CN114085803B - 建立具有再生特性的类器官培养体系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于获得和/或培养增生性哺乳动物类器官的组合物，其中所述组合物包括组蛋白去乙酰化抑制剂(例如VPA)和EZH2抑制剂(例如EPZ6438)。更进一步地，所述组合物还包括BMP信号抑制剂(例如LDN193189)，WNT激动剂(例如GSK‑3Inhibitor XV、R‑Spondin1)，双重p38MAPK/Tie‑2抑制剂(例如Pexmetinib)，EGF激动剂(例如EGF)，FGF激动剂(例如bFGF)。利用本发明中的新型类器官培养体系，能够建立一个与体内增生性肠上皮细胞共享再生特征的新型哺乳动物类器官系统。本发明还提供了组蛋白去乙酰化抑制剂(例如VPA)和EZH2抑制剂(例如EPZ6438)在用于活化损伤性干细胞中的用途。

Description

建立具有再生特性的类器官培养体系
技术领域
本发明涉及哺乳动物类器官，特别涉及增生性哺乳动物类器官、其用途以及获得它们的方法。
背景技术
类器官技术的发展允许干细胞在体外进行自组织，模拟了体内组织的复杂结构和功能。目前已经在多种组织器官上开发了类器官培养技术，这为研究分化发育和疾病治疗提供了宝贵的工具。然而，传统类器官培养技术主要反映干细胞及分化细胞在常态下的特征，在反映损伤后的体内再生过程方面有很大的局限性。越来越多的证据表明，损伤诱导的再生组织与正常的稳态组织有很大的不同，前者涉及到终末细胞的去分化和独特的损伤诱导的干细胞的出现。为了模拟这些复杂的过程，需要开发新的能够反映损伤相关再生特征的体外类器官培养系统。在此，我们建立了一种新的培养条件，能够在体外诱导和维持损伤相关的再生特征。
发明内容
三维类器官具有模拟生理状态下组织结构和功能的能力，为体外建模和疾病提供了宝贵的工具。然而，传统的类器官培养主要重建了组织干细胞及其衍生物的稳态，很少反映体内损伤相关再生的复杂过程。在此，我们建立了一种新的哺乳动物类器官培养系统，称为增生性哺乳动物类器官，具有损伤相关上皮再生的关键特征。增生性类器官保留了传统类器官的基本特征，同时表现出较复杂的隐窝绒毛结构。更重要的是，与传统类器官相比，它们显示出了显著的损伤相关再生特征的富集，如胚胎期标记基因的启动，这引发了一系列显著的损伤修复反应，能够模拟再生上皮细胞的增生性隐窝。此外，单细胞分析显示，在增生性哺乳动物类器官中存在一种独特的干细胞群，这种干细胞与体内损伤诱导的具有再生能力的干细胞具有相同的分子特征。机制分析显示，损伤相关再生表型的激活主要依赖于培养系统中表观遗传小分子VPA和EPZ6438的结合。此外，这两种化合物联合治疗能有效促进体内损伤后组织的再生。综上，我们的研究建立了一个新的重建损伤相关再生过程的体外模型，为探索再生机制开辟了新的途径。
具体地，本发明提供了用于培养获得增生性哺乳动物类器官的组合物和方法。具体地，本发明提供了以下技术方案：
1.组蛋白去乙酰化抑制剂(例如VPA)和EZH2抑制剂(例如EPZ6438)在用于活化损伤性干细胞中的用途。
2.根据项目1所述的用途，其中所述损伤性干细胞为哺乳动物(例如小鼠或人)损伤性干细胞。
3.根据项目1所述的用途，其中，所述损伤性干细胞以显著高水平表达标志物Tert,Bmi1,Hopx,Cxadr,CD44,Lgr5,Clu、Anxa1、Basp1中的一种或多种。
4.根据项目1所述的用途，其中所述组蛋白去乙酰化抑制剂选自由以下各项组成的组中的一种或多种：VPA，MS-275,SAHA，LBH589,TSA,MGCD0103,MC1568,LAQ824,PCI-34051,RGFP966,AR-42,CI994,丁酸钠,M344,Tubacin,Scriptaid,Tubastatin A,LMK235；优选为VPA；
任选地，所述EZH2抑制剂选自由以下各项组成的组中的一种或多种：EPZ6438，EPZ011989,EBI-2511,EPZ5676,EPZ005687,GSK343,UNC 1999,GSK126,GSK503,EI1,PF-06726304；优选为EPZ6438。
5.用于获得和/或培养增生性哺乳动物类器官的组合物，其特征在于，包括(1)组蛋白去乙酰化抑制剂(例如VPA)，和(2)EZH2抑制剂(例如EPZ6438)。
6.根据项目5所述的组合物，其特征在于，还包括以下组分：
(3)BMP信号抑制剂(例如LDN193189)，
(4)WNT激动剂(例如GSK-3抑制剂XV、R-Spondin1)，
(5)双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂(例如Pexmetinib)，
(6)EGF激动剂(例如EGF)，和/或
(7)FGF激动剂(例如bFGF)。
7.根据项目5所述的组合物，其中，所述(1)组蛋白去乙酰化抑制剂选自由以下各项组成的组中的一种或多种：VPA，MS-275,SAHA，LBH589,TSA,MGCD0103,MC1568,LAQ824,PCI-34051,RGFP966,AR-42,CI994,丁酸钠,M344,Tubacin,Scriptaid,Tubastatin A,LMK235；优选为VPA；
优选地，所述(1)组蛋白去乙酰化抑制剂的浓度为100μM-2500μM。
8.根据项目5所述的组合物，其中，所述(2)EZH2抑制剂选自由以下各项组成的组中的一种或多种：EPZ6438，EPZ011989,EBI-2511,EPZ5676,EPZ005687,GSK343,UNC 1999,GSK126,GSK503,EI1,PF-06726304；优选为EPZ6438；
优选地，所述(2)EZH2抑制剂的浓度为0.4μM-10μM。
9.根据项目6所述的组合物，其中，所述(3)BMP信号抑制剂选自由以下组成的组中的一种或多种：LDN193189,Noggin，DMH1,Dorsomorphin,K02288；
