이 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Liao et al 2004, Endocrinology, 145(6):2941-9]에 개시된 바와 같은 방법 및 분석을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 Wnt 패밀리 구성원, R-스폰딘 1 내지 4, 노린, 및 GSK-억제제 중 하나 이상 중에서 선택된다. 본 발명자들은 상기 기본 배양 배지에 하나 이상의 Wnt 작용물질의 첨가가 상피 줄기 세포 또는 단리된 장샘의 증식에 필수적임을 발견하였다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1을 포함하거나 이로 이루어진다. R-스폰딘 1을 바람직하게는 기본 배양 배지에 50 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 100 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 200 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 300 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 500 ng/㎖ 이상의 농도로 첨가한다. R-스폰딘 1의 가장 바람직한 농도는 대략 500 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖이다. 줄기 세포의 배양 중에, 상기 Wnt 패밀리 구성원을 바람직하게는 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가하며, 이러는 동안 상기 배양 배지는 바람직하게는 4일마다 새로 공급한다.
바람직한 실시태양에서, Wnt 작용물질을 R-스폰딘, Wnt-3a 및 Wnt-6으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다. 보다 바람직하게는, R-스폰딘 및 Wnt-3a를 모두 Wnt 작용물질로서 사용한다. 상기 조합은 놀랍게도 오르가노이드 형성에 상승효과를 가지므로 특히 바람직하다. 바람직한 농도는 R-스폰딘의 경우 대략 500 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖이고, Wnt3a의 경우 대략 100 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖이다.
상기 기본 배양 배지에 첨가되는 더욱 추가의 성분은 상피 성장 인자(EGF:(Peprotech), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파; Peprotech), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; Peprotech), 뇌-유래된 신경친화성 인자(BDNF; R&D Systems), 및 각질세포 성장 인자(KGF; Peprotech)를 포함하는 성장 인자 패밀리 중에서 선택된 분열촉진 성장 인자이다. EGF는 각종 배양된 외배엽 및 중배엽 세포들에 대해 효능 있는 분열촉진 인자이며 생체 내 및 시험관 내에 특정 세포들 및 세포 배양물 중 일부 섬유아세포의 분화에 충분한 영향을 미친다. 상기 EGF 전구체는, 단백질 분해 절단되어 세포를 자극하는 53-아미노산 펩타이드 호르몬을 생성시키는 막-결합된 분자로서 존재한다. 바람직한 분열촉진 성장 인자는 EGF이다. EGF를 바람직하게는 상기 기본 배양 배지에 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하의 농도로 첨가한다. 바람직한 농도는 10, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 ng/㎖ 이상 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100 ng/㎖ 이하이다. 보다 바람직한 농도는 50 이상 100 ng/㎖ 이하이다. 훨씬 더 바람직한 농도는 약 50 ng/㎖ 또는 50 ng/㎖이다. 동일한 농도들을 FGF, 바람직하게는 FGF10 또는 FGF7에 대해 사용할 수 있다. 하나보다 많은 FGF, 예를 들어 FGF7 및 FGF10을 사용하는 경우, FGF의 농도는 상기 한정된 바와 같고, 사용된 FGF의 전체 농도를 지칭한다. 줄기 세포의 배양 중에, 상기 분열촉진 성장 인자를 상기 배양 배지에 이틀마다 첨가하는 것이 바람직하며, 이러는 동안 상기 배양 배지를 바람직하게는 4일마다 새로 공급한다. 상기 bFGF 패밀리의 임의의 구성원을 사용할 수 있다. 바람직하게는 FGF7 및/또는 FGF10을 사용한다. FGF7은 또한 KGF(각질세포 성장 인자)로서 공지되어 있다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 분열촉진 성장 인자, 예를 들어 EGF와 KGF, 또는 EFG와 BDNF의 조합을 상기 기본 배양 배지에 첨가한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 분열촉진 성장 인자, 예를 들어 EGF와 KGF, 또는 EFG와 FGF10의 조합을 상기 기본 배양 배지에 첨가한다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시태양은 록(Rock)(Rho-키나제) 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 록 억제제의 첨가는, 특히 단일 줄기 세포의 배양 시 아노이키스를 방지하는 것으로 밝혀졌다. 상기 록 억제제를 바람직하게는 R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632; Sigma-Aldrich), 5-(1,4-다이아제판-1-일설포닐)아이소퀴놀린(파수딜 또는 HA1077; Cayman Chemical), 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀 다이하이드로클로라이드(H-1152; Tocris Bioschience) 중에서 선택한다. 상기 Rho-키나제 억제제, 예를 들어 Y-27632를 바람직하게는 상기 줄기 세포 배양의 처음 7일 동안 이틀마다 배양 배지에 첨가한다. Y27632의 바람직한 농도는 10 M이다.
더욱 추가의 실시태양에서, 본 발명에 따른 방법은 노치(Notch) 작용물질을 추가로 포함하는 배양물을 포함한다. 노치 신호전달은 세포-운명 결정뿐만 아니라 세포 생존 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 노치 수용체 단백질은 다수의 표면-결합된 또는 분비된 리간드, 예를 들어 비 제한적으로 델타 1, 재기드(Jagged) 1 및 2, 델타형 1, 델타형 3, 델타형 4와 상호작용할 수 있다. 리간드 결합 시, 노치 수용체는 ADAM 프로테아제 패밀리의 구성원들을 수반하는 일련의 절단 사건뿐만 아니라 감마 세크레타제 프레시닐린에 의해 조절된 막 내 절단에 의해 활성화된다. 상기에 의해, 하부 유전자들을 전사에 의해 활성화하는 경우 상기 노치의 세포 내 도메인이 핵으로 전좌된다. 바람직한 노치 작용물질을 재기드 1 및 델타 1, 또는 이들의 활성 단편 또는 유도체 중에서 선택한다. 가장 바람직한 노치 작용물질은 서열 CDDYYYGFGCNKFCRPR을 갖는 DSL 펩타이드(Dontu et al., 2004. Breast Cancer Res 6:R605-R615)이다. 상기 DSL 펩타이드(ANA spec)를 바람직하게는 10 μM 내지 100 nM 또는 10 μM 이상 100 nM 이하의 농도로 사용한다. 특히 배양 첫 주 동안 노치 작용물질의 첨가는 배양 효율을 2 내지 3의 인자까지 증가시킨다. 상기 노치 작용물질을 배양 배지에, 바람직하게는 상기 줄기 세포 배양의 처음 7일 동안 이틀마다 첨가한다.
노치 작용물질은 세포에서 노치 활성을 상기 분자 부재 하의 노치 활성 수준에 비해 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상까지 자극하는 분자로서 정의된다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, 노치 활성을 예를 들어 개시된 바와 같은 4xwtCBF1-루시페라제 정보제공 인자 구조물의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다(Hsieh et al., 1996. Mol. Cell. Biol. 16, 952-959).
본 발명은 또한 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제, Wnt 작용물질; 및 EGF, TGF, KGF, FGF10 및 FGF로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분열촉진 성장 인자 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 바람직하게는, 분열촉진 인자를 EGF, TGF- 및 KGF, 또는 EGF, TGF- 및 FGF7, 또는 EGF, TGF- 및 FGF, 또는 EGF 및 KGF, 또는 EGF 및 FGF 7, 또는 EGF 및 FGF, 또는 TGF 및 KGF, 또는 TGF 및 FGF7, 또는 TGF 및 FGF로 이루어진 그룹으로부터 선택한다. EGF를 TGF로 대체할 수도 있다. 여러 가지 바람직한 배양 배지가 수득되는 오르가노이드에 따라 나중에 확인된다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포 외 기질 상에서의 상피 줄기 세포 또는 단리된 장샘의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 허용한다. 세포 배양 배지란 용어는 배지, 배양 배지 또는 세포 배지와 동의어이다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 제 1 배양 배지는 BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및 각질세포 성장 인자 모두, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 B27, N2 및 N-아세틸시스테인의 보충과 함께 포함한다. KGF를 FGF, 또는 FGF10에 의해 대체할 수 있다. [Leu15]-가스트린 I, 엑센딘 및/또는 니코틴아미드를 또한 상기 제 1 배지에 첨가할 수도 있다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 제 2 배양 배지라 불리는 상기 배양 배지는 노긴, 및 바람직하게는 [Leu15]-가스트린 I, 엑센딘 및/또는 니코틴아미드가 없음을 제외하고 상기 제 1 배지와 동일하다. 따라서 상기 제 2 배양 배지는 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및 각질세포 성장 인자 모두, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 B27, N2 및 N-아세틸시스테인의 보충과 함께 포함한다. KGF를 또한 FGF 또는 FGF10에 의해 대체할 수 있다.
이들 2 개의 세포 배양 배지는 상기 배지 중에서 매트리겔 세포 외 기질에서 증식하여 세포 외 기질 상에 췌장 섬-형 구조물을 포함하는 췌장 오르가노이드를 형성하는 췌장 줄기 세포를 포함하는 췌장 단편을 지지한다. 노긴이 없는 상기 제 2 배지는 최소 배지인 반면 노긴이 있는 제 1 배지는 췌장 단편 확장을 위한 개선된 배지를 도출한다. 확장 배지는 바람직하게는 2일 이상의 배양 기간 동안 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진하는 배지이다.
적어도 5일 이내에 췌장 오르가노이드로의 세포의 분화를 촉진, 유도할 수 있는 제 3 배지가 고안되었다. 췌장 오르가노이드의 형성에 대한 하나의 바람직한 분화 마커는 뉴로제닌-3이며, 이의 발현은 RT-PCR에 의해 또는 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어 제 3 또는 제 4 배지로서 분화 배지는 뉴로제닌-3이 상기 배지 중에서 5일 이상 배양 후에 RT-PCR에 의해 또는 면역조직화학에 의해 검출될 수 있을 때 작용성이라고 한다. 상기 분화 단계를 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 제 1 또는 제 2 배지로서의 배지 중에서 제 1 확장 단계 후에 수행한다. 상기 제 3 배지는 FGF 또는 KGF 또는 FGF10이 없음을 제외하고 상기 정의된 제 2 배지와 동일하다. 상기 제 3 배지는 Wnt 작용물질로서 상피 성장 인자 및 R-스폰딘 1을 B27, N2 및 N-아세틸시스테인의 보충과 함께 포함한다.
상기 제 1 배지와 동일하지만 [Leu15]-가스트린 I 및/또는 엑센딘이 또한 보충된 제 4 배지가 고안되었다. 상기 제 3 배지는 최소 분화 배지인 반면, 상기 제 4 배지는 개선된 분화 배지이다. 분화 배지는 바람직하게는 5일 이상의 배양기간 동안 세포의 특이적인 분화를 유도하거나 촉진하는 배지이다. 췌장 오르가노이드의 경우에, 분화를 본 발명에서 앞서 정의한 바와 같이 췌장 계통과 관련된 특이 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 상기 췌장 계통과 관련된 다른 마커들의 예로는 분화 배지에서 적어도 7, 8, 9, 10일의 배양 후에 RTPCR 또는 면역조직화학에 의해 검출할 수 있는 인슐린의 분비가 있다.
따라서 췌장 오르가노이드의 수득 및/또는 배양에 바람직한 방법에서, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를 제 1 또는 제 2 배지 중에서 첫 번째 단계로 배양하고, 후속적으로 두 번째 단계에서 상기 제 3 또는 제 4 배지 중에서 배양한다. 상기 첫 번째 단계는 2 주 이상의 지속기간을 가질 수도 있으며 더 길 수도 있다. 첫 번째 단계를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개월 넘게 수행할 수도 있다. 상기 두 번째 단계는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 이상의 지속기간을 가질 수도 있다. 각각의 단계를 바람직하게는 본 발명에 정의된 바와 같은 세포 외 기질을 사용하여 수행한다. 각 배지 중에 존재하는 각 화합물의 바람직한 농도는 이미 본 명세서 또는 실시예에 한정되었다. 바람직한 실시태양에서, 췌장 오르가노이드가 재생 의학에 사용되는 경우, 이는 상피 세포 또는 단리된 췌장 단편으로부터 출발한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 췌장 오르가노이드가 약물 발견 시스템으로서 사용되는 경우, 선종으로부터 출발한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 췌장 오르가노이드는 본 발명의 추가의 태양이다. 따라서, 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 배지를 제공한다.
우리가 알고 있는 바에 의하면, 이는, 작용성이고 10 개월 이상 배양 후에 살아있는(실험 부분 참조) 췌장 오르가노이드를 수득한 최초이다. 작용성은 바람직하게는 인슐린의 분비를 특징으로 한다. 수득되는 췌장 오르가노이드의 최종 량은 배양 지속기간과 상관이 있기 때문에, 숙련가는 본 발명이 선봉의 발명이며 예를 들어 재생 의학에 잠재적으로 새로운 가능성을 연다는 것을 안다.
따라서, 췌장 오르가노이드의 수득 및/또는 배양의 바람직한 방법에서, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를 첫 번째 단계로, B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된, EGF, KGF 또는 FGF, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 포함하는 배지에서 세포 외 기질과 접촉하여 배양하고, 후속적으로 두 번째 단계로 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된, EGF 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 포함하는 배지에서 배양한다.
본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서, 배양 배지는 BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt3a를 포함한다. 상기 세포 배양 배지는 세포 외 기질로서 매트리겔을 포함하는 3차원 배양물 중의 단리된 소장 장샘의 배양을 지지한다.
본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서, 배양 배지는 BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘1, 노치 작용물질로서 재기드-DSL 펩타이드 및 Rho 키나제 억제제 Y-27632를 포함한다. 상기 세포 배양 배지는 세포 외 기질로서 매트리겔을 포함하는 3차원 배양물 중의 단리된 단일 상피 줄기 세포의 배양을 지지한다.
본 발명에 따른 더욱 추가의 바람직한 방법에서, 배양 배지는 B27, N2 및 N-아세틸시스테인 중 하나 이상의 보충과 함께, BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및/또는 BDNF, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a를 포함한다. Wnt-3a는 상기 바람직한 방법에서 바람직한 Wnt 작용물질이다. 상기 세포 배양 배지는 세포 외 기질로서 매트리겔을 포함하는 3 차원 배양물 중의 단리된 결장 장샘의 배양을 지지한다. 상기 배지는 2일 이상의 배양 기간 동안 세포의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 촉진할 수 있다. 결장 장샘의 형성에 대한 바람직한 분화 마커를 하기의 그룹 중에서 선택할 수도 있다: 장세포의 존재를 지시하는 알칼리성 포스파타제, 배상 세포의 존재를 지시하는 Muc2, 및 내분비 세포의 존재를 지시하는 뉴로제닉 3 또는 크로모그라닌. 이들 마커 각각의 발현을 RTPCR에 의해 또는 면역조직화학에 의해 검출할 수 있다. 결장 장샘의 수득을 위해 세포의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 촉진하기 위한 작용성 배지는 상기 동정된 마커들 중 하나 이상이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상의 배양기간 후에 검출될 수 있도록 하는 것이다. 바람직한 배지는 B27, N2 및 N-아세틸시스테인 중 하나 이상의 보충과 함께, BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및/또는 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a를 포함한다. 상기 배지를 본 발명의 추가의 태양을 나타내는 본 발명의 제 1 배지라 칭한다.
따라서, 결장 장샘의 수득 및/또는 배양에 바람직한 방법에서, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를 상기 나타낸 바와 같은 배지, 바람직하게는 제 5 배지에서 배양한다. 상기 방법을 바람직하게는 본 발명에 정의된 바와 같은 세포 외 기질을 사용하여 수행한다. 상기 배지 중에 존재하는 각 화합물의 바람직한 농도를 본 발명의 명세서 또는 실시예에서 이미 한정하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 결장 장샘은 본 발명의 추가의 태양이다. 우리가 알고 있는 바에 의하면, 이는, 작용성이고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 배양 후에 살아있는(실험 부분 참조) 결장 장샘이 수득된 최초이다. 작용성은 바람직하게는 상기 동정된 바와 같은 마커들 중 하나 이상의 존재를 특징으로 한다. 본 발명은 선봉의 발명이며 예를 들어 재생 의학에서 잠재적으로 새로운 가능성을 연다.
따라서, 결장 장샘의 수득 및/또는 배양의 바람직한 방법에서, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된, 노긴, EGF, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3을 포함하는 배지에서 세포 외 기질과 접촉하여 배양한다.
