CN114134102A - 从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞\类器官研究领域，公开了一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法。本发明具有以下优点和效果：通过Dispase(分散酶)降解弹性蛋白，在细胞完好的前提下使得结肠上皮层与固有层之间的连接松散，并通过在OGM培养基中添加Thiazovivin(TZV)、SB431542和CHIR99021三种小分子以提高类器官诱导成功率，能够以较低成本较高效率可靠地获取人类结肠类器官；同时具有以下优点：无需依赖高技能的上皮层剥离技术；获得更多的原代结肠祖细胞；提高原代培养基对结肠类器官的诱导成功率；利于推广与应用。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞\类器官研究领域，特别涉及从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法。
背景技术
类器官(Organoids)指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维(3D)培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。类器官三维培养是一种新兴的用来研究组织成体干细胞生长、分化、器官形成的体外研究系统。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能，并能长期稳定传代培养。
结肠是人体结构和功能最复杂的器官之一，结肠上皮具有极强的自我更新能力，其更新速度在成体哺乳动物的各器官中是最快的。目前，结肠类器官的三维培养是将分离的结肠隐窝或干细胞植入含有多种生长因子的细胞外基质(ECM)中，生成具有结肠上皮样结构的微型空心球体，这些球体被称为结肠类器官。
结肠类器官模型是肠干细胞在体外构建与体内肠上皮组织密切相似的隐窝-绒毛结构的技术突破。因此，类器官作为功能单元，为结肠干细胞的体外生物学研究提供了一个强有力的平台。这种结肠类器官是研究结肠生理和许多疾病状况的有用工具，特别是结直肠癌和遗传疾病(Zhao Q,Guan J,Wang X.Intestinal Stem Cells and IntestinalOrganoids[J].Journal of Genetics and Genomics,2020.)。随着类器官培养技术的进一步优化，来源于不同组织的类器官将在医学疾病的治疗研究中具有非常重要的作用。例如，建立罕见疾病的体外模型、病人个体类器官药物和疗法的筛查、类器官体内移植、类器官在组织再生研究中的应用等，可以看出，类器官的发展是未来精准医学不可或缺的基石。
与永生细胞系相比，这些类器官具有许多优点，但使用它们需要专门的技术。目前人类结肠3D类器官模型的研究已经较为成熟，人们能够在体外稳定传代培养人类的结肠3D类器官，且能长期冻存和复苏。但是传统的方法仍具有一定的局限性。如Sato T等报道的肠隐窝分离步骤较为繁琐，需要对上皮层进行细致地机械分离，高度依赖操作者的技能水平，不利于技术推广；且其创建的长期培养条件中的原代培养基对结肠类器官的诱导成功率不高(Sato T,Stange D E,Ferrante M,et al.Long-term Expansion of EpithelialOrganoids From Human Colon,Adenoma,Adenocarcinoma,and Barrett's Epithelium[J].Gastroenterology,2011,141(5):1762-1772.)。
上述传统的隐窝分离方法和3D类器官培养方法均存在一定的缺陷，正是本发明所解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，通过参考相关的人类结肠上皮干细胞的分离方法及其培养方法，对比已报道的利用EDTA螯合缓冲液建立和培养成体干细胞来源的人结肠类器官，进而建立了稳定的人结肠隐窝分离和3D类器官培养的方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：1.一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，包括如下步骤：(1)人结肠隐窝的分离：无菌采集人结肠活检或手术样本，冷PBS洗涤后剪碎，转移到50mL管中，加入1mg/mL的Dispase(分散酶)进行解离后，再用100％FBS孵育，加入Advanced DMEM/F12并通过移液枪枪头上下吹吸数次，自然沉降后弃上清，用冰冷的含山梨醇和蔗糖的螯合缓冲液重悬，在重力作用下沉降1分钟，收集中层，即为隐窝悬液；(2)人结肠类器官的诱导培养：将步骤1所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入Advanced DMEM/F12进行洗涤，离心弃上清，重复数次后重悬计数，根据计数结果用预冷的Matrigel或BME重悬，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中，待胶完全凝固后加入预热的含生长因子的OGM培养基培养。
