CN105950539A - 人小肠3d类器官研究p-糖蛋白模型的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人小肠3D类器官研究P‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)模型的构建方法。本发明中，首先将人小肠隐窝接种于基质胶中，加入含有特定生长因子的ADMEM/F12培养基进行培养以形成3D类器官；然后进行形态观察，并从mRNA和蛋白水平检测P‑gp的表达；最后采用共孵育的方法，以罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)为底物，研究维拉帕米(Verapamil)和米托坦(Mitotane)对Rh123转运的影响。所述人小肠3D类器官研究P‑gp的模型可应用于P‑gp介导的药物转运研究，所述人小肠3D器官研究P‑gp的模型也可广泛应用于P‑gp抑制剂的体外高通量筛选，所述方法高效、快速。

Description

人小肠3D类器官研究P-糖蛋白模型的构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人小肠3D类器官研究P-糖蛋白模型的构建方法及其在P-糖蛋白介导的药物转运研究中的应用。
背景技术
口服药物进入人体主要经过吸收、分布、代谢和排泄四个过程，而其中吸收、分布和排泄这三个过程通常是在转运体的参与下完成的。对口服药物而言，药物在消化道内的吸收速度和吸收程度将直接影响药效的发挥。其中，P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)对药物的吸收起到非常重要的作用。
P-gp(ABCB1,MDR1)是ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体超家族中重要的一员，表达于膜表面，分子量约为170kD。P-gp在许多正常的组织和器官中都有表达，尤其在小肠、肝脏、肾脏和血脑屏障中表达量较高。P-gp是由多药耐药基因(MDR1)编码的单链蛋白，含有1280个氨基酸。这1280个氨基酸组成两个亚基，每个亚基包括一个跨膜结构域(TMD)和一个ATP结合结构域(NBD)。其中，TMD是由6个疏水α-螺旋组成的极度疏水区，而NBD则是极度保守的的亲水区。P-gp的主要作用是利用ATP水解的能量将内源性物质(如胆酸、脂肪、糖类、氨基酸、胆固醇、激素及一些电解质等)、外源性物质(如药物及其代谢产物等)以及毒素排出细胞外，起到保护细胞的作用，是机体抵御不良环境的一道天然屏障，但同时也是限制药物吸收的主要因素。据统计，大约有40％的先导化合物在临床阶段被否决的主要原因是其药动学性质不佳，尤其是口服药物生物利用度过低。因此，在药物研发的早期阶段，不仅要关注化合物的活性，也要关注化合物的药动学性质，以期降低后期失败的风险。其中，P-gp介导的药物转运研究非常重要。另一方面，研究表明，P-gp在肿瘤细胞中的表达水平高于正常细胞，90％的肿瘤化疗失败是由于多药耐药现象的产生，而P-gp的过表达是产生多药耐药的主要原因。基于以上两点，研究P-gp介导的药物转运具有重要的临床意义。
在P-gp介导的转运研究中，源自人结肠癌细胞系的Caco-2细胞单层模型被视为最经典的药物转运研究模型。经过21天的培养，Caco-2细胞之间可以通过紧密连接形成具有极性的细胞单层，并且分化出类似人小肠的绒毛结构，可进行吸收与外排的双向转运研究来评价药物性质。然而，此模型的亦存在一些缺陷，比如(1)培养周期长，时间成本高；(2)细胞间的连接过于紧密，低估了药物通过细胞间隙的运输；(3)体外永生化的细胞，与真实的机体环境有较大差异。
随着科学与技术的发展，新的P-gp转运研究模型应运而生。2009年，Toshiro Sato等人报道了小鼠的单个隐窝在体外适宜的条件下可以形成一个三维的球状结构，称之为3D类器官。继Toshiro Sato等人报道后，两种新的转运研究方法相继被报道。2012年，TomohiroMizutani等人报道了利用荧光定量显微镜可以对3D类器官内的Rh123进行实时监测，以此来研究P-gp介导的底物转运。2016年，我们实验室的研究发现了利用超声破碎法和多功能酶标仪可以收集、检测3D类器官内的Rh123。