CN108387742B - 用于检测转运的生物传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测转运的生物传感器及其应用。具体地，本发明的方法包括步骤：(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：(a1)一生物传感器；(a2)一检测溶液；(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和(e)检测，从而获得所述待测物的转运检测结果；或获得所述待测物对转运体影响的结果。本发明操作简便、检测高效快速。

Description

用于检测转运的生物传感器及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及用于检测转运的生物传感器及其应用。

背景技术

物质的转运与众多生理活动有关。ATP结合盒转运体是目前研究较多的一类超家族转运体，由两个跨膜结构域及两个细胞质ATP结合域组成，其底物非常广泛，参与胆汁盐、核苷、胆固醇、肽、多种药物、氯离子、毒素、有机阴离子、铁、以及固醇等多种内源和外源性底物的转运。

目前已经发现49种人的ABC转运蛋白成员，分为七个亚家族(ABC-A至ABC-G)。一些外排型转运体往往与很多药物的耐药现象密切相关，因此，ABC转运蛋白被认为是克服肿瘤耐药治疗的重要靶标。

例如，肿瘤耐药的最主要原因之一是ATP结合盒转运蛋白超家族的成员以能量依赖的方式从细胞中泵出多种结构上不相关的抗肿瘤药物，如紫杉醇、环霉素、蒽紫杉烷、长春花生物碱等，从而降低细胞内的药物浓度，减弱药物的疗效。除了肿瘤药物之外，在许多其他药物的研究中，也需要对转运功能进行研究。

然而，目前缺乏令人满意的在体外高效准确地对生物转运功能进行检测的方法。

因此，本领域迫切需要开发能够高效而准确地对生物转运功能进行检测的方法，以满足高通量筛选的要求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能够高效而准确地对生物转运功能进行检测的生物传感器及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种在体外对待测物进行转运检测的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：

(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，并且所述的细胞选自下组：小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、或其组合；

(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器；

(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；

(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；

(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和

(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物对转运体影响的结果。

在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(b)中，将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；以及将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，形成第一混合液。

在步骤(e)中，检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。

在另一优选例中，所述的生物传感器是对干细胞进行定向培养而形成的。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的细胞来自哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠)、非人灵长动物。

在另一优选例中，所述的体外方法是对药物的耐药性进行评价的方法。

在另一优选例中，所述的待测物选自下组：小分子化合物、提取物、miRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的待测物为药物。

在另一优选例中，所述的待测物为抗肿瘤药物。

在另一优选例中，所述检测体系位于一个容器或一个孔中。

在另一优选例中，所述的生物传感器的数量为50-100个/孔。

在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔。

在另一优选例中，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.001-200μM，较佳地0.01-100μM，更佳地0.1-50μM，最佳地5-20μM。

在另一优选例中，所述的生物传感器具有选自下组的一个或多个特征：

(i)平均直径为50-200μm，较佳地70-120μm；

(ii)内部富集腔的大小为2×10⁵μM³至1.5×10⁷μM³，较佳地为1×10⁶μM³至5×10⁶μM³。

在另一优选例中，在步骤(c)中，所述时间t为0.1-72小时。

在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分离包括：离心、静置、或其组合。

在另一优选例中，在步骤(e)中，包括：

(e1)对分离的生物传感器进行清洗；

(e2)用PBS进行孵育以进行释放处理，从而释放所述生物传感器的内部富集腔内的所述待测物和/或所述转运底物；

(e3)对释放处理后的混合物取上清；和

(e4)对所述上清中的所述待测物和/或转运底物进行检测。

在另一优选例中，在步骤(e)中，对所述待测物和/或转运底物进行浓度检测。

在另一优选例中，所述的浓度检测包括步骤：

(e1)将经分离的生物传感器进行破碎处理，从而将内部富集腔内的所述待测物和/或转运底物释放出；

(e2)将含所述待测物和/或转运底物的上清转移置另一容器(如96孔板)；和

(e2)测定所述经释放的待测物和/或转运底物的浓度。

在另一优选例中，所述的检测包括荧光检测或LC-MS/MS。

在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为0.01-100μM，较佳地1-50μM，更佳地5-20μM。

在另一优选例中，所述的转运底物为荧光底物或发光底物。

在另一优选例中，所述的转运底物选自下组：CDF、奥美沙坦、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法还包括与阳性对照组进行比较。

在另一优选例中，所述的阳性对照组采用选自下组的抑制剂作为阳性对照物：probenecid、MK-571、杨梅酮、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于在体外对待测物进行转运检测的检测体系，所述检测体系包括：