本发明的进一步设置为：在步骤(1)中，PBS包括100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、5mM EDTA和0.1％BSA，放于4℃冰箱预冷，并在隐窝分离实验开始前准备好冰袋，结肠离体后应尽快进行取样并迅速置于含冷PBS缓冲液的15mL离心管中，取样后的运输过程需保持肠黏膜样本被冷PBS覆盖，并在冰袋上运输/保存。
本发明的进一步设置为：在步骤(1)中，取10cm细胞培养皿放于冰上并加入少许冷PBS，将结肠黏膜样本转移至培养皿中，用无菌一次性手术刀片在培养皿中将活检组织切成约3mm2的碎片。
本发明的进一步设置为：在步骤(1)中，在将获得的肠段切成约3mm2的碎片后，取1g左右的组织碎片转移到50mL管中，加入20mL的1mg/mL的Dispase(分散酶)解离30分钟，使上皮层与基底侧分离，移除Dispase溶液后加入10mL 100％FBS，冰上孵育15分钟，再加入与FBS等量的Advanced DMEM/F12，用预润洗的移液枪枪头上下吹吸组织后使其自然沉降，弃上清并加入10mL螯合缓冲液重悬，在重力作用下沉降1分钟，获得中层液体即为结肠隐窝悬液。
本发明的进一步设置为：在步骤(2)中通过OGM培养基培养时，培养前三天使用的OGM培养基内加入2.5μM的Thiazovivin(TZV)、0.1μM的SB431542和4μM的CHIR99021，并在第一天使用的OGM培养基中额外添加10μM的Y-27632。
本发明的进一步设置为：在步骤(2)通过OGM培养基培养时，第四天开始每隔2天更换一次，每2-3周传代一次，传代标准是结肠类器官相互接触之前；增殖后的结肠类器官可以直接用于分化，也可以经过传代后进一步增殖后再进行分化，或者将增殖后的结肠类器官进行冻存，在需要时再取出用于进一步的培养。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、该方法通过Dispase(分散酶)使得结肠上皮层与固有层之间的连接松散，通过吹吸形成的剪切力，释放结肠隐窝，利用含山梨醇和蔗糖的螯合缓冲液增加溶液的密度，分离富集含有结肠干细胞的结肠隐窝组织，从而获得大量结肠隐窝；经过特定的配方对结肠干细胞进行诱导培养，所获得的结肠类器官有以下优点：(1)具有持续增殖和持续分化的能力，且较传统原代培养基的诱导成功率有所增高；(2)来自人体组织并且能够保留或者重现结肠在体内时候的完整的组织结构(由单层的类似绒毛细胞的结构相连接，底部干细胞与潘氏细胞间隔排列，其上是TA细胞和成熟细胞)和正常生理功能(比如吸收营养物质、分泌黏液等)；(3)可操作性佳，不用高度依赖操作者的技能水平，且能像细胞系一样反复冻存、复苏和传代；(4)体现人类个体差异，可用于个性化诊疗，可以比较完善地模拟结肠在人体内的生理/病理过程和组织结构，是对个体患者进行精准医疗的有力助手；
2、肠上皮细胞不仅在营养物质的吸收中起着至关重要的作用，而且在人体与外界之间起着物理屏障的作用；肠上皮损伤常常与各种炎症性疾病、化疗和放疗以及药物介导的毒性有关；由于原发性肠上皮细胞的体外存活率较低，药物和其他治疗方法只能在动物模型中进行体内测试，而肠隐窝干细胞的三维培养和类器官的建立为体外培养和研究肠上皮细胞提供了新的可能性；目前结肠类器官模型的建立多依赖于操作者的技能水平，或导致成功率不高，不利于技术推广，无法真正满足学术研究和药物开发的需求；
3、通过Dispase(分散酶)降解弹性蛋白，在细胞完好的前提下使得结肠上皮层与固有层之间的连接松散，并通过在OGM培养基中添加Thiazovivin(TZV)、SB431542和CHIR99021三种小分子以提高类器官诱导成功率，能够以较低成本较高效率可靠地获取人类结肠类器官，有益于结肠类器官在精准医疗等领域的推广使用，其单独应用或结合其他领域的技术最终可以有下述有益效果：(1)有益于在临床前研究中尽早发现对原代细胞的不良甚至毒性影响；(2)有益于减少在动物身上进行的体内试验；(3)有益于预测待测药物和治疗的潜在毒性效应；(4)有益于节省研发耗时并提升实验成功率；
4、通过本发明所涉及的结肠类器官能够弥补传统方法建立的结肠类器官模型存在的问题，从而优化结肠类器官模型建立过程中的4个方面：(1)无需依赖高技能的上皮层剥离技术；(2)获得更多的原代结肠祖细胞；(3)提高原代培养基对结肠类器官的诱导成功率；(4)利于推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是人类组织来源的结肠类器官的培养粗略步骤图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，包括人结肠隐窝的分离、人结肠类器官的诱导培养两大步骤，培养全过程粗略步骤见图1。