본 발명에 따른 더욱 추가의 바람직한 방법에서, 배양 배지는 Wnt-3a 또는 KGF가 보충되고 B27, N2, N-아세틸시스테인을 추가로 포함하는, BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 포함한다. 상기 배지를 제 6 배지라 칭하며 따라서 이는 본 발명의 추가의 태양을 나타낸다. KGF를 FGF에 의해 또는 FGF10에 의해 대체할 수도 있다. 상기 배지는 바람직하게는 B27, N2, N-아세틸시스테인을 추가로 포함하는, BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및 FGF10, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a를 포함한다. FGF10은 예를 들어 FGF7보다 더 양호한 결과를 제공하므로 FGF로서 바람직하다(도 32). 상기 세포 배양 배지는 세포 외 기질로서 매트리겔을 포함하는 3차원 배양물 중의 단리된 위 단편 또는 위 오르가노이드의 배양을 지지한다. 상기 제 6 배지는 위 단편의 확장을 위한 배지이다. 확장 배지는 바람직하게는 2일 이상의 배양 기간 동안 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진하는 배지이다. 적어도 2일 이내에 위 오르가노이드 또는 위 단편을 향한 세포의 분화를 촉진, 유도할 수 있는 추가의 배지, 즉 제 7 배지가 고안되었다. 상기 제 7 배지는 Wnt-3a의 농도가 상기 제 6 배지 중에 존재하는 것에 비해 감소된 것을 제외하고 상기 나타낸 제 6 배지와 동일하다. 상기 농도는 상기 제 6 배지 중에 존재하는 Wnt-3a 농도에 비해 적어도 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600% 이상 감소된다. 상기 제 7 배지는 B27, N2, N-아세틸시스테인 및 가스트린이 보충된, 상피 성장 인자, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt3a, 노긴 및 FGF10을 포함한다. 가스트린은 바람직하게는 1 nM의 농도로 사용된다. 상기 제 7 배지는 분화 배지이다. 분화 배지는 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상의 배양 기간 동안 세포의 특이적인 분화를 유도하거나 촉진하는 배지이다. 위 오르가노이드 또는 위 단편의 경우에, 분화를 상기 위 계통과 관련된 특이적인 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 상기 위 계통과 관련된 마커들의 예로는 MUC5AC(피트 세포 마커), GASTRIN 및/또는 SOMATOSTATIN(둘 다, 내분비 세포 마커)가 있다. 상기 마커들 중 하나 이상의 존재를 바람직하게는 RT-PCR 및/또는 면역조직화학 또는 면역형광을 사용하여 수행한다. 상기 마커 중 하나 이상의 존재를 바람직하게는 RT-PCR 및/또는 면역조직화학 또는 면역형광을 사용하여 수행한다. 이들 마커 중 하나 이상의 존재를 분화 조건에서 6일 이상, 보다 바람직하게는 10일 이상 후에 검출할 수 있다. 예를 들어 제 7 배지로서 분화 배지는 상기 동정된 마커들 중 하나 이상을 상기 배지에서 6일 이상 배양 후에 PCR에 의해 또는 면역조직화학에 의해 검출할 수 있을 때 작용성이라고 한다. 상기 분화 단계를 바람직하게는 상기 정의한 바와 같은 제 6 배지와 같은 배지 중에서 첫 번째 확장 단계 후에 수행한다.
따라서 위 단편의 수득 및/또는 배양에 바람직한 방법에서 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를 첫 번째 단계로 상기 제 6 배지 중에서 배양하고, 후속적으로 두 번째 단계로 상기 제 7 배지 중에서 배양한다. 각각의 단계를 바람직하게는 본 발명에 정의된 바와 같은 세포 외 기질을 사용하여 수행한다. 상기 첫 번째 단계는 3일 이상의 지속기간을 가질 수 있으며 더 길 수도 있다. 첫 번째 단계를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9보다 더 오래 수행할 수도 있다. 상기 두 번째 단계는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 이상의 지속기간을 가질 수 있다. 각 배지 중에 존재하는 각 화합물의 바람직한 농도는 이미 본 발명의 명세서 또는 실시예에 한정되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 위 단편은 본 발명의 추가의 태양이다.
따라서, 위 단편의 수득 및/또는 배양의 바람직한 방법에서, 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를 첫 번째 단계로, BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및 FGF10, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a를 포함하고 B27, N2, N-아세틸시스테인을 추가로 포함하는 배지에서, 후속적으로 두 번째 단계로 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된, 상피 성장 인자 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a, 노긴 및 FGF10을 포함하는 배지에서 세포 외 기질과 접촉하여 배양하고, 여기에서 상기 Wnt-3의 농도는 상기 첫 번째 단계에서 존재하는 Wnt-3a 농도에 비해 두 번째 단계에서 감소된다.
본 발명에 따른 더욱 추가의 바람직한 방법에서, 배양 배지는 BMP 억제제로서 노긴 및 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자를 포함한다. 상기 세포 배양 배지는 세포 외 기질로서 매트리겔을 포함하는 3차원 배양물 중의 단리된 선종 단편 또는 단리된 단일 선종 세포의 배양을 지지한다.
리간드, 예를 들어 Wnt3a를 배양 배지에 새로 가할 수 있다. 한편으로, 리간드는 세포 주를 상기 리간드를 발현하는 적합한 발현 구조물로 형질감염시키거나 감염시킴으로써 세포에서 발현된다. 상기 세포 주를 배양하고 분비된 리간드를 포함하는 배양 배지를 적합한 시간 간격으로 수확한다. 예를 들어 세포는 상기가 합류점에 도달하고 성장을 멈추자마자 곧 Wnt3a를 생산할 것이다. 상기 발현 구조물로 형질감염되지 않았거나 감염되지 않은 세포로부터의 배양 배지를 대조군으로서 사용한다. 상기 처리된 배지를 수확하고, Wnt3a와 같은 Wnt 작용물질의 존재를 검사하기 위해 TCF 반응성 원소들에 의해, 예를 들어 루시페라제 발현이 조절되는 분석에서 시험한다(Korinek et al., 1997. Science 275:1784-1787). 상기 배지를 조직 재생을 위해 배양물 중에 사용하는 경우 희석한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, 리간드의 과잉 첨가는 때때로 너무 적은 리간드의 첨가처럼 상기 배양에 유해하다. 따라서, 상기 처리된 배지의 실제 희석은 상기 시험에서 측정되는 리간드의 양에 따라 변할 것이다.
본 발명은 또한 상피 줄기 세포 또는 세포 외 기질 상에 상기 줄기 세포를 포함하는 단리된 오르가노이드 구조물의 배양을 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도를 제공하며, 이때 상기 줄기 세포는 바람직하게는 인간 태아 줄기 세포를 포함하지 않는다. 인간 성인 줄기 세포가 바람직하다. 더욱 또한, 소장, 결장 및 위로부터의 단일 분류된 상피 줄기 세포도 또한 본 발명에 따른 배양 배지 중에서 이들 3차원 오르가노이드를 개시시킬 수 있다. 본 발명은 또한 췌장 섬-형 구조를 포함하는 췌장 오르가노이드를 형성하는 줄기 세포를 포함하는 췌장 단편의 배양을 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도를 제공한다.
상기 줄기 세포는 췌장, 위, 장 또는 결장 상피 줄기 세포인 것이 바람직하며, 이때 가장 바람직한 줄기 세포는 소장 줄기 세포이다. 본 발명에 따른 배양 배지는 모든 분화된 세포 유형들이 존재하는 융모-형 상피 도메인을 발생시키는 동시에 단일 장샘이 수 회의 장샘 분열 사건을 겪는 장기적인 배양 조건의 확립을 허용하였다. 본 발명에 따른 배양 방법의 사용은 7 개월 이상, 8 개월 이상, 9 개월 이상, 10 개월 이상의 배양기간을 허용하였다.
배양된 장샘은 상기를 배양시킨 후에 극적인 형태학적 변화를 겪는다. 새로 단리된 장샘의 상부 개구는 밀봉되고 상기 부위는 점진적으로 부풀어 세포사멸성 세포들로 충전되게 되며, 훨씬 더 가능하게는 세포사멸성 세포는 상기 융모 끝에서 잘려나간다. 상기 장샘 부위는 장샘 분열의 회고 과정인, 추가적인 장샘을 생성시키는 연속적인 발아 사건들을 겪는 것으로 밝혀졌다. 상기 장샘-형 연장부는 증식성 세포, 파네쓰 세포, 장세포 및 배상세포를 포함한, 모든 분화된 상피 세포 유형들을 포함한다. 근섬유아세포 또는 다른 비-상피 세포들은 어떠한 단계에서도 상기 오르가노이드에서 확인되지 않았다.
상기 발아 장샘 구조물의 연장부는 융모-형 상피에 의해 피복되고 세포사멸성 세포체에 의해 충전된 중심 관강을 둘러싸는 >40의 장샘-형 구조물을 포함하는 오르가노이드를 생성시켰다. 상기 장샘-융모 오르가노이드는 융모-형 상피에 의해 피복된 중심 관강을 포함한다. 상기 관강은 연속적인 시간 간격으로 개방되어 상기 내용물을 상기 배지 내로 방출한다. 상기 오르가노이드를 계대 배양하고 본질적인 특성의 상실 없이 6 개월 이상 배양물 중에서 유지시킬 수 있다. 계대 배양은 바람직하게는 오르가노이드의 수동 단편화를 수반한다.
유사한 장샘-융모 오르가노이드 구조물이 단일 상피 줄기 세포를 배양할 때 형성된다. 약 1 주일 후에, 완전한 장샘에 의해 수득되는 장샘-융모 오르가노이드 구조물을 강하게 닮은 구조물이 형성된다. 상기 오르가노이드의 조직학적 분석은 상기 기본적인 장샘-융모 구조의 보존, 모든 분화된 세포 유형의 존재, 및 비-상피 요소들의 부재를 또한 밝혔다.
따라서 하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 배양 배지 중에서 상피 줄기 세포 또는 단리된 장샘의 배양으로부터 생성되는 융모-형 상피에 의해 피복된 중심 관강을 포함하는, 장샘-융모 오르가노이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 장샘-융모 오르가노이드를 본 발명의 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 췌장 단편을 배양함으로써 생성되거나 수득할 수 있는 췌장 오르가노이드를 제공한다. 상기 췌장 오르가노이드의 대략 20%는 상기 배양 시작 후 7일째에 발아 구조물을 형성한다. 상기 췌장 관은, 매우 느리게만 성장하는 샘 꽈리 조직과 대조적으로 빠르게 증식한다. 상기 췌장 오르가노이드의 계대 배양 후, 건강한 췌장 조직 중에 존재하는 췌장 랑게르한스 섬을 닮은, 인슐린을 분비하는 췌장 섬-형 구조가 관찰된다. 본 발명은 중심 관강을 포함하는 위 오르가노이드를 또한 제공한다. 바람직하게는 상기 위 오르가노이드를 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있다.
예를 들어 상기 오르가노이드 중의 췌장 섬의 존재를 증가시키거나 또는 위 단편 등의 단리된 단편의 배양을 더욱 지지하기 위해서 배양 배지에 첨가될 수 있는 추가의 성장 인자들은 사이클로파민(소닉-헤지호그 억제제; Tocris Bioscience), 액티빈, GLP(글루카곤 유사 펩타이드) 및 그의 유도체(엑센딘 4; California Peptide Research), 가스트린(Genscript), 노치 작용물질(재기드 펩타이드, Ana Spec), 니코틴아미드 및 Wnt 작용물질, 예를 들어 Wnt-3a를 포함한다. Wnt-3a는 단일 세포와 함께 배양을 시작할 때 사용되는 것이 유리하다.
본 발명은 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드의 수집물을 추가로 제공하며, 이들은 각각 10 초과, 바람직하게는 20 초과, 보다 바람직하게는 40 초과의 오르가노이드를 포함한다. 상기 장샘-융모 오르가노이드는 융모형 상피에 의해 피복된 중심 관강을 둘러싼다. 상기 관강은 세포사멸성 세포체들로 충전된다. 상기 장샘-융모 오르가노이드 중의 세포는 양극화되며, 이때 줄기 세포가 상기 구조의 기저에 존재한다. 상기 장샘형 구조의 상단은 상기 관강 내로 발산된 세포사멸성 세포를 포함한다. 상기 장샘-융모 오르가노이드의 수집물은 바람직하게는 10% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 20% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 50% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 60% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 70% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 80% 이상의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 90% 이상의 생육성 세포를 포함한다. 세포의 생육성을 훽스트 염색 또는 FACS 중의 프로피듐 요오다이드 염색을 사용하여 평가할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 재생 의학에서 본 발명에 따른 장샘-융모 오르가노이드, 위 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드의 용도를 제공한다.
고속 대량 작업처리를 목적으로, 상기 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드를 다중 웰 플레이트, 예를 들어 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트 중에서 배양한다. 분자들의 라이브러리를 사용하여 상기 오르가노이드에 영향을 미치는 분자를 확인한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩타이드 라이브러리(예를 들어 LOPAPTM, Sigma Aldrich), 지질 라이브러리(BioMol), 합성 화합물 라이브러리(예를 들어 LOP ACTM, Sigma Aldrich) 또는 천연 화합물 라이브러리(Specs, TimTec)를 포함한다. 더욱 또한, 상기 선종 세포의 자손 중에서 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이들 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 상기 세포를 바람직하게는 일정 기간 동안 다수 농도의 시험 작용제에 노출시킨다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 평가한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포에서의 임의의 변화, 예를 들어 비 제한적으로 증식의 감소 또는 상실, 형태 변화, 및 세포사를 망라하는데 사용된다. 상기 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드를 또한 상기 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드는 아닌, 상피 암종 세포를 특이적으로 표적화하는 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
상기 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드는, 잠재적인 신규 약물 또는 공지되거나 신규의 식품 보충제의 독성 분석에서 Caco-2 세포 등의 세포 주의 사용을 추가로 대체할 수 있다.
더욱 또한, 상기 장샘-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드를 적합한 조직 배양물 또는 동물 모델이 현재 없는 노로바이러스와 같은 병원체의 배양에 사용할 수 있다.
장샘-융모 오르가노이드를 포함하는 배양물은 재생 의학, 예를 들어 장 상피의 방사선 치료 후 및/또는 수술 후 회복, 염증성 장 질병, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염을 앓고 있는 환자의 장 상피 회복, 및 짧은 창자 증후군을 앓고 있는 환자의 장 상피 회복에 유용하다. 추가의 용도가 소장/결장의 유전적 질병이 있는 환자의 장 상피 회복에 존재한다. 췌장 오르가노이드를 포함하는 배양물은 재생 의학에, 예를 들어 췌장 또는 그의 일부 절제 후 이식물로서, 및 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병과 같은 당뇨병의 치료에 또한 유용하다.
또 다른 실시태양에서, 상기 확장된 상피 줄기 세포를 예를 들어 췌장 β-세포를 포함한 췌장 세포 및 간 세포 등의 관련 조직 운명에 재구성한다. 지금까지는, 성인 줄기 세포로부터 췌장 세포 또는 간 줄기를 재생시키는 것이 가능하지 않았다. 본 발명의 배양 방법은 밀접하게 관련된 상피 줄기 세포를 췌장 β-세포를 포함한 췌장 세포 및 간 세포로 트랜스-분화하는 인자의 분석을 가능하게 할 것이다.
유전자 요법을 손상되거나 병든 조직의 회복을 향한 방법에 추가로 사용할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들어 DNA 및/또는 RNA와 같이 줄기 세포로 유전 정보를 전달하는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클을 사용할 수 있다. 숙련가는 유전자 요법에서 표적화된 특정 유전자를 대체하거나 보수할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자를 게놈 내 비특이적인 위치에 삽입하여 비작용성 유전자를 대체할 수 있다. 또 다른 예에서, 비정상 유전자 서열을 상동 재조합을 통해 정상 유전자 서열에 대체할 수 있다. 한편으로, 선택적인 복귀 돌연변이는 유전자를 그의 정상 기능으로 복원시킬 수 있다. 추가의 예는 특정 유전자의 조절(유전자가 작용하거나 작용하지 않는 정도)을 변경하는 것이다. 바람직하게는, 상기 줄기 세포를 유전자 요법 접근법에 의해 생체 외 처리하고 후속적으로 포유동물, 바람직하게는 치료가 필요한 인간으로 옮긴다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상피 선종 세포의 배양 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 외 기질을 제공하고, 상피 선종 세포를 상기 세포 외 기질에 부착시키고, 상기 세포를, 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제, 및 EGF, TGF-알파 및 KGF로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분열촉진 성장 인자 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지의 존재 하에서 배양함을 포함한다. KGF를 FGF 또는 FGF10으로 대체할 수도 있다.
상피 결장 선종 세포는 APC 단백질을 암호화하는 유전자의 변경(그 결과 APC를 포함하는 단백질 복합체에 의한 세포 내 β-카테닌의 덜 효율적인 분해가 생성된다)을 포함한다. 결장 선종에 흔한 다른 돌연변이는 β-카테닌 또는 액신2의 돌연변이를 포함한다. 전체적인 결과는 핵 중 증가된 양의 β-카테닌으로 인한 향상된 TCF/LEF 신호전달이다. Wnt 작용물질이 없는 배양 배지는 선종 세포의 증식에 충분한 것으로 밝혀졌다.
상기 선종 세포를, EDTA 등의 해리제의 사용을 포함하는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 상피 선종으로부터 단리할 수 있다. 한편으로, 단일 Lgr5- 또는 Lgr-6-양성 선종 세포를 Lgr5-결합 화합물에 이어서 자기 비드 또는 FACS 분석을 사용하여 상기 선종으로부터 단리할 수 있다.
본 발명은 또한 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제 및 상피 성장 인자(EGF) 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지의 존재 하에서 배양된 상피 선종 세포의 자손을 제공한다. 상기 배양된 선종 세포는 장샘-융모-형 구조와 같은 양극화된 3차원 구조를 발생시킬 수 없다. 오히려, 선종 세포는 세포들이 말초 또는 중심 관광을 향해 랜덤하게 배향된 풍선형 구조를 형성한다. 다른 상피 세포 유형들로의 분화 징후는 없다. 이러한 결과는 상기 장샘-융모형 구조의 3차원 구성에서 APC에 대한 역할을 가리킨다.
또한, 본 발명은 동일한 배양 배지 중에서 배양된 확장된 정상 상피 세포에 비해 선종 세포에 특이적으로 영향을 미치는 약물을 확인하기 위한 표적화된 약물 발견 선별에 대한 상기 선종 세포의 자손의 용도를 제공한다. 고속 대량 작업처리를 위해서, 선종 세포의 자손을 다중 웰 플레이트, 예를 들어 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트 중에서 배양한다. 분자들의 라이브러리를 사용하여 상기 자손에 영향을 미치는 분자를 확인한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩타이드 라이브러리(예를 들어 LOPAPTM, Sigma Aldrich), 지질 라이브러리(BioMol), 합성 화합물 라이브러리(예를 들어 LOP ACTM, Sigma Aldrich) 또는 천연 화합물 라이브러리(Specs, TimTec)를 포함한다. 더욱 또한, 상기 선종 세포의 자손 중에서 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이들 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 선종 세포에 영향을 미치는 화합물을 후속적으로 또는 병행하여, 확장된 정상 상피 세포에 영향을 미치는 지에 대해 시험한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포에서의 임의의 변화, 예를 들어 비 제한적으로 증식의 감소 또는 상실, 형태 변화, 및 세포사를 망라하는데 사용된다. 상기 자손을 또한 상피 암종 세포의 역전을 포함하여, 상피 선종 세포에 비해, 상기 암종 세포를 특이적으로 표적화하는 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
상기 자손을 또한 약물 후보의 시험관 내 대사 안정성 및 대사 프로파일의 측정을 위한 고속 대량 작업처리 접근에 사용할 수 있음은 분명할 것이다.