相比于Caco-2细胞单层，类器官模型具有很大的优势：(1)培养周期短，节约时间和成本；(2)直接由小肠隐窝干细胞分化而来，能够更真实地模拟机体环境；(3)P-gp的表达水平与机体更相似，能够更好地模拟体内药物的吸收情况。然而，以上报道的这两种方法操作都较为繁琐，不利于药物的高通量筛选。更重要的是，这两种研究药物转运的方法都是使用小鼠的小肠3D类器官，而小鼠与人存在种属差异，由小鼠3D类器官得来的数据与人体的真实情况相差较大。鉴于P-gp在人体内药物转运中的重要作用，我们需要一种与人体实际情况更接近的模型来研究P-gp介导的药物转运。2011年，人3D类器官的研究取得了突破性进展，Toshiro Sato等人成功实现了人小肠3D类器官培养。这一重大发现立刻引起了全球科学界的广泛关注。人的小肠3D类器官应用广泛，可以用于进行药理学、毒理学以及微生物学研究，也可以用于开展癌基因修复等相关研究。我们首次建立了人小肠3D类器官研究P-gp的模型并将其应用于P-gp介导的药物转运研究。与小鼠小肠3D类器官相比，人的小肠3D类器官能够消除属种差异，更真实地模拟人小肠的实际情况。使用人的小肠3D类器官来研究P-gp介导的药物转运，能够更真实地反映人体内药物转运的情况。与小鼠相比，人的类器官模型具有不可比拟的优势与研究价值。
发明内容
本发明克服现有技术中研究P-gp方法的不足，提出了一种人小肠3D类器官研究P-gp模型的构建方法，本发明还提出了将所述人小肠3D类器官用于P-gp介导的药物转运研究，所述人小肠3D器官研究P-gp的模型也可广泛应用于P-gp抑制剂的体外高通量筛选，所述方法高效、快速。
本发明提出了一种人小肠3D类器官模型，所述人小肠3D类器官模型的形状为三维中空球体，由干细胞、潘氏细胞以及上皮细胞等组成；类器官外侧模拟的是小肠基底侧，腔侧模拟的是小肠绒毛侧并有P-gp的表达。
其中，所述人小肠3D类器官模型培养至2-3天时类器官出现“出芽”现象，形成新的隐窝。
本发明提出了一种人小肠3D类器官模型的培养方法，包括以下步骤：(1)将人小肠隐窝混悬于基质胶中，取适量体积加入微孔板，如96孔板(5μL)或24孔板(50μL)，然后加入含有多种生长因子的ADMEM/F12培养基(96孔板100μL，24孔板500μL)进行37℃培养；(2)人小肠3D类器官培养的第0，1，2，3，4，5，6天，进行形态观察，当培养2天，可得到所述使用的人小肠3D类器官模型。
其中，人小肠3D类器官培养的第1，2，3，4，5，6天类器官体积逐渐增大，培养至2-3天时类器官出现“出芽”现象，形成新的隐窝。
其中，类器官外侧模拟的是小肠基底侧，腔侧模拟的是小肠绒毛侧并有P-gp的表达。
本发明提出了一种人小肠3D类器官研究P-gp的模型，包括所述人小肠3D类器官模型，类器官培养时间为2天；P-gp底物为Rh123，底物浓度为5μM；P-gp抑制剂为Verapamil和Mitotane，抑制剂浓度均为20μM；类器官中的Rh123收集方法为PBS孵育法，PBS孵育的时间为4h。
所述人小肠3D类器官模型的形状为三维中空球体，由干细胞、潘氏细胞以及上皮细胞等组成；类器官外侧模拟的是小肠基底侧，腔侧模拟的是小肠绒毛侧并有P-gp的表达。
本发明提出了一种人小肠3D类器官研究P-gp的模型的构建方法，包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官形态观察；(3)人小肠3D类器官中P-gp蛋白表达在mRNA水平上的检测；(4)免疫组化法检测并定位人小肠3D类器官中P-gp蛋白的表达；(5)人小肠3D类器官中P-gp介导的药物转运研究。
其中，所述步骤(2)中，进行形态观察的具体时间为类器官培养的第0，1，2，3，4，5，6天；培养的第0，1，2，3，4，5，6天类器官体积逐渐增大；培养至2-3天时类器官出现“出芽”现象，形成新的隐窝。
其中，所述步骤(3)、(4)中人小肠3D类器官的培养时间为2天。
所述人小肠3D类器官模型的形状为三维中空球体，由干细胞、潘氏细胞以及上皮细胞等组成；类器官外侧模拟的是小肠基底侧，腔侧模拟的是小肠绒毛侧并有P-gp的表达。
其中，所述方法步骤(5)中P-gp底物为Rh123，底物浓度为5μM；P-gp抑制剂为Verapamil和Mitotane，抑制剂浓度均为20μM；类器官中Rh123的收集方法为PBS孵育法，PBS孵育的时间为4h。
