CN114076700B - 一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，属于生物技术领域，包括：在组织切片的一面粘附透明胶带，组织切片经固定处理后，用另一层透明胶带覆盖组织切片的另一面，形成三层结构，然后用刻有方格矩阵的芯片在胶带上印上印记；将所述三层结构进行显微成像，获取细胞空间构架图；沿数个方向拉伸三层结构，拉伸后进行显微成像，获取拉伸后的细胞空间构架图；撕掉上层覆盖的透明胶带，从附带组织切片的透明胶带上获取单个目标细胞。该方法能够在获取完整单个细胞的同时，保留目标细胞的精准空间信息，适用动物组织目标细胞功能状态与细胞定位关系的研究。

Description

一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从动物组织冰冻切片上捕获完整单个目标细胞并保留其精准空间定位的方法。

背景技术

生物组织是由不同类型的细胞组成的复杂系统，通常在高度结构化的重复解剖单元中相互作用。单细胞分析能准确反映细胞的异质性，深入理解其基因型与表型之间的相互关系；然而，理解器官功能、发育和疾病需要将单细胞功能状态与其空间定位联系起来。

目前获取单个细胞的方法主要有激光显微切割法、微流控分选法、流式分选法、显微吸取法等。微流控分选、流式分选和显微吸取法均能获取完整单个细胞，但会丧失目标细胞的空间定位信息；激光显微切割法虽然可以在切片原位获取细胞，但不能获取完整单个细胞，因而不能排除相邻细胞的污染，导致后续实验结果的误差，此外，激光的高能量也会对细胞内组份造成损伤，且仪器和耗材价格昂贵。因此，开发一种既能获取完整单个细胞，又能保留目标细胞空间信息的廉价简便方法显得尤为重要。

发明内容

为了解决获取完整单细胞困难且无法空间定位的技术问题，本发明提供了一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，该方法能够在获取完整单个细胞的同时，保留目标细胞的精准空间信息，适用动物组织目标细胞功能状态与细胞定位关系的研究。

本发明通过以下技术方案实现：

一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，包括：

在组织切片的一面粘附透明胶带，组织切片经固定处理后，用另一层透明胶带覆盖组织切片的另一面，形成三层结构，然后用刻有方格矩阵的芯片在胶带上印上印记；

将所述三层结构进行显微成像，获取细胞空间构架图；

沿数个方向拉伸三层结构，拉伸后进行显微成像，获取拉伸后的细胞空间构架图；

撕掉上层覆盖的透明胶带，从附带组织切片的透明胶带上获取单个目标细胞，依据拉伸前后的细胞空间构架图，准确获取所述单个目标细胞的空间定位信息。

其中，所述组织切片通过动物组织脱水后冷冻固定，然后冰冻切片制得，所述组织切片厚度为3～20μm。

本发明中，根据不同细胞的直径调节组织切片厚度，以控制组织切片中完整细胞的层数为1层为宜。

进一步的，所述透明胶带采用单面带粘附性可拉伸胶带，具体为：以聚乙烯(PE)薄膜为基础材料，以交联型丙烯酸树脂作为交联剂。

进一步的，所述固定处理为：

向透明胶带上的组织切片添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后用PBS缓冲液洗去组织切片表面固定液。

进一步的，所述固定液的制备方法为：将Lomant试剂(即N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液；固定液中Lomant试剂的浓度为1～5mg/ml，DMSO体积占比30～60％，无水乙醇体积占比10～50％，PBS缓冲液体积占比30～50％，固定液滴加过程在-30～0℃下进行，完全浸润组织切片后置于10～35℃下固定5～10min，所述PBS缓冲液采用PBS，pH＝6～8。