본 발명은 더욱 또한 독성 분석에서 본 발명에 따른 선종 세포의 자손, 췌장 오르가노이드, 및 장샘-융모 오르가노이드의 용도를 제공한다. 상기 자손 및 장샘-융모 오르가노이드는 배양하기 용이하며 현재 독성 분석에 사용되는, 예를 들어 상피 세포 주, 예를 들어 Caco-2(ATCC HTB-37), I-407(ATCC CCL6) 및 XBF(ATCC CRL 8808)보다 더 밀접하게 1 차 상피 세포를 닮는다. 1차 선종 배양물 또는 장샘-융모 오르가노이드에 의해 수득된 독성 결과가 환자에게서 수득된 결과와 더 가깝게 닮을 것이 예상된다. 세포계 독성 시험을 기관 특이적 세포독성의 측정을 위해 사용한다. 상기 시험에서 시험된 화합물은 암 화학요법예방제, 환경적 화학물질, 식품 보충제, 및 잠재적인 독성제를 포함한다. 상기 세포를 일정 기간 동안 다수 농도의 시험 작용제에 노출시킨다. 상기 분석에서 시험 작용제의 농도 범위를 5일의 노출 및 최고 용해성 농도로부터 로그 희석을 사용하여 예비 분석으로 측정한다. 상기 노출 기간의 끝에서, 배양물들을 성장억제에 대해 평가한다. 종점을 50%까지 억제하는 농도(TC50)를 측정하기 위해서 데이터를 분석한다.
본 문서 및 청구의 범위에서, "포함하다"란 동사 및 그의 동사활용들은 비 제한적인 의미로, 단어 다음의 항목들을 포함하지만 구체적으로 언급되지 않은 항목들을 제외시키지 않음을 의미하기 위해서 사용된다. 또한 "이루어지다"란 동사는 본 발명에서 정의된 바와 같은 생성물이 구체적으로 나타낸 것들보다 추가적인 성분(들)을 포함할 수도 있고, 상기 추가적인 성분(들)이 본 발명의 독특한 특징을 변경시키지 않음을 의미하는 "필수적으로 이루어지다"에 의해 대체될 수도 있다. 또한 본 발명에 정의된 바와 같은 방법은 구체적으로 나타낸 것들보다 추가적인 단계(들)를 포함할 수도 있으며, 상기 추가적인 단계(들)는 본 발명의 독특한 특징을 변경시키지 않는다. 또한, 부정 관사 "하나의"에 의한 요소의 언급은, 내용상 상기 요소가 하나 및 오직 하나만이 존재함을 명백히 요구하지 않는 한, 하나보다 더 많은 상기 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 상기 부정 관사 "하나의"는 대개 "하나 이상"을 의미한다. 단어 "약" 또는 "대략"은 수치 값(약 10)과 함께 사용될 때 바람직하게는 상기 값이 상기 값의 1% 더 많거나 적은 10의 주어진 값일 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 참고문헌들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
하기의 실시예들은 단지 예시를 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 시험관 내에서 소장 장샘 및 융모의 배양
물질 및 방법
마우스: 6 내지 12 주된 이계 교배시킨 마우스를 사용하였다. Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2 대립유전자1의 생성 및 염기서열 분석은 앞서 개시되었다1. Rosa26-lacZ 또는 YFP Cre 정보제공 마우스를 잭슨 랩(Jackson Labs)으로부터 수득하였다.
장샘 단리, 세포 해리 및 배양: 장샘을 4 ℃에서 30 분간 2 mM EDTA/PBS 중에서 배양에 의해 쥐 소장으로부터 떼어냈다. 단리된 장샘을 카운트하고 펠릿화하였다. 500 개의 장샘을 50 ㎕ 매트리겔(BD Bioscience)과 혼합하고 24 웰 플레이트에 도말하였다. 매트리겔의 중합 후 500 ㎕의 장샘 배양 배지(성장 인자(10 내지 50 ng/㎖ EGF(Peprotech), 500 ng/㎖ R-스폰딘 111 및 100 ng/㎖ 노긴(Peprotech)이 있는 어드밴스드 DMEM/F12)를 가하였다. 분류 실험을 위해서, 단리된 장샘을 37 ℃에서 45 분간 배양 배지에서 배양한 다음, 유리 피펫으로 재현탁시켰다. 해리된 세포를 20 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. GFPhi, GFPlow 또는 GFP- 세포를 유식 세포측정(MoFlo, Dako)에 의해 분류하였다. 단일의 생육성 상피 세포를 전방 산란, 측면 산란 및 펄스-폭 매개변수, 및 프로피디움 요오다이드에 대한 음성 염색에 의해 게이트 제어하였다. 분류된 세포를 장샘 배양 배지에 수거하고 1 세포/웰(96 웰 플레이트 중, 5 ㎕ 매트리겔)로 재기드-1 펩타이드(Ana Spec, 1 μM)를 포함하는 매트리겔에 매몰하였다. Y-27632(10 μM)를 포함하는 장샘 배양 배지(48 웰 플레이트의 경우 250 ㎕, 96 웰 플레이트의 경우 100 ㎕)를 덮어씌웠다. 성장 인자를 이틀마다 가하고 전체 배지를 4일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 오르가노이드를 매트리겔로부터 회수하여 단일-장샘 도메인으로 기계적으로 해리시키고, 새로운 매트리겔로 옮겼다. 계대 배양을 1:5 분할 비로 매 1 내지 2 주마다 수행하였다.
시약; 쥐 재조합 EGF 및 노긴을 펩프로테크(Peprotech)로부터 구입하였다. 인간 재조합 R-스폰딘 111, Y-27632(Sigma), 4-하이드록시타목시펜(Sigma) 및 Edu(Invitrogen)를 배양 실험을 위해 사용하였다. 하기의 항체들을 면역염색을 위해 사용하였다: 항-라이소자임(Dako), 항-시냅토피신(Dako), 항-BrdU(Roche), 항-β-카테닌(BD Bioscience), 항-E-카데린(BD Bioscience), 항-평활근 액틴(Sigma), 항-EphB2 및 B3(R&D), 항-빌린, 항-Muc2, 항-크로모그라닌 A(Santa Cruz), 항-카스파제-3(Cell Signaling).
장샘 단리: 단리된 소장을 종방향으로 개방하고, 저온 PBS로 세척하였다. 상기 조직을 대략 5 ㎜ 조각으로 다지고, 저온 PBS로 추가로 세척하였다. 상기 조직 단편을 PBS가 있는 2 mM EDTA 중에서 얼음 상에서 30 분간 배양하였다. EDTA 배지의 제거 후, 상기 조직 단편을 저온 PBS로 10 ㎖ 피펫에 의해 격렬히 현탁하였다. 상등액은 융모 분획이며 이를 버리고; 침강물을 PBS로 재현탁하였다. 추가의 격렬한 현탁 및 원심분리 후에, 상등액은 장샘이 풍부하였다. 상기 분획을 70-um 세포 여과기(BD bioscience)에 통과시켜 잔류 융모 물질을 제거하였다. 단리된 장샘을 300 rpm에서 3 분간 원심분리하여 단세포로부터 장샘을 분리하였다. 최종 분획은 필수적으로 순수한 장샘들로 이루어졌으며 이를 배양 또는 단세포 해리에 사용하였다.
타목시펜 유도 및 X-gal 염색: CreERT2를 활성화하기 위해서, 장샘을 저 용량 4-하이드록시타목시펜(100 nM)과 12 시간 동안 배양하고 장샘 배양 배지 중에서 배양하였다. X-gal 염색을 앞서 개시한 바와 같이1 수행하였다. 4-하이드록시타목시펜 처리 부재 하에서는 염색이 보이지 않았다.
전자 현미경 분석: 앞서 개시한 바와 같이1 장샘 오르가노이드를 포함하는 매트리겔을 실온에서 5 시간 동안 카르노브스키(karnovsky) 고정액(2% 파라폼알데하이드, 2.5% 글루타르알데하이드, 0.1 M Na-카코딜레이트, 2.5 mM CaCl2 및 5 mM MgCl2, pH 7.4) 중에서 고정시켰다. 상기 샘플을 에폰(Epon) 수지에 매몰하고 필립스 CM10 현미경(Eindhoven, The Netherlands)으로 검사하였다.
미세배열 분석: 결장 장샘, 소장 장샘 및 오르가노이드의 유전자 발현 분석. 2 마리의 마우스로부터 새로 단리한 소장 장샘을 2 개의 부분으로 나누었다. RNA를 하나의 부분으로부터 직접 단리하고(RNeasy Mini Kit, Qiagen), 다른 부분은 1주일 동안 배양한 다음 RNA 단리하였다. 제조자의 설명(Agilent Technologies)에 따라 표지된 cRNA를 준비하였다. 소장 장샘 및 오르가노이드로부터 상이하게 표지한 cRNA를 2 개의 염료 교환 실험에서 4X44k 에이질런트(Agilent) 전 마우스 게놈 이중 색상 미세배열(G4122F) 상에서 상기 두 마우스에 대해 별도로 하이브리드화하여, 4 개의 개별적인 배열을 생성시켰다. 또한, 단리된 결장 장샘을 2 개의 염료 교환 실험에서 상이하게 표지된 소장 장샘에 대해 하이브리드화하여, 4 개의 개별적인 배열을 생성시켰다. 미세배열 신호 및 배경 정보를 특징 추출(V.9.5.3, Agilent Technologies)을 사용하여 검색하였다. 모든 데이터 분석을 어레이 어시스트(ArrayAssist)(5.5.1, Stratagene Inc.) 및 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Corporation)을 사용하여 수행하였다. 원 신호 강도를 국소 배경을 감하여 보정하였다. 음의 값을 오직 하나의 채널(소장 장샘 또는 오르가노이드) 또는(소장 장샘 또는 결장 장샘)에만 존재하는 특징들에 대한 강도 간의 비를 계산할 수 있도록 0(상기 국소 배경의 표준 편차)에 가까운 양의 값으로 바꾸었다. 로웨스(Lowess) 연산을 적용하여 정규화를 수행하고, 2 개(소장 장샘 또는 오르가노이드) 또는(소장 장샘 또는 결장 장샘) 모두의 강도가 바뀌거나 상기 두 강도 모두 상기 배경 신호의 2 배 미만인 경우 개별적인 특징들은 여과되었다. 더욱 또한, 불균일한 특징들은 여과되었다. 데이터를 공개 시 GEO(Gene Expression Omnibus, number GSE14594)에서 입수할 수 있다. 관리 부재의 계층 군집화를 클러스터 3(간격: 시티 블록, 보정: 평균 계통)를 사용하여 소장/결장 장샘 및 오르가노이드의 정규화된 강도(특징 추출에서 처리된 신호) 상에서 수행하고 이를 트리뷰(TreeView)로 가시화하였다. 유전자들은 이들이 일관되게 모든 배열에서 오르가노이드 또는 장샘에 3 배 초과하여 농축된 경우 현저하게 바뀐 것으로 간주되었다.
영상화 분석: 장샘 오르가노이드의 영상들을 공 초점 현미경검사(Leica, SP5), 도립 현미경(Nikon DM-IL) 또는 입체현미경(Leica, MZ16-FA)에 의해 취하였다. 면역조직화학의 경우, 샘플들을 실온에서 1 시간 동안 4% 파라폼알데하이드(PFA)로 고정시키고, 파라핀 절편을 표준 기법에 의해 처리하였다1. 면역조직화학을 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다1. 전체 면역염색의 경우, 장샘 오르가노이드를 디스파제(Invitrogen)를 사용하여 매트리겔로부터 단리하고, 4% PFA로 고정시킨 다음, 0.1% 트리톤-X를 사용하여 투과성으로 만들었다. EdU 염색을 제조자의 프로토콜(Click-IT, Invitrogen)에 따라 수행하였다. DNA를 DAPI 또는 ToPro-3(Molecular Probe)에 의해 염색하였다. 3D 영상을 공 초점 현미경검사(Leica, SP5)에 의해 획득하고 볼로시티(Volocity) 소프트웨어(Improvision)로 재건하였다.
결과
장 상피는 성인 포유동물에서 가장 빠르게 자가 갱신하는 조직이다. 우리는 최근에 소장 장샘의 기부에서 대략 6 개의 순환하는 Lgr5+ 줄기 세포의 존재를 입증하였다1. 본 발명에 이르러, 우리는 모든 분화된 세포 유형들이 존재하는 융모형 상피 도메인을 생성시키는 동시에 단일 장샘이 수 회의 장샘 분열 사건을 겪는 장기 배양 조건을 확립하였다. 단일 분류된 Lgr5+ 줄기 세포는 또한 상기 장샘-융모 오르가노이드를 개시시킬 수 있다. 추적 실험은 상기 Lgr5+ 줄기 세포 계층이 오르가노이드에서 유지됨을 가리킨다. 우리는 장 장샘-융모 유닛이 자기 조직화 구조이고, 이는 비-상피 세포 니치의 부재 하에서 단일 줄기 세포로부터 형성될 수 있다는 결론을 내린다.
상기 소장의 자가 갱신 상피는 장샘 및 융모로 정렬된다2. 세포들이 상기 장샘에서 새로 생성되고 상기 융모의 끝에서 세포사멸에 의해 상실되며, 이들은 마우스에서 5일의 턴-오버 시간을 갖는다. 자가 갱신 줄기 세포는 상기 장샘 기부 부근에 존재하고 빠르게 증식하는 트랜싯 증폭(TA) 세포를 생성시키는 것으로 오랫동안 공지되어 왔다. 추정되는 줄기 세포의 수는 장샘 당 4 내지 6 개이다. 장세포, 배상세포 및 장내분비 세포는 TA 세포로부터 발생하며 상기 장샘-융모 축을 따라 응집성 띠로 이동을 계속한다. 네 번째 주요 분화된 세포 유형인 파네쓰 세포는 장샘 기부에 존재한다. 최근에 우리는 상기 파네쓰 세포 사이에 삽입된 순환하는 장샘 기부 원주 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자, Lgr5를 동정하였다1. GFP/타목시펜-유도성 Cre 리콤비나제 카세트가 상기 Lgr5 좌에 통합된 마우스를 사용하여, Lgr5+ 세포가, Cre 유도 후 14 개월째에 평가할 때조차3, 상기 상피1의 모든 세포 유형을 생성시키는 다능 줄기 세포를 구성한다는 계통 추적에 의해 입증하였다3.
다양한 배양 시스템들을 개시하였지만4 -7, 기본적인 장샘-융모 생리학을 유지하는 장기 배양 시스템은 확립되지 못하였다2.
마우스 장샘 제제를 매트리겔에 현탁시켰다. 장샘 증식은 EGF 및 R-스폰딘 1을 필요로 하였다(도 1a). 계대 배양은 노긴의 필요성을 밝혔다(도 1b). 배양된 장샘은 정형화된 방식으로 반응을 나타내었다(도 2a). 상부 개구는 빠르게 밀봉되었고, 관강은 세포사멸성 세포로 충전되었다. 상기 장샘 부위는 장샘 분열의 회고인 연속적인 발아 사건을 겪었다17. 파네쓰 세포는 항상 상기 발아 돌기 부위에 존재하였다. 상기 장샘의 대부분을 배양할 수 있었다(도 2b). 추가의 확장은 융모-형 상피("융모 도메인")에 의해 피복된 중심 관강을 둘러싸는 >40 장샘-도메인을 포함하는 오르가노이드를 생성시켰다(도 2c-e). E-카데린 염색은 단일 세포층을 밝혀냈다(데이터 도시 안 됨). 매주, 오르가노이드를 기계적으로 해리시키고 상기 예비 도말 밀도의 1/5로 재 도말하였다. 오르가노이드를 하기 개시된 특징들의 상실 없이 >6 개월 동안 배양하였다. 미세배열에 의한 발현 분석은 오르가노이드가, 예를 들어 새로운 결장 장샘과 비교 시 새로 단리된 소장 장샘과 매우 유사하게 남아있음을 밝혀내었다(도 3).
Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 장샘의 배양은 Lgr5-GFP+ 줄기 세포가 장샘 바닥에서 파네쓰 세포와 섞이는 것을 밝혀냈다. Wnt 활성화는 핵 β-카테닌(도 4a, 도 5) 및 Wnt 표적 유전자 Lgr5(도 2d) 및 EphB218(도 4b)의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 상기 장샘에 국한되었다. 세포사멸성 세포들이 상기 중심 관강 내로 발산되었으며, 이는 생체 내에서 융모 끝에서 세포사멸성 세포들의 발산에 대한 과정 회고이다(도 4c). >3 개월 된 오르가노이드의 중기 발산은 일관되게 40 염색체/세포(n=20)를 밝혀냈다(도 4d). 놀랍게도, 우리는 근섬유아세포 또는 다른 비-상피 세포의 존재에 대한 증거가 없음을 발견하였다(도 6).
우리는 상기 Cre-활성화 가능한 Rosa26-LacZ 정보제공 인자와 교차된 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 마우스로부터 장샘을 배양하여 계통 추적을 허용하였다. 저-용량 타목시펜에 의한 유도 후 바로, 우리는 단일 표지된 세포를 주목하였다(도 4e-g). 이들 중 90% 초과는 전적으로 청색 장샘들을 생성시켰으며(도 4e-g), 이는 상기 Lgr5-GFP+ 세포가 실제로 줄기 세포 성질을 보유함을 의미한다. 상기 Cre-활성화 가능한 Rosa26-YFP 정보제공19 마우스로부터의 장샘은 공 초점 분석에 의한 계통 추적을 허용하였다. 우리는 타목시펜 처리 후 바로, 새로 단리한 장샘(도 7a-c) 및 확립된 오르가노이드(도 7d) 모두에서, 이어지는 날들에 걸쳐 계통 추적을 유도한 단일 표지된 세포를 주목하였다.