(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，其中所述的细胞选自下组：小肠绒毛细胞、潘氏细胞、或其组合；

(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器和任选的转运底物。

在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔。

在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为0.01-100μM，较佳地1-50μM，更佳地5-20μM。

在另一优选例中，所述的转运底物为荧光底物或发光底物。

在另一优选例中，所述的转运底物选自下组：CDF、奥美沙坦、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有：待测物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了在本发明一个实施例中经培养分化所形成生物传感器。其中，隐窝经3天的培养分化形成囊状的生物传感器，隐窝中的干细胞开始分化“出芽”形成新的隐窝结构。

图2显示了在小鼠小肠绒毛、隐窝以及体外培养分化的生物传感器中MRP2mRNA的表达；以及MRP2在不同培养天数的的生物传感器中mRNA表达水平。

图3显示了小鼠小肠和生物传感器中MRP2蛋白水平检测结果。箭头标记为MRP2的表达位置，MRP2蛋白表达位于小鼠小肠绒毛外侧和生物传感器囊腔内侧边缘。

图4显示了在本发明一个实例中的生物传感器的标准曲线(基于底物CDF)。

图5显示了本发明的一个实例中的生物传感器的检测结果是定量的，可用于高通量筛选药物和评价测试物质是否为生物转运的底物。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种体外的高效而准确地对生物转运功能进行检测的方法。基于该方法，不仅可以快速地而高通量地检测大量待测物(如药物候选物或已知的药物分子)对生物转运功能的影响，而且可以准确地给出定量结果，从而为药物研发或药物安全性研究提供帮助。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明的检测体系”、“本发明的体外检测系统”、或“本发明的在体外对待测物进行转运检测的检测体系”可互换使用，指本发明第二方面中所述的对转运功能进行检测的检测体系。

如本文所用，术语“本发明的传感器”、“本发明的生物传感器”可互换使用，指用于本发明方法或本发明检测系统的、完全由生物物质构成的用于定量检测待测物对转运功能的影响的检测器。

检测体系

本发明提供了一种在体外对待测物进行转运检测的检测体系，该体系含有本发明的生物传感器以及用于检测的转运底物。

本发明检测体系的一个特点是采用了本发明的生物传感器。

应理解，本发明的生物传感器是采用小肠隐窝或者隐窝干细胞，经特定的方法制备的。以啮齿动物为例，可用小鼠小肠隐窝组织或细胞，将其混悬于基质胶，然后在特定细胞因子(如m-EGF、m-noggin和R-spondin-1)存在下培养，从而形成具有空腔结构的生物传感器。所述的生物传感器中，空腔被多层细胞所包围，因而是封闭的。

典型地，本发明的生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层。其中，所述的腔体层包括多层细胞，所述的细胞选自下组：小肠绒毛细胞、潘氏细胞、或其组合。

由于本发明的生物传感器含有活细胞或由活细胞构成，因此，通常本发明的检测体系为液态体系，并且所述液态体系适合所述活细胞的生存或利于维持所述活细胞的生存。

此外，本发明的检测体系通常置于适合细胞存活的条件，或在适合细胞存活的条件下进行检测。代表性的条件包括：37±2℃，或室温(如20-30℃)；和/或5±1％CO₂条件下。

典型地，本发明的检测体系包括：

(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，其中所述的细胞选自下组：小肠绒毛细胞、潘氏细胞、或其组合；

(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器和任选的转运底物。

在本发明中，待测物的浓度没有特别限制，只要该待测物能够溶解或不会破坏本发明的生物传感器。典型地，所述待测物的浓度为0.001-200μM，较佳地0.01-100μM，更佳地0.1-50μM，最佳地5-20μM。

在本发明中，在所述检测体系中的生物传感器的数量没有特别限制。由于本发明生物传感器的体积小，因此可以在较小体积的检测体系中容纳更多的生物传感器。例如，所述的生物传感器的数量可以为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔，从而提供更准确的检测结果。

在本发明中，对于转运底物的种类和浓度没有特别限制。优选地，转运底物为荧光底物或发光底物。代表性的转运底物的例子包括(但并不限于)：CDF、奥美沙坦、或其组合。在本发明中，典型地，转运底物的浓度只要允许有一定量的转运底物被转运入本发明生物传感器的内部富集腔即可。通常，转运底物的浓度可以为0.01-100μM，较佳地1-50μM，更佳地5-20μM。