上述固定液与传统固定液区别在于：目前普遍使用的固定剂为4％多聚甲醛溶液(PFA)，PFA固定后无法提取DNA和RNA进行后续分析。

进一步的，用刻有方格矩阵的芯片在胶带上印上印记，以便后续对拉伸前后的单个细胞进行位置匹配。

进一步的，所述三层结构拉伸后面积扩大20～200％，三层结构的拉伸采用手动拉伸或机械装置拉伸。

本发明中，三层结构拉伸后面积扩大率根据细胞大小和拉伸前后切片成像时间进行调整。

进一步的，撕掉上层透明胶带后，将附带组织切片的透明胶带置于显微操作系统上，获取单个目标细胞。

具体的，单个目标细胞的获取方法为：撕掉上层透明胶带后，将附带组织切片的透明胶带绷直后附着于中间镂空的光滑铁片上，向胶带上切片区域滴加适量PBS，pH＝6～8，在显微镜下操作系统上成像，找到目标细胞，用显微操作系统将玻璃毛细管移至目标细胞处，使用油泵将单个目标细胞吸到毛细玻璃管中，再将细胞移至PCR管或者孔板中进行后续实验。

进一步的，所述显微成像采用：倒置显微镜或共聚焦显微镜或宽场显微镜，所述显微操作系统包括倒置显微镜、CCD镜头和显微操作仪。

进一步的，所述动物组织采用新鲜动物组织。

进一步的，所述三层结构的拉伸方向为两个或两个以上。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，采用两层透明胶带将组织切片固定后拉伸，实现组织细胞间的有效分离，不会对细胞内组分造成损伤，有利于获得完整单个细胞，结合拉伸前后的组织切片显微成像及对比，实现获取完整单个细胞的同时，保留目标细胞的精准空间信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是CD11c-Venus荧光蛋白报告转基因小鼠肝脏冰冻切片成像结果；

图2是CD11c-Venus荧光蛋白报告转基因小鼠肝脏冰冻切片拉伸后的成像结果；

图3是CD11c-Venus荧光蛋白报告转基因小鼠肝脏冰冻切片拉伸前后单个荧光蛋白标记细胞空间坐标匹配结果；

图4是CD11c-Venus荧光蛋白报告转基因小鼠肺脏冰冻切片拉伸前后单个荧光蛋白细胞空间坐标匹配结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

为了解决获取完整单细胞困难且无法空间定位的技术问题，本发明提供了一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，具体如下：

(1)在组织切片的一面粘附透明胶带，组织切片经固定处理后，用另一层透明胶带覆盖组织切片的另一面，形成三层结构；

(2)用刻有方格矩阵的芯片在第一片胶带上的光滑面(即黏附切片的背面)印上印记，以便后续对拉伸前后的单个细胞进行位置匹配；

(3)将所述三层结构进行显微成像，获取细胞空间构架图；

(4)沿数个方向拉伸三层结构，拉伸后进行显微成像，获取拉伸后的细胞空间构架图；

(5)撕掉上层覆盖的透明胶带，将附带切片的那层胶带置于显微操作系统上，获取单个目标细胞，依据拉伸前后的细胞空间构架图，准确获取所述单个目标细胞的空间定位信息。

所述组织切片通过动物组织脱水后冷冻固定，然后冰冻切片制得，所述组织切片厚度为3～20μm。

具体的，本发明优选的脱水方式，步骤包括：将洗净的动物器官放入至少10倍于器官体积的4℃预冷3h的质量浓度20％-35％蔗糖溶液中，4℃脱水1-4h至器官沉糖。但本发明的组织脱水方法并不局限于此，所述动物组织采用常规方法脱水即可满足本发明的脱水要求。

本发明优选的组织冷冻固定方式，步骤包括：将脱水后的动物组织用OCT胶包埋，-20或者-80℃冷冻固定，该方法冷冻固定的组织可在冷冻状态下保存数月，在保存期限内的组织均可用于本发明。但本发明的组织冷冻固定方法并不局限于此，采用常规组织冷冻固定方法也可满足本发明的要求。

本发明的实施例中给出了优选的切片方式，步骤包括：(1)将冷冻固定的动物器官固定在冰冻切片机的底座上，按照不同器官的切片条件设置冰冻箱和样品头的温度；(2)将胶带，毛刷提前放到冰冻切片机的冷冻箱中预冷10分钟；(3)设置冰冻切片厚度，3-20μm厚度，进行冰冻切片；(4)用毛刷将切好的切片展平，再用预冷的胶带粘附切片并抚平，使胶带与切片贴合紧密、浮贴。