최근에, 유선 상피 구조가 시험관 내에서 단일 중기 세포로부터 확립되었다2 1. 단일 Lgr5-GFPhi 세포가 분류된 경우, 이들은 바로 사망하였다. Rho 키나제 억제제 Y-27632는 상기 세포사를 현저하게 감소시켰다. 노치 작용성 펩타이드2 4는 증식성 장샘의 유지를 지지하는 것으로 밝혀졌다23. 이러한 조건 하에서, 상당 수의 Lgr5-GFPhi 세포가 생존하였으며 큰 장샘 오르가노이드를 형성하였다. 오르가노이드는 GFPlow 딸 세포가 시딩될 때 좀처럼 형성되지 않았다(도 8d). 다수의 Lgr5-GFPhi 세포들이 장샘 기부에서 파네쓰 세포와 혼합되었다(도 8e-f). EdU(티미딘 동족체) 결합은 상기 장샘 중에서 S-기 세포를 밝혀내었다(도 8g).
우리는 세포를 1 세포/웰로 분류하였고, 단세포의 존재를 가시적으로 확인하였으며, 결과적인 성장을 추적하였다. 4 개의 개별적인 실험들 각각에서, 우리는 100 개의 단세포를 확인하고 추적하였다. 평균적으로, 상기 Lgr5-GFPhi 세포의 대략 6%가 오르가노이드로 성장한 반면, 나머지 세포들은 전형적으로는 처음 12 시간 내에 죽었고, 이는 추정 상 상기 단리 과정에 고유한 물리적 및/또는 생물학적 스트레스에 기인한다. GFPlow 세포는 좀처럼 성장하지 않았다(도 9a). 도 9b 및 도 10은 단일 Lgr5-GFPhi 세포로부터 오르가노이드의 성장을 예시한다. 배양 4일까지, 상기 구조는 대략 100 개의 세포로 이루어졌으며, 이는 증식성 장샘 세포의 12 시간-세포 주기와 일치하였다25(도 9c). 2 주 후에, 상기 오르가노이드는 단세포로 해리되었으며 이를 재 도말하여 새로운 오르가노이드를 형성시켰다(도 9d). 상기 과정을 재 도말 효율의 명백한 손실 없이 2-주 기준으로 4 회 이상 반복할 수 있었다.
상기 단일 줄기 세포-유래한 오르가노이드는 전 장샘으로부터 유래한 것들과 구별할 수 없는 것으로 보였다. 파네쓰 세포 및 줄기 세포는 장샘 기부에 위치하였다(도 8e, f, 도 11 c, g). 빌린+ 성숙한 브러시 보더 및 정상 알칼리성 포스파타제에 의해 입증된 바와 같이 충분히 양극화된 장세포들이 중심 관강을 피복하였다(도 11a, e, i). 배상 세포(Muc2+, 도 11b; PAS+, 도 11f) 및 장내분비 세포(크로모그라닌 A+, 도 11 d; 시냅토피신+, 도 11h)가 상기 오르가노이드 구조 전체를 통해 산재되었다. 4 가지 유형의 성숙한 세포들이 전자 현미경검사에 의해 인지되었다(도 11i-l). 비-상피(간질/중간엽) 세포가 존재하지 않았으며, 관찰은 EM 영상화에 의해 확인되었다(도 11 i-p, 도 12 c-g). 상기 장샘(도 11m, o) 및 중심 관강 상피(도 11p)는 모두 매트리겔 지지체 상에 직접 놓여있는 양극화된 상피 세포의 단 층으로 이루어졌다. 상기 EM 사진의 고해상 영상을 도 5에 나타낸다. E-카데린의 경우 적색으로 염색되고 청색으로 핵과 대비 염색된 오르가노이드는 상기 오르가노이드 상피의 단층 성질을 밝혀냈다(데이터 도시 안 됨).
상피 장샘이 상피 하 근섬유아세포와 긴밀히 접촉하고 있음은 널리 공지되어 있으며2 6 -28 일반적으로 상기 근섬유아세포는 장샘 기부에서 분화된 세포 니치를 생성시키는 것으로 여겨진다27 ,29,30. 상기와 같은 니치는 상기 장 줄기 세포를 고정 및 지지하는 독특한 환경을 생성시킬 것이다. 본 발명에 이르러 우리는 자가 갱신 상피가 균일하게 존재하는 제한된 성장 신호 세트에 의해 확립될 수 있음을 보인다. 상기에도 불구하고, 상기 단리된 줄기 세포는 고도로 정형화된 방식으로 비대칭성을 독립적으로 생성시킨다. 이는, 기부에 위치하고 TA 세포로 충전된 드 노보 생성된 줄기 세포 및 파네쓰 세포를 갖는 장샘형 구조의 형성을 빠르게 유도한다. 이들 장샘형 구조는 분열이 끝난 장세포들로 이루어진 융모형 관강 도메인 내로 공급되며, 여기에서 세포사멸성 세포는 상기 관강 내로 사라지게 된다(융모 끝에서 세포 상실의 회고). 균일한 성장 촉진 환경에 노출된 단세포가 비대칭 구조를 생성시킬 수 있다는 역설적인 관찰은 Wnt 경로의 면밀한 조사 시 특히 자명하다. 모든 세포가 R-스폰딘 1에 노출되지만, 오직 장샘 중의 세포만이 활성 Wnt 신호전달의 특징, 즉 핵 β-카테닌 및 Wnt 표적 유전자의 발현을 나타낸다. 명백하게도, 세포 외 Wnt 신호에 대한 차별적인 노출보다 오히려 Wnt 신호전달에 대한 차별적인 반응성이 장샘-융모 축 형성의 중심에 있다.
요약하면, 우리는 단일 Lgr5+ ve 장 줄기 세포가 그의 환경으로부터의 위치적 실마리와 독립적으로 작동할 수 있고 정상적인 장의 회고인 연속적으로 확장하는 자기 조직화 상피 구조를 생성시킬 수 있다는 결론을 내린다. 상기 개시된 배양 시스템은 줄기 세포-구동 장샘-융모 생물학의 연구를 간결히 할 것이다. 더욱이, 재생 의학 및 유전자 요법에 쉽게 접근하는 새로운 수단을 개방할 수도 있다.
실시예 2 시험관 내 결장 장샘 및 융모의 배양
물질 및 방법
Wnt3a 처리된 배지
Wnt3a 리간드 발현 세포주, 및 Wnt3a 리간드 없는 동일 세포주(대조용 배지)를 3 내지 4 주의 기간 동안 배양한다. 상기 세포는 합류점에서 증식을 멈추자마자 곧 Wnt3a를 생산할 것이다. 상기 배지를 수확하고, TCF 반응성 요소-luc 구조물(TOP) 및 상기 TCF 반응성 요소에 돌연변이를 갖는 동일 구조물(FOP)을 사용하는 루시페라제 분석인 TOP플래시 분석으로 시험할 것이다. TOP/FOP 간의 비는 배양물에 사용되는 배지에 대해 20을 초과해야 한다. 상기 배지를 조직 재생을 위한 배양물에 사용할 때 25 내지 50% 희석한다.
새로 단리한 결장을 개방하고 PBS 또는 DMEM으로 세척하고, 작은 조각들로 절단하였다. 상기 단편들을 온화하게 흔들면서 4 ℃에서 1 시간 동안 2 mM EDTA/PBS와 함께 배양하였다. EDTA 용액의 제거에 이어서, 상기 조직 단편을 10 ㎖ 피펫으로 저온 PBS 10 ㎖ 중에 격렬히 현탁시켰다. 세포 찌꺼기를 함유하는 처음 상등액은 버리고 침전물을 10 내지 15 ㎖ PBS로 현탁하였다. 상기 조직 단편의 추가적인 격렬한 현탁 후에, 상등액에는 결장 장샘이 풍부하다. 상기 단편들을 펠릿화하고 매트리겔과 혼합하고 소장 오르가노이드 배양 시스템으로서 배양하였다. 상기 매트리겔을 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 매트리겔 중합 후, 500 ㎕의 조직 배양 배지(200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴, 100 ng/㎖ BDNF(Peprotech)가 보충된 50% 어드밴스드-DMEM/F12/50% Wnt-3a 처리된 배지)를 가하였다. 상기 전체 배지를 매 2 내지 3일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 상기 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리겔로부터 제거하고 작은 단편들로 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 매 2 주마다 1 회 이상 1:4 분할비로 계대 배양을 수행하였다. 상기 조건 하에서 배양물을 3 개월 이상 유지시켰다.
결과
결장 오르가노이드는 소장 오르가노이드에 비해 더 느리고 덜 효율적으로 증식한다. 소장과 동일한 성장 인자 조건으로, 원위 결장으로부터 단리한 결장 장샘의 5% 미만이 증식하고 오르가노이드 구조를 형성하였다(도 13). 결장의 근위 부분으로부터 결장 장샘이 증식하는 것은 어려웠다. 우리는 미세배열 분석(결장 Lgr5-GFP hi 세포 대 결장 Lgr5-GFP low 세포)에서 BDNF(뇌 유래된 신경영양성 인자)의 수용체, trkB의 상향조절을 발견하였기 때문에, 결장 오르가노이드에 대한 BDNF의 영향을 측정하였다. 우리는 BDNF- 배양물보다는 BDNF+ 배양물에서 대략 2 배 더 높은 배양 효율을 끊임없이 관찰하였다. 전형적으로, 하나의 결장 오르가노이드는 대략 10 개의 장샘 도메인을 함유할 것이다(도 14). 기원과 일관되게, 파네쓰 세포를 검출할 수 없었다. 소장 오르가노이드에 비해, 결장 장샘은 상기 결장 기부에서 Wnt-3a 생산 파네쓰 세포를 갖지 않으며, 따라서 Wnt-3의 보충은 결장 장샘의 배양 효율을 증가시키나 소장 장샘의 효율은 증가시키지 않는다. 전형적으로, 우리는 Wnt-3a 처리된 배지를 첨가한 경우 30% 이하의 배양 효율을 획득하였다(도 15).
결론적으로, 소장 유래된 장샘 및 결장 유래된 장샘을 모두 상기 개시된 조건을 사용하여 시험관 내에서 유지 및 증식시킬 수 있으며, 이는 상기를 인공 시스템에서 장 상피를 생성시키는, 지금까지 개시된 최초의 배양 방법으로 만든다.
실시예 3 시험관 내 선종의 배양
물질 및 방법
(실시예 1 참조)
결과
선종은 역사적으로 시험관 내에서 배양하기가 어려웠다. 상술한 조건을 사용하여 소장뿐만 아니라 결장으로부터 유래한 건강한 장샘을 성공적으로 배양하였기 때문에, 유사한 조건들이 시험관 내에서 선종을 유지시킬 수 있는 지의 여부를 측정했다. 2.5 mM EDTA를 사용하여 APC-/- 마우스로부터 선종을 단리한 후에, 단일 선종을 상술한 바와 유사한 조건 하에서 배양하였다. 중요하게, 상기 조건들은 시험관 내에서 선종의 생육을 유지하기에 적합하였지만, R-스폰딘은 과다하게 되었다. 이는 상기 세포 중의 APC의 부재가 핵 β-카테닌을 자동적으로 생성시킬 것이기 때문에, 상기 Wnt 신호전달 경로를 유도하는데 상기가 더 이상 필요하지 않다는 사실에 의해 쉽게 설명될 수 있다. 이는 Wnt 작용물질인 R-스폰딘을 시험관 내에서 선종의 배양에 과잉으로 만든다. 도 16a, 및 더 큰 배율인 도 16b는 통상적인 장샘 오르가노이드(중심 관강과 함께 발아하는 장샘을 볼 수 있다)와 대조적으로, 선종 오르가노이드는 낭포로서 성장한다. 상기 관강 내부의 다량의 죽은 세포의 존재로부터 결론지을 수 있는 바와 같이, 죽은 세포가 상기 관강 내로 발산된다. 통상적인 장샘 오르가노이드에서, 핵 β-카테닌은 오직 장샘-도메인의 기부에서만 보인다(도 4a 참조). 선종 오르가노이드에서(도 16c 및 보다 큰 배율의 16d), 핵β-카테닌이 모든 상피 세포에서 보였으며, 이는 유전자 APC 돌연변이와 일치하였다. 이들 오르가노이드를 무기한 계대 배양할 수 있다.
Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/APCflox/flox 마우스의 선종으로부터 유래한 단일 Lgr5+ 분류된 세포가 상기 언급한 배양 조건(R-스폰딘 부재)을 사용하여 시험관 내에서 유사한 선종 오르가노이드를 형성할 수 있는지의 여부를 추가로 시험하였다. 실제로, 이는 그 경우였으며, 상기 수득된 오르가노이드는 구조가 상기 시험관 내 배양에 대해 출발 물질로서 완전한 선종을 사용하여 수득한 경우에 매우 필적할만하였다(데이터 도시 안 됨).
실시예 4 다른 Wnt 작용물질들의 영향 시험
다른 Wnt 작용물질이 R-스폰딘과 동일한 영향을 갖는지, 즉 시험관 내에서 장샘-융모 오르가노이드의 형성을 촉진하는지의 여부를 측정하기 위해서, 용해성 Wnt3a를 Lgr5+ 분류된 단세포에 가하고 시험관 내 장샘-융모 형성에 대한 영향을 평가하였다.
물질 및 방법
Lgr5-GFPhi 세포를 분류하고 통상적인 단세포 배양 조건(단세포에 대해 상술한 바와 같이, EGF, 노긴, R-스폰딘, 노치 리간드 및 Y-27632) 이외에 Wnt3a(100 ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 우리는 100 세포/웰을 시딩하고 시딩 후 14일째에 오르가노이드의 수를 카운트하였다.
단리된 장샘을 실온에서 3 분간 PBS+0.1% 플루로닉 127(Sigma) 중의 1 uM 뉴포트 그린-DCF(MolecularProbes)와 함께 배양한 다음, PBS 세척을 수행하였다. 이 후에, 장샘을 매트리겔에 매몰하고 상술한 바와 같이 표준 조건을 사용하여 배양하였다.
결과
R-스폰딘의 부재 하에서 Wnt3a의 첨가는 결장 형성에 어떠한 영향도 미치지 않았다: R-스폰딘의 부재 하에서 결장은 거의 또는 전혀 형성되지 않았다. 그러나, R-스폰딘의 존재 하에서, 오르가노이드 형성의 증가된 효율이 Wnt3a의 존재 하에서만 관찰되었다(도 17). 이는 상기 두 인자 모두가 줄기 세포의 완전한 상피 세포층의 형성에 필요한 모든 세포로의 분화를 자극하고 지지하는 그들의 능력을 서로 지원함을 가리킨다. 현행 가설은 R-스폰딘이 프리즐드를 통한 신호전달에 앞서, 프리즐드, LRP6의 공-수용체의 내면화의 억제에 기여한다는 것이다. 상기 Wnt 인자의 프리즐드 및 공 수용체 LRP6에 결합 시, 상기 Wnt 신호전달 경로가 활성화된다3 1. LRP6이 상기 세포 표면에 존재할 때, Wnt 활성화가 일어날 것이다(도 18). 따라서, R-스폰딘이 상기 배양 배지 중에 존재하지 않는 경우, Wnt3a는 상기 Wnt 경로를 활성화할 수 없을 것이며, 따라서 LRP6이 내면화되고 이를 상기 Wnt 인자와 함께 신호전달에 이용할 수 없고, 이에 의해 상기 Wnt 경로의 활성화가 방지된다.
Wnt3a는 생리학적 환경 하에서 파네쓰 세포에 의해 생산되는 용해성 인자이다. 상기 세포는 일반적으로 줄기 세포에 인접하여 위치하며(도 19), 상기 세포가 장 상피 세포층의 진행하는 분화의 유지를 지지한다는 가설이 세워져 있다. 파네쓰 세포에 의해 또한 분비되는 다른 Wnt 인자는 Wnt6, 9b 및 11이다. Wnt6이 줄기 세포 분화에 대해 Wnt3a와 동일한 효과를 가질 것임이 예상된다. 이러한 발견은 파네쓰 세포가 줄기 세포 니치의 형성에 중요하다는 생각을 지지한다. 상기 데이터는, 줄기 세포 니치가 광범위하게 숙고되었지만 지금까지 어떠한 실험 데이터도 상기와 같은 니치의 존재를 지지하지 않았으므로 놀라운 것이다. 줄기 세포 니치의 존재에 대한 추가의 지지는 파네쓰 세포가 선택적으로 죽는다는 실험으로부터 나온다. 장샘을 쥐 소장으로부터 단리하고 파네쓰 세포를 특이적으로 박멸하는 아연 킬레이터32의 존재 하에서 시험관 내에서 배양하였다. 상기를 오직 파네쓰 세포에만 영향을 미치고 장샘 내 다른 세포에는 영향을 미치지 않도록 하는 낮은 농도 및 짧은 시간 동안 사용하였다. 상기 아연 킬레이터로 처리한 후에, 오르가노이드 형성을 평가하였다. 파네쓰 세포가 원래의 장샘 중에 더 이상 존재하지 않을 때 오르가노이드 형성의 현저한 감소가 관찰되었다(도 20). Wnt 3a의 존재 하에서, 상기 감소는 부분적으로 복원되었다(데이터 도시 안 됨). 이는 줄기 세포 니치(상기는 장샘 중 Lgr5+ 줄기 세포의 분화를 지지한다)의 유지에서 상기 파네쓰 세포의 역할을 지지한다.