优选地，所述(3)BMP信号抑制剂的浓度为0.04μM-1μM。
10.根据项目6所述的组合物，其中，所述(4)WNT激动剂选自由以下组成的组中的一种或多种：Wnt、R-Spondin 1-4(例如R-Spondin 1)和GSK抑制剂(例如GSK-3抑制剂XV，CHIR，Bio,SB216763,IM12,QS11,ML320,HLY78)；
优选地，所述(4)WNT激动剂为GSK-3抑制剂XV和R-Spondin1的组合。
11.根据项目6所述的组合物，其中，所述(5)双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂选自由以下组成的组中的一种或多种：Pexmetinib，SB203580，BIRB796,SB202190,LY2228820,VX-702,PH-797804,VX-745,TAK-715,BMS-582949；
优选地，所述(5)双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂的浓度为0.2μM-5μM。
12.根据项目6所述的组合物，其中，所述(6)EGF激动剂选自由以下组成的组中的一种或多种：EGF,HB-EGF,amphiregulin,betacellulin,epigen,上皮调节蛋白,神经调节蛋白1,神经调节蛋白2,神经调节蛋白3,神经调节蛋白4；
优选地，所述(6)EGF激动剂的浓度为10ng/ml-250ng/ml。
13.根据项目6所述的组合物，其中，所述(7)FGF激动剂选自由以下组成的组中的一种或多种：bFGF,FGF4,FGF7,FGF9,FGF10；
优选地，所述(7)FGF激动剂的浓度为4ng/ml-100ng/ml。
14.根据项目5所述的组合物，其特征在于，使用DMEM/F12作为基础培养基；
优选地，所述基础培养基中还添加有HEPES、GlutaMAX、penicillin/streptomycin、N2、B27、1mM N-Acetylcysteine。
15.获得和/或培养增生性哺乳动物类器官的方法，其特征在于，在培养基中进行培养，优选地在培养基中将ENR类器官或哺乳动物隐窝组织进行培养，其中所述培养基包含项目5-14任一项所述的组合物。
16.项目15所述的方法获得的增生性哺乳动物类器官。
17.增生性哺乳动物类器官，其通过以显著高水平表达的标志物Clu、Sca1、Anxa1、Reg3b中的一种或多种来表征。
18.项目16所述的增生性哺乳动物类器官的用途，例如用于体外模拟损伤再生研究，用于(高通量)筛选诱导或促进损伤再生的治疗化合物，或用作重建损伤相关再生过程的体外模型。
本发明的技术效果
利用本发明中的新型类器官培养体系，能够建立一个与体内增生性上皮细胞共享再生特征的新型哺乳动物类器官系统。在我们的类器官培养系统中，类器官具有与体内损伤诱导的增生性组织(例如隐窝)相类似的形态特征(例如出芽结构伸长、尺寸更大、隐窝绒毛结构更复杂)，并表达损伤相关的标志物，例如Clu，以及Sca1、Anxa1、Reg3b等，同时复活性干细胞(revival stem-like cells)也存在其中。值得注意的是，VPA和EPZ6438是建立新型类器官培养体系的关键，这两个表观小分子化合物对体内损伤再生的促进突出了再生过程中表观遗传调控的重要作用。
实验材料和操作方法
1.小鼠
所有动物实验均按照NIH规范进行。所有的小鼠实验都获得了北京大学动物保护与利用委员会的批准。Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠由陈婷博士(北京生命科学研究所)提供，6～12周龄小鼠用于隐窝分离与培养实验。C57BL/6小鼠购自维通利华(北京)。
2.隐窝分离与类器官培养
隐窝的分离和培养按已报道规范进行。简而言之，取近胃端约20厘米的小肠，纵向切开，切成2至4毫米的小段，用预冷的PBS冲洗干净后，使用2mM EDTA在4℃消化30分钟，期间保持轻柔震荡。加入预冷的PBS并剧烈震动以释放出隐窝，将混合物通过70μM细胞过滤器(BD Biosciences)以进一步浓缩隐窝。将大约500个隐窝与20μL基质胶(BD Biosciences)混合，并接种在一个48孔板的孔中央区域。待基质胶聚合后，加入500μL培养基，培养基由Advanced DMEM/F12(Gibco)，10mM HEPES(Gibco)，1x GlutaMAX(Gibco)，1％penicillin/streptomycin(Gibco)，1x N2(Gibco),1x B27(Gibco),1mM N-Acetylcysteine(Sigma-Aldrich)组成。其中，培养ENR类器官的条件为，向培养基中添加50ng/mL鼠源EGF、100ng/mL鼠源Noggin和500ng/mL人源R-spondin 1。其中，培养Hyper类器官的条件为，向培养基中添加0.2μM LDN193189，0.1μM GSK-3inhibitor XV，1μM Pexmetinib，500μM VPA，2μMEPZ6438，50ng/mL鼠源EGF，10％R-Spondin1条件培养液(Trevigen)和20ng/mL bFGF(有关详细信息，请参阅表1)。每隔一天更换一次细胞培养基。Hyper类器官可由ENR类器官或原代隐窝诱导获得。传代操作时，将基质胶连同类器官物一同刮下，机械吹打分离成单隐窝结构，重新接种并添加至新鲜基质中。类器官每7天进行一次传代操作，其中，ENR类器官按1:8进行传代，Hyper类器官按1:30进行传代。Hyper类器官在传代后推荐添加5％knockoutserum replacement(KSR,GIBCO)，以增强Hyper类器官扩增能力。传代后第6天，统计含有典型类器官结构和表达Lgr5-GFP的类器官数目。
表1试剂或来源