本发明优选的固定液可兼顾组织切片的形态、荧光蛋白标记、抗体标记荧光信号以及DNA和RNA完整性，固定后的切片或细胞中提取高质量的DNA和RNA，而目前普遍使用的PFA固定液固定的组织后切片难以提取DNA，不能提取高质量的RNA。

本发明原理为：采用两层透明胶带将组织切片固定后进行显微成像，获取细胞空间构架图，再对三层结构进行多向拉伸，组织中的细胞随着透明胶带的拉伸而相互分散开来，便于获取单个细胞，拉伸后进行显微成像，获取拉伸后的细胞空间构架图，对比两个细胞空间构架图，可获得拉伸后每一个细胞在拉伸前组织切片中的对应空间位置信息，进而便于在显微操作系统上，根据研究需要获取目标位置上的单个细胞。

该方法通过机械拉伸使组织中细胞离散，易于获得完整单个细胞，排除相邻细胞的污染，且不会对细胞内组分造成损伤，成本低廉。并且能够在获取完整单个细胞的同时，保留目标细胞的精准空间信息，适用动物组织目标细胞功能状态与细胞定位关系的研究。

下面将结合实施例及附图对本申请一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，用于CD11c-Venus黄色荧光蛋白报告转基因小鼠肝脏切片后获取带有精准空间定位的单个细胞，包括：

(1)CD11c-Venus黄色荧光蛋白报告转基因小鼠新鲜肝脏脱水，冰冻切片，固定。

对CD11c-Venus小鼠进行腹腔注射麻醉药麻醉，用4℃预冷的PBS心脏灌流，去除全身血液；灌流结束后快速取下小鼠肝脏，用预冷的PBS洗去器官表面的血液。将洗净的小鼠肝脏放入至少20ml 4℃预冷的20％-35％蔗糖溶液中，4℃脱水1-4h。设置冰冻切片机的冰冻箱和样品头温度为-20℃，将胶带、毛刷提前放到冰冻切片机的冷冻箱中预冷，OCT胶包埋脱水后的小鼠肝脏，将冷冻固定的动物组织固定在冰冻切片机的底座上，进行冰冻切片。在冷冻箱内将切片粘附到胶带上，滴加固定液，室温中固定切片。

(2)组织样本拉伸，取样。

用PBS洗去固定液，将切片朝上，胶带朝下铺平放置，向切片上小心覆盖另一层胶带，此胶带光滑面与切片接触，形成上下层为胶带，中间夹住冰冻切片的三层结构，用刻有方格矩阵的芯片在第一片胶带上的光滑面(即黏附切片的背面)印上印记，以便后续对拉伸前后的单个细胞进行位置匹配，将胶带贴到载玻片上后压紧，用倒置共聚焦显微镜10倍拼大图成像，获取拉伸前的图像，结果如附图1及附图3最左图所示。从载玻片上撕下三层结构，沿四个方向手动拉伸或者用机械装置拉伸三明治胶带，使胶带面积扩大20％-200％，将拉伸后的三明治胶带粘附在镂空的铁片上，用倒置共聚焦显微镜10倍拼大图成像，获取拉伸后的图像，结果如附图2，附图3右图所示。匹配拉伸前后切片上细胞的空间定位，确定目标细胞。撕下上层胶带后，将粘附拉伸后切片的下层胶带粘附在镂空的铁片上，置于显微操作系统，捕获单个目标细胞，进行后续实验。