실시예 5 배양 조건이 또한 위 오르가노이드의 성장을 지지한다
위는 3 개의 지형적 부위(기저부, 몸통 및 방) 및 2 개의 기능적 샘 영역(산분비 및 유문)으로 이루어진다. 상기 산분비 샘 영역은 상기 기관의 80%를 차지하는 반면 유문 영역은 상기 기관의 20%를 차지한다. 포유동물 위 상피는 평면 상피, 짧은 오목 및 긴 샘으로 이루어진 위 유닛으로 구성된다. 상기 오목은 점액 분비 세포에 의해 피복된 반면 상기 샘은 3 개의 부위로 분리된 분비 세포들로 구성된다: 협부, 목 및 기부. 상기 위 상피는 끊임없이 갱신된다. 우리 실험실에서 수행된 추적 연구는 상기 샘 기부에 위치한 LGR5 양성 세포가 줄기성(stemness)의 정의에 적합함을 보였다(Barker et al. 준비 중임).
지금까지, 위 단층 배양물은 여러 분화된 위 세포들에 의해 형성되는 상기 위 유닛의 특징들을 재현할 수 없었다. 더욱 또한, 상기 보고된 3-D 배양 방법 시스템은 어떠한 내분비 세포도 보이지 않고, 오직 고도로 분화된 위 표면 점액 세포만을 재건한다. 더욱이, 이들 배양물은 단지 7일의 기간에 걸쳐 수행되었으며, 따라서 이는 자가 갱신 능력의 부족을 가리킨다(Ootani A, Toda S, Fujimoto K, Sugihara H. Am J Pathol. 2003 Jun; 162(6):1905-12). 여기에서 우리는 쥐 위의 유문 부위로부터 위 유닛을 단리하는 방법을 개발하였으며 더 오래가는 유지를 보이는 3D-배양 시스템을 개발할 수 있었다.
물질 및 방법
위 유닛 단리
단리된 위를 종방향으로 개방하고 저온 어드밴스드-DMEM/F12(Invitrogen)로 세척하였다. 입체경 하에서, 유문 부위를 절제하고 몸체 및 전위로부터 단리하고 유문 점막을 족집게로 근육층으로부터 조심스럽게 분리하였다. 이어서, 상기 조직을 대략 5 ㎜의 조각으로 다지고 저온 단리 완충액(Na2HPO4 28 mM + NH2PO4 40 mM + NaCl 480 mM + KCl 8 mM + 슈크로스 220 mM + D-솔비톨 274 mM + DL-다이티오트레이톨 2.6 mM)으로 추가 세척하였다. 상기 조직 단편을 온화하게 흔들면서 4 ℃에서 2 시간 동안 단리 완충액과 함께 5 mM EDTA에서 배양하였다. EDTA 용액의 제거에 이어서, 상기 조직 단편을 10 ㎖ 피펫으로 저온 단리 완충액 10 ㎖에 격렬히 현탁시켰다. 죽은 세포를 함유하는 첫 번째 상등액은 버리고 침전물을 10 내지 15 ㎖ 저온 단리 완충액으로 현탁시켰다. 상기 조직 단편을 추가로 격렬히 현탁시킨 후에, 상기 상등액에는 위 유닛이 풍부하다. 매 10 내지 20 현탁액마다 상등액을 새로운 저온 단리 완충액으로 대체하고 얼음 상에서 유지시키고 위 유닛의 존재에 대해 검사한다. 이러한 과정을 상기 위 유닛이 완전히 방출될 때까지, 대개는 4 내지 5 회 반복한다. 농축된 위 유닛 현탁액을 2 내지 3분간 600 rpm에서 원심분리하여 단세포로부터 상기 단리된 위 유닛을 분리시키고 침전물을 배양에 사용한다.
위 배양
상기 샘, 협부 및 피트 부위들을 함유하는 전체 위 유닛을 선행 섹션에 나타낸 바와 같이 4 ℃에서 2 기간 동안 5 mM EDTA와 배양함으로써 쥐 위의 유문 부위로부터 단리하였다. 단리된 위 유닛을 카운트하고 펠릿화하였다. 100 개의 위 유닛을 25 ㎕의 매트리겔(BD Bioscience)과 혼합하고, 48-웰 조직 배양 플레이트 상에 시딩하고 상기 매트리겔의 완전한 중합까지 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 중합 후에, 250 ㎕의 조직 배양 배지(B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴, 100 ng/㎖ Wnt3A, 50 또는 100 ng/㎖ KGF가 보충된 어드밴스드-DMEM/F12)를 가하였다. 상기 전체 배지를 매 2일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 상기 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리겔로부터 제거하고 작은 단편들로 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 계대 배양을 주당 1회 또는 2회 1:4 분할비로 수행하였다. 상기 조건 하에서 1 개월 이상 배양을 유지하였다.
시약
어드밴스드 DMEM/F12 및 보충제 N2 및 B-27 무혈청 보충물을 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하고 N-아세틸시스테인을 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 쥐 재조합 EGF, 노긴 및 인간 EGF를 페프로테크(Peprotech)로부터, Wnt3A 재조합 단백질을 스템 셀 리써치(Stem Cell Research)로부터 구입하였다. 상기 언급한 성장 인자로부터, 상이한 농도는 R-스폰딘1 및 KGF에 대해서만 시험하였다. 50 ng/㎖ R-스폰딘 1은 배양물 성장을 억제한다. KGF를 50 또는 100 ng/㎖로 사용할 수 있으나, 상기 발아 효율은 100 ng/㎖ 조건에서 더 높다. Wnt3A 처리된 배지를 앞서 개시한 바와 같이 제조하였다(Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan AW, Weissman IL, Reya T, Yates JR 3rd, Nusse R. Nature. 2003 May 22; 423(6938):448-52).
면역조직화학 및 영상화 분석
X-gal 염색을 위해, 오르가노이드를 실온에서 1 내지 2 시간 동안, PBS 중 100 mM MgCl2 중 0.25% 글루타르알데하이드(Sigma)로 상기 매트리겔 중에서 직접 고정시켰다. 그 후에, 배양물을 세척 용액(PBS 중 0.01% 나트륨 데옥시콜레이트 + 0.02% NP40 + 5 mM MgCl2)으로 3 회 세척하고 37 ℃에서 16 시간 동안 0.21% K4Fe(CN)6 및 0.16% K3Fe(CN)6의 존재 하에 1 ㎎/㎖ X-Gal(Invitrogen)과 함께 배양하였다. PBS 중에서 세척 후에, 배양물을 실온에서 15 분간 PBS 중 2% PFA로 후 고정시켰다. 모든 시약들을 시그마 사로부터 획득하였다.
면역조직화학을 위해서, 오르가노이드를 트립신(Tryple Select, Invitrogen)을 사용하여 상기 매트리겔로부터 단리하고, 실온에서 1 시간 동안 4% PFA로 고정시키고, 파라핀에 매몰하였다. 파라핀 절편을 표준 기법을 사용하여 처리하고 면역조직화학을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다. 하기의 항체들을 사용하였다: 항-마우스 Ki67(클론 MM1, Monosan)(1:200), 항-토끼 절단된 카스파제-3(Cell Signaling Technology)(1:400) 및 항-인간 위 뮤신 5AC(Novocastra clone 45M1)(1:200). 시트레이트 완충제 항원 보상을 모든 경우에 수행하였다. 절편들을 메이어의 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 위 오르가노이드 및 단리된 위샘의 영상들을 도립 현미경(Nikon DM-IL) 또는 공 초점 현미경검사(Leica SP5)로 취하였다.
결과
지금까지, 위 배양물들을 단층으로 증식시켰다. 그러나, 단층 배양물은 여러 개의 분화된 위 세포들(피트 점액 세포, 장내분비 세포 및 증식하는 무점액 세포)에 의해 형성되는 세포 전체 위 유닛의 특징들을 재현하는 능력이 없다. 최근에 우리 실험실은 장 장샘의 기부에 존재하는 Lgr5 양성 세포가 진정한 장 줄기 세포임을 생체 내 계통 추적에 의해 입증하였다(Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A, Korving J, Begthel H, Peters PJ, Clevers H. Nature. 2007;449:1003-7). 장 상피로서, 위 상피는 끊이없이 갱신된다. Lgr5 양성 세포가 유문 위샘 유닛의 기부에서 발견되었으며, 추적 연구는 이들 LGR5 양성 세포가 자가 갱신 및 다능 능력을 보임으로써 줄기성의 정의에 적합함을 보였다(Barker et al. 준비 중임). 우리는 단일 Lgr5+ 세포로부터 장 장샘을 3-D 구조로 배양할 수 있었기 때문에, 유사한 조건들이 시험관 내에서 유문 위 유닛의 성장을 유지할 수 있는지의 여부를 측정하였다.
5 mM EDTA를 사용하여 위샘 유닛을 단리한 후에, 위샘(도 21a)을 매트리겔에 현탁시켰다. 위 배양물 증식은 EGF(50 ng/㎖), 노긴(100 ng/㎖), R-스폰딘 1(1 ug/㎖) 및 Wnt3A(100 ng/㎖)을 필요로 하였다(도 21b). KGF(50 또는 100 ng/㎖)는 발아 사건의 형성에 필수적이었으며, 따라서 상기 배양물의 확장에 필수적이었다. 따라서, 상기 배양된 유문 유닛은 장 장샘 오르가노이드로서 반응을 나타내었다. 상기 유닛의 개방된 상부 부분은 밀봉되고 상기 관강은 세포사멸성 세포로 충전된다. 상기 새로 형성된 위 오르가노이드는 중심 관강과 함께 발아하는 위샘과 극성을 유지하면서 연속적인 발아 사건들(위 분열의 회고)을 겪었다. Wnt3A 처리된 배지(재조합 Wnt3A 재조합 단백질과 비교 시 10 내지 100 배 더 높은 Wnt 활성을 나타낸다)를 사용한 경우, 발아 형성의 효율에 현저한 증가가 검출되었으며(도 21c), 이는 상기 발아 형성 및 형태발생에 대한 Wnt 용량-의존성을 드러냈다.
오르가노이드를 개시된 성질들의 상실 없이 1 개월 이상 배양하였다. 매주, 오르가노이드를 기계적 해리에 의해 1:4 계대 배양한다(도 22). Lgr5-LacZ 유문 위 유닛의 배양은 위 오르가노이드 중의 Lgr5 양성 줄기 세포의 존재를 나타냈다(도 23a). Ki67 염색에 의해 입증된 바와 같이, 증식하는 세포는 상기 샘형 구조의 기부에 위치하는 반면(도 23b), 세포사멸성 카스파제 3 양성 세포는 관강 내로 돌출하는 것이 발견된다(도 23c). 상기 위 뮤신 5AC(MUC5AC)는 위 피트 세포(또한 소와 세포로서 명명됨)의 특이 마커이다. MUC5AC 양성 세포는 오르가노이드에서 발견되며, 이는 하나 이상의 분화된 위 세포 계통의 존재를 가리킨다(도 23d). 그러나, 내분비 유래한 세포는 검출되지 않았다. 따라서, 추가적인 인자들이 필요하다. 여기에는 가스트린 방출 펩타이드, 헤지호그 및 노치 패밀리의 활성화제 또는 억제제, Wnt 경로의 다른 활성화제 및 BMP 패밀리의 다른 억제제, TGF 패밀리의 활성화제가 있을 수 있다.
실시예 6a 췌장 오르가노이드를 시험관 내에서 증식시킬 수 있다
물질 및 방법
새로 단리한 췌장을 작은 조각들로 절단하고, 절단 효소 혼합물(300 U/㎖ 콜라게나제 XI 형(Sigma), 0.01 ㎎ 디스파제 I(Roche) 및 0.1 ㎎ DNase)이 있는 DMEM(Invitrogen) 중에서 오비탈 진탕기(80 rpm, 37 ℃)에서 10 분간 배양하였다. 배양 후에, 상기 조직 단편들을 기계적 피펫팅에 의해 온화하게 해리시켰다. 절단되지 않은 단편들을 통상적인 중력에 의해 1 분간 침전시키고 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 상등액을 70 um-세포 여과기에 통과시키고, 잔사를 DMEM으로 세척하였다. 상기 세포 여과기 상에 남아있는 단편들을, 뒤집어진 세포 여과기를 DMEM으로 헹구어 수확하고 펠릿화하였다. 상기 단편들은 대개 췌장 샘꽈리 조직으로 이루어지고 췌장 관을 포함하였다. 상기 펠릿을 매트리겔과 혼합하고 소장 오르가노이드 배양 시스템(실시예 1의 물질 및 방법 참조)으로서 배양하였다. 상기 매트리겔을 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 매트리겔의 중합 후에, 500 ㎕의 조직 배양 배지(B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴, 50 또는 100 ng/㎖ KGF(Peprotech)가 보충된 어드밴스드-DMEM/F12)를 가하였다. 상기 상장 인자들을 매 2일마다 첨가하였다. 상기 전체 배지를 매 4 내지 6일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 상기 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리겔로부터 제거하고 작은 단편들로 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 매주 1 회 또는 2 회 1:4 분할비로 계대 배양을 수행하였다. 상기 조건 하에서 배양물을 2 개월 이상 유지시켰다.
결과
췌장 조직은 EGF의 존재 하에 배양 후 3 내지 4일째 간단한 낭포 구조를 형성하였다. 노긴 및 R-스폰딘은 상기 낭포 구조의 크기를 상승적으로 증가시켰으나, 오르가노이드의 형태발생에는 영향을 미치지 않았다. KGF는 발아 형성뿐만 아니라 배양 효율을 현저하게 유도하였다. 성장 인자(EGF, 노긴, R-스폰딘-1 및 KGF)의 최적 조합을 사용하여, 성장 인자들의 최상의 조합으로 췌장 관의 80%가 넘게 성장하였다.
일단 췌장 관을 배양물에서 취하였으면, 상기 도관을 상기 구조의 양단부에서 신속하게 밀봉하여 간단한 구조를 형성시켰다. 오르가노이드의 대략 20%가 상기 배양 시작 후 7일째에 발아 구조를 형성하기 시작하였다(도 24). 상기 췌장 관은, 단지 매우 느리게만 성장하는 상기 샘꽈리 조직에 비해, 빠르게 증식한다.
흥미롭게도, 상기 오르가노이드의 계대 배양 후, 상기 배양 시작 후 대략 2 내지 3주째에, 췌장 섬형 구조가 관찰되었다(도 25). 상기 섬형 구조는 일반적으로는 계대 배양 전에는 관찰되지 않는다. 상기 섬은 7일 이상 생존하나, 매우 느리게 증식하거나 전혀 증식하지 않는다. 상기 섬형 구조는 건강한 췌장 조직 중에 존재하는 췌장 랑게르한스섬을 닮는다. 상기와 같은 섬은 다른 것들 중에서도, 각각 글루카곤 및 인슐린을 생산하는 알파 세포 및 베타 세포를 함유한다. 상기 관찰된 섬형 구조는 인슐린, 뉴로제닌 3 및 Pdx-1을 발현하는 세포를 함유한다. 여러 가지 성장 인자들을 이들이 췌장 조직으로부터 유래하는 오르가노이드 중의 췌장 β 세포의 존재를 증가시키는지의 여부를 측정하기 위해서 시험할 것이다. 후보 성장 인자들은 사이클로파민(소닉-헤지호그 억제제), 액티빈, GLP(글루카곤 유사 펩타이드) 및 그의 유도체(엑센딘 4), 가스트린 및 니코틴아미드를 포함한다.
실시예 6b 췌장 오르가노이드를 시험관 내에서 증식시킬 수 있다
물질 및 방법
새로 단리한 췌장을 작은 조각들로 절단하고, 절단 효소 혼합물(300 U/㎖ 콜라게나제 XI 형(Sigma), 0.01 ㎎/㎖ 디스파제 I(Roche) 및 0.1 ㎎/㎖ DNase)이 있는 DMEM(Invitrogen) 중에서 오비탈 진탕기(80 rpm, 37 ℃)에서 10 분간 배양하였다. 배양 후에, 상기 조직 단편들을 기계적 피펫팅에 의해 온화하게 해리시켰다. 절단되지 않은 단편들을 통상적인 중력에 의해 1 분간 침전시켰다. 상기 절단되지 않은 단편들을 상기 절단 효소 혼합물로 10분간 추가로 절단시켰다. 상기 절단 과정을 상기 절단되지 않은 단편들이 대개 췌장 관들로 이루어질 때까지 반복하였다. 췌장 관 구조물을 현미경 하에서 절단되지 않은 단편들로부터 수동으로 골라내었다. 상기 췌장 관을 매트리겔과 혼합하고 소장 오르가노이드 배양 시스템(실시예 1의 물질 및 방법 참조)으로서 배양하였다. 상기 매트리겔을 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 매트리겔의 중합 후에, 500 ㎕의 조직 배양 배지(1x 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM Hepes, B27, N2, 10 mM N-아세틸시스테인, 10 nM [Leu15]-가스트린 I, 100 nM 엑센딘4, 10 mM 니코틴아미드, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴, 50 또는 100 ng/㎖ FGF7(KGF) 또는 FGF10(Peprotech)이 보충된 어드밴스드-DMEM/F12)를 가하였다. 상기 배양 배지를 매 2일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 상기 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리겔로부터 제거하고 작은 단편들로 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 매주 1 회 또는 2 회 1:4 분할비로 계대 배양을 수행하였다. 상기 조건 하에서 배양물을 10 개월 이상 유지시켰다.
결과
췌장 조직은 EGF의 존재 하에 배양 후 3 내지 4일째 간단한 낭포 구조를 형성하였다. 노긴 및 R-스폰딘은 상기 낭포 구조의 크기를 상승적으로 증가시켰으나, 오르가노이드의 형태발생에는 영향을 미치지 않았다. FGF7(KGF)/FGF10은 발아 형성뿐만 아니라 배양 효율을 현저하게 유도하였다. 성장 인자(EGF, 노긴, R-스폰딘-1 및 FGF7(KGF)/FGF10)의 최적 조합을 사용하여, 성장 인자들의 최상의 조합으로 췌장 관의 80%가 넘게 성장하였다.