3.荧光定量PCR分析
使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN,74106)从培养类器官的整个孔中提取总RNA。使用Trans-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金)将RNA反转录为cDNA。qPCR使用KAPA SYBR_FAST qPCR Kit Master Mix试剂(KAPA Biosystems)和CFXConnectTM Real-Time System(Bio-Rad)仪器。数据采用delta-delta Ct法进行分析。β-actin被用作归一化基因表达的内参。本研究中使用的qPCR引物序列见表2。
表2qRT-PCR引物
4.免疫荧光染色
培养的类器官使用4％多聚甲醛(鼎国)在室温固定15分钟，并用含0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich)的PBS进行通透。类器官与一抗(具体信息见表3)在4℃孵育过夜，然后与二抗(具体信息见表3)在37℃孵育1小时。细胞核用DAPI(Roche Life Science)染色。
表3
5.流式细胞分析
除去细胞培养基，加入TrypLE Express(Gibico)。在37℃孵育10分钟后，类器官被消化成分离的单细胞，用Sca1-PECy5在4℃染色30分钟，PBS洗涤3次。细胞再次使用7-AAD(7-aminoactinomycin D)进行染色并使用40μm细胞过滤器过滤。最后，使用BDLSRFortessa仪器进行流式分析实验。使用FlowJo软件(Ashland)进行数据分析。
6.定义损伤相关的再生特征
使用已发表的不同肠损伤模型的数据集进行筛选，并对损伤和非损伤隐窝组织样品的差异表达基因进行分析。在寄生虫感染模型(GSE97405)中，寻找到1101个上调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1)和564个下调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1.4)。在DSS模型(E-MTAB-5249)中，寻找到681个上调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1)和1444个下调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1)。在照射模型(GSE117783)中，寻找到1673个上调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1)和1002个下调基因(FDR≤0.05，差异倍数>1)。将3种损伤模型中上调基因和下调基因分别取交集，并合并为损伤相关的再生特征，共包含63个上调基因和54个下调基因(参见表4)。
表4损伤相关再生特征的基因列表上调基因
下调基因
7.整体RNA测序
使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN,74106)从培养类器官的整个孔中提取总RNA。RNA测序文库构建使用Ultra RNA Library Prep Kit for/>(NEBEngland BioLabs)。使用Illumina HiSeq x Ten系统和随机引物对2x 150bp的配对端文库进行测序。使用GSEA软件包分析转录组中已发表的和新定义的特征基因的富集程度。
8.单细胞RNA测序
单细胞RNA测序的样品详情见表5。为将类器官分离为单个细胞，使用TrypLEExpress(Gibico)在37℃消化20分钟，并用血球计数板计数活细胞。按照制造商的建议，每个样本平均有大约3000个单细胞进行10x Genomics单细胞分离和RNA测序。使用IlluminaNovaseq6000测序仪进行深度测序。
表5scRNA-Seq样品质量数据
9.整体RNA测序的分析
原始序列使用Trimmomatic(版本0.39)进行清理，原始基因计数使用Salmon(版本1.0,Ref)进行估计。小鼠基因参考从GENCODE(版本M25)下载。使用DEseq2将原始计数归一化和进一步的方差稳定，并使用热图可视化呈现。
10.单细胞RNA测序的分析
使用Cellranger(v.3.0.0)软件(10x Genomics)处理8个单细胞RNA测序样品的序列。使用Seurat程序包导入和合并生成的过滤细胞UMI计数矩阵(版本3.1.4)。那些表达少于1500个基因或从线粒体基因中读取超过25％的细胞被丢弃。Scater程序包(版本3.11)进一步用于质量控制和基于反卷的归一化。归一化的数据被导入到Seurat对象数据槽中。随后，显著变化基因(n＝2000)被确定；归一化数据通过线粒体比率和总基因计数进行缩放和回归；使用Seurat序包中的默认参数进行主成分分析。根据前10个PC建立共享近邻网络(Shared Nearest Neighbor network，SNN)，并且采用基于模块化优化的聚类算法(Louvain)对单元进行聚类，分辨率设为1.0，能有效识别了大部分单元类型。对于更精细的SSC2c样细胞群的识别，是用了更精细的分辨率(3.0)和更多的PC数(n＝15)，并将识别出的SSC2c样细胞群集成到其他细胞类型中。UMAP降维是基于前15个PC计算的。对于点图，计算每个群的每个基因的平均归一化表达水平以及表达水平为>0的细胞百分比。每个基因的表达水平和百分比进一步按每个基因在所有群/组内的相应最大值进行归一化。利用findmarker在Seurat中的功能鉴定单细胞群间的差异表达基因。p值的阈值设为0.05，并且需要至少2倍的表达差异变化。使用SSC2c和胚胎期特征基因相应基因集的平均归一化表达水平，用于相关分析。SSC2c特征基因包含Clu、Anxa1、Cxadr、Basp1四个基因。胚胎期特征基因来自于已发表文章。