检测方法

基于本发明的检测体系，本发明还提供了一种在体外对待测物进行转运检测的方法，该方法可高效、准确、快速地评价候选物质(或待测物)对于某种生物转运功能的影响程度。

典型地，本发明的检测方法包括步骤：

(a)提供本发明的检测体系；

(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；

(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；

(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；

(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。

在另一优选例中，如果所述待测物本身就是一种转运底物，那么直接检测内部富集腔内的所述待测物(即转运底物)的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，如果待测物本身不是转运底物(例如，影响转运的物质，如转运促进剂或转运抑制剂)，那么可以检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量。典型地，在本发明方法中，在步骤(b)中，将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；以及在步骤(e)中，检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。

在本发明的一个实例中，提供了对MRP2生物转运功能进行检测的方法。

多药耐药相关蛋白MRP2又名ATP结合盒转运蛋白C2(ATP-binding cassettetransprters C2，ABCC2)、小管多种有机阴离子转运蛋白(cana licular multispecificorganicanion transporter，cMOAT)。MRP2属于ABC转运蛋白中C亚家族中的一员。其广泛分布于小肠、肾脏、肝脏、胰腺等多个正常组织的小管上皮细胞的顶端膜侧，参与体内物质的外排作用。

在本发明的一个实例中，提供了一个基于MRP2的检测体系，其中所述检测体系不仅含有本发明的生物传感器，而且还含有一种特定的荧光物质作为转运底物，即5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein(CDF)。在本发明中，以CDF为代表的转运底物会被转运从而从生物传感器的外部转移到生物传感器的内部(即内部富集腔)，从而随后被定量检测。

在本发明中，可以在对待测物进行检测时同时设置空白对照组、阴性对照组、和/或阳性对照组。所述的对照组可以是促进转运的物质，也可以是抑制转运的物质。

对于MRP2而言，本发明人发现，一种特别适合的对照物质是probenecid、MK-571或类似物质。本发明的实验表明，这些对照物质在检测体系中的含量与被本发明生物传感器所富集并检测到的转运底物(如CDF)的数量或浓度存在非常高的相关性。

在本发明中，基于标准曲线、标准值或基于与对照组的比较，可以半定量或定量地针对待测物给出该待测物对生物转运功能的影响力，从而为药物研究等提供有力的参考。

本发明的主要优点包括：

(a)相比于过表达MRP2的MDCKII细胞系模型，生物传感器无需转染及稳转细胞株的筛选，因此模型的建立更加简便。

(b)相比于Caco-2单层细胞转运模型相比，生物传感器是直接由小肠隐窝中的干细胞分化而成，在生理功能及结构上更相似于小肠上皮细胞，能更好地模拟药物在体内的跨膜外排作用。

(c)与Caco-2单层细胞模型培养需要21天相比，体外诱导分化形成生物传感器用于MRP2转运研究仅需3天，周期短，时间成本低。

(d)利用PBS孵育促使CDF从生物传感器中释放，并且利用荧光酶标仪对CDF的浓度进行检测，检测限较低，且简单、快速、高效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.

制备生物传感器

在本实施例中，基于小鼠隐窝制备生物传感器，方法如下：

(1)8-10周龄C57BL/6小鼠CO₂窒息处死后，解剖出小肠放入预冷的PBS中。

(2)利用解剖的镊子小心去除小肠外壁上脂肪组织，然后使用眼科剪纵向打开小肠腔，并用预冷的PBS清洗5次后转移至无菌的50mL离心管中，置于冰上。

(3)在无菌的超净台中，用含有青霉素/链霉素(P/S)的预冷的PBS再次清洗小肠5次。

(4)将其转移至50mL含有2mM EDTA的PBS中，放于4℃冰箱中消化25分钟。

(5)消化好的小肠转移到含有25mL预冷PBS的50mL离心管中，来回摇晃50下左右，收集悬液。

(6)重复上一步骤，将两次所得悬液经过70μm的细胞筛网过滤到新的50mL的离心管中，然后加入2mL的10％的BSA，4℃，200g离心5分钟。

(7)离心后，小心弃去上清，并用1mL ADMEM/F12培养基重悬沉淀，用移液器取出5μL重悬液置于显微镜下计数。

(8)根据所需隐窝的数量，取出一定体积的重悬液于1.5mL的离心管中，然后加入终浓度为1％的BSA。4℃，200g离心5分钟。

(9)离心后，小心弃去上清，加入所需体积的基质胶重悬沉淀并使用枪头小心充分混匀，然后5μL/孔接入37℃预热的96孔板中。

(10)放置于37℃培养箱中培养10分钟，使基质胶充分凝固。

(11)每孔中加入含有500ng/mL R-spondin-1、100ng/mL m-noggin和50ng/mL m-EGF的ADMEM/F12完全培养基100μL，在5％CO₂，37℃条件下培养。每3天更换一次完全培养基。

对于形成的生物传感器，进行分离并进行观察和检测。

实施例2.