일단 췌장 관을 배양물에서 취하였으면, 상기 도관을 상기 구조의 양단부에서 신속하게 밀봉하여 간단한 구조를 형성시켰다. 오르가노이드의 대략 80%가 상기 배양 시작 후 7일째에 발아 구조를 형성하기 시작하였다(도 24). 상기 췌장 관은, 단지 매우 느리게만 성장하는 상기 샘꽈리 조직에 비해, 빠르게 증식한다.
흥미롭게도, 상기 오르가노이드의 계대 배양 후, 상기 배양 시작 후 대략 2 내지 3주째에, 췌장 섬형 구조가 관찰되었다(도 25). 상기 섬형 구조는 일반적으로는 계대 배양 전에는 관찰되지 않는다. 상기 섬은 14일 이상 생존하지만, 매우 느리게 성장하거나 또는 전혀 성장하지 않는다. 상기 섬형 구조는 건강한 췌장 조직 중에 존재하는 췌장 랑게르한스섬을 닮는다. 상기와 같은 섬은 다른 것들 중에서도, 각각 글루카곤 및 인슐린을 생산하는 알파 세포 및 베타 세포를 함유한다. 상기 관찰된 섬형 구조는 인슐린, 뉴로제닌 3 및 Pdx-1을 발현하는 세포를 함유한다. 여러 가지 성장 인자들을 이들이 췌장 조직으로부터 유래하는 오르가노이드 중의 췌장 β 세포의 존재를 증가시키는지의 여부를 측정하기 위해서 시험할 것이다. 후보 성장 인자들은 사이클로파민(소닉-헤지호그 억제제), 액티빈, GLP(글루카곤 유사 펩타이드) 및 그의 유도체(엑센딘 4), 가스트린 및 니코틴아미드를 포함한다.
실시예 7 Wnt/Lgr5 재생 반응의 구동에 의한 시험관 내 성인 췌장 전구세포의 방해받지 않는 확장
물질 및 방법
마우스, 시약 및 조직
췌장 조직을 하기의 마우스들로부터 수득하였다: 액신-LacZ 녹 인(Lustig et al. Mol. Cell. Biol. 2002), Lgr5-LacZ 녹 인(Barker et al, 2007), Lgr5-GFP(Barker et al, 2007). 액신-LacZ 마우스에게 100 ㎍의 정제된 인간 R-스폰딘1(A. Abo, Nuvelo Inc, CA, USA에 의해 친절하게 제공됨)을 IP 주사하고 상기 췌장에서 LacZ 발현 분석을 위해 48 시간 후에 죽였다.
췌장 관 결찰을 래트에서 일부 약간 변경하여 개시된 바와 같이(Wang et al., 1995) 수행하였다: PDL에 대한 실험 절차는 하기와 같았다: 동물들을, 플루아니손:펜타닐:미다졸람의 혼합물을 각각 3.3 ㎎/㎏, 0.105 ㎎/㎏ 및 1.25 ㎎/㎏의 투여량으로 복강 내 주사하여 마취시킨다. 동물들을 반듯이 누운 위치로 놓고 복부 표면을 면도하고 소독 용액(요오드 용액)으로 깨끗하게 한다. 이어서, 검상 연골로부터 전면 상복부 벽에서 중앙 절개를 수행하고 췌장을 노출시킨다. 해부 현미경 하에서, 췌장 비장 엽을 배치하고 췌장 관을 상기 위엽 관과의 연접부의 원위 약 1 ㎜에서 7-0 폴리프로필렌 봉합사 미세섬유로 결찰한다. 수술 후 진통제 부프레노르핀을 0.01 내지 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 s.c. 투여한다. 이어서, 상기 복벽과 피부를 5-0 봉합사로 닫았다.
새로 단리한 췌장을 실시예 6에 개시한 바와 같이 처리하여, 하기에 개시하는 바와 같은 조건 하에서 배양되는 췌장 단편을 생성시켰다. 주 췌장 관 및 도관의 제 1 가지를 기계적으로 단리한다. 상기 단편들을 작은 조각들로 절단하고 절단 효소 혼합물(300 U/㎖ 콜라게나제 XI형(Sigma), 0.01 ㎎/㎖ 디스파제 I(Roche) 및 0.1 ㎎/㎖ DNase)이 있는 DMEM(Invitrogen) 중에서 오비탈 진탕기(800 rpm, 37 ℃)에서 30 분간 배양하였다. 절단 후 샘꽈리 세포의 대부분이 상기 단편으로부터 방출되었다. 절단되지 않은 단편은 대개 췌장 관 세포로 이루어지며 이를 통상적인 중력에 의해 1 분간 침전시키고, 상등액은 버렸다. PBS로 3 회 세척 후, 상기 절단되지 않은 단편을 실온에서 30 분간 2 mM EDTA/PBS와 함께 배양하였다. 상기 단편들을 격렬히 피펫팅하고 통상적인 중력으로 1 분간 침전시켰다. 도관 세포가 농축된 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 3 회 세척하였다. 상기 도관 세포를 펠릿화하고 매트리겔과 혼합하였다. 상기 매트리겔을 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 매트리겔의 중합 후, 500 ㎕의 확장 배지(1x 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM Hepes, B27, N2, 1 mM N-아세틸시스테인, 10 nM [Leu15]-가스트린 I, 100 nM 엑센딘4, 10 mM 니코틴아미드, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴, 50 또는 100 ng/㎖ FGF7(KGF) 또는 FGF10(Peprotech)이 보충된 어드밴스드-DMEM/F12)를 가하였다. 상기 전체 배지를 매 2일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 상기 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리겔로부터 제거하고 작은 단편들로 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 매주 1 회 1:4 분할비로 계대 배양을 수행하였다. 상기 조건 하에서 배양물을 2 개월 이상 유지시켰다. 분화를 위해서, 확장 배지를 분화 배지(글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM Hepes, B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 10 nM [Leu15]-가스트린 I, 100 nM 엑센딘4, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴이 보충된 어드밴스드-DMEM/F12)로 교환하였다.
FGF10을 페프로테크로부터 수득하였다. BrdU를 시그마 사로부터 수득하였다.
Q-PCR
RNA를 RNA 이지 미니 키트(Quiagen)에 의해 단리하고, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소(Promega)를 사용하여 역 전사시켰다. cDNA를 열 순환기에서 증폭시켰다.
사용된 프라이머들을 하기에 나타낸다.
mmTBP (forward): TATTGTATCTACCGTGAATCTTGG
mmTBP (reverse): CAGTTGTCCGTGGCTCTC
Lgr5 (forward) TCCAACCTCAGCGTCTTC
Lgr5 (reverse) TGGGAATGTGTGTCAAAG (Tm=57℃)
(순방향/역방향)
PCR
모든 프라이머들을 게놈 DNA의 식별을 위해서 인트론 서열에 접하거나 걸쳐 있도록 디자인하였다.
Hprt (F) AAGTTTGTTGTTGGATATGC (R) CATCTTAGGCTTTGTATTTGG
(Tm ) 57℃, 106bp
Ngn3 (F)TCCTCGGAGCTTTTCTACGA(R)TGTGTCTCTGGGGACACTTG
(Tm) 60℃, 239bp/373bp (genomic band)
Pax6 (F) AACAACCTGCCTATGCAACC (R) ACTTGGACGGGAACTGACAC
TM 60℃, 206 bp
Glucokinase (F) AAGATCATTGGCGGAAAG (R) GAGTGCTCAGGATGTTAAG
(Tm ) 57℃ 193bp
Chromogranin A (F) GCTGACAGCAGAGAAGCGGCT(R)
GACAGGCTCTCTAGCTCCTGG(Tm ) 60℃ 231bp
Glut2 (slc2a2) (F) AAGTTGGAAGAGGAAGTCAG (R)
AGACCTTCTGCTCAGTCG (Tm) 57℃ 124bp
Insulin (F) TTTGTCAAGCAGCACCTTTG (R) TCTACAATGCCACGCTTCTG
(Tm ) 57℃, 214bp
Somatostatin (F) GAGGCAAGGAAGATGCTGTC (R)
GGGCATCAITCTCTGTCTGG (Tm) 57℃, 214bp
Glucagon (F) ITACITTGTGGCTGGAITGCIT (R)
AGTGGCGTTTGTCITCAITCA (Tm) 57℃, 149bp
영상 분석
장샘 오르가노이드의 영상들을 레이카(Leica) SP5에 의한 공 초점 현미경 검사, 도립 현미경(Nikon DM-IL) 또는 입체현미경(Leica, MZ16-FA)에 의해 취하였다. 면역조직화학을 위해서, 샘플들을 실온에서 1 시간 동안 4% 파라폼알데하이드(PFA)로 고정시키고, 파라핀 절편을 표준 기법으로 처리하였다(Barker et al, Nature 2007). 면역조직화학을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(Barker et al, Nature 2007). 전체 면역염색을 위해서, 췌장 오르가노이드를 디스파제(Invitrogen)를 사용하여 매트리겔로부터 단리하고, 4% PFA로 고정시킨 다음 0.1% 트리톤 X-100으로 투과성으로 만들었다. 하기의 항체들을 면역조직화학을 위해 사용하였다: 항-BrdU(Amersham), 항-Ki67(Dako), 항-인슐린(Sigma), 항-C-펩타이드(Cell signaling), 항-Ngn3(발생 하이브리도마 연구 뱅크).
DNA를 DAPI 또는 ToPro-3(Molecular Probes)로 염색하였다. 3차원 영상을 공 초점 현미경검사에 의해 획득하였다. X-gal에 의한 염색을 실시예 5의 면역조직화학 및 영상화 분석에 개시된 바와 같이 수행하였다.
FACS
췌장 오르가노이드를 R-스폰딘(1 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 배양하고 이를 매트리겔로부터 기계적으로 또는 효소에 의해(TrypLE) 제거하였다. 단리된 오르가노이드를 37C에서 10 분간 TrypLE에 의해 추가로 절단하였다. 해리된 세포를 40 um 세포 여과기(BD bioscience)에 통과시키고 APC 접합된 항-EpCAM(eBioscience)로 염색하였다. LacZ를 플루오리포터(FluoReporter) 키트(Invitrogen)에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 생육성 단세포를 펄스-폭, 측면 산란 매개변수 및 프로피디움 요오다이드 염색에 의해 게이트 조절하였다.
단일 액신2-LacZ 양성 췌장 세포의 시험관 내 확장
췌장을 PDL 처리 후 7일째에 마우스로부터 단리하고, 췌장 관을 상술한 바와 같이 단리하였다. 단리된 췌장 관을 37 C에서 20 분간 TrypLE 익스프레스(Invitrogen)와 함께 배양한 다음, 40 um 세포 여과기(BD bioscience)에 통과시켰다. 세포를 실시예 7에 개시된 바와 같이 LacZ에 대해 EpCAM-APC 및 형광 기질로 염색하였다(플루오로리포터 키트). 세포를 분석하고 생육성 단일 상피 세포를 유식 세포측정기(MoFlo; Dako Cytomation)에 의해 분류하고, EM 배지에 수거하였다. 분류된 세포를 펠릿화하고, 매트리겔과 혼합하고, 50% Wnt 처리된 배지 및 10 mM Y-27632를 포함하는 EM 배지와 함께 4일간 배양하였다. 배양 배지를 4일 후에 Wnt 및 Y-27632가 없는 EM 배지로 교환하였다.
결과
상기 소장으로부터 유래한 단일 Wnt-의존성 Lgr5+ 줄기 세포를 배양하여 연속적으로 확장하는 장형 오르가노이드를 형성시킬 수 있다(Sato et al., 2009). 건강한 성인 췌장에서, 상기 Wnt 경로는 불활성이며 -결과적으로- Lgr5는 발현되지 않는다. 부분 도관 결찰(PDL)에 의해 손상 시, 우리는 상기 Wnt 경로가 확고하게 활성화되는 반면, Lgr5 발현은 재생하는 도관의 발아 돌기에서 나타나는 것을 발견한다. 상기 장 배양 시스템으로부터 변경된 조건 하에서, 새로 단리된 성인 도관 단편은 Lgr5의 발현을 개시하고 >30 주 동안 매주 10 배 확장하는 발아 낭포를 형성한다. 성장 자극의 제거는 상기 낭포를, 내분비 및 β-세포 마커를 발현하는 미숙한 섬 형태를 갖는 구조로 전환시킨다. 손상된 췌장으로부터의 단일 Wnt-자극된 세포는 또한 상기 장기적인 배양을 개시시킬 수 있다. 우리는 헤이플릭 한계가 최적화된 조건 하에서 배양 시 성인 전구세포에 적용되지 않는다는 결론을 내렸다. 따라서, 기관-특이적인 성인 줄기 세포의 확장을 촉진하는 배양 방법은 ES- 또는 iPS-계 조직 발생에 대한 대안을 나타낼 수 있다.
상기 태아 췌장의 외분비 및 내분비 구획의 발생이 매우 상세하게 이해되어 있지만(Jensen, 2004), 출생 후 췌장의 섬 세포의 발생에 대해서는 훨씬 덜 알려져 있다(Bonner-Weir and Weir, 2005; Bouwens and Rooman, 2005). 유전자 계통 추적은 기존의 β 세포가, 줄기/전구 세포보다는 오히려, 통상적인 생리학적 조건 하에서 및 부분 췌장절제 후 모두에서 성인 마우스에 새로운 β 세포를 발생시킨다는 증거를 제공하였다(Dor et al., 2004; Teta et al., 2007). 성인 마우스 췌장의 도관 내층 중 다능성 전구세포(손상된 췌장에서 활성화되어 작용성 β 세포 질량을 증가시킬 수 있다)의 존재가 최근에 개시되었다(Xu et al. 2008). 태아 섬 세포 전구세포에 대한 주 스위치를 암호화하고(Apelqvist et al., 1999; Gradwohl et al., 2000; Gu et al., 2002; Schwitzgebel et al., 2000) 정상의 신생아 췌장에서 침묵하는(Gu et al., 2002) Ngn3의 프로모터 정보제공 인자를 지니는 성인 마우스의 췌장에서 PDL을 수행함으로써 손상이 억제되었다. 이들 β 세포 전구세포의 분화는 Ngn3-의존성이며, 글루코스-반응성 β 세포를 포함한 모든 섬 세포 유형을 생성시킨다(Xu et al, 2008). 신호가 손상 시 상기 전구세포들의 출현을 구동함은 현재 공지되어 있지 않다. 상기와 같은 통찰력은 상기 통찰력이 전구세포 확장으로의 시험관 내 접근의 디자인을 안내할 수도 있으므로 중요한 것으로 보인다.
Wnt 신호전달이 β 세포 전구세포의 유도에서 한 역할을 하는지의 여부를 측정하기 위해서, 상기 액신2-LacZ 대립유전자의 발현을 상기 성인 췌장에서 추적하였다. 상기 액신2-LacZ 대립유전자는 Wnt신호전달에 대해 정확하고, 일반적인 정보제공 인자를 나타내는 것으로 입증되었다(Lusting et al., Mol. Cell. Biol. 2002). 예상된 바와 같이, 상기 정보제공 인자는 성인 췌장에서 불활성이었다(도 26A). 그러나, 우리가 상기 Wnt 작용물질 Rspo1(Kim et al., 2005)을 액신2-LacZ 마우스에 주사하여 상기 Wnt 신호전달 경로를 활성화하였을 때, 우리는 상기 췌장의 도관을 따라 존재하지만 샘꽈리 또는 섬에는 존재하지 않는 Wnt-반응성 세포의 존재를 알게 되었다(도 26B). β 세포 전구세포는 앞서 췌장의 손상시에만 검출되었으므로, 우리는 PDL을 수행함으로써 손상 시 Wnt-반응성이 상기 세포에서 생리학적으로 활성화되는 지의 여부를 시험하였다. 도 26C는 PDL 및 비-PDL 영역으로부터 단리한 췌장 조직 절편의 H&E 염색을 나타낸다. 앞서 보고된 바와 같이(Abe et al. 1995), 상기 샘꽈리 세포는 5일 후 세포사멸성으로 되고 완전히 이해되지는 않은 기전에 의해 새로 형성된 도관 구조에 의해 대체된다. 7일 후에, 섬 수의 증가(섬 신생) 및 섬 크기의 증가가 또한 관찰된다(별표가 가리키는 바와 같이). 이는 상기 PDL이 성공적이었음을 가리킨다. 실제로, 상기 액신2-LacZ 정보제공 인자는 상기 췌장의 결찰된 부분의 도관을 따라 특이적으로 활성화된 반면, 결찰되지 않은 부분은 상기 반응을 보이지 않았다(도 26D 및 E). 더욱이, 상기 증식 반응은 Ki67 염색에 의해 측정된 바와 같이, 대개 상기 결찰된 부분의 도관으로 제한된 반면, 결찰되지 않은 부분의 도관에서는 핵 Ki67을 검출할 수 없었다(도 26F). 이는 R-스폰딘으로 처리 후 상기 췌장 중 증식성 BrdU 양성 세포의 검출을 닮았다(도 26G).