11.寄生虫感染模型、DSS肠炎模型及Hyper类器官模型整体RNA测序数据整合
对感染模型和Hyper类器官模型的原始计数进行了log转换。然后，这些数据集被合并，并只挑选损伤相关的再生特征基因用于下游分析。在sva包中使用Combat函数对数据集的批处理效果进行了修正。主成分分析和相关性分析均是在已处理的合并数据集上执行的。
12.辐照模型及Hyper类器官模型单细胞RNA测序数据整合
辐照样品和正常对照样品的10X数据集从GEO(GSE123516)下载，合并后使用相同的方法对细胞类型进行聚类和注释。具体来说，来自辐照模型的CBC细胞被分为SSC1、SSC2a/b/c亚型。由于我们对干细胞更感兴趣，从辐照模型中获得的干细胞群的原始计数以及ENR和Hyper类器官的数据集被合并。对合并后的数据集进行进一步的归一化、缩放、回归和主成分分析，如前所述。使用Harmony(1.0版)校正了辐照模型和类器官数据集之间的批处理效应。下游基于图的聚类和UMAP分析基于前15个调整后的Harmony坐标计算。
为了比较添加VPA和EPZ6438与否的Hyper类器官中的干细胞群，我们加入不添加VPA和EPZ6438的Hyper类器官样品的原始计数，并进行了所有的下游分析。为了可视化，仅绘制了来自辐照模型以及S61、S62、S63样品的细胞(S61、S62、S63的样本具体信息见表5)。
13.统计分析
所有值均用均数±SEM表示。统计参数，包括统计分析方法，统计显著性阈值，n值在图的图例和补充图的图例中都有说明。QPCR、流式细胞分析(FACS)和细胞或类器官数统计使用非配对双尾t检验进行评估；Ki67+隐窝数、隐窝长度、疾病活动度指数及组织学评分使用秩和检验进行评估；小鼠体重和结肠长度采用单因素方差分析进行评估。采用Prism软件(GraphPad)进行统计分析。
14.数据可用性
当前研究中产生的数据均可以从GEO数据库中获取。本研究中使用的所有其他数据均在本文中作为源数据提供。
附图说明
图1建立具有损伤相关再生特征的哺乳动物类器官
a，qPCR分析在上述条件下(n＝2孔)培养的类器官中Clu和胚胎期基因的表达。采用双侧不配对t检验确定P值。
b，在上述条件下培养的典型肠类器官形态。
c，在上述条件下培养的CLU和胚胎期基因的免疫荧光染色。
d，在上述条件下培养的SCA1+细胞的流式细胞仪分析(n＝3孔)。采用双侧不配对t检验确定P值。
e，在指定条件下培养的各类器官CLU+细胞的定量(n＝15个器官)。采用双侧不配对t检验确定P值。
f，热图显示不同类器官和不同损伤模型的原代隐窝中损伤诱导再生信号的表达谱(n＝3只小鼠)。代表性基因显示在左边。Gran和Non-gran分别表示位于肉芽肿上方和邻近的隐窝。DSS和Non-DSS分别表示在右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)诱导的结肠炎上皮细胞的隐窝和未接受DSS处理的正常隐窝。
***P<0.001；**P<0.01。标尺100μm。所有的实验都至少被独立地重复了三次，得到了类似的结果。
图2增生性肠类器官与体内损伤后的原代隐窝有相似的细胞谱系组成
a，来自Hyper和ENR类器官的scRNA-seq数据的UMAP可视化结果。(左)展示无监督的集群。(右)展示ENR类器官及Hyper类器官。
b,热图显示已知的不同细胞类型特异性标记基因的表达谱。
c,堆叠柱状图显示所包括的细胞类型的百分比，其中Hyper类器官分别诱导自ENR类器官(上)或原代隐窝(下)。从ENR类器官来源的Hyper类器官与从原代隐窝来源的Hyper类器官具有相似的谱系组成。
d，综合分析体外不同类器官和体内辐照模型干细胞群。UMAP显示了来自类器官第1、2、3、12、17细胞群的scRNA-seq数据(中)，以及来自辐照模型的SSC1、SSC2a、SSC2b、SSC2c细胞群(左)。聚类显示细胞群17表达SSC2c的代表性标记基因(右)。来自不同样本的细胞也用不同的颜色表示。
图3VPA和EPZ6438对于哺乳动物类器官建立增生性表型至关重要
a,不同成分对Hyper类器官损伤诱导再生特征表达的影响(n＝3只小鼠)。代表性基因显示在左边。
b,不同类器官间scRNA-seq数据的UMAP可视化结果。图2b中注释的干细胞群和细胞群17被圈出来了。
c,综合分析体外不同类器官和体内辐照模型干细胞群。UMAP可视化结果显示，相比Hyper类器官，未使用VPA/EPZ6438的Hyper类器官和ENR类器官之间的干细胞群更相似。
d,UMAP可视化结果显示胚胎期基因的表达。添加和不添加VPA/EPZ6438的Hyper类器官分别用使用虚线圈出。
图4增生性肠类器官的特征
a,在指定条件下7天内(n＝4孔)类器官的生长曲线。采用双侧不配对t检验确定P值。
b,在上述条件下培养的代表性的类器官形态。
c,不同代数(n＝4孔)统计类器官总数量和Lgr5-GFP阳性类器官数量。
d,免疫荧光染色检测8C条件下培养类器官中潘氏细胞、肠内分泌、杯状细胞标记基因的表达。标尺100μm。
e,透射电镜检测8C条件下培养类器官的潘氏细胞、肠内分泌细胞和杯状细胞。标尺4μm。
f,在8C条件下培养140d后中期扩散细胞核。
g,图1d所示不同类器官中SCA1+细胞的流式细胞仪分析。
***P<0.001；**P<0.01。所有的实验都至少被独立地重复了两次，得到了类似的结果。
图5Hyper类器官的转录组分析
a,GSEA分析显示在上述条件下培养的肠上皮特征基因和结肠炎相关的再生基因富集。
b,GSEA分析显示损伤相关的再生特征在不同的肠上皮和器官中富集。
c,d,PCA分析(c)和相关矩阵分析(d)RNA-seq数据显示，相比较于ENR类器官，Hyper类器官与损伤相关的上皮细胞表达谱更接近。
图6单细胞转录组分析Hyper类器官