生物传感器形态学的观察

在本实施例中，对实施例1制备的生物传感器进行形态学的观察，其中利用Olympus DP 71倒置显微镜观察并拍摄培养3天的生物传感器形态。

结果如图1所示，分离的隐窝随着培养3天后分化形成生物传感器，并且隐窝中的干细胞开始分化“出芽”形成新的隐窝。

实施例3

生物传感器具有MRP2转运功能

在本实施例中，通过mRNA表达水平检测，间接证明实施例1制备的生物传感器具有MRP2转运功能。方法如下：

对于实施例1制备的生物传感器，在体外诱导分化不同天数，弃去培养基，预冷的PBS清洗1次后用移液枪头破碎基质胶，并用预冷的PBS将其转移到1.5mL的离心管中，于4℃，200g离心5分钟，弃去上清，收集生物传感器。对于收集的生物传感器，经过Trizol提取出总RNA，通过逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，进行实时定量PCP分析MRP2在体外分化形成的生物传感器中的表达水平。

结果：如图2所示，体外分化的生物传感器的MRP2mRNA表达水平与其在小肠隐窝和绒毛中的表达相一致，并且生物传感器的MRP2mRNA表达水平在培养过程中稳定表达。因此说明生物传感器具备研究MRP2转运的生物结构。

实施例4

生物传感器脱水及石蜡包埋

在本实施例中，对实施例1制备的生物传感器进行脱水及石蜡包埋，以便进行观察和研究。

(1)生物传感器的固定：对于分化培养3天所形成的生物传感器，弃去培养基，先用预冷的PBS洗2遍，然后再用移液枪头划碎基质胶，加入PBS将其转移至1.5mL的离心管中，4℃，200g离心5分钟，小心弃上清，将生物传感器重悬于4％的中性多聚甲醛中，固定过夜。

(2)冲洗：为了去除固定液，生物传感器用PBS洗3次，每次15分钟。

(3)脱水：固定后的生物传感器依次浸入50％、75％、85％、95％、100％Ⅰ、100％Ⅱ乙醇中各1小时。

(4)透明：脱水后的生物传感器依次浸入二甲苯/乙醇(1:1,v/v)20分钟，二甲苯I及二甲苯II各15分钟。

(5)浸蜡：将生物传感器依次浸入蜡I 1小时，蜡II 1小时，蜡Ⅲ2小时。

(6)包埋：浸蜡完成后的生物传感器通过石蜡组织包埋机进行包埋。

(7)切片：将蜡块固定在组织切片机上，石蜡切片的厚度为5μm。

实施例5

生物传感器的免疫组织化学染色

在本实施例中，通过免疫组织化学染色检测，证明实施例1制备的生物传感器具有MRP2转运功能。方法如下：

(1)脱蜡：将生物传感器的石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10min，再放入二甲苯：无水乙醇(1:1,v/v)中5min，进行脱蜡。

(2)复水：脱蜡后的切片依次置入100％乙醇Ⅰ10分钟和100％乙醇Ⅱ各10分钟；95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇及50％乙醇中各5分钟。

(3)水洗：复水后的切片放入蒸馏水中漂洗5分钟。

(4)抗原表位修复：抗原表位修复液为pH 6.0枸椽酸盐缓冲液，置于微波炉中加热至沸腾，迅速将切片浸于沸腾的缓冲液后，放入70℃烘箱保温10分钟，自然冷却至室温。

(5)PBS洗3次，每次5分钟。

(6)灭活内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水中10分钟灭活内源性过氧化物酶。

(7)PBS洗3次，每次5分钟。

(8)封闭：切片组织上滴加含有2％的山羊血清的PBS，37℃条件下封闭1小时。

(9)一抗孵育：切片甩干后，在组织上滴加用封闭液稀释的MRP2抗体(1:500)，4℃孵育过夜。

(10)PBS洗3次，每次5分钟。

(11)二抗孵育：在切片组织上滴加封闭液稀释的HRP-羊抗兔(1:1000)，室温孵育2小时。

(12)PBS洗3次，每次5分钟。

(13)DAB显色：将混匀的DAB显色液滴加到切片的组织上，显色10分钟，自来水冲洗掉DAB显色液。

(14)苏木精染色：切片置于苏木精染液5分钟，自来水冲洗2-3次之后再用75％酒精(含1％盐酸)分色20秒，并置于氨水中反蓝20秒。

(15)蒸馏水洗3次，每次5分钟。

(16)凉干：将切片置于室温下自然凉干。

(17)透明：用二甲苯透明10分钟。

(18)封片：使用中性树胶封片，然后放入70℃烘箱内过夜烘干切片。

(19)镜检：切片置于配备有LEICA DFC310 FX拍照系统的LEICA DM4000 B LED显微镜下观察，并进行拍摄照片。

结果如图3所示，MRP2蛋白主要表达于生物传感器腔内侧边缘。因此，本发明的生物传感器可作为MRP2转运功能的生物传感器，其中本发明生物传感器的内部的富集腔可用于富集被MRP2转运的转运底物。