本发明中，依据肉眼可分辨每一个细胞拉伸前后的对应关系，对各图中细胞的数字标记采用手工标注或者软件标注。

由图3可知：双层胶带拉伸后细胞分离效果更好，且胶带拉伸距离小，节省成像时间，切片拉伸面积越大，显微成像时间越长，匹配单细胞空间位置也更方便。

实施例2

本实施例提供一种组织切片获取单细胞的方法，用于CD11c-Venus黄色荧光蛋白报告转基因小鼠肺脏切片后获取带有精准空间定位的单个细胞，包括：

(1)CD11c-Venus黄色荧光蛋白报告转基因小鼠新鲜肺脏脱水，冰冻切片，固定。

对CD11c-Venus小鼠进行腹腔注射麻醉药麻醉，用4℃预冷的PBS心脏灌流，去除全身血液；灌流结束后快速取下小鼠肺脏，用预冷的PBS洗去器官表面的血液。将洗净的小鼠肺脏放入至少20ml 4℃预冷的20％-35％蔗糖溶液中，4℃脱水1-4h。设置冰冻切片机的冰冻箱和样品头温度为-20℃，将胶带、毛刷提前放到冰冻切片机的冷冻箱中预冷，OCT胶包埋脱水后的小鼠肺脏，将冷冻固定的动物组织固定在冰冻切片机的底座上，进行冰冻切片。在冷冻箱内将切片粘附到胶带上，滴加固定液，室温中固定切片。

(2)组织样本拉伸，取样。

用PBS洗去固定液，将切片朝上，胶带朝下铺平放置，向切片上小心覆盖另一层胶带，此胶带光滑面与切片接触，形成上下层为胶带，中间夹住冰冻切片的三层结构，用刻有方格矩阵的芯片在第一片胶带上的光滑面(即黏附切片的背面)印上印记，以便后续对拉伸前后的单个细胞进行位置匹配，将胶带贴到载玻片上后压紧，用倒置共聚焦显微镜10倍拼大图成像，获取拉伸前的图像。从载玻片上撕下三层结构，沿四个方向手动拉伸或者用机械装置拉伸三明治胶带，使胶带面积扩大20％-200％，将拉伸后的三明治胶带粘附在镂空的铁片上，用倒置共聚焦显微镜10倍拼大图成像，获取拉伸后的图像，结果如附图4所示。匹配拉伸前后切片上细胞的空间定位，确定目标细胞。撕下上层胶带后，将粘附拉伸后切片的下层胶带粘附在镂空的铁片上，置于显微操作系统，捕获单个目标细胞，进行后续实验。

本发明中，依据肉眼可分辨每一个细胞拉伸前后的对应关系，对各图中细胞的数字标记采用手工标注或者软件标注。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，包括：

在组织切片的一面粘附透明胶带，组织切片经固定处理后，用另一层透明胶带覆盖组织切片的另一面，形成三层结构，然后用刻有方格矩阵的芯片在胶带上印上印记；

将所述三层结构进行显微成像，获取细胞空间构架图；

沿数个方向拉伸三层结构，拉伸后进行显微成像，获取拉伸后的细胞空间构架图；

撕掉上层覆盖的透明胶带，从附带组织切片的透明胶带上获取单个目标细胞，依据拉伸前后的细胞空间构架图，准确获取所述单个目标细胞的空间定位信息；

所述固定处理为：向透明胶带上的组织切片添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后用PBS缓冲液洗去组织切片表面固定液，所述固定液的制备方法为：将Lomant试剂溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液；固定液中Lomant试剂的浓度为1～5 mg/ml，DMSO体积占比60%，无水乙醇体积占比10%，PBS缓冲液体积占比30%，固定液滴加过程在-30～0℃下进行，完全浸润组织切片后置于10～35℃下固定5～10 min，所述PBS缓冲液采用PBS，pH=6～8。

2.根据权利要求1所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述组织切片通过动物组织脱水后冷冻固定，然后冰冻切片制得，所述组织切片厚度为3～20μm。

3.根据权利要求1所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述透明胶带采用单面带粘附性可拉伸胶带。

4.根据权利要求1所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述三层结构拉伸后面积扩大20～200%，三层结构的拉伸采用手动拉伸或机械装置拉伸。

5.根据权利要求1所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，撕掉上层透明胶带后，将附带组织切片的透明胶带置于显微操作系统上，获取单个目标细胞。

6.根据权利要求5所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述显微成像采用：倒置显微镜或共聚焦显微镜或宽场显微镜，所述显微操作系统包括倒置显微镜、CCD镜头和显微操作仪。

7.根据权利要求2所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述动物组织采用新鲜动物组织。

8.根据权利要求1所述的一种组织切片获取带有精准空间定位单细胞的方法，其特征在于，所述三层结构的拉伸方向为两个以上。