a,不同的细胞类型在Hyper类器官和ENR类器官中标记基因的表达。代表性基因显示在左边。
b,Hyper类器官与ENR类器官的谱系组成比较。
c,UMAP可视化结果显示Lgr5表达。用橙色虚线和蓝色虚线分别将Hyper和ENR类器官分隔开。
d,小提琴图显示了Lgr5在Hyper类器官和ENR类器官中的表达。
e,点图显示了本研究中1、2、3、12和17细胞群中，以及辐照诱导的SSC2c细胞群中SSC2c标记基因的表达比例。
f,将SSC2c标记基因在Hyper和ENR类器官中的表达叠加在UMAP上，如图2d所示。用虚线将Hyper和ENR类器官分隔开。
图7VPA和EPZ6438对于维持哺乳动物器官增生性表型至关重要
a,GSEA分析有无VPA和EPZ6438的Hyper类器官中肠上皮特征基因和结肠炎相关再生基因的富集情况。
b,PCA分析显示相比Hyper类器官，无VPA和EPZ6438的Hyper类器官更类似于ENR类器官和体内稳态上皮细胞。
c,有无VPA和EPZ6438的典型Hyper类器官形态。
d,不同代数(n＝4孔)统计类器官总数量和Lgr5-GFP阳性类器官数量。
e,免疫荧光染色检测有无VPA和EPZ6438的Hyper类器官中CLU和胚胎期基因的表达。标尺100μm。
f，在指定条件下培养的类器官中CLU+细胞的数量(n＝15个类器官)。采用双侧不配对t检验确定P值。
***P<0.001。c、d、e和f的实验至少被独立地重复了两次，结果相似。
图8不同类器官的单细胞转录组分析
a，将SSC2c标记基因在有VPA/EPZ6438和无VPA/EPZ6438的Hyper类器官中表达叠加在UMAP上，如图3c所示。-VE表示无VPA/EPZ6438的Hyper类器官，Hyper表示有VPA/EPZ6438的Hyper类器官
b，热图显示在指定条件下培养的类器官中胚胎期特征基因的表达。代表性基因如右图所示。
c，在图3b所示的UMAP上覆盖不同类器官器官类型的胚胎期基因表达。有和没有VPA/EPZ6438的Hyper类器官分别用虚线分隔开。
图9乙酰化抑制剂，EZH2抑制剂及BMP抑制剂同靶点替换测试
qPCR分析在上述条件下(n＝2孔)培养的类器官中再生基因的表达。采用单因素方差分析确定P值。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
定义
如本文所用的术语“损伤性干细胞”为在组织损伤修复过程中，高度活跃并发挥重要功能的干细胞群，以显著高水平表达标志物Tert,Bmi1,Hopx,Cxadr,CD44,Lgr5,Clu、Anxa1、Basp1中的一种或多种。
如本文所用的术语“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地积聚而自组织成的立体的细胞组织体。
如本文所用的术语“哺乳动物类器官”是指使用隐窝组织或干细胞培养而成的类器官。
如本文所用的术语“ENR类器官”是指在EGF、Noggin和R-spondin1的传统条件(简称ENR条件)下培养得到的哺乳动物类器官，其形态或功能特点为：形态为空心小球，内部具有完整的肠道上皮结构，而且含有所有种类的肠上皮功能细胞，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和Lgr5+干细胞。其具有隐窝结构，但结构数量较少，且隐窝长度较短。
如本文所用的术语“增生性哺乳动物类器官”，也称为Hyper类器官，是指所述类器官具有与体内损伤诱导的增生性组织(例如隐窝)相类似的形态特征(例如出芽结构伸长、尺寸更大、隐窝绒毛结构更复杂)，并表达损伤相关的标志物，例如Clu，以及Sca1、Anxa1、Reg3b等。在本发明中，增生性哺乳动物类器官包括哺乳动物(例如小鼠或人)的组织器官(例如肠道、肝、肺、肾、胰腺、胃、皮肤、内耳等)的涉及到疾病损伤修复的类器官组织。
如本文所用的术语“复活性干细胞”是指在哺乳动物损伤过程中活化的干细胞，这些活化后的干细胞能够分化成几乎所有的功能性细胞类型，进而促进了组织损伤修复的发生，其通常以显著高水平表达标志物Clu、Anxa1、basp1中的一种或多种。
如本文所用的术语“基质胶”，也称为细胞外基质(ECM)，由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成。本发明方法中使用的ECM由MatrigelTM(BD Biosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV。
组合物
(1)组蛋白去乙酰化抑制剂
优选的组蛋白去乙酰化抑制剂为VPA，其浓度可使用常规浓度，例如100μM-2500μM，优选地250μM-1000μM，最优选地为500μM。其结构式如下：
在本文公开的方法中也可使用其他的组蛋白去乙酰化抑制剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：MS-275,SAHA，LBH589,TSA,MGCD0103,MC1568,LAQ824,PCI-34051,RGFP966,AR-42,CI994,Sodium butyrate,M344,Tubacin,Scriptaid,Tubastatin A,LMK235。
(2)EZH2抑制剂
优选的EZH2抑制剂包括EPZ6438，其浓度可以使用常规浓度，例如0.4μM-10μM，优选为1μM-4μM，最优选地为2μM。其结构式如下：
Tazemetostat(EPZ-6438)
在本文公开的方法中也可使用其他的组蛋白去乙酰化抑制剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：EPZ011989,EBI-2511,EPZ5676,EPZ005687,GSK343,UNC 1999,GSK126,GSK503,EI1,PF-06726304。