本发明还提出了一种在人小肠3D类器官研究P-gp的模型中检测P-gp介导的药物转运的方法，所述方法包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官分别与①P-gp底物Rh123②P-gp底物Rh123与P-gp抑制剂Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小肠3D类器官中Rh123收集与检测。
其中，所述步骤(1)中，所述人小肠3D类器官培养时间为2天。
其中，所述步骤(2)中，底物Rh123浓度为5μM，P-gp抑制剂Verapamil和Mitotane浓度均为20μM；所述孵育时间为20，40，60，80，100min；目的是作出Rh123在类器官中时间依赖性的积累图。无论是对照组还是给药组，都可以再细分为不同小组，每小组分别孵育不同时间，然后以时间为横坐标，Rh123浓度为纵坐标作图，观察Rh123在类器官中随孵育时间积累的情况。
其中，所述步骤(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rh123释放，PBS的孵育时间为4h。
本发明还提出了将所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型用于P-gp介导的药物转运研究中的应用。
本发明还提出了将所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型用于P-gp介导的药物转运研究中的应用。所述应用包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官分别与①P-gp底物Rh123②P-gp底物Rh123与P-gp抑制剂Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小肠3D类器官中Rh123收集与检测。
由于P-gp是一种外排转运体，可以将其底物如Rh123外排到3D类器官内，但这种外排作用可以被P-gp的抑制剂如Verapamil和Mitotane抑制，通过收集、检测并比较对照组和给药组类器官中的Rh123，可以得出相应的结论。
其中，所述步骤(1)中，人小肠3D类器官培养时间为2天。
其中，所述步骤(2)中，底物Rh123的浓度为5μM，P-gp抑制剂Verapamil和Mitotane的浓度均为20μM；孵育时间为20，40，60，80，100min，目的是检测Rh123在类器官中的积累量是否存在时间依赖性，无论是对照组还是给药组，都可以再细分为不同小组，每小组分别孵育不同时间，然后以时间为横坐标，Rh123浓度为纵坐标作图，可以观察Rh123在类器官中随孵育时间积累的情况。
其中，所述步骤(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rh123释放，PBS孵育时间为4h。
其中，随着步骤(2)中孵育时间的增加，Rh123的浓度在对照组和实验组类器官中都呈现升高的趋势；由于实验组加入了P-gp抑制剂，P-gp的外排作用被抑制，导致实验组类器官中Rh123积累缓慢；Mitotane为第三代P-gp抑制剂，抑制效果比Verapamil强，加入Mitotane后该组类器官中Rh123的积累比Verapamil组更缓慢。
本发明还提出了将所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型用于P-gp抑制剂的体外高通量筛选的应用。
本发明还提出了一种促使所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型中Rh123释放的方法，采用PBS孵育的方法促使其中的Rh123释放，其中，微孔板中加入的PBS体积为150μL，孵育时间为4h，即可将人小肠3D类器官模型中的Rh123释放出来，避光环境下取80μL上清至新的96孔板，然后用锡箔纸包裹至多功能酶标仪，在λex/λem＝485nm/535nm条件下进行荧光值测定。
与现有技术采用超声破碎的方法收集类器官中的Rh123相比，本发明采用的是PBS孵育的方法，操作简单、快速，节省人力物力，更加适合高通量药物筛选。
本发明还提出了一种引物序列，其中，
上游引物序列为F：5’-GAGGCCAACATACATGCCTTC-3’，
下游引物序列为R：5’-GTCTAACAAGGGCACGAGCTA-3’。