实施例6

基于生物传感器研究MRP2介导的药物转运功能

在本实施例中，采用实施例1制备的生物传感器对待测物进行转运检测。方法如下：

(1)用PBS梯度稀释CDF标准液，浓度分别为125nM、62.5nM、31.25nM，15.62nM、7.81nM、3.91nM、1.95nM和0.98nM，96孔板每孔各加入100μL，每个浓度的标准液重复3个平行。利用荧光酶标仪FLUOStar OPTIMA，在λ_ex/λ_em＝480nm/520nm条件下进行荧光强度检测。

以CDF的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，并利进行线性回归。

获得的标准曲线如图4所示，相关系数R²>0.99，表明标准曲线回归线性很好。

(2)按照实施例1中所描述的方法，分离小肠隐窝置于96孔板中，经分化培养，形成生物传感器。

(3)生物传感器培养至3天，置于显微镜下观察并计数。

(4)在避光的条件下，对照组加入只含有终浓度为10μmol/L CDF的100μL培养基，抑制剂组加入含50μmol/L MK-571或1mmol/L Probenecid与10μmol/L CDF的100μL培养基。

(5)96孔板置于37℃培养箱分别孵育20、40、60、80、100分钟，吸去培养基，用预冷的PBS洗5遍，每次3分钟。

(6)每孔加入150μL PBS，37℃培养箱孵育4小时。

(7)培养4小时后，生物传感器破裂，囊腔中的CDF释放到PBS中，取100μL上清加入96孔板中，在λ_ex/λ_em＝480nm/520nm条件下检测荧光强度。

(8)利用CDF标准曲线回归的方程计算各个样品中的CDF的浓度，以生物传感器的个数进行校准，用于消除每孔生物传感器数量的不同引起的浓度差异。实验结果如图5所示，MRP2的抑制剂MK-571和Probenecid能够明显抑制MRP2对CDF的外排作用，最终导致生物传感器中的CDF积累降低。

结果如图5所示，

当MRP2的抑制剂MK-571和Probenecid存在时，由于转运能力下降，因此转移进入生物传感器内部的转运底物CDF的数量下降，由此，导致被该生物传感器所检测到的CDF的数量下降。

令人意外的是，该生物传感器的检测结果不仅是定性的，而且是定量的。此外，由于将检测耗时短，并采用微型生物传感器，因此特别适合用于高通量药物筛选和针对微量样品的检测，尤其是筛选与转运有关的药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种在体外对待测物进行转运检测的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：

一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，并且所述的细胞选自下组：小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、或其组合，并且，所述生物传感器由以下方法制备：用小肠隐窝组织或细胞，将其混悬于基质胶，然后在特定细胞因子存在下培养，从而形成所述的生物传感器，其中所述特定细胞因子包括m-EGF、m-noggin和R-spondin-1；

(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；

(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；

(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和

(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物对转运体影响的结果；

并且所述方法是对MRP2生物转运功能进行检测的方法。

2.如权利要求1所述的方法，在步骤(e)中，检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。

3.如权利要求1所述的方法，所述的生物传感器是对干细胞进行定向培养而形成的。

4.如权利要求1所述的方法，所述的待测物选自下组：小分子化合物、提取物、miRNA、或其组合。

5.如权利要求1所述的方法，所述检测体系位于一个容器或一个孔中。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物传感器的数量为50-100个/孔。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为20-200个/孔。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为50-100个/孔。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.001-200μM。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.01-100μM。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.1-50μM。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物传感器具有选自下组的一个或多个特征：

(i)平均直径为50-200μm；

(ii)内部富集腔的大小为2×10⁵μM³至1.5×10⁷μM³。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，平均直径为70-120μm。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，内部富集腔的大小为1×10⁶μM³至5×10⁶μM³。

16.如权利要求1所述的方法，在步骤(e)中，对所述待测物或转运底物进行浓度检测。

17.如权利要求1所述的方法，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为0.01-100μM。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为1-50μM。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为5-20μM。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转运底物为荧光底物或发光底物。

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