(3)BMP信号抑制剂
BMP作为二聚配体与由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶(即I型和II型受体)组成的受体复合物结合。II型受体将I型受体磷酸化，导致该受体激酶的活化。I型受体随后将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，产生的信号转导通路引起转录活性。
所述BMP抑制剂被定义为与BMP分子结合而形成复合物的试剂，其中例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合来中和BMP活性。可选地，所述抑制剂是起拮抗剂或反向激动剂作用的试剂。这类抑制剂与BMP受体结合，并阻止BMP与所述受体结合。
优选的BMP信号抑制剂包括LDN193189，其浓度可以使用常规浓度，例如为0.04μM-1μM，优选地0.1μM-0.4μM，最优选地为0.2μM。
在本文公开的方法中也可使用其他的BMP信号抑制剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：DMH1,Dorsomorphin,K02288。
(4)WNT激动剂
WNT激动剂可用于激活细胞中TCF/LEF介导的转录。
优选地WNT激动剂包括GSK-3抑制剂XV和R-Spondin1的组合。其中，GSK-3抑制剂XV的浓度可以为0.02mM-0.5mM，优选地0.05mM-0.2mM，最优选地为0.1mM；其中，R-Spondin1的体积分数可以为2％-50％，优选地5％-20％，最优选地为10％。
在本文公开的方法中也可使用其他的WNT激动剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的。在本文中，Wnt激动剂包括分泌型糖蛋白，该分泌型糖蛋白包括Wnt-1/Int-1；Wnt-2/Irp(Int-1相关蛋白)；Wnt-2b/13；Wnt-3/Int-4；Wnt-3a；Wnt-4；Wnt-5a；Wnt-5b；Wnt-6；Wnt-7a；Wnt-7b；Wnt-8a/8d；Wnt-8b；Wnt-9a/14；Wnt-9b/14b/15；Wnt-10a；Wnt-10b/12；Wnt-11和Wnt-16。其它的Wnt激动剂包括分泌型蛋白的R-spondin家族，该家族参与Wnt信号通路的激活和调节，并由4个成员(R-spondin 1、R-spondin 2、R-spondin3和R-spondin4)组成。最近鉴定出Wnt信号通路的小分子激动剂，即氨基嘧啶衍生物，并且其也明确包括在Wnt激动剂中。
已知的GSK抑制剂包括GSK-3抑制剂XV，CHIR，Bio,SB216763,IM12,QS11,ML320和HLY78，以及能阻止GSK-3与axin相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生的肽。
在优选的实施方案中，所述Wnt激动剂选自Wnt家族成员、R-spondin 1-4和GSK抑制剂中的一种或多种。本发明人发现，向培养基添加至少一种Wnt激动剂对于上皮干细胞或分离的隐窝的增殖是必需的。
在优选的实施方案中，Wnt激动剂选自R-Spondin 1和GSK-3抑制剂XV。该组合是特别优选地，其对类器官形成具有意想不到的协同效应。
(5)双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂
P38蛋白激酶是由Han等用内毒素刺激哺乳动物细胞，从中分离纯化的酪氨酸磷酸蛋白激酶。P38是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，它可因生理性应激、脂多糖、渗透性应激和紫外线照射而激活。P38通路的关键酶包括MAPKK类的MKK3、MKK6和MAPKKK类的TAK、ASK、MLK。TAK被TAK结合蛋白(TAB)激活，介导转化生长因子(TGF-β)的信号转导。TAK亦可以激活MKK4，进而活化P38。P38激活后发生核转位，并对许多蛋白激酶和转录因子具有磷酸化和激活的作用。P38信号通路的抑制剂包括SB203580，Doramapimod(BIRB796)，SB201190，LY2228820，VX-702(抑制p38aMAPK)，PH-797804，VX-745(作用于p38a)，TAK-715(作用于p38a)，BMS-582949(抑制p38aMAPK)，Losmapimod(GW856553X，R-1503/Ro4402257)，Pexmetinib(ARRY-614)，Skepinoe-L。本发明人发现，在哺乳动物类器官培养中加入P38信号通路抑制剂的一种或几种可以改善类器官的增殖速度。
优选的双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂包括Pexmetinib，其浓度可以使用常规浓度，例如为0.2μM-5μM，优选地0.5μM-2μM，最优选地为1μM。
在本文公开的方法中也可使用其他的双重p38 MAPK/Tie-2抑制剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：SB203580，BIRB796,SB202190,LY2228820,VX-702,PH-797804,VX-745,TAK-715,BMS-582949。
(6)EGF激动剂
优选的EGF激动剂包括EGF，其浓度可以使用常规浓度，例如为10ng/ml-250ng/ml，优选地25ng/ml-100ng/ml，最优选地为50ng/ml。
在本文公开的方法中也可使用其他的EGF激动剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：HB-EGF,双调蛋白(amphiregulin),细胞素(betacellulin),epigen,上皮调节蛋白(epiregulin),神经调节蛋白1,神经调节蛋白2,神经调节蛋白3,神经调节蛋白4。