本发明还提出了一种检测P-gp的mRNA水平的方法，包括以下步骤：(1)提取总mRNA；(2)将总mRNA反转为cDNA；(3)ABCB1引物设计与验证；(4)PCR扩增目的基因；(5)琼脂糖凝胶电泳分离目的基因。
P-gp介导的药物指的是可与P-gp的活性位点结合，并借助ATP提供的能量进行转运的药物。Rh123作为P-gp的底物，可以与3D类器官上的P-gp结合而被转运。当P-gp的活性位点被竞争性抑制或者ATP的酶活被抑制时，P-gp介导的Rh123转运就会受到限制，3D类器官腔侧的Rh123浓度就会降低。
所述P-gp介导的药物包括地高辛(Digoxin)、洛哌丁胺(Loeramide)、奎尼丁(Quinidine)、长春花碱(Vinblastine)等。
本发明首次构建人的小肠3D类器官研究P-gp的模型并将其应用于P-gp介导的药物转运研究，而且采用PBS孵育的方法促使其中的Rh123释放，其优点在于：
(1)相比于人结肠癌细胞系的Caco-2细胞单层模型，3D类器官直接由人小肠隐窝中的干细胞分化形成，在生理上与小肠更相似，能更好地模拟药物在体内的跨膜转运；培养周期短，时间成本低。
(2)与培养小鼠的小肠3D类器官相比，人的类器官模型能够消除属种差异，更真实地模拟人小肠的实际情况。使用人的小肠3D类器官来研究P-gp介导的药物转运，能够更直接地反映人体内药物转运的情况。与小鼠的类器官相比，人的类器官研究具有不可比拟的优势与研究价值。
(3)PBS孵育促使Rh123释放的收集方法，不需加入额外的试剂，也无需进行其他操作，简单、快速、高效，而且经济成本低，更加适合高通量药物筛选。
附图说明
图1为人小肠3D类器官0-6天的形态。随着培养天数增加类器官体积逐渐增大并出现“出芽”现象。
图2为ABCB1引物退火温度摸索结果。在各温度下引物条带单一，为避免后续PCR反应出现杂带，选择64℃为最适退火温度。
图3为人小肠、隐窝和3D类器官中P-gp蛋白表达在mRNA水平上的检测结果。在3D类器官中存在P-gp的表达。
图4为免疫组化法检测人小肠和3D类器官中P-gp蛋白表达水平的结果。箭头所指为P-gp的表达位置，在小肠组织中P-gp表达于绒毛侧，在类器官中P-gp表达于腔侧。
图5为罗丹明123(Rh123)的标准浓度曲线。在5-500nM浓度范围内，取权重因子为1/x2进行线性回归，标曲呈现很好的线性(r2>0.99)。
图6为两种P-gp抑制剂对罗丹明123(Rh123)跨3D类器官转运的影响。随着孵育时间的增加，Rh123的浓度在对照组和实验组类器官中都呈现升高的趋势；由于P-gp受到抑制，实验组中Rh123积累缓慢；米托坦(Mitotane)的对P-gp的抑制效果比维拉帕米(Verapamil)强，Mitotane组Rh123积累更缓慢。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1人小肠3D类器官培养
(1)将包含小肠干细胞、潘氏细胞以及小肠上皮细胞等细胞类型的人小肠隐窝混悬于基质胶中，密度以每1μL含5-10个完整隐窝为宜。
(2)取适量体积上述基质胶加入预热的96孔板(5μL)或24孔板(50μL)，37℃培养箱放置15min以便基质胶凝固。
(3)基质胶凝固后，加入相应体积(96孔板100μL，24孔板500μL)的含有多种生长因子(Recombinant Human R-Spondin-1,Recombinant Murine Noggin,Recombinant MouseEpidermal Growth Factor(EGF),Recombinant Mouse Wnt-3a)的ADMEM/F12培养基，然后将其放置37℃培养箱进行培养。每两天换一次培养基。
实施例2人小肠3D类器官形态观察
将培养0、1、2、3、4、5和6天的3D类器官置于配备Olympus DP 71拍照系统的OlympusIX 71显微镜下进行观察并拍照，结果如图1所示。从图中可以看出，随着培养天数增加，隐窝体积逐渐增大并形成类器官结构。当类器官体积增大到一定程度时，隐窝中的干细胞开始分化形成新的隐窝，表现为“出芽”现象。
实施例3人小肠3D类器官中P-gp蛋白表达在mRNA水平上的检测
(1)3D类器官的获取：按照实施例1中的培养方法在3D类器官培养2天后(24孔板中)，将其从细胞培养箱中取出，弃去培养基，PBS清洗两遍后每孔加入1mL预冷的PBS，将基质胶轻轻吹散后转移至15mL离心管，室温下200×g离心5min，沉淀即为3D类器官，弃去上清，备用。