人结肠隐窝的分离的具体步骤如下：
(1)将小量分装的Matrigel或BME(R&D)提前放于4℃冰箱融化；本实施例中选用Matrigel；
(2)将PBS(含100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、5mM EDTA和0.1％BSA，下同)放于4℃冰箱预冷，并在隐窝分离实验开始前准备好冰袋；
(3)准备结直肠癌患者手术或活检组织样本用于培养结肠类器官的正常组织。用事先准备好的灭过菌的剪刀和镊子进行取样，取样部位离肿瘤的距离大于3cm；为方便处理，所取片段尽量为宽条形(8mm*10mm)；结肠离体后应尽快进行取样并迅速置于含冷PBS缓冲液的15mL离心管中，取样后的运输过程需保持肠黏膜样本被冷PBS覆盖，并在冰袋上(大概4℃)运输/保存；
(4)将结肠黏膜样本转移至装有足量冷PBS缓冲液的15mL离心管中，上下振荡，洗涤结肠黏膜样品，重复洗涤2次；
(5)取10cm细胞培养皿放于冰上并加入少许冷PBS，将结肠黏膜转移至培养皿中，用无菌一次性手术刀片在培养皿中将活检组织切成约3mm2的碎片；
(6)将1g左右的组织碎片转移到50mL管内，加入20mL的1mg/mL的Dispase(分散酶)解离30分钟，在冰上孵育30分钟，使上皮层与基底侧分离；
(7)待解离完毕后，使其自然沉降，去除Dispase溶液，加入10mL 100％FBS和3mMCaCl2，在冰上孵育15分钟；
(8)加入与FBS等量的Advanced DMEM/F12；
(9)用预润洗过的1mL移液枪枪头上下剧烈吹吸组织碎片数次，将组织弄碎，自然沉降或离心后弃上清；
(10)沉淀用10mL冰冷的含山梨醇和蔗糖的螯合缓冲液重悬，在重力作用下沉降1分钟后，将含有隐窝的中层清液收集到新的预润洗过的50mL管中，透过灯光可以肉眼观察到隐窝，得到隐窝悬液；
人结肠类器官的诱导培养的具体步骤如下：
(1)将隐窝悬液在200g/4℃离心3分钟，弃上清；
(2)加入20mL Advanced DMEM/F12，混匀后离心(200g/4℃/3min)，弃上清，重复此步骤2次；
(3)加入Advanced DMEM/F12重悬沉淀，另取1.5mL Eppendorf管，加入10μL隐窝悬液和1mL Advanced DMEM/F12，混匀后取10μL悬液进行计数；
(4)加入1倍体积的Matrigel与隐窝悬液充分混合，点胶50μL每孔于24孔板的板中心；
(5)将培养板放于37℃培养箱内孵育15分钟，使Matrigel凝固；
(6)每个孔中加入500μL含生长因子的OGM培养基，培养前三天使用的OGM培养基内加入2.5μM的Thiazovivin(TZV)、0.1μM的SB431542和4μM的CHIR99021，并在第一天使用的OGM培养基额外添加10μM的Y-27632；
(7)第四天开始每隔1天更换一次OGM培养基，每2-3周传代一次，传代标准是结肠类器官相互接触之前；增殖后的结肠类器官可以直接用于分化，也可以经过传代后进一步增殖后再进行分化，或者将增殖后的结肠类器官进行冻存，在需要时再取出用于进一步的培养。
同时在本发明中所需的相关试剂与配方如下：
Pen/Strep青霉素-链霉素混合液(货号：15140-122)购于美国ThermoFisher公司。
Advanced DMEM/F12培养液(货号：12634-010)、中性蛋白酶DispaseⅡ(货号：17105041)、胎牛血清(FBS，货号：10099141)购于美国Gibco公司。
Basement Membrane Matrigel(货号：354234)购于美国康宁公司。
Na2HPO4(货号：S118441)、KH2PO4(货号：P113041)、NaCl(货号：C111538)、KCl(货号：P112144)、D-Sorbitol(货号：S104836)、Sucrose(货号：S112236)、DL-dithiothreitol(货号：D104860)购于阿拉丁公司。
Thiazovivin(TZV，货号：04-0017)购于美国Stemgent公司。
IntestiCultTM Organoid Growth Medium(Human)(货号：06010)、IntestiCultTMOrganoid Differentiation Medium(Human)(货号：100-0214)、SB431542(p38抑制剂，货号：72232)、CHIR99021(货号：72052)、Y-27632(货号：72304)购于加拿大STEM CELL公司。
Primocin(货号：ant-pm-1)购于美国InvivoGen公司。
EDTA(货号：15575-038)购于美国Invitrogen公司。
超低内毒素蒸馏水(货号：L912KJ)购于上海源培生物。
PBS(货号：G4207-500)购于Servicebio生物科技有限公司。
表1是螯合缓冲液的配制，且在配制后用0.22μm滤膜过滤除菌，具体成分如下：