(7)FGF激动剂
优选的FGF激动剂包括bFGF(即FGF2)，其浓度可以使用常规浓度，例如为4ng/ml-100ng/ml，优选地10ng/ml-40ng/ml，最优选地为20ng/ml。
在本文公开的方法中也可使用其他的FGF激动剂，它们均是本领域已知的并且是市售可获得的，包括但不限于：FGF4,FGF7,FGF9,FGF10。
实施例1培养体系的筛选
为了开发一种新的器官系统来重建肠上皮细胞损伤后再生过程，我们首先着重于寻找能够启动肠上皮细胞表达损伤相关再生特征的条件因子。肠干细胞损伤后肠再生干细胞的特异性标志物Clu，以及Sca1、Anxa1、Reg3b等损伤相关修复上皮细胞中特异性表达的胚胎期标记基因，作为我们体外筛选的主要标志物。我们重点筛选了一些在调控干细胞扩增中广泛使用的细胞因子、信号通路和表观遗传学的小分子。并得到了一种新的培养条件，其包括8个组分(8C；包括LDN193189、GSK-3Inhibitor XV、Pexmetinib、VPA、EPZ6438、EGF、R-Spondin1条件培养基和bFGF)，能够有效上调这些标记基因在哺乳动物类器官中的表达(图1a)。值得注意的是，在8C条件下培养的类器官的生长速度要快于在EGF、Noggin和R-spondin 1的传统条件(简称ENR条件)下培养的类器官的生长速度，而且Lgr5-GFP+细胞的生长速度也显著更快(图4a-c)。与传统ENR条件类似，在8C条件下培养的类器官包含多种分化的细胞谱系，包括杯状细胞、肠内分泌细胞和Paneth细胞(图4d,e)。此外，在8C条件下培养的类器官在20多次传代后也表现出基因组稳定性(图4f)。
实施例2类器官的再生特征
我们分析了新的类器官培养体系的再生特性。与传统ENR条件培养下的类器官相比，8C条件显著促进了出芽结构的伸长，类器官尺寸变得更大，同时具有更加复杂的隐窝绒毛结构，这些形态特征与体内损伤诱导的增生性隐窝相类似(图1b,图4b)。此外，免疫荧光和流式细胞分析显示，与ENR条件相比，8C条件下SCA1、ANXA1、REG3b、CLU等关键再生相关标志基因均有高表达(图1c-e，图4g)。这些数据表明，在8C条件下培养的类器官可能具有体内损伤诱导的增生态肠上皮的再生特征。
为了在转录组水平上进一步探索8C条件下培养的类器官的再生特征，我们进行了RNA-seq分析，同时检测了再生相关基因的表达。基因集富集分析(GSEA)显示，与ENR条件相比，8C条件显著富集了已报道的再生相关基因(包括参与YAP信号通路和胚胎期相关基因)(图5a)。此外，先前报道的结肠炎相关的再生基因特征在8C条件下也高度富集(图5a)。为了进一步验证类器官的增生性特征，我们综合分析了辐照、寄生蠕虫感染和硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导损伤相关上皮细胞的转录组数据，定义了一种损伤相关再生特征，其中包含63个上调基因和54个下调基因(表4)。结果显示8C条件下培养的类器官显著富集损伤相关的再生特征，这类似于体内损伤后增生性隐窝的表型(图1f，图5b)。与此结果一致的是，损伤相关再生特征基因表达的相关性和降维分析显示，与ENR条件下培养的类器官相比，8C条件下培养的类器官更类似于不同损伤模型中修复上皮细胞的增生性隐窝(图5c,d)。总的来说,这些结果表明，在8C条件下培养的类器官具有一种增生性表型，类似于在体内受损后的增生性隐窝。因此，我们将这些器官命名为增生性哺乳动物器官(Hyper类器官)。
实施例3单细胞RNA测序分析Hyper类器官揭示了其独特的谱系组成
接下来，我们使用单细胞RNA-seq分析了Hyper类器官的谱系组成，并以ENR条件下培养的类器官作为对照。无监督聚类显示不同类器官间合并数据集共有17个不同的上皮细胞群(图2a,b，图6a)。与传统ENR类器官相比，Hyper类器官明显减少了潘氏细胞和肠上皮细胞，而肠内分泌细胞略有增加，类似于体内组织损伤诱导的谱系变化(图2c，图6b)。利用已报道的干细胞标记对类器官中的干细胞群进行鉴定，结果显示1、2、3、12细胞群具有干细胞的分子特征(图2a-c，图6a)。与传统ENR类器官相比，Hyper类器官显著富集了Lgr5阳性的隐窝柱状基底细胞(图6c,d)。更重要的是，富集辐照模型中的损伤干性基因Clu、Anxa1和Ly6a的细胞群17只表达在Hyper类器官中(图2b,图6e,f)。据报道，在辐照诱导的干细胞群SSC2c中，Clu+复活干细胞(revival stem cells)负责损伤后肠上皮的再生。我们整合了所有来自ENR/Hyper类器官和体内辐照模型的干细胞，发现大量的Hyper类器官干细胞，特别是cluster 17，与来自辐照crypts的SSC2c很好地聚集在一起(图2d)。因此，Hyper类器官包含一个特定的干细胞群，类似于在损伤相关再生过程中出现的再生干细胞。综上所述，这些数据表明Hyper类器官具有独特的分化谱系和干细胞群组成。
实施例4 VPA和EPZ6438对于哺乳动物类器官获得增生性表型和特征至关重要
为了探索Hyper类器官获得再生特征的诱导机制，我们从培养条件中单独减去每个诱导因子，并进行转录组分析。减去LDN193189或R-Spondin1条件培养基会导致类器官的生长迟缓(数据未显示)，表明这些因素在Hyper类器官的存活中起着重要作用。分别减去Pexmetinib、EGF或bFGF可略微下调损伤相关的再生特征，但仍可获得类器官(图3a)。值得注意的是，同时减去VPA和EPZ6438显著下调了之前定义的损伤相关的再生特征(图3a)。GSEA分析显示，在未使用VPA和EPZ6438处理的Hyper类器官中，报道的再生相关特征和基因有所下调(图7a)。对损伤相关再生特征基因表达的降维分析显示，从Hyper类器官培养中减去VPA和EPZ6438使它们更接近于来自于在不同的损伤模型中稳态上皮的隐窝(图7b)。与此结果一致的是，未使用VPA和EPZ6438处理的Hyper类器官减少了隐绒毛结构的复杂性，并在连续传代过程中逐渐丧失了Lgr5-GFP的表达(图7c,d)。