(2)mRNA的获取：向装有小肠组织和分选出的隐窝以及3D类器官的管中每管加入500μL Trizol，按照标准步骤提取总mRNA。(其中，人的小肠组织经过匀浆处理)
(3)cDNA的获取：以提取的总mRNA为模板(模板量为1000ng)，使用反转录试剂盒，在逆转录酶的作用下反转为cDNA，反转体系为20μL。
(4)ABCB1引物设计：上游引物为F：5’-GAGGCCAACATACATGCCTTC-3’，下游引物为R：5’-GTCTAACAAGGGCACGAGCTA-3’。产物长度为127bp。
(5)ABCB1引物退火温度摸索：取1μL cDNA为模板，加入上述引物，分别选取56、58、60、62和64℃共5个退火温度进行PCR反应。其中反应体系为20μL，循环数为35。结果如图2所示。从图中可以看出在上述条件下PCR产物条带单一，产物长度为127bp。为避免后续实验产物出现杂带，选择64℃为最适退火温度。
(6)PCR反应：分别取1μL cDNA为模板，加入验证好的上述引物进行PCR反应，反应体系为20μL，循环数为35，退火温度为64℃。
(7)琼脂糖凝胶电泳：配置2％(w/v)的琼脂糖凝胶。向上述PCR反应产物中加入4μLDNA上样缓冲液，混匀后取6μL上样，120V电泳20min后将其置于凝胶成像系统(Bio-Imaging System 910)下拍照，结果如图3所示。其中，β-actin作为内参。从图中可以看出在小肠3D类器官中存在P-gp的表达。
实施例4免疫组化法检测并定位人小肠3D类器官中P-gp蛋白的表达
(1)3D类器官的获取：按照实施例1中的培养方法在3D类器官培养2天后(96孔板中)，将其从细胞培养箱中取出，弃去培养基，PBS清洗两遍后每孔加入150μL预冷的PBS，放置冰上，然后用枪头将基质胶轻轻吹散并转移至15mL离心管，室温下200×g离心5min，沉淀即为3D类器官，弃去上清，备用。
(2)固定：将3D类器官包裹于称量纸内，与卷好的小肠组织一起放入4％多聚甲醛中，并于4℃摇床过夜。
(3)冲洗：用自来水将3D类器官与小肠组织冲洗24h，洗掉固定液。
(4)脱水：采用乙醇脱水法，将3D类器官与小肠组织依次在50％、75％、85％、95％、100％乙醇中放置1小时。
(5)透明：先将3D类器官与小肠组织放入无水乙醇：二甲苯(1:1,v/v)20min，再将其在二甲苯I和二甲苯II中各放置15min。
(6)浸蜡：将3D类器官与小肠组织放置在蜡I 30min，蜡II 2小时，最后放置蜡III中过夜。
(7)包埋：先将小肠组织修剪成合适大小再包埋。蜡块凝固后将其放入-20℃冰箱冰冻5min后再将其与铅盒轻轻分离。
(8)切片：切片前，先除去组织块周围多余的石蜡，将蜡块修剪成形状规则的正方形或长方形；将蜡块固定在切片机上切片，切片厚度为4μm；切好后用毛笔小心地将切片放到42℃水浴锅中展片；然后再将其贴于载玻片上，做好标记后放到62℃烤片机上烤片2小时；烤片结束后待其冷却便可放入切片盒中保存。
(9)免疫组化：
①脱蜡：将切片依次放入二甲苯I(10min)、二甲苯II(10min)、二甲苯：100％乙醇(1:1,v/v)(5min)、100％乙醇(5min)、95％乙醇(5min)、85％乙醇(5min)、75％乙醇(5min)、纯水(3min)进行脱蜡。
(事先打开水浴锅，调至100℃)
②抗原修复：配制200mL柠檬酸钠(10mM)修复液倒入修复盒中，将玻片按照一定的方向逐一插入修复盒，然后盖紧盖子放入水浴锅中100℃修复20min，自然冷却至室温。
③去除过氧化氢酶，润洗：准确量取甲醇36mL，然后加入4mL 30％H2O2配置终浓度为3％的H2O2，将其倒入浸泡瓶，将切片按照一定的方向插入浸泡瓶后避光放置10min以去除过氧化氢酶，之后蒸馏水润洗3次，再用含2％Triton-X 100的PBST润洗(细胞打孔)2次，每次3min。
④抗原位点封闭：先用滤纸将切片四周的液体擦干，然后在切片周围画一合适大小的油圈，再在油圈内滴加1-2滴封闭液(5％脱脂奶粉)，于湿盒内反应20min。
⑤添加一抗：弃去封闭液，先用滤纸将油圈上残留的液体擦去，再向油圈内滴加50μLP-gp单克隆抗体，最后将其平放在湿盒内4℃过夜。
⑥添加二抗：弃去一抗，PBST清洗3次，每次5min，然后添加生物素标记的二抗，室温反应30min。(注意保持切片湿润)。