우리는 앞서 장에서 Wnt 반응성 세포의 몇몇 집단이 줄기 세포임을 입증하였다(Barker et al, 2007). 상기 세포 집단에 대한 마커는 Lgr5이었다. 상기 Lgr5 유전자는 액신2 처럼, Wnt-반응성 유전자이다. 그러나 소장 및 피부에서 상기는 오직 Wnt-자극된 줄기 세포에서만 발현되고 트랜싯 증폭 세포에서는 발현되지 않는다(Barker et al, 2007; Jaks et al, 2008). 따라서 상기는 진정한 줄기 세포 마커인 것으로 생각된다. 우리는 장 중의 Lgr5+ 세포와 유사하게, 췌장 중의 Lgr5+ 세포도 또한 손상 후 검출된 바와 같은 β 세포 전구세포의 기원일 수도 있음을 가정하였다. 상기 가설을 시험하기 위해서, 우리는 액신-LacZ 및 Lgr5-LacZ 마우스의 췌장에서 PDL을 수행하고 Lgr5 mRNA 발현 및 LacZ 염색을 측정하였다. 흥미롭게도, Lgr5는 PDL 후 시간 과정 중에 qPCR에 의해 쉽게 검출가능하게 되었다(도 26H). 더욱이, Lgr5-LacZ 녹 인 마우스에서 PDL은 X-gal 염색에 의해 입증된 바와 같이, 재생 도관의 돌기(별표로 가리킴)에서 상기 정보제공 인자의 특이적인 활성을 생성시켰다. 활성 재생 부위에서 Lgr5 발현의 출현은 Lgr5가 생리학적 자가 갱신 중인(예를 들어 장, 위 또는 모낭 중에서) 줄기 세포를 마크할 수도 있을 뿐만 아니라, 그의 발현이 또한 손상 시 재생 줄기 세포/전구세포의 Wnt에 의한 활성화를 알릴 수도 있음을 암시하였다.
상기 Wnt-의존성 Lgr5 줄기 세포 마커의 출현이 제공되는 경우, 우리는 성인 췌장 전구세포가 앞서 한정된 장 오르가노이드 배양 조건에서 확장될 수도 있음을 추론하였다(Sato et al, 2009). 췌장 세포의 이종 집단의 배양물을 앞서 확립하였으며 상기 배양물은 전형적으로는 성장 인자, 예를 들어 EGF(Githens et al. In Vitro Cell Dev Biol. 1989), FGF10(Miralles et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999) 및 HGF(Lefebvre et al. Diabetes. 1998, Suzuki et al., Diabetes 53, 2004) 및 혈청 보충물, 예를 들어 가스트린(Rooman et al. Gastroenterology 2001), 니코틴아미드(Rooman et al., Diabetologia. 2000) 등을 포함한다. 다수의 상기와 같은 배양물은 몇몇 조건 하에서 당뇨병 마우스(Hao et al., 2006; Ramiya et al., 2000)에 이식될 때 고혈당증을 역전시킬 수 있는 β 세포형 표현형(Bonner-Weir et al., 2000; Seaberg et al., 2004; Suzuki et al., 2004)을 갖는 세포의 시험관 내 발생을 생성시켰다. 이러한 접근법들 중 대부분은 시간에 따라 노화를 겪는 혼합된 세포 집단들로 시작한다. 오늘날 내분비 계통을 따라 분화하는 능력을 유지하는, 장시간에 걸쳐 한정된, 형질전환되지 않은 성인 췌장 전구세포의 확고한 확장을 유지하는 확고한, 장기 배양 시스템이 존재하지 않는다고 말하는 것은 정당한 것으로 보인다.
우리는 먼저 확장 배지(EM)에서 정제된 도관 단편을 증식시키고자 하였다. 도 27A에 나타낸 바와 같이, 작은 도관 단편들은 즉시, 연속적인 발아를 겪는 낭포형 구조로의 확장을 겪는 반면, 섬(데이터 도시 안 됨) 및 샘꽈리(기부 패널)는 점진적으로 붕괴되었다. 상기 배양물은 30 주에 걸쳐 주당 10 배 확장한다(그리고 매주 계대 배양된다). 다수의 성장 인자들을 시험하여 시험관 내 췌장 세포의 최적 확장에 필요한 신호들을 측정하였다(도 27B). 명백하게, EGF의 부재 하에서, 배양물은 7일 후 붕괴되었다. 또한 R-스폰딘 또는 FGF10의 부재는 14일 후 상기 배양물의 생육성을 감소시켰다. 대조적으로, 노긴, BMP 억제제는 췌장 단편의 지속된 성장에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 상기 확장 배지에 대한 니코틴아미드, 엑센딘4, 가스트린의 첨가는 필수적은 아니지만 배양 효율을 증가시켰다(데이터 도시 안 됨).
우리는 Wnt 신호전달이 PDL 시 활성화됨을 입증하였으므로, 지속된 성장에 대한 시험관 내 새로 단리된 췌장 단편의 Wnt 작용물질의 첨가 효과를 측정하였다. 도관을 액신2-LazZ 마우스로부터 단리하였을 때, 전체 발아 낭포는 오직 Wnt 작용물질 R스폰딘1의 존재 하에서만 청색으로 염색되었으며(도 27C), 이는 PDL 후 생체 내 상기 상황을 닮았다(도 26D 및 E). 액신2-LacZ 췌장으로부터 새로 단리된 섬 또는 샘꽈리에서 청색 염색은 관찰되지 않았다. PDL 시 생체 내 관찰과 유사하게, Lgr5-LacZ 낭포의 돌기만이 청색으로 염색되었다(도 27D). 더욱이, R-스폰딘의 존재 하에서 14일 동안 췌장 Lgr5-LacZ 오르가노이드의 배양은 Lgr5+ 세포의 퍼센트를 현저하게 증가시켰다(도 27E). 중요하게, 췌장 단편을 EM에서 R-스폰딘의 부재 하에 배양 시, 오르가노이드는 1 개월 내에 증식을 멈추는 반면, R-스폰딘의 존재 하에서는 무기한 확장될 수 있다. 이러한 관찰은 도관 근처에 위치한 Wnt-반응성 전구세포가 상기 발아 낭포의 성장에 연료를 공급하였고, 이는 후속적으로 줄기 세포-유사 성질을 갖는 Lgr5-발현 세포에 의해 유지되었음을 함축한다.
이러한 개념을 시험하기 위해서 직접 우리는 액신2-LacZ 양성 세포를 PDL 후 7일째에 마우스로부터 분류하였고 상기 세포가 도관-개시된 낭포와 식별할 수 없는 낭포의 발아를 효율적으로 개시함을 발견하였다(도 28). 상기 단세포는 배지 중에 Wnt3a의 존재를 필요로 한다. 단세포 해리 후 Wnt3A의 존재 또는 부재 하에서의 배양 효율의 비교는 Wnt3A의 부재 하에서 배양된 단세포가 초기에 작은 낭포 구조로서 성장하지만 2 내지 4일 후에 증식을 멈춤을 보였다. 이는 단리된 췌장 단편으로부터 출발하는 췌장 배양물에 대한 경우가 아니다. 흥미롭게도, 상기 Wnt3A를 4일 후에 제거할 수 있었으며, 이는 상기 어느 한 신호가 성장을 자극하는데 더 이상 필요하지 않거나, 또는 Wnt3A의 생산이 상기 배양과 함께 출발한 단일 분류된 세포로부터 유래한 세포에 의해 개시되었음을 가리킨다.
우리는 이어서 내분비 계통 세포를 생성시키는 발아 낭포의 잠재성을 평가하고자 하였다. 이 때문에, 우리는 분화 배지(DM)를 한정하기 위해서 상기 EM에 대한 다수의 변화를 시험하였다. 일련의 인자들을 내분비 계통으로의 분화에 대한 이들의 영향에 대해 시험하였다. FGF10의 제거는 분화의 유도에 결정적인 것으로 보였다. 오직 TGF10의 부재 하에서만 섬형 구조가 나타났으며(도 29A), 이는 β 세포 전구세포(Ngn3), β 세포(인슐린), 글루카곤(α 세포) 및 소마토스타틴(δ 세포)에 대한 여러 분화 마커들의 발현이 나타난 것에 상응하였다(도 29B 및 C). 더욱이, 글루코키나제, Pax6 및 크로모그라닌 A와 같은 분화 마커들은 상기 DM 배지에의 노출 후 10일째에 출발하여 상향조절되었다. 따라서, DM은 최적으로는 적어도 EGF 및 R-스폰딘으로 이루어졌으며 어떠한 FGF7 또는 10도 존재하지 않았다. 분화 조건 하에서 줄기 세포 마커인 Lgr5의 지속된 발현은 DM 중 R-스폰딘, Wnt 작용물질의 존재에 의해 설명될 수 있는데, 그 이유는 Lgr5가 Wnt 반응성 유전자이기 때문이다. 세포를 EM 중 니코틴아미드의 존재 하에서 배양할 때, 이를 상기 배지로부터 제거하는 것뿐만 아니라 완전한 분화를 획득하는 것도 또한 중요하였다. 임의의 배양 기간 후 발아 낭포를 EM에서 DM으로 옮길 때, 상기 낭포는 정형화된 "퇴화" 과정을 겪는다, 즉 상기 벽의 점진적인 내측 폴딩은 섬과 형태학적으로 닮은 보다 적은 치밀한 몸체로의 상기 낭포의 밀착을 유도한다(도 29D). 섬형 형태는 인슐린 및 C-펩타이드와 같은 β 세포 섬 마커에 의해 확인되었다(도 29E). Wnt 신호전달에 대한 재생 과정의 상기 단계의 의존성을 확인하기 위해서, 췌장 단편들을 R-스폰딘의 부재 또는 존재 하의 DM 중에서 배양하였다. 중요하게는, Ngn3의 발현에 의해 입증된 바와 같이, β 세포 전구세포는 오직 R-스폰딘의 존재하에서만 검출될 수 있었다(도 29F).
실시예 8 인간 췌장 단편의 시험관 내 확장
태아 췌장 발생 중, 뉴로제닌3+ 또는 인슐린 발현 세포가 상기 췌장 관 네트워크에서 보였으며, 이는 췌장 관 세포가 내분비 전구세포를 생성시키고 결과적으로 내분비 세포를 성숙시킴을 암시하였다. 인간 췌장 관 세포는 시험관 내에서 글루코스 반응성 인슐린 생산 세포로 분화함이 입증되었으며(Bonner-Weir, S et al 2000 PNAS), 이러한 발견은 췌장 관 세포를 베타 세포 대체 요법에 매력적인 공급원으로 만들었다. 그러나, 도관 세포를 내분비 분화 능력의 상실 없이 확장시키는 것은 어려웠다. 앞서 보고된 배양 시스템에서, 인간 췌장 관 세포는 상피 성질을 상실하거나 2 주 내지 5 주 후에 노화를 겪었다(Trautmann B et al, Pancreas vol.8 248-254). 따라서, 내분비 분화 능력을 유지하는 인간 췌장 관 세포를 확장하는 확고한 배양 시스템은 존재하지 않는다. 마우스 췌장 오르가노이드 배양 시스템의 확립을 이용하여, 우리는 인간 췌장 오르가노이드 배양 시스템을 확립하고자 하였다.
시험관 내 인간 췌장 전구세포의 증식
인간 췌장을 네덜란드의 라이덴(Leiden) 대학 의료 센터로부터 수득하였다. 중요하게는, 상기 마우스 췌장 단편에 대해 개시된 바와 동일한 조건 하에서(실시예 7), 새로 단리한 인간 췌장 단편을 또한 시험관 내에서 증식시킬 수 있다(도 30).
상기 확장 조건 하에서, 상기 췌장 단편의 배양 효율은 대략 80%이었으며, 이는 상기 새로 단리한 췌장 단편의 80%가 보다 긴 기간 동안 시험관 내에서 효율적으로 확장하였음을 의미한다. 마우스 췌장에 비해, 샘꽈리 조직은 낭포 구조를 보다 용이하게 형성하지만, 상기 구조는 4 주 이내에 증식을 멈춘다. 보다 큰 소 도관 네트워크로부터의 췌장 도관 세포는 낭포 구조를 보다 효율적으로 생산하며 결국에는 발아 돌기가 있는 오르가노이드를 형성한다. 상기 췌장 오르가노이드는 주당 1 회 1:5의 비로 분할하였으며, 증식 능력의 상실 없이 5 주 이상 시험관 내에서 유지되었다.
요약하면, 우리는 인간 췌장 오르가노이드 배양 시스템을 확립하였으며 원래 부피의 3000 배 이상 췌장 관 세포의 확장에 성공하였다. 우리는 인간 췌장 관 세포에 대한 내분비 분화 배양 조건을 최적화하고 있는 중이며 이러한 시험관 내 접근방법은, 일단 최적화되면, 1형 및 2형 당뇨병이 있는 보다 많은 수의 사람들이 이용할 수 있는 베타 세포 대체 요법을 만드는데 중요한 영향이 있을 수 있다.
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실시예 9 시험관 내 인간 소장 또는 결장 장샘의 배양
실시예 1 및 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에 이르러 마우스 소장 및 결장 상피에 대한 장시간 배양 조건을 최초로 생성시킬 수 있다. 장샘-융모 오르가노이드는 일련의 예측된 성장 인자 및 세포 외 기질의 보충을 통해 성장한다. 상기 오르가노이드는, 능동적으로 분할하고 장 중에 존재하는 모든 주요한 분화된 세포 계통들을 생성시키는 장 줄기 세포를 함유한다. 본 실시예에서 우리는 상기 배양 조건이 마우스 장 상피에만 유일한 것이 아니라 인간 장 상피의 성장에도 또한 사용될 수 있음을 보인다.
물질 및 방법
마우스 결장 오르가노이드 배양물
마우스 오르가노이드 배양물을 실시예 1에 개시된 바와 같이 배양하였다. Wnt 생산의 억제제(IWP-2)를 사용하여 Wnt 분비를 억제하였다(Chen et al, Nat Chem Biol. 2009 Feb; 5(2):100-7).
인간 결장 오르가노이드 배양물
인간 결장 장샘을 절제된 정상 결장 시편으로부터 단리하고 확립된 오르가노이드 배양 시스템을 사용하여 7일간 오르가노이드 구조로서 배양하였다(Sato et al., 2009 Nature May 14;459(7244):262-5). 상기 프로토콜은 마우스 유래한 오르가노이드 배양물에 대해 최적화되었지만, 우리는 인간 결장 오르가노이드의 최적의 성장을 보장하기 위해서, Wnt3a 처리된 배지의 첨가에 의해 약간의 변화를 수행하였다. 상기 처리된 배지를 수득하기 위해서, 상기 리간드를 암호화하는 적합한 발현 구조물을 형질감염시킴으로써 Wnt3a를 세포 주에서 발현시킨다. 상기 세포 주를 배양하고 상기 분비된 리간드를 포함하는 배양 배지를 적합한 시간 간격으로 수확한다. 예를 들어, 세포는 상기가 합류점에 도달하는 순간 Wnt3a의 생산을 시작하고 성장을 멈춘다. 형질감염되지 않았거나 또는 상기 빈 발현 구조물로 감염된 세포로부터의 배양 배지를 음성 대조군으로서 사용하였다. 상기 처리된 배지를 수확하고, 예를 들어 루시페라제 발현이 TCF 반응성 요소에 의해 조절되어 Wnt3a와 같은 Wnt 작용물질의 존재를 정량화하는 분석에서 시험하였다(Korinek et al., 1997. Science 275:1784-1787).
결과
상기 장 상피의 증식은 Wnt 신호전달 경로에 따라 변한다. 그러나 상기 Wnt 공급원의 정확한 위치는 분명하지 않다(Gregorieff and Clevers, 2005, Genes Dev. Apr 15; 19(8):877-90). 상기 마우스 장 오르가노이드는 니치 독립적인 방식으로 성장하였으므로(Sato et al., 2009 Nature May 14;459(7244):262-5), 우리는 상기 오르가노이드가 그 자신의 Wnt 리간드를 생산할 수도 있음을 추정하였다. 이를 시험하기 위해서 우리는 포큐파인 억제제와의 배양을 통해 Wnt 분비를 억제하였다. 포큐파인은 Wnt 분비에 중요하다(도식적 도면 31A). 1 μM IWP(Chen et al, Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2):100-7)와 배양 결과 오르가노이드의 사망이 발생하였다(도 31B 및 C). 상기 오르가노이드를 Wnt3a 처리된 배지의 첨가에 이해 구제할 수 있었으며, 이는 상기 오르가노이드가 실제로 Wnt 리간드를 생산함을 가리킨다(도 31 D 및 E).
우리는 이어서 인간 장 오르가노이드의 배양을 시도하였다. 상기 배지에 Wnt3a의 첨가가 필요한 것으로 판명되었는데, 그 이유는 상기 없이 장샘 오르가노이드가 결코 발아 구조물을 형성하지 못했으며 소장의 경우 5 내지 10일 이내에, 결장의 경우 3 내지 4일 안에 죽었기 때문이다. 종합적으로 상기 인간 장 장샘 오르가노이드는 상기 마우스 오르가노이드 배양물에 필적할만한 방식으로 성장하였다. 전형적으로, 우리는 Wnt-3a 처리된 배지의 활성에 따라 80% 이하의 배양 효율을 획득하였다. 상기 인간 장 배양물은 3 개월까지 배양되었다. 인간 결장에서 Wnt-3a의 효과는, 마우스 결장 오르가노이드 배양물에서 상기 효과가 향상된 것으로 또한 관찰된 바와 같이 예상되었다. 인간 소장 및 결장에서 Wnt-3a의 요구는 마우스 장에 비해 인간 장에 존재하는 더 낮은 수의 파네쓰 세포로 인해, 상기 인간 오르가노이드에 의한 내생 Wnt 리간드의 더 낮은 생산으로부터 생길 수 있다. 지금까지, 재생 가능한 장기적인 인간 장 배양 시스템이 없었으며, 우리의 배양 시스템은 인간 장 줄기 세포 생물학을 이해하는데 뿐만 아니라 약물 선별 등의 임상 지향된 시험에 적용하는데 유용하다.
실시예 10 위 오르가노이드의 성장에 최적화된 배양 조건
실시예 5에 개시된 바와 같이, 오랜 기간 동안 위 상피를 배양하는데 사용될 수 있는 배양 배지가 확인되었다. 우리는 여기에 상기 위 오르가노이드 배양에 최적화된 조건들을 개시한다.