实施例5 VPA和EPZ6438对于哺乳动物类器官获得损伤相关干细胞群及胚胎期基因表达至关重要
接下来，我们进一步研究了VPA和EPZ6438对Hyper类器官独特的干细胞组成的贡献。无监督聚类结果显示，未使用VPA和EPZ6438处理的Hyper类器官与ENR类器官聚集在一起，这一点在干细胞聚类中尤为明显(图3b,c)。此外，在未使用VPA和EPZ6438处理的Hyper类器官中，SSC2c标记基因的表达以及关键再生干细胞标记基因Clu的表达均显著降低(图7e,f)。这些结果进一步证实了VPA和EPZ6438是Hyper类器官中损伤相关干细胞群开始发育的诱因。此外，去除VPA和EPZ6438后胚胎期基因表达细胞显著减少，并下调了胚胎期基因表达(图3d，图8b,c)，这表明VPA和EPZ6438是Hyper类器官维持原始状态的必要因素。总之，这些结果表明，VPA和EPZ6438是激活损伤相关再生特征和Hyper类器官表型的关键。
实施例7乙酰化抑制剂与EZH2抑制剂对于哺乳动物类器官获得增生性表型和特征至关重要
在之前的实验中，我们发现组蛋白去乙酰化抑制剂VPA和EZH2抑制剂EPZ6438对于哺乳动物类器官获得增生性表型和特征至关重要。因此，我们使用其他种类的经典组蛋白去乙酰化抑制剂TSA与MS275替代VPA，或者使用其他种类的经典EZH2抑制剂GSK126与EPZ011989替代EPZ6438，发现培养出的类器官均能够显著启动一系列再生基因，获得与VPA或EPZ6438相似的增生性表型(图9)。因此，我们认为其他种类的乙酰化抑制剂和EZH2抑制剂均的协同作用，对于哺乳动物类器官获得增生性表型和特征至关重要。
综上所述，我们在体外建立了一个与体内增生性肠上皮细胞共享再生特征的新型哺乳动物类器官系统。在我们的类器官培养系统中，复活性干细胞(revival stem-likecells)的存在为理解干细胞在组织再生中的作用提供了一个机会。值得注意的是，组蛋白去乙酰化抑制剂和EZH2抑制剂(例如VPA和EPZ6438)是诱导Hyper类器官增生性和再生表型的关键，这两个表观小分子化合物对体内损伤再生的促进突出了再生过程中表观遗传调控的重要作用。Hyper类器官是未来体外模拟损伤再生研究的重要工具，可为深入了解哺乳动物再生机制提供理论依据。此外，我们的系统可以用于高通量筛选，以确定潜在的治疗化合物，可以诱导或促进损伤再生。综上所述，我们的研究为研究体外再生机制提供了一个有价值的平台，这可能有助于开发促进体内再生的新策略。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.用于获得和/或培养增生性小鼠小肠类器官的组合物，其特征在于，包括(1)组蛋白去乙酰化抑制剂VPA，和(2)EZH2抑制剂EPZ6438；
并且所述组合物还包括以下组分：
(3)BMP信号抑制剂LDN193189，
(4)WNT激动剂GSK-3抑制剂XV和R-Spondin1，
(5)p38 MAPK抑制剂Pexmetinib，
(6)EGF激动剂EGF，和
(7)FGF激动剂bFGF。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(1)组蛋白去乙酰化抑制剂VPA的浓度为100μM-2500μM。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(2)EZH2抑制剂EPZ6438的浓度为0.4μM-10μM。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(3)BMP信号抑制剂LDN193189的浓度为0.04μM-1μM。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(5)p38 MAPK抑制剂Pexmetinib的浓度为0.2μM-5μM。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(6)EGF激动剂EGF的浓度为10ng/ml-250ng/ml。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述(7)FGF激动剂bFGF的浓度为4ng/ml-100ng/ml。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，使用DMEM/F12作为基础培养基。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，使用添加有HEPES、GlutaMAX、penicillin和streptomycin、N2、B27、1mM N-Acetylcysteine的DMEM/F12作为基础培养基。
10.获得和/或培养增生性小鼠小肠类器官的方法，其特征在于，在培养基中将ENR类器官或小鼠隐窝组织进行培养，其中所述培养基包含权利要求1-9中任一项所述的组合物。
11.权利要求10所述的方法获得的增生性小鼠小肠类器官。
12.权利要求11所述的增生性小鼠小肠类器官的用途，
其中所述增生性小鼠小肠类器官用于体外模拟损伤再生研究，用于筛选诱导或促进损伤再生的治疗化合物，或用作重建损伤相关再生过程的体外模型。
13.权利要求11所述的增生性小鼠小肠类器官的用途，其中所述增生性小鼠小肠类器官用于高通量筛选诱导或促进损伤再生的治疗化合物。
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