⑦添加链亲和素标记-HRP(辣根过氧化物酶)：弃去二抗，PBST清洗3次，每次5min，然后添加50μL链亲和素标记的HRP并于避光环境下反应30min。
⑧显色：先用PBST清洗3次，每次5min，在避光环境下将DAB试剂盒中三种液体混合并以纯水稀释后，向每个玻片添加50μL的显色液显色5min。
⑨苏木精染色：先用自来水冲洗3次将显色液去除，然后用苏木精染色5min；自来水冲洗3次之后再用75％酒精(含1％盐酸)去色20s；蒸馏水清洗3次后在自来水中返蓝20min。
⑩封片：将切片依次放入75％乙醇(3min)、85％乙醇(3min)、95％乙醇(3min)、100％乙醇(5min)、无水乙醇：二甲苯(1:1,v/v)(5min)、二甲苯I(5min)、二甲苯II(10min)，然后取出切片，擦干后滴加一滴树脂胶，盖上盖玻片，自然晾干。
(10)拍照：待切片晾干后，将其置于配备有LEICA DFC310FX拍照系统的LEICADM4000B LED显微镜下观察并拍照，结果如图4所示。从图中可以看出在小肠组织中P-gp表达于小肠绒毛侧，而在小肠3D类器官中，P-gp表达于球状类器官的内侧边缘。结果说明小肠3D类器官的内侧模拟的是小肠的绒毛侧，而类器官的外侧模拟的是小肠的基底侧。
实施例5人小肠3D类器官中P-gp介导的药物转运研究
(1)Rh123标准浓度曲线的建立。
避光环境下，用PBS将Rh123稀释成系列浓度梯度(5,10,20,50,100,200,500nM)的标准液并依次加入96孔板，每孔80μL，每个浓度设3个平行。然后将96孔板于避光环境下放入多功能酶标仪(FLUOStar OPTIMA)，在λex/λem＝485nm/535nm条件下进行检测。以Rh123浓度为横坐标、测得的荧光值为纵坐标、权重因子为1/x2进行线性回归，结果如图5所示。相关系数r2>0.99，表明线性很好。
(2)人小肠3D类器官培养。
按照实施例1所述培养方法在96孔板内进行人小肠3D类器官培养。
(3)人小肠3D类器官中P-gp底物与抑制剂共孵育。
类器官培养2天后，将其从细胞培养箱中取出，并于显微镜下计数。计数结束后在避光环境下进行分组实验，对照组加入只含Rh123的培养基，实验组加入同时含有Verapamil(第一代P-gp抑制剂)或Mitotane(第三代P-gp抑制剂)与Rh123的培养基，然后将其放入37℃细胞培养箱孵育。Rh123的浓度为5μM，抑制剂的浓度为20μM。
(4)人小肠3D类器官中Rh123收集与测定。
在特定孵育时间点(20,40,60,80,100min)取出相应的96孔板，于避光环境下向每孔加入150μL预热的PBS连续清洗5次(每次2min)以去除残留的Rh123。再向每孔加入150μL预热的PBS，然后将96孔板放入37℃培养箱并开始计时。待4小时后，类器官破裂，囊腔中积累的Rh123释放到PBS中，此时于避光环境下取80μL上清液至新的96孔板中，然后用锡箔纸包裹至多功能酶标仪进行荧光值测定。将测得的样品荧光值代入标准浓度曲线，得到样品中Rh123的总浓度。然后将总浓度除以每孔的类器官个数，得到平均每个类器官中Rh123的浓度以消除类器官个数的影响以及由类器官个体差异带来的实验误差。
实验结果如图6所示，从图中可以看到，随着孵育时间的增加，Rh123的浓度在对照组和实验组类器官中都呈现升高的趋势；由于实验组加入了P-gp抑制剂，P-gp的外排作用被抑制，导致实验组类器官中Rh123积累缓慢；Mitotane为第三代P-gp抑制剂，抑制效果比Verapamil强，加入Mitotane后该组类器官中Rh123的积累比Verapamil组更缓慢。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (14)

1.一种人小肠3D类器官模型，其特征在于，所述人小肠3D类器官模型的形状为三维中空球体；包括干细胞、潘氏细胞以及上皮细胞；所述人小肠3D类器官外侧模拟的是小肠基底侧，腔侧模拟的是小肠绒毛侧，并有P-gp的表达。
2.一种人小肠3D类器官模型的培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将人小肠隐窝混悬于基质胶中，取适量体积加入微孔板，然后加入含有多种生长因子的ADMEM/F12培养基，37℃培养2天，得到如权利要求1所述的人小肠3D类器官模型。