| 组分 | 最终使用浓度浓度 |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 5.6mmol/L |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 8mmol/L |
| NaCl | 96.2mmol/L |
| KCl | 1.6mmol/L |
| D-Sorbitol | 54.9mmol/L |
| Sucrose | 43.4mmol/L |
| DL-dithiothreitol | 0.5mmol/L |
| EDTA | 2mmol/L |
表2是Dispase工作液配制，具体成分如下：
| 试剂名称 | 最终使用浓度 |
| Dispase | 1mg/mL |
| FBS | 2.5％ |
| BSA | 0.1％ |
| HEPES | 10mM |
| DMEM/F12 | N/A |
| CaCl<sub>2</sub> | 3mM |
OGM培养基为在基础培养基(IntestiCultTM OGM Human Basal Medium和Organoid
Supplement培养基按体积比1：1混合)中加入以下添加剂，如下表3：
| 添加剂 | 最终使用浓度 |
| Primocin | 0.1mg/mL |
| IGF1 | 100ng/mL |
| FGF2 | 50ng/mL |
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)人结肠隐窝的分离：无菌采集人结肠活检或手术样本，冷PBS洗涤后剪碎，转移到50mL管中，加入1mg/mL的Dispase(分散酶)进行解离后，再用100％FBS孵育，加入AdvancedDMEM/F12并通过移液枪枪头上下吹吸数次，自然沉降后弃上清，用冰冷的含山梨醇和蔗糖的螯合缓冲液重悬，收集中层，即为隐窝悬液；
(2)人结肠类器官的诱导培养：将步骤1所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入AdvancedDMEM/F12进行洗涤，离心弃上清，重复数次后重悬计数，根据计数结果用预冷的Matrigel或BME重悬，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中，待胶完全凝固后加入预热的含生长因子的OGM培养基培养。
2.根据权利要求1所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(1)中，PBS包括100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、5mM EDTA和0.1％BSA，放于4℃冰箱预冷，并在隐窝分离实验开始前准备好冰袋，结肠离体后应尽快进行取样并迅速置于含冷PBS缓冲液的15mL离心管中，取样后的运输过程需保持肠黏膜样本被冷PBS覆盖，并在冰袋上运输/保存。
3.根据权利要求2所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(1)中，取10cm细胞培养皿放于冰上并加入少许冷PBS，将结肠黏膜样本转移至培养皿中，用无菌一次性手术刀片在培养皿中将活检组织切成约3mm2的碎片。
4.根据权利要求3所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(1)中，在将获得的肠段切成约3mm2的碎片后，取1g左右的组织碎片转移到50mL管中，加入20mL的1mg/mL的Dispase(分散酶)解离30分钟，使上皮层与基底侧分离，移除Dispase溶液后加入10mL 100％FBS，冰上孵育15分钟，再加入与FBS等量的Advanced DMEM/F12，用预润洗的移液枪枪头上下吹吸组织后使其自然沉降，弃上清并加入10mL螯合缓冲液重悬，在重力作用下沉降1分钟，获得中层液体即为结肠隐窝悬液。
5.根据权利要求1所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(2)中通过OGM培养基培养时，培养前三天使用的OGM培养基内加入2.5μM的Thiazovivin(TZV)、0.1μM的SB431542和4μM的CHIR99021，并在第一天使用的OGM培养基中额外添加10μM的Y-27632。
6.根据权利要求5所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(2)通过OGM培养基培养时，第四天开始每隔2天更换一次，每2-3周传代一次，传代标准是结肠类器官相互接触之前；增殖后的结肠类器官可以直接用于分化，也可以经过传代后进一步增殖后再进行分化，或者将增殖后的结肠类器官进行冻存，在需要时再取出用于进一步的培养。
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