물질 및 방법
위 유닛 단리, 단세포 해리 및 EGFP+ ve 세포 분류
위샘을, 약간의 변형과 함께 앞서 개시한 바와 같이(Bjerknes and Cheng, 2002, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Sep;283(3):G767-77) 마우스 유문 부위로부터 단리하였다. 간단히, 현미경 하에서, 상기 위를 보다 큰 곡률을 따라 개방하고, 염수 용액으로 세척하고, 상기 유문을 단리하였다. 상기 위의 근육층을 제거하고 나머지 상피를 5 ㎜ 조각으로 분할하고 4 ℃에서 10 mM EDTA(배양 또는 염색의 경우) 또는 5 mM EGTA(RNA 단리의 경우)를 함유하는 완충된 염수 용액(Na2HPO4 28 mM, KH2PO4 40 mM, NaCl 480 mM, KCl 8 mM, 슈크로스 220 mM, D-솔비톨 274 mM, DL-다이티오트레이톨 2.6 mM) 중에서 3 내지 5 시간 동안 배양하였다. 킬레이트제의 제거 후에, 상기 조직 단편을 10 ㎖ 피펫을 사용하여 상기 완충된 용액 중에 격렬히 현탁시켰다. 현탁 및 원심분리 후에, 침전물 중에는 위샘이 농축되어 있었다. 샘 단리 후에, 세포를 수거하고, 10 ㎎/㎖ 트립신 및 0.8 단위/㎕ DNAse I(미세배열 분석의 경우)가 보충된 무 칼슘 SMEM 배지(Invitrogen) 중에 재현탁하거나 또는 0.8 단위/ul DNAse(배양을 목적으로)가 보충된 트리플익스프레스(TrypleExpress)(GIBCO) 중에 재현탁하였다. 상기 두 경우 모두, 37 ℃에서 20 내지 25 분간 배양 후에, 세포를 회전시키고, 40 μM 메쉬를 통해 여과하였다. EGFPhi 및 EGFPlo 세포를 유식 세포측정(MoFlo, Beckman Coulter)에 의해 분류하였다. 단일의 생육성 상피 세포를 전방 산란 및 펄스-폭 매개변수에 의해 게이트 조절하였다. 명시된 경우, 세포를 프로피디움 요오다이드의 음성 염색을 위해 게이트 조절하고, 트리졸 LS(Invitrogen)에 수거하고, 제조자의 프로토콜에 따라 RNA 단리하거나, 또는 위 배양 배지에 수거하고, 매트리겔(BD Bioscience) 중에 매몰하고 하기 상세히 설명된 프로토콜에 따라 배양하였다.
위 배양물
배양을 위해서, 단리된 위샘을 카운트하고 총 100 개의 샘을 50 ul의 매트리겔(BD Bioscience)과 혼합하고 24-웰 플레이트에 도말하였다. 매트리겔의 중합 후, 위 배양 배지(성장 인자(50 ng/m EGF(Peprotech), 1 ug/㎖ R-스폰딘1, 100 ng/㎖ 노긴(Peprotech), 100 ng/㎖ FGF10(Preprotech) 및 Wnt3A 처리된 배지를 함유하는, B27, N2 및 n아세틸시스테인(Invitrogen)이 보충된 어드밴스드 DMEM/F12)를 덧씌웠다. 단세포 배양을 위해서 총 100 개의 분류된 EGFPhi 세포/웰을 위 배양 배지에 수거하고 매트리겔(BD Bioscience)에 매몰하였다. 매트리겔의 중합 후, 위 배양 배지를 덧씌웠다. 시딩 후 처음 2일간, 상기 배지에, 아노이키스를 피하기 위해서, 10 μM 록 억제제 Y-27632(Sigma Aldrich)를 또한 보충하였다. 성장 인자를 매 이틀마다 가하고 전체 배지를 매 4일마다 교환하였다. 계대 배양을 위해서, 위 오르가노이드를 매트리겔로부터 제거하고, 기계적으로 해리시키고 새로운 매트리겔로 옮겼다. 계대 배양을 매 1 내지 2 주마다 1:5 내지 1:8 분할비로 수행하였다. 상기 Wnt3A 요건을 확인하기 위해서, 마우스 Wnt3A 재조합 단백질(Stem cell technologies)을 상기 Wnt3A 처리된 배지 대신에 보충하였다. 시험관 내 추적 실험을 위해서, 2 주된 위 오르가노이드를 20 시간 동안 위 배양 배지 중에서 100 nM의 4-하이드록시타목시펜과 함께 배양하여 Lgr5-CreERT2를 활성화하였다. YFP를 후속적으로 가시화하고 공 초점 현미경검사(Leica, SP5)를 사용하여 살아있는 오르가노이드로 기록하였다.
Wnt3a 처리된 배지
상기 Wnt3a 배지를 다른 곳에 개시된 프로토콜에 따라 제조하였다(Willert et al., 2003, Nature. May 22;423(6938):448-52). 문헌[van de Wetering et al., 2001 Cancer Res. Jan 1;61(1):278-84]에 개시된 바와 같이, 상기 TOP/FOP 분석을 사용하여 상기 Wnt3a 처리된 배지 및 대조용 처리된 배지의 Wnt 활성을 시험하였다. ≥50의 TOP/FOP 비는 높은 Wnt 배지로 간주되며 위 오르가노이드 배양 배지로 1:1 희석되었다. 상기 높은 Wnt3a 배지(TOP/FOP 비 ∼5)의 1:10 희석은 낮은 Wnt 배지로 간주되었으며 분화 목적에 사용되었다.
위 오르가노이드 면역조직화학
면역조직화학을 위해서 위 오르가노이드를 PBS로 1 회 세척하고 RT에서 15 내지 20 분간 4% 파라폼알데하이드로 즉시 고정시켰다. 명시된 경우 위 오르가노이드를 파라핀에 매몰하고 표준 기법을 사용하여 처리하였다. 전체 염색을 위해서, 샘플들을 PBS 0.5% 트리톤-X100-1%BSA로 투과성으로 만들고 1차 항체와 밤새 배양하였다. PBS 0.3% 트리톤 X100 중에서 수 회 세척한 후에, 샘플들을 2 차 항체와 배양하였다. EdU 염색을 제조자의 설명에 따라 수행하였다(Click-IT; Invitrogen). 핵을 TOPRO3 요오드 또는 Hoescht33342로 염색하였다. 위샘 및 위 오르가노이드의 영상들을 공 초점 현미경검사(Leica, SP5)를 사용하여 획득하였다. 3차원 재건을 볼로시티(Volocity) 소프트웨어(Improvision)를 사용하여 수행하였다.
RT-PCR
RNA를 Rneasy Mini RNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 위 세포 배양물 또는 새로 단리한 조직으로부터 추출하고 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소(Promega)를 사용하여 역 전사시켰다. cDNA를 앞서 개시한 바와 같이(Huch et al., 2009) 열 순환기(GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems, London, UK)에서 증폭시켰다. 사용된 프라이머를 하기에 나타낸다(유전자 기호 다음에 순방향(5'-3') 및 역방향(5'-3') 프라이머).
Lgr5: GGAAATGCTTTGACACACATTC, GGAAGTCATCAAGGTTATTATAA
Gif: TGAATCCTCGGCCTTCTATG, CAGTTAAAGTTGGTGGCACTTC
Pgc: CCAACCTGTGGGTGTCTTCT, TTAGGGACCTGGATGCTTTG
Muc6: TGCATGCTCAATGGTATGGT, TGTGGGCTCTGGAGAAGAGT
Muc5ac: CCATGAAGTGGGAGTGTGTG, TTGGGATAGCATCCTTCCAG
Ghrl: GCCCAGCAGAGAAAGGAATCCA, GCGCCTCTTTGACCTCTTCC
Gast: GCCAACTATTCCCCAGCTCT, GGCTCTGGAAGAGTGTTGCT
Stt: GAGGCAAGGAAGATGCTGTC, GGGCATCATTCTCTGTCTGG
Muc2: GAACGGGGCCATGGTCAGCA, CATAATTGGTCTTGCATGCC
Cdx2: CTTGCTGCAGACGCTCAAC, TCTGTGTACACCACCCGGTA
Hprt: AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA, TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
결과
시험관 내에서 위 유닛의 최적 성장을 측정하기 위해서, 우리는 위샘 유닛을 단리하고 이를 매트리겔에 현탁하고 상이한 조건 하에서 배양하였다. 위 배양물 성장 조건은, 처리된 배지 형태의 Wnt3A에 대한 엄격한 의존성을 제외하고, 상기 소장 배양물(EGF, 노긴 및 R-스폰딘 1 포함)의 조건과 유사하였다. 상기 요건을 정제된 Wnt3a 단백질(도 33A)을 사용하여 확인하였다. 더욱 또한, FGF10은 발아 사건의 구동 및 상기 배양물의 다중 유닛 오르가노이드로의 확장에 필수적인 성분인 것으로 입증되었다(도 33B). FGF10을 사용하여 FGF7(KGF)(실시예 5에서 사용되었다)을 대체할 수 있으며, 심지어 상기 배양 시작 후 4일째에 발아하는 오르가노이드 %의 2 배가 증가한다. 상기 새로 형성된 위 오르가노이드는 중심 관강 주위에 분포된 위샘-도메인 발아돌기와 함께, 그의 극성을 유지하면서 연속적인 발아 사건을 겪었다(도 33D). Wnt3A 처리된 배지의 부재 하에서, 상기 위 오르가노이드는 빠르게 열화되었다(도 33E). 매주, 오르가노이드를 기계적으로 해리하고 그의 예비도말 밀도의 1/5로 분할하였다. 배양된 유문 유닛은 E-Cad 염색에 의해 입증된 바와 같이(도 33F) 단층 상피 구조였다. 우리는 상술한 성질들의 임의의 검출 가능한 상실 없이 8 개월 이상 위 오르가노이드를 성공적으로 배양하였다.
위 Lgr5+ ve 세포(도 34A)가 시험관 내에서 유문 위샘 유닛을 생성시키고 유지시킬 수 있는지의 여부를 측정하기 위해서 우리는 Lgr5-EGFP 높은 세포를 분류하였다(도 34B). 단일의 Lgr5-EGFP 높은 세포를 분류할 때, 상기 세포의 평균 8%가 오르가노이드로 성장한 반면, 나머지 세포는 처음 24 시간 이내에 죽었다. 상기 분류된 Lgr5-EGFPhi 세포는 급속히 분할하기 시작하였고 작은 낭포형 구조는 5일 후에 이미 가시적이었다. 다음 날들 동안, 새로 형성된(낭포형) 구조들은 샘형 도메인을 생성시키기 시작하였다(도 34C). 배양물 중에서 9 내지 11일 후에, 위 오르가노이드를 수동으로 해리하고 분할하여 새로운 오르가노이드를 생성시켰다. 단세포로부터 유래한 위 오르가노이드는 개시된 성질들의 상실 없이(도 34D), 적어도 3개월 동안 매주 성공적으로 재 도말되었다. 7일 이후, Lgr5-EGFP 발현은 상기 샘형 도메인의 기부로 제한되었다(도 34E). EdU 염색에 의해 입증된 바와 같이, 증식하는 세포는 상기 샘형 도메인의 기부에 위치한 반면(도 34F), 세포사멸성 카스파제 3-양성 세포는 관광 내로 분출되는 것으로 밝혀졌다(데이터 도시 안 됨). 계통 추적은 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP 정보제공 마우스로부터 단리된 단일 Lgr5+ve 세포로부터 유래한 확립된 오르가노이드에서 연구되었다. 타목시펜 유도에 이어서, 상기 YFP+ve 정보제공 유전자는 상기 샘형 도메인 내에서 단일 Lgr5+ve 세포에서 빠르게 활성화되었다. 다음 수일에 걸쳐, 상기 YFP 발현 도메인은 상기 성장하는 오르가노이드 내에서 상당히 확장되었으며, 이는 시험관 내 오르가노이드 성장에 대한 상기 Lgr5+ve 줄기 세포의 기여를 입증한다(도 34G). 단세포 배양물로부터 유래한 오르가노이드는 E-카데린 염색에 의해 입증된 바와 같이(도 34I), 단층 상피 구조였다. Lgr5 이외에, 상기 배양물은 위 상피 마커 위 고유 인자, 뮤신 6 및 펩시노겐 C를 발현하였다. 이러한 배양 조건 하에서 피트 또는 장내분비 계통으로의 분화는 관찰되지 않았다(이는 상기 피트 세포 계통이 관찰된 실시예 5와 상이하다. 그러나, 상기 실시예에서 Wnt3a 단백질이, 덜 활성인 Wnt 처리된 배지 대신에 사용되었다. 상기 Wnt 처리된 배지 농도를 낮춘 결과 상기 피트 세포 계통으로의 분화가 발생한다, 하기 참조). 상기 배양 배지 중 Wnt3A 농도의 감소는 위 뮤신 5AC(MUC5AC) 및 과요오드산-쉬프(PAS)의 발현에 의해 입증된 바와 같은 양극화된 피트 세포, Tff2 발현에 의해 입증된 바와 같은 목 점액 세포, 및 일부 산란된 미숙한 장내분비 세포(크로모그라닌 A)를 갖는 필적할만한 위 구조물을 형성시킨다(도 34H,I). RA, IGF 및 엑센딘4와 같은 추가적인 성장 인자의 첨가는 상기 다양한 세포 계통을 향한 위 배양물의 보다 성숙한 분화를 생성시킬 수도 있다. 이 모든 것을 총합하자면, 이들 생체 내 및 시험관 내 관찰은 Lgr5가 상기 유문 위에서 자가 갱신하는 다능성 성인 줄기 세포의 앞서 인식하지 못한 집단을 표시함을 입증한다.
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Claims (18)

  1. 융모형 상피 또는 결장 장샘 오르가노이드에 의해 피복된 중심 관강을 포함하는 장샘-융모 오르가노이드.
  2. 상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포의 배양 방법으로서,
    세포 외 기질을 제공하고;
    상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를 상기 세포 외 기질과 배양하고;
    상기 줄기 세포, 단리된 조직 단편, 또는 선종 세포를,
    뼈 형성 단백질(BMP) 억제제;
    5 내지 500 ng/㎖의 분열 촉진 성장 인자가 첨가되고, 상피 줄기 세포 및 단리된 조직 단편을 배양하는 경우 Wnt 작용물질이 첨가되는 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지의 존재 하에서 배양함을 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 BMP 억제제가 노긴(Noggin)이고, 상기 분열촉진 성장 인자가 상피 성장 인자 및 각질세포 성장 인자이고, 상기 Wnt 작용물질이 R-스폰딘 1인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 BMP 억제제가 노긴, DAN, 및 써베루스(Cerberus) 및 그렘린(Gremlin)을 포함한 DAN형 단백질 중에서 선택되는 방법.
  5. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 Wnt 작용물질이 Wnt, R-스폰딘 1-4, 노린(Norrin) 및 GSK-억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Wnt 작용물질이 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a이고/이거나 상기 분열촉진 성장 인자가 EGF인 방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지가 Y-27632, 파수딜(Fasudil) 및 H-1152 중에서 선택된 록(Rock)(Rho-키나제) 억제제를 또한 포함하는 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지가 노치(notch) 작용물질을 또한 포함하는 방법.
  9. 결장 장샘을 수득하고/하거나 배양하기 위한, 바람직하게는 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로서,
    -상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를, 노긴, EGF, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3을 포함하고 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된 배지 중에서 세포 외 기질과 접촉시켜 배양하는 방법.
  10. 췌장 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하기 위한, 바람직하게는 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로서,
    -상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를, 첫 번째 단계로 EGF, KGF 또는 FGF, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 포함하고 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된 배지 중에서
    -후속적으로 두 번째 단계로 EGF, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1을 포함하고, B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된 배지 중에서 세포 외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하는 방법.
  11. 위 단편을 수득하고/하거나 배양하기 위한, 바람직하게는 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로서,
    -상피 줄기 세포, 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편 또는 선종 세포를, 첫 번째 단계로 BMP 억제제로서 노긴, 분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자 및 FGF10, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a를 포함하고 B27, N2, N-아세틸시스테인을 또한 포함하는 배지 중에서
    -후속적으로 두 번째 단계로 상피 성장 인자, 및 Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1 및 Wnt-3a, 노긴 및 FGF10을 포함하고 B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 보충된 배지 중에서 세포 외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하고, 상기 Wnt-3의 농도를 상기 첫 번째 단계에서 존재하는 상기 Wnt-3a 농도에 비해 상기 두 번째 단계에서 감소시키는 방법.
  12. 뼈 형성 단백질(BMP) 억제제;
    Wnt 작용물질; 및
    5 내지 500 ng/㎖의 상피 성장 인자(EGF)
    가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지.
  13. 세포 외 기질 상에서 상피 줄기 세포 또는 단리된 조직 단편을 배양하기 위한, 제 12 항에 따른 배양 배지의 용도.
  14. 제 2 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득할 수 있는 융모형 상피 또는 결장 장샘 오르가노이드에 의해 피복된 중심 관강을 포함하는 장샘-융모 오르가노이드.
  15. 섬형 구조, 바람직하게는 제 2 항 내지 제 8 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득할 수 있는 섬형 구조를 포함하는 췌장 오르가노이드.
  16. 중심 관강, 바람직하게는 제 2 항 내지 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득할 수 있는 위 오르가노이드.
  17. 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 재생 의학에서, 제 1 항 또는 제 14 항의 장샘-융모 오르가노이드 또는 결장 장샘, 제 15 항의 췌장 오르가노이드, 또는 제 16 항의 위 오르가노이드의 용도.
  18. 선종 세포를 배양하기 위한
    뼈 형성 단백질(BMP) 억제제; 및
    5 내지 500 ng/㎖의 상피 성장 인자(EGF)
    가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 세포 배양 배지의 용도.
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