3.一种人小肠3D类器官研究P-gp的模型，其特征在于，包括如权利要求1所述的人小肠3D类器官模型、浓度为5μM的P-gp底物Rh123、浓度均为20μM的P-gp抑制剂Verapamil和Mitotane。
4.一种人小肠3D类器官研究P-gp的模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官形态观察；(3)人小肠3D类器官中P-gp蛋白表达在mRNA水平上的检测；(4)免疫组化法检测并定位人小肠3D类器官中P-gp蛋白的表达；(5)人小肠3D类器官中P-gp介导的药物转运研究；所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型如权利要求3所述。
5.其中，所述步骤(2)中，进行形态观察的具体时间为类器官培养的第0，1，2，3，4，5，6天；培养的第0，1，2，3，4，5，6天，类器官体积逐渐增大；培养至2-3天时类器官出现“出芽”现象，形成新的隐窝；所述方法步骤(3)、(4)中类器官的培养时间为2天；所述方法步骤(5)中P-gp底物为Rh123，底物浓度为5μM，P-gp抑制剂为Verapamil和Mitotane，抑制剂浓度均为20μM，类器官中Rh123的收集方法为PBS孵育法，PBS孵育的时间为4h。
6.一种在人小肠3D类器官研究P-gp的模型中检测P-gp介导的药物转运的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官分别与①P-gp底物Rh123②P-gp底物Rh123与P-gp抑制剂Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小肠3D类器官中Rh123收集与检测；所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型如权利要求3所述。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，人小肠3D类器官培养的时间为2天；所述步骤(2)中，底物Rh123的浓度为5μM，P-gp抑制剂Verapamil和Mitotane的浓度均为20μM；所述步骤(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rh123释放，PBS孵育 时间为4h。
8.将如权利要求3所述的人小肠3D类器官研究P-gp的模型用于P-gp介导的药物转运研究中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：(1)人小肠3D类器官培养；(2)人小肠3D类器官分别与①P-gp底物Rh123②P-gp底物Rh123与P-gp抑制剂Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小肠3D类器官中Rh123收集与检测。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，人小肠3D类器官培养时间为2天；所述步骤(2)中，底物Rh123的浓度为5μM，P-gp抑制剂Verapamil和Mitotane的浓度均为20μM；所述步骤(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rh123释放，PBS孵育时间为4h。
11.将如权利要求3所述的人小肠3D类器官研究P-gp的模型用于P-gp抑制剂的体外高通量筛选的应用。
12.一种促使人小肠3D类器官研究P-gp的模型中Rh123释放的方法，其特征在于，采用PBS孵育的方法促使其中的Rh123释放，其中，微孔板中加入的PBS体积为150μL，孵育时间为4h；所述人小肠3D类器官研究P-gp的模型如权利要求3所述。
13.一种引物序列，其特征在于，上游引物序列为F：5’-GAGGCCAACATACATGCCTTC-3’，下游引物序列为R：5’–GTCTAACAAGGGCACGAGCTA-3’。
14.一种检测P-gp的mRNA水平的方法，包括以下步骤：(1)提取总mRNA；(2)将总mRNA反转为cDNA；(3)ABCB1引物设计与验证，所述ABCB1引物如权利要求13所述；(4)PCR扩增目的基因；(5)琼脂糖凝胶电泳分离目的基因。
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